JP7025342B2 - 標的塩基配列を検出する方法、プローブを設計および製造する方法ならびにキット - Google Patents
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Description
[1]核酸試料から、塩基変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列(A)を検出する方法であって、該方法は、以下のステップ:
(1)核酸試料に、QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素で標識された検出プローブと、競合プローブとを加えて、反応試料を得ること、これによって、反応試料中の標的塩基配列(A)を有する標的核酸に、蛍光標識検出プローブまたは競合プローブがハイブリダイズする;
(2)反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;および
(3)(2)の測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を一次微分すること
を含み、ここで、
(i)蛍光標識検出プローブの塩基配列は、標的塩基配列(A)に相補的な塩基配列(A’)を含み、
(ii)競合プローブの塩基配列は、塩基変異ヌクレオチドが塩基未変異ヌクレオチドに置き換わっている以外は標的塩基配列(A)と同じ塩基配列である非標的塩基配列(B)に相補的な塩基配列(B’)を含み、
(iii)蛍光標識検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列ならびに核酸試料への添加量は、以下の手順:
(a)標的核酸は含まれているが、非標的塩基配列(B)を有する非標的核酸は実質的に含まれていない対照標的核酸試料、および、標的核酸は実質的に含まれないが、非標的核酸は含まれている対照非標的核酸試料の夫々に、蛍光標識検出プローブと競合プローブとを加えて、対照標的反応試料および対照非標的反応試料を得ること;
(b)各対照反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;ならびに
(c)測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を夫々、一次微分すること
に従うと、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを実質的に有さないように、決定されている、前記方法。
(4)(3)で得られた一次微分曲線がピークを有する場合、核酸試料中に標的塩基配列(A)が存在すると判断すること
を含み、ここで核酸試料が、標的核酸の外に、非標的核酸をも含んでいてもよい、[1]に記載の方法。
[3]非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より少なくとも5℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より低い、[1]または[2]に記載の方法。
[5]非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より少なくとも10℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値+5℃を超えない、[1]または[2]に記載の方法。
[6]非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より少なくとも15℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値+5℃を超えない、[1]または[2]に記載の方法。
[8](I)標的核酸上の、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域が、競合プローブとハイブリダイズする領域を含むか;(II)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域を含むか;または、(III)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域と一致する、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[10]核酸試料への競合プローブの添加量が、蛍光標識検出プローブの添加量の少なくとも20倍(モル比)である、[1]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素が、TAMRA(商標)、BODIPY(登録商標) FL、PACIFIC BLUE(商標)およびCR6G(登録商標)からなる群から選択される少なくとも1種の蛍光色素である、[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
[13]塩基変異ヌクレオチドが、一塩基置換の変異を含むDNAである、[1]~[12]のいずれかに記載の方法。
[14][1]~[13]のいずれかに記載の方法に使用可能な蛍光標識検出プローブおよび競合プローブを設計する方法であって、該方法は、
(1’)(a)~(c)に従い、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを実質的に有さないように、蛍光標識検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列を決定すること
を含む、前記方法。
(1”)[14]に記載の方法に従って設計された、夫々の塩基長および塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成すること;および
(2”)蛍光標識検出プローブのオリゴヌクレオチドを、QP法に使用可能な蛍光色素で標識すること
を含む、前記方法。
[16][1]~[13]のいずれかに記載の方法において用いられるためのキットであって、蛍光標識検出プローブ、競合プローブおよび使用説明書を含む、前記キット。
なお、本明細書において、用語SNPは、当該技術分野におけるSNPsと同義で用いる。また、本明細書において、用語SNPが用いられて説明されている事項については、基本的には、「SNP」を「一塩基置換の変異を含むDNA」に置き換えたとしても、同様の説明が成り立つ。つまり、以下の説明において、SNPは検出の対象の一例であり、本発明は、一塩基置換の変異を含むDNAを検出する技術に広く適用され得る。
本明細書中に別記のない限り、本発明に関して用いられる科学的および技術的用語は、当業者に通常理解されている意味を有するものとする。一般的に、本明細書中に記載された分子生物学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸化学に関して用いられる用語およびその技術は、当該技術分野においてよく知られ、通常用いられているものとする。本明細書中に参照される全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明に係る検出方法は、以下のステップ(1)~(3)を少なくとも含む、核酸試料から、塩基変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列(A)を検出する方法である。
(1)核酸試料に、蛍光標識検出プローブと、競合プローブとを加えて、反応試料を得ること、これによって、反応試料中の標的塩基配列を有する標的核酸に、蛍光標識検出プローブまたは競合プローブがハイブリダイズする;
(2)反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;および
(3)(2)の測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を一次微分すること。
核酸は、DNAまたはRNAであれば特に限定されず、天然のものであっても合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、例えば、生物から回収されたゲノムDNA、mRNA、rRNA、ヘテロ核(hn)RNA等がある。また、合成された核酸として、例えば、β-シアノエチルホスフォロアミダイト法、DNA固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたDNAや、PCR等の公知の核酸合成法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたcDNA等がある。
本明細書において、標的塩基配列を含む塩基配列を有する核酸を、「標的核酸」という。
なお、核酸試料中に含有される核酸が、二本鎖核酸である場合、あらかじめ一本鎖核酸にしておくことが好ましい。一本鎖核酸を用いることにより、後述するステップ(1)において、該一本鎖核酸に、検出プローブまたは競合プローブをハイブリダイズさせることができる。抽出された二本鎖核酸の一本鎖化は、熱エネルギーを加える等の公知の手法により行うことができる。
「ハイブリダイズ」とは、一本鎖核酸同士が(例えば熱処理により一本鎖化した検出対象のDNAとプローブとが)相補的な塩基対を形成して結合し二本鎖となることをいう。本明細書において、「ハイブリダイズ」には、一方の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列がハイブリダイズする場合、および、一方の塩基配列と他方の塩基配列との間で、例えば1~数塩基対、相補的な塩基対を形成できない部分(ミスマッチの部分)があっても、相補性を有する部分同士で塩基対を形成することで配列全体としてはハイブリダイズする場合が、含まれる。本明細書においては、一方の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列がハイブリダイズすることを「完全マッチのハイブリダイズ」「特異的にハイブリダイズする」と表現し、ミスマッチを含む場合を「ミスマッチのハイブリダイズ」「非特異的にハイブリダイズする」と表現することがある。
典型的には、かかる相違部位は、SNPにおける変異部位であり、「塩基変異ヌクレオチド」および「塩基未変異ヌクレオチド」は、夫々1つのヌクレオチドである。しかし、例えば、塩基変異が1塩基の欠失変異である場合、欠失部位を挟んだ連続する2塩基を「塩基変異ヌクレオチド」とし、欠失を含まない連続する3塩基を「塩基未変異ヌクレオチド」として本発明を適用することも可能である。また、例えば、塩基変異が1塩基の挿入変異である場合、挿入されたヌクレオチドとその両隣に連続するヌクレオチドの合計3塩基を「塩基変異ヌクレオチド」とし、挿入を含まない連続する2塩基を「塩基未変異ヌクレオチド」として本発明を適用することも可能である。欠失塩基数または挿入塩基数が2塩基以上であってもよい。すなわち、本願に添付の特許請求の範囲における「塩基変異ヌクレオチドが塩基未変異ヌクレオチドに置き換わっている」という記載は、「塩基変異ヌクレオチド」および「塩基未変異ヌクレオチド」が夫々連続する数個のヌクレオチドであるような場合も包含する。
本明細書中において、この非標的塩基配列を含む塩基配列を有する核酸を、「非標的核酸」という。
ここで、ヌクレオチドアナログとは、非天然のヌクレオチドであり、天然のヌクレオチドであるデオキシリボヌクレオチド(DNA)やリボヌクレオチド(RNA)と同様の機能を有するものをいう。すなわち、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同様にリン酸ジエステル結合により鎖を形成することができ、かつ、ヌクレオチドアナログを用いて形成されたプライマーやプローブは、ヌクレオチドのみを用いて形成されたプライマーやプローブと同様に、PCRやハイブリダイズに用いることができる。このようなヌクレオチドアナログとして、例えば、PNA(ポリアミドヌクレオチド誘導体)、LNA(BNA)、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、およびこれらの複合体等がある。ここで、PNAは、DNAやRNAのリン酸と5炭糖からなる主鎖をポリアミド鎖に置換したものである。また、LNA(BNA)は、リボヌクレオシドの2’部位の酸素原子と4’部位の炭素原子がメチレンを介して結合している2つの環状構造を持つ化合物である。
ここで、修飾体としては、たとえば、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾ホスフェート-糖-骨格オリゴヌクレオチド、修飾PNA、修飾LNA(BNA)、修飾ENA等がある。ここで、ヌクレオチドやヌクレオチドアナログの修飾に用いられる物質は、本発明の効果を損なわない限り、特に限定されるものではなく、ヌクレオチド等の修飾に通常用いられる物質を用いることができる。修飾ヌクレオチドや修飾ヌクレオチドアナログとして、たとえば、アミノ基、カルボキシビニル基、リン酸基、メチル基等の官能基により修飾されたヌクレオチド等、メチル基により2-O-メチル化修飾されたヌクレオチド等、ホスホロチオエート化修飾されたヌクレオチド等、後述する蛍光色素等の標識分子により修飾されたヌクレオチド等がある。
QP法に使用可能な蛍光色素としては、例えば、TAMRA(商標)(インビトロジェン社製)、BODIPY(登録商標) FL(インビトロジェン社製)、PACFIC BLUE(商標)(インビトロジェン社製)、CR6G(登録商標)(インビトロジェン社製)等が挙げられる。各蛍光色素の検出プローブへの標識は、有機合成方法等の通常用いられる方法により行うことができる。
以下、検出プローブを、「蛍光標識検出プローブ」ともいう。
「蛍光標識検出プローブの塩基配列」が「標的塩基配列に相補的な塩基配列を含む」ことは、蛍光標識検出プローブの塩基配列(A’)が標的塩基配列(A)に相補的である場合と、蛍光標識検出プローブの塩基配列(A’)が、標的核酸上の標的塩基配列(A)を含み標的塩基配列(A)よりも長い領域の塩基配列に相補的である場合とを包含する。
「競合プローブの塩基配列」が「非標的塩基配列に相補的な塩基配列を含む」ことは、競合プローブの塩基配列(B’)が非標的塩基配列(B)に相補的である場合と、競合プローブの塩基配列(B’)が、非標的核酸上の非標的塩基配列(B)を含み非標的塩基配列(B)よりも長い領域の塩基配列に相補的である場合とを包含する。
まず、ステップ(1)において、反応試料中の標的塩基配列を有する標的核酸に、蛍光標識検出プローブまたは競合プローブをハイブリダイズさせる。蛍光標識検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列ならびに核酸試料への添加量は、所定の条件を満たすように決定されているが、その条件については後述する。標的核酸と、蛍光標識検出プローブと、競合プローブとのハイブリダイズの反応条件は、特に限定されるものではなく、蛍光標識検出プローブおよび競合プローブのTm値等を考慮した上で、通常の温度、pH、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができる。
Tm=2×(配列中のAの数+配列中のTの数)+4×(配列中のGの数+配列中のCの数)
また、より正確性を期すために、Tm値は、例えば、従来公知のMELTCALCソフトウェア(http:/www.meltcalc.com/)等により算出でき、隣接法(Nearest Neighbor Method)によって決定することもできる。
(a)標的核酸は含まれているが、非標的塩基配列(B)を有する非標的核酸は実質的に含まれていない対照標的核酸試料、および、標的核酸は実質的に含まれないが、非標的核酸は含まれている対照非標的核酸試料の夫々に、蛍光標識検出プローブと競合プローブとを加えて、対照標的反応試料および対照非標的反応試料を得ること;
(b)各対照反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;ならびに
(c)測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を夫々、一次微分すること
に従うと、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを実質的に有さなくなる、という機能的な条件を満たすように決定されている。
非標的核酸または標的核酸が「実質的に」含まれないことは、試料中に当該非標的核酸または標的核酸が全く含まれない場合に加えて、当該非標的核酸または標的核酸が検出されない程度に少量しか含まれない場合も意味する。「対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを実質的に有さなくなる」とは、例えば、厳密には、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを有していても、そのピークの強度(蛍光強度の最大の振れ幅)が、対照標的反応試料の一次微分曲線のピークの強度と比較して大幅に弱くなり(平坦化し)、対照標的反応試料の一次微分曲線のようなピークの形状を有さなくなる場合を含んでもよい。
蛍光標識検出プローブ/競合プローブとのモル比にも依るが、非標的核酸に対する競合プローブのTm値と蛍光標識検出プローブのTm値との差が、少なくとも5℃であると、蛍光標識検出プローブと非標的核酸とのミスマッチのハイブリダイズによるピークが抑制され易い傾向にある。また、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より低いと、標的核酸に対する蛍光標識検出プローブのハイブリダイズがし易くなり、標的核酸を検出する際、一次微分曲線のピークがより鋭くなる傾向にある。
なお、非標的核酸に対する競合プローブのTm値と蛍光標識検出プローブのTm値との差、および標的核酸に対する競合プローブのTm値と蛍光標識検出プローブのTm値との差は、相互に関連して変動し、独立に設定することはできない。このため、標的とする配列によっては、上記の好適なTm値条件の組み合わせを満たせない場合があり得る。例えば、非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より、少なくとも10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃または20℃高いとき、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より低くならない場合があり得る。標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より高くなると、標的核酸に対する蛍光標識検出プローブのハイブリダイズが競合プローブに妨げられ易くなり、その結果、標的核酸を検出する際の一次微分曲線のピークが減衰する傾向が生じる。しかし、かかる場合もまた、蛍光標識検出プローブと非標的核酸とのミスマッチのハイブリダイズによるピークが十分に抑制(平坦化)されてピークの有無が視覚的に判断できるのであれば、本発明の効果が達成されるので、好適といえる。例えば、非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、蛍光標識検出プローブのTm値より、少なくとも10℃、好ましくは11℃、12℃、13℃、14℃、さらに好ましくは15℃、16℃、17℃、18℃、19℃または20℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのTm値+5℃を超えない、好ましくは、蛍光標識プローブのTm値+4℃、蛍光標識プローブのTm値+3℃、蛍光標識プローブのTm値+2℃、蛍光標識プローブのTm値+1℃または蛍光標識プローブのTm値を超えない場合も、好適であり得ることが見出されている(具体的には、以下の実施例3の、競合プローブとして「RB516A-3-P-8」を使用した例を参照)。
検出すべき標的核酸の配列それ自体や、検出・競合プローブが該配列のどの領域をカバーするかにも依るが、一般に、非標的核酸に対する競合プローブのTm値と蛍光標識検出プローブのTm値との差が大きくなるほど、競合プローブ/蛍光標識プローブの添加量(モル比)は小さくなる傾向にある。当業者は、標的核酸の配列を元に、プローブのかかるTm値の差と添加量とを、本発明に係る手順に基づき、ルーチンな実験で容易に決定することができる。
(I)標的核酸上の、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域が、競合プローブとハイブリダイズする領域を含むか;
(II)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域を含むか;または、
(III)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域と一致することを含めてもよい。
なお、この(I)~(III)でいう「ハイブリダイズ」は、完全マッチのハイブリダイズもミスマッチのハイブリダイズも含む。(I)または(II)の場合には、蛍光標識検出プローブとハイブリダイズする領域および競合プローブとハイブリダイズする領域のうち、いずれか狭いほうの領域が、標的塩基配列に相当する。(III)の場合には、蛍光標識検出プローブと競合プローブとが、ともに標的塩基配列と同じ塩基長を有し、完全に一致した領域で互いに競合してハイブリダイズし得る。
これにより、本発明に係る検出方法では、温度-蛍光強度曲線の一次微分曲線のピークの有無に基づいて、標的塩基配列の有無を明確に判別することができる。さらに、本発明に係る検出方法では、Tm値に影響を与える要因である反応液中の塩濃度がある程度変化しても、判別能に影響が生じにくく、安定して正確な検出結果を得ることができるという利点がある。
(4)(3)で得られた一次微分曲線がピークを有する場合、核酸試料中に標的塩基配列(A)が存在すると判断すること
を含んでもよい。ここで核酸試料が、標的核酸の外に、非標的核酸をも含んでいてもよい。かかるステップ(4)では、ステップ(1)~(3)で得られた温度-蛍光強度曲線の一次微分曲線が、ピークを有する形状であるか、ピークを実質的に有さない形状であるかによって、標的塩基配列(A)の有無を容易に判断することができる。ここで核酸試料が、標的核酸の外に、非標的核酸をも含んでいてもよいということは、この方法により、例えば遺伝子診断等において、対立遺伝子のヘテロ接合体に含まれる標的塩基配列の存在の有無をも容易に判断することができるということである。
本発明は、上記の検出方法に使用可能な蛍光標識検出プローブおよび競合プローブを設計する方法を提供することもできる。該方法は、
(1’)(a)~(c)に従い、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを実質的に有さないように、蛍光標識検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列を決定すること
を含む。
このようなプローブの設計方法により、SNPの1塩基の違いを高精度で検出し、温度-蛍光強度曲線の一次微分曲線のピークの有無によって標的塩基配列の有無を容易に判断することが可能となるようなプローブセットを実現することができる。
また、本発明は、上記の検出方法に使用可能な蛍光標識検出プローブおよび競合プローブを製造する方法を提供することもできる。該方法は、
(1”)上記のプローブの設計方法の方法に従って設計された、夫々の塩基長および塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成すること;および
(2”)蛍光標識検出プローブのオリゴヌクレオチドを、QP法に使用可能な蛍光色素で標識すること
を含む。オリゴヌクレオチドは、人工的に合成させても、生合成させてもよく、その配列に基づく製造方法は当該技術分野において既に周知であり、当業者は適切な方法を選択することができる。
また、本発明は、上記の検出方法において用いられるためのキットを提供することもできる。本発明に係るキットは、上記の蛍光標識検出プローブ、競合プローブおよび使用説明書を含む。使用説明書は、例えば、検出できる標的塩基配列についての情報、上記の検出方法のステップ(1)~(3)またはステップ(1)~(4)についての情報、および、蛍光標識検出プローブおよび競合プローブ夫々の、核酸試料への添加量についての情報等を含み得る。
本発明に係るキットは、遺伝子診断に用いられるためのキットであってもよい。
さらに、本発明は、上記の検出方法を利用した遺伝子診断の方法を提供することもできる。本発明に係る遺伝子診断の方法は、
(1-1)DNAを含む検体から、診断対象のDNA領域を含む核酸試料を得ること;
(1-2)核酸試料に、QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素で標識された検出プローブと、競合プローブとを加えて、反応試料を得ること、これによって、反応試料中の標的塩基配列(A)を有する標的核酸に、蛍光標識検出プローブまたは競合プローブがハイブリダイズする;
(2)反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;および
(3)(2)の測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を一次微分すること
を含み、ここで、蛍光標識検出プローブおよび競合プローブは、上記の標的塩基配列の検出方法と同じ条件(i)~(iii)を満たすものである。本発明に係る遺伝子診断の方法は、標的塩基配列を有する遺伝子の有無の判断をより容易にするため、上記の検出方法のステップ(4)((3)で得られた一次微分曲線がピークを有する場合、核酸試料中に標的塩基配列(A)が存在すると判断すること)を含んでもよい。
また、本発明に係る遺伝子診断の方法は、さらに簡便な方法とするため、ステップ(1-1)において診断対象のDNA領域の核酸を十分に含む核酸試料を得る手段として、該DNA領域の核酸をLAMP法により増幅させてもよい。これにより、例えばPCR法を用いた既存の遺伝子診断方法と比較して、より短時間で簡便な遺伝子診断方法を提供することができる。なお、本方法におけるLAMP法による増幅後の核酸は、上述のとおり「生体に由来する核酸試料」の一例である。
本発明に係る標的塩基配列を検出する方法を用いて、結核菌のリファンピシン耐性獲得に関わるrpoB遺伝子の耐性決定領域(rifampicin resistance determining region、RRDR)を対象として、一塩基変異検出を実施した。この一塩基変異検出では、rpoB遺伝子の塩基配列の516番目のコドン中の、1塩基がAからTに置換されることによってそのコードするアミノ酸がAspからValに置換される変異を標的とした。この変異部位を含む領域の塩基配列は、「標的塩基配列を有する標的核酸」(Aアレル)または「非標的塩基配列を有する非標的核酸」(Tアレル)で表される。なお、実施例1は、「塩基変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列」を野生型の塩基配列とし、「塩基未変異ヌクレオチド」を含む「非標的塩基配列」を変異型の塩基配列として、核酸試料中に野生型の塩基配列が含まれるか否かを判別する例に相当する。
ここで、前提として、実施例1では、Aアレル中の標的塩基配列のセンス鎖が上記変異部位に「A」を有し、Tアレル中の非標的塩基配列のセンス鎖が上記変異部位に「T」を有するが、実際に検出プローブ・競合プローブをハイブリダイズさせる対象は、夫々の塩基配列のアンチセンス鎖である。このため、実施例1の内容を、本願に添付の特許請求の範囲の記載に照らすと、Aアレルのセンス鎖に相補するアンチセンス鎖が、請求項中の「標的核酸」の一例に相当し、「標的塩基配列のセンス鎖」に相補する「標的塩基配列のアンチセンス鎖」が、請求項中の「標的塩基配列」の一例に相当する。同様に、Tアレルのアンチセンス鎖が、請求項中の「非標的核酸」の一例に相当し、非標的塩基配列のアンチセンス鎖が、請求項中の「非標的塩基配列」の一例に相当する。
上記のrpoB RRDRの配列が変異型である遺伝子配列と、その一塩基変異部位の配列が野生型である遺伝子配列との夫々について、ゲノムDNA中の以下の領域:
Mycobacterium tuberculosis H37Rv ID: ref|NC_000962.3|760767-761516
(米国国立生物工学情報センター(NCBI)のGenBank内で検索可能。)
をサブクローニングしたプラスミドを制限酵素処理(XbaI/XhoI)して得られたサンプルを、鋳型として用いた。より具体的には、該データベースからそのH37Rvの配列を取得し、人為的に薬剤耐性配列(変異型)となるよう変異させたプラスミドを作製して(ユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスによる)使用した。同様に、感受性配列(野生型)のプラスミドも合成しており、ヘテロについては、合成した野生型と変異型のプラスミドを混合して使用した。
上記の鋳型に対して、以下のプライマーを用い、65℃で90分間LAMP反応を行った。LAMP反応は、Loopamp(登録商標)リアルタイム濁度測定装置 LA200(Teramecs)により行った。
20mM Tricine pH8.8、50mM KCl、8mM MgSO4、1.4mM ATP、1.4mM GTP、1.4mM CTP、1.4mM TTP、0.5% Tween20、16U Bst-Large Fragment。
上記の反応により、変異型の鋳型中のTアレルおよび野生型の鋳型中のAアレルを、夫々特異的に増幅させた。これにより、増幅産物に、蛍光標識検出プローブ(最終濃度0.04μM)と競合プローブ(最終濃度1.2μM)とが添加されたものに相当する、反応試料が得られた。これらの反応試料を、装置MX3005p(Agilent technologies)により、99℃で5分間加熱後、-2℃/30秒の速度で降温させ、30秒毎に蛍光値を測定した。測定によって得られた、温度-蛍光強度曲線に相当するデータについて、MX3005p(Agilent technologies)専用ソフトウェアにより微分値を算出した。図1に示す一次微分曲線(熱解離曲線)が得られた。
実施例1と同様のrpoB RRDRの遺伝子について、一塩基変異の検出のためのプローブの設計条件を検討した。図2に示すとおりの標的塩基配列を有する標的核酸(Aアレル、配列番号9(3’→5’方向に見た配列))および非標的塩基配列を有する非標的核酸(Tアレル、配列番号10(3’→5’方向に見た配列))を、夫々、対照標的核酸試料および対照非標的核酸試料に用いた。これらの標的核酸および非標的核酸に対して、標的塩基配列のセンス鎖および非標的塩基配列のセンス鎖と同一の(すなわち、配列番号9で表される塩基配列中の標的塩基配列および配列番号10で表される塩基配列中の非標的塩基配列に夫々相補的な)塩基配列を有する検出プローブおよび競合プローブを夫々設計した。これらの検出プローブと競合プローブとは、互いに同じ塩基長を有し、互いに変異部位のヌクレオチド(「T」または「A」)に相補的な1塩基が異なる以外は同じ塩基配列を有する。
本発明における競合プローブを使用した場合と比較するため、2通りの部分競合型プローブを設計した。部分競合型プローブ-1および部分競合型プローブ-2は、その塩基配列の一部が、標的核酸上の検出プローブと共通の領域に対してハイブリダイズし得るように設計されている。
同様に、対照標的核酸試料および対照非標的核酸試料に、夫々、検出プローブ(最終濃度0.04μM)および部分競合型プローブ-1または-2(最終濃度1.2μM)を添加した各反応試料についても、温度を変化させながら蛍光強度を測定した。
さらに、対照実験として、対照標的核酸試料および対照非標的核酸試料に、夫々、検出プローブ(最終濃度0.04μM)のみを添加して、温度を変化させながら蛍光強度を測定した。結果を図3-1に示す。
一方、検出プローブと共に上記の競合プローブを用いた場合には、対照非標的核酸試料についての一次微分曲線が、消光ピークを実質的に有さなかった。したがって、この競合プローブは、本発明の検出方法に上記検出プローブと共に使用可能であり、この競合プローブを用いることによって、標的核酸が実質的に含まれていなければ実質的に消光ピークが現れない検出系を実現することができる。
この結果は、特許文献1に記載の発明に対する本発明の効果の顕著性を如実に表した例ともいえる。
実施例1および実施例2と同様のrpoB RRDRの遺伝子について、競合プローブ設計のためのTm値条件を検討するために、蛍光標識検出プローブと競合プローブ、夫々の標的核酸・非標的核酸に対する結合力をTm値として算出し、上述した温度-蛍光強度曲線の一次微分曲線における消光ピークの有無との関係性を調べた。
本実施例では実施例1・実施例2とは異なり、標的核酸をTアレル(変異型の塩基配列)とし、非標的核酸をAアレル(野生型の塩基配列)とした。すなわち、図4-1に示すとおりの標的塩基配列を有する標的核酸(Tアレル、配列番号10(3’→5’方向に見た配列))、および非標的塩基配列を有する非標的核酸(Aアレル、配列番号9(3’→5’方向に見た配列))を、夫々、対照標的核酸試料および対照非標的核酸試料に用いた。本実施例では、Tアレルに完全マッチする(すなわち、配列番号10で表される塩基配列中の標的塩基配列に完全に相補的な)検出プローブを、蛍光色素BODIPY(登録商標) FLで標識することによって、蛍光標識プローブ(蛍光標識検出プローブとして)を作製した。また、Aアレルに完全マッチする(すなわち、配列番号9で表される塩基配列中の非標的塩基配列に完全に相補的な)Tm値の異なる競合プローブ10種を作製した。Tm値の異なる複数の競合プローブは、蛍光標識プローブに対して競合プローブの塩基長を、蛍光標識プローブより数塩基短いものから蛍光標識プローブより数塩基長いものまで様々に変更することで作製した。
一方、Tアレルに対する競合プローブ(Aアレル完全マッチ)のTm値が蛍光標識プローブ(Tアレル完全マッチ)のTm値よりも-1.8℃以上高くなるとTアレルを鋳型としたときの消光ピークが段階的に減衰し、9.9℃高くなったとき(競合プローブとして「RB516A-3-P-9」または「RB516A-3-P-10」を使用したとき)Tアレルを鋳型としたときの消光ピークは消失した。これは、理論上、標的核酸に対する競合プローブのTm値が蛍光標識検出プローブのTm値よりも高いときには、標的核酸に対して競合プローブの方が蛍光標識検出プローブよりも安定的にハイブリダイズするので、標的核酸に対する蛍光標識検出プローブのハイブリダイズが阻害され、検出可能な消光が減少するからであると考えられる。
ここで、標的核酸に対する競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのTm値を上回っている場合には、非標的核酸に対する競合プローブのTm値もさらに高くなる傾向があり、例えば非標的核酸に対する競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのTm値より15℃以上高くなり得る(具体的に、図4-2を参照すると競合プローブ「RB516A-3-P-8」を用いた場合に競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのそれより16.8℃高い)。したがって、例えば、非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのTm値より少なくとも15℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が蛍光標識プローブのTm値+5℃を超えないことも、別の好適なTm値条件の一例といえる。
本発明者らは、rpoB RRDR以外の一塩基変異の検出についても、本発明の検出方法を適用することができることを示した。本実施例では、実施例1~3とは異なり、ヒトの遺伝子中のある特定の一塩基変異の判別を目的として、検出プローブおよび競合プローブの設計条件(Tm値)を検討した。本実施例では、まず、対象とする一塩基変異部位を含む適当な長さの標的塩基配列を決定し、標的塩基配列に対して相補的な検出プローブを作製して蛍光色素で標識し、蛍光標識検出プローブとした。さらに、同じ検出プローブに対して競合プローブの塩基長を、検出プローブより数塩基短いものから検出プローブより数塩基長いものまで様々に変更し、上記のように対照標的反応試料および対照非標的反応試料について一次微分曲線を求める実験を行い、一塩基変異の検出のためのプローブの設計条件を検討した。この実験からは、競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列の条件として、非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、検出プローブのTm値より少なくとも5℃高く、かつ、標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、検出プローブのTm値より低く、かつ競合プローブ/蛍光標識検出プローブの添加量(モル比)が30/1である場合に、対照標的反応試料の一次微分曲線が消光ピークを有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線が消光ピークを実質的に有さなくなる(あるいは、消光ピークを有していても、対照標的反応試料の一次微分曲線の消光ピークに比べて明らかに弱い消光ピークであり、対照標的反応試料の場合とは明らかに区別可能である)という結果が得られた。
しかし、非標的核酸に対する競合プローブのTm値と検出プローブのTm値との差が5℃に満たない場合には、検出プローブと非標的核酸とのミスマッチのハイブリダイズによる消光ピークが抑制されず、対照非標的反応試料の一次微分曲線にも、対照標的反応試料の一次微分曲線と似たような消光ピークが見られる結果となった。一方、標的核酸に対し、競合プローブのTm値を、検出プローブのTm値より高くした場合には、標的核酸の検出による消光ピークそのものが小さくなるという結果が得られた。これは、標的核酸に対して競合プローブの方が検出プローブよりも安定的にハイブリダイズするため、標的核酸に対する検出プローブのハイブリダイズによる検出が阻害されるからである。
また、上記条件において、非標的核酸に対し、競合プローブのTm値を、検出プローブのTm値より少なくとも15℃高くした以外は上記条件と同じ場合には、同じ非標的核酸に対する競合プローブのTm値を検出プローブのTm値より5~10℃程度高くした場合と比較して、対照非標的反応試料の一次微分曲線の形状がより平坦に近づくことが見出された。このことから、本発明において、非標的核酸に対する競合プローブの特異性(ハイブリダイゼーションの熱安定性)を、非標的核酸に対する検出プローブのハイブリダイゼーションの熱安定性に対してより大幅に高めることで、特異性が低いミスマッチのハイブリダイズによる消光ピークをより確実に抑制することができると考えられる。
Claims (15)
- 核酸試料から、塩基変異ヌクレオチドを含む標的塩基配列(A)を検出する方法であって、該方法は、以下のステップ:
(1)核酸試料に、QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素で標識された検出プローブと、競合プローブとを加えて、反応試料を得ること、
これによって、反応試料中の標的塩基配列(A)を有する標的核酸に、前記蛍光色素で標識された検出プローブまたは競合プローブがハイブリダイズする;
(2)反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;
(3)(2)の測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を一次微分すること;および
(4)(3)で得られた一次微分曲線がピークを有する場合、核酸試料中に標的塩基配列(A)が存在すると判断すること(ここで核酸試料が、標的核酸の外に、非標的核酸をも含んでいてもよい)
を含み、ここで、
(i)前記蛍光色素で標識された検出プローブの塩基配列は、標的塩基配列(A)に相補的な塩基配列(A')を含み、
(ii)競合プローブの塩基配列は、塩基変異ヌクレオチドが塩基未変異ヌクレオチドに置き換わっている以外は標的塩基配列(A)と同じ塩基配列である非標的塩基配列(B)に相補的な塩基配列(B')を含み、
(iii)前記蛍光色素で標識された検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列ならびに核酸試料への添加量は、以下の手順:
(a)標的核酸は含まれているが、非標的塩基配列(B)を有する非標的核酸は実質的に含まれていない対照標的核酸試料、および、標的核酸は実質的に含まれないが、非標的核酸は含まれている対照非標的核酸試料の夫々に、前記蛍光色素で標識された検出プローブと競合プローブとを加えて、対照標的反応試料および対照非標的反応試料を得ること;
(b)各対照反応試料の温度を変化させながら、蛍光強度を測定すること;ならびに
(c)測定結果から得られた温度-蛍光強度曲線を夫々、一次微分すること
に従うと、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを有さないように、決定されている、前記方法。 - 非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より少なくとも5℃高く、かつ、
標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より低い、請求項1に記載の方法。 - 非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より少なくとも10℃高く、かつ、
標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より低い、請求項1に記載の方法。 - 非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より少なくとも10℃高く、かつ、
標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値+5℃を超えない、請求項1に記載の方法。 - 非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より少なくとも15℃高く、かつ、
標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値+5℃を超えない、請求項1に記載の方法。 - 非標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より少なくとも15℃高く、かつ、
標的核酸に対し、競合プローブのTm値が、前記蛍光色素で標識された検出プローブのTm値より低い、請求項1に記載の方法。 - (I)標的核酸上の、前記蛍光色素で標識された検出プローブとハイブリダイズする領域が、競合プローブとハイブリダイズする領域を含むか;
(II)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、前記蛍光色素で標識された検出プローブとハイブリダイズする領域を含むか;または、
(III)標的核酸上の、競合プローブとハイブリダイズする領域が、前記蛍光色素で標識された検出プローブとハイブリダイズする領域と一致する、
請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。 - 核酸試料への競合プローブの添加量が、前記蛍光色素で標識された検出プローブの添加量の少なくとも10倍(モル比)である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料への競合プローブの添加量が、前記蛍光色素で標識された検出プローブの添加量の少なくとも20倍(モル比)である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素が、TAMRA(商標)、BODIPY(登録商標) FL、PACIFIC BLUE(商標)、およびCR6G(登録商標)からなる群から選択される少なくとも1種の蛍光色素であって、
TAMRA(商標)が、テトラメチルローダミンであり、
BODIPY(登録商標) FLが、4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸であり、
PACIFIC BLUE(商標)が、3-カルボキシ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリンであり、
CR6G(登録商標)が、カルボキシローダミン6Gである、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。 - 核酸試料が、生体に由来する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 塩基変異ヌクレオチドが、一塩基置換の変異を含むDNAである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~12のいずれか一項に記載の方法に使用可能な検出プローブおよび競合プローブを設計する方法であって、該方法は、
(1') (a)~(c)に従い、対照標的反応試料の一次微分曲線がピーク(極大値)を有するが、対照非標的反応試料の一次微分曲線がピークを有さないように、検出プローブおよび競合プローブ夫々の塩基長および塩基配列を決定すること
を含む、前記方法。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の方法に使用可能である、QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素で標識された検出プローブおよび競合プローブを製造する方法であって、該方法は、
(1'')請求項13に記載の方法に従って設計された、夫々の塩基長および塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成すること;および
(2'')検出プローブのオリゴヌクレオチドを、QP法に使用可能な蛍光色素で標識すること
を含む、前記方法。 - 請求項1~12のいずれか一項に記載の方法において用いられるためのキットであって、QP(Quenching Probe/Primer)法に使用可能な蛍光色素で標識された検出プローブ、競合プローブおよび使用説明書を含む、前記キット。
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