CN117660653A - 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 - Google Patents
一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117660653A CN117660653A CN202311725641.9A CN202311725641A CN117660653A CN 117660653 A CN117660653 A CN 117660653A CN 202311725641 A CN202311725641 A CN 202311725641A CN 117660653 A CN117660653 A CN 117660653A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hsa
- mir
- δct
- lung cancer
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 108091044796 Homo sapiens miR-1290 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091068991 Homo sapiens miR-141 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091069002 Homo sapiens miR-145 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091067654 Homo sapiens miR-148a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091068997 Homo sapiens miR-152 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091070489 Homo sapiens miR-17 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091067627 Homo sapiens miR-182 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091070496 Homo sapiens miR-20a stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091070494 Homo sapiens miR-22 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091067572 Homo sapiens miR-221 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091070371 Homo sapiens miR-25 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108091066899 Homo sapiens miR-340 stem-loop Proteins 0.000 claims description 11
- 108091067469 Homo sapiens miR-181a-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 10
- 108091067618 Homo sapiens miR-181a-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 10
- 108091068998 Homo sapiens miR-191 stem-loop Proteins 0.000 claims description 10
- 108091067650 Homo sapiens miR-30d stem-loop Proteins 0.000 claims description 10
- 108091032108 Homo sapiens miR-424 stem-loop Proteins 0.000 claims description 10
- 108091067468 Homo sapiens miR-210 stem-loop Proteins 0.000 claims description 9
- 108091053840 Homo sapiens miR-486 stem-loop Proteins 0.000 claims description 9
- 108091059229 Homo sapiens miR-486-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 9
- 108091066332 Homo sapiens miR-320a stem-loop Proteins 0.000 claims description 8
- 108091069003 Homo sapiens miR-9-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 7
- 108091068996 Homo sapiens miR-9-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 7
- 108091069001 Homo sapiens miR-9-3 stem-loop Proteins 0.000 claims description 7
- 108091069006 Homo sapiens miR-125b-1 stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 108091069087 Homo sapiens miR-125b-2 stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 108091067554 Homo sapiens miR-381 stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 101150104466 NOCT gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 35
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- -1 hsa-miR-26b-5p_R+1 Proteins 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 108091030146 MiRBase Proteins 0.000 description 2
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091070399 Homo sapiens miR-26b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 108091084679 miR-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091033354 miR-3-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091058771 miR-3-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒，血清miRNA标志物组合包括：hsa‑miR‑20a‑5p、hsa‑miR‑145‑5p、hsa‑miR‑152‑3p、hsa‑miR‑25‑3p、hsa‑miR‑148a‑3p、hsa‑miR‑182‑5p、hsa‑miR‑22‑3p、hsa‑miR‑221‑3p、hsa‑miR‑1290、hsa‑miR‑141‑3p、hsa‑miR‑17‑5p等22个miRNA位点，将其应用于早期肺癌血清miRNA检测试剂盒，可以实现区分早期肺癌患者和健康对照人群，从而进行临床辅助诊断，具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于肺癌诊断技术领域，涉及一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒。
背景技术
肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，也是我国30年来发生率增长最快的恶性肿瘤。在我国21世纪开展的第三次死因回顾调查则显示肺癌已居癌症死亡原因首位。中国肿瘤登记中心数据显示，2015年我国新发肺癌病例78.7万例，预计至2025年，中国每年新发的肺癌患者将达100万。由于肺癌早期(Ⅰ-Ⅱ期)症状不明显75％的肺癌患者就诊时已是肺癌晚期(Ⅲ-Ⅳ期)，术后5年生存期约为5％。而低剂量螺旋CT(LDCT)年度筛查能发现85％的Ⅰ期肺癌，术后10年预期生存率可达92％。因此早发现、早诊断和早治疗是延长肺癌患者生存期的唯一有效方法。
对肺癌和肺结节的评估方法通常包括临床资料、影像学、肿瘤标志物、功能显像、非手术和手术活检。年龄、职业、吸烟史、慢性肺部疾病史、个人和家族肿瘤史、治疗经过及转归等临床信息，可为肺癌和肺结节良恶性鉴别提供重要参考意见。作为早期肺癌的发现，LDCT是比较经典的筛查手段，可以大大提高早期肺癌的检出率，但假阳性率高达96.4％，导致患者的过度治疗。同时辐射是这项检查的另一个弊端，因此急需要一个灵敏度和特异性均高的检测方法。
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一种小的非编码单链RNA，通常长度为18-25个核苷酸，可与靶基因3’UTR区域结合从而对其表达进行负调控。研究表明，miRNA参与调控多种生命活动，同时参与许多疾病(如：肿瘤、自身免疫性疾病等)的发生、发展及转归，因此miRNA的差异表达能为疾病的筛查、诊断及预后提供临床意义。miRNA的表达谱具有明显的组织特异性，在不同肿瘤中有特定的表达模式，且广泛存在于人体的各组织器官及体液内。这些特性使miRNA成为肿瘤诊断的新的生物标志物和治疗靶点成为可能。qPCR是目前最常用的检测已知miRNAs表达的方法，该方法快速、简单、可重复性好，能非常灵敏、准确地定量分析miRNAs的表达，是临床应用中最重要的方法。这为循环miRNAs作为肿瘤非侵入性诊断标志物提供了可靠的技术保障。
目前，尽管已经有许多研究报道了miRNA在肺癌中的异常表达，并发现了许多非常有前景的肺癌早期诊断血清miRNA，但这些结果并不一致，并且不能相互验证。原因在于，(1)样本类型(如：组织、血清、血浆等)、采集及保存的过程不同；(2)不同方法分离、储存及提取外周血中生物标志物的含量不同；(3)检测方法的不同，如测序法、扩增法、杂交法等；(4)个体之间的体液环境、遗传因素、生活环境等非癌因素都会影响miRNA的表达，需要大量的人群样本及规范全面的入组标准来消除这种影响；(5)miRNA序列较短导致引物探针设计较困难，且没有针对性的软件可以直接使用；(6)目前暂时没有标准化的内参作为参照，因此引物探针、反应体系、内参体系均需筛选及优化过程。
发明内容
基于以上，本发明的目的在于提供一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒，能够将早期肺癌患者血清与健康人血清进行区分，从而快速、便捷、准确、无创地检测肺癌。
本发明为实现技术目的采用的技术方案为：
一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合，包括：hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p。
一种用于早期肺癌诊断的试剂盒，包括上述血清miRNA标志物组合。
优选地，所述试剂盒通过Logit回归方程计算风险评估值，Logit回归方程为：
Logit＝-39.2077-3.9314*ΔCthsa-miR-20a-5p+6.9035*ΔCthsa-miR-145-5p+2.2237*ΔCthsa-miR-152-3p-2.6988*ΔCthsa-miR-25-3p+1.336*ΔCthsa-miR-148a-3p+0.8011*ΔCthsa-miR-182-5p+6.8527*ΔCthsa-miR-22-3p-1.2653*ΔCthsa-miR-221-3p-1.9309*ΔCthsa-miR-1290-0.4832*ΔCthsa-miR-141-3p+2.9818*ΔCthsa-miR-17-5p+5.548*ΔCthsa-miR-191-5p-3.7906*ΔCthsa-miR-30d-5p-0.923*ΔCthsa-miR-181a-5p+4.0693*ΔCthsa-miR-340-3p+0.5375*ΔCthsa-miR-424-3p-1.5022*ΔCthsa-miR-210-3p+1.4206*ΔCthsa-miR-486-5p-2.5031*ΔCthsa-miR-320a-3p-2.1942*ΔCthsa-miR-125b-5p-1.8443*ΔCthsa-miR-9-3p-1.6145*ΔCthsa-miR-381-3p
根据靶点和内参(U6)的Ct值，将22个靶点的Ct值分别减去内参(U6)的Ct值，求得22个靶点相对内参的ΔCt，然后代入以上公式，计算出Logit值。
更优选地，22个靶点若NoCt，应将Ct值赋值为40(最大循环数)后，再进行计算。
更优选地，当样本Logit＜0.28时，则该样本为阴性，当样本Logit≥0.28时，则该样本为阳性。
本发明的有益效果在于：
本发明选择hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p作为组合分子标记物，经过临床样本验证实验，在早期肺癌诊断具有优势。
这22个miRNA组合首次应用于肺癌血清miRNA检测试剂盒的开发，该肺癌血清miRNA检测试剂盒运用实时荧光定量方法，可以实现区分早期肺癌患者和健康对照人群，从而进行临床辅助诊断，具有较高的临床应用价值。
本发明用于辅助诊断早期肺癌的试剂盒，可以简单、有效、无创地检测肺癌。
附图说明
图1为本发明用于早期肺癌诊断的试剂盒的使用流程图。
图2为hsa-miR-20a-5p灵敏度检测结果。
图3为hsa-miR-145-5p灵敏度检测结果。
图4为hsa-miR-152-3p灵敏度检测结果。
图5为hsa-miR-25-3p灵敏度检测结果。
图6为hsa-miR-148a-3p灵敏度检测结果。
图7为hsa-miR-182-5p灵敏度检测结果。
图8为hsa-miR-22-3p灵敏度检测结果。
图9为hsa-miR-221-3p灵敏度检测结果。
图10为hsa-miR-1290灵敏度检测结果。
图11为hsa-miR-141-3p灵敏度检测结果。
图12为hsa-miR-17-5p灵敏度检测结果。
图13为hsa-miR-191-5p灵敏度检测结果。
图14为hsa-miR-30d-5p灵敏度检测结果。
图15为hsa-miR-181a-5p灵敏度检测结果。
图16为hsa-miR-340-5p灵敏度检测结果。
图17为hsa-miR-424-3p灵敏度检测结果。
图18为hsa-miR-210-3p灵敏度检测结果。
图19为hsa-miR-486-5p灵敏度检测结果。
图20为hsa-miR-320a-3p灵敏度检测结果。
图21为hsa-miR-26b-5p灵敏度检测结果。
图22为hsa-miR-125b-5p灵敏度检测结果。
图23为hsa-miR-9-3p灵敏度检测结果。
图24为hsa-miR-340-3p灵敏度检测结果。
图25为hsa-miR-381-3p灵敏度检测结果。
图26为本发明测试例对16个标志物组合绘制的ROC曲线。
图27为本发明测试例对18个标志物组合绘制的ROC曲线。
图28为本发明测试例对20个标志物组合绘制的ROC曲线。
图29为本发明测试例对22个标志物组合绘制的ROC曲线。
图30为本发明测试例对24个标志物组合绘制的ROC曲线。
图31为本发明应用例中22个靶点联合构建模型的预测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
一、血清miRNA标志物的初步筛选
本发明通过高通量测序，筛选出了包含hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-26b-5p_R+1、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-381-3p在内的表达差异明显的肺癌相关血清miRNA表达谱。每个miRNA序列和miRBase数据库登录号如下：
表1.miRNA序列和miRBase数据库登录号
二、血清miRNA标志物组合的优化结合图1，主要包括以下步骤：
1、miRNA的提取
使用血清/血浆miRNA提取试剂盒(柱纯化)(麦锐克，中国苏州，货号：MRE00101)提取血清/血浆样本的总RNA，包括非编码小RNA。a.取200μL血清或血浆等液体样本转移至1.5mL DNase/RNase-free离心管中；b.分别加入200μL裂解液和10μL蛋白酶K，充分涡旋振荡混匀后短暂离心；c.65℃静置10min后，冷却至室温；d.将洗脱柱1套入收集管中，备用；e.加入600μL无水乙醇至步骤a.中的1.5mL DNase/RNase-free管中，涡旋混匀后，将混合液加入到上述准备好的洗脱柱1中，12000rpm离心1min，弃滤液；f.将洗脱柱1放回收集管，加入500μL洗液1，12000rpm离心30sec，弃滤液；g.将洗脱柱1放回收集管，加入500μL洗液2，12000rpm离心30sec，弃滤液；h.重复上步操作；i.将洗脱柱1放回收集管，12000rpm离心2min，以除去残留的液体；j.将洗脱柱1放入新的1.5mL DNase/RNase-free离心管中，向洗脱柱1中央加入30-50μLRNase-free H2O，室温放置2min；k.12000rpm离心1min。收集滤液，即为总RNA溶液，长期保存应置于-80℃。
2、反转录反应
反转录试剂：5×miRNA stem-loop cDNA synthesis kit(麦锐克，苏州)
表2.特异性茎环反转录引物名称和序列
表3.反转录反应体系
| 组分 | 加入体积(μL) |
| 5×miRNA RT Mix | 2 |
| miRNA RT Enzyme Mix | 1 |
| 特异性茎环反转录引物(2μM) | 0.5 |
| 无酶水 | 4.5 |
| 总RNA | 2 |
| 总体积 | 10 |
表4.反转录反应条件
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 50℃ | 10min | 1 |
| 85℃ | 5min | 1 |
逆转录产物立即进行qPCR反应或置于-20℃保存。
3、qPCR反应
qPCR试剂：2×miRNA stem-loop qPCR Master Mix(麦锐克，苏州)
表5.特异性上游引物和通用下游引物的名称及序列
表6.特异性探针名称及序列
表7.qPCR反应体系
| 组分 | 加入体积(μL) |
| 2×miRNA stem-loop qPCR Master Mix | 10 |
| 特异性上游引物(10μM) | 0.4 |
| 通用下游引物(10μM) | 0.4 |
| 特异性探针(10μM) | 0.2 |
| 无酶水 | 7 |
| cDNA | 2 |
| 总体积 | 20 |
表8.qPCR反应条件
在60℃时进行荧光信号采集。
4、灵敏度检测
基于步骤2和3，对合成RNA模板进行稀释后检测，灵敏度检测结果如图2～25所示，曲线从左往右表示合成模板起始浓度依次为10fg/μL、2fg/μL、0.4fg/μL、0.08fg/μL、0.016fg/μL、0.0001fg/μL。由此可见，该检测方法可检测到至少0.016fg/μL浓度下的miRNA。
5、组合优化
对从筛选中获得的24个miRNA生物标志物的组合和非参数因子进行了200次两倍交叉验证，以测试16、18、20、22、24个miRNAs的生物标志物组合的性能。AUC被用作优化指标以构建简单的线性回归模型，使用线性回归模型计算风险评估值。对不同个数标志物组合绘制ROC曲线及综合指标图，如图26～30及下表所示。
表9.16～24个miRNAs的生物标志物组合的性能
根据AUC，当组合个数为22个时AUC为1，当组合个数增加到24个时AUC依旧为1，当组合个数减少为20个、18个、16个时，AUC均小于1，因此最终选择miRNA个数为22个的组合。
三、肺癌患者诊断模型的构建
通过Logit回归方程拟合hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p 22个指标构建肺癌患者诊断模型。通过数据分析，得到该诊断模型公式，及回归方程为：
Logit＝-39.2077-3.9314*ΔCthsa-miR-20a-5p+6.9035*ΔCthsa-miR-145-5p+2.2237*ΔCthsa-miR-152-3p-2.6988*ΔCthsa-miR-25-3p+1.336*ΔCthsa-miR-148a-3p+0.8011*ΔCthsa-miR-182-5p+6.8527*ΔCthsa-miR-22-3p-1.2653*ΔCthsa-miR-221-3p-1.9309*ΔCthsa-miR-1290-0.4832*ΔCthsa-miR-141-3p+2.9818*ΔCthsa-miR-17-5p+5.548*ΔCthsa-miR-191-5p-3.7906*ΔCthsa-miR-30d-5p-0.923*ΔCthsa-miR-181a-5p+4.0693*ΔCthsa-miR-340-3p+0.5375*ΔCthsa-miR-424-3p-1.5022*ΔCthsa-miR-210-3p+1.4206*ΔCthsa-miR-486-5p-2.5031*ΔCthsa-miR-320a-3p-2.1942*ΔCthsa-miR-125b-5p-1.8443*ΔCthsa-miR-9-3p-1.6145*ΔCthsa-miR-381-3p
根据靶点和内参(U6)的Ct值，将22个靶点的Ct值分别减去内参(U6)的Ct值，求得22个靶点相对内参的ΔCt，然后代入以上公式，计算出Logit值。22个靶点若NoCt，应将Ct值赋值为40(最大循环数)后，再进行计算。
当样本Logit＜0.28时，则该样本为阴性，当样本Logit≥0.28时，则该样本为阳性。
应用例
基于实施例中提供的方案，对1个另外的验证队列进行验证，检测血清中的hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p和内参U6的Ct值。验证队列包括58例样本(28例肺癌病人及30例健康人)。
对检测结果，采用IBM SPSS Statistics 26进行统计分析，22个靶点联合构建模型的预测结果如图31所示。用这22个miRNA标志物组合来检测早期肺癌有100％灵敏度和100％特异性。可以很好区分早期肺癌患者和健康对照人群。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (5)
1.一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合，包括：hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-152-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-320a-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-9-3p、hsa-miR-381-3p。
2.一种用于早期肺癌诊断的试剂盒，包括权利要求1所述的血清miRNA标志物组合。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过Logit回归方程计算风险评估值，Logit回归方程为：
Logit＝-39.2077-3.9314*ΔCthsa-miR-20a-5p+6.9035*ΔCthsa-miR-145-5p+2.2237*ΔCthsa-miR-152-3p-2.6988*ΔCthsa-miR-25-3p+1.336*ΔCthsa-miR-148a-3p+0.8011*ΔCthsa-miR-182-5p+6.8527*ΔCthsa-miR-22-3p-1.2653*ΔCthsa-miR-221-3p-1.9309*ΔCthsa-miR-1290-0.4832*ΔCthsa-miR-141-3p+2.9818*ΔCthsa-miR-17-5p+5.548*ΔCthsa-miR-191-5p-3.7906*ΔCthsa-miR-30d-5p-0.923*ΔCthsa-miR-181a-5p+4.0693*ΔCthsa-miR-340-3p+0.5375*ΔCthsa-miR-424-3p-1.5022*ΔCthsa-miR-210-3p+1.4206*ΔCthsa-miR-486-5p-2.5031*ΔCthsa-miR-320a-3p-2.1942*ΔCthsa-miR-125b-5p-1.8443*ΔCthsa-miR-9-3p-1.6145*ΔCthsa-miR-381-3p根据靶点和内参的Ct值，将22个靶点的Ct值分别减去内参的Ct值，求得22个靶点相对内参的ΔCt，然后代入以上公式，计算出Logit值。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，22个靶点若NoCt，应将Ct值赋值为40后，再进行计算。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，当样本Logit＜0.28时，则该样本为阴性，当样本Logit≥0.28时，则该样本为阳性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311725641.9A CN117660653A (zh) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311725641.9A CN117660653A (zh) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117660653A true CN117660653A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90064006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311725641.9A Pending CN117660653A (zh) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117660653A (zh) |
-
2023
- 2023-12-15 CN CN202311725641.9A patent/CN117660653A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108624688B (zh) | hsa_circ_0012755作为前列腺癌分子靶标在制备药物和试剂盒中的应用 | |
| CN111424085B (zh) | tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用 | |
| CN112980947A (zh) | 检测与肺癌诊疗相关的外周血循环microRNA的引物及试剂盒 | |
| CN108866187B (zh) | 一种与肺癌辅助诊断相关的长链非编码rna标志物及其应用 | |
| CN106755343A (zh) | 胰腺癌预后诊断分子标记物 | |
| TWI571514B (zh) | 評估罹患大腸直腸癌風險的方法 | |
| CN111455053B (zh) | 用于结直肠腺瘤诊断的外泌体rna分子标记物组合及其应用 | |
| CN117568481A (zh) | 一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物及其应用 | |
| TWI758670B (zh) | 健康風險評估方法 | |
| CN105671179B (zh) | 血清microRNA在肝癌诊断中的应用及诊断试剂盒 | |
| CN108300788A (zh) | 一种用于检测轻型脑外伤的微小核糖核酸组合及其应用 | |
| CN112646876B (zh) | 用于银屑病诊断的miRNA及其应用 | |
| CN117660653A (zh) | 一种用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物组合及试剂盒 | |
| CN117604102A (zh) | 用于早期肺癌诊断的血清miRNA标志物及试剂盒 | |
| EP3988675A1 (en) | Method for differential diagnosis of prostate disease and marker for differential diagnosis of prostate disease as well as kit therefor | |
| CN116287252B (zh) | 长链非编码rna apcdd1l-dt在制备检测胰腺癌的产品中的应用 | |
| CN111187836B (zh) | 泌尿上皮癌的检测套组及微型核糖核酸组合物在制备用于预测泌尿上皮癌检测套组中的应用 | |
| CN113774138B (zh) | 用于肺癌诊断的试剂盒、装置及方法 | |
| CN116121245B (zh) | 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 | |
| CN109182520B (zh) | 一种宫颈癌及其癌前病变检测试剂盒及其应用 | |
| CN108220427B (zh) | 一种用于鉴别诊断BHD综合征与原发性自发性气胸的血浆microRNA标记物及应用 | |
| CN114790482A (zh) | 一种筛查或辅助筛查结直肠癌的方法及其使用的miRNA组合 | |
| CN113981096A (zh) | 一种用于诊断结直肠癌的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN112176060A (zh) | 一组血浆非编码rna及检测其表达水平的引物组与结直肠癌检测试剂盒 | |
| CN115058514A (zh) | 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌诊断试剂中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |