JP6124802B2 - 突然変異解析 - Google Patents
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Description
a)下記を含有する反応混合物、すなわち、
i)増幅されるべき遺伝子座に少なくとも相当する核酸を含有するサンプル;
ii)第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度(Tm)で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;および
iii)核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー:サンプルのTmが、プローブ:第一対立遺伝子のTmよりも高い、プライマー;
を含有する反応混合物を用意するステップと;
b)反応混合物をプローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと;
c)反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅は融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度は、プローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと;
d)プローブ:第一対立遺伝子のTm以下の温度で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し;プローブ:第二対立遺伝子のTm以下の高温で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し;その2つを比較することによって、増幅された第一対立遺伝子を検出するステップ
とを含む。
KRASのコドン12および13を標的とする、5' AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG 3'(HYB_KRAS_CD12/13、配列番号1)
KRASのコドン61を標的とする、5' AGGTCAAGAGGAGTACAGTG 3'(HYB_KRAS_CD61、配列番号2)
KRASのコドン146を標的とする、5' TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT 3'(HYB_KRAS_CD146、配列番号3)
EGFRのエクソン18を標的とする、5' GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG 3'(EGFRX18_HYB、配列番号4)
EGFRのエクソン19を標的とする、5' CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCC 3'(EGFRX19HYB_DEL、配列番号5)
EGFRのエクソン20を標的とする、5' CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC 3' (EGFRX20_HYB、配列番号6)
EGFRのエクソン21を標的とする、5' TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG 3'(EGFRX21 HYB、配列番号7)
BRAFのアミノ酸600を標的とする、5' CTACAGTGAAATCTCGATGG 3'(BRAF_V600、配列番号8)。
a)下記を含有する反応混合物、すなわち、
i)サンプル;
ii)第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度(Tm)で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;および
iii)核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位と隣接した第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー:サンプルのTmが、プローブ:第一対立遺伝子のTmより高い、プライマー;
を含有する反応混合物を用意するステップと;
b)反応混合物をプローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと;
c)反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅は融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度は、プローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと;
d)反応混合物の温度をプローブ:突然変異対立遺伝子のTm以下に維持するステップと;
e)反応混合物の温度をステップd)の温度より高いが、プローブ:野生型対立遺伝子のTm以下に維持するステップと;
f)ステップd)およびe)においてハイブリダイズしたプローブを検出し、それによってサンプル中の突然変異対立遺伝子の有無を決定するステップ
とを含む。
本発明は、望ましくない対立遺伝子の増幅を妨げるためのブロッカーと、突然変異対立遺伝子の存在を報告するレポーターとの両方として単一のプローブを用いた、低コピー数の突然変異(例えば体細胞変異)が選択的に増幅および検出されうる方法を提供する。更に、プローブは、単一の実験から、同一遺伝子座の中の異なる多数の対立遺伝子(例えば、代替SNP)を検出するために使用され得る。本方法は、SNPならびに挿入または欠失などの突然変異を検出するために使用され得る。
K-RAS
野生型K-RAS遺伝子の部分配列は、図1に示される。コドン12/13、61、および146の標的領域は、太字で強調表示される。
EGFR
図10は、EGFRのエクソン18領域についてのEGFRプローブ配列(EGFRX18_HYB)を示す。プローブ配列は、野生型領域と完全に相補的であるが、3つの起こり得るSNP突然変異(2155 G>A、2155 G>T、および2156 G>C)があり、そのそれぞれは、単一ミスマッチ塩基によってプローブ配列と異なる。この場合も、EGFRX18_HYBプローブは、2つの蛍光部分を有するhyBeacon(登録商標)プローブである。
BRAF遺伝子は、アミノ酸600にいくつかの潜在的なSNP突然変異:1799 T>A、G、またはC、ならびに多重突然変異、1799 TG>AT、1798 GT>AAまたはAG、および1797 AGT>GAGを含む。hyBeacon(登録商標)プローブBRAFV600_HYBは、野生型配列の一部と完全に相補的である。プローブおよび様々な標的配列は、図17に示される。
バックグラウンドの野生型配列に対する、任意の与えられたサンプル中での体細胞突然変異の割合の低さのため、突然変異検出の性能および感度を改善するためのアッセイ設計への体系的なアプローチが通常は必要とされる。一般的に、特定の突然変異部位からの増幅を目的とするためには、その突然変異の情報が必要であり、複数の突然変異のためには複数のプライマーが必要である。しかし、本明細書に開示される方法は、このような情報は必要ない。体細胞突然変異と同様に、本方法は、他の用途を見出だしうるものであり、例えば、少量のHIV薬剤耐性変異株は、患者の抵抗性についての総合的な負担を増加させるにもかかわらず、通常、従来の遺伝子型決定では認識されない。
Claims (23)
- 少なくとも第一対立遺伝子と第二対立遺伝子とを有する遺伝子座の第一対立遺伝子を選択的に増幅および検出する方法であって、
a)下記を含有する反応混合物、すなわち、
i)増幅されるべき遺伝子座に相当する核酸を少なくとも含有するサンプル;
ii)第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度(Tm)で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;および
iii)核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、前記プライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位の両側にある第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー:サンプルのTmが、プローブ:第一対立遺伝子のTmより高い、プライマー対;
を含有する反応混合物を用意するステップと;
b)反応混合物をプローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと;
c)反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、前記増幅が融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度が、プローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子とハイブリダイズし、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと;
d)プローブ:第一対立遺伝子のTm以下の温度で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し;プローブ:第二対立遺伝子のTm以下の、より高い温度で、プローブとサンプルとのハイブリダイゼーションを検出し;その2つを比較することによって、増幅された第一対立遺伝子を検出するステップ
とを含み、
前記プローブは、プローブが標的鎖とハイブリダイズしているか否かによって異なるシグナルを生じる蛍光標識によって標識されており、
前記プライマーの一方は律速的な量で供給され、増幅反応は非対称PCRであり、
プライマーの一方または両方は、プローブが結合のためにプライマーと競合するように、プローブ結合部位と重複し、それによってプライマーの結合を妨げ、従って鎖伸長を妨げる、
方法。 - 第一対立遺伝子が突然変異対立遺伝子であり、第二対立遺伝子が野生型対立遺伝子である、請求項1に記載の方法。
- 融解段階の温度が、プライマー:サンプルのTmおよびプローブ:第二対立遺伝子のTmより高い、請求項1または2に記載の方法。
- 遺伝子座が、複対立遺伝子の遺伝子座であり;すなわち、その遺伝子座に存在しうる、野生型対立遺伝子および2つより多くの突然変異対立遺伝子がある、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- プローブ:野生型対立遺伝子のTmがいずれのプローブ:突然変異対立遺伝子のTmよりも高くなるように、前記プローブが選択される、請求項4に記載の方法。
- それぞれの存在しうるプローブ:対立遺伝子の組合せのTmが異なる、請求項4または5に記載の方法。
- 前記のそれぞれの組合せのTmが、少なくとも0.1℃異なる、請求項6に記載の方法。
- 前記のそれぞれの組合せのTmが、少なくとも0.25℃異なる、請求項7に記載の方法。
- 前記のそれぞれの組合せのTmが、少なくとも0.5℃異なる、請求項8に記載の方法。
- 前記のそれぞれの組合せのTmが、少なくとも0.75℃異なる、請求項9に記載の方法。
- 前記プローブが第二対立遺伝子の一方の鎖と完全に相補的である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 第一対立遺伝子が、1つ以上の点突然変異によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 第一対立遺伝子が、複数の一塩基多型(SNP)によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 第一対立遺伝子が、1つ以上の欠失および/または挿入によって第二対立遺伝子の配列と異なる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブがDNAである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 第一対立遺伝子と第二対立遺伝子との間の配列の違いが、プローブが結合する領域の内部にある、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子座が複対立遺伝子であり、検出するステップが更に、反応混合物を1つ以上の中間温度に上昇させ、ハイブリダイズしたプローブ分子を各中間温度で検出することを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子座が、KRAS、EGFR、またはBRAFヒト遺伝子から選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子座が、KRASのコドン12および13、KRASのコドン61、ならびにKRASのコドン146から選択される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子座が、EGFRのエクソン18、19、20、または21から選択される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 標的遺伝子座が、BRAFのアミノ酸残基600、および対応するヌクレオチド残基である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- プローブ配列が、
KRASのコドン12および13を標的とする、5' AGTTGGAGCTGGTGGCGTAG 3'(HYB_KRAS_CD12/13、配列番号1)、
KRASのコドン61を標的とする、5' AGGTCAAGAGGAGTACAGTG 3'(HYB_KRAS_CD61、配列番号2)、
KRASのコドン146を標的とする、5' TGTAGTCGTTTCTGTTCTGT 3'(HYB_KRAS_CD146、配列番号3)、
EGFRのエクソン18を標的とする、5' GCTGGGCTCCGGTGCGTTCG 3'(EGFRX18_HYB、配列番号4)、
EGFRのエクソン19を標的とする、5' CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCC 3'(EGFRX19_HYB_DEL、配列番号5)、
EGFRのエクソン20を標的とする、5' CTACCGGTCGCACGGTCGCACCCTGTTGGGGGTGCACAC 3' (EGFRX20_HYB、配列番号6)、
EGFRのエクソン21を標的とする、5' TGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG 3'(EGFRX21_HYB、配列番号7)、および
BRAFのアミノ酸600を標的とする、5' CTACAGTGAAATCTCGATGG 3'(BRAF_V600、配列番号8)
からなる群より選択される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。 - 被験体からのサンプル中の体細胞変異を検出する方法であって、前記サンプルが少なくとも第一対立遺伝子および第二対立遺伝子を有する遺伝子座に由来する核酸を含有し、第一対立遺伝子は突然変異対立遺伝子であり、第二対立遺伝子は野生型対立遺伝子であって、前記方法が、
a)下記を含有する反応混合物、すなわち、
i)サンプル;
ii)第二対立遺伝子とハイブリダイズするよりも低い融解温度(Tm)で第一対立遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ;および
iii)核酸増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマー対であって、そのプライマーが、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位の両側にある第一部位および第二部位でサンプル中の核酸とハイブリダイズし、プライマー:サンプルのTmが、プローブ:第一対立遺伝子のTmよりも高い、プライマー対;
を含有する反応混合物を用意するステップと;
b)反応混合物をプローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間の温度に維持し、プローブが第二対立遺伝子と選択的にハイブリダイズするようにするステップと;
c)反応混合物に対して温度サイクリング増幅を行うステップであって、その増幅が融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度が、プローブ:第一対立遺伝子のTmとプローブ:第二対立遺伝子のTmとの間であり、プローブがこれらの段階の間、第二対立遺伝子にハイブリダイズされ、それによって第一対立遺伝子を増幅するステップと;
d)反応混合物の温度をプローブ:突然変異対立遺伝子のTm以下に維持するステップと;
e)反応混合物の温度を、ステップd)の温度より高いがプローブ:野生型対立遺伝子のTm以下である温度に維持するステップと;
f)ステップd)およびe)においてハイブリダイズしたプローブを検出し、それによってサンプル中の突然変異対立遺伝子の有無を決定するステップ
とを含み、
前記プローブは、プローブが標的鎖とハイブリダイズしているか否かによって異なるシグナルを生じる蛍光標識によって標識されており、
前記プライマーの一方は律速的な量で供給され、増幅反応は非対称PCRであり、
プライマーの一方または両方は、プローブが結合のためにプライマーと競合するように、プローブ結合部位と重複し、それによってプライマーの結合を妨げ、従って鎖伸長を妨げる、
方法。
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