CN101240329B

CN101240329B - 一种dna的荧光检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN101240329B
Application number: CN200710048129XA
Authority: CN
Inventors: 宋世平; 刘兴奋; 李江; 王丽华; 樊春海
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2027-11-13
Also published as: CN101240329A

Abstract

本发明公开了一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒。该方法将捕获探针连接在磁性颗粒表面后通过DNA之间的杂交捕获靶向DNA，靶向DNA的另一段核苷酸序列与荧光素修饰的信号探针杂交，形成磁性颗粒一靶向DNA一荧光标记的信号探针的三明治夹心结构，同时加入上述的捕获探针或信号探针的竞争性探针与靶向DNA竞争结合，最后加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子对信号放大检测，从而检测出靶向DNA。本发明可以显著提高基因及基因突变检测的选择性和灵敏度，无需进行核酸扩增，操作快速简便，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

Description

一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒。

背景技术

基因(DNA或RNA)是遗传信息的载体，在生物的个体生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命过程中起着极为重要的作用。基因检测在临床诊断、单核苷酸多态性分析、基因测序、环境分析、反控等领域具有重要的意义。随着人们对自身健康的日益关注，对肿瘤、癌症等重大疾病早期诊断技术的要求也越来越高，因此迫切需要发展高灵敏度的基因检测技术。基因突变是单核苷酸多态性的形式之一，与多种疾病的发生有着密切的关系，最新研究表明，有四百多种疾病的发生与基因突变有关。为了在发病早期就能检测到极微量致病基因的存在，常常需要对待测基因进行PCR扩增或采用其它形式的信号放大方法，如纳米金放大、共轭高分子放大、酶联放大等(L.Pang，J.Li，J.Jiang，G.Shen，R.Yu，Anal. Biochem.2006，358，99；D.Q.Tang，D.J.Zhang，D.Y.Tang，H.Ai，J.Immunol.Methods 2006，316，144；X.Yao，X.Li，F.Toledo，C.Zurita-Lopez，M.Gutova，J.Momand，F.Zhou，Anal.Biochem.2006，354，220)。

本申请人公开号为CN1808101A的专利申请中公开了一种DNA的荧光检测方法及其试剂盒，该检测方法包括：利用连接于磁性颗粒上的捕获探针将待检DNA从生物样品中进行磁性富集和分离；然后加入荧光基团(FAM)标记的信号探针，使磁性分离和富集后的待检DNA与信号探针杂交配对，并用低盐缓冲液洗涤；再加入水溶性导电高分子材料，即共轭高分子(如聚芴衍生物PF)实现信号倍增，用该导电高分子材料的激发波长作荧光光谱，利用荧光共振能量转移(FRET)检测方法检测分析出待检DNA。该方法具有较高的特异度和敏感度。但是，一方面低盐洗涤的过程会增加操作的步骤，延长反应和检测时间；另一方面，低盐溶液也会使完全互补的双链DNA部分解链，从而使互补与突变的可区分性减小，即会降低对突变的选择性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种选择性更佳的DNA的荧光检测方法，而且该方法灵敏度高，无需扩增，操作快速简便，综合性能高。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种采用上述DNA的检测方法的试剂盒。

本发明人在上述CN1808101A公开的技术方案基础上，经过进一步的研究，发现采用竞争机制，磁性颗粒对靶向DNA的富集、分离，以及水溶性共轭高分子与荧光基团之间的FRET技术相结合，可以大大提高DNA检测的特异度和灵敏度，缩短了反应时间，综合性能更佳，特别可用于基因及突变基因的检测，更有希望应用于一些与基因突变有关的病症，如肿瘤的诊断。其中，竞争机制是生物检测中经常采用的一种用于提高选择性的检测方法，如ELISA竞争法和竞争性PCR等。在基因(DNA)检测中，也常采用这种方法。与线性DNA分子相比，茎环结构DNA探针由于可以形成特定的茎环结构，与其互补的靶向DNA结合时具有更窄的融解温度范围和更高的选择性(G.Bonnet，S.Tyagi，A.Libchaber，F.Kramer，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，6171)，常用于单碱基错配的检测。因此，茎环结构竞争探针的引入将会进一步提高DNA生物传感器的综合性能。

因此，本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案是：一种DNA的荧光检测方法，包括以下步骤：

1)将捕获探针连接在磁性颗粒表面；

2)加入待测的靶向DNA和荧光素修饰的信号探针，该捕获探针能与靶向DNA的一段核苷酸序列杂交，该信号探针能与靶向DNA的另一段核苷酸序列杂交，通过DNA之间的杂交，形成磁性颗粒-靶向DNA-荧光素修饰的信号探针的三明治夹心结构；

3)最后除去游离的荧光素修饰的信号探针后，加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子，对该信号探针上的荧光信号进行放大检测，从而检测出靶向DNA；

其中，步骤2)在杂交时还加入上述捕获探针或信号探针的竞争性探针，与靶向DNA竞争结合。

优选的，所述的捕获探针可以是茎环结构的DNA探针，同时所述的信号探针是线性DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与捕获探针仅相差一个碱基。

优选的，所述的捕获探针可以是线性DNA探针，同时所述的信号探针是茎环结构的DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与信号探针仅相差一个碱基。

优选的，步骤2)中所述的杂交反应的温度可以是29℃～39℃，优选的是37℃左右。通过控制反应的温度条件，使磁性颗粒-靶向DNA-荧光素修饰的信号探针的三明治夹心结构中含有单点突变的双链在此条件下解链，成为游离状态，而完全互补的双链不受影响。

优选的，所述的竞争性探针加入的摩尔量可以是被竞争探针的1～7倍，优选的是2倍左右。

根据本发明，步骤1)所说的磁性颗粒同现有技术，如上述CN1808101A中所述，其已被广泛用于生物活性物质的富集、分离、药物的磁靶向以及疾病的诊断和治疗等方面。功能化后的磁性颗粒不仅可以通过表面的配体(或受体)与受体(或配体)之间的特异相互作用，如亲和素-生物素(biotin)来实现对靶向生物目标的快速分离，而且可以作为固相载体用于连接生物分子。与传统分离方法相比，使用磁性颗粒进行分离的速度明显缩短，在30秒内即可实现快速分离。此外，利用磁性颗粒可以实现对靶向物质分析时反应与检测分开进行，避免了反应体系中其它组分的干扰。本发明中的磁性颗粒通常选用可市购的链亲和素包覆的微米级的磁珠(MMPs)商品，也可以是根据现有方法合成的直径为50～100nm的磁性纳米粒子。当采用微米级的MMPs时，为了避免磁珠对光的散射，在荧光检测前通常需使固定在磁珠上的DNA变性解链，而所选用的变性解链方法可以是常规方法，如加入NaOH等强碱(具体可参见CN1808101A)。

根据本发明，步骤3)中所述的共轭高分子优选水溶性聚芴(PF)。本发明采用微米级的磁珠MMPs为例来说明，在含有变性分离下来的信号探针的上清液中，加入水溶性的共轭高分子PF再进行荧光检测，通过PF与荧光素之间的荧光共振能量转移实现信号放大。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案是：一种DNA荧光检测的试剂盒，包括：

1)连接于磁性颗粒上的捕获探针，荧光素修饰的信号探针；

2)上述捕获探针或信号探针的竞争性探针；

3)水溶性聚芴。

本发明引入竞争机制，特别是具有高选择性的茎环结构的竞争性探针，提高了DNA检测的选择性；同时以功能化的磁性颗粒作为磁性颗粒，实现游离组分的快速分离，进一步提高了选择性。本发明同时选择荧光素修饰的信号探针，在最后检测时直接加入共轭高分子，通过其与荧光素之间的荧光共振能量转移，实现信号倍增。不但提高了DNA检测的灵敏度，而且无需对信号探针进行扩增，操作简便。本发明可以显著提高DNA及DNA突变检测，特别是基因，如乳腺癌易感基因BRCA1及其突变基因检测的选择性和灵敏度，在生物检测、疾病的早期诊断和治疗中有着重要的意义。

附图说明：

图1为本发明引入竞争性捕获探针的DNA检测方法的工作原理图；其中，A为检测互补靶向DNA的工作原理图，B为检测突变靶向DNA的工作原理图。

图2为本发明引入竞争性信号探针的DNA检测方法的工作原理图；其中，A为检测互补靶向DNA的工作原理图，B为检测突变靶向DNA的工作原理图。

图3为引入竞争性捕获探针竞争反应温度为37℃时靶向DNA(a)和突变靶向DNA(b)的荧光检测信号，靶浓度为1nM。

图4为分别引入两种竞争机制反应温度均为37℃时的靶向DNA和突变靶向DNA的荧光检测信号。a，b分别为引入竞争性捕获探针时的靶向DNA和突变靶向DNA的荧光检测信号；c，d分别为引入竞争性信号探针时的靶向DNA和突变靶向DNA的荧光检测信号。

具体实施方式

下面用乳腺癌易感基因BRCA1及其突变基因的检测为实施例来进一步说明本发明，但本发明并不限于检测乳腺癌易感基因及其突变基因，也并不受实施例中其它条件的限制。

以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其他未具体注明的实验条件按照常规或药品或以其制造厂商所建议的条件。

荧光检测所用仪器为荧光分光光度计(Hitachi F-4500，日本)。荧光光谱测量条件：氙灯激发，激发和发射狭峰宽度均为2.5nm，电压PMT 950V，响应时间2S，激发波长为380nm，发射波长扫描范围390-700nm；用3mL石英比色皿进行测量，样品体积1ml；室温。

链亲和素修饰的超顺磁性颗粒(magnetic micro-particles，MMPs)购于Promega公司，颗粒直径为1.0μm左右，固含量为1mg/mL，结合能力为1.25nmol探针/mg MMPs。

水溶性共轭高分子为阳离子的聚芴衍生物(PF)，根据文献(F.Huang，H.Wu，D.Wang，W.Yang，Y.Cao，Chem.Mater.2004，16，708)合成，其结构式如下：

其中，R＝(CH₂)₃N⁺(CH₃)₂CH₂CH₃Br。

各种DNA序列如表1所示，均购自上海生物工程技术有限公司。

表1寡聚核苷酸碱基组成表

名称	碱基组成
名称	碱基组成	DNA1DNA2DNA3DNA4DNA5DNA6DNA7DNA8DNA9	5’-CGC TCA AAC CCT ATG TAT GCT CGA GCG5-BIOTIN-3’5’-CGC TCA AAC CCT A<u>A</u>G TAT GCT CGA GCG-3’5’-FAM-GTA TGA ATT ATA ATC AAA-3’5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTATAA TTC ATA C-3’5’-GAG CAT AC<u>T</u> TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGA TTATAA TTC ATA C-3’5’-GAA ACC CTA TGT ATG CTC TTT TTT TTT T5-BIOTIN-3’5’-FAM-TAC GCG GTA TGA ATT ATA ATC AAA CGC GT-3’5’-TAC GCG GTA TGA AT<u>A</u> ATA ATC AAA CGC GT-3’5’-GAG CAT ACA TAG GGT TTC TCT TGG TTT CTT TGATTA T<u>T</u>A TTC ATA C-3’

实施例所用各种溶液成分如表2所示。

表2所用各种溶液成分表

溶液名称	溶液组成
溶液名称	溶液组成	0.5×SSCTTLTTA杂交液洗涤液	75mM NaCl，7.5mM柠檬酸钠，pH 7.4100mM Tris-HCl，0.1％Tween 20，1M LiCl，pH 8.0250mM Tris-HCl，0.1％Tween 20，5％BSA，pH 7.4750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，pH 7.410mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 7.4

实施例1

如图1所示，按产品说明书要求，MMPs在使用前首先用0.5×SSC缓冲液洗涤3次，然后将biotin标记的茎环结构的捕获探针DNA 1加入到含有TTL缓冲液的MMPs中，轻轻混合约10分钟。捕获探针的表面密度约为4～6×10¹¹链/cm²。然后将MMPs和捕获探针的复合物(MMPs-capture probe，记为MMPs-cp 1)用TTA缓冲液洗两次，悬浮于杂交液中，4℃冷藏备用。

然后将茎环结构的竞争性捕获探针DNA 2、靶向DNA 4(或突变靶向DNA 5)和线性信号探针DNA 3的混合物加入到预先制备好MMPs-cp 1的悬浮液中，其中靶向DNA或突变靶向DNA 5的浓度均为1nM，竞争性捕获探针DNA2∶捕获探针DNA 1∶互补靶向DNA4或突变靶向DNA 5∶信号探针DNA3的摩尔浓度比约为2∶1∶1∶2。在37℃反应30分钟。反应完毕，磁性分离去除游离组分。然后用洗涤液洗涤3～5次，直至洗涤得到的分离上清液中无荧光信号为止。然后向磁性颗粒复合物中加入100μL浓度为50mM的NaOH，室温变性5分钟，磁性分离，收集变性上清液，向其中加入等量HCL进行中和，再加入200μL 10mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲溶液和400μLH₂O进行荧光检测(Ex：480nm，Em：490-700nm)，最后再加入PF溶液使其终浓度为200nM，进行共轭高分子信号放大的检测(Ex：380nm，Em：390～700nm)。

结果见图3。37℃反应时，可以使含有单点突变的DNA双链解离，而完全互补的双链不受影响。二者的信号比为3.8，具有显著性差异，因此可以将互补和突变的信号区分开来。与现有技术(CN1808101A专利申请)中互补靶向与突变DNA的信号比为2.2相比，可见本发明大大提高了DNA检测的选择性。

实施例2

参照实施例1中的条件进行反应，不同之处在于杂交反应的温度为29℃。结果是互补靶向与突变DNA的信号比为2.25。

实施例3

参照实施例1中的条件进行反应，不同之处在于杂交反应的温度为39℃。结果是互补靶向与突变DNA的信号比为2.31。

实施例4

参照实施例1中的条件进行反应，不同之处在于：竞争性捕获探针DNA2∶捕获探针DNA 1∶互补靶向DNA4或突变靶向DNA 5∶信号探针DNA3的摩尔浓度比约为7∶1∶1∶2。结果是互补靶向与突变DNA的信号比为2.36。

实施例5

参照实施例1中的条件进行反应，不同之处在于：竞争性捕获探针DNA2∶捕获探针DNA 1∶互补靶向DNA 4或突变靶向DNA 5∶信号探针DNA3的摩尔浓度比约为1∶1∶1∶2。结果是互补靶向与突变DNA的信号比为2.97。

实施例6

参照实施例1中的条件进行反应，不同之处在于：使用线性捕获探针DNA 6制备MMPs和捕获探针的复合物(MMPs-capture probe，记为MMPs-cp6)，信号探针为茎环结构的DNA 7，竞争探针为茎环结构的DNA 8，待检DNA为靶向DNA 4或突变靶向DNA 9，两组均在37℃左右反应。本实施例待检DNA的浓度也为1nM。其它试剂和步骤与实施例1相同。其反应原理如图2所示。

结果见图4。结果显示，对引入竞争性信号探针的策略而言，信号探针为茎环结构，由于茎环结构中茎的形成而使部分碱基对FAM的猝灭增强，因此FAM的荧光发射效率较低，与PF之间发生FRET时，FRET效率较低。此外，茎环结构的存在产生的空间位阻也是影响其FRET效率的一个重要因素。结果表明引入竞争性捕获探针对单点突变的选择性更好。这是因为在引入竞争性捕获探针的策略中，信号探针为线性结构，其自身不存在二级结构，因此其荧光发射效率较高，与PF之间发生FRET时，FRET效率较高。

Claims

1.一种DNA的荧光检测方法，包括以下步骤：

1)将捕获探针连接在磁性颗粒表面；

3)最后除去游离的荧光素修饰的信号探针后，加入具有信号倍增功能的水溶性的共轭高分子，该水溶性的共轭高分子是阳离子聚芴，对该信号探针上的荧光信号进行放大检测，从而检测出靶向DNA；

其特征是步骤2)在杂交时还加入上述捕获探针或信号探针的竞争性探针，与靶向DNA竞争结合。

2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征是所述的捕获探针是茎环结构的DNA探针，所述的信号探针是线性DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与捕获探针仅相差一个碱基。

3.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征是所述的捕获探针是线性DNA探针，所述的信号探针是茎环结构的DNA探针，所述的竞争性探针无任何修饰，其序列组成与信号探针仅相差一个碱基。

4.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征是步骤2)中杂交反应的温度是29℃～39℃。

5.根据权利要求4所述的荧光检测方法，其特征是所述的杂交反应温度是37℃。

6.根据权利要求1～5任一项所述的荧光检测方法，其特征是所述的竞争性探针加入的摩尔量是被竞争探针的1～7倍。

7.根据权利要求6所述的荧光检测方法，其特征是所述的竞争性探针加入的摩尔量是被竞争探针的2倍。

8.一种DNA荧光检测的试剂盒，其特征是其包括：

1)连接于磁性颗粒上的捕获探针，荧光素修饰的信号探针；

2)上述捕获探针或信号探针的竞争性探针；

3)水溶性聚芴，该水溶性聚芴是阳离子聚芴。