CN101384733A - 通过元素分析实施的基因表达检测 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了用于基因表达分析的方法和试剂盒。该方法采用元素标记的寡核苷酸作为探针，随后通过元素分析对其进行分析。还披露了用于分析生物分子的方法和试剂盒，其采用元素标记的载体如珠粒，接着进行元素分析。元素分析可以采用电感耦合等离子质谱(ICP－MS)进行。

Description

通过元素分析实施的基因表达检测
相关申请交叉引用
本申请要求于2006年2月13日提交的标题为“通过ICP-MS对金属标签的寡核苷酸基因的表达分析”美国临时专利申请60/772,588的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
版权和法律声明
本申请文件的披露内容的一部分包含受版权保护的材料。当在专利和商标局专利文件或记录中出现时，版权所有者不禁止传真复制任何本专利文件或专利披露内容，但在其它情况下则保留所有版权。
技术领域
本发明涉及一种采用元素分析用于基因表达分析的快速而灵敏的检测，其使用了标记有元素标签或连接至元素吸入载体的互补寡核苷酸。
背景技术
生物“样品”是指需要分析的生物种类的任何样品。例如，样品可以包括生物分子、组织、流体、以及动物、植物、真菌、或细菌的细胞。它们还可以包括病毒源分子。典型的样品包括但不限于唾液、血、血细胞(例如白细胞)、组织或细针活组织切片、尿、腹水、以及胸膜液、或者来自那里的细胞。生物样品还可以包括组织的切片(section)诸如用于组织学目的所取下的冷冻切片。另一种生物样品的典型来源是病毒和动物、植物、细菌、真菌的细胞培养物，其中可以操纵基因的表达状态以探究基因之间的关系。其它的样品对本领域技术人员来说是已知的。
“RNA样品”是生物样品的核糖核酸(RNA)制品。它不仅包括成熟的mRNA，而且包括RNA加工中间体以及新生的pre-mRNA转录物。例如，用多聚(T)柱纯化的总mRNA含有具有多聚(A)尾巴的RNA分子。这些多聚A+RNA分子可以是成熟的mRNA、RNA的加工中间体、新生转录本或降解中间体。
本文所使用的“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，为单链或双链形式，诸如任何DNA或RNA或DNA/RNA杂交分子。该术语是指任何DNA，包括但不限于，基因组DNA、线粒体DNA、质粒DNA、叶绿体DNA、cDNA、扩增的DNA或RNA片段、总RNA、信使RNA、小核RNA。
“寡核苷酸”是长度范围在2至约1000个核苷酸，更典型地长度为2至约500个核苷酸的单链核酸。它也可以包括“锁核酸”分子(LNA)。
“LNA”是指双环高亲和性RNA类似物，其中通过引入O2′，C4′-亚甲基桥使核糖的呋喃糖环化学地锁定在RNA模拟结构(RNA-mimicking conformation)中，导致对互补DNA和RNA分子的空前杂交亲和性。短LNA修饰的寡核苷酸的热稳定性和改善的错配辨别力使得它们对于单核苷酸多态性(SNP)基因分型、基于反义的基因沉默以及基因表达谱非常有用。
“靶核酸”是指互补寡核酸苷探针特异性杂交到其上的核酸(经常源自生物样品，因而也称为样品核酸)。靶核酸可以源自任何核酸源(例如，包括但不限于化学合成、扩增反应、法医样品，等)。它或者存在或者不存在一种或多种待检测的靶核酸，或者待定量的一种或多种靶核酸的量。被检测的一种或多种靶核酸优选具有这样的核苷酸序列，其互补于它们特异性结合(杂交)的一种或多种对应寡核苷酸探针的核苷酸序列。术语靶核酸可以指探针特异性杂交至其上的较大核苷酸的特定子序列，或指其丰度(浓度)和/或表达水平需检测的整个序列(例如，基因或mRNA)。上述定义的其它变型对本领域技术人员来说是已知的。
“探针”是指通过互补碱基配对(通常是氢键形式)结合至互补序列的靶核酸上的核酸。如本文所使用的，寡核苷酸探针可包括天然(即A、G、C或T)或如本领域技术人员已知的修饰的碱基(例如，但不限于，7-脱氮鸟苷(7-deazaguanosine)，肌苷，等)。另外，在寡核苷酸探针中的碱基可以通过除磷酸二酯键之外的键合(linkage)连接，只要它不干扰杂交。因而，寡核苷酸探针可以是肽核酸，其中构成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键进行连接。特定转录物的表达可以通过多个探针，通常，5、10、15、20、30或40个探针进行检测。各个探针可以靶向转录物的不同子区域。然而，探针可以重叠在靶区域上。可以使用选择程序例如MassachusettsInstitute of Technology(MIT)的Primer 3来选择或设计探针。根据本发明，探针可以在3’或5’端，或者在寡核苷酸的中部用元素标签进行标记。在一种实施方案中，探针通过一个末端被固定在载体上。探针的其它实例对本领域技术人员来说是熟知的。
“载体”是已经通过例如吡咯-2，5-二酮(马来酰亚胺)、磺酸阴离子、或对(氯甲基)苯乙烯(但不限于这些)功能化的表面。载体可以是，例如合成膜、珠粒(聚苯乙烯、琼脂糖、硅石，等)、在塑料微孔中的平的表面、载玻片、反应管等(不限于这些)。载体的功能是作为连接探针或靶分子的固相而发挥作用。而在该定义的另一种变型中，对本领域技术人员来说是已知的，载体是指在两个不同物质状态(液体和固体，固体和固体，液体和液体，液体和气体，气体和固体等)之间的任意表面。
“连接至(到)载体”是指直接连接或间接连接其上，包括通过共价结合、氢键、离子相互作用、疏水相互作用、或使用连接至寡核苷酸探针末端的特异性配体(用于与连接至载体例如珠粒上的配体结合分子进行特异性反应)的连接。例如，这样的系统可以包括生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin)，其中探针携带生物素部分而载体涂覆有链霉亲和素。寡核苷酸探针至载体的共价化学连接可以通过核酸上的5’-磷酸至涂覆载体通过磷酸酰胺键(phosphamidate bond)来完成。连接至载体可以借助间隔分子实现以提供在探针与靶的双链部分之间的间隔1。用于将寡核苷酸固定至载体上的这样的方法在本领域已经很好地建立2-4。而在这个定义的另一种变型中，其对本领域技术人员来说是已知的，连接至载体是指与两个不同物质状态(液体和固体，固体和固体，液体和液体，液体和气体，气体和固体等)之间的界面上的功能连接。
“元素标记的珠粒”是功能地结合或吸收有(imbibed)具有一种或多种同位素的一种元素或多种元素的载体珠粒类型(例如，但不限于，聚苯乙烯、琼脂糖、硅石，等)。对于本领域技术人员已知的是，元素可以是化学结构部分(chemical moiety)的原子部分(atomic part)。
“惟一标记的珠粒”是指在珠粒中吸收有一种或多种元素的一种或多种同位素的大量原子的物理实体，使得通过元素分析使标记有一种类型的所述元素的所述珠粒的一种类型与所述元素的任何其它类型相区别。各个惟一标记的载体具有能够与特定靶核酸特异性地杂交的大量类似或不同的寡核苷酸。
“元素标签(element tag)”是一种化学结构部分(chemicalmoiety)，其包括连接至负载分子结构的具有一种或多种同位素的一种元素原子或大量元素原子。元素标签还包括将标签连接至底物的方式，其可以包括(但不限于)吡咯-2，5-二酮(马来酰亚胺)、磺酸阴离子、或对(氯甲基)苯乙烯(分别用于硫醇、N-末端，或C-末端)。一种元素标签可以与在相同样品中的大量其它元素标签相区分，因为它的元素或同位素组成与其它标签的不同。
“过渡元素”是指具有以下原子序数的任何元素，21-29，39-47，57-79以及89。过渡元素包括稀土元素、镧系元素以及贵金属(Cottonand Wilkinson，1972)。
“亲和性产品”或“亲和性试剂”是指已知的与相应的靶分子(肽、抗原、小分子等)形成高特异性非共价键的生物分子(抗体、适体(aptamer)、凝集素、序列特异性结合肽(sequence-specificbinding peptide)等)。标记有惟一元素标签的亲和性试剂是标记有惟一的并且与相同样品中大量其它元素标签相区别的元素标签的亲和性产品。
“特异性杂交至”，是指当该序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，在严格的条件(stringent condition)下核酸分子优先地结合、双联(duplex)或杂交至特定的核苷酸序列。杂交条件的最优化对本领域技术人员是已熟知的，在WO95/219445中进行了总结。术语“严格的条件”是指在这样的条件下探针将优先地杂交至它的靶序列，较低程度上或者根本不与其它序列杂交。严格的条件取决于序列并且在不同环境下而不同。较长的序列在较高的温度特异性杂交。通常，对于短探针(例如，10至50个核苷酸)，严格的条件是其中盐浓度至少约0.01至1.0M Na+(或其它盐)在pH7.0至8.0并且温度为至少约30℃的条件。正如本领域技术人员已知的，严格的条件也可以用加入破稳剂如甲酰胺来达到。
“原位杂交”是指这样的杂交技术:其中互补单链核酸探针与内源靶分子之间的杂交反应在特别制备的细胞或组织切片中进行而不对靶核酸进行纯化。
“背景信号强度”是指由靶核酸与标记的寡核苷酸(例如，寡核苷酸探针，对照探针，等)之间的非特异性结合、或其它相互作用产生的杂交信号。
“错配探针”提供与样品中不是探针所指向的靶的核酸的非特异性结合或交叉杂交的对照。
“寡(dT)n-元素标签(oligo(dT)n-elemental tag)”是金属标记的寡核苷酸，如在寡(dT)-LNA复合物中，其由数(n)个脱氧胸苷三磷酸核苷和其它核苷构成，用作mRNA的多聚腺苷化区域的杂交探针。脱氧胸苷三磷酸核苷的数量可以在约6至约50的范围。
“元素分析”是这样的过程，其中对样品的元素组成以及有时同位素组成进行分析。元素分析可以通过许多方法实现，包括:光学原子谱，例如火焰原子吸收、石墨炉原子吸收，以及电感耦合等离子体原子发射法，其探测原子的外部电子结构；质谱原子光谱，例如电感耦合质谱，其探测原子的质量；X射线荧光，粒子诱发X射线发射，X射线光电子谱，以及俄歇电子谱，其探测原子的内部电子结构。
“元素分析仪”是采用一种元素分析方法对样品的原子组成进行定量的仪器。
“颗粒元素”分析是其中所分析的样品(由分散在液体中的颗粒(例如在缓冲液中的珠粒)组成)以这样的方式进行查询(interrogate)的过程:针对单个颗粒(例如，逐个珠粒)对原子组成进行记录。分析仪器的实例是基于质谱计的流式细胞仪。
“溶液元素分析”是其中所分析的样品以这样的方式进行查询的过程:元素组成被平均分布在样品的整个体积中。
“内标”被限定为已知量的化合物，与加入到未知物中的分析物不同。来自分析物的信号与来自内标的信号进行比较以确定存在多少分析物。当进行质谱定量时可以使用内标。内标也可以通过对本领域技术人员来说已知的其它方式使用。
“固定和渗透”是指通过试剂例如戊二醛、甲醛、福尔马林、乙醇、甲醇等的细胞成分的化学交联，以及用清洁剂在细胞膜中产生孔。合适的清洁剂可以容易地选自非离子清洁剂。期望这些清洁剂以约0.001％至约0.1％之间的浓度使用。一种可以使用的清洁剂是Triton X-100(Sigma T9284)。其它合适清洁剂的实例包括Igepal和Nonidet P-40。其它合适清洁剂可以由本领域技术人员容易地选择。
人类基因组计划已经打开了大量基因序列信息的通道，这将有助于诊断和治疗多种人类疾病。然而，医药中的基因谱(geneprofiling)要求调整现存的方法并引入新的灵敏并可靠的技术。用于同时监测数千基因的基因组筛选方法包括这样的技术，如DNA微阵列、差异显示、以及基因表达系列分析(SAGE)。所有阵列的基本原理是荧光或生物素标记的由样品RNA产生的cRNA或cDNA物质与连接至固体载体的寡核苷酸或互补DNA分子杂交。目前，基因芯片阵列是所使用的主要平台，其中载玻片表面是底物和荧光——检测方法6-10。平面微阵列的替代是正由Luminex，BDBiosciences，Illumina开发的珠粒阵列以及许多其它(技术)。微球阵列可通过将珠粒用不同比率的荧光染料浸渍或结合量子点(quantum dot)或者通过在珠粒表面上物理蚀刻条形码来产生11。微阵列主要表现来自许多单独细胞的累积信号并且涉及有关单个细胞的信息的损失。样品制品和通用参考标准是关键的，因为从细胞的异质性群体获得的基因组信息会干扰特定癌细胞的基因谱。
DNA诊断方法通常涉及通过聚合酶链式反应(PCR)或其它类似的扩增技术进行靶序列的扩增以提高检验的灵敏度和特异性。在PCR方法12中，制备对靶序列的相对互补链上的区域是互补的两条引物序列。过量的脱氧胸苷三磷酸连同热稳定的DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)加入到反应混合物中。如果靶序列存在于样品中，通过加入核苷酸，引物会结合到靶上并且聚合酶将使得引物沿着靶序列延伸。通过升高和降低反应混合物的温度，延伸的引物反应产物将从靶上分离变成新靶。过量的引物会结合到靶上以及反应产物上，重复该过程。
存在几种用于多重检测单个细胞中的核酸的方法，但它们目前还没有将定量与大量的多重检测(multiplexing)结合。半定量的原位杂交组织化学(ISH)是一种用于检测单个细胞中特异性RNA序列的存在并估计其相对丰度的技术13；14。信号的可视化通常通过发色底物或荧光染料来实现，对于多重检测并不容易修改。细胞遗传学家还研发了一种称为荧光原位杂交(FISH)的独特染色体表征方法15-17，其使用荧光标记的核酸以通过在固定的生物结构和活细胞二者中杂交使互补序列可视化。RNA FISH目的是在细胞分区中定位mRNA的转录位点。Levsky和合作者采用先进的计算机化荧光显微镜和多重寡聚DNA探针的工作18已经证明对原位培养的细胞的细胞核中的十一种基因同时产生FISH谱的可行性。另外，通过使用时移视频显微镜，可以将活细胞中的转录位点、mRNA合成和蛋白产物的可诱导阵列可视化19。基于傅立叶光谱的光谱成像(SIm)已经表明对RNA物质的定量分析20。通过与六个惟一标记的、对于不同的酪氨酸激酶基因具有特异性的cDNA探针杂交来检测RNA的相对量，而光谱图形使用预先记录的基准光谱和去卷积软件进行分析。定量荧光原位杂交(Q-FISH)与流式细胞技术结合(称为流式FISH)已经应用到白细胞系中的端粒长度的研究，其采用优化的用于常规和快速分析的条件21。
因此，用于对单个细胞中基因和蛋白表达分析的高灵敏、定量和多重系统的发展对于分子研究和诊断来说仍然是困难的目标。元素分析，与特定目的的试剂相结合，具有实现这一目标的潜能。
微球或珠粒对于免疫检测的负载表面化学是一种具有吸引力的选择。可以以类似于96孔板的方式，构成或加入各种组合、涂料或轭合基团以提供所需的表面化学。微球的一个优点是能够提高单位体积的反应混合物的反应表面积，这提供了提高免疫检测的能力和动力学范围潜力的可靠方式。在下面的实例中，免疫检测可以与ICP-MS检测相结合22。最初用于多参数细胞分析而研发的流式细胞技术也广泛用于检测轭合到微球表面的抗原和寡核苷酸23。
传统的微球技术(基于荧光染料发射检测)被认为作为一种探测基因组和蛋白质组功能的工具，具有很大的希望。惟一标记的珠粒的颗粒元素分析随时准备彻底变革基因表达研究、临床诊断以及癌症研究。具有嵌入金属的聚苯乙烯珠粒用薄的聚硅烷层涂覆，以防止通常在粘结相色谱(bonded-phase chromatography)中使用的元素浸析。聚苯乙烯珠粒根据传统的乳液聚合进行制备，苯乙烯作为单体而过硫酸钾或过氧化苯甲酰作为聚合剂。等位基因特异性寡核苷酸(互补探针)共价固定在表面上。对于相同的基因，颗粒可以携带1种或多种8不同的互补寡核苷酸探针。与从生物样品中分离的mRNA或PCR产物(靶基因)进行杂交，其中加入元素标签用于靶鉴别。颗粒逐个地进行流式元素分析(flow-elemental analysis)，例如流式ICP-MS以鉴别颗粒种类并且定量基因表达水平。吸收有一种元素(Eu)并用羧基残基衍生的微球可以从Seradyn Inc.获得并且在本申请人的教导中作为主要实验的证据进行试验。对元素标签的要求与荧光标签的那些相比是宽松的，因为元素的化学特性对于通过ICP-MS对其检测来说并不重要。该方法的基本原理要求，元素标签含有一种可重复数量的并且优选大量的给定同位素的原子。所结合的鉴定原子的数量的可重复性对于定量分析来说是基础，那些原子的数量的增加线性地提高了灵敏性。
新型流式类ICP-MS仪器可以用于通过颗粒元素分析对个别白血病细胞的基因表达谱。为了这一目的，大量mRNA种类可以通过原位杂交进行检测。多重检测可以通过用不同稀有金属元素标签标记寡核苷酸探针来实现，其中稀有金属元素标签可以用ICP-MS仪器特异鉴别。RNA检测的灵敏性可以通过每个转录物使用三个至八个寡核苷酸探针并且每个探针标记有给定元素的多个标签来改善。在用多个基因进行多重实验前，各个转录物被分别杂交以确保表达水平独立于多重检测。估计单个细胞表达约10,000个mRNA，总RNA量约1～10pg。在白血病患者样品中，中等丰度的转录物每个细胞20至100个拷贝，而高丰度——超过1000个拷贝的融合转录物。通过流式ICP-MS的单细胞RNA谱与在前进行的微阵列分析的直接比较，可以用来验证该新型方法。所感兴趣的基因的选择可以借助于公共可获得的数据库进行，如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/)、基因组及其表达的集成分子分析(Integrated Molecular Analysis of Genomic and theirExpression)(IMAGE)联盟以及基因组研究院(The Institute forGenomic Rearch)(http://www.tigr.org)。另外，使用具有元素标签的互补寡核苷酸并用均质细胞样品(培养的细胞系、来自原始细胞危象的患者的白血病样品)进行的原位杂交，可以通过溶液ICP-MS进行分析，以确定均布整个样品的平均基因表达谱(示意图在图2A示出)。
针对一些白血病相关基因(G-CSF受体，Bax，Bcl-2，c-Fos等)的、用生物素标记的即用cDNA杂交探针可以由商业来源(Maxim Biotech Inc.，GeneDetect Inc.)和研究实验室获得。寡核苷酸探针可以用软件算法(商业和公共获得)进行设计，用本领域技术人员已知的最优化杂交参数(例如熔化温度(Tm)、50％G+C含量、所期望的探针长度)选择序列。在选择过程中努力使发夹结构和探针之间的二聚体的形成最小化，并减少与其它靶序列的同源杂交(cross-homology)。寡核苷酸可以通过在本领域已知的标准方法合成，例如通过使用自动DNA合成仪(例如可商购自Biosearch，Applied Biosystem等)合成。作为实例，硫代磷酸寡核苷酸可以通过Stein等的方法合成24。在申请人的教导中，通过功能化学，羧基-或氨基烯丙基-修饰的寡核苷酸可以连接至元素标签或惟一标记的载体，例如珠粒。将功能团置于DNA链的5’端并采用合适的试剂以将修饰的DNA连接到惟一标记的载体(例如珠粒)的表面上，将使核酸能够共价连接到载体上。例如，可以使用碳二亚胺(EDC)化学，以将具有胺标记的DNA连接到羧基修饰的颗粒上。
本发明提供了在快速分析成千上百个mRNA分子中的更好的灵敏性和精确性。通过排除mRNA靶的荧光标记进一步提供了检测基因表达水平的改善的功效和精确性，同时确保在生物样品中RNA水平的定量和高通量检测。本发明还可用于检测其它核酸，例如，基因组DNA。例如，单个DNA链在一端连接至元素标签，而整个分子杂交至与惟一标记的载体(例如珠粒)相连的互补寡核苷酸上。
发明内容
本申请人的教导的这些和其它特点叙述如下。
本申请人的教导的一个方面是提供一种用于细胞分析的方法，包括:(a)提供细胞或细胞颗粒；(b)固定细胞或细胞颗粒；(c)用靶核酸特异性的探针在杂交溶液中对细胞或细胞颗粒进行培育，该探针标记有唯一的元素标签，使得标记有一种类型的所述标签的所述探针的一种类型通过元素分析与标记有不同类型的所述标签的所述探针的任何其它类型是可区分的；(d)通过严格的洗涤条件将未杂交的探针与杂交至靶核酸的探针分离；以及(e)通过元素分析对细胞或细胞颗粒进行分析，以鉴别探针并定量结合至靶核酸的探针。标记有不同元素标签的两种或多种不同的探针可以杂交到两种或多种靶核酸上。靶核酸可以选自以下物质组成的组:细胞内核酸分子、基质RNA(matrix RNA)、小RNA(microRNA)、基因转录前体RNA、信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、病毒DNA、病毒RNA、细菌DNA、细菌RNA、以及质粒DNA。该方法可以进一步包括同时分析表面和/或细胞内蛋白分子、表面和/或细胞内脂质分子、表面和/或细胞内多糖分子、和/或表面和/或细胞内小分子。小分子可以选自由维生素、激素、半抗原以及核苷(例如，ATP、ADP、环状AMP和NADH)组成的组。
上述方面的进一步，细胞或细胞颗粒可以与对表面或/和细胞内分子为特异性的亲和性试剂反应，亲和性试剂标记有元素标签，该元素标签包含连接至负载分子结构的、具有一种或多种元素的一种或多种同位素的多个原子的化学结构，使得标记有一种类型的所述标签的所述亲和性试剂的一种类型通过元素分析与所述标签的任何其它类型是可区分的，接着将未结合的亲和性试剂与结合的亲和性试剂分离。表面或/和细胞内分子可以是蛋白质、脂质、多糖和/或小分子。亲和性试剂可以选自由抗体、适体、凝集素和小分子组成的组。细胞可以是动物、植物、细菌或真菌的全细胞。细胞颗粒可以选自由分离的染色体、分离的细胞核、分离的线粒体、分离的叶绿体、分离的病毒、分离的细菌组成的组。探针可以选自由寡核苷酸探针、锁核酸(LNA)分子、肽核酸(PNA)分子、质粒DNA、扩增的DNA、扩增的RNA、RNA片段、基因组DNA片段组成的组。
本申请人教导的另一方面是提供一种用于生物分子均质分析的方法，包括:(a)在使亲和性试剂能够与生物分子结合的条件下，用标记有元素标签的亲和性试剂以及惟一标记的颗粒(使得标记有一种类型的所述标签的所述颗粒的一种类型通过元素分析与标记有不同类型的所述标签的所述颗粒的任何其它类型是可区分的)培育生物分子；(b)将结合有生物分子的颗粒与未结合的颗粒分离；(c)通过颗粒元素分析测定所结合的颗粒，其中颗粒分散在液体中以定量测定单独颗粒的原子组成和同位素组成，从而检测连接到所述颗粒上的生物分子的类型和数量。颗粒可以是珠粒。生物分子可以来自组织或细胞样品。样品可以选自由动物样品、植物样品、细菌样品、以及真菌样品组成的组。生物分子可以选自由mRNA、蛋白质、脂质、多糖以及小分子组成的组。生物分子与亲和性试剂的结合可以包括mRNA分子与连接到惟一标记的微球上的寡核苷酸的杂交。寡核苷酸可以包括多种脱氧胸苷三磷酸核苷(deoxythimidine triphosphate nucleoside)以及连接到惟一标记的微球上的互补核酸探针。互补核酸探针可以选自由寡核苷酸、LNA、PNA以及质粒DNA组成的组。生物分子可以选自由蛋白质、脂质、多糖以及小分子组成的组，它们与连接到惟一标记的微球的元素标记的亲和性试剂相结合。亲和性试剂可以选自由抗体、适体、以及凝集素、核酸、结合肽、蛋白质受体以及磷脂组成的组。
本申请人的教导的另一方面是用于检测和测定样品中元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到与所感兴趣的核酸互补的特异性探针上的元素标签，该试剂盒包括:(a)用于直接标记互补探针的元素标签；以及(b)互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)用元素标签直接标记探针；ii)固定和渗透细胞或细胞颗粒；iii)在杂交溶液中用元素标记的探针培育细胞或细胞颗粒；iv)将结合的探针与未结合的探针分离；v)溶解具有杂交材料的细胞或细胞颗粒；以及vi)检测和测定元素标记的探针。检测和测定可以通过体积元素分析或颗粒元素分析进行。
本申请人的教导的另一方面是提供一种用于检测和测定样品中元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到与所感兴趣的核酸互补的特异性探针上的元素标签，该试剂盒包括:(a)标记有元素标签的互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)固定和渗透细胞或细胞颗粒；ii)在杂交溶液中用元素标记的探针培育细胞或细胞颗粒；iii)将结合的探针与未结合的探针分离；iv)溶解具有杂交材料的细胞或细胞颗粒；以及v)测定和测定元素标记的探针。
上述试剂盒可以进一步包括与多种核酸互补的多种特异性探针以及用于惟一标记各个类型的探针的多种惟一元素标签。上述试剂盒可以进一步包括:(a)用于选自由蛋白质、脂质、多糖和小分子组成的组的细胞内或细胞外生物分子的亲和性试剂；以及(b)对生物分子的亲和性试剂进行标记的元素标签。试剂盒可以包括关于以下的说明书:(i)对生物分子的亲和性试剂进行标记；(ii)用生物分子的亲和性试剂培育细胞或细胞颗粒；(iii)将结合的生物分子的亲和性试剂与未结合的生物分子的亲和性试剂进行分离；(iv)检测和测定结合的生物分子的亲和性试剂。最后，试剂盒可以包括用于多种生物分子的多种特异性试剂以及对用于各个类型的生物分子的各个类型的亲和性试剂进行惟一标记的多种元素标签。
本申请人的教导的另一方面是提供用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到寡(dT)n(其连接到可区分的元素标记的颗粒上)上的元素标签，该试剂盒包括:(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；(b)寡(dT)n；(c)多种可区分的元素标记的颗粒；以及(d)多种互补探针。该试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)将多种互补探针直接连接到可区分元素标记的颗粒上；ii)进行核酸纯化；(iii)将元素标签连接至寡(dT)n；iv)使互补探针与元素标记的寡(dT)n反应；v)在溶液中用靶核酸与连接至元素标记的寡(dT)n的互补探针(其连接到可区分元素标记的颗粒上)杂交；vi)将结合的颗粒与未结合的颗粒分离；vii)通过颗粒元素分析来检测和测定结合的颗粒。该颗粒可以是珠粒。多种互补探针可以用可区分元素标签直接标记。
本申请人的教导的另一方面是提供用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到寡(dT)n上的元素标签(其连接到可区分元素标记的颗粒上)，该试剂盒包括:(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；(b)寡(dT)n；(c)连接到多种可区分元素标记的颗粒上的多种互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)进行核酸纯化；(ii)将元素标签连接至寡(dT)n；(iii)使互补探针与元素标记的寡(dT)n反应；iv)在溶液中用靶核酸与连接到元素标记的寡(dT)n的互补探针(其连接到可区分元素标记的颗粒上)杂交；v)将结合的颗粒与未结合的颗粒分离；vi)通过颗粒元素分析来检测和测定所结合的颗粒。
本申请人的教导的另一方面是用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到寡(dT)n上的元素标签以及连接到互补探针的惟一标记的颗粒的元素，该试剂盒包括:(a)元素标签标记的寡(dT)n；以及(b)连接到多种惟一标记的颗粒上的多种互补探针。试剂盒进一步包括关于以下的说明书:i)进行核酸纯化；ii)用纯化的核酸与连接到惟一标记的颗粒上的互补探针进行杂交；iii)将惟一标记的颗粒与金属标记的寡(dT)n反应；iv)将结合的颗粒与未结合的颗粒分离；v)通过颗粒元素分析来检测和测定结合的颗粒的元素。
在另一方面，颗粒可以被固体载体取代。例如，载体可以是平(例如玻璃或塑料)板、孔板、探针(嵌入到样品中)或其它固体材料。在这种情况下，固体表面不必必须为元素标记的，因为(在板上或孔板上)位置能指示连接其上的互补探针的识别。说明书类似于上述(i)至(v)，但是在这种情况下仅测定连接到寡(dT)n上的元素。
上述的试剂盒可以进一步包括选自以下物质组成的组的试剂和装置:解离溶液(dissociation solution)、具有核酸结合膜的旋转柱(spin column)、用于从生物样品中分离和纯化核酸的纯化柱、用于扩增所纯化的核酸的试剂和溶液、标准品、稀释缓冲液、解离缓冲液、洗涤缓冲液、杂交缓冲液和测定缓冲液。内源核酸可以在形态上完整的细胞中原位扩增。元素可以使用质谱计来测定。元素可以是同位素或离子。元素可以选自以下元素组成的组:过渡元素、贵金属、镧系元素、稀土元素、金、银、铂、铑、铱和钯。该元素可以包括多于一种元素和/或多于一种同位素和/或一种同位素的多于一个原子。亲和性产品可以选自由抗体、Fab′、适体、抗原、激素、生长因子、受体、蛋白质和核酸组成的组。试剂盒还可以包括用于颗粒元素分析的说明书。
附图说明
本领域技术人员应理解，下述的附图仅是用于说明目的。这些附图并不是为了以任何方式限制本申请人的教导的范围。在附图中解释说明本发明，这些附图是为了例示而不是限制。
图1.(A)在三种不同的情况下使用生物素标记的反义寡核苷酸(“寡(oligo)”)对28S rRNA的原位杂交和流式细胞检测。(1)-对应用无义生物素标记的寡核苷酸(“寡”)杂交的阴性对照细胞，(2)-在室温下用4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，接着用蛋白酶K(Proteinase K)(5U/ml)15分钟，用28S rRNA寡核苷酸杂交；(3)-在37℃用4％的多聚甲醛处理细胞15分钟，蛋白酶K(Proteinase K)(5U/ml)15分钟，用28S rRNA寡核苷酸杂交；(4)-在37℃用4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，接着0.3％Triton-X100，接着蛋白酶K(Proteinase K)(5U/ml)15分钟，用28S rRNA寡核苷酸杂交。由(4)所表明的条件被选择用于进一步的实验。(B)通过流式细胞术(左图)和ICP-MS(右图)的28S rRNA原位杂交分析的比较。
图2.通过ICP-MS对白血病细胞中的BCR/Abl(断裂点簇区/阿贝尔松白血病(Abelson leukemia))基因表达分析。(A)用生物素标记的寡核苷酸探针对固定/渗透的细胞进行的用于形成BCR/Abl融合基因的示例性原位杂交。生物素通过标记有铽(Tb)的链霉亲和素(StrAv)来鉴别。将细胞颗粒溶解在HCl中，通过溶液元素ICP-MS分析对细胞颗粒进行分析。用BCR/Abl反义寡探针、28S rRNA(阳性对照)和无义寡探针(B/A)以及无探针(对照)杂交KG-1a细胞(左图)和K562细胞(右图)的实验结果；背景和无义探针对应所减去的值。对样品进行三次重复操作。数据表示为铽(Tb)对铱(Ir)内标信号的归一化比率。
图3.通过ICP-MS对粘附癌细胞的表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达分析。用EGFR、D-细胞周期蛋白基因的基因特异性探针、28S rRNA(阳性对照)以及无义阴性对照，B/A(B/A是用作阴性对照的具有随机名称的随机寡核苷酸)与A431细胞杂交。对样品进行三次重复操作。数据表示为铽(Tb)对铱(Ir)内标信号的归一化比率。
图4.通过ICP-MS在K562白血病细胞中同时进行的蛋白质和基因的表达分析。(A)用28S rRNA和无义寡核苷酸探针(B/A)的原位杂交；(B)在杂交期间对BCR/Abl蛋白质和阴性对照IgG的免疫标记值。对样品进行三次重复操作。数据表示为铕(Eu)或铽(Tb)对铱(Ir)内标信号的归一化比率。
图5.原位杂交和ICP-MS基因表达分析的工作流程图。
图6.通过颗粒元素分析对元素标记的珠粒进行基因表达分析的工作流程图。
图7.通过ICP-MS同时进行基因和蛋白质表达分析的工作流程图。
具体实施方式
本发明包括元素标签的使用。在本申请人的教导的方法中所采用的元素的选择是优选地基于其在所研究的样品中的丰度以及该元素对所研究的样品是否有毒来进行选择的。
在本申请人的教导中，期望应用过渡金属和稀土金属族的多数金属。明智的是，选择具有低毒性或无毒性并在生长介质和生物样品中具有低丰度的元素。例如，钒和汞可能对于某些细胞是有毒的，而Fe、Cu和Zn可以在一些细胞培养介质中以高浓度存在。另一方面，Pr、Ho、Tb、La，例如通常被哺乳动物细胞很好地耐受并且在环境中丰度不高。
可以使用标签元素的不常见的同位素组成以便区分样品中天然存在的元素和标签物质。如果标签元素的相对丰度与所分析的给定样品中的元素的相对丰度充分不同，则是有利的。“充分不同”是指在本发明的方法中可以在所研究的样品中含有的背景元素基础上检测靶元素标签。实际上，正是标记的元素与样品本体的内部元素(inter-element)比率的不同，可有利地用于分析样品。选择在分析期间不产生干扰信号(即不因具有相同质量而具有重叠的信号)的元素标签是可行的。因此，在一种样品中可以同时进行两次或更多分析测定。另外，因为元素标签可包含相同原子的多个拷贝而制成，因此测定的信号可以大大放大。
本申请人的教导的这些方面可以通过以下实施例而进一步理解，这些实施例不应解释为以任何方式限制本发明教导的范围。
实验1
在一种实施方案中，其中工作流程图示于图5中，通过以下步骤进行了用于ICP-MS检测的原位杂交:首先以这样一种方式处理组织或细胞样品，以使靶染色体核酸和染色体外(extrachomasomal)核酸能够用于与互补探针杂交(固定/渗透)；然后将样品暴露给标记有不同元素标签并与所感兴趣的基因互补的一种探针或多种探针；第三，洗涤样品以去除过量的未结合和非特异性相互作用的探针；最后，对样品进行颗粒或溶液元素分析。
实验2
对于通过ICP-MS对元素标记的珠粒进行基因分析(工作流程图示于图6)，总RNA从生物样品分离，用轭合至寡核苷酸探针上的唯一标记的珠粒与其杂交；将元素标记的寡(dT)20探针；加入混合物中；最后，珠粒进行单颗粒ICP-MS分析。
使用本领域已知的方法从给定样品中分离总RNA。例如，可以使用酸性胍盐-苯酚-氯仿提取法，或者可以使用商业试剂如TRIzol试剂(GIBCOL Life Technologies)用于从哺乳动物组织分离RNA。另外，可通过寡dT柱色谱或通过使用(dT)n磁珠(见，例如，Sambrook et al.25，F.Ausubel et al.26)分离信使RNA。方便地，使用RNeasy总RNA分离试剂盒，例如(QIAGEN)可以将总RNA从哺乳动物细胞中分离。TRIzol提取中在乙醇沉淀步骤后用Rneasy总RNA提取试剂盒进行第二次清除可能是有利的。可以需要一轮的RNA扩增(Ambion试剂盒)。本领域技术人员将明了，这提供了反义(aRNA)池。反义RNA用作靶核酸时，选择与反义核酸的子序列互补的寡核苷酸探针。相反，当靶核酸池是正义核酸池时，选择与正义核酸的子序列互补的寡核苷酸探针。最后，当核酸池是双链时，探针可以是正义的或反义的，因为靶核酸包括正义和反义链二者。
表达水平对照是与生物样品中组成型表达的基因特异性杂交的探针，并用于进行归一化。实际上任何组成型表达的基因提供用作表达水平对照的合适靶。通常，表达水平对照探针具有与组成型表达的“管家基因(housekeeping gene)”(包括但不限于β-肌动蛋白基因、转铁蛋白受体基因、GAPDH基因、HPRT、CPB、G6PD、28S rRNA以及类似物的)子序列互补的序列。
本发明的方法可以用于核酸检测，以及蛋白质检测(用于鉴别细菌、法医科学)以及同时进行基因和蛋白质表达分析。
该方法还可以使用本领域技术人员已知的载体，例如载玻片、板或孔，代替珠粒或颗粒。
在这种方法的变型中，生物分子(例如但不限于蛋白质、脂质、多糖)，结合标记有元素标签并与涂覆有生物分子的“亲和性试剂”的唯一标记的载体结合的特异小分子(例如但不限于药物、激素、信息素、糖)。然后通过元素分析对载体进行分析，以鉴别所述生物分子与小分子的反应(例如，作为受体结合生长因子)。在这种情况下，小分子直接被标记，小分子分析物的识别是依靠于它们经由亲和性试剂与元素标记的珠粒的结合，而珠粒元素识别标志与小分子的标签识别标志共同确认并量化小分子。
实验3
在另一种实施方案中，实施例的第一系列采用传统的ICP-MS仪器作为检测器和含有亲和性试剂的商购金属(镧系元素)进行。应当理解，可以使用其他金属并可以使用其他仪器用于元素分析。使用了采用生物素标记的反义寡核苷酸探针(其设计成与人类白血病细胞中特异的、疾病相关基因原位杂交)。通过与镧系元素标记的链霉亲和素联合来鉴别探针(见图2A)。
对模型人类白血病细胞系试验了用ICP-MS检测进行原位杂交的可行性，结果与流式细胞术进行比较(如图1所示)。进行实验以确定最优的固定和渗透条件以及用于悬浮细胞(其随后用于ICP-MS基因表达分析)的原位杂交参数。如图1所示将KG-1A细胞固定(图注)，然后在杂交溶液中用500ng/ml的生物素标记的28SrRNA探针(5’-生物素-ATCCAACGCTTGGTGAATTC-3’，人类28S核糖体RNA GI:337381)或无义生物素标记的探针(B/A；阴性对照)进行培育。接着洗涤和封闭反应(blocking)，加入链霉亲和素-PerCP(标记有苷叶绿素(peridin chlorophyll)的链霉亲和素-一种蛋白质)。图1A示出了由FACSCalibur(BD Biosciences)流式细胞仪获得的荧光强度图。图1B示出了ICP-MS体积块分析(volumebulk analysis):杂交的细胞与链霉亲和素-Tb(DELFIA)反应，洗涤并溶解在具有1ppb Ir(铱内标)的浓盐酸中。通过流式细胞仪(FCM)和ICP-MS检测均有清楚的人类28S rRNA的杂交信号。因此，建立了使用标记有金属的第二亲和性试剂(链霉亲和素-Tb)实验条件用于通过ICP-MS成功鉴别在白血病细胞中的高丰度组成型转录本。
实验4
下面的实施例表明用ICP-MS检测的原位杂交是灵敏的，足以检测中等丰度的白血病特异性基因种类。为了这一目的，使用了人慢性髓系白血病细胞系(K562)(已知其表达由b3a2编码的BCR/Abl致癌激酶)和反义寡核苷酸。实验的示意图示于图2A中。我们比较了使用5’-生物素标记的BCR/Ab特异性反义探针(BCR/ABL)、5’-生物素标记的28S rRNA探针(阳性对照)以及生物素标记的无义探针(B/A)在K562细胞和KG-1A细胞(急性髓系白血病模型细胞系；不表达BCR/Abl转录本)中b3a2融合基因的表达。如图1所述将细胞固定和渗透，然后在或者含有生物素标记的BCR/Abl、28S rRNA、无义探针或者不含探针的杂交溶液中培育分离的细胞样品。接着洗涤和封闭(blocking)，加入链霉亲和素Tb。通过溶液元素分析进行分析，其中所标记的细胞溶解在HCl/Ir中，而全部样品(每个样品0.3e6个KG1a细胞和3e6个K562细胞)用常规的ICP-MS仪器进行元素分析。结果示于图2B中。左边的图表明当在KG-1a细胞中的28S rRNA水平非常高时，来自BCR/Abl探针的信号在无义(B/A)和阴性对照(ctrl)的反应水平上。另一方面，K562细胞(图2B中的右图)与BCR/Abl探针强烈杂交，比与28S rRNA的杂交低约14倍。这样，ICP-MS可靠地检测了在K562细胞中的BCR/Abl基因水平。
实验5
而在另一种实施方案中，使用粘附A431人类表皮癌细胞进行了原位杂交实验。已知这些细胞过度表达表皮生长因子受体(EGFR)。将细胞接种到组织培养级96多孔板(tissue culture grade96-multiwell plate)中，并使其连接(attachment)和增殖两天(每孔约75e3个细胞)。根据图1的图注的方法(4)将细胞固定和渗透；洗涤并在孔中用5’-标记有生物素的反义寡核苷酸探针:28SrRNA、EGFR、D-细胞周期蛋白基因以及B/A杂交。每个探针重复孔。探针与链霉亲和素-Tb反应。在洗涤后，将细胞溶解在HCl/Ir中并通过溶液ICP-MS进行分析。如来自图3的证据，A431细胞表达了较高量的EGFR、mRNA，实质上较低水平的D-细胞周期蛋白基因(并不是所有的细胞都增殖)并且示出了对阳性探针，28S rRNA的强响应。
实验6
下面的实验说明了本申请人的教导在相同细胞中同时检测蛋白质和基因表达的独特能力(见图7)。为了这一目的，我们使用K562模型细胞系，其表达高水平的p210 BCR/Abl蛋白质。将识别BCR/Abl蛋白质(Cell Singalling Techno.，Inc)的第一抗体或同型(isotype)对照IgG用于在PermFlow溶液(InVirion，Inc.)中固定和渗透的细胞上。然后用PBS洗涤细胞，与第二抗兔-Eu偶联物(DELFIA，Perkin Elmer)反应(见图4B)。接着将免疫标记的细胞在DAKO原位杂交溶液(DAKO，Inc.)中预杂交，并用5’-生物素标记的-28S核糖体RNA反义探针或者用5’-生物素标记的-B/A无义探针作为阴性对照在室温下杂交2小时。用4xSSC、2x SSC、0.2xSSC和PBS进行严格的洗涤(stringent wash)以将非特异性杂交最小化。最后，细胞用链霉亲和素-Tb偶联物(DELFIA)培育，并溶解在HCl/Ir中(图4A)。如来自对比图4A和图4B的证据，对于BCR/Abl蛋白质表达(Eu)染色和对核糖体基因表达(Tb)探针标记的细胞，给出了比IgG对照染色和B/A探针标记的细胞显著更高的信号。
试剂盒:
本发明还提供了包括实现本发明方法的成分的试剂盒。
例如，提供了用于检测和测定样品中的元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到与所感兴趣核酸互补的特异性探针上的元素标签，试剂盒包括:(a)用于直接标记互补探针的元素标签；以及(b)互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)用元素标签对探针直接标记；ii)固定和渗透细胞或细胞颗粒；iii)在杂交溶液中用元素标记的探针培育细胞或细胞颗粒；iv)将结合的探针与未结合的探针分离；v)将具有杂交的材料的细胞或细胞颗粒溶解；以及vi)测定和测定元素标记的探针。检测和测定可以通过溶液元素分析或颗粒元素分析进行。
还提供了用于检测和测定样品中元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到与所感兴趣核酸互补的特异性探针上的元素标签，该试剂盒包括:(a)标记有元素标签的互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)固定和渗透细胞或细胞颗粒；ii)在杂交溶液中用元素标记的探针培育细胞或细胞颗粒；iii)将结合的探针与未结合的探针分离；iv)将具有杂交材料的细胞或细胞颗粒溶解；以及v)测定和测定元素标记的探针。
上述试剂盒可以进一步包括与多种核酸互补的多种特异性探针以及用于惟一标记各个类型探针的多种惟一元素标签。上述试剂盒可以进一步包括:(a)用于选自由蛋白质、脂质、多糖和小分子组成的组的细胞内或细胞外生物分子的亲和性试剂；以及(b)用于对生物分子的亲和性试剂进行标记的元素标签。试剂盒可以包括关于以下的说明书:(i)对生物分子的亲和性试剂进行标记；(ii)用生物分子的亲和性试剂对细胞或细胞颗粒进行培育；(iii)将结合的生物分子的亲和性试剂与未结合的生物分子的亲和性试剂进行分离；(iv)检测和测定结合的生物分子的亲和性试剂。最后，试剂盒可以包括用于多种生物分子的多种特异性试剂以及用于对各个种类的生物分子的各个种类的亲和性试剂进行惟一标记的多种元素标签。
提供了用于检测和测定元素的另一种试剂盒，其中所测定的元素的是连接到寡(dT)n以及唯一标记的颗粒的元素上的元素标签，该试剂盒包括:(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；(b)寡(dT)n；(c)多种唯一标记的颗粒；以及(d)多种互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)将多种互补探针直接连接到唯一标记的颗粒上；ii)进行核酸纯化；(iii)将元素标签连接到寡(dT)n；iv)使连接到唯一标记的颗粒上的互补探针与纯化的核酸杂交；v)将结合的唯一标记的颗粒与金属标记的寡(dT)n反应；vi)将结合的颗粒与未结合的颗粒分离；vii)通过颗粒元素分析来检测和测定结合的颗粒的元素。颗粒可以是珠粒。在另一方面，颗粒可以被固体载体取代。例如，载体可以是平(例如玻璃或塑料)板、孔板、探针(嵌入到样品中)或其他固体材料。在这种情况下，固体表面并不必必须为元素标记的，因为位置(在板上或孔板上)能指示连接其上的互补探针的识别。说明书类似于上述(i)至(v)，但是在这种情况下仅测定连接到寡(dT)n上的元素。
提供了另一种用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素的是连接到寡(dT)n(寡(dT)n连接到可区分元素标记的颗粒上)上的元素标签，试剂盒包括:(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；(b)寡(dT)n；(c)连接到多种可区分元素标记的颗粒上的多种互补探针。试剂盒可以进一步包括关于以下的说明书:i)进行核酸纯化；(ii)将元素标签连接到寡(dT)n；iii)使互补探针与元素标记的寡(dT)n反应；iv)在溶液中使连接到元素标记的寡(dT)n的互补探针(其连接到可区分元素标记的颗粒上)与靶核酸杂交；v)将结合的颗粒与未结合的颗粒分离；vi)通过颗粒元素分析来检测和测定结合的颗粒。
在另一方面，颗粒可以被固体载体取代。例如，载体可以是平(例如玻璃或塑料)板、孔板、探针(嵌入到样品中)或其他固体材料。在这种情况下，固体表面不必必须是元素标记的，因为位置(在板上或孔板上)能指示连接其上的互补探针的标识。说明书类似于上述(i)至(v)，但是在这种情况下仅测定连接到寡(dT)n上的元素。
上述的试剂盒可以进一步包括选自由以下组成的组的试剂和装置:解离溶液(dissociation solution)、具有核酸结合膜的旋转柱(spin column)、用于从生物样品中分离和纯化核酸的纯化柱、用于扩增纯化的核酸的试剂和溶液、标样、稀释缓冲液，解离缓冲液、洗涤缓冲液、杂交缓冲液和测定缓冲液。内源核酸可以在形态上完整的细胞中原位扩增。元素可以使用质谱计来测定。元素可以是同位素或离子。元素可以选自以下元素组成的组:贵金属、镧系元素、稀土元素、金、银、铂、铑、铱和钯。元素可以包括多于一种元素和/或多于一种同位素和/或多于一种同位素的原子。亲和性产品可以选自由抗体、Fab′、适体、抗原、激素、生长因子、受体、蛋白质和核酸组成的组。试剂盒还可以包括用于颗粒元素分析的说明书。
试剂盒可以包括以下成分:
(a)原位扩增试剂；
(b)核酸纯化试剂和装置；
(c)原位杂交缓冲液；
(d)固定和渗透溶液；
(e)洗涤溶液；
(f)溶解试剂。
本申请人的教导提供了上述披露的方法。这些方法允许:
(a)多重进行(multiplexing)；
(b)蛋白质和基因表达的同时分析；
(c)具有或不具有扩增步骤的方法；
(d)没有昂贵聚合酶的低成本分析；
(e)在单细胞中的基因分析；
(f)基因表达的绝对定量。
在本披露内容中所引用的所有参考文献通过引用全文合并于此。
尽管结合各种实施方式描述了本申请人的教导，这并不是为了将本申请人的教导限于这些实施方式。相反，本申请人的教导包括作为本领域技术人员所意识到的各种替换、改变以及等价物。
参考文献列表
1.Lockhart，D.J.，Chee，M.，Gunderson，K.，Lai，C，Wodicka，L.，Cronin，M.T.，Lee，D.，Tran，H.M.，Matsuzaki，H.，Gall，G.H.，Barone，A.D.，Mcgall，G.H.，Chaoqiang，L.，and Lee，D.H.Identifying differences in nucleic acid levels between samples-using arrays comprising probe oligo:nucleotide(s)which can formhybrid duplexes with nucleic acids in the samples.AFFYMETRIXINC，Lockhart，D.J.，Chee，M.，Gunderson，K.，Lai，C，Wodicka，L.，Cronin，M.T.，Lee，D.H.，Tran，H.M.，Matsuzaki，H.，Mcgall，G.H.，and Barone，A.D.[EP880598-A；WO9727317-A；WO9727317-A1；AU9722533-A；EP880598-A1；US6344316-B1；JP2002515738-W；US2003064364-A1；US6858711-B2；US2005158772-A1；US2005191646-A1].
2.Pease，A.C；Solas，D.；Sullivan，E.J.；Cronin，M.T.；Holmes，C.P；Fodor，S.P.A.Light-Generated Oligonucleotide Arrays for RapidDna-Sequence Analysis Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，1994，91，5022-26.
3.Guo，Z.；Guilfoyle，R.A.；Thiel，A.J.；Wang，R.；Smith，L.M.Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms byhybridization with oligonucleotide arrays on glass supportsNucleic Acids Res.1994，22，5456-65.
4.Gravitt，P.E.；Peyton，C.L.；Apple，R.J.；Wheeler，C.M.Genotyping of 27 human papillomavirus types by using L1consensus PCR products by a single-hybridization，reverse lineblot detection method Journal of Clinical Microbiology 1998，36，3020-27.
5.Rosenberg，M.，Debouck，C，and Bergsma，D.Methods andcompsns.for identifying genes which are differentially expressed-in a normal healthy animal and an animal having a selected diseaseor infection.SMITHKLINE BEECHAMCORP.[W O9521944-A；EP743989-A；EP743989-A4；WO9521944-A1；EP743989-A1；JP9508800-W].
6.Lipshutz，R.J.；Fodor，S.P.；Gingeras，T.R.；Lockhart，D.J.Highdensity synthetic oligonucleotide arrays Nat.Genet.1999，21，20-24.
7.Churchill，G.A.Fundamentals of experimental design for cDNAmicroarrays Nat.Genet.2002，32 Suppl，490-95.
8.Churchill，G.A.Fundamentals of experimental design for cDNAmicroarrays Nat.Genet.2002，32 Suppl，490-95.
9.Weeraratna，A.T.；Nagel，J.E.；Mello-Coelho，V.；Taub，D.D.Gene expression profiling:from microarrays to medicine J Clin.Immunol.2004，24，213-24.
10.Wang，D.，Li，G.，Ma，X.，Liu，C，Zhou，Y.，and Cheng，J.Detectinga target nucleic acid molecule，for use in clinical diagnosis，comprises incubating the cell lysate，without nucleic acidpurification，with a nucleic acid probe，allowing hybridization.UNIV QINGHUA and CAPITAL BIOCHIP CO LTD.[WO2005017193-A1；AU2003257371-A1；CN1580283-A].
11.Venkatasubbarao，S.Microarrays—status and prospects TrendsBiotechnol.2004，22，630-37.
12.Mullis，K.B.，Arnheim，N.，Saiki，R.K.，Erlich，H.A.，Horn，G.T.，Scharf，S.J.，Banks，Mullis K.，and Keichi，Saiki R.Process foramplifying detecting or cloning nucleic acid sequences-useful indisease diagnosis and in prepn.of transforming vectors.CETUSCORP，HOFFMANN LA ROCHE & CO AG，and HOFFMANNLA，R.O.C.H.[EP200362-A2；EP200362-A3；JP92067957-B2；JP92067960-B2；EP200362-A1；EP200362-B；EP200362-A；AU8655322-A；AU8655323-A；JP61274697-A；JP62000281-A；DK8601448-A；DK8601449-A；US4683195-A；US4683202-A；ES8706822-A；ES8706823-A；ZA8602334-A；ZA8602335-A；ES8800356-A；ES8800357-A；CA1237685-A；US4800159-A；US4683202-B；IL78281-A；CA1291429-C；IL78284-A；JP92067957-B；JP92067960-B；EP200362-Bl；DE3687537-G；JP6007166-A；DK171160-B；DK171161-B；JP2546576-B2；IE83456-B；IE83464-B；US4683195-B；CA1340121-E].
13.Kadkol，S.S.；Gage，W.R.；Pasternack，G.R.In situ hybri dization-Theory and practice Molecular Diagnosis 1999，4，169-83.
14.Jonker，A.；deBoer，P.A.J.；vandenHoff，M.J.B.；Lamers，W.H.；Moorman，A.F.M.Towards quantitative in situ hybridizationJournal of Histochemistry & Cytochemistry 1997，45，413-23.
15.Raap，A.K.Advances in fluorescence in situ hybridization Mutau.Res.1998，400，287-98.
16.Tanke，H.J.；Dirks，R.W.；Raap，T.FISH andimmunocytochemistry:towards visualising single target moleculesin living cells Curr.Opin.Biotechnol.2005，16，49-54.
17.Levsky，J.M.；Singer，R.H.Fluorescence in situ hybridization:past，present and future J CellSci.2003，116，2833-38.
18.Levsky，J.M.；Shenoy，S.M.；Pezo，R.C；Singer，R.H.Single-cellgene expression profiling Science 2002，297，836-40.
19.Janicki，S.M.；Tsukamoto，T.；Salghetti，S.E.；Tansey，W.P.；Sachidanandam，R.；Prasanth，K.V.；Ried，T.；Shav-Tal，Y.；Bertrand，E.；Singer，R.H.；Spector，D.L.From silencing to geneexpression:Real-time analysis in single cells Cell 2004，116，683-98.
20.Weier，H.U.；Chu，L.W.；Murnane，J.P.；Weier，J.F.Applicationsand technical challenges of fluorescence in situ hybridization instem cell research Blood Cells Mol.Dis.2004，32，68-76.
21.Derradji，H.；Bekaert，S.；VanOostveldt，P.；Baatout，S.Comparison of different protocols for telomere length estimationby combination of quantitative fluorescence in situ hybridization(Q-FISH)and flow cytometry in human cancer cell linesAnticancer Res.2005，25，1039-50.
22.Baranov，V.L；Quinn，Z.；Bandura，D.R.；Tanner，S.D.A sensitiveand quantita-tive element-tagged immunoassay with ICPMSdetection Analytical Chemistry，2002，74，1629-36.
23.Zhang，Q.Y.；Garner，K.；Viswanatha，D.S.Rapid detection ofleukemia-associated translocation fusion genes using a novelcombined RT-PCR and flow cytometric method Leukemia 2002，16，144-49.
24.Stein，C.A.；Subasinghe，C；Shinozuka，K.；Cohen，J.S.Physicochemical Properties of PhosphorothioateOligodeoxynucleotides Nucleic Acids Research 1988，16，3209-21.
25.Sambrook et al.，in Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989).
26.Ausubel et al.，in Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley-Intersciences(1987).

Claims (57)

1.一种用于细胞分析的方法，包括:
(a)提供细胞或细胞颗粒；
(b)固定并渗透所述细胞或所述细胞颗粒；
(c)在杂交溶液中用对靶核酸特异的探针培育所述细胞或所述细胞颗粒，所述探针标记有惟一的元素标签使得标记有一种类型的所述标签的所述探针的一种类型通过元素分析与标记有不同类型的所述标签的所述探针的任何其它类型是可区分的；
(d)通过严格的洗涤条件将未杂交的探针与杂交至所述靶核酸的探针分离；以及
(e)通过元素分析对所述细胞或细胞颗粒进行分析，以鉴别所述探针并对结合至所述靶核酸的探针进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中标记有不同元素标签的两种或更多种不同的探针被杂交到两个或更多个靶核酸上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸选自以下组成的组:细胞内核酸分子、基质RNA、小RNA、基因转录前体RNA、信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、染色体DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、病毒DNA、病毒RNA、细菌DNA、细菌RNA、以及质粒DNA。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括同时分析表面和/或细胞内蛋白分子。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括同时分析表面和/或细胞内脂质分子。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括同时分析表面和/或细胞内多糖分子。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括同时分析表面和/或细胞内小分子，所述小分子选自由维生素、激素、半抗原以及核苷组成的组。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核苷选自由ATP、ADP、环状AMP和NADH组成的组。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之后，所述细胞或细胞颗粒与对表面或/和细胞内蛋白质特异的亲和性试剂反应，所述亲和性试剂标记有包含连接至负载分子结构的一种或多种元素的一种或多种同位素的多种原子的化学结构的元素标签，使得标记有一种类型的所述标签的所述亲和性试剂的一种类型通过元素分析与所述标签的任何其它类型是可区分的，接着将结合的亲和性试剂与未结合的亲和性试剂分离。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述亲和性试剂选自由抗体、适体、凝集素和小分子组成的组。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)之后，所述细胞或细胞颗粒与对表面或/和细胞内分子特异的亲和性试剂反应，所述亲和性试剂标记有元素标签，使得标记有一种类型的所述标签的所述亲和性试剂的一种类型通过元素分析与所述标签的任何其它类型是可区分的，接着将未结合的亲和性试剂与结合的亲和性试剂分离。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面或/和细胞内分子是脂质。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面或/和细胞内分子是多糖。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述表面或/和细胞内分子是小分子。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述亲和性试剂选自由抗体、适体、凝集素和小分子组成的组。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是动物、植物、细菌或真菌的全细胞。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞颗粒选自由分离的染色体、分离的细胞核、分离的线粒体、分离的叶绿体、分离的病毒、分离的细菌组成的组。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针选自由寡核苷酸探针、锁核酸(LNA)分子、肽核酸(PNA)分子、质粒DNA、扩增的DNA或其片段、扩增的RNA或其片段、RNA的片段以及基因组DNA片段组成的组。
19.一种用于在溶液中生物分子的均质分析的方法，包括:
(a)在使亲和性试剂能够与生物分子结合的条件下，用标记有元素标签的所述亲和性试剂以及惟一标记的载体对所述生物分子进行培育，使得标记有一种类型的所述标签的所述载体的一种类型通过元素分析与标记有不同类型的所述标签的所述载体的任何其它类型是可区分的；
(b)将所述结合有生物分子的载体与未结合的载体分离；
(c)通过颗粒元素分析测定所述结合的载体，其中所述载体分散在液体中以定量测定单独载体的原子和同位素组成，从而检测连接到所述载体上的生物分子的类型和数量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述载体选自由颗粒、微球以及珠粒组成的组。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物分子来自组织或细胞样品。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品选自由动物样品、植物样品、细菌样品、以及真菌样品组成的组。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物分子选自由mRNA、蛋白质、脂质、多糖以及小分子组成的组。
24.根据权利要求19所述的方法，其中所述生物分子与所述亲和性试剂的结合包括mRNA分子与连接到惟一标记的微球上的寡核苷酸的杂交。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述寡核苷酸包括多个脱氧胸苷三磷酸核苷以及连接到惟一标记的微球上的互补核酸探针。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述互补核酸探针选自由寡核苷酸、LNA、PNA以及质粒DNA组成的组。
27.根据权利要求19所述的方法，进一步包括将所述生物分子结合到特异性小分子上，其中所述小分子标记有元素标签，所述元素标签结合了覆盖有对所述生物分子的亲和性试剂的唯一标记的载体，接着通过元素分析以鉴别所述生物分子与所述小分子的反应。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述亲和性试剂选自由抗体、适体、以及凝集素、核酸、结合肽、蛋白质受体以及磷脂组成的组。
29.一种用于检测和测定样品中元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到与所感兴趣的核酸互补的特异性探针上的元素标签，所述试剂盒包括:
(a)用于直接标记互补探针的元素标签；以及
(b)互补探针。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:i)用所述元素标签对所述探针直接标记；ii)固定和渗透细胞或细胞颗粒；iii)在杂交溶液中用所述元素标记的探针培育所述细胞或细胞颗粒；iv)将结合的探针与未结合的探针分离；v)将具有杂交材料的所述细胞或细胞颗粒溶解；以及vi)检测和测定所述元素标记的探针。
31.一种用于检测和测定样品中元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到与所感兴趣核酸互补的特异性探针上的元素标签，所述试剂盒包括:
(a)标记有元素标签的互补探针。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:i)固定和渗透所述细胞或细胞颗粒；ii)在杂交溶液中用所述元素标记的探针培育所述细胞或细胞颗粒；iii)将结合的探针与未结合的探针分离；iv)将具有杂交材料的所述细胞或细胞颗粒溶解；以及v)检测和测定所述元素标记的探针。
33.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述检测和测定通过溶液元素分析进行。
34.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述检测和测定通过颗粒元素分析进行。
35.根据权利要求29至34任一项所述的试剂盒，进一步包括与多种核酸互补的多种特异性探针以及用于惟一标记各个类型的探针的多种的惟一元素标签。
36.根据权利要求29至35任一项所述的试剂盒，进一步包括:
(i)用于选自由蛋白质、脂质、多糖和小分子组成的组中的细胞内或细胞外生物分子的亲和性试剂；以及
(ii)用于对所述生物分子的所述亲和性试剂进行标记的元素标签。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:(i)对所述生物分子的所述亲和性试剂进行标记；(ii)用所述生物分子的所述亲和性试剂对所述细胞或细胞颗粒进行培育；(iii)将结合的所述生物分子的亲和性试剂与未结合的所述生物分子的亲和性试剂进行分离；以及(iv)检测和测定结合的所述生物分子的亲和性试剂。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，包括用于多种生物分子的多种特异性试剂以及用于对各个种类的生物分子的各个种类的亲和性试剂进行惟一标记的多种元素标签。
39.一种用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到寡(dT)n以及连接到互补探针上的唯一标记的载体的元素上的元素标签，所述试剂盒包括:
(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；
(b)寡(dT)n；
(c)至少一种唯一标记的载体；以及
(d)多种互补探针。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:i)将所述多种互补探针直接连接到唯一标记的载体上；ii)进行核酸纯化；(iii)将所述元素标签连接到所述寡(dT)n；iv)使连接到唯一标记的载体上的所述互补探针与纯化的核酸杂交；iii)将结合的唯一标记的载体与所述金属标记的寡(dT)n反应；iv)将未结合的核酸与结合的核酸分离；v)通过元素分析来检测和测定所结合的载体的元素。
41.根据权利要求39或40所述的试剂盒，其中存在多种载体并且所述载体是颗粒或珠粒。
42.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述多种互补探针直接用可区分的元素标签标记。
43.一种用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到寡(dT)n上以及连接到互补探针上的唯一标记的载体的元素上的元素标签，所述试剂盒包括:
(a)用于直接标记寡(dT)n的元素标签；
(b)寡(dT)n；以及
(c)连接到至少一种唯一标记的载体上的多种互补探针。
44.根据权利要求43所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:i)进行核酸纯化；(ii)将所述元素标签连接到寡(dT)n；iii)使所述互补探针与所述元素标记的寡(dT)n反应；iv)用连接至唯一标记的载体上的所述互补探针与纯化的核酸杂交；iii)将结合的唯一标记的载体与所述金属标记的寡(dT)n反应；iv)将未结合的核酸与结合的核酸分离；v)通过元素分析来检测和测定结合的载体的元素。
45.用于检测和测定元素的试剂盒，其中所测定的元素是连接到寡(dT)n上并连接到互补探针上的唯一标记的载体的元素上的元素标签，所述试剂盒包括:
(a)元素标签标记的寡(dT)n；以及
(b)连接到至少一种惟一标记的载体上的多种互补探针。
46.根据权利要求45所述的试剂盒，进一步包括关于以下的说明书:i)进行核酸纯化；ii)将连接到惟一标记的载体上的所述互补探针与纯化的核酸进行杂交；iii)将结合的惟一标记的载体与所述金属标记的寡(dT)n反应；iv)将未结合的核酸与结合的核酸分离；v)通过元素分析来检测和测定结合的载体的元素。
47.根据权利要求39所述的试剂盒，其中所述载体是珠粒。
48.根据权利要求29或39所述的试剂盒，进一步包括选自以下组成的组中的试剂和装置:解离溶液、具有核酸结合膜的旋转柱、用于从生物样品中分离和纯化核酸的纯化柱、用于扩增纯化的核酸的试剂和溶液、标样、稀释缓冲液，解离缓冲液、洗涤缓冲液、杂交缓冲液和测定缓冲液。
49.根据权利要求29所述的试剂盒，其中内源核酸在形态上完整的细胞中原位扩增。
50.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素使用质谱仪来测定。
51.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素是同位素。
52.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素选自以下元素组成的组:贵金属、过渡金属、稀土元素、金、银、铂、铑、铱和钯。
53.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素包括多于一种元素。
54.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素包括多于一种同位素。
55.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中所述元素包括一种同位素的多于一个原子。
56.根据权利要求36至39任一项所述的试剂盒，其中亲和性产品选自由抗体、Fab′、适体、抗原、激素、生长因子、受体、蛋白质和核酸组成的组。
57.根据权利要求29至50任一项所述的试剂盒，其中包括用于颗粒元素分析的说明书。
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WO (1) WO2007093050A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439178A (zh) * 2009-05-20 2012-05-02 阿德万德克斯公司 革兰氏阳性细菌全细胞分析方法
CN113355394A (zh) * 2021-06-15 2021-09-07 杭州谱育科技发展有限公司 基于质谱技术的核酸检测方法
CN113355393A (zh) * 2021-06-15 2021-09-07 杭州谱育科技发展有限公司 基于金属编码技术的核酸检测方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7479630B2 (en) * 2004-03-25 2009-01-20 Bandura Dmitry R Method and apparatus for flow cytometry linked with elemental analysis
US8101368B2 (en) * 2006-02-13 2012-01-24 Dvs Sciences Inc. Quantitation of cellular DNA and cell numbers using element labeling
EP1991694B1 (en) 2006-02-13 2016-04-13 Fluidigm Canada Inc. Element-tagged oligonucleotide gene expression analysis
CA2658787C (en) 2006-08-15 2013-04-09 Alexei Antonov Apparatus and method for elemental analysis of particles by mass spectrometry
EP2092294B1 (en) 2006-11-02 2015-06-03 Mitchell A. Winnik Particles containing detectable elemental code
DE102010032075A1 (de) * 2010-07-23 2012-01-26 Eads Deutschland Gmbh Wasserstofferzeugung mittels hydrierten Polysilanen zum Betrieb von Brennstoffzellen
CN102621129A (zh) * 2012-04-18 2012-08-01 上海市毛麻纺织科学技术研究所 一种银纤维纺织品中银的定性与定量检测方法
CA2888308C (en) 2012-10-26 2021-01-19 Fluidigm Canada Inc. Cell analysis by mass cytometry
EP2929050A1 (en) * 2012-12-10 2015-10-14 AdvanDx, Inc. Use of probes for mass spectrometric identification of microorganisms or cells and associated conditions of interest
US9218949B2 (en) 2013-06-04 2015-12-22 Fluidigm Canada, Inc. Strategic dynamic range control for time-of-flight mass spectrometry
CN103439501B (zh) * 2013-08-23 2016-03-23 河南省科学院高新技术研究中心 一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法
EP3043891B1 (en) * 2013-09-13 2019-01-16 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Multiplexed imaging of tissues using mass tags and secondary ion mass spectrometry
US20180188264A1 (en) * 2015-06-29 2018-07-05 Fluidigm Canada Inc. Systems, methods and compositions for simultaneous detection of rna and protein by mass spectrometry
WO2018008435A1 (ja) * 2016-07-04 2018-01-11 株式会社ダナフォーム 核酸分析方法
CN113454460B (zh) * 2019-01-30 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 表征生物制剂中的可见和/或亚可见粒子的方法
US20230151355A1 (en) * 2019-03-12 2023-05-18 Universal Sequencing Technology Corporation Methods for Single Cell Intracellular Capture and its Applications
CN110487923B (zh) * 2019-03-22 2023-04-07 中国计量科学研究院 一种基于分子排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用的线性质粒dna含量的检测方法
JP7226538B2 (ja) * 2019-05-17 2023-02-21 株式会社島津製作所 細胞外小胞の検出方法
CN111575383A (zh) * 2020-06-10 2020-08-25 四川省疾病预防控制中心 基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003767A2 (en) * 2003-07-03 2005-01-13 Mds Inc., Doing Business As Mds Sciex Elemental analysis of tagged biologically active materials

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4022876A (en) * 1973-06-21 1977-05-10 Stanford Research Institute Mass spectrometric immunoassay
IL49685A (en) * 1976-05-31 1978-10-31 Technion Res & Dev Foundation Specific binding assay method for determining the concentration of materials and reagent means therefor
JPS607166A (ja) 1983-06-24 1985-01-14 Toshiba Corp 保護回路
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
ZA862335B (en) 1985-03-28 1987-11-25 Cetus Corp Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DK171161B1 (da) 1985-03-28 1996-07-08 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til påvisning af forekomst eller fravær af mindst én specifik nukleinsyresekvens i en prøve eller til skelnen mellem to forskellige nukleinsyresekvenser i denne prøve
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5079172A (en) * 1988-11-04 1992-01-07 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit
DK130991D0 (da) * 1991-07-04 1991-07-04 Immunodex K S Polymere konjugater
US6391590B1 (en) * 1991-10-21 2002-05-21 The Regents Of The University Of California Recombinant streptavidin-metallothionein chimeric protein having biological recognition specificity
US5569754A (en) * 1993-06-11 1996-10-29 Board Of Regents, University Of Tx Systems RNA import elements for transport into mitochondria
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
JP3188794B2 (ja) * 1993-09-10 2001-07-16 セイコーインスツルメンツ株式会社 プラズマイオン源質量分析装置
US5773823A (en) * 1993-09-10 1998-06-30 Seiko Instruments Inc. Plasma ion source mass spectrometer
EP0743989B1 (en) 1994-02-14 2007-03-21 Smithkline Beecham Corporation Methed of identifying differentially expressed genes
US5521289A (en) * 1994-07-29 1996-05-28 Nanoprobes, Inc. Small organometallic probes
WO1997027317A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis techniques
EP0852004B1 (en) * 1995-10-11 2011-01-19 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens
US5981180A (en) * 1995-10-11 1999-11-09 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
JPH09115476A (ja) * 1995-10-19 1997-05-02 Seiko Instr Inc プラズマイオン質量分析装置
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6116516A (en) * 1996-05-13 2000-09-12 Universidad De Sevilla Stabilized capillary microjet and devices and methods for producing same
ES2140998B1 (es) * 1996-05-13 2000-10-16 Univ Sevilla Procedimiento de atomizacion de liquidos.
JP3492081B2 (ja) * 1996-05-15 2004-02-03 セイコーインスツルメンツ株式会社 プラズマイオン源質量分析装置
US6444650B1 (en) * 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
US6449562B1 (en) * 1996-10-10 2002-09-10 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method
WO1998017992A2 (en) * 1996-10-25 1998-04-30 Applied Imaging, Inc. Multifluor-fluorescence in situ hybridization (m-fish) imaging techniques using multiple multiband filters with image registration
CA2257247C (en) * 1997-04-15 2012-09-11 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Novel protein binding to osteoclastogenesis inhibitory factor and process for producing the same
US6031098A (en) * 1997-08-11 2000-02-29 California Institute Of Technology Detection and treatment of duplex polynucleotide damage
US7090804B2 (en) * 1998-01-27 2006-08-15 Clinical Mirco Sensors, Inc. Amplification of nucleic acids with electronic detection
US7060457B2 (en) * 1998-03-18 2006-06-13 Johns Hopkins University Aberrant glutamate transporters and methods of use
US6290839B1 (en) * 1998-06-23 2001-09-18 Clinical Micro Sensors, Inc. Systems for electrophoretic transport and detection of analytes
US6913884B2 (en) * 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US6630296B2 (en) * 2000-08-08 2003-10-07 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed enzymatic assays
CA2426580C (en) * 2000-10-19 2011-09-13 Target Discovery, Inc. Mass defect labeling for the determination of oligomer sequences
US7135296B2 (en) * 2000-12-28 2006-11-14 Mds Inc. Elemental analysis of tagged biologically active materials
CA2431864C (en) * 2000-12-28 2011-09-06 Mds Inc., Doing Business As Mds Sciex Elemental analysis of tagged biologically active materials
DE10106370B4 (de) * 2001-02-12 2005-01-27 Vermicon Ag Oligonukleotidsonden zur Detektion von parodontopathogenen Bakterien mittels in situ-Hybridisierung
US7479630B2 (en) * 2004-03-25 2009-01-20 Bandura Dmitry R Method and apparatus for flow cytometry linked with elemental analysis
DE10152821B4 (de) * 2001-10-25 2006-11-16 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektren ohne elektronisches Rauschen
US20030092090A1 (en) * 2001-11-14 2003-05-15 Kiamars Hajizadeh Rapid prion-detection device, system, and test kit
DE10227599B4 (de) * 2002-06-20 2005-04-28 Proteome Factory Ag Verfahren und Reagenz zur spezifischen Identifizierung und Quantifizierung von einem oder mehreren Proteinen in einer Probe
FI20021325A0 (fi) * 2002-07-05 2002-07-05 Valtion Teknillinen Menetelmä ja reagenssipakkaus yksittäisten polynukleotidien määrän määrittämiseksi
CN1672050A (zh) * 2002-08-02 2005-09-21 美国艾培拉公司 荧光偏振检测
WO2004034018A2 (en) * 2002-10-07 2004-04-22 Trellis Bioscience, Inc. Multihued labels
JP2007524347A (ja) * 2003-02-27 2007-08-30 ナノスフェアー　インコーポレイテッド マイクロアレイ形式のアッセイにおける、万能ナノ粒子プローブを用いた標識不要の遺伝子発現プロファイリング
ATE469170T1 (de) * 2003-03-28 2010-06-15 Medimmune Llc Zusammensetzungen und verfahren mit dem respiratory syncytial virus untergruppe b stamm 9320
CN1580283A (zh) 2003-08-13 2005-02-16 清华大学 一种检测核酸分子的方法
JPWO2005095942A1 (ja) 2004-03-30 2008-02-21 独立行政法人理化学研究所 レーザーアブレーションを用いた生体試料の分析方法およびその装置
CA2565967A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 Perkinelmer Las, Inc. Multiplexing assays for analyte detection
EP1778867B1 (en) * 2004-07-01 2010-04-28 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions to detect nucleic acids in a biological sample
US7462720B2 (en) * 2004-09-02 2008-12-09 Agency Science Tech & Res Determination of nucleic acid using electrocatalytic intercalators
CA2592851A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Mack Schermer Particle-based multiplex assay system with three or more assay reporters
GB2425178A (en) 2005-04-13 2006-10-18 Univ Sheffield Analysis of biological samples by mass spectrometry
WO2006115870A2 (en) * 2005-04-20 2006-11-02 Becton Dickinson And Company Multiplex microparticle system
US20060240444A1 (en) * 2005-04-21 2006-10-26 Peiguo Chu Detection methods
WO2007022074A2 (en) * 2005-08-11 2007-02-22 Perkinelmer Las, Inc. Assay particles and methods of use
JP2007146149A (ja) * 2005-11-02 2007-06-14 Fujifilm Corp 蛍光性重合体微粒子、蛍光性重合体微粒子の製造方法、蛍光検出キット及び蛍光検出方法
DE102006001793A1 (de) 2006-01-12 2007-07-26 Forschungsgesellschaft für Arbeitsphysiologie und Arbeitsschutz e.V. Verfahren und diagnostisches Kit zur simultanen Identifizierung und Quantifizierung von einzelnen oder in Gemischen vorliegenden Biomolekülen und deren Modifikationen
WO2007140571A1 (en) 2006-02-13 2007-12-13 Olga Ornatsky Quantitation of cellular dna and cell numbers using element labeling
EP1991694B1 (en) 2006-02-13 2016-04-13 Fluidigm Canada Inc. Element-tagged oligonucleotide gene expression analysis
WO2007093049A1 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Olga Ornatsky Kinase and phosphatase assays conducted by elemental analysis
EP3260863B1 (en) 2006-05-27 2021-03-10 Fluidigm Canada Inc. Method for performing multiplex analysis of two or more analytes
US20110024615A1 (en) 2006-12-29 2011-02-03 Tanner Scott D Cell injector for flow cytometer having mass spectrometer detector and method for using same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003767A2 (en) * 2003-07-03 2005-01-13 Mds Inc., Doing Business As Mds Sciex Elemental analysis of tagged biologically active materials

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARBEN MERKOCÜI等: "Toward an ICPMS-Linked DNA Assay Based on Gold Nanoparticles Immunoconnected through Peptide Sequences", 《ANAL. CHEM》 *
OLGA I. ORNATSKY等: "Messenger RNA Detection in Leukemia Cell lines by Novel Metal-Tagged in situ Hybridization using Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry", <TRANSLATIONAL ONCOGENOMICS> *
YUNWEI CAO等: "DNA-Modified Core-Shell Ag/Au Nanoparticles", 《J. AM. CHEM. SOC.》 *
宁明哲 等: "铕标记基因探针半定量检测丙型肝炎病毒RNA", 《中华检验医学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439178A (zh) * 2009-05-20 2012-05-02 阿德万德克斯公司 革兰氏阳性细菌全细胞分析方法
CN113355394A (zh) * 2021-06-15 2021-09-07 杭州谱育科技发展有限公司 基于质谱技术的核酸检测方法
CN113355393A (zh) * 2021-06-15 2021-09-07 杭州谱育科技发展有限公司 基于金属编码技术的核酸检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2640508A1 (en) 2007-08-23
JP2015070853A (ja) 2015-04-16
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WO2007093050A1 (en) 2007-08-23
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US20190161790A1 (en) 2019-05-30
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JP2009526242A (ja) 2009-07-16
CA2640508C (en) 2014-04-15
EP3018215A1 (en) 2016-05-11
EP3561071B1 (en) 2020-12-16
JP5777269B2 (ja) 2015-09-09
DK1991694T3 (da) 2016-08-01
WO2007093050A8 (en) 2007-10-11
US20070190560A1 (en) 2007-08-16
EP3561071A1 (en) 2019-10-30
EP1991694B1 (en) 2016-04-13
US10577648B2 (en) 2020-03-03

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