JPWO2011071046A1 - 疾患関連遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(P1)塩基長が11〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜230を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P1’)前記(P1)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P2)塩基長が15〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜234を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P2’)前記(P2)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P3)塩基長が17〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜236を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P3’)前記(P3)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
野生型1(WT) ggtggc
変異型2(c12−AGT) agtggc
3(c12−CGT) cgtggc
4(c12−TGT) tgtggc
5(c12−GAT) gatggc
6(c12−GCT) gctggc
7(c12−GTT) gttggc
8(c13−TGC) ggttgc
9(c13−GAC) ggtgac
10(c12−AAT) aatggc
11(c12−TTT) tttggc
12(c12−CTT) cttggc
13(c12−AGT c13−GAC) agtgac
本発明の多型検出用プローブは、前述のように、疾患関連遺伝子であるK−ras遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記(P1)、(P2)、(P3)、(P1’)、(P2’)および(P3’)の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
(P1)塩基長が11〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜230を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P1’)前記(P1)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P2)塩基長が15〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜234を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P2’)前記(P2)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P3)塩基長が17〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜236を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P3’)前記(P3)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
5'-cctacgymannagctccaactac-3' (配列番号3)
5'-cttgcctacgymannagctccaactac-3' (配列番号4)
5'-cttgcctacgymannagctccaactacca-3' (配列番号5)
5'-cttgcctacgymann-3' (配列番号29)
5'-ctcttgcctacgymannagctccaact-3' (配列番号6)
5'-cctacgccaccagctccaactac-3' (配列番号7)
5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3' (配列番号8)
5'-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3' (配列番号9)
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3' (配列番号10)
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaactTGCTGGCTACGC-3' (配列番号31)
5'-cttgcctacgtcacc-3' (配列番号30)
(P1’)塩基長が11〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜230を含む塩基配列からなり、前記塩基番号230の塩基を、3’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P2’)塩基長が15〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜234を含む塩基配列からなり、前記塩基番号234の塩基を、3’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P3’)塩基長が17〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜236を含む塩基配列からなり、前記塩基番号236の塩基を、3’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
本発明の多型検出方法は、前述のように、本発明のK−ras遺伝子の多型検出用プローブを用いて、K−ras遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出方法である。
(A)前記多型を検出する被検核酸と本発明の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(B)前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程
(X) 鋳型核酸から前記増幅物を生成する工程
F1
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3' (配列番号11)
F2
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3' (配列番号12)
F1−LP
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’ (配列番号32)
(Rプライマー)
R2
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3' (配列番号18)
R1−LP
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’ (配列番号33)
m=cまたはa
R3−LP
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’ (配列番号34)
R−WT
5'-ctcttgcctacgccacc-3' (配列番号13)
R−c12−XGT
5'-cactcttgcctacgccacD-3' (配列番号14)
D=t、gまたはa
R−c12−GXT
5'-gcactcttgcctacgccaD-3' (配列番号15)
D=t、gまたはa
R−c13−TGC
5'-caaggcactcttgcctacgcA-3' (配列番号16)
R−c13−GAC
5'-tcaaggcactcttgcctacgT-3' (配列番号17)
(P4)塩基長が9〜50塩基長であり、配列番号2における塩基番号229〜237を含む塩基配列からなり、前記塩基番号237を3’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P4’)前記(P4)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(BRAF用プローブ)
5'-ctagctacagwgaaatctc-3' (配列番号19)
5'-ctagctacagagaaatctc-3' (配列番号27)
5'-ctagctacagtgaaatctc-3' (配列番号28)
5'-gctacagwgaaatctc-3' (配列番号35)
5'-gctacagagaaatctc-3' (配列番号36)
5'-gctacagtgaaatctc-3' (配列番号37)
(P4’)塩基長が9〜50塩基長であり、配列番号2における塩基番号229〜237を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号237の塩基に相補的な塩基を5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
Fプライマー
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3' (配列番号20)
F3プライマー
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3' (配列番号38)
Rプライマー
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3' (配列番号21)
R5プライマー
5'-aaactgatgggacccactccat-3' (配列番号39)
本発明の多型検出用試薬は、本発明の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出用試薬である。本発明においては、前述の本発明の多型検出用プローブを含むことが特徴であって、その他の構成や条件は何ら制限されない。本発明の多型検出用試薬は、例えば、K−ras遺伝子の多型の検出に使用するプローブキットともいえる。
本例では、野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドの存在下、Tm解析を行い、K−ras遺伝子の多型を検出した。
5'-aacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
c12−TGT(配列番号23)
5'-aacttgtggtagttggagctTgtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
c12−GAT(配列番号24)
5'-aacttgtggtagttggagctgAtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
c13−GAC(配列番号25)
5'-aacttgtggtagttggagctggtgAcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
c12−AAT(配列番号26)
5'-aacttgtggtagttggagctAAtggcgtaggcaagagtgccttgacgata-3'
5'-(TAMRA)-cctacgccaccagctccaactac-P-3' (配列番号7)
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Tm解析を行い、K−ras遺伝子の多型を検出した。
F1プライマー(配列番号11)
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3'
R−WTプライマー(配列番号13)
5'-ctcttgcctacgccacc-3'
R−c12−XGT
5'-cactcttgcctacgccacD-3' (配列番号14)
D=t、gまたはa
R−c12−GXT
5'-gcactcttgcctacgccaD-3' (配列番号15)
D=t、gまたはa
5'-(TAMRA)-cctgcctacgccaccagctccaactac-P-3' (配列番号8)
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Tm解析を行い、K−ras遺伝子の多型を検出した。
R−WTプライマー(配列番号13)
5'-ctcttgcctacgccacc-3'
R−c13−TGCプライマー(配列番号16)
5'-caaggcactcttgcctacgca-3'
R−c13−GACプライマー(配列番号17)
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3'
5'-(TAMRA)-cctgcctacgccaccagctccaactacca-P-3' (配列番号9)
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Tm解析を行い、K−ras遺伝子およびBRAF遺伝子の多型を検出した。
(K−ras用プライマー)
F2プライマー
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3' (配列番号12)
R2プライマー
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3' (配列番号18)
(BRAF用プライマー)
Fプライマー
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3' (配列番号20)
Rプライマー
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3' (配列番号21)
(K−ras用プローブ)
5'-(BODIPY FL)-ctcttgcctacGCCACCagctccaact-P-3' (配列番号10)
(BRAF用プローブ)
5'-ctagctacagAgaaatctc-(TAMRA)-3' (配列番号27)
本例では、パラフィン包埋切片臨床検体から得たDNA抽出液について、Tm解析を行い、K−ras遺伝子およびBRAF遺伝子の多型を検出した。
(BRAF用プライマー)
F3プライマー
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3' (配列番号38)
R5プライマー
5'-aaactgatgggacccactccat-3' (配列番号39)
(BRAF用プローブ)
5'-gctacagAgaaatctc-(TAMRA)-3' (配列番号36)
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Tm解析を行い、K−ras遺伝子の多型を検出した。
F1−LPプライマー(配列番号32)
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’
R1−LPプライマー(配列番号33)
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’
m=cまたはa
5'-(BODIPY FL)-ctcttgcctacgccaccagctccaacttgctggctacgc-P-3' (配列番号31)
本例では、野生型プラスミドと、変異型プラスミドとの共存下で、Tm解析を行い、K−ras遺伝子の多型を検出した。プラスミド試料は、前記実施例6と同じプラスミド試料のWTとmt2〜9を使用した。
R3−LPプライマー(配列番号34)
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’
5'-(TAMRA)-cttgcctacgtcacc-P-3' (配列番号30)
Claims (37)
- 下記(P1)、(P2)、(P3)、(P1’)、(P2’)および(P3’)の少なくともいずれかのオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子であるK−ras遺伝子の多型検出用プローブ。
(P1)塩基長が11〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜230を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P1’)前記(P1)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P2)塩基長が15〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜234を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P2’)前記(P2)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
(P3)塩基長が17〜50塩基長であり、配列番号1における塩基番号220〜236を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなり、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基を、5’末端領域に有するオリゴヌクレオチド
(P3’)前記(P3)のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド - 前記配列番号1に示す塩基配列における220−225番目の塩基配列が、
ggtggc、agtggc、cgtggc、tgtggc、gatggc、gctggc、gttggc、ggttgc、ggtgac、aatggc、tttggc、cttggcおよびagtgacの少なくともいずれかである、請求項1に記載の多型検出用プローブ。 - 前記(P1)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基を、5’末端から数えて1〜4番目の位置に有し、
前記(P2)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基を、5’末端から数えて1〜4番目の位置に有し、
前記(P3)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基を、5’末端から数えて1〜4番目の位置に有する、請求項1に記載の多型検出用プローブ。 - 前記(P1)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基を、5’末端の位置に有し、
前記(P2)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基を、5’末端の位置に有し、
前記(P3)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基を、5’末端の位置に有する、請求項1に記載の多型検出用プローブ。 - 前記(P1)のオリゴヌクレオチドが、配列番号3で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記(P2)のオリゴヌクレオチドが、配列番号4、配列番号5または配列番号29で示されるオリゴヌクレオチドであり、
前記(P3)のオリゴヌクレオチドが、配列番号6で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の多型検出用プローブ。
5'-cctacgymannagctccaactac-3' (配列番号3)
5'-cttgcctacgymannagctccaactac-3' (配列番号4)
5'-cttgcctacgymannagctccaactacca-3' (配列番号5)
5'-cttgcctacgymann-3' (配列番号29)
5'-ctcttgcctacgymannagctccaact-3' (配列番号6) - 前記(P1)のオリゴヌクレオチドが、配列番号7で示されるオリゴヌクレオチドであり、前記(P2)のオリゴヌクレオチドが、配列番号8、配列番号9または配列番号30で示されるオリゴヌクレオチドであり、
前記(P3)のオリゴヌクレオチドが、配列番号10または配列番号31で示されるオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の多型検出用プローブ。
5'-cctacgccaccagctccaactac-3' (配列番号7)
5'-cttgcctacgccaccagctccaactac-3' (配列番号8)
5'-cttgcctacgccaccagctccaactacca-3' (配列番号9)
5'-cttgcctacgtcacc-3' (配列番号30)
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaact-3' (配列番号10)
5'-ctcttgcctacgccaccagctccaacttgctggctacgc-3' (配列番号31) - 前記プローブが、蛍光標識物質を有する標識プローブである、請求項1に記載の多型検出用プローブ。
- 前記(P1)のオリゴヌクレオチド、(P2)のオリゴヌクレオチドおよび(P3)のオリゴヌクレオチドが、5’末端領域に、前記蛍光標識物質を有し、前記(P1’)のオリゴヌクレオチド、(P2’)のオリゴヌクレオチドおよび(P3’)のオリゴヌクレオチドが、3’末端領域に、前記蛍光標識物質を有する、請求項7に記載の多型検出用プローブ。
- 前記(P1)のオリゴヌクレオチド、(P2)のオリゴヌクレオチドおよび(P3)のオリゴヌクレオチドが、5’末端から数えて1〜4番目の塩基の位置に、前記蛍光標識物質を有し、
前記(P1’)のオリゴヌクレオチド、(P2’)のオリゴヌクレオチドおよび(P3’)のオリゴヌクレオチドが、3’末端から数えて1〜4番目の塩基の位置に、前記蛍光標識物質を有する、請求項7に記載の多型検出用プローブ。 - 前記(P1)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号230の塩基に相補的な塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記(P1’)のオリゴヌクレオチドが、配列番号1における塩基番号230の塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記(P2)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号234の塩基に相補的な塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記(P2’)のオリゴヌクレオチドが、配列番号1における塩基番号234の塩基に、前記標識物質を有し、
前記(P3)のオリゴヌクレオチドが、前記塩基番号236の塩基に相補的な塩基に、前記蛍光標識物質を有し、
前記(P3’)のオリゴヌクレオチドが、配列番号1における塩基番号236の塩基に、前記蛍光標識物質を有する、請求項7に記載の多型検出用プローブ。 - 前記多型検出用プローブが、Tm解析用のプローブである、請求項1に記載の多型検出用プローブ。
- 請求項1に記載のK−ras遺伝子の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出用試薬。
- さらに、K−ras遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項12に記載の多型検出用試薬。
- 前記プライマーが、配列番号1の塩基配列における塩基番号220−225を含む領域を増幅するためのプライマーである、請求項13に記載の多型検出用試薬。
- 前記プライマーが、
配列番号11、配列番号12および配列番号32の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号13〜18、配列番号33および配列番号34の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項13に記載の多型検出用試薬。
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3' (配列番号11)
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3' (配列番号12)
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’ (配列番号32)
5'-ctcttgcctacgccacc-3' (配列番号13)
5'-cactcttgcctacgccacd-3' (配列番号14)
5'-gcactcttgcctacgccad-3' (配列番号15)
5'-caaggcactcttgcctacgca-3' (配列番号16)
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3' (配列番号17)
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3' (配列番号18)
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’ (配列番号33)
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’ (配列番号34) - 前記プライマーが、
配列番号13に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号14〜17の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項13に記載の多型検出用試薬。 - さらに、BRAF遺伝子の多型検出用プローブを含み、
前記プローブが、配列番号2における塩基番号229の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項12に記載の多型検出用試薬。 - 前記BRAF遺伝子の多型検出用プローブが、配列番号27および配列番号36の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブである、請求項17に記載の多型検出用試薬。
5'-ctagctacagagaaatctc-3' (配列番号27)
5'-gctacagagaaatctc-3' (配列番号36) - さらに、BRAF遺伝子における検出目的の多型を含む領域を増幅するためのプライマーを含む、請求項17に記載の多型検出用試薬。
- 前記プライマーが、配列番号2の塩基配列における塩基番号229番目の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーである、請求項19に記載の多型検出用試薬。
- 前記プライマーが、
配列番号20および配列番号38の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号21および配列番号39の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項20に記載の多型検出用試薬。
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3' (配列番号20)
5'-tgcttgctctgataggaaaatgagatctac-3' (配列番号38)
5'-acaactgttcaaactgatgggac-3' (配列番号21)
5'-aaactgatgggacccactccat-3' (配列番号39) - 請求項1に記載の多型検出用プローブを用いて、疾患関連遺伝子であるK−ras遺伝子の多型を検出する工程を含むことを特徴とする、疾患関連遺伝子の多型検出方法。
- 下記(A)工程および(B)工程を含む、請求項22に記載の多型検出方法。
(A)前記多型を検出する被検核酸と請求項1に記載の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(B)前記温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記被検核酸における前記多型を検出する工程 - 前記反応系が、二種類以上の前記多型検出用プローブを含み、前記二種類以上の多型検出用プローブが、それぞれ、異なる蛍光標識物質を有する、請求項23に記載の多型検出方法。
- 前記(A)工程において、前記被検核酸が、鋳型核酸からの増幅物である、請求項23に記載の多型検出方法。
- さらに、下記(X)工程を含む、請求項25に記載の多型検出方法。
(X) 鋳型核酸から増幅物を生成する工程 - 前記(X)工程が、前記多型検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記鋳型核酸から核酸増幅物を生成する工程であり、
前記(A)工程において、前記(X)工程における前記反応系の温度を変化させ、前記シグナル値の測定を行う、請求項26に記載の多型検出方法。 - 前記(X)工程が、配列番号1の塩基配列における塩基番号220−225を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項26に記載の多型検出方法。
- 前記プライマーが、
配列番号11、配列番号12および配列番号32の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号13〜18、配列番号33および配列番号34の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項28に記載の多型検出方法。
5'-accttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttc-3' (配列番号11)
5'-aaggcctgctgaaaatgactg-3' (配列番号12)
5'-ggtactggtggagtatttgatagtgt-3’ (配列番号32)
5'-ctcttgcctacgccacc-3' (配列番号13)
5'-cactcttgcctacgccacd-3' (配列番号14)
5'-gcactcttgcctacgccad-3' (配列番号15)
5'-caaggcactcttgcctacgca-3' (配列番号16)
5'-tcaaggcactcttgcctacgt-3' (配列番号17)
5'-ggtcctgcaccagtaatatgca-3' (配列番号18)
5'-gaattagctgtatcgtmaaggcactc-3’ (配列番号33)
5'-cacaaaatgattctgaattagctgtatcg-3’ (配列番号34) - 前記プライマーが、
配列番号13に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号14〜17の少なくともいずれかに示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項28に記載の多型検出方法。 - 前記疾患関連遺伝子であるBRAF遺伝子の多型を、同一の反応系で検出する、請求項22に記載の多型検出方法。
- 前記(A)工程が、
前記多型を検出する被検核酸と、請求項1に記載の多型検出用プローブおよびBRAF遺伝子の多型検出用プローブとを含む反応系の温度を変化させ、前記被検核酸と前記各多型検出用プローブとのハイブリッドの融解状態を示すシグナル値を測定する工程である、請求項31に記載の多型検出方法。 - 前記BRAF遺伝子の多型検出用プローブが、
配列番号2の塩基配列における塩基番号229の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドからなるプローブである、請求項32に記載の多型検出方法。 - 前記BRAF遺伝子の多型検出用プローブが、配列番号27および配列番号36の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブである、請求項33に記載の多型検出方法。
5'-ctagctacagagaaatctc-3' (配列番号27)
5'-gctacagagaaatctc-3' (配列番号36) - 請求項1に記載の多型検出用プローブおよび前記BRAF遺伝子の多型検出用プローブが、それぞれ、異なる標識物質を有する標識プローブである、請求項32に記載の多型検出方法。
- 前記(X)工程が、あわせて、配列番号2の塩基配列における塩基番号229の塩基を含む領域を増幅するためのプライマーを使用して、前記増幅物を生成する、請求項28に記載の多型検出方法。
- 前記プライマーが、
配列番号20および配列番号38の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマー、および、
配列番号21および配列番号39の少なくとも一方に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーの少なくとも一方である、請求項36に記載の多型検出方法。
5'-cctttacttactacacctcagatatat-3' (配列番号20)
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