CN111575383A - 基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，包括金属纳米探针的制备、特异性杂交反应以及基于ICP‑MS的含量检测三个操作步骤。同时检测方法包括将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微孔中，孵育清洗后获得固载有贵金属纳米粒子的杂交复合物微孔板；将微孔中的贵金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中，使用ICP‑MS仪器测定贵金属同位素的信号强度。本发明通过贵金属纳米粒子标记报告探针；链霉亲和素杂交反应将金属纳米粒子固载到微孔板上；通过加入稀硝酸溶解贵金属纳米粒子，通过ICP‑MS进行测定，本发明的方法具有较高的灵敏度和特异性，能够用于多种miRNA的同时快速、高灵敏检测，从而实现宫颈癌早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及到一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法。
背景技术
由于miRNAs的异常表达水平往往早于肿瘤的发生，因此，miRNA在预测肿瘤发生状态方面具有很大的潜力。宫颈癌(CC)是严重危害女性健康的恶性肿瘤，随着临床医学对疾病早期诊断的需求越来越高，与宫颈癌相关miRNAs标志物的寻找及其定量检测越来越受到高度关注。
近年来，研究发现多种miRNA的异常表达与宫颈癌的发病机制密切相关。例如：Li等人阐明了过表达的miR-486-5p激活致癌的PI3K/Akt通道和抑制PTEN的表达来刺激致细胞增殖、迁移和侵袭，表明了miR-486-5p可以作为一种新的生物标志物用于宫颈癌的诊断和治疗。
王慧军、李小兰等人发现宫颈癌患者的病理组织中miRNA-221表达水平升高，并发现这一现象与与宫颈癌临床病理因素的相关性，证实了miRNA-221基因对宫颈癌发病发展起着重要影响。
王慧军、李小兰检测了31例宫颈癌(Cervical cancer，CC)标本及配对正常组织标本中micRNA-221的表达，分析了micRNA-221表达水平与患者临床特征之间的关系，为micRNA-221后续功能研究奠定基础。
上述检测所采用的具体方法为：提取31例手术切除的宫颈癌及癌旁正常组织标本中的总RNA，反转录获得cDNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测micRNA-221的表达水平，统计分析其表达水平与患者临床病理特征之间的关系。结果31例组织标本中28例(90.3％)宫颈癌组织micRNA-22121表达水平上调(P<0.05)，但上调和患者年龄、性别、肿瘤的TNM和FIGO分期等无明显相关性(P>0.05)。结论micRNA-221在宫颈癌组织中表达明显上调，提示其与宫颈癌发生有一定关系。
周玉飞、岳青芬探讨了miRNA-21、miRNA-34a在宫颈癌、CIN、正常组织中的表达差异及对宫颈癌早期诊断的价值。周玉飞、岳青芬所采用的具体方法为：选取子宫肌瘤患者、CIN患者、宫颈癌患者为研究对象，检测病理组织、正常组织及血清中miRNA-21、miRNA-34a的表达水平，统计分析二者表达的临床意义。
检测结果为：(1)与其他患者相比，宫颈癌患者组织及血清中miRNA-21表达水平显著较高，miRNA-34a水平显著较低(P<0.01)；(2)临床分期、是否存在淋巴结转移是影响miRNA-21表达水平的独立性危险因素。但miRNA-34a表达水平对宫颈癌患者临床病理参数无明显影响；(3)ROC曲线显示，miRNA-21、miRNA-34a对宫颈癌诊断的敏感性为87.9％、92.8％，特异性为78.8％、64.8％。结论miRNA-21、miRNA-34a参与了宫颈癌的发生发展过程，且二者对宫颈癌的诊断有一定的预测效能。
经研究发现宫颈癌患者血清中miR-21、miR-221和miR-486-5p的表达显著增加，而且分期越晚表达越高，且基因的异常水平往往早于肿瘤的形成。因此，如果能够实现这三种miRNAs的联合定量检测，有望实现宫颈癌的早期诊断。
目前，miRNA检测的技术主要有基于杂交、扩增和测序原理的三大技术。但这三种技术都存在着不可规避的缺点，比如：基于扩增原理的技术主要有RT-PCR扩增法、滚环扩增技术和指数扩增技术，在临床实验室中相对被广泛使用的是基于扩增原理的PCR技术，该技术相对成熟且成本较低，但不能对miRNA进行精确测定。基于测序原理的大规模测序技术虽然能够快速且高灵敏度地检测miRNA，但其对数据库较大和复杂的样本进行测序时，需耗费较高的成本。基于杂交原理的印迹杂交技术一直被视为miRNA检测和鉴定的标准方法，但检测费时、样品用量大、灵敏度低限制了该技术广泛使用；微阵列芯片检测，能实现miRNA快速高通量检测，但该方法具有灵敏度低、特异性不好的缺点。因此，开发一种简单、灵敏度高并且能同时进行多组分miRNA检测的方法是很有必要的。
利用ICP-MS能够对多种元素同时分析且灵敏度高的特性和金属在生物体中很少存在而基体干扰小的优点，通过多种金属纳米颗粒标记报告探针，金属纳米颗粒标记报告探针、目标miRNAs和捕获探针通过特异性识别固载到微孔板上，最终ICP-MS对标记探针金属同位素的质荷比进行分析，从而达到对多种miRNA的同时定量检测。ICP-MS对标记元素的选择不需要元素有放射、光学、磁学、电学等特殊的性质，因此选择的范围比较大。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，包括以下步骤：
步骤(1)金属纳米探针的制备
将三种不同的金属纳米粒子溶胶分别加入ssDNA-486-5p报告探针溶液、ssDNA-221报告探针溶液以及ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置若干小时，静置后每隔一段时间加入NaCl溶液处理，然后离心去除上清液，并使用磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于磷酸盐缓冲液中，得到三种金属纳米探针，并在低温下保存备用；
步骤(2)特异性杂交反应
将链霉亲和素微孔板用杂交缓冲液预洗若干次，然后将生物素标记的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温下震荡孵育；孵育完毕后吸出微孔板孔内液体，清洗缓冲液洗去未结合的捕获探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载；获得已经固载有捕获探针的微孔板；
将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微孔中，经过孵育后冷却至室温，并在室温下孵育一定时间，然后吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗后使用超纯水清洗，除去多余的金属纳米探针；获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板；
步骤(3)基于ICP-MS的含量检测
在固载有杂交复合物的微孔中加入稀硝酸溶液进行反应，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中，然后将反应溶液转移至离心管中后使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于表征三种目标miRNA浓度。
本发明的优化方案之一，步骤(1)中，三种不同的金属纳米粒子分别为纳米银溶胶、纳米铂溶胶和纳米金溶胶，三种金属纳米探针分别为AgNPs标记的ssDNA-486-5p报告探针；PtNPs标记的ssDNA-221报告探针；AuNPs标记的ssDNA-21报告探针。
本发明的优化方案之一，步骤(1)的具体方法为：
取2ml纳米银溶胶、2ml纳米铂溶胶、2ml纳米金溶胶分别加入体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-486-5p报告探针溶液，体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-221报告探针溶液以及体积为40μL、含量为100mM/L的ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置24h，之后24h内每隔8h加入120μL、2M/L的NaCl溶液处理，然后使用离心机在10000rpm转速下离心20min，去除上清液，并使用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于2mL的磷酸盐缓冲液PBS中，得到三种金属纳米探针，并在低温4℃下保存备用。
本发明的优化方案之一，步骤(2)的杂交缓冲液中氯化钠的含量为750mM/L，柠檬酸钠的含量为75mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2；清洗缓冲液中氯化钠的含量为300mM/L，柠檬酸钠的含量为30mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2。
本发明的优化方案之一，步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为：
使用杂交缓冲液清洗链霉亲和素微孔板2-3次，每次每孔使用300μL；然后将总体积为10μL、含量为5μM的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和90μL的杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温震荡孵育1h，然后吸出微孔板孔内液体，用清洗缓冲液清洗2～3次，每孔300μL，去除未结合的捕获探针，链霉亲和素和捕获探针的生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载，获得已经固载有捕获探针的微孔板。
本发明的优化方案之一，步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为：
将5μL三种金属纳米探针和100μL三种目标miRNA的混合溶液分别加入到经过处理的已经固载有捕获探针的微孔板中，在60℃下孵育半小时，在2～3h内缓慢降至室温，然吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗微孔2～3次，超纯水洗孔1次，除去多余的金属纳米探针，获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板。
本发明的优化方案之一，步骤(3)基于ICP-MS的含量检测的具体方法为：
在固载有杂交复合物的微孔中加入2％稀硝酸溶液进行反应，每孔中加入100uL，在75℃反应20分钟，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中；然后将反应溶液转移至离心管中后用2％HNO3硝酸溶液稀释至2mL，使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于推算出三种目标miRNA浓度。
本发明的优化方案之一，本发明设计了目标标记物的寡核苷酸序列：
目标miRNA-486-5p的序列为：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG；
目标miRNA-221的序列为：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUU；
目标miRNA-21的序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
本发明的优化方案之一，
捕获探针ssDNA-486-5p的序列为TCAGTACAGGATTTTTTTTTT-biotin；
捕获探针ssDNA-221的序列为ACAATGTAGCTTTTTTTTTTT-biotin；
捕获探针ssDNA-21的序列为CTGATAAGCTATTTTTTTTTT-biotin。
本发明的优化方案之一，
ssDNA-486-5p报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT TTT TTT TTC TCG GGG CAG C；
ssDNA-221报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT TTTTTT TTA ACC CAG CAG；
ssDNA-21报告探针序列为HS-(CH2)6-TTTTTTTTTTTCAACATCAGT。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明通过金属纳米粒子标记报告探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载；通过加入稀硝酸溶解金属纳米粒子，得到含有金属离子的硝酸溶液，通过ICP-MS进行测定，金属同位素的信号强度与目标miRNAs浓度的对数呈线性关系，本发明的方法具有较高的灵敏度和特异性，能够用于多种miRNA的同时快速、高灵敏检测，从而实现宫颈癌早期诊断。
2、本发明通过ICP-MS能够同时检测多个金属元素，进而能够对多个目标miRNA进行联合检测，相对于现有技术中只能够检测一种miRNA具有更高的检测灵敏度和准确度。生物体中几乎不存在金属同位素银、铂和金，因此检测中干扰小；ICP-MS对金属同位素进行检测，也不需要元素有特殊的性质，不需要放射性的，光学的，电学的，电化学的和磁性的特殊性质，可操作性更高，更容易实施。
附图说明
图1为本发明特异性杂交反应和含量检测的原理图；
图2为本发明实施例4的miRNA-486-5p的标准曲线；
图3为本发明实施例4的miRNA-221的标准曲线；
图4为本发明实施例4的miRNA-21的标准曲线；
图5为本发明对比实验实施例5的实验结果，其中1为目标miRNA、2为对照组A、3为对照组B，4为对照组C；所有探针浓度为10pM。
具体实施方式
本发明提供了一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，包括以下步骤：步骤(1)金属纳米探针的制备
将三种不同的金属纳米粒子溶胶分别加入ssDNA-486-5p报告探针溶液、ssDNA-221报告探针溶液以及ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置若干小时，静置后每隔一段时间加入NaCl溶液处理，然后离心去除上清液，并使用磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于磷酸盐缓冲液中，得到三种金属纳米探针，并在低温下保存备用；
步骤(2)特异性杂交反应
将链霉亲和素微孔板用杂交缓冲液预洗若干次，然后将生物素标记的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温下震荡孵育；孵育完毕后吸出微孔板孔内液体，清洗缓冲液洗去未结合的捕获探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载；获得已经固载有捕获探针的微孔板；
将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微孔板中，经过孵育后冷却至室温，并在室温下孵育一定时间，然后吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗后使用超纯水清洗，除去多余的金属纳米探针；获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板；
步骤(3)基于ICP-MS的含量检测
在固载有杂交复合物的微孔中加入稀硝酸溶液进行反应，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中，然后将反应溶液转移至离心管中后使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于表征三种目标miRNA浓度。
实施例1：金属纳米探针的制备
将取三种金属纳米粒子溶胶，纳米银溶胶、纳米铂溶胶和纳米金溶胶，因此首先制备三种金属纳米探针分别为AgNPs标记的ssDNA-486-5p报告探针；PtNPs标记的ssDNA-221报告探针；AuNPs标记的ssDNA-21报告探针。的具体方法为：
取2ml纳米金溶胶、2ml纳米银溶胶、2ml纳米铂溶胶分别加入体积为40μL、含量为100mM/L的ssDNA-21报告探针溶液，体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-486-5p报告探针溶液以及体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-221报告探针溶液中，室温下静置24h，之后24h内每隔8h加入120μL、2M/L的NaCl溶液处理，然后使用离心机在10000rpm转速下离心20min，去除上清液，并使用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于2mL的磷酸盐缓冲液PBS中，得到三种金属纳米探针，并在低温4℃下保存备用。
实施例2：特异性杂交反应
通过用无RNA酶的离心管、无RNA酶枪头、RNA酶清除剂和DEPC处理水提供无RNA酶的环境。
制备杂交缓冲液，杂交缓冲液中氯化钠的含量为750mM/L，柠檬酸钠的含量为75mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2。
制备清洗缓冲液；清洗缓冲液中氯化钠的含量为300mM/L，柠檬酸钠的含量为30mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2。
特异性杂交反应的具体方法为：
使用杂交缓冲液清洗链霉亲和素微孔板3次，每次每孔使用300μL；然后将总体积为10μL、含量为5μM的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和90μL的杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温震荡孵育1h，然后吸出微孔板孔内液体，用清洗缓冲液清洗3次，每孔300μL，去除未结合的捕获探针，链霉亲和素和捕获探针的生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载，获得已经固载有捕获探针的微孔板。
将5μL三种金属纳米探针和100μL三种目标miRNA的混合溶液分别加入到经过处理的已经固载有捕获探针的微孔板中，在60℃下孵育半小时，在2h内缓慢降至室温，然吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗微孔3次，超纯水洗孔1次，除去多余的金属纳米探针，获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板。
实施例3：基于ICP-MS的含量检测的具体方法为：
在固载有杂交复合物的微孔中加入2％稀硝酸溶液进行反应，每孔中加入100uL，在75℃反应20分钟，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中；然后将反应溶液转移至离心管中后用2％HNO3硝酸溶液稀释至2mL，使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于推算出三种目标miRNA浓度。
实施例4：标准曲线的绘制
将5μL三种金属纳米探针和100μL不同浓度(0.25pM、0.5pM、1pM、10pM、50pM、100pM)的三种目标miRNA的混合溶液分别加入到经上述处理的微孔板中，在60℃孵育半小时后，在2.5h内缓慢降至室温。吸出孔内液体，用清洗缓冲液洗孔3次，超纯水洗孔1次，除去多余的金属纳米探针。
每孔中加入100uL、2％HNO3硝酸溶液在75℃反应20分钟，之后将溶液取出用2％稀硝酸溶液稀释至2mL，用ICP-MS按照表1仪器条件测定。
表1：ICP-MS测定条件
本发明以1.0mg/L 115In和209Bi为内标，ICP-MS测定金属同位素(107Ag,195Pt,和197Au)的信号强度，金属同位素的响应信号与目标miRNA浓度的对数呈线性关系，能够用于多种miRNA的定量检测。
以浓度的对数为横坐标，以金属计数与内标计数比值为信号强度并作为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线如图2-图4所示：在0.25pM到100pM范围内，目标miRNA-486-5p的线性方程分别为Y＝0.00242lgC+0.00821；
目标miRNA-221的线性方程分别为Y＝0.00147lgC+0.00312；
目标miRNA-21的线性方程分别为Y＝0.00137gC+0.00452；相关系数R2分别为0.9680、0.9305和0.9418。
以11次空白样品(目标miRNA浓度为0)信号强度3倍标准偏差对应的浓度作为检出限，计算得到目标miRNA-486-5p、目标miRNA-221和目标miRNA-21的检出限(LODs)分别为0.18pM,0.23pM和0.22pM。
实施例5：对比实验
实验目的：验证本发明方法对目标miRNA检测的特异性；
实验过程：设计两个对照组，其中对照组A为单碱基错配探针，即对照组A的碱基序列与正常碱基序列具有至少一个错位。对照组B为完全不相干探针。对照组C为空白对照组。其中，对照组A和对照组B的序列为：
单碱基错配探针-miR-486-5p UCC UGU ACU GAG AUG CCC CGA G；
单碱基错配探针-miR-221AGC UAC AUU GUC UGC UGA GUU；
单碱基错配探针-miR-21UAG AUU AUA AGA CUG AUG UUG A；
不相干探针1UAG CAG CAC GUA AAU AUU GGC G；
不相干探针2ACU GAU UUC UUU UGG UGU UCA G；
不相干探针3UAC AGU AUA GAU GAU GUA CU；
实验方法：参考本发明实施例1至实施例3的步骤和方法，通过ICP-MS仪器对照组A、对照组B和对照组C进行检测，测试结果如图5所示。
从检测结果中可以发现，对照组A所代表的单碱基错配目标miRNAs的信号强度都低于目标miRNAs，对照组B所代表的完全不相干的miRNAs信号和空白对照组对照组C的信号没有太大差异。表明建立的ICP-MS同时检测多组分miRNA方法具有潜在的临床应用前景，可用于宫颈癌的快速、高灵敏早期诊断。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)金属纳米探针的制备
将三种不同的金属纳米粒子溶胶分别加入ssDNA-486-5p报告探针溶液、ssDNA-221报告探针溶液以及ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置若干小时，静置后每隔一段时间加入NaCl溶液处理，然后离心去除上清液，并使用磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于磷酸盐缓冲液中，得到三种金属纳米探针，并在低温下保存备用；
步骤(2)特异性杂交反应
将链霉亲和素微孔板用杂交缓冲液预洗若干次，然后将生物素标记的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温下震荡孵育；孵育完毕后吸出微孔板孔内液体，清洗缓冲液洗去未结合的捕获探针，链霉亲和素和生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载；获得已经固载有捕获探针的微孔板；
将三种金属纳米探针与三种目标miRNA的混合液加入到已经固载有捕获探针的微孔中，经过孵育后冷却至室温，并在室温下孵育一定时间，然后吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗后使用超纯水清洗，除去多余的金属纳米探针；获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板；
步骤(3)基于ICP-MS的含量检测
在固载有杂交复合物的微孔中加入稀硝酸溶液在高温下进行反应，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中，然后将反应溶液转移至离心管中后使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于表征三种目标miRNA浓度。
2.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，三种不同的金属纳米粒子分别为纳米银溶胶、纳米铂溶胶和纳米金溶胶，三种金属纳米探针分别为AgNPs标记的ssDNA-486-5p报告探针；PtNPs标记的ssDNA-221报告探针；AuNPs标记的ssDNA-21报告探针。
3.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体方法为：
取2ml纳米银溶胶、2ml纳米铂溶胶、2ml纳米金溶胶分别加入体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-486-5p报告探针溶液，体积为40μL、含量为100mM/L ssDNA-221报告探针溶液以及体积为40μL、含量为100mM/L的ssDNA-21报告探针溶液中，室温下静置24h，之后24h内每隔8h加入120μL、2M/L的NaCl溶液处理，然后使用离心机在10000rpm转速下离心20min，去除上清液，并使用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS清洗，清洗后重悬于2mL的磷酸盐缓冲液PBS中，得到三种金属纳米探针，并在低温4℃下保存备用。
4.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于：所述步骤(2)的杂交缓冲液中氯化钠的含量为750mM/L，柠檬酸钠的含量为75mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2；
清洗缓冲液中氯化钠的含量为300mM/L，柠檬酸钠的含量为30mM/L、吐温20的含量为0.05％，pH为7.2。
5.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为：
使用杂交缓冲液清洗链霉亲和素微孔板2-3次，每次每孔使用300μL；然后将总体积为10μL、含量为5μM的捕获探针ssDNA-486-5p、捕获探针ssDNA-221、捕获探针ssDNA-21的混合溶液和90μL的杂交缓冲液加入到链霉亲和素微孔板中，室温震荡孵育1h，然后吸出微孔内液体，用清洗缓冲液清洗2～3次，每孔300μL，去除未结合的捕获探针，链霉亲和素和捕获探针的生物素通过共价偶联实现捕获探针的固载，获得已经固载有捕获探针的微孔板。
6.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)特异性杂交反应的具体方法为：
将5μL三种金属纳米探针和100μL三种目标miRNA的混合溶液分别加入到经过处理的已经固载有捕获探针的微孔中，在60℃下孵育半小时，在2～3h内缓慢降至室温，然吸出孔内液体，用清洗缓冲液清洗微孔2～3次，超纯水洗孔1次，除去多余的金属纳米探针，获得固载有金属纳米粒子的杂交复合物微孔板。
7.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于，所述步骤(3)基于ICP-MS的含量检测的具体方法为：
在固载有杂交复合物的微孔中加入2％稀硝酸溶液进行反应，每孔中加入100uL，在75℃反应20分钟，将微孔中的金属纳米粒子溶解到稀硝酸溶液中；然后将反应溶液转移至离心管中后用2％HNO3硝酸溶液稀释至2mL，使用ICP-MS仪器测定金属同位素的信号强度，该信号强度用于推算出三种目标miRNA浓度。
8.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于：
目标miRNA-486-5p的序列为：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG；
目标miRNA-221的序列为：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUU；
目标miRNA-21的序列为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
9.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于：
捕获探针ssDNA-486-5p的序列为TCAGTACAGGATTTTTTTTTT-biotin；
捕获探针ssDNA-221的序列为ACAATGTAGCTTTTTTTTTTT-biotin；
捕获探针ssDNA-21的序列为CTGATAAGCTATTTTTTTTTT-biotin。
10.如权利要求1所述的基于金属纳米探针的多种宫颈癌miRNA标志物同时检测的方法，其特征在于：
ssDNA-486-5p报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT TTT TTT TTC TCG GGG CAG C；
ssDNA-221报告探针的序列为HS-(CH2)6-TT TTTTTT TTA ACC CAG CAG；
ssDNA-21报告探针序列为HS-(CH2)6-TTTTTTTTTTTCAACATCAGT。
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