JP2016077208A - Ｋｒａｓ遺伝子変異の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明が解決しようとする課題は、Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３における変異の有無を簡便・正確かつ迅速・安価に判別可能なキットおよび方法に関する。
【解決手段】特定のフォワードプライマー、リバースプライマー、および、プローブを用いる、Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３における変異の有無を検出するための方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、がん細胞のＫＲＡＳ遺伝子の変異の有無を検出するための試薬に関する。

ＫＲＡＳ遺伝子は、シグナル伝達経路で働くＧＴＰａｓｅをコードする遺伝子であり、細胞の増殖に関与する。ＫＲＡＳ遺伝子は、シグナル伝達経路において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）が出す細胞増殖シグナルを受け取り核に伝達する。
ＫＲＡＳ遺伝子の変異は膵膓癌の約９０％、大膓癌の約５０％、また非小細胞肺癌の約３０％で発生しており、その突然変異の８５％は、遺伝子上のｅｘｏｎ２のコドン１２、１３で発生している（非特許文献１）。

ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異は、抗癌薬、たとえば抗ＥＧＦＲ抗体薬などの分子標的薬に対する薬剤耐性と関連している。ＫＲＡＳ遺伝子に変異があると、ＥＧＦＲからのシグナルがなくても細胞増殖のシグナルを出し続けるので、前記分子標的薬等がＥＧＦＲに結合してその働きを阻害しても、下流にある変異したＫＲＡＳ遺伝子によって細胞増殖シグナルが出続け、がん細胞の増殖を抑制できない。
したがって、ＫＲＡＳ遺伝子変異の有無を明らかにすることは、がん疾患において、より効果的な治療法の選択などに極めて重用である。

遺伝子変異を検出する方法は、いくつか報告されており、例えばダイレクトシーケンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（特許文献１）リアルタイムＰＣＲ法、特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法などの解析方法がある。

特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション法では、ハイブリダイゼーション条件の調整が非常に繊細で、反応条件を厳しくコントロールする必要がある。ダイレクトシーケンス法は、ＰＣＲで増幅された領域全体の配列を観察できるが、癌組織のような正常細胞由来のＤＮＡが混入する場合には、変異を検出するために最低、１５〜２０％以上の腫瘍由来のＤＮＡが必要となり、解析に時間を要する。また、ＰＣＲ−ＲＥＬＰ法は、いくつかの処理があり手間がかかり、得られた増幅産物を扱うため、増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。

この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて簡便で正確性に優れたＫＲＡＳ遺伝子変異の検出方法が提案されている。この検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。

特開２００３−１３５０７２

ＳａｍｏｗｉｔｚＷＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．９：１１９３−７，２０００

ＫＲＡＳ遺伝子変異の検出は、抗ＥＧＦＲ抗体薬に対する薬剤耐性を解明する上で非常に重要な意義を持っている。そこで、本発明は、ＫＲＡＳ遺伝子について、コドン１２（配列番号１）の８３位のＧＧＴ塩基がＡＧＴ，ＣＧＴ，ＴＧＴ，ＧＡＴ，ＧＣＴまたはＧＴＴ塩基に変異した状態、コドン１３（配列番号１）の８６位のＧＧＣ塩基がＡＧＣ，ＣＧＣ，ＴＧＣ，ＧＡＣ，ＧＣＣまたはＧＴＣ塩基に変異した状態かの有無を簡便・正確かつ迅速・安価に判別可能なキットおよび方法の提供を目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＫＲＡＳ遺伝子の一部領域を特異的に増幅するための核酸プライマーおよび該核酸プライマーを用いた核酸増幅反応によって得られた増幅核酸を検出するための核酸プローブを含んだ冷蔵で保存が可能な試薬組成を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。

［項１］
以下の工程（１）〜（３）を含む、ＫＲＡＳ遺伝子の変異を検出する方法。
（１）フォワードプライマーが以下の（Ａ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｂ）の特徴を有する１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって試料中の被検核酸を増幅する工程
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の６２〜７０番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３７〜４２番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の５１〜６１番目を３´末端とし、該配列の２６〜３６番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる１種類の核酸プローブであって、以下の（Ｃ）に該当する核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（Ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１６７番目または１７０番目を３´末端とし、該配列の１４９番目または１５０番目を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
（３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
［項２］
項１に記載の方法において、さらに工程（３）のあとに以下の工程（４）を行う方法。
（４）工程（３）で測定または検出されるデータを解析することでＫＲＡＳ遺伝子の変異の有無を判別する工程
［項３］
核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３〜４のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列５〜７のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項１または２に記載の方法。
［項４］
核酸プローブが、配列番号８、９または１０で示される塩基配列を有する、項１から３のいずれかに記載の方法。
［項５］
核酸プライマーセットが項３に記載の核酸プライマーセットであり、核酸プローブが項４に記載の核酸プローブである、項１または２に記載の方法。
［項６］
前記試料が大腸、直腸等の組織、口腔粘膜擦過物、羊水、尿、パラフィン含埋組織、喀痰、組織切片、便、血液（全血）、血液培養液および胃液からなる群、および、前記の群に列挙されるもののうち任意のものを溶液で希釈したものの中から選択されたものである、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１から５のいずれかに記載の方法。
［項８］
１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ａ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｂ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の６２〜７０番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３７〜４２番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の５１〜６１番目を３´末端とし、該配列の２６〜３６番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
［項９］
フォワードプライマーが配列番号３〜４のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列５〜７のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項８に記載の核酸プライマーセット。
［項１０］
Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における突然変異を検出するための核酸プローブであって、配列番号２で示される塩基配列の１６７番目または１７０番目を３´末端とし、該配列の１４９番目または１５０番目を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
［項１１］
核酸プローブが、配列番号８、９または１０で示される塩基配列を有する、項１０に記載の核酸プローブ
［項１２］
核酸プライマーセットが項８または項９に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが項１０または項１１に記載の核酸プローブである、Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における突然変異を検出するためのプライマー・プローブのセット。
［項１３］
項１から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項８または項９に記載の核酸プライマーセットと、項１０または項１１に記載の核酸プローブとを含む組成物。
［項１４］
項１〜６のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項８または請求項９に記載の核酸プライマーセットと、項１０または項１１に記載の核酸プローブとを含むキット。

本発明によれば、Ｋｒａｓ遺伝子変異の有無を簡便、正確かつ迅速・安価に判別することが可能となる。

実施例1の結果を示す図である。 実施例１の結果を示す図である。 比較例１の結果を示す図である。 比較例１の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。 実施例２の結果を示す図である。

本発明は、Ｋｒａｓ遺伝子の変異の有無を判別するための核酸プライマー（プライマー）、核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いてＫｒａｓ遺伝子変異（コドン１２及び１３における変異）の有無を検出するための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。

Ｋｒａｓ遺伝子の部分配列を示したものが配列番号１であり、塩基番号８３〜８８がコドン１２，１３を示す。
また、配列番号２は配列番号１の相補的配列である。

核酸プライマーセット
本発明のＫｒａｓ遺伝子変異の検出方法において、Ｋｒａｓ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、１対の核酸プライマーからなり、かつ以下の（ｉ）の特徴を有する。
（ｉ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
上記の（ｉ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。

本明細書における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類（１配列）のフォワードプライマーと１種類（１配列）のリバースプライマーとで構成される。

［塩基配列の同一性］
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。

上記の核酸プライマーセットは、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２の８３位、および、コドン１３の８６位を含む部分領域を核酸増幅するために用いられるものであれば特に限定されず、上記（ｉ）の特徴を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーが以下の（Ａ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｂ）からなる。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の６２〜７０番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３７〜４２番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の５１〜６１番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の２６〜３６番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー

前記（Ａ）の核酸プライマーの塩基配列は、好ましくは配列番号１で示される塩基配列の６２番目または７０番目を３´末端とする塩基配列の核酸プライマーである。
また、前記（Ｂ）の核酸プライマーの塩基配列は、好ましくは配列番号２で示される塩基配列の５１番目、５３番目または６１番目を３´末端とする塩基配列の核酸プライマーである。

前記核酸プライマーセットを構成するそれぞれの核酸プライマーは、少なくとも３´末端から５番目までの核酸が配列番号１および配列番号２の両方と一致するように設計されている。従って、該核酸プライマーセットは配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部、および配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部の両方を核酸増幅することが可能になっている。

このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３〜４のいずれかで示される塩基配列、および、リバースプライマーとして配列番号５〜７のいずれかで示される塩基配列、の組合せが例示できる。

核酸プローブ
本発明で用いられる核酸プローブは、Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における変異の有無を検出するためのものであり、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。

そのような核酸プローブとして好ましくは（ｉｉ）の特徴を備えた核酸プローブが挙げられる。
（ｉｉ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
上記の（ｉｉ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％である。

前記核酸プローブの塩基配列は、前記（ｉｉ）を満たすものであれば特に制限されないが、好ましくは以下の（Ｃ）の特徴を備えた核酸プローブである。
（Ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１６７番目または１７０番目を３´末端とし、該配列の１４９番目または１５０番目を５´末端とする塩基配列の核酸プローブ
前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号２の共通配列の一部と同じ配列を有しており、配列番号１で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。

前記（Ｃ）の核酸プローブは、該核酸増幅産物と複合体を形成するのであれば、該核酸プローブ塩基配列の一部は配列番号１または２で示される塩基配列と異なっていてもよい。ただし、該核酸プローブの塩基配列が配列番号１または２と大きく異なる場合は該核酸プローブの特異性が低下し、該核酸増幅産物以外との複合体を形成しうる可能性が大きくなる。従って、該核酸プローブは配列番号１または配列番号２の一部塩基配列と８５％以上の相同性があることが好ましい。より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは１００％である。

このような核酸プローブとして、配列番号８、９、１０の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。

上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。

標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（モレキュラープローブ社製）、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。

本発明のＫｒａｓ遺伝子変異の検出方法
本発明のＫｒａｓ遺伝子変異の有無を判別する方法は、試料中のＫｒａｓ遺伝子のコドン１２，１３の変異を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。

該方法の一つの様態として、以下の（１）〜（３）の工程を含むＫｒａｓ遺伝子変異の有無を検出する方法が挙げられる。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。

本発明のＫｒａｓ遺伝子の変異有無を判別する方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。変異の有無が判別可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
例えば、上記の方法において、さらに工程（３）のあとに以下の工程（４）を行うことができる。
（４）工程（３）で測定または検出されるデータを解析することでＫＲＡＳ遺伝子の変異の有無を判別する工程

該方法で用いられるＫｒａｓ遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばＫｒａｓ遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。

被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。

前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる

前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、大腸、直腸等の組織、口腔粘膜擦過物、羊水、尿、パラフィン含埋組織、喀痰、組織切片、便、血液（全血）、血液培養液、胃液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。

続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。

［ＤＮＡポリメラーゼ］
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。

本発明プローブが含まれる反応系でＫｒａｓ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＫｒａｓ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＫｒａｓ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。

Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＫｒａｓ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。

他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。

通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。

さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。

核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のＫｒａｓ遺伝子変異検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。

核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。

前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。

核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。

融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。

本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のＫｒａｓ遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。

標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。

標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。

本発明のＫｒａｓ遺伝子変異の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。

得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。

前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。

また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。

ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。

そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。

被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。

具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。

Ｋｒａｓ遺伝子変異を検出するための組成物またはキット
本発明のＫｒａｓ遺伝子変異を検出するための組成物またはキットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記Ｋｒａｓ遺伝子の変異検出方法に用いることが出来る。前記組成物またはキットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。

本明細書で用いられる酵素の活性測定方法について、以下に記す。
ＤＮＡ合成活性
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。

その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ^〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ

３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

〔実施例１：Ｋｒａｓ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
以下に示す試料１、試料２および陰性コントロール（ＮＣ）を調製した。
試料１：コドン１３（配列番号１）の８６位のＧＧＣがＧＣＣに変異した変異型ｐｌａｓｍｉｄと野生型ｐｌａｓｍｉｄを３：７の割合で混合し１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０００（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
試料２：野生型ｐｌａｓｍｉｄを １０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０００（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
陰性コントロール（ＮＣ）：精製水
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロール（１μｌ）にそれぞれ下記試薬（７μｌ）を添加し、さらに精製水２μｌを添加して１０μｌとした。これに対して下記の条件により核酸増幅および融解曲線解析を行ってＫｒａｓ遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。

（試薬）
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３〜４のいずれか１本）０．２μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５、７のいずれか１本）０．４μＬ
１０μＭ オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号８、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
（試料）
試料１、試料２、精製水（ＮＣ）のいずれか一つ（１μｌ）

核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）

(結果)
図１は、フォワードプライマーが配列番号３、リバースプライマーが配列番号７、核酸プローブが配列番号８からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１において、試料１の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する２つのシグナルのピークを示している。また、試料２の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。図１より、試料１、試料２のＫｒａｓ遺伝子が検出されており、なおかつ変異の有無が判別できている。

また、図２は、フォワードプライマーとして配列番号４、リバースプライマーとして配列番号５の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。図２において、試料１の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する２つのシグナルのピークを示している。また、試料２の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。図２より明らかなように、試料１、試料２共にＫｒａｓ遺伝子が検出されている。図２より、試料１、試料２のＫｒａｓ遺伝子が検出されており、なおかつ変異の有無が判別できている。
以上から、いずれの組み合わせでもＫｒａｓ遺伝子変異（コドン１２及び１３における変異）の有無を検出できており、本発明のＫｒａｓ遺伝子検出用オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブはいずれもＫｒａｓ遺伝子変異の有無の検出に有効であることが示された。

〔比較例１：異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたＫｒａｓ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。ただし、用いた試薬、試料は下記のとおり。

（試薬）
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ 核酸プライマー（配列番号１１）０．２μｌ
１０μＭ 核酸プライマー（配列番号１２、１３のいずれか１本）０．４μｌ
１０μＭ 核酸プローブ（配列番号８）０．４μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
（試料）
試料１、試料２、精製水（ＮＣ）のいずれか一つ（１μｌ）

(結果)
図３は、フォワードプライマーが配列番号１１、リバースプライマーが配列番号１２、核酸プローブが配列番号８からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図３において、試料１の測定結果は野生型および変異型にそれぞれ由来する２つのシグナルのピークを示している。一方、試料２の測定結果は本来検出されるべき位置にシグナルのピークが得られていない。すなわち、図３の結果からは、試料１からは遺伝子を検出できているが、試料２からは野生型Ｋｒａｓ遺伝子が検出できていないことが明らかである。

また、図４は、フォワードプライマーとして配列番号１１、リバースプライマーとして配列番号１３の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。図４において、試料２の測定結果は野生型に由来する１つのシグナルのピークを示している。一方、試料１の測定結果は野生型に由来するシグナルのピークを示しているが、本来検出されるべき位置に変異型に由来するシグナルのピークが得られていない。すなわち、図４の結果からは、試料１と試料２の区別ができず、Ｋｒａｓ遺伝子変異の有無の検出できていないことが明らかである。

以上のことから、本発明以外の核酸プライマーおよび核酸プローブを用いると、本発明の検出方法と同様の方法を用いても、Ｋｒａｓ遺伝子変異の有無が検出できないことが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。

〔実施例２：Ｋｒａｓ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
以下に示す試料３〜１４、試料１５および陰性コントロール（ＮＣ）を調製した。
試料３〜１４：コドン１２（配列番号１）の８３位のＧＧＴ塩基がＡＧＴ，ＣＧＴ，ＴＧＴ，ＧＡＴ，ＧＣＴまたはＧＴＴ塩基に変異した状態、コドン１３（配列番号１）の８６位のＧＧＣ塩基がＡＧＣ，ＣＧＣ，ＴＧＣ，ＧＡＣ，ＧＣＣまたはＧＴＣ塩基に変異した状態であるそれぞれの変異型ｐｌａｓｍｉｄを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でそれぞれ２００（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
試料１５：野生型ｐｌａｓｍｉｄを １０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２００（コピー／μＬ）となるように調製したｐｌａｓｍｉｄ希釈液
陰性コントロール（ＮＣ）：精製水
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。ただし、用いた試薬、試料は下記のとおり。

（試薬）
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４）０．２μ Ｌ
１０μＭオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６）０．４μＬ
１０μＭオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号８、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μＬ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
（試料） 試料３〜１４、試料１５、精製水（ＮＣ）のいずれか一つ（１μｌ）

（結果）
図５、図６及び図７は、フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、核酸プローブが配列番号８からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図５、図６、図７より明らかなように、試料３〜１４の変異型Ｋｒａｓ遺伝子と試料１５の野生型Ｋｒａｓ遺伝子の区別が可能であり、Ｋｒａｓ遺伝子変異の有無が検出されている。

本発明は、がん細胞のＫＲＡＳ遺伝子の変異の有無の検出など、診断や医療などの分野に貢献する。

Claims (14)

1. 以下の工程（１）〜（３）を含む、ＫＲＡＳ遺伝子の変異を検出する方法。
   （１）フォワードプライマーが以下の（Ａ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｂ）の特徴を有する１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって試料中の被検核酸を増幅する工程
   （Ａ）配列番号１で示される塩基配列の６２〜７０番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３７〜４２番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
   （Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の５１〜６１番目を３´末端とし、該配列の２６〜３６番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
   （２）工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる１種類の核酸プローブであって、以下の（Ｃ）に該当する核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
   （Ｃ）配列番号２で示される塩基配列の１６７番目または１７０番目を３´末端とし、該配列の１４９番目または１５０番目を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
   （３）工程（２）で得られた複合体を検出する工程
2. 請求項１に記載の方法において、さらに工程（３）のあとに以下の工程（４）を行う方法。
   （４）工程（３）で測定または検出されるデータを解析することでＫＲＡＳ遺伝子の変異の有無を判別する工程
3. 核酸プライマーセットが、フォワードプライマーが配列番号３〜４のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列５〜７のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、請求項１または２に記載の方法。
4. 核酸プローブが、配列番号８、９または１０で示される塩基配列を有する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 核酸プライマーセットが請求項３に記載の核酸プライマーセットであり、核酸プローブが請求項４に記載の核酸プローブである、請求項１または請求項２に記載の方法。
6. 前記試料が大腸、直腸等の組織、口腔粘膜擦過物、羊水、尿、パラフィン含埋組織、喀痰、組織切片、便、血液（全血）、血液培養液および胃液からなる群、および、前記の群に列挙されるもののうち任意のものを溶液で希釈したものの中から選択されたものである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
8. １対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ａ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｂ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
   （Ａ）配列番号１で示される塩基配列の６２〜７０番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３７〜４２番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
   （Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の５１〜６１番目を３´末端とし、該配列の２６〜３６番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
9. フォワードプライマーが配列番号３〜４のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列５〜７のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、請求項８に記載の核酸プライマーセット。
10. Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における突然変異を検出するための核酸プローブであって、配列番号２で示される塩基配列の１６７番目または１７０番目を３´末端とし、該配列の１４９番目または１５０番目を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
11. 核酸プローブが、配列番号８、９または１０で示される塩基配列を有する、請求項１０に記載の核酸プローブ
12. 核酸プライマーセットが請求項８または請求項９に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが請求項１０または請求項１１に記載の核酸プローブである、Ｋｒａｓ遺伝子のコドン１２及び１３における突然変異を検出するためのプライマー・プローブのセット。
13. 請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、請求項８または請求項９に記載の核酸プライマーセットと、請求項１０または請求項１１に記載の核酸プローブとを含む組成物。
14. 請求項１〜６のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、請求項８または項９に記載の核酸プライマーセットと、請求項１０または請求項１１に記載の核酸プローブとを含むキット。