CN104792753B

CN104792753B - 基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法

Info

Publication number: CN104792753B
Application number: CN201510160078.4A
Authority: CN
Inventors: 李根喜; 曹亚; 陈伟伟; 韩鹏
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2035-04-07
Also published as: CN104792753A

Abstract

本发明公开了一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，它包括（1）寡核苷酸DNA链末端修饰的小分子配体与其靶蛋白的特异性分子识别；（2）结合抑制点击化学反应；（3）基于由铜纳米颗粒和氧化石墨烯组成的荧光淬灭纳米探针体系的荧光定量检测。该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，且具有良好的普适性，因而在临床诊断和药物研发等领域中具有巨大的潜在应用价值。

Description

基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法

技术领域

本发明涉及一种检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，特别涉及一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。

发明背景

蛋白质作为生命有机体的基本组成部分和细胞功能的重要执行者，几乎参与了所有的生理和病理过程，而这些过程又往往涉及到蛋白质和小分子配体之间的相互作用。因此蛋白质-小分子配体相互作用的相关研究，特别是以此为基础的小分子配体靶蛋白的分析检测具有十分重要的意义。它不仅有助于揭示蛋白质和小分子配体参与的复杂细胞通路机制，而且可以为临床诊断、新药开发设计等提供必要的数据信息支持。传统的小分子配体靶蛋白的检测技术主要包括毛细管电泳、蛋白质片断互补测定、表面等离子共振和荧光各向异性分析等。这些方法虽各有优势，但同时也存在操作繁琐、仪器设备昂贵、灵敏度不足等缺陷。

近年来，通过共价键合的方式将小分子与寡核苷酸DNA链相耦连发展出了一类新型的小分子配体功能化的核酸探针，其既具备小分子配体高亲和力和高特异性的靶蛋白结合能力，又具有DNA分子良好的设计灵活型。利用这类新型核酸探针，若干种简便快捷且灵敏度高的小分子配体靶蛋白检测新方法得以建立，进一步促进了相关领域的发展。但与此同时，这些新方法往往依赖于核酸工具酶参与的末端保护机制，而工具酶的活性在血清等复杂样本中易受酸度、离子浓度和其他分子的影响或污染，这将严重阻碍相应方法在复杂样本中的实际应用。在此背景下，发明一种无需工具酶参与的简单、灵敏的小分子配体靶蛋白检测新方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有方法的不足，提出一种无需工具酶参与的具有较高选择性和灵敏度的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法。该方法依赖于寡核苷酸DNA链末端修饰的特定小分子配体与其靶蛋白的特异性分子识别以及结合抑制的点击化学反应，并借助由铜纳米颗粒和石墨烯组成的荧光淬灭纳米探针体系，实现对于目标蛋白的荧光定量检测。

为实现上述目的，本发明采用如下机理：设计两条碱基完全互补的DNA单链P1和P2，其中P1的5'末端含有叠氮基团，P2的3'末端修饰有特定小分子配体；在室温条件下，P1和P2在溶液中杂交形成双链，成为具有荧光发射特性的铜纳米颗粒合成的模板。另外设计一条3'末端进行炔基功能化的DNA单链P3，其可以在亚铜离子（Cu⁺）存在的条件下通过末端炔基与叠氮基团间的偶极环加成“点击化学”反应实现与P1链的连接，形成具有单链分支的P1-P2-P3复合DNA结构；此时，若向检测体系中引入氧化石墨烯，上述DNA复合结构由于单链分支与氧化石墨烯之间的相互作用而被稳定吸附到氧化石墨烯表面，最终导致以P1-P2双链为模板合成的铜纳米颗粒的荧光被显著淬灭。另一方面，当检测体系中存在小分子配体靶蛋白时，靶蛋白可以通过与小分子配体间的高亲和力和特异性的分子识别过程而连接到P2链末端，形成蛋白结合的P1-P2双链。这种情况下，由于蛋白结合所形成的巨大位阻效应，P1和P3链末端的叠氮和炔基基团无法彼此靠近，从而抑制了点击化学反应的发生；此时，若向检测体系中引入氧化石墨烯，只有游离的P3单链被吸附至氧化石墨烯表面，而P1-P2双链远离氧化石墨烯，从而使以其为模板形成的铜纳米颗粒的荧光得以较好地保持。基于以上过程，我们就可以通过分析最终反应体系中铜纳米颗粒的荧光强度，实现对小分子配体靶蛋白的定量检测。

根据上述机理，本发明采用的技术方案：

一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

（a）设计并合成三条末端分别修饰叠氮基团、小分子配体和炔基基团的寡核苷酸DNA单链；其中，修饰有叠氮基团的寡核苷酸DNA单链 P1的序列为：5'-Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3'，修饰有小分子配体的寡核苷酸DNA单链P2的序列为：5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-小分子配体-3'，修饰有炔基基团的寡核苷酸DNA单链P3的序列为：5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3'；

（b）单链P1和单链P2互补杂交形成DNA双链，且杂交形成双链后叠氮基团和小分子配体位于双链的同一侧末端；具体步骤为：将单链P1和单链P2按1:1的摩尔比混合于MOPS缓冲溶液中，搅拌均匀后在20~30 ºC条件反应2~3小时，以使P1和P2链互补杂交形成双链；

（c）将含有待测的小分子配体靶蛋白的样品溶液加入步骤（b）所得的P1-P2双链溶液中，通过靶蛋白与小分子配体间的特异性分子识别，形成靶蛋白结合的P1-P2双链；识别结合反应时间为1~2小时，反应温度为30~40 ºC；

（d）向步骤（c）所得反应体系中加入单链P3，P3链和P1-P2双链的摩尔比为1:1，再加入还原剂抗坏血酸，混合均匀后加入含有二价铜离子的MOPS缓冲溶液，以进行点击化学反应并合成铜纳米颗粒；反应所用时间为20~40分钟，温度为20~30 ºC；所述的P3链和抗坏血酸的摩尔比为1 : 2000~3000， P3链和二价铜离子的摩尔比为1 : 200~300；

（e）向步骤（d）所得反应体系中加入氧化石墨烯，使反应体系中氧化石墨烯和P3链的终浓度比为25~50 ug/mL：1 uM；混匀后在20~30 ºC条件下反应20~40分钟以进行荧光淬灭；反应结束后，使用荧光光谱仪记录反应体系最终的荧光图谱，并根据荧光发射强度实现对小分子配体靶蛋白的定性定量检测。

步骤（a）中所使用的P1和P2链的碱基序列并非已知序列，而是根据本发明的技术原理随机设计而成。其基本原则是两者碱基完全互补，且在实验过程中能够保持稳定的双链结构，以作为铜纳米颗粒合成的模板。同时考虑到长链DNA不易合成且成本较高，因此P1和P2链的最优序列长度为15~35 bp。一旦P1和P2链的序列被设计出来，其合成将交由专业的核酸合成公司完成。

步骤（c）中所使用的P3链的序列同样是随机设计而成，其基本设计原则是：首先，为了在维持低合成成本的同时保证P3链与氧化石墨烯之间有效的相互作用，序列长度应为12~20 bp；其次，为了避免P3链成为铜纳米颗粒合成的模板，序列中不应存在多个连续的胸腺嘧啶碱基。

在步骤（c）中，二价铜离子在溶液中被抗坏血酸还原成Cu⁺，后者一方面发生歧化反应生成零价铜原子，进而在P1-P2双链的大沟位置发生富集并最终生成铜纳米颗粒；另一方面可以催化P1和P3链末端的叠氮和炔基基团间的偶极环加成“点击化学”反应，形成具有单链分支的P1-P2-P3复合DNA结构。

步骤（e）中所使用的荧光光谱仪为日立 F-7000 FluorescenceSpectrophotometer，激发波长为340 nm，发射波长扫描范围为500~670 nm。

本发明建立的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，利用所发现的结合抑制点击化学反应，将寡核苷酸DNA链末端修饰的特定小分子配体与靶蛋白之间的分子识别作用与“铜纳米颗粒-石墨烯”荧光淬灭纳米探针体系相偶联，实现了小分子配体靶蛋白的定量检测。该方法灵敏度高，特异性强，同时无需蛋白酶参与，操作快速简便，因而在临床诊断、药物研发等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明建立的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法的原理示意图。

图2为未发生（A）或发生（B）点击化学反应的实验体系在氧化石墨烯淬灭40分钟前后的荧光光谱。

图3为检测8.0 nM 叶酸受体及对照实验中所得到的荧光图谱。（a）实验组，体系中含有8.0 nM 叶酸受体；（b）对照组，体系中不含叶酸受体；（c）对照组，体系中含有1 μM血红蛋白。

图4为检测不同浓度叶酸受体（从下至上分别为0 nM、0.2 nM、0.4 nM、0.8 nM、1.6nM、3.2 nM、4.8 nM 、6.4 nM 和8.0 nM）时得到的荧光图谱。

图5为最终检测体系中铜纳米颗粒在598 nm处的荧光发射强度F₅₉₈值与叶酸受体浓度间的关系，插入图为叶酸受体浓度在0.2-6.4 nM范围内，F₅₉₈值与叶酸受体浓度之间的线性关系。

图6为检测（a）0 nM、（b）4 nM、（c）10 nM亲和素时得到的荧光图谱。

图7为检测不同蛋白时得到的最终反应体系的F₅₉₈值。

具体实施方法

实施例一：点击化学反应的荧光表征，具体涉及点击化学反应的进行以及“铜纳米颗粒-石墨烯”荧光淬灭纳米探针体系的建立，其步骤如下：

向81 μL MOPS缓冲中加入18 μL 10 μM的P1链和18 μL 10 μM的P2链，混合均匀后在室温下反应2.5小时，以使P1和P2链互补杂交形成双链。随后，向上述溶液中加入90 μLMOPS缓冲、18 μL 0或10 μM P3链以及5 μL 100 mM的抗坏血酸溶液，振荡均匀后再向其中加入230 μL含200 μM硫酸铜的MOPS缓冲，室温下反应30分钟，以进行点击化学反应并合成铜纳米颗粒。最后，向上述溶液中加入40 μL 200 μg/mL的氧化石墨烯，室温下荧光淬灭0或40分钟后取部分溶液进行荧光检测。

相关寡核苷酸DNA链序列如下：

P1链：5'-Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3'。

P2链：5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-3'。

P3链：5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3'。

荧光检测具体参数：所用仪器是日立F-7000荧光光谱仪，激发波长为340 nm，发射波长扫描范围为500~670 nm，使用的待测溶液体积为50 μL。

检测结果如图2所示。实验体系A中未加入P3链，此时，点击化学反应由于炔基基团的缺失而未发生；实验体系B中则含有P3链，因而点击化学反应得以顺利进行。从图中可以看出，在加入氧化石墨烯作用40分钟后，体系A的荧光强度仅小幅下降，而体系B的荧光强度显著降低，这是因为在体系B中，铜纳米颗粒由于点击化学反应的发生而被吸附到氧化石墨烯表面，导致其荧光信号被淬灭。以上结果表明利用“铜纳米颗粒-石墨烯”荧光淬灭纳米探针体系，可以实现对点击化学反应的荧光表征。

实施例二：叶酸受体的定量检测。叶酸受体是在多种恶性肿瘤细胞中过量表达的结合并转录叶酸分子（folate）的细胞表面受体，其检测对于相关癌症的治疗诊断具有重要意义。因此，本发明以叶酸受体的定量检测为例，考察所建立的荧光生物传感方法的可行性。具体涉及寡核苷酸DNA链末端修饰的叶酸分子与叶酸受体之间的特异性识别、结合抑制点击化学反应以及基于“铜纳米颗粒-石墨烯”荧光淬灭纳米探针体系的分析检测，其步骤如下：

取18 μL 10 μM的P1链和18 μL 10 μM的P2链与81 μL MOPS缓冲混合。室温下反应2.5小时后，再往该体系中加入90 μL含有不同浓度叶酸受体（0 nM、0.2 nM、0.4 nM、0.8nM、1.6 nM、3.2 nM、4.8 nM、6.4 nM 和8.0 nM）的样品溶液，37ºC反应60分钟，以使叶酸受体与寡核苷酸DNA链末端修饰的叶酸分子特异性结合。随后，向上述溶液中加入18 μL 含有10 μM P3链的MOPS缓冲以及5 μL 100 mM的抗坏血酸溶液，混匀后再加入230 μL含200 μM硫酸铜的MOPS缓冲，室温下反应30分钟，以进行点击化学反应并合成铜纳米颗粒。最后，向上述溶液中加入40 μL 200 μg/mL的氧化石墨烯，室温下荧光淬灭40分钟后取部分溶液进行荧光检测。

本例中所采用的寡核苷酸DNA链P1和P3的序列以及具体检测步骤与实施例一中相同，P2链序列为5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-folate-3'。

检测结果如图3-图5所示。

图3显示了本发明建立的荧光生物传感方法检测8.0 nM 叶酸受体时所得到的荧光图谱，以及在一系列对照实验中所得到的荧光图谱。如图3a所示，当体系中存在8.0 nM叶酸受体时，荧光图谱在598 nm处出现一个明显的荧光发射峰；而在空白对照组，荧光图谱中只有一个较小的背景信号峰（图3b）。此外，当利用1 μM血红蛋白替代叶酸受体进行反应时，最终检测体系在598 nm处的荧光发射峰强度与空白对照组基本相同（图3c）。以上结果表面该方法可以用于叶酸受体的检测，并且具有良好的特异性。

如图4所示，随着叶酸受体浓度的提高，最终检测体系中铜纳米颗粒的荧光发射峰（598 nm）逐渐上升，这说明随着叶酸受体浓度的增加，越来越多的P1-P2双链通过其末端修饰的叶酸分子与叶酸受体特异性的结合并进而抑制点击化学反应的发生，最终导致越来越少的铜纳米颗粒因被吸附到氧化石墨烯表面而发生荧光淬灭。

图5显示了最终检测体系中铜纳米颗粒在598 nm处的荧光发射强度F₅₉₈值随叶酸受体浓度的变化情况。从图中可以看出，在0.2-8 nM浓度范围内，随着叶酸受体浓度的增加，F₅₉₈值逐渐升高。同时，图5的插入图显示，该方法对叶酸受体检测的线性范围为0.2-6.4nM，检测限为50.8 pM。

实施例三：复杂样品中叶酸受体的检测

为了研究本发明建立的荧光生物传感方法在复杂样品中的检测效果，我们将不同浓度的叶酸受体溶解于人血清中制备得到血清样品（加入叶酸受体浓度分别为0.8 nM、3.2nM和6.4nM），并按照实施例二中的步骤进行荧光检测。如表1所示，血清样品中叶酸受体检测的回收率为99.4~106.2%，表明该方法能够满足复杂样品分析的需要。

表1 血清样品中检测叶酸受体的回收率

实施例四：亲和素的荧光检测。亲和素是一种分子质量为68kD的碱性糖蛋白，其与生物素（biotin）之间高亲和力的相互作用是目前在生物医学领域研究最为深入且应用最为广泛的小分子-靶蛋白结合系统。因此，本发明以亲和素的荧光检测为例，通过改变所使用的小分子配体，进一步考察所建立的荧光生物传感方法应用于小分子配体靶蛋白检测的普适性。具体涉及寡核苷酸DNA链末端修饰的生物素分子与亲和素之间的特异性识别、结合抑制点击化学反应以及基于“铜纳米颗粒-石墨烯”荧光淬灭纳米探针体系的分析检测，其步骤如下：

取18 μL 10 μM的P1链和18 μL 10 μM的P2链与81 μL MOPS缓冲混合。室温下反应2.5小时后，再往该体系中加入90 μL含有不同浓度亲和素（0 nM、4 nM 和10 nM）或非特异性蛋白（100 nM牛血清白蛋白、叶酸受体和血红蛋白）的样品溶液，37ºC反应60分钟，以使亲和素与寡核苷酸DNA链末端修饰的生物素分子特异性结合。随后，向上述溶液中加入18 μL含有10 μM P3链的MOPS缓冲以及5 μL 100 mM的抗坏血酸溶液，混匀后再加入230 μL含200μM硫酸铜的MOPS缓冲，室温下反应30分钟，以进行点击化学反应并合成铜纳米颗粒。最后，向上述溶液中加入40 μL 200 μg/mL的氧化石墨烯，室温下荧光淬灭40分钟后取部分溶液进行荧光检测。

本例中所采用的寡核苷酸DNA链P1和P3的序列以及具体检测步骤与实施例一中相同，P2链序列为5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-biotin-3'。

检测结果如图6和图7所示。

图6显示了本发明建立的荧光生物传感方法检测不同浓度亲和素时所得到的荧光图谱。从图中可以看出，在空白对照组，最终反应体系的荧光发射强度较弱（图6a）；当检测4nM 亲和素时，反应体系所得到的荧光图谱在598 nm处的发射峰有明显的提升（图6b）；而当亲和素浓度进一步增加至10 nM时，598 nm处的荧光发射峰强度得到进一步的增强（图6c）。图7则显示了利用该方法检测10 nM亲和素时所得到的最终反应体系的F₅₉₈值，以及在一系列对照实验中所得到的最终反应体系的F₅₉₈值。如图所示，当检测10 nM 亲和素时，最终反应体系的F₅₉₈值较高；而对于一系列非特异性蛋白，最终反应体系的F₅₉₈值与在空白对照中得到的结果基本相同。以上结果有效地证明，通过选取特定的小分子配体（生物素），该方法同样可以用于亲和素的定性定量检测，且具有很高的特异性。

上述实施例的结果表明，本发明建立的检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法具有很好的灵敏性和特异性，且设计思路简单、实验操作方便，在临床诊断和药物研发等领域中有着很大的潜在应用价值。同时，考虑到小分子配体-靶蛋白相互作用的多样性，通过选取特定的小分子配体，该方法可以应用于不同的小分子配体靶蛋白的分析检测，因而具有良好的普适性。

<110> 上海大学

<120> 基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法

<160> 3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工基因

<400> 1

5'-Azide-GAAGTCATGAGCGTATGAGTA-3 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213>人工基因

<400> 1

5'-TACTCATACGCTCATGACTTC-小分子配体-3' 21

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

5'-CGATCCAGGTCATGC-Alkyne-3' 15

Claims

1.一种基于结合抑制点击化学反应检测小分子配体靶蛋白的荧光生物传感方法，其特征在于该方法的具体步骤为：