CN101960022A

CN101960022A - Ⅱ期和ⅲ期结肠癌的分子分期和预后

Info

Publication number: CN101960022A
Application number: CN200980107672XA
Authority: CN
Inventors: Y·蒋; Y·张; Y·王
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2008-01-22
Filing date: 2009-01-19
Publication date: 2011-01-26
Also published as: MX2010008008A; JP2011509689A; WO2009094318A3; BRPI0907440A2; CA2712773A1; EP2240609A4; KR20100120657A; EP2240609A2; US20090192045A1; IL206991A0; WO2009094318A2

Abstract

本发明涉及II期和III期结肠癌的分子分期和预后。本发明的试剂和制品包括用于进行7基因检测分析的试剂，以将结肠癌分期为II期或III期结肠癌。

Description

Ⅱ期和Ⅲ期结肠癌的分子分期和预后

背景技术

结肠癌的精确分期不但有利于疾病预后预测，还有利于患者的临床管理和治疗选择。在20世纪40年代引入了基于临床和病理特征的TNM系统，并逐渐演变发展，在20世纪80年代后得到了广泛的采用(Quirke等人(2007))。在这些指南中，充分的淋巴结评估对结肠癌的正确分期至关重要。然而，由于患者、外科医生、病理学者和肿瘤相关变量，63％的结肠癌患者可能得不到充分的淋巴结评估。(Baxter等人(2005))。

基因组学方法已经成功地应用于癌症分类和子分类的鉴定、疾病进展预测以及治疗选择和疗效预测(Bhattacharjee等人(2001)；Khan等人(2001)；Sorlie等人(2003)；Agrawal等人(2002)；和Wang等人(2005))。基因和表观遗传学信息为当前癌症诊断和预后准确性的改善提供了可能，并可与临床和病理参数互为补充。通过使用微阵列分析，为II期结肠癌患者开发了23基因预后标记(Wang等人(2004))。此标记已经从多个临床试点的独立样本中得到进一步验证(Jiang等人(2008))。然而，据信可以通过肿瘤的更精确分期来提高基因标记的预后价值。

发明内容

在本发明的一个方面，诊断包括用于测定结肠癌是处于II期还是III期的7基因标记。

在本发明的另一方面，诊断包括用于检测7基因表达的试剂，该7基因用于区分II期与III期结肠癌。

在本发明的另一方面，用于区分II期与III期结肠癌和/或提供结果预后的试剂盒包括用于检测7标记基因的表达以及任选的一组组成型表达基因的表达的试剂。

附图说明

图1使用Affymetrix微阵列对137例II期与III期患者进行的7基因标记ROC和Kaplan-Meier生存分析。A.7基因标记的ROC曲线。B.使用7基因标记对137个冷冻肿瘤样本分析所得的Kaplan-Meier曲线以及时序检验。高风险组和低风险组差异显著(P＝0.007)。

图2使用RTQ-PCR对123个FPE II期与III期样本进行7基因标记的ROC和Kaplan-Meier生存分析。A.7基因标记的ROC曲线。B.使用7基因标记对123个FPE样本分析所得的Kaplan-Meier曲线以及时序检验。高风险组和低风险组差异显著(P＝0.0271)。

图3使用RTQ-PCR对来自4个不同临床试点的180个独立的FPE II期结肠癌样本进行7基因标记的Kaplan-Meier生存分析。

具体实施方式

淋巴结转移是II期和III期结肠癌分期最重要的临床因素之一，并且临床指南建议对于正确分期，必需检查至少12个淋巴结。然而，不到40％的结肠癌患者接受了充分的淋巴结评估(Baxter等人(2005))。用于预测II期结肠癌的肿瘤复发的23基因预后标记以前便已涉及，例如美国专利公布20060063157，其全文以引用方式并入本文。随后的文献中有报道，使用新鲜冷冻肿瘤标本在123例II期结肠癌的独立患者组中对该标记进行验证，并使用福尔马林固定石蜡包埋样本在110例II期患者的组中对该标记进行验证(Jiang等人(2008))。本发明涉及更精确的分期。

生物标记为核酸/蛋白质指示标记物的任何标记。核酸可以为本领域中任何已知的核酸，包括(但不限于)细胞核、线粒体(同质性、异质性)、病毒、细菌、真菌、支原体等的核酸。该标记可以为直接或间接的，并且可在给定生理参数条件下以及与内参、安慰剂、正常组织或另一恶性肿瘤进行比较时，测量基因过表达或低表达。生物标记包括(但不限于)核酸和蛋白质(均有过表达和低表达以及直接和间接之分)。使用核酸作为生物标记可包括本领域已知的任何方法，包括(但不限于)测量DNA扩增、缺失、插入和复制；测量RNA；测量微RNA(miRNA)；测量杂合性缺失(LOH)；直接测量或经基因组扩增后测量单核苷酸多态性(SNPs，Brookes(1999))、拷贝数多态性(CNPs)；测量微卫星DNA；测量表观遗传改变(例如DNA低甲基化或高甲基化)和FISH。使用蛋白质作为生物标记的方法包括本领域已知的任何方法，包括(但不限于)测量数量、活性、修饰(例如糖基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化等)或免疫组织化学(IHC)和代谢周转。其他生物标记包括成像、分子谱、细胞计数和细胞凋亡标记物。

当标记基因含有Seq ID NO指定的序列时，其对应于该序列。当基因区段或片段含有足以表明其为该基因序列的一部分参考序列或其互补序列时，其对应于此基因序列。当基因表达产物中的RNA、mRNA或cDNA杂交到含有此序列(如探针)的组合物上时，其对应于此序列，或者对于肽或蛋白质来说，其被该mRNA编码。当基因表达产物的区段或片段含有足以区分出该基因序列或基因表达产物序列的一部分参考基因表达产物或其互补序列时，基因表达产物的区段或片段对应于此基因序列或基因表达产物序列。

在本说明书中描述和受权利要求书保护的本发明的方法、组合物、制品和试剂盒包括一种或多种标记基因。在整个本说明书中使用的“标记物”或“标记基因”是指对应于如下任何基因的基因或基因表达产物：所述基因的过表达或低表达与指示或组织类型相关。

建立基因表达谱的优选方法包括测定RNA的量，该RNA由能够编码蛋白质或肽的基因的生成。此测定通过逆转录PCR(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差异显示RT-PCR、Northern印迹分析和其他相关的测试实现。虽然可以采用单个PCR反应来实施这些技术，但最好扩增由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)，并使用微阵列对其进行分析。多种不同的阵列构型及其制备方法是本领域的技术人员已知的，并在如下专利中有所描述，例如5445934、5532128、5556752、5242974、5384261、5405783、5412087、5424186、5429807、5436327、5472672、5527681、5529756、5545531、5554501、5561071、5571639、5593839、5599695、5624711、5658734和5700637。

微阵列技术允许同时测量数千种基因的稳态mRNA水平，从而提供了识别细胞增殖失控的效应(如启动、阻滞或调控)的强大工具。目前广泛使用的微阵列技术有两种。第一种是cDNA阵列，第二种是寡核苷酸阵列。虽然这些芯片的构造存在差异，但是基本上所有的下游数据分析和输出都是相同的。这些分析的结果通常为接收自标记探针的信号的强度的测量值，该标记探针用于检测来自样本的cDNA序列，该cDNA序列在微阵列的已知位置上与核酸序列杂交。信号强度通常与cDNA的量成比例，因此也与在样本细胞中表达的mRNA成比例。大量的此类技术是可得的并且可用的。用于确定基因表达的优选方法可见于6271002、6218122、6218114和6004755。

通过比较此类信号强度可以分析表达水平。完成该比较最好的方式是生成试验样本与对照样本中基因表达强度的比率矩阵。例如，可将来自患病组织的基因表达强度与相同类型的良性或正常组织产生的表达强度进行比较。这些表达强度的比值反映了试验样本和对照样本之间在基因表达上的倍数变化。

选择可以基于产生序列表的统计试验，该序列表与肿瘤起源的原发部位相关的因子之间的每个基因的差异表达的显著性证据有关。此类试验的例子包括ANOVA和Kruskal-Wallis。列表中的名次可以作为模型中的权重，该模型设计用于将这种权重总和(最多到截止值)解释为有利于一类而不利于另一类的优势证据。文献中所述的以前的证据也可用于调整权重。

优选的实施例通过识别稳定的对照组，并将此组换算成所有样本之间的方差为零，从而将每个测量值归一化。将该对照组定义为受测定的系统误差影响并且已知不会独立于该误差而改变的任何单个内源转录物或内源转录物组。所有标记物都通过产生零方差的样本特异性因子调整，以用于对照组的任何描述性统计量(如平均值或中值)或用于直接测量。作为另外一种选择，如果对照组方差只与系统误差有关的假设不真，而进行归一化时所得分类误差较小，则对照组仍然按照规定使用。非内源峰值对照也可能是有用的，但不是优选的。

基因表达谱可以多种方式显示。最常见的方式是将原始荧光强度或比率矩阵布置到树状图中，其中列表示试验样本，行表示基因。如此布置数据可以使有相似表达谱的基因彼此相邻。每个基因的表达比率用颜色来直观表示。例如，小于1的比率(下调)出现在图谱的蓝色部分，而大于1的比率(上调)出现在图谱的红色部分。可商购获得的计算机软件程序可用于显示此类数据，这些计算机软件程序包括“Genespring”(SiliconGenetics，Inc.)和“Discovery”以及“Infer”(Partek，Inc.)

就测量蛋白质含量来确定基因表达而言，本领域任何已知的方法都是合适的，只要其可导致足够的特异性和灵敏度。例如，可通过使蛋白质结合至该蛋白质特异性的抗体或抗体片段，并测量抗体结合的蛋白质的量来测量蛋白质含量。可用放射性荧光试剂或其他可检测试剂标记抗体，以方便检测。检测方法包括(但不限于)酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫印迹技术。

在本发明的方法中使用的调控基因在“实例”中有所描述。相对于不同起源恶性肿瘤患者而言，差异表达的基因在特定起源恶性肿瘤患者中或者上调或者下调。上调和下调是相对的术语，其意指基因表达量相对于某些基线存在可检测差值(超出用来测量的系统中的噪音的贡献)。在这种情况下，根据算法确定基线。使用相同的测量方法可测得患病细胞中所关注的基因相对于基线水平或者上调或者下调。在上下文中，“患病的”是指由细胞不可控制的增殖引起的阻断或干扰或潜在干扰机体功能正常发挥的机体状态变化。当某人的基因型或表型的某些方面与疾病的存在相符时，此人被诊断为患有此疾病。然而，进行诊断或预后的行为可以包括确定疾病/状况事宜，例如确定复发可能性、治疗类型和治疗监控。在治疗监控中，通过比较基因表达随时间的变化，确定是否基因表达谱已经变化为或正变化为更符合正常组织的模式，从而就给定疗程的效果做出临床判断。

可以对基因进行分组，以便获得的关于在此组中基因集合的信息提供作出临床相关判断(例如诊断、预后或治疗选择)的重要依据。这些基因集合构成本发明的组合。对于大部分诊断标记物，通常希望使用足以作出正确医疗判断的数量最少的标记物。这样可以防止为等待进一步分析而延误治疗，并防止无谓地浪费时间和资源。

确定基因表达组合的一种方法是通过使用优化算法，例如在确定股票投资组合时广泛使用的均值方差算法。该方法在20030194734中有详细描述。基本上，该方法需要确定一组输入值(金融应用中的股票，此处则为用强度衡量的表达)，该输入值会优化使用它所获得的收益(如产生的信号)，同时又使收益的不确定性最低。许多商业软件程序可以进行这种运算。优选使用本说明书中称为“Wagner软件”的“Wagner As sociatesMean-Variance Optimization Application”(Wagner Associates均值-方差优化应用程序)。该软件使用“Wagner Associates Mean-VarianceOptimization Library”(Wagner Associates均值-方差优化库)中的函数确定有效边界，优选采用马可维茨理论中的优化投资组合(Markowitz(1952))。使用这类软件需要转化微阵列数据，以便以股票收益方式将该数据作为输入处理，并且在该软件用于所需财务分析目的时，需要使用风险测量值。

选择组合的方法也可以包括启发式规则的使用。优选地，在生物学基础上和为得出临床结果而对该技术的理解的基础上制定启发式规则。更优选地，将这些规则用于优化方法中的输出。例如，可以将选择组合的均值-方差方法应用于在患有癌症的受试者中差异表达的多种基因的微阵列数据。该方法的输出将为最优基因集，该基因集可以包括表达于周边血液和患病组织的某些基因。如果试验方法中使用的样本采自周边血液，并且差异表达于癌症病例中的某些基因，也可以差异表达于周边血液，则可以应用启发式规则，其中组合选自不包括差异表达于周边血液的那些样本的有效边界。当然，也可以在形成有效边界之前应用该规则，例如，在数据预选过程中应用该规则。

可以使用未必与所考虑的生物学相关的其他启发式规则。例如，可以应用这样一条规则，即只有指定百分比的组合可以由特定的基因或一组基因表示。可商购获得的软件(例如Wagner软件)很适合这些类型的启发式方法。例如，当除了准确度和精度之外的因素(如预期许可费)对是否愿意包括一个或多个基因有影响时，这种方法是可用的。

本发明的基因表达谱也可以结合在癌症诊断、预后或治疗监控方面有用的其他非基因诊断方法一起使用。例如，在一些情况下，将上述基于基因表达的方法的诊断作用与来自诸如血清蛋白质标记物(如癌症抗原27.29(“CA 27.29”))之类的常规标记物的数据结合具有有益效果。存在一系列此类标记物，其中包括诸如CA 27.29之类的被分析物。在一种此类方法中，从接受治疗的患者体内定期采集血样，然后对血样进行有关上述一种血清标记物的酶免疫分析。当标记物浓度显示肿瘤复发或治疗失败，则采集适于基因表达分析的样本来源。当存在可疑肿块时，则通过细针穿刺术(FNA)采样，然后再按上述方法分析从肿块中抽取的细胞的基因表达谱。作为另外一种选择，可以从之前移除肿瘤的组织的邻近区域采集组织样本。当其他试验会得到含混结果时，该方法尤其有用。

分离核酸和蛋白质的方法是本领域熟知的。参见(例如)全文以引用方式并入本文的US 6,992,182以及在互联网的万维网上的Ambion网址和美国专利20070054287中有关RNA分离的讨论。

DNA分析可以为本领域已知的任何方法，包括(但不限于)甲基化、去甲基化、染色体核型分析、倍体分析(非整倍体、多倍体)、DNA完整性分析(通过凝胶或分光光度测定评价)、易位、突变、基因融合、活化-钝化、单核苷酸多态性(SNPs)、拷贝数或用于检测基因构成的全基因组扩增。RNA分析包括本领域已知的任何方法，包括(但不限于)q-RT-PCR、miRNA或转录后修饰。蛋白质分析包括本领域已知的任何方法，包括(但不限于)抗体检测、翻译后修饰或代谢周转。蛋白质可以为细胞表面标记物，优选地为上皮、内皮、病毒或细胞型。生物标记可以与病毒/细菌感染、侵害或抗原表达有关。

根据本发明制备的试剂盒包括用于确定基因表达谱的格式化检测分析法。这些试剂盒可以包括进行检测分析所需的一些或全部材料，例如试剂和指令以及在其中进行生物标记检测分析的介质。

本发明的制品包括可用于治疗、诊断、预后和以其他方式评估疾病的基因表达谱的表现形式。这些基因表达谱的表现形式被压缩到可以由设备自动读取的介质中，例如计算机可读介质(磁性介质、光学介质等)。该制品也可以包括评估该介质中的基因表达谱的指令。例如，该制品可以包括CD ROM，该CD ROM具有比较上述基因组合的基因表达谱的计算机指令。该制品也可以将基因表达谱以数字形式记录在其中，以便将其与得自患者样本的基因表达数据进行比较。作为另外一种选择，基因表达谱可以不同的表示格式进行记录。图像记录是一种此类格式。聚类算法(例如上述得自Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”软件中所包括的)是可视化此类数据的最佳辅助工具。

根据本发明的不同类型的制品为用来显示基因表达谱的介质或格式化检测分析法。这些制品可以包括(例如)微阵列，在微阵列中互补序列或探针固定到矩阵上，而表征所关注基因的序列与固定有互补序列或探针的矩阵结合，从而形成对其存在性的可读判定。作为另外一种选择，根据本发明的制品可以制成试剂盒，该试剂盒用于进行杂交、扩增和产生表征所关注基因表达水平的信号，以检测癌症。

提供了下面的实例以举例说明本发明而不是限制本发明。

实例1

材料和方法

患者样本

从78例编码的II期和59例III期结肠癌患者中采集获得冷冻肿瘤标本。存档的原发性肿瘤样本是在外科手术时收集的。在苏木精-伊红染色的组织切片上评估每个标本的组织病理学，以确定诊断和肿瘤含量。通过计数上皮肿瘤细胞的细胞核来估计肿瘤的百分比含量。患者合格标准包括：结肠原发性II期和III期腺癌，主要治疗手段仅为外科手术，不需辅助或新辅助治疗，在组织样本中至少有70％的肿瘤细胞，随访期至少3年，排除此前便已发展成远端复发的患者。按照结肠癌患者全科医疗对术后患者进行监测，包括针对患者的体格检查、血细胞计数、肝功能试验、血清CEA和结肠镜检查。为所选患者进行腹部CT扫描和胸部X光检查。如果疑似癌症复发，则为患者进行诊断检查，包括针对所选患者的结肠镜检查、胸部/腹部/骨盆CT和MRI。如果可行的话，则在所有患者中进行诊断性活组织检查，以确定转移病灶。复发时间或无病时间被定义为：就复发患者而言，为从手术日期到确认肿瘤复发的日期；就无病患者而言，为从手术日期到最后随访日期。

还从85例II期和38例III期结肠癌患者中采集获得FPE肿瘤标本。还有单独采集的180例II期结肠癌FPE标本。评估每个标本的组织病理学，以确定诊断和肿瘤含量。患者合格标准和随访程序与冷冻样本选择中的相同。

微阵列分析

处理所有冷冻肿瘤组织以进行RNA提取(Baxter等人(2005))。使用公布的方法(Affymetrix(Santa Clara，CA))制备生物素标记的靶标并将其杂交到Affymetrix U133a基因芯片(Affymetrix U133a GeneChip)(Affymetrix(Santa Clara，CA))上。使用标准的Affymetrix方案扫描阵列。每个探针组被认为是一个单独的基因。使用

分析软件MAS 5.0，并根据以前描述的分析方法计算每个基因的表达值(Wang等人(2004))。

从FPE样本提取RNA

FPE样本是福尔马林固定的(n＝45)或Hollandes固定的(n＝65)FPE组织。在FPE组织样本中的RNA提取是根据使用高纯RNA石蜡试剂盒(High Pure RNA Paraffin Kit)(Roche Applied Sciences(Indianapolis，IN))的改良方案进行的。FPE组织块根据块的大小进行切片(6-8mm＝6×10μm，≥8mm＝3×10μm)。按照制造商手册中所描述的方法将切片脱蜡。将组织切片在55℃下于烘箱中干燥10分钟，并重悬于100μL组织裂解缓冲液、16μL 10％SDS和80μL蛋白酶K中。样本在恒温混匀器中涡旋和温育，恒温混匀器设定值为：转速400rpm、温度55℃、时间：3小时。按照试剂盒手册进行样本处理的后续步骤。使用分光光度计，通过读取OD 260/280值来定量RNA样本，然后将RNA样本稀释到终浓度为50ng/uL。提取的RNA样本在-80℃下储存于无RNA酶纯水中直至使用。

RTQ-PCR分析

使用一步多重RTQ-PCR检测分析对提取自FPE组织的RNA样本进行基因标记和看家对照基因的评估。为了最小化RTQ-PCR反应的差异，使用三种看家对照基因(包括β-肌动蛋白基因、HMBS和RPL13A)归一化RNA的输入量。为了防止扩增样本中任何污染DNA，用于RTQ-PCR检测分析的PCR引物或探针设计成跨越内含子，以使该检测分析不扩增任何残留的基因组DNA。在一步RTQ-PCR反应中使用100纳克的总RNA。使用在一步PCR预混试剂盒(

one-step PCR Master Mix reagents kit)(Applied Biosystems(Fresno，CA))中包含的40×Multiscribe和RNA酶抑制剂混合液进行逆转录。然后将cDNA加入无尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的2×Master Mix。在ABI 7900HT序列检测系统(ABI 7900HT sequencedetection system)(Applied Biosystems(Frenso，CA))上使用10μL反应体积规格的384孔板进行PCR扩增。引物和探针的浓度分别为4和2.5μmol/L。反应混合液在48℃下温育30分钟以进行逆转录，再在95℃下10分钟进行酶活化步骤，然后进行40个循环的95℃下变性15秒、60℃下退火和延伸1分钟。生成从100pg至100ng起始材料范围内的标准曲线，当R²值为＞0.99时，接受循环阈值(Ct)。另外，按照制造商手册将所有引物和探针优化到具有相同的扩增效率。用于扩增7基因和3看家对照基因的引物和探针序列如下，每条序列均从5’到3’方向书写：

EP2MA正向引物：CATTATTCAAGGCCGAGTACAGATG；

EP2MA反向引物：CACGTACACGATGTGTCCCTTCT；

EP2MA探针：FAM-CAGGCGGTGTGCCTGCTGCAT-BHQ。

KLF5正向引物：CCTGAGGACTCACACTGGTGAA；

KLF5反向引物：CAGCTCATCCGATCGCG；

KLF5探针：FAM-CAAGTGTACCTGGGAAGGCTGCGACTG-BHQ。

CAPG正向引物：CGCAGCTCTGTATAAGGTCTCTGA；

CAPG反向引物：GATATCAGCAGTTCAAGGGCAA；

CAPG探针：FAM-AACCTGACCAAGGTGGCTGACTCCAG-BHQ。

LILRB 3正向引物：AGATGGACACTGAGGCTGCTG；

LILRB 3反向引物：CTTCCGTCTAAGGGTCAAGCTG；

LILRB 3探针：FAM-CCCAGGATGTGACCTACGCCCAG-BHQ。

LAT正向引物：CTCCCACCGGACGCCATC；

LAT反向引物：CCTCGTTCTCGTAGCTCGCCA；

LAT探针：FAM-CGGGATTCTGATGGTGCCAACAGT-BHQ-1-TT。

CHC1正向引物：TTTGTGGTGCCTATTTCACCTTT；

CHC1反向引物：CGGAGTTCCAAGCTGATGGTA；

CHC1探针：FAM-CCACGTGTACGGCTTCGGCCTC-BHQ。

YWHAH正向引物：CCTGTCTCTTGGGAAGCAGTTT；

YWHAH反向引物：GCTCCTGTGGGCTCAAAG；

YWHAH探针：FAM-ATCATGGGCATTGCTGGACTGATGG-BHQ。

β-肌动蛋白基因正向引物：AAGCCACCCCACTTCTCTCTAA；

β-肌动蛋白基因反向引物：AATGCTATCACCTCCCCTGTGT；

β-肌动蛋白基因探针：FAM-AGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTC-BHQ。

HMBS正向引物：CCTGCCCACTGTGCTTCCT；

HMBS反向引物：GGTTTTCCCGCTTGCAGAT；

HMBS探针：FAM-CTGGCTTCACCATCG-BHQ。

RPL13A正向引物：CGGAAGAAGAAACAGCTCATGA；

RPL13A反向引物：CCTCTGTGTATTTGTCAATTTTCTTCTC；

RPL13A探针：FAM-CGGAAACAGGCCGAGAA-BHQ。

对于每个样本，按照ΔCt＝Ct(靶基因)-Ct(4个对照基因的平均值)计算ΔCt。ΔCt归一化已广泛应用于临床RTQ-PCR检测分析。

统计方法

t检验用于比较II期结肠癌患者和III期结肠癌患者之间每个基因的区别。对作为训练集的CCF患者进行逻辑回归(Logistic regression)，以建立评估成为III期的可能性的模型。由逻辑模型得出的每个患者成为III期的概率用于生成“接受者操作特性”(ROC)曲线。从ROC曲线中选择概率阈值以产生至少90％的特异性(正确鉴定90％的II期患者)。由训练集构建的模型用于计算其中一组测试集的患者成为III期的概率。KaplanMeier生存曲线(Kaplan等人(1958))和从Cox比例风险回归计算所得的风险率用于评估在预测的II期和预测的III期患者之间的无复发生存的差异。使用软件(Insightful(Fairfax Station，VA))进行所有的统计分析。

结果

患者和肿瘤特性

在表1和表2中总结了患者及其肿瘤的临床和病理特征。

表1：Cleveland临床中心新鲜冷冻样本和FPE样本的患者和肿瘤特性

表2：180个验证样本(FPE组织)的患者和肿瘤特性

所有患者都有关于年龄、性别、TNM期、检测的淋巴结数目、等级和肿瘤位置等信息。所有患者患有散发性结肠癌。本研究排除直肠癌患者。根据AJCC第6版指南进行TNM分期。每个临床试点也报告组织学分级或分化状态。检测的淋巴结数目在试点之间有所不同，因为样本取自不同时期的存档集合。只采用外科手术治疗患者，没有患者接受新辅助性或辅助性治疗。除了那些在3年之内复发或死亡的患者以外，可获得本研究中所有患者最少3年的随访数据。统计分析表明肿瘤特性在复发和未复发患者之间差异不显著。

新鲜冷冻样本中的基因标记分析。

在早期研究中的患者样本组(Wang等人(2004))中，两个亚组检测到肿瘤，分别代表高分化和低分化肿瘤。Cadherin17基因表达用于将II期肿瘤分为两个亚组，并且预后的基因标记设计成包括针对亚组I(7基因)和亚组II(15基因)的分类器。在本研究中，发现亚组II(无法检测的Cadherin17)只占78个II期肿瘤中的1个(1.3％)和59个III期肿瘤中的1个(1.7％)。因此，在本研究的算法中，设计了改进的基因标记，其只包括针对亚组I的7基因。此7基因在如下的表3中列出，并列出基因库标识号和Affymetrix U133a芯片标识号。

表3

基因	Seq ID NO
		LILRB3	1
YWHAH	3

RCC1	5
		KLF5	7
CAPG	9
		LAT	11
EPM2A	13

为评估7基因标记的分期性能，我们首先使用t检验比较7基因对于区分临床上定义的II期和III期患者的识别能力。然后对137个样本进行逻辑回归，以构建一个模型来评估每个患者成为III期或II期的可能性。用于评估作为分期预测因子的7基因标记的性能的参数是接受者操作特性(ROC)分析曲线下方的面积(AUC)。如图1A所示，此标记给出的AUC值为0.9。

Kaplan-Meier分析得到预测的II期和III期患者的生存曲线(图1B)。很明显，预测的II期和III期患者被分成两个截然不同的患者群组，其中一个群组预后良好(预测的II期患者)，另一个群组预后较差(预测的III期患者)。在单因素Cox比例风险回归模型中，估计的肿瘤复发的相对风险为2.7(95％CI，1.3-5.5，P＝0.007)。

FPE样本中的基因标记分析

为了证实7基因标记在临床相关样本中的分期价值，开发了RTQ-PCR检测分析法，并首先在来自II期和III期结肠肿瘤的123个FPE样本中进行此检测分析。由于RTQ-PCR检测分析法在样本类型和检测分析平台方面完全不同于微阵列，7基因的分期识别能力用t检验进行重新评估。对这些123例患者的RTQ-PCR数据集进行逻辑回归，重新构建用于评估每个患者成为III期或II期的可能性的模型。首先，评估ROC曲线(图2A)。7基因预测因子给出的AUC值为0.77。Kaplan-Meier分析和时序检验均显示在预测的III期癌症组和预测的II期癌症组之间复发的时间有显著差异(HR2.4，95％CI 1.1-5.2；P＝0.02)(图2B)。

来自4个不同临床试点的独立检验集

已经对临床上定义的II期和III期结肠癌进行7基因标记检验，并证实了此标记能够区分微阵列平台上的新鲜冷冻标本和RTQ-PCR平台上的FPE标本这两类。为了检验预定义的7基因标记是否能够针对临床上定义的II期结肠癌来区分预后良好的患者和预后较差的患者，采用了180个检验集样本来评估此7基因实用性。通过应用从123个II期和III期样本集获得的预定义的模型和算法，180例II期患者中的150例患者被归类为预测的II期癌症，30例临床II期患者被归类为预测的III期癌症。Kaplan-Meier分析和时序检验均显示在预测的III期癌症组和预测的II期癌症组之间复发的时间有显著差异(HR 2.0，95％C I 1.0-3.6；P＝0.05)，如图3所示。

引用的参考文献

20030194734

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Claims

1.一种对结肠直肠癌状态进行分期的方法，包括鉴定基因组合中的差异调控，所述基因组合基本上由Seq ID NO 1、Seq ID NO 3、SeqID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、Seq ID NO 11、和Seq IDNO 13组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中对II期和III期结肠直肠癌进行区分。

3.根据权利要求2所述的方法，其中表达模式的比较通过模式识别方法进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述模式识别方法包括使用Cox比例风险分析。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法在原发性肿瘤样本上进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中如果样本的基因表达模式为在Cox比例风险分析中指示II期的模式，那么结肠直肠癌为II期结肠直肠癌，如果不是这样，则为III期结肠直肠癌。

7.一种用于对结肠直肠癌患者进行分期的试剂盒，包括用于检测以下物质的材料：包含Seq ID NO 1、Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、SeqID NO 7、Seq ID NO 9、Seq ID NO 11和Seq ID NO 13的基因组合的分离的核酸序列、它们的互补序列、或其部分。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中唯一的基因组合为Seq ID NO1、Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、SeqID NO 11和Seq ID NO 13以及看家基因或对照基因。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，还包括用于进行微阵列分析的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，还包括介质，所述核酸序列、它们的互补序列，或其部分通过所述介质进行分析。

11.用于评估结肠直肠癌状态的制品，包括用于鉴定以下物质的材料：包含Seq ID NO 1、Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、Seq ID NO 11和Seq ID NO 13的基因组合的核酸序列、它们的互补序列、或其部分。

12.根据权利要求11所述的制品，其中唯一的基因组合为Seq ID NO1、Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq ID NO 9、SeqID NO 11和Seq ID NO 13以及看家基因或对照基因。

13.根据权利要求12所述的制品，还包括用于进行微阵列分析的试剂。

14.根据权利要求13所述的制品，还包括介质，所述核酸序列、它们的互补序列、或其部分通过所述介质进行分析。

15.根据权利要求11所述的制品，包括用于进行PCR反应的试剂，其中所述试剂包括用于检测基本上由以下组成的基因的探针和引物：

Seq ID NO 1、Seq ID NO 3、Seq ID NO 5、Seq ID NO 7、Seq IDNO 9、Seq ID NO 11和Seq ID NO 13以及看家基因或对照基因。

16.根据权利要求15所述的制品，还包括用于分析使用所述试剂盒所得的结果的指令，以进行结肠直肠癌分期。

17.根据权利要求16所述的制品，其中所述指令为计算机指令。

18.根据权利要求17所述的制品，其中所述计算机指令包含在磁性介质或光学介质中。