CN112687342A

CN112687342A - 基于tcga数据库鉴定的一组免疫相关分子标志物在食管癌预后预测中的应用

Info

Publication number: CN112687342A
Application number: CN202011281538.6A
Authority: CN
Inventors: 徐同鹏; 张皓; 朱玲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2021-04-20

Abstract

本发明公开了基于TCGA数据库鉴定的组织中一组免疫相关分子标志物在食管癌预后中的应用，具体为：建立与食管癌预后相关的免疫基因预后模型；建立模型的方法为：步骤1数据收集和处理，步骤2筛选差异表达基因，步骤3差异表达免疫相关基因的鉴定；步骤4转录因子‑免疫差异表达基因调控网络的转录因子分析与构建；步骤5生存分析；步骤6建立了基于食管癌免疫相关基因的预后风险指数评估模型。

Description

基于TCGA数据库鉴定的一组免疫相关分子标志物在食管癌预后预测中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体为基于TCGA数据库鉴定的一组免疫相关分子标志物在食管癌预后预测中的应用。

背景技术

在全球范围内，食道癌是第七种最常见的癌症，是第六大癌症死亡原因。食管癌患者5 年生存率不到20％，病死率很高，严重影响人类健康。2017年，全球食管癌发病人数和死亡人数分别为473000人和436000人。2020年，美国估计将有约18440人确诊为食道癌，16170 人死于食道癌。食管癌的治疗主要集中在术前化疗或术后放疗化疗。然而，由于癌细胞对化疗药物的耐药性，50％的患者对治疗效果不满意。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的两种病理类型。它们在分布、病因、危险因素和治疗上存在差异。食管鳞状细胞癌占食管癌的90％，在东亚和南非很常见。食管鳞状细胞癌的危险因素很多，如吸烟、酗酒、吃辣的食物和多环芳烃。食管腺癌的主要危险因素为Barrett食管、胃食管反流病等。西方人群食管腺癌的发病率高于亚洲人群。食管鳞癌和腺癌在分子特征上存在差异，特异性基因的变化尤其不同。

近年来，免疫治疗在包括食管癌在内的多种恶性肿瘤中得到了发展，被认为是许多癌症治疗的新希望。一些临床试验表明，免疫检查点抑制剂nivolumab和pembrolizumab可以被认为是食管癌新的标准二线治疗策略。免疫治疗在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用。免疫检查点抑制因子(ICI)包括抗PD1、抗PD-L1和抗CTLA-4。肿瘤免疫微环境包括多种免疫细胞，如树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、T和B淋巴细胞等。然而，只有少数患者因耐药而在临床上受益，一些患者在免疫治疗后病情急剧恶化。因此，为了个体化治疗，有必要确定准确预测可能受益于免疫治疗的患者的生物标志物。

目前已证实，预测免疫检查点抑制效应的因素仅有微卫星不稳定性(M食管癌预后生物标志物及其应用I)、PD-L1、肿瘤突变负荷(TMB)、DNA错配修复缺陷(DMMR)和TIL食管癌预后生物标志物及其应用。一项研究发现免疫相关基因(ABL1、ATF2、ATG5、C6、CD38、HMGB1、ICO食管癌预后生物标志物及其应用LG、IL12RB2和PLAU)与食管鳞癌患者的总体生存密切相关。已有研究建立了预测食管癌生存的免疫基因预后标志物。一项基于食管癌预后生物标志物及其应用ERPINE1、MMP12、PLAUR和Ep食管癌预后生物标志物及其应用8四个基因构建和验证的食管癌免疫标志物的大规模多中心回顾性分析，预测了新辅助放化疗的病理完全缓解，为新辅助放化疗与免疫治疗的结合奠定了基础。陆涵等人的研究表明，CD103+CD8+TIL在食管鳞癌中表现为组织驻留记忆性T细胞表型，并高表达免疫检查点(PD-1、TIM-3)。封闭抗PD-1抗体后，CD103+CD8+TIL诱导产生较强的抗肿瘤免疫。最近，为了帮助寻找个体化的免疫治疗靶点，一些研究在免疫基因组图谱分析的基础上建立了肺鳞状细胞癌、结直肠癌等肿瘤的综合预后指标。然而，免疫相关基因在食管癌两种病理亚型中的预后价值尚未完全阐明。关于免疫相关基因在不同亚型食管癌生存和预后中作用的研究较少。本发明通过生物信息学分析建立了一个新的预后模型指标，筛选出可能受益于免疫治疗的食管鳞癌和食管腺癌患者。

技术问题：综上所述，近年来，免疫治疗已成为肿瘤治疗领域的研究热点。有必要探索预测免疫治疗患者预后的指标，以筛选免疫治疗的受益者。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了基于TCGA数据库鉴定的组织中一组免疫相关分子标志物在食管癌预后中的应用，食管癌基于病理类型分为食管鳞癌和食管腺癌。

基于TCGA数据库鉴定的组织中一组免疫相关分子标志物在食管癌预后中的应用，具体为：建立与食管癌预后相关的免疫基因预后模型；建立模型的方法为：

步骤1数据收集和处理，TCGA数据库获取食管癌的免疫相关基因转录组数据、临床数据和随访数据；

步骤2筛选差异表达基因，使用Edger算法寻找差异表达基因；

步骤3差异表达免疫相关基因的鉴定，将差异表达基因与免疫基因杂交，检验分析获得与食管癌相关的免疫差异表达基因；

步骤4转录因子-免疫差异表达基因调控网络的转录因子分析与构建，构建转录因子与与预后相关的免疫差异基因之间的相互作用网络；

步骤5生存分析，将免疫差异基因与步骤1中的临床数据和随访数据的生存资料进行整合，采用R软件生存软件包进行单因素Cox分析；

步骤6免疫基因预测模型的开发，获得与预后相关的免疫相关差异表达基因，采用多元 Cox回归方法，建立了基于食管癌免疫相关基因的预后风险指数评估模型，风险指数的计算公式为：与预后相关的免疫差异基因模型风险指数＝多变量Cox回归的系数×基因表达水平。

进一步的，步骤2中，使用Edger算法寻找差异表达基因，将|logFC|>1、FDR<0.05作为筛选标准。

进一步的，步骤3中，利用R软件的edgeR软件包和Wilcoxon检验分析获得与食管癌相关的免疫差异表达基因。

进一步的，所述食管癌基于病理类型分为食管鳞癌和食管腺癌。

进一步的，食管鳞癌预后相关的免疫基因预后模型基于12个基因建立；12个基因具体为：HLA-B、S100A12、SLC40A1、FABP9、CD14、APLN、BMP1、BMP4、FGF19、IGF2、OSM、EGFR；

食管腺癌预后相关的免疫基因预后模型基于11个基因建立；11个基因具体为：ULBP1、IL1B、 FABP2、MAPT、CST4、CACYBP、DLL4、IL17A、PGF、TNFSF18、OXTR。

进一步的，风险分值的计算公式如下：

食管鳞癌的风险分数＝0.006486756×HLA-B+0.003511031×S100A12-0.134223077× SLC40A1+0.785407491×FABP9-0.021149907×CD14+0.238292334×APLN-0.226841694 ×BMP1+0.315827065×BMP4+0.00809996×FGF19+0.118629975×IGF2+1.008924188× OSM-0.01772927×EGFR；

食管腺癌的风险分数＝-1.230594393×ULBP1+0.060399108×IL1B+0.163713621× FABP2+2.31747042×MAPT+0.139658347×CST4+0.132029819×CACYBP+0.156437833×DLL4+1.690819322×IL17A-0.428632286×PGF+0.943049137×TNFSF18+0.568394224×OXTR。

本发明具有如下有益效果：本发明确定了明确的共识生物标志物来预测食管癌免疫治疗。利用TCGA数据库对食管鳞癌和腺癌的全基因组进行了分析，分别基于12个和11个基因建立了与食管鳞癌和腺癌预后相关的免疫基因预后模型。探讨免疫相关基因的临床意义及其与免疫细胞浸润的相关性，以期提高食管癌的免疫治疗效率，促进食管癌个体化免疫治疗的发展。

附图说明

图1流程图；

图2差异免疫基因。a食管鳞癌热图b食管鳞癌火山图c食管腺癌热图d食管腺癌火山图；

图3免疫相关转录因子的差异基因表达。a鳞癌热图b鳞癌火山图c腺癌热图d腺癌火山图；

图4转录因子调节免疫基因网络图a食管鳞癌b食管腺癌；

图5预后相关免疫基因单变量分析的森林图。a食管鳞癌b食管腺癌；

图6与预后相关的差异免疫基因风险模型的预后能力评估。高危和低危人群的得分分布： a食管鳞癌f食管腺癌。患者生存状态图：b食管鳞癌g食管腺癌。模型中包含的基因表达图谱热图：c食管鳞癌h食管腺癌。两组的生存状态：d食管鳞癌i食管腺癌。ROC曲线：e食管鳞癌j食管腺癌；

图7食管鳞癌和食管腺癌的单变量和多变量回归分析。食管鳞癌、食管腺癌单因素回归分析：a食管鳞癌c食管腺癌。多元回归分析：b食管鳞癌d食管腺癌；

图8临床因素相关分析。食管鳞癌：A、B、C、D、E、食管腺癌：F、G、h、I、J、K；

图9模型指数与免疫细胞(B细胞；CD4-T细胞；CD8-T细胞；巨噬细胞；中性粒细胞；树突状细胞)浸润程度的关系。食管鳞癌:a b c d e f食管腺癌:g h i j k l。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

方法和材料

数据收集和处理

应用TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/获取食管癌患者的免疫相关基因转录组数据、临床数据和随访数据。在ImmPort数据门户中，导出了免疫相关基因列表。

筛选差异表达基因

使用Edger算法寻找差异表达基因，将|logFC|>1、FDR<0.05作为筛选标准。

差异表达免疫相关基因的鉴定

将上述差异表达基因与免疫基因杂交，利用R软件的edgeR软件包 (http://bioconductor.org/Packages/edger/)和Wilcoxon检验分析获得与食管癌相关的免疫差异表达基因。

转录因子-免疫差异表达基因调控网络的转录因子分析与构建

本发明检索了Cistrome癌症数据库，下载了肿瘤相关转录因子，并提取了与临床预后相关的差异表达的转录因子。本发明构建了这些转录因子与与预后相关的免疫差异基因之间的相互作用网络，以探讨转录因子对这些基因的调控机制。

与生存相关的免疫相关基因分析

本发明进行了生存分析。将差异免疫相关基因与患者生存资料进行整合，采用R软件生存软件包进行单因素Cox分析。

免疫基因预测模型的开发

采用多元Cox回归方法，建立了基于食管癌免疫相关基因的预后风险指数评估模型，风险指数的计算公式为：与预后相关的免疫差异基因模型风险指数＝多变量Cox回归的系数×基因表达水平。

高危与低危患者的差异分析

根据与生存相关的差异免疫基因风险评分中值，将基因分为高危组和低危组，绘制生存曲线，探讨高危组和低危组患者生存预后的差异，用生存ROC R软件包绘制受试者的工作特征曲线，计算AUC曲线下面积判断真阳性率，利用R软件的Survminer软件包，采用Kaplan-Meier法探讨高危组和低危组患者的生存和预后。

临床特征的临床相关性研究

探讨生存相关免疫基因与患者性别、肿瘤分期等临床资料的相关性。本发明通过ggpubr 软件包，使用计算的风险分数探讨生存相关免疫基因与性别、肿瘤分期等临床数据之间的临床相关性。

免疫细胞浸润与肿瘤微环境的评价

从TIMER数据库中提取食管癌患者免疫细胞浸润的数据，探讨风险评分是否与免疫细胞浸润有关，免疫细胞包括B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。

统计分析

用R软件(3.6.1版)和R软件包分析免疫基因差异，用R软件clusterProfiler软件包分析免疫基因的功能富集情况，用单因素方差分析探讨免疫相关基因的表达及其与生存的关系。采用χ-2检验确定分类变量，将p<1的变量纳入多因素分析。采用单因素和多因素Cox回归分析解释临床病理特征和危险评分对预后的影响。采用生存ROC R软件包计算受试者的工作特征(ROC)曲线，评价免疫相关基因预测指标的准确性。临床参数差异采用独立t检验。P<0.05，认为差异有统计学意义。用R软件生存和Survminer软件包建立Kaplan-Meier曲线。采用双侧Loggrank检验和Kaplan-Meier法探讨高危和低危食管癌患者的生存情况。

结果

差异表达免疫相关基因的鉴定

本发明从TCGA数据库中筛选出食管癌与正常组织的差异表达基因。本发明发现在鳞癌中有5942个差异表达基因，其中高表达基因4283个，低表达基因1659个。用同样的方法，本发明筛选了3026个腺癌上调基因和625个下调基因。通过将这些基因与免疫相关基因取交集，本发明在鳞癌中获得了372个免疫相关差异基因，其中257个是高表达的，115个是低表达的(图2ab)。腺癌中有232个免疫相关差异基因表达上调，37个基因表达下调(图2cd)。

转录因子-免疫差异表达基因调控网络的转录因子分析与构建

本发明从Cistrome数据库中下载了转录因子集，通过和食管癌两种亚型与正常组织差异表达基因取交集，分别获得食管鳞癌和腺癌差异表达的转录因子集，分别包括83(食管鳞癌) 和49(食管腺癌)个差异的转录因子，其中食管鳞癌中上调65个，下调18个(图3ab)，食管腺癌中上调43个，下调6个(图3cd)。为了了解与预后相关的免疫差异基因的调控机制，本发明以这些差异转录因子和本发明以前筛选的免疫差异基因为基础，构建了转录因子-免疫基因相互作用的调控网络。本发明发现BMP4、CD14、PSME2、HLA-B、IGF2、CKLF、FABP9、 IL1F10、TSLP和OSM是食管鳞癌的高危免疫基因，而NR2F2、EGFR和BMP1是低危免疫基因(图4a)。CACYBP、MAPT、CST4、PSMD11、IL17A、PLAU、OXTR、FABP2、CSF2 和TNFSF18是食管腺癌的高危免疫基因(图4b)。

与生存相关的免疫相关基因分析

本发明将上述筛选的免疫相关差异表达基因与患者的临床信息和随访数据相结合进行生存分析。为了获得与预后相关的免疫相关差异基因，本发明对预后相关的免疫基因进行了单因素分析。结果表明，CTSL、S100A12、SLC40A1、BMP4、FGF19、TNFSF10、CD14、PSME2、 HLA-B、APLN、IGF2、CKLF、FABP9、IL1F10、TSLP和OSM等16个基因是食管鳞癌的高危基因，NR2F2、EGFR和BMP1是ESCLC的低危基因(图5a)。食管腺癌中有23个高危基因和1个低危基因(图5b)。

免疫基因预测模型的开发

根据与预后相关的免疫差异基因和患者生存资料，采用多因素Cox回归分析，构建免疫相关基因的预后模型。经单因素和多因素Cox回归分析，分别有12个基因和11个基因进入了食管鳞癌和食管腺癌的预后模型。风险分值的计算公式如下：

食管鳞癌的风险分数＝0.006486756×HLA-B+0.003511031×S100A12-0.134223077× SLC40A1+0.785407491×FABP9-0.021149907×CD14+0.238292334×APLN-0.226841694 ×BMP1+0.315827065×BMP4+0.00809996×FGF19+0.118629975×IGF2+1.008924188× OSM-0.01772927×EGFR(表.1a).

食管腺癌的风险分数＝-1.230594393×ULBP1+0.060399108×IL1B+0.163713621× FABP2+2.31747042×MAPT+0.139658347×CST4+0.132029819×CACYBP+0.156437833×DLL4+1.690819322×IL17A-0.428632286×PGF+0.943049137×TNFSF18+0.568394224×OXTR(表.1b).

表1a食管鳞癌的免疫基因预后模型的系数

表1b食管腺癌的免疫基因预后模型的系数

高危与低危患者的差异分析

以中位数为分界点，根据危险评分将患者分为高危组和低危组。本发明发现高危组患者的生存预后明显差于低危组(p<0.05)(图6d和图6i)。食管鳞癌和食管腺癌的ROC曲线下面积分别为0.917和0.882，具有较高的真阳性率。图6a和图6f显示患者的风险评分与预后呈负相关。高风险组的死亡人数明显高于低风险组，生存时间也明显短于低风险组(图6b和图6g)。多因素Cox回归分析调整了性别、肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况、远处转移等因素 (图7)。分析图显示，风险评分可以独立预测食管癌和食管癌患者的预后(P<0.01)。

表2独立预后因素的单因素和多因素回归分析a食管鳞癌b食管腺癌

表2a

表2b

表3免疫相关基因表达与临床病理因素的关系a食管鳞癌b食管腺癌

表3a

表3b

临床特征的临床相关性研究

本发明还探讨了风险评分、免疫相关差异基因与肿瘤临床特征的关系。结果表明，免疫相关差异基因MAPT、TNFSF18和OXTR在EAC中的表达男性高于女性(图8i，图8j和图8g)，而IL1B的表达则相反(图8f)。结果表明，免疫相关差异基因MAPT、TNFSF18和OXTR 在食管腺癌中的表达男性高于女性(图8i，图8j和图8g)，而IL1B的表达则相反(图8f)。S100A12基因的表达与食管鳞癌的分期有关(图8c)。TNFSF18在3～4期食管癌中的表达低于1、2期。在T分期，在食管腺癌中，TNFSF18在3～4期的表达明显高于1～2期(图8h)。然而，在食管鳞癌中，BMP1和EGFR基因的高表达往往预示着较好的M分期(图8a和图8d)，即肿瘤没有远处转移。研究还发现，本发明的模型风险评分与食管腺癌的T分期之间存在显著的正相关(图8k)。就食管鳞癌的生存结局而言，HLA-B是一个危险基因，高表达表明生存结局较差 (图8b)，而EGFR的表达水平越高，生存的可能性就越大(图8e)。

免疫细胞浸润与肿瘤微环境的评价

本发明使用TIMER的样本来探索免疫基因组是否能反映患者肿瘤免疫微环境的状态。下载食管癌患者免疫浸润水平，分析和可视化预后相关免疫基因与免疫细胞丰度的相关性，并使用Pearson相关分析。结果表明，B细胞浸润程度与食管鳞癌的与预后相关免疫差异基因评估模型的评分呈负相关(图9a)。未发现该预后指标与6种免疫细胞浸润的其他统计学相关性。

本发明利用TCGA数据库对食管鳞癌和腺癌的全基因组进行了分析，分别基于12个和 11个基因建立了与食管鳞癌和腺癌预后相关的免疫基因预后模型。探讨免疫相关基因的临床意义及其与免疫细胞浸润的相关性，以期提高食管癌的免疫治疗效率，促进食管癌个体化免疫治疗的发展。

基因组分析有力地证明食管鳞状细胞癌和食管腺癌是不同的肿瘤实体，它们的基因变化谱有很大的不同。对食管癌基因组特征的研究发现，食管鳞状细胞癌和食管腺癌表现出一组几乎互斥的驱动基因，表明它们的发育是独立的。使用了单变量Cox回归分析。在食管鳞癌和腺癌中，分别获得了19个和24个与预后相关的差异免疫基因。其中重点分析了与性别、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移等临床特征相关的8个基因，这些基因可能对食管癌患者的预后起重要作用。食管鳞癌分别为EGFR、S100A12、BMP1、HLA-B基因，腺癌分别为IL-1B、 MAPT、OXTR、TNFSF18基因。

表皮生长因子受体(EGFR)是酪氨酸激酶的一员，是乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤靶向治疗的热门靶点。其在食管鳞癌中的过度表达常提示预后不良。食管鳞癌组织中EGFR基因的表达与肿瘤细胞或肿瘤浸润的免疫细胞呈负相关，但关于EGFR基因表达与食管癌免疫治疗患者预后关系的研究较少。EGFR是食管鳞癌患者的一种免疫差异基因，其表达下调与食管鳞癌的预后不良有关。EGFR在无远处转移的患者中的表达高于有远处转移的患者，其高表达往往预示着较好的生存预后。骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子超家族的成员之一，本发明中，BMP1在食管鳞癌中也是一个与预后相关的免疫分化基因，其表达水平越高，远处转移的可能性越小。IL-1β基因的IL-1β基因簇位于染色体2q上，属于IL-1蛋白簇，编码促炎因子IL-1β7。IL-1β被认为是促进肿瘤进展、转移和免疫抑制的重要调节因子。IL-1B是食管腺癌的风险免疫相关差异基因，女性表达普遍高于男性；微管相关蛋白Tau基因(MAPT 基因)编码Tau蛋白，可促进细胞骨架微管的聚合和稳定，调节微管蛋白的动态变化，本发明发现MAPT的表达与食管腺癌预后不良有关，男性表达高于女性。一些利用TCGA数据库的研究发现，MAPT基因的表达与低级别胶质瘤患者的生存率密切相关。

还建立了两个免疫相关基因的预后指数模型，分别基于特定基因在食管鳞癌和食管腺癌中的表达水平和相应的回归系数。计算食管癌患者的危险评分，预测食管癌患者免疫治疗的疗效。根据评分将患者分为两个危险组。结果显示，食管鳞癌和腺癌高危人群的生存预后明显差于低危人群。风险评分越高，预后越差。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.基于TCGA数据库鉴定的组织中一组免疫相关分子标志物在食管癌预后中的应用，其特征在于：具体为：建立与食管癌预后相关的免疫基因预后模型；建立模型的方法为：

步骤2筛选差异表达基因，使用Edger算法寻找差异表达基因；

步骤6免疫基因预测模型的开发，获得与预后相关的免疫相关差异表达基因，采用多元Cox回归方法，建立了基于食管癌免疫相关基因的预后风险指数评估模型，风险指数的计算公式为：与预后相关的免疫差异基因模型风险指数＝多变量Cox回归的系数×基因表达水平。

2.基于权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤2中，使用Edger算法寻找差异表达基因，将|logFC|>1、FDR<0.05作为筛选标准。

3.基于权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤3中，利用R软件的edgeR软件包和Wilcoxon检验分析获得与食管癌相关的免疫差异表达基因。

4.基于权利要求1所述的应用，其特征在于：所述食管癌分为食管鳞癌和食管腺癌。

5.基于权利要求4所述的应用，其特征在于：食管鳞癌预后相关的免疫基因预后模型基于12个基因建立；12个基因具体为：HLA-B、S100A12、SLC40A1、FABP9、CD14、APLN、BMP1、BMP4、FGF19、IGF2、OSM、EGFR；

食管腺癌预后相关的免疫基因预后模型基于11个基因建立；11个基因具体为：ULBP1、IL1B、FABP2、MAPT、CST4、CACYBP、DLL4、IL17A、PGF、TNFSF18、OXTR。

6.基于权利要求5所述的应用，其特征在于：风险分值的计算公式如下：

食管鳞癌的风险分数＝0.006486756×HLA-B+0.003511031×S100A12-0.134223077×SLC40A1+0.785407491×FABP9-0.021149907×CD14+0.238292334×APLN-0.226841694×BMP1+0.315827065×BMP4+0.00809996×FGF19+0.118629975×IGF2+1.008924188×OSM-0.01772927×EGFR；

食管腺癌的风险分数＝-1.230594393×ULBP1+0.060399108×IL1B+0.163713621×FABP2+2.31747042×MAPT+0.139658347×CST4+0.132029819×CACYBP+0.156437833×DLL4+1.690819322×IL17A-0.428632286×PGF+0.943049137×TNFSF18+0.568394224×OXTR。