CN107663540A

CN107663540A - 一种与癌症相关的分子标志物及其检测方法

Info

Publication number: CN107663540A
Application number: CN201710979517.3A
Authority: CN
Inventors: 吕兆洁; 蔡志明
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: CN107663540B

Abstract

一种与癌症相关的分子标志物，该分子标志物是CAPG基因或其表达产物，所述CAPG基因在癌症中表达上调。一种检测分子标志物的方法，该分子标志物是CAPG基因的mRNA，该方法包括：取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA；对样本尿路上皮组织RNA进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA；以获得的尿路上皮组织的cDNA为模版，进行RT‑PCR反应，将样本尿路上皮组织中的CAPG基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的CAPG基因的mRNA表达量进行对比，确定样本中CAPG基因的mRNA表达量是否高于正常CAPG基因的mRNA表达量。

Description

一种与癌症相关的分子标志物及其检测方法

技术领域

本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体涉及一种与癌症相关的分子标志物及其检测方法。

背景技术

在全世界各个国家和地区，尿路上皮癌是一种最常见泌尿生殖系统恶性肿瘤。据估计，仅在2008年单年度就有386300例新发病例和150200例死亡病例。过去的研究表明：尿路上皮癌是一个具有较高异质性的疾病，它有两个不同亚型(浅表型和侵入型)，其临床表现多变、遗传背景复杂。最近，我们开展的一项研究结果表明：在膀胱移行细胞癌中，有八个染色质重塑基因(UTX，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCORI，ARIDIA和CHD6)存在频发突变。然而，目前我们对尿路上皮癌的体细胞突变情况仍缺乏系统的认识，我们对尿路上皮癌发生过程中的关键“驱动基因”也知之甚少。

为了确定这些突变基因与尿路上皮癌发生的相关性，我们采用过去研究中所描述的统计学方法分析了每个基因的体细胞突变率是否显著高于整个基因组的背景突变率。通过该分析，我们一共发现了37个显著突变基因，其中包括7个已知尿路上皮癌的基因(Tp53，HRAS，FGFR3，PIK3CA，RBI，KRAs)以及我们过去所发现的八个染色质重塑基因(UTX，ARIDIA，MLL-MLL3，CREBBP-EP300，NCORI和CHD6)。此外，我们还分析了染色质重塑相关基因和基因家族的突变情况，并在尿路上皮癌中观察到多个其他染色质重塑基因的频发突变，包括组蛋白脱甲基酶基因UTX/UTY(30％)，核染色质重塑基因ARIDIA/4A(17％)，组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因MLL/MLL3/MLLS(16％)，组蛋白乙酞转移酶基因EP300/400(15％)，SWI/SNF复合体相关基因sMARCA4/cl(7％)和组蛋白脱甲基酶基因JARIDIA/B(6％)。总的来说，在99例病例中，至少有57例(58％)患者的染色质重塑基因存在体细胞突变，这进一步表明调节染色质构象的表观遗传学改变和翻译后修饰可能是尿路上皮癌发生过程中的一种主要的驱动机制。

我们采用了全基因组测序技术分析了99例肿瘤的拷贝数变异情况，发现染色体臂或整个染色体水平的异常主要集中在以下染色体(臂)：5p，8q，13p和20p-q扩增和8p，9p-q，11p，14p，15p，17p和21p丢失。与先前的研究结果一致，就总体扩增或缺失的特征而言，不同尿路上皮癌亚型的扩增或缺失特征没有明显差异。通过拷贝数变异分析，我们发现许多公认的致癌基因异常可能与尿路上皮癌的发生相关。我们采用GSITIC算法来识别在多个样本中重复出现的小片段拷贝数变异。我们一共找到84个局部扩增区域，其中包括几个过去已经发现与尿路上皮癌有关的基因，如：TRIO，MDMZ，MYC，EZF3，CCNDI和ERBBZ。其他扩增区域所包含的基因在尿路上皮癌中尚属首次报道，包括CCNE1，CEBPA，E2F1和MUCl。我们还发现了80个重复发生的局部缺失区域，包括RBI和CREBBP(它们在尿路上皮癌中常发生截断突变)。最常见的局部缺失区域(可在50％肿瘤中检测到)为9p21，其中包含CDKN2A/B基因。

人们已经证明，在确定肿瘤特异性标志物、亚型和预测治疗结果方面，利用微阵列或第二代测序技术进行大规模的mRNA表达谱绘测的方法是有效的。这种方法使得同时对成千上万的基因乃至整个基因组扫描的系列研究成为可能，因此这种方法可以促进对肿瘤的全面理解并有利于高敏感性和高特异性的生物标志物的发现。与微阵列技术相比，基于序列的分析不产生mRNA杂交序列并且避免重复性，它可以在无限的动态范围中测量基因表达水平。

发明内容

本发明提供一种与癌症相关的分子标志物及其检测方法。

根据第一方面，一种实施例中提供一种与癌症相关的分子标志物，该分子标志物是CAPG基因或其表达产物，所述CAPG基因在癌症中表达上调。

进一步地，所述分子标志物是CAPG基因的mRNA。

进一步地，所述分子标志物是CAPG基因表达的蛋白质。

进一步地，所述癌症是尿路上皮癌。

根据第二方面，一种实施例中提供一种检测第一方面的分子标志物的方法，分子标志物是CAPG基因的mRNA，所述方法包括：

(1)取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA；

(2)对样本尿路上皮组织RNA进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA；

(3)以步骤(2)获得的尿路上皮组织的cDNA为模版，进行RT-PCR反应，将样本尿路上皮组织中的CAPG基因的mRNA表达量与正常尿路上皮组织中的CAPG基因的mRNA表达量进行对比，确定样本中CAPG基因的mRNA表达量是否高于正常CAPG基因的mRNA表达量。

进一步地，所述RT-PCR反应的引物为：

CAPG上游引物：5′-GCAGCTCTGTATAAGGTCTCTG-3′(SEQ ID NO：1)；

CAPG下游引物：5′-TTTCGCCCCTTCCAGATATAG-3′(SEQ ID NO：2)。

进一步地，所述RT-PCR的条件为：50℃2分钟、95℃2分钟，1个循环；95℃15秒、55℃30秒、72℃40秒，40个循环。

根据第三方面，一种实施例中提供一种检测第一方面的分子标志物的方法，分子标志物是CAPG基因表达的蛋白质，所述方法包括：对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，确定样本尿路上皮组织中CAPG基因表达的蛋白质的染色指数。

根据第四方面，一种实施例中提供一种检测第一方面的分子标志物的引物对，该引物对为：

CAPG上游引物：5′-GCAGCTCTGTATAAGGTCTCTG-3′(SEQ ID NO：1)；

CAPG下游引物：5′-TTTCGCCCCTTCCAGATATAG-3′(SEQ ID NO：2)。

本发明研究表明，CAPG高表达是膀胱癌预后差的指标之一；CAPG高表达可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；CAPG高表达可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。

附图说明

图1示出了(a，b)CAPG在膀胱癌组织和细胞中高表达；(c-f)CAPG高表达与膀胱癌淋巴转移相关，CAPG高表达与膀胱癌级别升高相关，膀胱癌淋巴转移与膀胱癌患者预后差相关，膀胱癌高级别与膀胱癌患者预后差相关。

图2示出了CAPG在膀胱癌中的蛋白表达情况，与正常膀胱组织相比，CAPG在膀胱癌组织中高表达。

图3示出了CAPG高表达与膀胱癌患者预后差相关；P<0.01。

图4示出了运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性结果，T0，T1，T2组的总体生存率要明显优于T3和T4组(p<0.001)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本发明相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本发明的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

本发明公开了CAPG基因在检测尿路上皮癌中的应用。通过RT-PCR反应对尿路上皮组织样本中的CAPG基因的mRNA表达量与正常尿路上皮上皮组织中的CAPG基因的mRNA表达量进行对比，当样本中CAPG基因的mRNA表达量高于正常CAPG基因的mRNA表达量时，该样本为尿路上皮癌样本；也可以通过对尿路上皮癌样本组织进行免疫组化测定，当样本尿路上皮上皮组织的染色指数超过5时，该样本尿路上皮组织中CAPG高表达，该样本为尿路上皮癌样本。本发明具有为尿路上皮癌患者的诊断提供了一种新的诊断性指标，此外CAPG还可以用来预测尿路上皮癌患者的预后生存差异。

本发明通过基于序列的分析以及分子生物学实验结果，我们揭示了在尿路上皮癌患者中CAPG的表达上调，并确定CAPG的蛋白表达可以作为尿路上皮癌患者重要的并且独立的预后评价指标。虽然病理TNM分期可以预测T1和T2或T1和T3生存差异，但是分子标记却能够预测T2和T3患者生存差异，这个不能通过TNM分期来预测。本发明的结果不仅描述了尿路上皮癌的分子特性，并且提供了尿路上皮癌的潜在的预后标志物；更重要的是，为功能与临床验证提供了一个丰富的案例。

以下通过试验例详细说明本发明的技术方案，应当理解，试验例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。以下试验例中使用的样本和试剂说明如下：

(1)样本：

1)所有患者在术前都未经放疗或化疗；2)患者都是由中山肿瘤中心进行病理诊断和临床诊断后确诊的；3)年龄大于18岁；4)肿瘤组织是术中通过电切或全切获得的；5)样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNA1ater中，并在4℃冷藏过夜，其后-80℃低温储存；6)经HE染色，肿瘤细胞超过80％的肿瘤组织；7)正常膀胱组织在病理学检查中显示正常的膀胱组织细胞且无肿瘤细胞污染。

手术切除的新鲜组织立即沉浸在RNAlater(Qiagen公司，德国)中，并4℃冷藏过夜以便溶液深入浸润组织，其后-80℃低温储存。另一方面，苏木精-伊红(HE)染色检测肿瘤细胞的百分比，筛选出肿瘤细胞超过80％的肿瘤组织作进一步的研究。正常膀胱组织的病理学检查显示正常膀胱组织无肿瘤细胞污染。根据2002美国癌症联合委员会(AJCC)分期系统，对每名患者的肿瘤进行分期或重新分期。

(2)试剂：RNAlater；DNase I(RNase-Free，美国，Promega)；Trizol试剂溶液(Invitrogen，Car1Sbad，美国)；oligo(dT)磁珠(Invitrogen，美国)；逆转录酶(M-MLV)(Fermentas，美国)；RT-PCR仪(AB 17000)来自美国应用生物系统公司。本发明中涉及到上述试剂的使用均按照试剂使用说明中的步骤进行操作。

试验例1：RT-PCR检测CAPG基因的mRNA在尿路上皮癌中表达上调

1、样本RNA提取：

A、将尿路上皮癌组织和正常邻近组织的样本放入RNAlater中进行保藏。

B、按照TRIZOL试剂(Invitrogen公司，美国)说明书的步骤对尿路上皮癌组织和正常邻近组织的样本中的总RNA进行提取，步骤如下：

a、匀浆处理(Homogenization)：按10-30mg组织加入lml TRIZOL试剂，用电动匀浆器或者一次性研磨杆充分匀浆，从匀浆中提取总RNA。

b、分层(Phase Separation)：(a)、样品加入TRIZOL试剂后，室温放置5min，使样品充分裂解；在4℃下，12,000rpm离心10分钟，取上清；(b)、每lml TRIZOL试剂加入200ul氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

c、RNA沉淀(RNA Precipitation)：在4℃下，12,000rpm离心10-15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550ul)转移到新管中。

d、按照RNase-free的DNase I使用说明书中的步骤消除步骤总RNA的DNA污染。

2、使用逆转录酶合成cDNA：

对RNase-free的PCR管中的样本尿路上皮组织RNA用oligo(dT)磁珠进行逆转录，得到样本尿路上皮组织的cDNA，具体的：

(1)离心管中配制模板RNA/引物混合液，全量6ul；

(2)70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上；

(3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部；

(4)在上述离心管中配制反转录反应液；

(5)42℃保温1小时；

(6)70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于第二链cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使用量为1ul-5ul。

3、RT-PCR检测：

(1)RT-PCR反应体系组成(共15ul)

总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中，其中各引物序列为：

CAPG上游引物：5′-GCAGCTCTGTATAAGGTCTCTG-3′(SEQ ID NO：1)；

CAPG下游引物：5′-TTTCGCCCCTTCCAGATATAG-3′(SEQ ID NO：2)；

GAPDH上游引物：5'-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'(SEQ ID NO：3)；

GAPDH下游引物：5'-GACTCCGACCTTCACCTTCC-3'(SEQ ID NO：4)。

(2)cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1：20稀释，如遇到基因表达低的样品，则适当降低稀释比例至1：10或1：5。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序。

(3)把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

(4)将八连管放入RT-PCR仪(ABI7000)中进行扩增，扩增条件为：50℃(2分钟)和95℃(2分钟)，1个循环；95℃(15秒)，55℃(30秒)和72℃(40秒)，40个循环。

计算出各样本的回归曲线，并且根据SPSS软件(version17.0SPSS Inc.)计算出相对数量mRNA的循环阈值。目标基因的相对表达水平被标准化为内参基因GAPDH的几何平均数。通过比较阈值周期(2-ΔCT)对数据进行分析，结果如图1所示。结果表明，(a，b)CAPG在膀胱癌组织和细胞中高表达；(c-f)CAPG高表达与膀胱癌淋巴转移相关，CAPG高表达与膀胱癌级别升高相关，膀胱癌淋巴转移与膀胱癌患者预后差相关，膀胱癌高级别与膀胱癌患者预后差相关。

试验例2：免疫组化检测CAPG基因的蛋白质在尿路上皮癌中表达上调

为了审查癌症相关基因的临床意义，将CAPG分为高蛋白表达组和低蛋白表达组。然后使用GraphPad Prism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性。并使用SPSS17.0进行多变量Cox回归分析。此外，利用蛋白表达(免疫组化染色指数评分)来评估两个皮尔森tail系数，以测试这三个基因的相关性。

进行免疫组化(参见WuS，WangY，SunL，ZhangZ，JiangZ，QinZ，et al.Decreasedexpression of dual-specificity phosphatases associated with poor prognosis inClear Cell renal Cell Carcinoma.BMC Caner.2011：11：413.)。简而言之，福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)切片，用二甲苯脱蜡。用3％的过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性和10％牛血清白蛋白阻止非特异性结合。标本加用第一抗体(Abcam，MA，USA)，在4℃环境中孵育过夜，用抗体稀释液代替第一抗体获得阴性对照。此后，切片在37℃下MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse IHC Kit(Maixin，中国)处理15-20分钟，3-氨基-9-乙基咔唑浸泡，Mayer苏木精复染，脱水，最后以晶体析出。对石蜡切片的免疫组化染色程度进行评估，其中：0为没有阳性细胞，<5％染色指数为1，6％-25％染色指数为2，26％-50％染色指数为3，51％-75％染色指数为4，>75％染色指数为5。根据平均光密度，对染色强度进行分级：0级，无染色；1级，弱染色(淡黄色)；2级，中度染色(黄色)；和3级，强染色(棕色)。癌细胞蛋白表达的比例和染色强度被用来计算染色指数。我们根据染色指数值来评估该基因在良性和恶性病变尿路上皮组织的表达，分值为0、1、2、3、4、5、6、8、9、10、12和15。在总体生存率异质性大小的基础上制定蛋白表达的临界值。染色指数>＝5为高表达，而染色指数<＝4为低表达。

为了检验CAPG作为预后指标的意义，运用GraphPadPrism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性的方法，对104名尿路上皮癌患者(“患者编号”、“性别”、“年龄”和“TNM”)的肿瘤组织和邻近的正常组织的福尔马林固定石蜡包埋切片进行了免疫组化分析，以检测这些蛋白质的表达情况。所有患者在手术之前没有接受化疗和放疗。

如图2所示，CAPG在肿瘤组织中显色很高，但在正常组织中显色明显。基于CAPG蛋白质的表达，我们将104名病人平分为染色指数>＝5和染色指数镇<＝4两组。

如图3所示，CAPG的高表达预示病人的预后不良(p<0.01)。

试验例3：作为预后指标分子标记物与TNM分期的对比试验

为了检验分子标志物能否作为独立的预后指标，我们将使用SPSS17.0进行COX分析，结果显示CAPG的表达情况可作为膀胱癌患者总生存数的独立的预测因素(p<0.001)。

为了检验TNM分期与生存率之间的关联性，同时还采用GraPhPadPrism6进行Kaplan-Meier分析，在分析中运用时序检验来检验表达模式与预后之间的相关性，将验证队列(330名患者组成一个队列)分为三组，分别为T0，T1，T2(n＝82)，T3(n＝86)，T4(n＝43)。如图4所示，T0，T1，T2组的总体生存率要明显优于T3和T4组(p<0.001)。尽管TNM分期可独立预测生存率，但是它不能预测T3和T4亚组之间患者生存率的差异。对于预后的预测，如图4所示，CAPG可以区分T3和T4组中高风险亚组(p<0.001)。CAPG作为分子标志物可以更好的预后。综上所述，CAPG所表达的蛋白质比TNM分期有着更好的预测效果。

目前研究发现一些与膀胱癌进程相关的分子标志物，但是多变量分析证明这些已知标志物并不能作为独立的预后指标。虽然肿瘤的分期以及肿瘤的病理学分级仍被认为是最可信的临床结果预测指标。然而，其它一些肿瘤研究却表明：用分子标志物判断生存预后要比病理学分级更好。为了证明在预后生存方面分子标志物优于病理学分级，在本发明中，我们并不是简单的选择性的测试几个基因序列，而是以全基因组mRNA表达谱为基础尽可能找出与预后有关的所有基因。此外，除了基因的表达量，基因突变作为肿瘤的诊断和预后判断更具有可操作性以及可靠性。基于本发明庞大数据量和详实的临床资料，通过特定的统计学方法寻找到的高频率热点突变，同时具有显著生物学功能，因此概括起来，本发明具有的优点如下：CAPG高表达是膀胱癌预后差的指标之一；CAPG高表达可以作为膀胱癌诊断的一个辅助指标；CAPG高表达可以作为治疗膀胱癌的一个新的作用靶点。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 一种与癌症相关的分子标志物及其检测方法

<130> 17I25014

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcagctctgt ataaggtctc tg 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttcgcccct tccagatata g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctctctgct cctcctgttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactccgacc ttcaccttcc 20

Claims

1.一种与癌症相关的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物是CAPG基因或其表达产物，所述CAPG基因在癌症中表达上调。

2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物是CAPG基因的mRNA。

3.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物是CAPG基因表达的蛋白质。

4.根据权利要求1-3任一项所述的分子标志物，其特征在于，所述癌症是尿路上皮癌。

5.一种检测权利要求1-4中任一项所述的分子标志物的方法，其特征在于，所述分子标志物是CAPG基因的mRNA，所述方法包括：

(1)取样本尿路上皮组织，提取尿路上皮组织的RNA；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR反应的引物为：

CAPG上游引物：5′-GCAGCTCTGTATAAGGTCTCTG-3′（SEQ ID NO：1）；

CAPG下游引物：5′-TTTCGCCCCTTCCAGATATAG-3′（SEQ ID NO：2）。

7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述RT-PCR的条件为：50℃ 2分钟、95℃2分钟，1个循环；95℃ 15秒、55 ℃30秒、72℃ 40秒，40个循环。

8.一种检测权利要求1-4中任一项所述的分子标志物的方法，其特征在于，所述分子标志物是CAPG基因表达的蛋白质，所述方法包括：对样本尿路上皮组织进行免疫组化测定，确定样本尿路上皮组织中CAPG基因表达的蛋白质的染色指数。

9.一种检测权利要求1-4中任一项所述的分子标志物的引物对，其特征在于，所述引物对为：

CAPG上游引物：5′-GCAGCTCTGTATAAGGTCTCTG-3′（SEQ ID NO：1）；

CAPG下游引物：5′-TTTCGCCCCTTCCAGATATAG-3′（SEQ ID NO：2）。