JP5757909B2 - 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット - Google Patents
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Description
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キットに関する。
ＡＢＣＣ２遺伝子は、肝細胞の胆管に局在して、グルタチオン、グルクロン酸、硫酸抱合体を胆管から胆管に輸送するトランスポーターをコードしており、様々な薬剤の代謝に関与していると考えられている。
また、近年、日本人におけるＡＢＣＣ２遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を解析したところ、様々な遺伝子多型が見出された。また、ＡＢＣＣ２遺伝子の５’末端から２４塩基手前のシトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているＣ−２４Ｔを測定することにより、薬剤耐性を予測できる可能性が示唆された（非特許文献１参照）。そのため、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を正確にかつ短時間、低コストで簡便に測定する方法が待ち望まれている。
また、近年、日本人におけるＡＢＣＣ２遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を解析したところ、様々な遺伝子多型が見出された。また、ＡＢＣＣ２遺伝子の５’末端から２４塩基手前のシトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているＣ−２４Ｔを測定することにより、薬剤耐性を予測できる可能性が示唆された（非特許文献１参照）。そのため、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を正確にかつ短時間、低コストで簡便に測定する方法が待ち望まれている。
また、薬剤の感受性に関連する変異としては、例えば、Ｃ−２４Ｔ変異の他にも、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における３４３５番目のシトシン（Ｃ）が、チミン（Ｔ）に変異しているＣ３４３５Ｔ変異等の多数の変異が知られている（特許文献１参照）。そのため、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型だけではなく、その他の薬剤感受性に関する変異体をＣ−２４Ｔ変異と併せて検出することにより、薬剤耐性をより高感度で予測できる可能性があると考えられている。
現在、遺伝子の多型を測定する方法としては、測定したい塩基を含む部分を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、当該特定塩基における変異の有無で切断の有無が分かれるような制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）が知られている（非特許文献２参照）。
また、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する方法も知られている（特許文献２参照）。
Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、２００２年、Ｖｏｌ．３０、Ｎｏ．４、ｐ．３６３−３６４
Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．、２０１０年、第９巻、第１号、ｐ．３４−４０
しかしながら、ＡＢＣＣ２遺伝子の変異には、上述の通り種々の変異が存在している。このため、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法では、ＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行う必要がある。そのため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがあり、これに起因して偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまう場合がある。また、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出までに必要な時間も非常に長くなってしまう場合がある。さらに、操作が複雑なため、自動化が困難である。
これらの現状を踏まえ、ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
これらの現状を踏まえ、ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
本発明は、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効判定方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することを課題とする。
本発明は以下のとおりである。
＜１＞ 配列番号１２で示される塩基配列からなり３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
＜２＞ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するか又は増加する、＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
＜３＞ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞ 前記多型検出用プローブが、融解曲線分析用のプローブである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを用いることにより、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜６＞ （Ｉ）＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、＜５＞に記載の多型検出方法。
＜７＞ さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、＜６＞に記載の多型検出方法。
＜８＞ さらに、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを用いて、ＭＤＲ１遺伝子及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子からなる群より選択される少なくとも一方の多型を検出することを含む、＜５＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜９＞ ＜５＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の多型検出方法により、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することと、検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、を含む、薬剤の薬効判定方法。
＜１０＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを含む、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬キット。
＜１１＞ さらに、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーを含む、＜１０＞に記載の多型検出用試薬キット。
＜１２＞ さらにＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するためのプローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型を検出するためのプローブからなる群より選択される少なくとも１種以上の多型検出用プローブを含む、＜１０＞又は＜１１＞に記載の多型検出用試薬キット。
＜１＞ 配列番号１２で示される塩基配列からなり３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
＜２＞ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するか又は増加する、＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
＜３＞ 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、＜１＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞ 前記多型検出用プローブが、融解曲線分析用のプローブである、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを用いることにより、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜６＞ （Ｉ）＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、＜５＞に記載の多型検出方法。
＜７＞ さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、＜６＞に記載の多型検出方法。
＜８＞ さらに、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを用いて、ＭＤＲ１遺伝子及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子からなる群より選択される少なくとも一方の多型を検出することを含む、＜５＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の多型検出方法。
＜９＞ ＜５＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の多型検出方法により、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することと、検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、を含む、薬剤の薬効判定方法。
＜１０＞ ＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを含む、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬キット。
＜１１＞ さらに、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーを含む、＜１０＞に記載の多型検出用試薬キット。
＜１２＞ さらにＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するためのプローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型を検出するためのプローブからなる群より選択される少なくとも１種以上の多型検出用プローブを含む、＜１０＞又は＜１１＞に記載の多型検出用試薬キット。
本発明によれば、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することができる。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効判定方法を提供することができる。さらに本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することができる。
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効判定方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法によりＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効判定方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法によりＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
本発明における「ＡＢＣＣ２遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＣ＿００００１０．１０の１０１５４２４６３〜１０１６１１６６２の配列を意味する。配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ｒｓ７１７６２０の１〜６１１の配列であり、ＡＢＣＣ２遺伝子のプロモーター領域における核酸の塩基配列の一部に相当する。
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
＜ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブ＞
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１及びＰ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’）配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド。
本発明の前記Ｐ１及び前記Ｐ１’からなる群より選択される一種の蛍光標識オリゴヌクレオチド（以下、「前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチド」ともいう。）は、配列番号１に示す塩基配列の２０７番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む配列である。
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む配列である。
ＡＢＣＣ２遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち２０７番目に対応する塩基は、Ｃ（シトシン）であるが、変異型においてはＴ（チミン）に変異しており（以下、「Ｃ−２４Ｔ変異」と称する。）、当該塩基は、ＡＢＣＣ２遺伝子の−４２８番目〜１８３番目の塩基のうち、２０７番目の塩基に該当する。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して相同性を有すことを要する。
具体的には、本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
具体的には、本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して、８０％以上の同一性を示す。
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドと、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
また、本発明にかかる前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２０７番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ１−１）であってもよい。
当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
本発明における前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを要する。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１） に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
また、本発明にかかる前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１１〜６０の配列であり、配列番号１における２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンである以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号１で示される配列のうち２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２０７番目の塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチド（Ｐ１’−１）であってもよい。
当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号１における２０７番目の塩基の多型を認識するという機能を有するため、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、特定の塩基配列を有することに加え、配列番号１における２０７番目の塩基の多型を認識するという機能を有するため、変異型のＡＢＣＣ２遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
さらに、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
挿入、欠失又は置換の中でも、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとして、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基以外に位置する塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
挿入、欠失又は置換の中でも、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとして、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基以外に位置する塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１１ｍｅｒ〜６０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１０ｍｅｒ以下や、６１ｍｅｒ以上である場合には、ＡＢＣＣ２遺伝子多型の検出感度が低下する。
また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１２ｍｅｒ〜５５ｍｅｒ、１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、又は１８ｍｅｒ〜３５ｍｅｒとしうる。１２ｍｅｒ〜５５ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
また前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１２ｍｅｒ〜５５ｍｅｒ、１５ｍｅｒ〜４５ｍｅｒ、又は１８ｍｅｒ〜３５ｍｅｒとしうる。１２ｍｅｒ〜５５ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
また前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
以下に本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表１では、配列番号１の２０７番目の塩基に対応する塩基を小文字で表記し、当該配列番号１の２０７番目に対応する塩基がＡ、Ｇ、Ｔ及びＣの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。また、配列番号１に示す配列に対して変異を加えたものは、下線を付した。
ここでＴｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した。
なお、表１では、配列番号１の２０７番目の塩基に対応する塩基を小文字で表記し、当該配列番号１の２０７番目に対応する塩基がＡ、Ｇ、Ｔ及びＣの場合であるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。また、配列番号１に示す配列に対して変異を加えたものは、下線を付した。
ここでＴｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ ９９ ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した。
本発明において、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（ｍｔ））と、配列番号１の２０７番目の塩基に対応する塩基のみが非相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（ＷＴ））との差は、例えば２．０℃以上、３．０℃以上、５．０℃以上、又は７．０℃以上等が挙げられる。前記Ｔｍ値の差が２．０℃以上であることで、例えば、配列番号１における２０７番目の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、２１７番目の塩基が蛍光色素で標識されていることを要する。
前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された２１７番目の塩基が、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。これは、蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
上記塩基配列を有し、３’末端のＣが蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの具体例を以下に示す（大文字の塩基は変異点を示し、（ＴＡＭＲＡ）は、前記蛍光色素に該当する。）。但し、本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドは以下のものに限定されない。
前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドはＡＢＣＣ２遺伝子における多型、特にＣ−２４Ｔ変異を検出するＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
また、ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、２１７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、２１７番目の塩基に対応する塩基が蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
＜プライマー＞
後述するＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＡＢＣＣ２遺伝子多型を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＡＢＣＣ２遺伝子の多型の部位である、配列番号１で示される配列のうち２０７番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
後述するＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＡＢＣＣ２遺伝子多型を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＡＢＣＣ２遺伝子の多型の部位である、配列番号１で示される配列のうち２０７番目の塩基に対応する塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）にすることができる。
以下に本発明の多型検出方法において、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
前記配列番号１で示される配列のうち２０７番目の塩基における多型を検出するためのプライマーとしては、下記Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’からなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドであればよい。
（Ｐ２）配列番号１で示される塩基配列のうち１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド、（Ｐ２’）配列番号１に示す塩基配列において１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、（Ｐ３）配列番号１で示される塩基配列のうち２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列の相補鎖に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド、及び（Ｐ３’）配列番号１に示す塩基配列において２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（Ｐ２）配列番号１で示される塩基配列のうち１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド、（Ｐ２’）配列番号１に示す塩基配列において１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、（Ｐ３）配列番号１で示される塩基配列のうち２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列の相補鎖に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチド、及び（Ｐ３’）配列番号１に示す塩基配列において２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における２０７番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ２’のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において１７２番目〜１９４番目の塩基を含む塩基長２３〜６０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、且つ配列番号１における２０７番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ２又はＰ２’のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ２又はＰ２’のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列の相補鎖に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における２０７番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ３’のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において２６５番目〜２９４番目の塩基を含む塩基長３０〜６０の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、且つ配列番号１における２０７番目の塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ３又はＰ３’のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ３又はＰ３’のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
なお、ハイブリダイゼーションを行う方法についてはプローブの項に記載した方法に従えばよく、ストリンジェントな条件についてはプローブの項に記載した条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性や、挿入、欠失又は置換の範囲についても、プローブの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
なお、ハイブリダイゼーションを行う方法についてはプローブの項に記載した方法に従えばよく、ストリンジェントな条件についてはプローブの項に記載した条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性や、挿入、欠失又は置換の範囲についても、プローブの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
以下に、本発明の多型検出方法における前記配列番号１における２０７番目の塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
また、前記配列番号１における２０７番目の塩基における多型を検出するためには、前記Ｐ２及びＰ３、又はＰ２’及びＰ３’で表される各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることができる。
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することを含むＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＡＢＣＣ２遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＣ２遺伝子における多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
本発明にかかるＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法は、前記ＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することを含むＡＢＣＣ２遺伝子多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＡＢＣＣ２遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＣ２遺伝子における多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）ハイブリダイズの前又は工程（Ｉ）のハイブリダイズすることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることができる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＡＢＣＣ２遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することができる。このため、前記多型検出用プローブとして、前述の蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することができる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＡＢＣＣ２遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることができる。
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことができる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を検出できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＡＢＣＣ２遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＡＢＣＣ２遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
本発明の多形検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、Ｑ Ｐｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
具体例として、Ｑ Ｐｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
なお、本発明の多型検出方法においては、さらに、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを用いることにより、ＡＢＣＣ遺伝子の多型に加えて、ＭＤＲ１遺伝子及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子からなる群より選択される少なくとも一方の多型を検出することができる。
さらに、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブと、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブと、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブとを併用することにより、これら３種の遺伝子多型を１つの系で簡便に検出できるだけではなく、薬剤に対する耐性及び有効性をより正確に予測することができる。
複数の遺伝子多型を、同一の系で検出する方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各多型を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各多型を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
複数の遺伝子多型を、同一の系で検出する方法としては、特に制限されるものではない。例えば、各多型を検出できる各プローブを予め混合し、試料に添加してもよいし、一本鎖核酸を含む試料に各多型を検出できる各プローブを連続的に添加してもよい。
ここで、「系」とは、蛍光標識オリゴヌクレオチド及び一本鎖核酸がハイブリダイズしたハイブリッドを含む試料で形成される１個の独立した反応系を意味する。
本発明における「ＭＤＲ１遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列の一部は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰアクセッションＮｏ．ｒｓ１０４５６４２の１〜５１１の配列に相当する。配列番号２にＭＤＲ１遺伝子をコードする塩基配列の一部を示す。
また、本発明における「ＣＹＰ３Ａ５遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列の一部は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰアクセッションＮｏ．ｒｓ７７６７４６の１〜８０１の配列を意味する。配列番号３にＣＹＰ３Ａ５遺伝子をコードする塩基配列の一部を示す。
また、本発明における「ＣＹＰ３Ａ５遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列の一部は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰアクセッションＮｏ．ｒｓ７７６７４６の１〜８０１の配列を意味する。配列番号３にＣＹＰ３Ａ５遺伝子をコードする塩基配列の一部を示す。
前記ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブとしては、ＭＤＲ１遺伝子の多型を検出できるプローブであれば特に制限はされないが、ＭＤＲ１遺伝子のエクソン２６における多型を検出できるプローブとすることができ、ＭＤＲ１遺伝子の３４３５番目の塩基における多型を検出できるプローブとすることもできる。
これらのＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブとしては、例えば特開２００５−２８７３３５号公報に記載のプローブに記載のプローブ等が挙げられる。また、例えば配列番号１９に示す塩基配列からなるプローブ等も挙げられる。
前記ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブとしては、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型を検出できるプローブであれば特に制限はされないが、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子のイントロン３における多型を検出できるプローブとすることができ、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子の６９８６番目の塩基における多型を検出できるプローブとすることもできる。例えば、配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ等が挙げられる。
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するので、ＡＢＣＣ２遺伝子におけるこの多型に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
また、多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、免疫抑制剤、分子標的治療薬、抗うつ薬等が挙げられ、特に免疫抑制剤及び分子標的治療薬が挙げられる。
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するので、ＡＢＣＣ２遺伝子におけるこの多型に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
また、多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、免疫抑制剤、分子標的治療薬、抗うつ薬等が挙げられ、特に免疫抑制剤及び分子標的治療薬が挙げられる。
＜多型検出用試薬キット＞
本発明のＡＢＣＣ２遺伝子における多型を検出するためのＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用試薬キットは、上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用試薬キットには、ＡＢＣＣ２遺伝子のうち、配列番号１で示される配列のうち２０７番目の塩基における多型を簡便にかつ感度よく検出することが可能な既述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＡＢＣＣ２遺伝子の多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
本発明のＡＢＣＣ２遺伝子における多型を検出するためのＡＢＣＣ２遺伝子多型検出用試薬キットは、上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用試薬キットには、ＡＢＣＣ２遺伝子のうち、配列番号１で示される配列のうち２０７番目の塩基における多型を簡便にかつ感度よく検出することが可能な既述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＡＢＣＣ２遺伝子の多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
また、本発明における多型検出用試薬キットは、上述の検出対象となるＡＢＣＣ２遺伝子多型を含む配列を増幅可能なプライマーをさらに含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よくＡＢＣＣ２遺伝子の多型の検出を行うことができる。
また、本発明における多型検出用試薬キットは、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブに加えて、上述したＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブをさらに含んでいてもよい。
なお、多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
また、本発明における多型検出用試薬キットは、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型検出用プローブに加えて、上述したＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブをさらに含んでいてもよい。
なお、多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅可能なプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅可能なプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
さらに本発明の多型検出用試薬キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＡＢＣＣ２遺伝子における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
［実施例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表４に記載した処方の検査用試薬を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。なお、使用したポリラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表４に記載した処方の検査用試薬を用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。なお、使用したポリラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼである。
なお、上記表４で使用したプローブとプライマーの詳細を以下の表５及び表６にそれぞれ示す。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び６１℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
なお、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
鋳型としては、全血と精製ゲノム（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
全血は、以下のように調製した。
全血１０μｌを８０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを８０μｌの希釈液２に加える。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られる。これを１ｔｅｓｔあたりの鋳型として使用した。
全血１０μｌを８０μｌの希釈液１に加え、よく混合した後、この混合液１０μｌを８０μｌの希釈液２に加える。この混合液１７μｌを９５℃１０分で加熱すると４μｌの前処理済全血が得られる。これを１ｔｅｓｔあたりの鋳型として使用した。
精製ゲノム（Ｒｏｃｈｅ社製）は、３０コピー／μｌを１ｔｅｓｔあたり４μｌ使用した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
図２の（Ａ）は、全血を鋳型として用いたときのＭＤＲ１遺伝子において、野生型のピーク及びＣ３４３５Ｔ変異型のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｄ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＭＤＲ１遺伝子において、野生型のピーク及びＣ３４３５Ｔ変異型のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｂ）は、全血を鋳型として用いたときのＣＹＰ３Ａ５遺伝子において、野生型（＊１）のピーク及び変異型(*３)のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｅ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＣＹＰ３Ａ５遺伝子において、変異型（＊３）のピークについて、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｃ）は、全血を鋳型として用いたときのＡＢＣＣ２遺伝子において、野生型のピークについて、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｆ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＡＢＣＣ２遺伝子について、野生型のピーク及びＣ−２４Ｔ変異型のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｄ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＭＤＲ１遺伝子において、野生型のピーク及びＣ３４３５Ｔ変異型のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｂ）は、全血を鋳型として用いたときのＣＹＰ３Ａ５遺伝子において、野生型（＊１）のピーク及び変異型(*３)のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｅ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＣＹＰ３Ａ５遺伝子において、変異型（＊３）のピークについて、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｃ）は、全血を鋳型として用いたときのＡＢＣＣ２遺伝子において、野生型のピークについて、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
図２の（Ｆ）は、ヒトゲノムを鋳型として用いたときのＡＢＣＣ２遺伝子について、野生型のピーク及びＣ−２４Ｔ変異型のピークの両方について、明瞭なピークを得ることが可能であることを示している。
［実施例２］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表９に記載した処方の反応液を用いてＴｍ解析を行った。
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表９に記載した処方の反応液を用いてＴｍ解析を行った。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いたので、励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
多型検出用プローブには、配列番号１で示される配列のうち２０７番目〜２１７番目の塩基を含む塩基長１９の配列であり、２１７番目の塩基が蛍光色素（ＴＡＭＲＡ）で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド（ｔｃｔｇｇａａｃＡａａｇａｃｔｃｔｔｃ 配列番号１２）を用いた。
野生型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ＷＴ（ａｔａｔｔａａｔａｇａａｇａｇｔｃｔｔＴｇｔｔｃｃａｇａｃｇｃａｇｔｃｃａｇｇａ 配列番号２５）を使用し、変異型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ（ａｔａｔｔａａｔａｇａａｇａｇｔｃｔｔＣｇｔｔｃｃａｇａｃｇｃａｇｔｃｃａｇｇａ 配列番号２６）を使用し、混合型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ＷＴと、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔとを、１：１の割合で混合させたものを使用した。
野生型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ＷＴ（ａｔａｔｔａａｔａｇａａｇａｇｔｃｔｔＴｇｔｔｃｃａｇａｃｇｃａｇｔｃｃａｇｇａ 配列番号２５）を使用し、変異型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ（ａｔａｔｔａａｔａｇａａｇａｇｔｃｔｔＣｇｔｔｃｃａｇａｃｇｃａｇｔｃｃａｇｇａ 配列番号２６）を使用し、混合型の鋳型としては、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ＷＴと、一本鎖核酸 ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔとを、１：１の割合で混合させたものを使用した。
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図３を得た。図３の（Ａ）は野生型の結果を示し、図３の（Ｂ）は変異型の結果を示し、図３（Ｃ）は混合型の結果を示す。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
その結果、図３（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの場合においても、野生型と変異型とを識別できるピークを得ることが明らかになった。
［比較例１］
多型検出用プローブを、配列番号１２に記載の塩基配列で示される３Ｔ-ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ-Ｆ２（ｔｃｔｇｇａａｃＡａａｇａｃｔｃｔｔｃ-(ＴＡＭＲＡ)）から、配列番号２７に記載の塩基配列で示される３Ｔ-ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ-Ｆ１（(ＴＡＭＲＡ)-ｃｔｇｇａａｃＡａａｇａｃｔｃｔｔｃｔａｔｔ−（リン酸化））に変更した以外は、実施例２と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
多型検出用プローブを、配列番号１２に記載の塩基配列で示される３Ｔ-ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ-Ｆ２（ｔｃｔｇｇａａｃＡａａｇａｃｔｃｔｔｃ-(ＴＡＭＲＡ)）から、配列番号２７に記載の塩基配列で示される３Ｔ-ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ-Ｆ１（(ＴＡＭＲＡ)-ｃｔｇｇａａｃＡａａｇａｃｔｃｔｔｃｔａｔｔ−（リン酸化））に変更した以外は、実施例２と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
その結果、プローブの蛍光値の変化量を示す図４を得た。図４の（Ａ）は野生型の結果を示し、図４の（Ｂ）は変異型の結果を示し、図４（Ｃ）は混合型の結果を示す。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
Ｔｍ解析においては、温度が上昇することによって、プローブが解離し、蛍光値が上昇するため、ピークが凸型となって初めて正常な判定を行うことが可能となるものである。しかし、図４（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、３Ｔ-ＡＢＣＣ２-Ｃ-−２４Ｔ-ｍｔ-Ｆ１を多型検出用プローブとして用いた場合には、ピークの形状が凹型となるため、正常な判定を行うことができないことが明らかとなった。
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＡＢＣＣ２遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
Claims (12)
- 配列番号１２で示される塩基配列からなり３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドである、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ。
- 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するか又は増加する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
- 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ、該標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少する、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
- 前記多型検出用プローブが、融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
- 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いることにより、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
- （Ｉ）請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、請求項５に記載の多型検出方法。 - さらに、前記（Ｉ）の前または（Ｉ）と同時に核酸を増幅することを含む、請求項６に記載の多型検出方法。
- さらに、ＭＤＲ１遺伝子の多型検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型検出用プローブからなる群より選択される少なくとも１種のプローブを用いて、ＭＤＲ１遺伝子及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子からなる群より選択される少なくとも一方の多型を検出することを含む、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の多型検出方法。
- 請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出することと、
検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、
を含む、薬剤の薬効判定方法。 - 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含む、ＡＢＣＣ２遺伝子の多型を検出するための多型検出用試薬キット。
- さらに、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を増幅可能なプライマーを含む、請求項１０に記載の多型検出用試薬キット。
- さらにＭＤＲ１遺伝子の多型を検出するためのプローブ及びＣＹＰ３Ａ５遺伝子の多型を検出するためのプローブからなる群より選択される少なくとも１種以上の多型検出用プローブを含む、請求項１０又は請求項１１に記載の多型検出用試薬キット。
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