CN112646876B - 用于银屑病诊断的miRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可用于银屑病诊断或辅助诊断的新的生物标志物,该生物标志物选自miRNAhsa‑let‑7d‑3p、hsa‑miR‑134‑5p、hsa‑miR‑485‑5p、hsa‑miR‑941和hsa‑miR‑1228‑5p中的至少一种。hsa‑let‑7d‑3p、hsa‑miR‑134‑5p、hsa‑miR‑485‑5p、hsa‑miR‑941和hsa‑miR‑1228‑5p可以应用于制备用于诊断或辅助银屑病的产品,为银屑病的诊断提供一种无创或微创、特异性好、敏感性高、准确率高的诊断方法,有利于银屑病的早期确诊。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及用于银屑病诊断的miRNA及其在制备用于银屑病诊断的产品中的应用。
背景技术
作为直径为30-100纳米的膜结合纳米囊泡,外泌体可由大多数细胞类型分泌,存在于几乎所有的体液中。外泌体中以鉴定出多种不同的成分,包括脂质、蛋白质、mRNAs、miRNAs(microRNAs)、lncRNA(long non-coding RNA)等。大量研究表明,通过摄取循环外泌体,受体细胞可以被上述外泌体RNAs调节。其中,血清外泌体miRNA已被确定为人类疾病的可靠生物标志物和治疗目标,例如癌症,呼吸系统疾病和糖尿病性肾病等。鼻咽癌的血清外泌体miR-24-3p水平已被证明与患者无病生存期较差有关(Kapetanakis NI,Baloche V,and Busson P.2017.Tumor exosomal microRNAs thwarting anti-tumor immuneresponses in nasopharyngeal carcinomas.Ann Transl Med 5:164.10.21037/atm.2017.03.57),血清外泌体miR-126具有预测急性呼吸窘迫综合征的潜力(Wu X,Wu C,Gu W,et al.2019.Serum Exosomal MicroRNAs Predict Acute Respiratory DistressSyndrome Events in Patients with Severe Community-Acquired Pneumonia.BiomedRes Int2019:3612020.10.1155/2019/3612020),血清外泌体miRNA的子集(miR-1246,miR-642a-3p,let-7c-5p,miR-1255b-5p,let-7i-3p,miR-5010-5p,miR-150-3p,miR-4449)与糖尿病性肾病相关(Kim H,Bae YU,Jeon JS,et al.2019.The circulating exosomalmicroRNAs related to albuminuria in patients with diabetic nephropathy.JTransl Med 17:236.10.1186/s12967-019-1983-3)。目前,寻常型银屑病患者外泌体miRNA的表达谱尚未见报道。
银屑病是一种慢性、炎性、全身性皮肤病,影响世界人口的1%至3%。根据银屑病的临床特征,银屑病可以分为寻常型、关节病型、脓胞型及红皮病型。寻常型银屑病(Psoriasis vulgaris,PV)是银屑病最常见的形式,发生在80%-90%的银屑病患者中,这些患者在四肢、头皮和骶区表面出现覆盖有珠状鳞片的红斑丘疹。PV患者常年遭受发炎、瘙痒和疼痛的损害,甚至伴随一生,需要进行长期治疗,而目前用于PV的常规药物价格昂贵。由于PV的普遍性,多样性和长的持续时间,科学家和医务工作者越来越重视发现寻常型银屑病的新型生物标志物和治疗靶标。
典型的银屑病的临床特现明显,通过视诊不难诊断,但对临床表现不典型的银屑病患者,诊断时容易与脂溢性皮炎,原位鳞状细胞癌(Bowen病,特别是躯干部位),二期梅毒,真菌感染,皮肤型红斑狼疮,湿疹,扁平苔藓,玫瑰糠疹或由于搔抓造成的局限性皮炎(慢性单纯性苔藓)相混淆。皮损组织病理学检查有助于临床表现不典型的银屑病患者的确认,但一方面,皮损组织病理学检查为有创性诊断,另一方面,同样的,虽然典型的损害活检发现一般有特征性,但不典型的损害活检为非特征性;某些其他皮肤病可以有银屑病样组织学表现,使镜下诊断带来困难或模棱两可。
因此,目前仍急需一种新的无创或微创的、有效的银屑病的诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于银屑病诊断或辅助诊断的新的生物标志物,提供了对银屑病具有诊断价值的miRNA以及其在银屑病诊断中的应用。
根据本发明的一个方面,提供了miRNA在制备用于银屑病诊断的产品中的应用,其中,miRNA选自hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中的至少一种。
本申请提供了5种在寻常型银屑病患者和健康人血清外泌体中差异性表达的miRNA,分别为hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对差异性表达的结果以及这些miRNA用于诊断银屑病时的特异性、敏感性等进行了验证。其中,qRT-PCR验证结果表明,与在健康人血清外泌体中的表达水平相比,hsa-let-7d-3p在寻常型银屑病患者血清外泌体中的表达水平显著下降,而hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p在寻常型银屑病患者血清外泌体中的表达水平显著上调,而ROC曲线分析结果表明,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p均对银屑病的诊断特具有一定的特异性和敏感性,其中hsa-miR-941的特异性最高,其次为has-miR-1228-5p。因此,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p可用作银屑病诊断生物标志物,应用于制备用于银屑病诊断的产品。
为了方便描述,本发明中,将对其在血清外泌体中的表达水平进行检测的miRNA称为血清外泌体miRNA。
本发明中,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p这5种血清外泌体miRNA,可以单独用作银屑病的诊断标志物,也可以两种或多种一起联合用作银屑病的诊断标志物,应用于制备用于银屑病诊断的产品。
在一些实施方式中,银屑病具体可以为寻常型银屑病。
根据本发明的另一个方面,提供了检测血清外泌体miRNA表达水平的产品在制备用于银屑病诊断的产品中的应用,其中,血清外泌体miRNA选自hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中的至少一种。
本发明中,检测血清外泌体miRNA表达水平的产品可以为采用本领域中任意已知的可以检测样本中miRNA表达水平的技术检测血清外泌体样本中hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中至少一种miRNA的表达水平的产品,可以为市售产品,也可以是自行制备的产品。
在一些实施方式中,检测血清外泌体miRNA表达水平的产品可以为通过下述至少一种方法检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器:核酸测序技术、核酸杂交技术或核酸扩增技术。
在一些实施方式中,检测血清外泌体miRNA表达水平的产品可以为通过下述至少一种方法检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器:高通量测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术或荧光定量PCR技术。
在一些实施方式中,检测血清外泌体miRNA表达水平的产品可以为检测血清外泌体miRNA表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒。
在一些实施方式中,上述检测血清外泌体miRNA表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒包括检测血清外泌体miRNA的引物、探针或基因芯片。
检测血清外泌体miRNA表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒可以为现有的商品化的用于检测hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中至少一种miRNA的表达水平的试剂盒,如上海生工的miRNA荧光定量PCR试剂盒(染料法);也可以自行制备。
本发明中,用于银屑病诊断的产品包括但不限于用于确诊或辅助确诊受检者是否患有银屑病的试剂、试剂盒、芯片或仪器。
根据本发明的又一个方面,提供了一种用于银屑病诊断的试剂盒,包括用于检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂,其中,血清外泌体miRNA选自hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中的至少一种。
在一些实施方式中,用于检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂为通过实时荧光定量PCR技术检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂。
在一些实施方式中,通过实时荧光定量PCR技术检测血清外泌体miRNA表达水平的试剂包括引物、探针或芯片,以及实时荧光定量PCR扩增所需的缓冲液、聚合酶、dNTP mix、ddH2O、荧光染料等试剂。其中,引物、探针、芯片等均可以使用本领域技术人员已知的方法制备,缓冲液、聚合酶、dNTP mix、ddH2O、荧光染料等试剂均可以通过市售途径获得。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:提供了hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p这5种对银屑病具有诊断价值的miRNA,这5种miRNA可以应用于制备用于诊断银屑病的产品,为银屑病的诊断提供一种无创或微创、特异性好、准确率高的诊断方法,有利于银屑病的早期确诊,及时做好治疗,提供治疗效果。
附图说明
图1-7依次表示qRT-PCR验证PV患者和健康人血清外泌体中hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p的表达水平;
图8为hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p用于诊断银屑病的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。如无特殊说明,实施例中所用试剂为可以通过市售获得的常规产品,实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件,或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。
实施例1
1、血清外泌体分离和鉴定
共收集了15名寻常型银屑病(PV)患者的空腹静脉血样本,PV病患者来源于2015年1月至2017年3月就诊于广东省中医院风湿皮肤科(又称广州中医药大学第二附属医院)的银屑病患者,且所有入选的PV患者均符合中华医学会报告的《2008年银屑病临床指南》的标准,另收集15名健康人的空腹静脉血样本作为对照组。空腹静脉血样本离心后,取分离出的血浆保存在-80℃下直至检测。
根据制造商的说明,使用Exo Quick Exosome Precipitation Solution Kit从500μL血浆样品中分离出外泌体,具体步骤包括:将外泌体分离试剂添加到血浆样品中,并在4℃下孵育至少30分钟以沉淀外泌体沉淀。使用扫描电子显微镜(SEM)(FEI XL30,荷兰)来可视化外泌体形态,并使用NanoSight测量外泌体直径,分离得到的外泌体呈球形和囊泡形态,直径30-150nm,其中,直径约为108.3nm的外泌体的密度最高。通过蛋白质印迹分析证实了制得的外泌体具有外体膜标记物(TSG101,CD9,CD63和CD81)阳性的典型外泌体特征。
分离得到的血清外泌体保存在-80℃下直至进行下一步研究。
2、小RNA文库的构建,测序和miRNA鉴定
利用TRIzol(Thermo Fisher Scientific,上海,中国)从分离得到的血清外泌体中提取总RNA,然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)富集18nt至30nt的RNA分子,接着将5'和3'接头都连接到收集到的RNA分子上,然后将连接产物逆转录,并收集140-160bp大小的产物以生产cDNA文库,并使用Ribobio Co.(中国广州)的Illumina HiSeqTM 2500进行测序。
为了获得高质量的干净的读数(clean reads),原始的读数通过Illumina HiSeqTM2500测序系统内部Perl脚本进行了分析。舍弃含有接头或含有超过10%的poly-N序列的脏读数(dirty reads)和Phred得分<5%的低质量读数后,得到的多有干净的标签(cleantags)均根据GeneBank数据库和Rfam数据库(11.0)与小RNA对齐,以去除rRNA,scRNA,snoRNA,snRNA和tRNA。同时,所有干净的标签也使用默认参数运行的TopHat v2.0.9与人类参考基因组(Grch37)进行比对(方法具体参考:Trapnell C,Roberts A,Goff L,etal.2012.Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seqexperiments with TopHat and Cufflinks.Nat Protoc 7:562-578.10.1038/nprot.2012.016.)。对应于外显子或内含子的标签可能是来自mRNA降解的片段,因此这些标签被去除。另外,对应于重复序列的那些标签也被丢弃。然后在miRBase数据库(第21版)中搜索所有干净的标签,以识别已知的miRNA。
共构建了30个小RNA文库,包括15个PV组和15个对照组并进行了测序,以揭示miRNA谱。经过相应的筛选后,从PV组获得了约1300万个干净的标签,而从对照组中获得了约1100万个干净的标签。每组中的干净的读数的百分比约为88%。然后,使用TopHat将干净的读数对应到人类参考基因组(Grch37),超过90%的干净的读数被对应上,其中,分别在对照组和PV组的干净的标签中发现了751和846个已知的miRNA。
3、miRNA差异表达谱
根据miRNA在各组中的表达,计算miRNA的表达水平,并使用以下公式将其标准化为TPM(transcripts per million reads):
TPM=实际的miRNA读数/(干净的标签的总的读数×106)
用于确定各组之间差异表达的miRNA的公式如下所示:
|log2(fold change)|≥1且P值<0.05的miRNA被认为是显著差异表达的miRNA。
与对照组相比,PV组共发现246种不同表达的miRNA,包括hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p。表1中的数据表明,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p在PV组和对照(HC)组中差异表达。
表1在PV中差异表达的miRNA
4、qRT-PCR分析
使用miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒(Tiangen,中国北京)分别对PV组和HC组血清外泌体中的miRNA:hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941、hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p进行逆转录,合成cDNA。
以逆转录合成的cDNA为模板、miRNA的反向序列为引物利用TRAN公司的RT-PCR试剂进行荧光定量PCR,以has-U6作为检测的内参物,qPCR扩增的反应体系如表2所示,PCR反应步骤如表3所示。荧光定量PCR结果以内参的循环数作为对照,按照2-△△Ct方法处理数据。
表2PCR反应体系
试剂 | 用量 |
qPCRmasterMix | 10μL |
PCR Forward Primer(10μM) | 0.6μL |
PCR Reverse Primer(10μM) | 0.6μL |
cDNA模板 | 4μL |
ddH<sub>2</sub>O | 4.8μL |
Total | 20μL |
表3PCR反应步步骤
结果如图1-7所述,由图1-7的结果可知,与HC组相比,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p在PV组中的表达水平具有显著性差异,hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-375-3p在PV组中的表达水平无显著差异。
实施例2准确性、敏感性和特异性验证
另外纳入19例PV患者和19例健康对照对hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p对银屑病的诊断的准确性、敏感性和特异性进行评估和验证,方法为:取各参与试验的试验者空腹静脉血样本参考实施例1中的方法分离血清外泌体,从分离得到的血清外泌体中提取总RNA以及进行qRT-PCR,检测hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p的表达水平并进行ROC曲线分析。结果如表4和图8所示。
表4 ROC统计分析结果列表
指标 | hsa-let-7d-3p | hsa-miR-1228-5p | hsa-miR-134-5p | hsa-miR-485-5p | hsa-miR-941 |
AUC(%) | 58.7258 | 85.5956 | 52.9412 | 67.6190 | 88.4615 |
最佳临界值 | 0.76 | 0.85 | 0.45 | 4.09 | 0.70 |
敏感性(%) | 68.42 | 73.68 | 64.71 | 53.33 | 69.23 |
特异性(%) | 68.42 | 89.47 | 60.00 | 92.86 | 94.44 |
阴性预测价值(%) | 68.42 | 77.27 | 60.00 | 65.00 | 80.95 |
阳性预测价值(%) | 68.42 | 87.50 | 64.71 | 88.89 | 90.00 |
真阳性率(%) | 68.42 | 73.68 | 64.71 | 53.33 | 69.23 |
假阳性率(%) | 31.58 | 10.53 | 40.00 | 7.14 | 5.56 |
真阴性率(%) | 68.42 | 89.47 | 60.00 | 92.86 | 94.44 |
假阴性率(%) | 31.58 | 26.32 | 35.29 | 46.67 | 30.77 |
假发现率(%) | 31.58 | 12.50 | 35.29 | 11.11 | 10.00 |
准确性(%) | 68.42 | 81.58 | 62.50 | 72.41 | 83.87 |
精确度(%) | 68.42 | 87.50 | 64.71 | 88.89 | 90.00 |
尤登指数(%) | 36.84 | 63.16 | 24.71 | 46.19 | 63.66 |
由表4和图8的结果可知,hsa-let-7d-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p用于对银屑病的诊断或辅助诊断均具有一定的特异性和敏感性,其中hsa-miR-941的效果最好,AUC值最高,为88.4615%,特异性达94.44%;其次为has-miR-1228-5p,AUC值为85.5956%,敏感性为73.68%,特异性为89.47%。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.检测miRNA表达水平的产品在制备用于寻常型银屑病诊断的产品中的应用,其中,所述miRNA选自hsa-miR-941和hsa-miR-1228-5p中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述检测miRNA表达水平的产品为检测血清外泌体样本中的所述miRNA的表达水平的产品。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述检测血清外泌体样本中的所述miRNA的表达水平的产品为通过下述至少一种方法检测血清外泌体样本中所述miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器:核酸测序、核酸杂交或核酸扩增。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述检测血清外泌体样本中的所述miRNA的表达水平的产品为通过下述至少一种方法检测血清外泌体样本中所述miRNA表达水平的试剂、试剂盒、芯片和/或仪器:高通量测序、原位杂交、基因芯片或荧光定量PCR。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述检测血清外泌体样本中的所述miRNA的表达水平的产品为检测血清外泌体样本中所述miRNA表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述实时荧光定量PCR试剂盒包括检测血清外泌体样本中的所述miRNA的引物、探针或基因芯片。
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