CN101666805A - 特异性蛋白检测芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性蛋白检测芯片的制备方法，将至少一条修饰有荧光分子的单链DNA探针化学修饰在贵重金属基片表面，使标记的荧光分子的荧光被贵重金属表面淬灭，处于荧光“关”的状态，具体步骤为：先根据特异性蛋白的种类多样性，筛选出分别与之特异性结合的一类或多类单链DNA探针；再采用不同的荧光分子针对性地修饰各类单链DNA探针一端；最后将荧光分子修饰过的其中一类或多类单链DNA探针修饰固定在贵重金属基片表面，制成特异性蛋白检测芯片。通过单链DNA探针与病变的蛋白质之间特异性的相互作用改变贵重金属基片表面和荧光分子之间的距离，引起荧光分子荧光强度的显著改变，从而实现利用单链DNA探针对特异性蛋白的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物基因芯片的制备方法，尤其涉及一种生物蛋白检测芯片的制备方法，可以用于生物蛋白特异性分析，属于生物信息工程技术领域。
背景技术
DNA是生命重要的遗传物质，人们对于DNA的研究和应用正在不断地深入中，孕育出当前热门的一门基因芯片技术。该技术是将基因探针以微阵列的方式通过化学修饰、固定在固相载体表面。
基因探针又称“寡核苷酸探针”，是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，可以仅仅是基因的一部分；也可以是DNA本身，还可以是由之转录而来的RNA。寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。为了确定寡核苷酸探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。现有比较流行的标记方式是采用荧光基团标记，当目标核酸与基因芯片上的核苷酸片段杂交后，荧光信号的强度便可以示出待检样品中特异性核酸的种类及浓度。
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得的DNA探针数量很多，包括细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
准确、及时、高效、灵敏的医学诊断在人类战胜疾病的过程中扮演着一个关键角色，这是对疾病进行治疗和调控的前提。传统的检测方法，包括免疫层析法、电化学发光、表面等离子共振技术、石英晶体微天平、同位素标记(RIA)、酶标记(ELISA)等分析技术，均不能同时满足制样简单、检测迅速和灵敏度高等要求。随着基因芯片技术研究的深入开展，一种用于特异性蛋白检测、由荧光分子标记的单链DNA探针为检测手段的基因检测芯片，在这些疾病的前期诊疗及后期疗效复检中的作用，已得到了充分的理论证明。但长期以来，对此项技术的研究仅限于理论，而通过实验室制备并对其进行改进的深入研究一直没有得以展开。为此，寻求一种实验室可操作的制备方法，为特异性蛋白检测芯片的工业化制造突破障碍，是从事该领域工作的科研人员的一项重要课题。
发明内容
本发明的目的在于突破现有技术的瓶颈，提供一种特异性蛋白检测芯片的制备方法，通过该种实验室可实施的制备手段，可以提高对待检试液中低浓度的特异性蛋白检测的灵敏度和准确性，提供更具体、更量化的实验方案支持。
本发明的技术方案如下：
特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：将至少类条修饰有荧光分子的单链DNA探针化学修饰在贵重金属基片表面，使标记的荧光分子的荧光被贵重金属表面淬灭，处于荧光“关”的状态，具体步骤如下：
I、根据特异性蛋白的种类多样性，筛选出分别与之特异性结合的一类或多类单链DNA探针；
II、采用不同的荧光分子针对性地修饰各类单链DNA探针一端；
III、将荧光分子修饰过的其中一类或多类单链DNA探针通过化学键合固定在贵重金属基片表面，制成特异性蛋白检测芯片。
上述本发明技术方案第二步中，荧光分子采用荧光范围覆盖整个可见光区的CdSe量子点、或CdS量子点、或CdTe量子点、或CdSe/ZnS量子点、或CdSe/CdS量子点、或CdSe/CdS/ZnS量子点、或CdTe/CdS量子点、或CdTe/ZnS量子点、或CdTe/CdS/ZnS量子点，或者包括但不局限于吲哚类菁染料、花青染料的各种有机荧光分子。
上述本发明技术方案第三步中，具有特异性结合一类特异性蛋白功能的多类单链DNA探针在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，用于某一类特异性蛋白的检测；或者具有特异性结合一类以上特异性蛋白功能的多类单链DNA探针在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，并以特异性蛋白种类所对应的单链DNA探针分组，用于一类以上特异性蛋白的检测。并且，所述贵重金属基片采用金薄膜、银薄膜、或者由金纳米颗粒或银纳米颗粒涂布的玻片而所述化学键合包括但不限于巯基与贵重金属表面形成配位键、或氨基与羧基之间形成酰胺键，或者巯基与碳碳双键之间的加成等。
本发明的显著进步在于：通过单链DNA探针与病变的蛋白质之间特异性的相互作用改变贵重金属基片表面和荧光分子之间的距离，引起荧光分子荧光强度的显著改变，从而实现利用单链DNA探针对特异性蛋白的高灵敏检测。
具体实施方式
本发明通过单链DNA探针与特异性蛋白之间的特异性相互作用改变贵重金属表面和荧光分子之间的距离，引起荧光分子荧光强度的显著改变，并基于该特性制备特异性蛋白的检测芯片。
本发明特异性蛋白检测芯片的制备方法，详细过程是：1)针对不同的重大疾，筛选出与之特异性蛋白专门特异性结合的一类或多类单链DNA探针；2)采用不同颜色的荧光分子针对性地修饰单链DNA探针一端；3)利用上述由荧光分子修饰过的单链DNA探针修饰固定到贵重金属基片表面，使其修饰的荧光分子荧光处于“关”的状态，完成特异性蛋白检测芯片的制作。该检测芯片的工作原理是：加入检测样品，当被检测的样品中没有目标的特异性蛋白时，荧光分子的荧光没有变化，仍然处于“关”的状态；当被检测的样品中含有与单链DNA探针特异性结合的蛋白质时，荧光分子的荧光将处于“开”的状态，荧光强度呈数量级增强，从而实现对特异性蛋白的高灵敏检测。
其中，步骤1)贵重金属采用金纳米颗粒、或银纳米颗粒、或金薄膜、或银薄膜。
步骤2)量子点采用CdSe量子点、或CdS量子点、或CdTe量子点、或CdSe/ZnS量子点、或CdSe/CdS量子点、或CdSe/CdS/ZnS量子点、或CdTe/CdS量子点、或CdTe/ZnS量子点、或CdTe/CdS/ZnS量子点，或者包括但不局限于吲哚类菁染料、花青染料的各种有机荧光分子。上述荧光分子的荧光范围可以覆盖整个可见光区，从紫色到红色。
步骤3)中具有特异性结合一类特异性蛋白功能的多类单链DNA探针可在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，用于某一类特异性蛋白的检测。并且其排布后的化学键合具有多样性，可以包括但不限于巯基与贵重金属表面形成配位键、氨基与羧基之间形成酰胺键、或者巯基与碳碳双键之间的加成等。
步骤4)中具有特异性结合一类以上特异性蛋白功能的多类单链DNA探针在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，并以特异性蛋白种类所对应的单链DNA探针分组，用于一类以上特异性蛋白的检测。
步骤5)中加入检测样品后，当被检测样品中含有与单链DNA特异性作用的特异性蛋白时，引起荧光分子荧光强度的显著变化，实现对样品的高灵敏检测。步骤3)中可以利用不同荧光的荧光分子分别标记同一种特异性蛋白对应的多条单链DNA探针，如果样品检测后，多种荧光分子的荧光强度都出现显著增强，可以定量地判断被检测个体含有此类特异性蛋白的含量，为治疗提供更具体、更量化的方案。步骤4)中可以利用不同荧光的荧光分子分别多种特异性蛋白对应的多条单链DNA探针，如果样品检测后，多种荧光分子的荧光强度都出现显著增强，可以判断被检测个体含有多类特异性蛋白。
实施例1：
将10μL浓度为10μM的单链DNA探针修饰在10nm厚的金膜表面，其中单链DNA的另一端修饰了绿色荧光的量子点。检测前量子点的荧光被金纳米薄膜淬灭。加入血样，5分钟后对样品的荧光强度进行测量，如果绿色荧光增强，说明血样中含有该DNA对应病变一的特异性蛋白。根据标准曲线，计算得到血样中该病变一特异性蛋白的浓度。
实施例2：
将10μL浓度为10μM的单链DNA探针修饰在30nm的银纳米粒子表面，其中单链DNA的另一端修饰了红色荧光的有机染料分子Cy3。Cy3的荧光被银纳米粒子淬灭。加入血样，5分钟后对样品的荧光强度进行测量，如果红色荧光增强，说明血样中含有该DNA对应病变二的特异性蛋白。根据标准曲线，计算得到血样中该病变二特异性蛋白的浓度。
实施例3：
分别将10μL浓度为10μM的单链DNA探针1和单链DNA探针2修饰在30nm厚的金纳米粒子表面，其中单链DNA探针1的另一端修饰了绿色荧光的Cy3，单链DNA探针2的另一端修饰了红色荧光的Cy5。两种荧光都被金纳米粒子淬灭。加入血样，5分钟后对样品的荧光强度进行测量，如果两种荧光分子的荧光强度都增强，说明血样中含有两种探针都对应病变三的特异性蛋白，或者含有两种探针分别对应病变三和病变四的特异性蛋白；并根据标准曲线，计算得到血样中一种或多种特异性蛋白的浓度。
综上所述，本发明利用单链DNA与特异性蛋白之间的相互作用，通过对标志性蛋白质的特异性识别，改变读出光信号的强度，实现对样品的有效、实时、高灵敏检测。通过微机电系统的集成，可以实现该技术方案应用的芯片化，进而提供一种便携式、高通量、高灵敏的重大疾病早期诊断芯片。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (6)
1.特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：将至少类条修饰有荧光分子的单链DNA探针化学修饰在贵重金属基片表面，使标记的荧光分子的荧光被贵重金属表面淬灭，处于荧光“关”的状态，具体步骤如下：
I、根据特异性蛋白的种类多样性，筛选出分别与之特异性结合的一类或多类单链DNA探针；
II、采用不同的荧光分子针对性地修饰各类单链DNA探针一端；
III、将荧光分子修饰过的其中一类或多类单链DNA探针通过化学键合固定在贵重金属基片表面，制成特异性蛋白检测芯片。
2.根据权利要求1所述的特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：步骤II中所述荧光分子采用荧光范围覆盖整个可见光区的CdSe量子点、或CdS量子点、或CdTe量子点、或CdSe/ZnS量子点、或CdSe/CdS量子点、或CdSe/CdS/ZnS量子点、或CdTe/CdS量子点、或CdTe/ZnS量子点、或CdTe/CdS/ZnS量子点，或者包括但不局限于吲哚类菁染料、花青染料的各种有机荧光分子。
3.根据权利要求1所述的特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：步骤III中具有特异性结合一类特异性蛋白功能的多类单链DNA探针在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，用于某一类特异性蛋白的检测。
4.根据权利要求1所述的特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：步骤III中具有特异性结合一类以上特异性蛋白功能的多类单链DNA探针在贵重金属基片表面的不同区域呈阵列排布，并以特异性蛋白种类所对应的单链DNA探针分组，用于一类以上特异性蛋白的检测。
5.根据权利要求1所述的特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：步骤III中所述贵重金属基片采用金薄膜、银薄膜、或者由金纳米颗粒或银纳米颗粒涂布的玻片。
6.根据权利要求1所述的特异性蛋白检测芯片的制备方法，其特征在于：步骤III中所述化学键合包括巯基与贵重金属表面形成配位键、氨基与羧基之间形成酰胺键、或者巯基与碳碳双键之间的加成。
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