CN116287252B - 长链非编码rna apcdd1l-dt在制备检测胰腺癌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种长链非编码RNA APCDD1L‑DT在制备检测胰腺癌的产品中的应用，所述APCDD1L‑DT的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了试剂盒在制备检测胰腺癌的产品中的应用、胰腺癌诊断和/或预后评估的系统、可读介质、胰腺癌诊断和/或预后评估的装置以及所述系统、可读介质和装置在胰腺癌诊断和/或预后评估中的应用。本发明提供的产品及应用，具有操作简单、灵敏性高、特异性强和周期短等特点，有利于胰腺癌的早期诊断和治疗，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及长链非编码RNA APCDD1L-DT在制备检测胰腺癌的产品中的应用。
背景技术
胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其预后在所有肿瘤中排名最末。预计到2030年，胰腺癌可能成为仅次于肺癌的第二大癌症死亡原因。近年来胰腺癌的发病率及病死率均呈上升趋势。胰腺癌患者总体5年生存率约8.2％，其高死亡率归因于早期症状不明显、缺乏有效的诊断方法、病程进展迅速、易发生早期淋巴结转移和远处转移、晚期难以手术根治等。近年来，虽然外科技术和系统治疗取得了一些进展，但是治疗胰腺癌仍极具挑战性，手术仍是治愈胰腺癌的唯一手段，但其确诊时往往已是晚期，满足手术切除条件的患者少之又少，且因术中切除率低、肿瘤后期进展迅速、放化疗敏感性差等原因，胰腺癌的预后仍是消化系统肿瘤中最差的。因此，早期诊断胰腺癌成为胰腺癌研究的重中之重，鉴定新的生物标志物对胰腺癌早期诊断和改善预后意义重大。
目前糖类抗原199(Carbohydrate antigen199，CA199)仍是胰腺癌诊断唯一公认的肿瘤标志物，但其特异性及敏感度均不太理想，慢性胰腺炎、胆道梗阻及感染等可能引起CAl99升高而造成假阳性结果，部分lewis抗原阴性血型的患者不表达CAl99造成假阴性结果，其单独检测胰腺癌具有一定的局限性，常需联合其他肿瘤标志物以提高诊断效能。不断上升的发病率和持续的低生存率凸显了探索高风险患者筛查方法的必要性，开发早期检测标志物、改善患者预后和医疗管理是目前亟须解决的问题。
近年来的研究表明，非编码RNA与肿瘤的发生、发展密切相关，可作为有效的分子标志物应用于肿瘤的辅助诊断、预后判断与疾病监测，并可为治疗提供更多的靶向分子。然而在PAAD中，仍有大量非编码RNA的功能未被阐明，临床期待发现更多特异而敏感的非编码RNA，并将其运用于PAAD的临床诊疗。
APCDD1L-DT(Ensembl数据库编号为ENSG00000231290)是APCDD1L基因的反义转录本，隶属于长链非编码RNA(lncRNA)类。在目前研究中，尚无报道揭示APCDD1L-DT在PAAD中的表达情况，以及是否可作为PAAD的标志物，也无在PAAD中APCDD1L-DT表达的检测方法。
发明内容
为克服现有技术中胰腺癌诊断标志物的特异性、敏感度、准确性不高且难以单独进行单独检测的不足，本发明提供了一种lncRNA APCDD1L-DT的新用途，即APCDD1L-DT在制备检测胰腺癌的产品中的应用。本发明中由APCDD1L-DT制备的产品在胰腺癌诊断和预后评估中具有较高的灵敏性、特异性和准确性。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明第一方面，提供一种长链非编码RNA在制备检测胰腺癌的产品中的应用，所述长链非编码RNA为APCDD1L-DT，所述APCDD1L-DT的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述胰腺癌的发生部位选自胰头癌、胰体尾癌和全胰腺癌中的至少一种。
在一些实施方案中，所述胰腺癌的病理分类选自导管腺癌、多形性癌、腺鳞癌、粘液癌、粘液表皮样癌、印戒细胞癌、腺泡细胞癌、小腺体癌、大嗜酸性颗粒细胞性癌和小细胞癌中的至少一种。
在一些实施方案中，所述产品为胰腺癌的诊断和/或预后评估的产品。
在一些实施方案中，所述样本为组织或血浆。
本发明第二方面，提供一种试剂盒在制备检测胰腺癌的产品中的应用，所述试剂盒包含APCDD1L-DT和/或检测APCDD1L-DT的试剂，所述APCDD1L-DT的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在一些实施方案中，所述胰腺癌的发生部位选自胰头癌、胰体尾癌和全胰腺癌中的至少一种。
在一些实施方案中，所述胰腺癌的病理分类选自导管腺癌、多形性癌、腺鳞癌、粘液癌、粘液表皮样癌、印戒细胞癌、腺泡细胞癌、小腺体癌、大嗜酸性颗粒细胞性癌和小细胞癌中的至少一种。
在一些实施方案中，所述产品为胰腺癌的诊断和/或预后评估的产品。
在一些实施方案中，所述样本为组织或血浆。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括内参和/或检测内参的试剂。
在一些实施方案中，所述内参为GAPDH。
在一些实施方案中，所述检测APCDD1L-DT或检测编码内参的基因的试剂包括引物对和/或探针组合。
在一些具体的实施方案中，检测APCDD1L-DT的所述引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，和/或，检测编码GAPDH的基因的所述引物对序列如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。
本发明第三方面，提供一种胰腺癌诊断和/或预后评估的系统，所述胰腺癌诊断和/或预后评估的系统包括以下模块：
输入模块，其用于输入待测样本数据，所述待测样本数据包括APCDD1L-DT检测数值；
分析模块，其用于分析待测样本数据得到分析结果；其中，当所述待测样本数据达到判断条件时，输出分析结果为“阳性”；当所述待测样本数据不满足判断条件时，输出分析结果为“阴性”；
判断模块，所述判断模块根据所述待测样本数据判断样本来自的受试者是否具有肿瘤风险，并输出判断结果；其中，当APCDD1L-DT的分析结果为“阳性”时，输出判断结果为“具有患肿瘤风险/预后欠佳”；当分析结果为“阴性”时，输出判断结果为“不具有患肿瘤风险/预后佳”；
在一些具体的实施方案中，所述判断条件为待测样本中的APCDD1L-DT的表达量大于或等于来自正常人的样本中的1.55倍时，判断待测样本数据达到判断条件，输出分析结果为“阳性”；当待测样本中的APCDD1L-DT的表达量小于来自正常人的样本中的1.55倍时，判断待测样本数据不满足判断条件，输出分析结果为“阴性”。
本发明第四方面，提供一种可读介质，所述可读介质存储了程序，所述程序被处理器执行时可实现如本发明第三方面所述的胰腺癌诊断和/或预后评估的系统的功能。
本发明第五方面，提供一种胰腺癌诊断和/或预后评估的装置，其包括：
(1)如本发明第四方面所述的可读介质；
(2)处理器，用于执行程序以实现如本发明第三方面所述的胰腺癌诊断和/或预后评估的系统的功能；
在一些实施方案中，所述装置还包括输出装置，用于输出判断结果。
本发明第六方面，提供如本发明第三方面所述的系统、如本发明第四方面所述的可读介质或如本发明第五方面所述的装置在胰腺癌诊断和/或预后评估中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明首次公开了lncRNA APCDD1L-DT在制备胰腺癌诊断和/或预后的产品中的应用，其具有操作简单、灵敏性高、特异性强和周期短等特点，有利于胰腺癌的早期诊断和治疗，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为在TCGA与GTEx数据库中，PAAD患者样本及正常对照样本中APCDD1L-DT的差异表达。
图2为在TCGA与GTEx数据库中，PAAD患者样本中APCDD1L-DT检测结果的ROC曲线。
图3为TCGA数据库中，APCDD1L-DT与PAAD患者预后相关性分析。
图4为APCDD1L-DT在健康对照与PAAD患者组织样本中的差异表达。
图5为APCDD1L-DT在健康对照与PAAD患者血液样本中的差异表达。
图6为APCDD1L-DT诊断胰腺癌的性能检测。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1TCGA与GTEx数据库中，APCDD1L-DT基因在胰腺癌组织和正常对照组织中的差异表达情况及预后相关性分析
1、本发明所述的APCDD1L-DT其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
2、利用TCGA与GTEx数据库，分析179例PAAD患者样本及171例正常对照样本高通量测序结果，得到PAAD差异基因表达谱，其中所述基因APCDD1L-DT在胰腺癌患者组显著高表达(如图1所示)，ROC曲线下面积(the area under the ROC curve，AUC)等于0.857(如图2所示)。
本领域技术人员所熟知的是，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。该值大于0.7即表示检测靶点能够作为该种检测的特异性标示物。
3、进一步，针对TCGA数据库179例PAAD样本APCDD1L-DT表达水平与患者预后进行相关性分析，以APCDD1L-DT表达量对179例PAAD患者进行分组，发现低表达APCDD1L-DT组PAAD患者总生存期显著长于高表达APCDD1L-DT组，APCDD1L-DT与PAAD预后显著负向相关(如图3所示)。
实施例2APCDD1L-DT基因在健康对照与PAAD患者组织及血液样本中的差异表达
1、样本收集与处理：收取PAAD患者癌组织以及相应配对的癌旁组织各20例，同时收集PAAD患者及健康人血浆样本各30例。
2、组织RNA提取：按照Total RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取组织总RNA。
3、血浆RNA提取：应用艾美捷血浆RNA提取试剂盒进行样本总RNA提取，按照试剂盒说明书操作。
4、RNA纯度分析
应用超微量分光光度计NanoDrop2000检测RNA的纯度，通过比较A260/A280的大小来判断RNA的纯度，比值大小在1.8～2.0区间内，认为RNA纯度较好，适合用于后续实验。
5、逆转录：按照HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司)说明书指示操作，进行反转录合成cDNA。
6、定量PCR扩增检验：
反应体系如表1所示：
表1.PCR反应体系
| 组分 | 含量 |
| qPCR扩增Mix | 10μL |
| cDNA | 2μL |
| PCR上游引物 | 0.8μL |
| PCR下游引物 | 0.8μL |
| ddH2O | 6.4μL |
反应程序如表2所示：
表2.PCR反映程序
ABI 7500荧光定量PCR仪器选定熔解曲线程序，在爬坡过程中连续收集样品荧光信号以获得熔解曲线。Real-Time PCR采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。APCDD1L-DT及GAPDH引物序列如表3所示：
表3.特异性扩增引物序列及相关信息
7、结果分析与胰腺癌ROC曲线评估临床应用价值
APCDD1L-DT在胰腺癌组织中的表达显著高于正常配对组织(图4)。同时APCDD1L-DT在胰腺癌患者血浆中的表达显著高于正常人血浆中的表达(图5)。进一步采用ROC曲线评估APCDD1L-DT的临床应用价值，具体用AUC(Area Under the Curve，ROC曲线下方面积)来表示，AUC值在0.5和1.0之间，AUC越接近于1，表明特异性与灵敏性越好，临床应用价值越大。我们依据APCDD1L-DT在胰腺癌中的表达水平，进行ROC曲线分析，如图6所示，ROC曲线分析其AUC数值为0.821，提示检测APCDD1L-DT的相对表达量用于胰腺癌的诊断具有较高价值。
Claims (11)
1.一种长链非编码RNA在制备检测胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为APCDD1L-DT，所述APCDD1L-DT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其中，所述产品为诊断产品，所述检测的样本为组织。
2.一种试剂盒在制备检测胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含APCDD1L-DT和/或检测APCDD1L-DT的试剂，所述APCDD1L-DT的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；其中，所述检测APCDD1L-DT的试剂包括特异性扩增引物对和/或探针组合；所述产品为诊断产品，所述检测的样本为组织。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括内参和/或检测内参的试剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内参为GAPDH；和/或，检测编码内参的基因的试剂包括引物对和/或探针组合。
5. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，检测所述APCDD1L-DT的特异性扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，检测编码GAPDH的基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示。
7.一种胰腺癌诊断的系统，其特征在于，所述胰腺癌诊断的系统包括以下模块：
输入模块，其用于输入待测样本数据，所述待测样本数据包括APCDD1L-DT的表达量的检测数值；
分析模块，其用于分析待测样本数据得到分析结果；其中，当所述待测样本数据达到判断条件时，输出分析结果为“阳性”；当所述待测样本数据不满足判断条件时，输出分析结果为“阴性”；
判断模块，所述判断模块根据所述待测样本数据判断样本来自的受试者是否具有肿瘤风险，并输出判断结果；其中，当APCDD1L-DT的分析结果为“阳性”时，输出判断结果为“具有患肿瘤风险”；当分析结果为“阴性”时，输出判断结果为“不具有患肿瘤风险”。
8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述判断条件为待测样本中的APCDD1L-DT的表达量大于或等于来自正常人的样本中的1.55倍时，判断待测样本数据达到判断条件，输出分析结果为“阳性”；当待测样本中的APCDD1L-DT的表达量小于来自正常人的样本中的1.55倍时，判断待测样本数据不满足判断条件，输出分析结果为“阴性”。
9.一种可读介质，其特征在于，所述可读介质存储了程序，所述程序被处理器执行时可实现如权利要求7或8所述的系统的功能。
10.一种胰腺癌诊断的装置，其特征在于，包括：
（1）如权利要求9所述的可读介质；
（2）处理器，用于执行程序以实现所述胰腺癌诊断的系统的功能。
11.如权利要求10所述的装置，其特征在于，所述装置还包括输出装置，用于输出判断结果。
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