JP6343899B2 - 黄色ブドウ球菌の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、従来知られていなかった遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌を検出するための試薬に関する。
黄色ブドウ球菌は、常在菌であり、かつ血流感染、肺炎、髄膜炎など様々な感染症の原因菌である。特に血流感染の場合は様々な合併症を引き起こしうるため、早期にかつ正確に診断する方法が必要不可欠である。
通常、黄色ブドウ球菌の検査はグラム染色およびコアグラーゼ試験によって行われることが多い。これは、人から通常検出され、かつコアグラーゼ陽性であるブドウ球菌は黄色ブドウ球菌のみであるという知見に基づく。該方法は広く知られる検査法であるが、分離培養を行って得られたコロニーに対して行われるため、検査を行うにはまず菌の培養を行わなければならない。
これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌を検出することが可能である（非特許文献１）。核酸増幅検査では、例えば黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子（熱安定性ヌクレアーゼをコードしている遺伝子）をＰＣＲによって増幅し検出する方法が知られている（非特許文献２）。
核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も古典的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
この問題を解決する方法として、標的核酸と結合すると消光する特徴を有する蛍光色素標識プローブＱＰｒｏｂｅを用いて正確性に優れた黄色ブドウ球菌の遺伝子検出方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１に記載の検出方法では核酸増幅と核酸検出を連続して行えるため、核酸増幅後に反応系を開放する必要がなく、キャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができる。
German Medical Science, July, 2009, 7:Doc06
Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1654-1660
特許文献１ではｎｕｃ遺伝子を標的として検出する方法が提示されている。しかし、該方法はｎｕｃ遺伝子の塩基配列に変異が生じた場合、プライマーまたはプローブのミスマッチが生じてｎｕｃ遺伝子を検出できなくなる可能性があった。そして現実に、本発明者らは、特許文献１に記載の方法で検出できないタイプの黄色ブドウ球菌を発見した。
本発明が解決しようとする課題は、新たに発見された変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌を、通常の黄色ブドウ球菌と同様に検出するための方法および該方法を実施するための検出試薬に関する。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ｎｕｃ遺伝子の一部領域を特異的に増幅するための核酸プライマーおよび該核酸プライマーを用いた核酸増幅反応によって得られた増幅核酸を検出するための核酸プローブを含んだ冷蔵で保存が可能な試薬組成を見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下のような構成からなる。
[項１]
黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）〜（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有し、核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
［項２］
項１に記載の方法であって、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ´）および（Ｂ´）の特徴を有し、（２）の工程で用いられる核酸プローブが（Ｃ´）および（Ｄ´）の特徴を有する、方法。
（Ａ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
[項３]
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される項１または項２に記載の方法。
[項４]
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１〜３のいずれかに記載の方法。
[項５]
１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
[項６]
フォワードプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列９〜１１のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項５に記載の核酸プライマーセット。
[項７]
ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
[項８]
前記核酸プローブが、配列番号１２または１３で示される塩基配列を有する、項７に記載の核酸プローブ
[項９]
前記核酸プライマーセットが項５または項６に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが項７または項８に記載の核酸プローブである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
[項１０]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
[項１１]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブ、または、項１０に記載の組成物を含むキット。
黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）〜（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ）および（Ｂ）の特徴を有し、核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
［項２］
項１に記載の方法であって、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが（Ａ´）および（Ｂ´）の特徴を有し、（２）の工程で用いられる核酸プローブが（Ｃ´）および（Ｄ´）の特徴を有する、方法。
（Ａ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｂ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち一部または全部を増幅できる核酸プライマーセット
（Ｃ´）配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ´）配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
[項３]
前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される項１または項２に記載の方法。
[項４]
前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、項１〜３のいずれかに記載の方法。
[項５]
１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
[項６]
フォワードプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが塩基配列９〜１１のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、項５に記載の核酸プライマーセット。
[項７]
ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
[項８]
前記核酸プローブが、配列番号１２または１３で示される塩基配列を有する、項７に記載の核酸プローブ
[項９]
前記核酸プライマーセットが項５または項６に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが項７または項８に記載の核酸プローブである、項１〜４のいずれかに記載の方法。
[項１０]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
[項１１]
項１〜４および項９のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、項５または項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと項７または項８のいずれかに記載の核酸プローブ、または、項１０に記載の組成物を含むキット。
本発明によれば、通常の黄色ブドウ球菌の検出と、従来報告されていなかったｎｕｃ遺伝子変異を有する黄色ブドウ球菌の検出とを区別することなく、迅速、確実かつ簡便に行うことが可能となる。
本発明は、通常のｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、変異したｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出するための核酸プライマー（プライマー）、核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いて黄色ブドウ球菌を検出するための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。
本発明における通常のｎｕｃ遺伝子とは、ＮＣＢＩのアクセションＮｏ．ＢＸ５７１８５６のＲｅｇｉｏｎ８９５６６１〜８９６３４７に掲載された塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子を指す。該遺伝子の３０３位〜５４２位を示したものが配列番号１である。また、本発明における「変異したｎｕｃ遺伝子」とは、３０３位〜５４２位が配列番号２で示される塩基配列であるｎｕｃ遺伝子を指す。配列番号２の部分配列を有するｎｕｃ遺伝子をもつ黄色ブドウ球菌はこれまで報告がなく、今回初めて発見された塩基配列である。
また、配列番号３は配列番号１の相補的配列であり、配列番号４は配列番号２の相補的配列である。配列番号５はデータベースに登録されているｎｕｃ遺伝子全体の塩基配列である。
また、配列番号３は配列番号１の相補的配列であり、配列番号４は配列番号２の相補的配列である。配列番号５はデータベースに登録されているｎｕｃ遺伝子全体の塩基配列である。
核酸プライマーセット
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法において、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、１対の核酸プライマーからなり、かつ以下の（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有する。
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
上記の（Ａ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｂ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法において、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する核酸プライマーセットは、１対の核酸プライマーからなり、かつ以下の（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有する。
（Ａ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
（Ｂ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部または全部を核酸増幅することが可能な核酸プライマーセットである。
上記の（Ａ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｂ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
本明細書における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類（１配列）のフォワードプライマーと１種類（１配列）のリバースプライマーとで構成される。
［核酸配列の相同性］
本願明細書において、核酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用できる。
本願明細書において、核酸配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用できる。
上記の核酸プライマーセットは、（Ａ）および（Ｂ）の両方の特徴を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーが以下の（Ｅ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｆ）からなる。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３´末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３´末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プライマー
前記（Ｅ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目のいずれかの塩基であるならば、５´末端は配列番号１の５４番目〜６５番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号１の５６番目〜６２番目であり、より好ましくは５８番目〜６１番目である。
また、前記（Ｆ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号３で示される塩基配列の５９番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号３の３１番目〜４１番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号３の３２〜４０番目であり、より好ましくは３４〜３８番目である。
また、前記（Ｆ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号３で示される塩基配列の５９番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号３の３１番目〜４１番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号３の３２〜４０番目であり、より好ましくは３４〜３８番目である。
前記核酸プライマーセットを構成するそれぞれの核酸プライマーは、少なくとも３´末端から５番目までの核酸が配列番号１および配列番号２の両方と一致するように設計されている。従って、該核酸プライマーセットは配列番号１で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部、および配列番号２で示される塩基配列であるオリゴヌクレオチドの一部の両方を核酸増幅することが可能になっている。
このような核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列、および、リバースプライマーとして配列番号９〜１１のいずれかで示される塩基配列、の組合せが例示できる。
核酸プローブ
本発明で用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
本発明で用いられる核酸プローブは、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
そのような核酸プローブとして好ましくは（Ｃ）および（Ｄ）の両方の特徴を備えた核酸プローブが挙げられる。
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
上記の（Ｃ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｄ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、前記核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
上記の（Ｃ）において、配列番号１との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。同様に、上記の（Ｄ）において、配列番号２との同一性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
前記核酸プローブの塩基配列は、前記（Ｃ）（Ｄ）を満たすものであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３´末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列の核酸プローブである。前記塩基配列の核酸プローブは、配列番号１および２の共通配列の一部と同じ配列を有しており、１と２のいずれの配列番号で示される塩基配列を含む核酸増幅産物とも複合体を形成することができる。
このような核酸プローブとして、配列番号１２、１３の塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法は、試料中の黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法
本発明の黄色ブドウ球菌の検出方法は、試料中の黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
該方法の一つの様態として、以下の（１）〜（３）の工程を含む黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法が挙げられる。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。ｎｕｃ遺伝子の検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
該方法で用いられるｎｕｃ遺伝子を増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばｎｕｃ遺伝子とは異なる遺伝子を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料、カテーテル洗浄液、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。これらの試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、組織切片、血液（全血）などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
本発明プローブが含まれる反応系でｎｕｃ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のｎｕｃ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にｎｕｃ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるｎｕｃ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
ＤＮＡ合成活性
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
本発明のｎｕｃ遺伝子検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
本発明のｎｕｃ遺伝子の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
ｎｕｃ遺伝子検出キット
本発明のｎｕｃ遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記ｎｕｃ遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
本発明のｎｕｃ遺伝子検出キットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記ｎｕｃ遺伝子検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：ｎｕｃ遺伝子のシークエンス解析〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００００（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁したコロニー液を試料とした。前者を試料１、後者を試料２とした。
（２）核酸増幅およびシークエンス
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｎｕｃ遺伝子をＰＣＲによって核酸増幅した。この核酸増幅産物をＰＣＲで使用した核酸プライマーを用いてシークエンス解析し、塩基配列を解読した。
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００００（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁したコロニー液を試料とした。前者を試料１、後者を試料２とした。
（２）核酸増幅およびシークエンス
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｎｕｃ遺伝子をＰＣＲによって核酸増幅した。この核酸増幅産物をＰＣＲで使用した核酸プライマーを用いてシークエンス解析し、塩基配列を解読した。
核酸増幅用試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１４）１．０μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１５）１．０μｌ
１０×ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２（東洋紡）２．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ０．５μｌ
試料 ２μｌ
精製水 １４μｌ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１４）１．０μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１５）１．０μｌ
１０×ＫＯＤ Ｐｌｕｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｖｅｒ．２（東洋紡）２．５μｌ
２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ １．５μｌ
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ０．５μｌ
試料 ２μｌ
精製水 １４μｌ
核酸増幅
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９８℃・１０秒
６０℃・３０秒
６８℃・２０秒
（以上３５サイクル）
６８℃・１分
（以上１サイクル）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９８℃・１０秒
６０℃・３０秒
６８℃・２０秒
（以上３５サイクル）
６８℃・１分
（以上１サイクル）
結果
シークエンス解析の結果、試料１からは配列番号１の塩基配列が、試料２からは配列番号２の塩基配列が得られ、両者でｎｕｃ遺伝子の塩基配列が大きく異なることが明らかになった。
シークエンス解析の結果、試料１からは配列番号１の塩基配列が、試料２からは配列番号２の塩基配列が得られ、両者でｎｕｃ遺伝子の塩基配列が大きく異なることが明らかになった。
〔実施例２：本発明プライマー・プローブによるｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、それをＴｒｉｓ前記緩衝液で１０倍希釈したコロニー希釈液を試料とした。前者を試料３、後者を試料４とした。試料３は配列番号１からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有しており、試料４は配列番号２からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有している。また、陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ ＡＵＲＥＵＳ （ｍｅｃＡ＋） ＤＮＡ ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５０（コピー／μｌ）に調製したＤＮＡ希釈液、および分離培養された黄色ブドウ球菌のコロニーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、それをＴｒｉｓ前記緩衝液で１０倍希釈したコロニー希釈液を試料とした。前者を試料３、後者を試料４とした。試料３は配列番号１からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有しており、試料４は配列番号２からなる塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有している。また、陰性コントロール（ＮＣ）として精製水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号６、７、８のいずれか一つ）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１０）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１２、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号６、７、８のいずれか一つ）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１０）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１２、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
結果
図１は、フォワードプライマーが配列番号６、リバースプライマーが配列番号１０、核酸プローブが配列番号１２からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、試料３（Ｆ６,試料３）と試料４（Ｆ６,試料４）の両方からｎｕｃ遺伝子が検出されている。また、図２、図３は、フォワードプライマーとしてそれぞれ配列番号７、８の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、リバースプライマーと核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも，試料３と試料４の両方が検出されていることが明らかである。
以上から、本発明の核酸プライマーは配列番号１および配列番号２のいずれの一部領域も核酸増幅可能であり、本発明の核酸プローブは配列番号１および配列番号２由来の核酸増幅産物の両方を検出できることが示され、また、本発明の方法は、配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法であることが示された。
図１は、フォワードプライマーが配列番号６、リバースプライマーが配列番号１０、核酸プローブが配列番号１２からなる核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、試料３（Ｆ６,試料３）と試料４（Ｆ６,試料４）の両方からｎｕｃ遺伝子が検出されている。また、図２、図３は、フォワードプライマーとしてそれぞれ配列番号７、８の塩基配列からなる核酸プライマーを用い、リバースプライマーと核酸プローブは上記と同じものを用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも，試料３と試料４の両方が検出されていることが明らかである。
以上から、本発明の核酸プライマーは配列番号１および配列番号２のいずれの一部領域も核酸増幅可能であり、本発明の核酸プローブは配列番号１および配列番号２由来の核酸増幅産物の両方を検出できることが示され、また、本発明の方法は、配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法であることが示された。
〔比較例１：異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表３に記載した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号１６）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１７）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１８、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
結果
図４は上記試薬組成で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４から、試料３からはｎｕｃ遺伝子を検出できているが（比較 試料３）、試料４はＮＣと同様の結果が得られており（比較 試料４、比較 ＮＣ）、試料４からのｎｕｃ遺伝子検出はできていないことが明らかである。
従って、異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いると、本発明の検出方法と同様の方法を用いても、本発明のように配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法には成りえないことが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表３に記載した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号１６）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１７）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１８、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料 試料３、試料４、精製水のいずれか一つ（１μｌ）
精製水２．２５μｌ
結果
図４は上記試薬組成で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４から、試料３からはｎｕｃ遺伝子を検出できているが（比較 試料３）、試料４はＮＣと同様の結果が得られており（比較 試料４、比較 ＮＣ）、試料４からのｎｕｃ遺伝子検出はできていないことが明らかである。
従って、異なる核酸プライマーおよび核酸プローブを用いると、本発明の検出方法と同様の方法を用いても、本発明のように配列番号１を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子および配列番号２を含む塩基配列を有するｎｕｃ遺伝子の両方を検出できる方法には成りえないことが示された。以上から、本発明で規定した特徴を有する核酸プライマーセットおよび核酸プローブを用いて、本発明の検出方法を実施することが重要であることが示された。
本発明を黄色ブドウ球菌の遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に黄色ブドウ球菌を検出することができる。さらに、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌と、配列番号２と９５％以上相同な塩基配列を含むｎｕｃ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌の両方を検出できる検出方法、検出試薬を提供できる。
Claims (11)
- 試料中の黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出する方法であって、該方法は以下の工程（１）〜（３）からなる方法であり、該方法の（１）の工程で用いられる核酸プライマーセットが、以下の（Ｅ）の特徴を有するフォワードプライマーと以下の（Ｆ）の特徴を有するリバースプライマーとで構成され、該方法の（２）で用いられる核酸プローブが（Ｃ）および（Ｄ）の特徴を有する方法。
（１）１対の核酸プライマーセットを含む反応液によって被検核酸を増幅する工程
（２）（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる核酸プローブとをハイブリダイズさせ、複合体を形成せしめる工程
（３）（２）で得られた複合体を検出する工程
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３’末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３’末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｃ）配列番号１と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ
（Ｄ）配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列であるオリゴヌクレオチドのうち、該核酸プライマーセットによって増幅された領域と複合体を形成できる核酸プローブ - 前記核酸プローブが、配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３’末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列を有する核酸プローブである、請求項１に記載の方法。
- 前記試料が全血、血液培養液、膿、髄液、胸水、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、喀痰、カテーテル洗浄液、組織切片、およびこれらを適当な溶液で希釈したもの、のいずれかから選択される請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記核酸プローブの少なくとも一方の末端が蛍光標識されており、かつ、前記核酸プローブの蛍光標識されている核酸の塩基はシトシンである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 試料中の黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子を検出するための１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、フォワードプライマーが以下の（Ｅ）の特徴を有し、リバースプライマーが以下の（Ｆ）の特徴を有する、核酸プライマーセット。
（Ｅ）配列番号１で示される塩基配列の８３番目または８４番目を３’末端とし、該配列の５４番目〜６５番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列の核酸プライマー
（Ｆ）配列番号３で示される塩基配列の５９番目を３’末端とし、該配列の３１〜４１番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列の核酸プライマー - フォワードプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーであり、リバースプライマーが配列番号９〜１１のいずれかで示される塩基配列の核酸プライマーである、請求項５に記載の核酸プライマーセット。
- ｎｕｃ遺伝子の一部領域を検出するための核酸プローブであって、配列番号３で示される塩基配列の１３７番目を３’末端とし、該配列の１１８番目〜１２３番目の任意の塩基を５’末端とする塩基配列を有する核酸プローブ。
- 前記核酸プローブが、配列番号１２または１３で示される塩基配列を有する、請求項７に記載の核酸プローブ。
- 前記核酸プライマーセットが請求項６に記載の核酸プライマーセットであり、前記核酸プローブが請求項８に記載の核酸プローブである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 請求項１〜４および請求項９のうちいずれかに記載の方法を実施するための組成物であって、請求項５または請求項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと、請求項７または請求項８のいずれかに記載の核酸プローブとを含む組成物。
- 請求項１〜４および請求項９のうちいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、請求項５または請求項６のいずれかに記載の核酸プライマーセットと請求項７または請求項８のいずれかに記載の核酸プローブ、または、請求項１０に記載の組成物を含むキット。
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013210943A JP6343899B2 (ja) | 2013-10-08 | 2013-10-08 | 黄色ブドウ球菌の検出方法 |
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