CN109402254A - 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒 - Google Patents

一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域,涉及一种预测胰腺癌患者不良预后风险的LncRNA模型及检测试剂盒。该模型包括样品采集、RNA提取、LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌预后相关的17个LncRNA。本发明通过检测患者LncRNA表达水平，可应用于临床判断胰腺癌患者预后。本发明的17个LncRNA可以作为标志物预测胰腺癌患者术后生存，并提供了相应的试剂盒，通过检测试剂盒对胰腺癌病人术后的组织LncRNA水平进行检测，判断胰腺癌患者预后，具有高通量、高敏感性等优点。

Description

一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种长链非编码RNA(LncRNA)模型及检测试剂盒，及其在预测胰腺癌病人不良预后风险方面的应用。
背景技术
根据最新流行病学调查，全球每年约250万人死于胰腺癌，死亡率位居恶性肿瘤第四位。近20年来我国胰腺癌的发病率持续增高，其死亡率位居恶性肿瘤第五位。在胰腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人意，其术后1年生存率不到20％，5年生存率仅为4％-7％。胰腺癌已经成为早期诊断最难、恶性程度最高、生存预后最差的肿瘤之一，是目前全世界肿瘤学研究的热点。
胰腺癌发现时大部分已处于晚期，病死率高，其主要原因胰腺癌早期即有局部淋巴结或远处转移，85％的患者确诊时已失去手术根治的机会。目前其治疗策略制定和预后判断主要依赖TNM分期，然而其并不能精准反映患者所处的实际阶段和预后。临床上尚无高灵敏性、高特异性的分子诊断方法精准判断胰腺癌的预后。
目前，公认LncRNA是一类序列长度大于200nt的非编码RNA；已有研究证实LncRNA在基因调控及各种细胞功能中起着重要的作用；而LncRNA在胰腺癌中的作用也被广泛关注。有研究表明，LncRNA通过对目标基因表达的调控，影响胰腺癌的恶性进程。近年来，越来越多的研究证实了LncRNA作为生物标记物预测肿瘤患者预后的可行性。
基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人拟提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型及检测试剂盒，用于检测胰腺癌患者不良预后的分子标记物。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状和基础，提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型及检测试剂盒，用于检测一种能在胰腺癌组织中检测的、有较高预测准确度的、胰腺癌患者不良预后的分子标记物。
本发明的另一个目的是提供上述模型的应用，对术后胰腺癌患者不良预后风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，改善患者预后。
本发明提供了一种检测胰腺癌预后相关LncRNA的模型包括样品采集RNA提取LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌相关的17个LncRNA。
所述的筛选是对胰腺癌癌组织进行RNA测序，并与和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而获得胰腺癌相关的17个LncRNA。
所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：
LncRNA名
ENSG00000272750.1
ENSG00000235078.1
ENSG00000270562.1
ENSG00000250413.1
ENSG00000249700.7
ENSG00000260070.1
ENSG00000232445.1
ENSG00000244198.4
ENSG00000271966.1
ENSG00000176236.6
ENSG00000279029.1
ENSG00000257534.1
ENSG00000257303.1
ENSG00000269906.1
ENSG00000276250.1
ENSG00000267015.1
ENSG00000271784.1
表1
相关序列参见http://www.gencodegenes.org网站。
本发明提供了一种胰腺癌标志物，所述的胰腺癌标志物包括表1所述的LncRNA。
本发明还提供一种预测胰腺癌患者预后的LncRNA模型，所述的模型包括表2所述的LncRNA的表达权重。
LncRNA名 权重系数(B)
ENSG00000272750.1 -0.007894547
ENSG00000235078.1 -0.198597798
ENSG00000270562.1 -0.018438516
ENSG00000250413.1 -0.021035564
ENSG00000249700.7 -0.041273129
ENSG00000260070.1 -0.015183685
ENSG00000232445.1 0.016172084
ENSG00000244198.4 -0.084552592
ENSG00000271966.1 -0.022991908
ENSG00000176236.6 -0.121026448
ENSG00000279029.1 0.02416932
ENSG00000257534.1 -0.014257028
ENSG00000257303.1 -0.05251776
ENSG00000269906.1 0.007557004
ENSG00000276250.1 -0.283657215
ENSG00000267015.1 0.117787771
ENSG00000271784.1 -0.268003602
表2
本发明还提供了一种检测试剂盒，其中包括表3所述LncRNA的特异性引物。所述的试剂盒中还包括抽提和/或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。
所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。
所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。
表3
本发明的模型的构建方法依次包括提取样本的RNA、RNA测序并筛选胰腺癌相关的LncRNA等几个方面。
该构建方法包括以下步骤：
(1)提取并纯化胰腺癌组织的RNA样本；
(2)对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，筛选其中与患者生存相关的17个LncRNA；
(3)计算上述17个LncRNA的表达权重，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数，根据其中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。
本发明所述模型的构建方法还可以包括RNA质量控制：用光谱仪定量检测提取的总RNA的浓度及质量。
在本发明的一个实施例中，采用NanoDrop 2000作为光谱仪。
可以对本发明所述的LncRNA模型进行验证：获取独立的另一组胰腺癌患者癌组织，经过组织RNA抽提并质检后，进行RNA测序；依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值；判断每位患者的患者生存时间；通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进行评价。
本发明提供了相应的试剂盒及引物，通过实时定量PCR检测试剂盒技术对胰腺癌病人术后的组织LncRNA水平的检测，具有高通量、高敏感性和高均一性等特征。该方法简便、快速且经济实用。
更具体的，本发明所述的LncRNA模型构建与验证方法的步骤为:
(1)收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本；
(2)提取和纯化胰腺癌组织的RNA样本；
(3)RNA质量控制：用NanoDrop 2000光谱仪定量(NanoDrop Technologies,Waltham,MA)检测提取的总RNA的浓度及质量；
(4)对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而筛选出与疾病生存相关的LncRNA，所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：
LncRNA名
ENSG00000272750.1
ENSG00000235078.1
ENSG00000270562.1
ENSG00000250413.1
ENSG00000249700.7
ENSG00000260070.1
ENSG00000232445.1
ENSG00000244198.4
ENSG00000271966.1
ENSG00000176236.6
ENSG00000279029.1
ENSG00000257534.1
ENSG00000257303.1
ENSG00000269906.1
ENSG00000276250.1
ENSG00000267015.1
ENSG00000271784.1
表1
(5)计算上述17个LncRNA的表达权重(如表2所示)，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数(Risk Score(RS))：其指数的计算公式如下：RS＝B1*X1+…+B17*X17，其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数(如表2所示)；根据计算得出的RS值及其中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小，同时通过COX多因素比例风险回归模型对所构建LncRNA模型的预测效能进行评价；
(6)将上述所得的LncRNA模型及计算公式，在另外的胰腺癌患者组成独立的验证集中进行验证：经过组织RNA抽提并质检后，利用RNA测序检测如表1所示LncRNA的表达量，依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值及其中位数；依此判断每位患者的不良预后，通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进行评价。
本发明的模型，可以通过COX比例风险回归模型，计算每个患者生存的风险指数，根据计算得出的值和中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。
所述的风险指数的计算公式是RS＝B1*X1+…+B17*X17；其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数。
LncRNA名 权重系数(B)
ENSG00000272750.1 -0.007894547
ENSG00000235078.1 -0.198597798
ENSG00000270562.1 -0.018438516
ENSG00000250413.1 -0.021035564
ENSG00000249700.7 -0.041273129
ENSG00000260070.1 -0.015183685
ENSG00000232445.1 0.016172084
ENSG00000244198.4 -0.084552592
ENSG00000271966.1 -0.022991908
ENSG00000176236.6 -0.121026448
ENSG00000279029.1 0.02416932
ENSG00000257534.1 -0.014257028
ENSG00000257303.1 -0.05251776
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ENSG00000267015.1 0.117787771
ENSG00000271784.1 -0.268003602
表2
本发明还包括所述模型在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用，其中包括检测表1所列LncRNA的特异性引物(表3)。
所述的试剂盒中还包括抽提和/或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成，说明书，等等。
所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成。
所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成。
表3
本发明经过严格细致的研究，构建了一种预测胰腺癌患者预后LncRNA模型；在预测96个月的病人生存中，所述LncRNA均呈现出较好预测效能。本发明所述模型能够为患者肿瘤治疗提供一定的建议，为医生治疗选择提供参考，进而减少不必要治疗，实现个体化治疗，提高患者术后生存率。临床治疗中，在胰腺癌患者诊断明确后，即可通过对上述LncRNA的检测，快速判断患者不良预后风险，并根据结果选择合适的治疗方案，实现个体化治疗。
附图说明
图1是本发明实施例中训练组和验证组中LncRNA模型对于预测胰腺癌患者不良预后的预测分析结果图，结果显示高风险组生存比低风险组显著差。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下面结合实施案例来具体说明本发明。
实施例1LncRNA模型的构建和分析
一、研究对象：
本实施案例的研究对象分别为:胰腺癌组织106例，构成训练集；胰腺癌组织71例，构成验证集,纳入及排除标准为：
(1)病理确诊为胰腺癌，导管腺癌；
(2)确诊时无其他肿瘤病史；
(3)排除其他导管原位癌。
二、实验方法
(1)收集胰腺癌患者的手术切除癌组织标本
(2)胰腺癌组织总RNA的抽提和纯化
将患者切除的胰腺癌旁组织与TRIzol试剂按比例75毫克：1mL混合，用匀浆器匀浆；将匀浆液在室温下孵育5分钟，按1：0.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2.5分钟；于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每1mL TRIzol试剂加入0.5mL的比例加入异丙醇，混匀，20℃下静置10分钟，于12000×g、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照每1mLTRIzol试剂加入1mL的比例加入75％乙醇，振荡混匀；于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀10分钟；用DEPC DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过的水重新溶解RNA；用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及A260/A280的比值，当A260/A280的比值为1.9-2.1时，进入下一步。
(3)RNA质量检测
将10×MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸RNA变性缓冲液)l0mL、0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的水70mL、37％甲醛20mL与RNA琼脂糖1.0g混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用DEPC处理过的水将10×MOPS缓冲液稀释成1×MOPS缓冲液配制电泳缓冲液；将步骤2.1中得到的RNA样品5.5μL、10×MOPS缓冲液1.0μL、37％甲醛3.5μL以及去离子甲酰胺10.0μL混合，配成电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μL 10×RNA加样缓冲液以及0.1μL EB(溴化乙锭)，混合均匀后加入上样孔内，电压100V条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检验证实RNA没有降解时，进一步进行研究。
(4)将106例胰腺癌组织组成训练集，按照操作说明规定的标准操作步骤，对所提取的RNA样本进行全转录组测序。以测序内部参考基因表达为参照对结果进行标化处理。LncRNA表达水平和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归分析，计算每个LncRNA与患者生存的关系，进而筛选出与胰腺癌预后相关的LncRNA(表1)。
(5)计算上述17个LncRNA的表达权重，训练集106例胰腺癌组织筛选出的LncRNA表达权重如表2所示。通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数(RiskScore(RS)：其指数的计算公式如下：RS＝B1*X1+…+B17*X17，其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数；根据计算得出的RS值和中位数，将患者划分为高危和低危，进而判断患者不良预后风险大小。运用该预测模型对训练组106例胰腺癌患者进行不良预后预测分析(图1)，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险(训练组：HR＝8.32，95％CI:4.31-16.07，P＝2.3e-13)。
实施例2LncRNA模型的验证
将上述所得的LncRNA模型及计算公式，在另外71例胰腺癌患者中进行验证：71例胰腺癌患者组成独立的验证集，获取其癌组织，按照上述方法抽提RNA并通过质量检测，进一步进行RNA测序。依据表达水平对每个LncRNA进行赋值后带入上述建立的RS公式内，计算每位患者的RS值及中位数；依此判断每位患者的不良预后风险；通过COX多因素比例风险回归模型对LncRNA模型的预测效能进一步进行评价。运用该预测模型对验证组71例胰腺癌患者进行不良预后预测分析(图1)，结果显示，模型预测的高危患者相较于低危患者具有更高的不良预后风险(验证组：HR＝2.32，95％CI:1.13-4.74，P＝0.018)，可对患者不良预后进行准确预测。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 一种预测胰腺癌术后生存的LncRNA模型及检测试剂盒
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<212> DNA
<213> ENSG00000244198.4 Reverse primer
<400> 16
ctgacagaag ggcaagt 17
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000271966.1 Forward primer
<400> 17
ctttctgatg ggggtgcagt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000271966.1 Reverse primer
<400> 18
gacagcagtt ccgtgcacta 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> ENSG00000176236.6 Forward primer
<400> 19
gactcgagtt taggccccg 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000176236.6 Reverse primer
<400> 20
gggctcaaga ttccctgcat 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000279029.1 Forward primer
<400> 21
cgccagacag aaggacaagt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000279029.1 Reverse primer
<400> 22
ggtgcagagt aagcctcctg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000257534.1 Forward primer
<400> 23
atggggttgc cactcaactt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000257534.1 Reverse primer
<400> 24
gaaaaccacc caaagctcgg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000257303.1 Forward primer
<400> 25
tcaccttggt tcccaagagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000257303.1 Reverse primer
<400> 26
cctgatcagc acccttctcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000269906.1 Forward primer
<400> 27
atgatggcca caggaaggtg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000269906.1 Reverse primer
<400> 28
gccacaccag tggtacttga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000276250.1 Forward primer
<400> 29
atacaacagg ctccctggtc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000276250.1 Reverse primer
<400> 30
gatgagcgat tggtgaccct 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000267015.1 Forward primer
<400> 31
cacatcatcg ccacacatcg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000267015.1 Reverse primer
<400> 32
tgaatcccac tcaggttgcc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000271784.1 Forward primer
<400> 33
ccacctctca gttggtcgtc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> ENSG00000271784.1 Reverse primer
<400> 34
tgacccttcc gactctgact 20

Claims (11)

1.一种胰腺癌预后预测相关LncRNA的模型，其特征在于，该模型包括样品采集、RNA提取、LncRNA测定和LncRNA表达量加权计算四部分；
所述的LncRNA是筛选获得的、胰腺癌预后相关的17个LncRNA。
2.按权利要求1所述的模型，其特征在于，所述的筛选是对胰腺癌癌组织进行RNA测序，并与和患者的临床随访信息相关联，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，获得胰腺癌相关的17个LncRNA。
3.按权利要求1或者2所述的模型，其特征在于，所述的17个胰腺癌相关LncRNA如下表所示：
LncRNA 名 ENSG00000272750.1 ENSG00000235078.1 ENSG00000270562.1 ENSG00000250413.1 ENSG00000249700.7 ENSG00000260070.1 ENSG00000232445.1 ENSG00000244198.4 ENSG00000271966.1 ENSG00000176236.6 ENSG00000279029.1 ENSG00000257534.1 ENSG00000257303.1 ENSG00000269906.1 ENSG00000276250.1 ENSG00000267015.1 ENSG00000271784.1
表1。
4.一种胰腺癌标志物，其特征在于，所述的胰腺癌标志物包括表1所述的LncRNA。
5.权利要求1所述模型的构建方法,其特征在于，该构建方法依次包括提取样本的RNA、RNA测序并筛选胰腺癌相关的LncRNA。
6.按权利要求5所述的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：
(1)提取并纯化胰腺癌组织的RNA样本；
(2)对胰腺癌癌组织进行RNA测序，组成训练集，利用单因素COX比例风险回归模型，计算每个LncRNA与患者生存的关系，筛选其中与患者生存相关的LncRNA；
(3)利用LASSO Cox回归模型，在训练集中建立LncRNA预后模型，并运用十折交叉验证进行验证，计算获得LncRNA预后预测模型中包含的17个LncRNA的权重系数，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者不良预后的风险指数，根据其中位数，将患者划分为高危和低危两组，判断患者不良预后风险。
7.权利要求1所述的模型在制备胰腺癌预后预测试剂盒中的应用。
8.按权利要求7所述的应用，其特征在于，通过COX比例风险回归模型，计算每个患者生存的风险指数，根据计算得出的值及其中位数，将患者划分为高危和低危，判断患者不良预后风险。
9.按权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的风险指数的计算公式是RS＝B1*X1+…+B17*X17；
其中，X为每个LncRNA在两分类方法中的赋值，B为每个LncRNA的权重系数。
10.按权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的权重系数如表2所示：
LncRNA 名 权重系数(B) ENSG00000272750.1 -0.007894547 ENSG00000235078.1 -0.198597798 ENSG00000270562.1 -0.018438516 ENSG00000250413.1 -0.021035564 ENSG00000249700.7 -0.041273129 ENSG00000260070.1 -0.015183685 ENSG00000232445.1 0.016172084 ENSG00000244198.4 -0.084552592 ENSG00000271966.1 -0.022991908 ENSG00000176236.6 -0.121026448 ENSG00000279029.1 0.02416932 ENSG00000257534.1 -0.014257028 ENSG00000257303.1 -0.05251776 ENSG00000269906.1 0.007557004 ENSG00000276250.1 -0.283657215 ENSG00000267015.1 0.117787771 ENSG00000271784.1 -0.268003602
表2。
11.一种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测表1所列LncRNA的如表3所示的特异性引物；
所述的试剂盒中还包括抽提和/或鉴定RNA的试剂，以及阳性对照、阴性对照、反转录系统、扩增系统和384微孔板组成和说明书；
所述的反转录系统由5×反转录体系缓冲液、反转录酶、脱氧核糖核酸混合物以及随机核苷酸引物组成；
所述的扩增系统由含Taq酶的信使核糖核酸表达定量检测混合液组成；
表3。
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