JP2007049991A - 乳癌の骨への再発の予測 - Google Patents
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Abstract
【課題】リンパ節陰性患者における遠隔再発の予測に対して、乳癌予後判定手段が、最近、記述されているが、目下、骨への再発リスクに限定した患者の識別に利用できる診断ツールは、ほとんどない。患者の骨への癌再発リスクを具体的に識別し、当該患者が適切な治療を受けるのを確実なものとすることが求められている。
【解決手段】乳癌の骨への再発を予測する方法を、遺伝子群の発現を分析することによって実施する。キットを含有するマイクロアレーなどの様々な媒体での遺伝子発現プロファイルが含まれる。
【選択図】なし
【解決手段】乳癌の骨への再発を予測する方法を、遺伝子群の発現を分析することによって実施する。キットを含有するマイクロアレーなどの様々な媒体での遺伝子発現プロファイルが含まれる。
【選択図】なし
Description
〔背景〕
本発明は、骨への再発に対する乳癌患者の予後に関するもので、患者の生体サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づく。
本発明は、骨への再発に対する乳癌患者の予後に関するもので、患者の生体サンプルの遺伝子発現プロファイルに基づく。
乳癌における最も多い遠隔再発部位は、骨である。赤色骨髄中血流、腫瘍細胞中の接着分子、および、骨マトリックス中固定増殖因子、例えばトランスフォーミング(形質転換)増殖因子-β、骨形成タンパク、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子および線維芽細胞増殖因子、を含めて、骨再発の促進に多くの因子が関与している。しかし、骨と乳癌由来癌細胞との、相互作用の促進に関する遺伝子主体の関係は、概して不明であった。
リンパ節陰性患者における遠隔再発の予測に対して、乳癌予後判定手段が、最近、記述されている。ワングら(Wang et al)による, PCT/US2005/005711, 2005年2月18日出願。乳房腫瘍を各種の臨床関連サブタイプに分類するに当って、遺伝子発現パターンも使用されている。ペルーら(Perou et al.) (2000年)；セアリーら(Sorlie et al.) (2001年)；セアリーら(Sorlie et al.) (2003年)；グルーヴバーガーら(Gruvberger et al.) (2001年)；ヴァント・ヴィアら(van't Veer et al. )(2002年)；ヴァン・デ・ヴィジュヴァーら(van de Vijver et al.) (2002年)；アールら(Ahr et al.) (2002年)；フアンら(Huang et al.) (2003年)；ソティリウら(Sotiriou et al.) (2003年)；ウールフルら(Woelfle et al.) (2003年)；マら(Ma et al.) (2003年)；ラマスワミら(Ramaswamy et al.) (2003年)；チャンら(Chang et al.) (2003年)；ソティリウら(Sotiriou et al.) (2003年)；およびヘデンフォークら(Hedenfalk et al.)(2001年)。しかし、目下、骨への再発リスクに限定した患者の識別に利用できる診断ツールは、ほとんどない。患者の骨への癌再発リスクを具体的に識別し、当該患者が適切な治療を受けるのを確実なものとすることが求められている。
〔発明の概要〕
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカー(Markers)を介して遺伝子発現レベルを測定することによって乳癌の病態を評価する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが骨転移に関する乳癌の病態を示す方法を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカー(Markers)を介して遺伝子発現レベルを測定することによって乳癌の病態を評価する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが骨転移に関する乳癌の病態を示す方法を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーを介してサンプル中の遺伝子発現レベルを測定することによって乳癌の病期を分類する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが骨転移に関する乳癌の病期を示す方法を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーを介してサンプル中の遺伝子発現レベルを測定することによって乳癌患者の治療をモニターする方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベル(アルゴリズムで示すとおり)が十分に骨転移リスクを示すので、医師が当該転移の防止に推奨される治療法の程度およびタイプを決定できる方法を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーを介してサンプル中の遺伝子発現レベルを測定することによって乳癌患者を治療する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが高骨転移リスクを示し、当該患者がハイリスク患者であれば、アジュバント療法で当該患者を治療する方法を包含するものである。
本発明は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを入手し、単変量Cox回帰分析(univariate Cox's regression analysis)を適用して選別遺伝子を入手し、標準Cox係数によって、重み付け発現レベル(weighted expression levels)を選択遺伝子に適用し、骨再発確率スコアとして応用できる予測モデルを入手することによって、乳癌患者の予後を可能にする骨再発確率スコアを作成する方法を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、サンプルの遺伝子発現を測定し、骨再発確率スコアを適用し、得られた結果を使用して、報告書、および、それによって作成された患者報告書を作成することによって、乳癌患者の予後患者報告書を作成する方法を包含するものである。
本発明は、マーカーを含有する組成物を包含するものである。
本発明は、乳癌患者から得た生体サンプルを使用して乳癌の予後を決定するアッセイを実施するためのキットを包含するものである。当該キットは、マーカー検出用材料を含有する。好ましくは、当該キットは、その使用説明書を含む。
本発明は、マーカーを含有する、乳癌の病態の評価用品を包含するものである。
本発明は、マーカーを含有する診断/予後ポートフォリオであって、その組合せが十分に生体サンプルにおける乳癌の病態または骨への再発リスクを特徴付けることができるポートフォリオを包含するものである。
本発明の方法は、他の乳房予後判定手段と同時に使用できるのが有利である。これは、最初に、いずれかの再発の予後を決定した後、本出願に示すPAM法を適用するように反射的に実施できる。別法として、これらの方法は、同時に、または、ほぼ同時に実施し、いずれかの部位での再発、さらに具体的には骨への再発の尤度(likelihood of relapse)に関する情報を医師および/または患者に提供することができる。
〔発明の詳細な説明〕
乳癌の病態の評価法を包含する本発明は、患者が乳癌の骨への高再発リスクを有するか否かを決定する。本出願全体の予後(prognosis)および予測(prediction)は、骨への発現を伴う乳癌の再発に関する予測を指すものである。これらの方法は、乳癌患者からの生体サンプル入手、および、サンプル中の特定遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが骨転移に関する乳癌の病態を示す方法を含む。
乳癌の病態の評価法を包含する本発明は、患者が乳癌の骨への高再発リスクを有するか否かを決定する。本出願全体の予後(prognosis)および予測(prediction)は、骨への発現を伴う乳癌の再発に関する予測を指すものである。これらの方法は、乳癌患者からの生体サンプル入手、および、サンプル中の特定遺伝子の発現レベルを測定する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが骨転移に関する乳癌の病態を示す方法を含む。
本明細書に記述され、請求の範囲に記載される本発明の方法、組成物、用品およびキットは、1種類以上のマーカーを含む。「マーカー」は、本明細書全体で、
a)遺伝子および遺伝子発現産物、例えばRNA、mRNAおよび対応するcDNA、さらに、ペプチド、タンパク、前記のものの断片および補体と、
b)プローブ、抗体、リガンド、ハプテンおよび標識などの組成物であって、a)との物理的または化学的相互作用によって、遺伝子または遺伝子発現産物の存在を示し、
遺伝子、遺伝子発現産物または組成物が、
i) SEQ ID NO 112、
ii) SEQ ID NO 112と、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116から成る群のメンバーとの組合せ、
iii) SEQ ID NO 112 と、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、および、SEQ ID NO 116の全部との組合せ、
iv) SEQ ID NO 112〜SEQ ID NO 116 の1個以上およびSEQ ID NO 117〜198の1個以上、または、
v) SEQ ID NO 112〜SEQ ID NO 198の全部、
と一致する、組成物と、
を示すに当って使用される。
a)遺伝子および遺伝子発現産物、例えばRNA、mRNAおよび対応するcDNA、さらに、ペプチド、タンパク、前記のものの断片および補体と、
b)プローブ、抗体、リガンド、ハプテンおよび標識などの組成物であって、a)との物理的または化学的相互作用によって、遺伝子または遺伝子発現産物の存在を示し、
遺伝子、遺伝子発現産物または組成物が、
i) SEQ ID NO 112、
ii) SEQ ID NO 112と、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116から成る群のメンバーとの組合せ、
iii) SEQ ID NO 112 と、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、および、SEQ ID NO 116の全部との組合せ、
iv) SEQ ID NO 112〜SEQ ID NO 116 の1個以上およびSEQ ID NO 117〜198の1個以上、または、
v) SEQ ID NO 112〜SEQ ID NO 198の全部、
と一致する、組成物と、
を示すに当って使用される。
遺伝子は、SEQ ID NOで表される配列に、その配列を含有する場合、該当する。遺伝子セグメントまたは断片は、遺伝子の配列であるとしてそれを区別するのに十分な参照配列またはその補体の一部を含有する場合、前記遺伝子配列に該当する。遺伝子発現産物は、そのRNA、mRNAまたはcDNAが、前記配列を有する組成物(例、プローブ)にハイブリダイズし、あるいは、ペプチドまたはタンパクの場合、前記mRNAによってコード化される場合、前記配列に該当する。遺伝子発現産物のセグメントまたは断片は、当該遺伝子の配列であるとしてそれを区別するのに十分な参照遺伝子発現産物またはその補体の一部を含有する場合、前記遺伝子または遺伝子発現産物の配列に該当する。
iiおよびiiiに対応するマーカーが好ましい。ivおよびvに対応するマーカーが最も好ましい。
組織サンプル中の特定の核酸配列(例、SPN含有遺伝子)の単なる有無が、診断または予後に価値があるのはまれでしかないと判明しているが、各種のタンパク、ペプチドまたはmRNAの発現に関する情報は、重要であると次第に見なされている。ゲノム内でそれ自体がタンパク、ペプチドまたはmRNAを発現する能力を有する核酸配列が存在する(このような配列を「遺伝子」と称する)というだけでは、特定の細胞にタンパク、ペプチドまたはmRNAが発現されるか否かを決定しない。タンパク、ペプチドまたはmRNAを発現できる特定の遺伝子が発現するか否か、また、仮にそうだとしても、当該発現がどの程度起こるかは、様々な複雑な要因によって決定される。しかし、どの遺伝子が活性であるか、不活性であるかの相対的指標は、遺伝子発現プロファイル中に認められる。本明細書では、乳癌患者が骨への再発をきたす可能性があるか否かを識別し、報告する上で、遺伝子発現のアッセイが有用である、と報告されている。乳癌患者が最も有益な治療を受けられることの保証を含めた多くの理由で、これは重要である。
サンプル調製は、本発明の方法を実施し、キットおよび用品を使用する重要な態様である。サンプル調製には、患者サンプルの収集が必要である。本発明の方法で使用される患者サンプルは、乳房サンプル中の原発腫瘍から得られる上皮細胞など、癌細胞を含有すると疑われているサンプルである。サンプルは、バルク組織調製およびレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(laser capture microdissection)を含む当技術分野で周知のいずれの方法によっても調製される、原発腫瘍組織、組織または体液の吸引物、乳管液を含むがそれらに制約されない、癌細胞の存在が疑われるどのサンプルであることもできる。バルク組織調製物は、生検または手術標本から入手できる。体液は、細針吸引、洗浄および医学技術上周知の抜取り法で容易に入手できる。最も好ましくは、サンプルは、原発腫瘍から入手される。切除縁から得られるサンプルも好ましい。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)技術は、被験細胞を選別し、細胞型不均質性が引き起こす変動性を最小化する1つの方法である。サンプルは、末梢血から抜取られた循環上皮細胞を含むこともできる。これらは、多数の方法によって入手できるが、最も好ましい方法は、本明細書にその全体が組み入れられた米国特許第6,136,182号に記述されている磁気分離技術である。いったん対象細胞を含有するサンプルが得られると、遺伝子材料が、本発明の方法で、またはキットまたは用品によって抜取られ、使用される。好ましくは、RNAが、抽出、増幅され、適切なポートフォリオの遺伝子用に、好ましくはマイクロアレーによって遺伝子発現プロファイルが得られる。
診断時にすべてリンパ節陰性であり、すべて再発した原発乳房腫瘍107例の遺伝子発現マイクロアレーデータ(アフィメトリックスU133Aチップ(Affymetrix U133A Chips))を使用すると、遺伝子パネルは、骨に再発した患者と身体の他の部位に再発した患者の間で有意に差次的に発現されることが判明した。このパネルは、本出願に記述されているSAM法の使用に到った。そのパネル、TFF-1で最も差次的に発現される遺伝子は、独立したコホートにおいて、定量RT-PCRによって確認された(n=122、p=0.0015)。さらに、総じて骨再発を正確に予測するクラシファイヤー(classifier)が開発された。このクラシファイヤー/パネルを、本出願では、PAMパネルと呼ぶ。このクラシファイヤーは、ビスフォスフォネート療法を含むが、それに制約されない骨転移の治療に特に適したアジュバント療法を推奨する手段として使用できる。内分泌療法、化学療法、放射線療法または他の治療法に加えて、これらの治療法を推奨できる。
本発明の乳癌病期分類法は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーによってサンプル中の遺伝子発現レベルを測定する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルを、乳癌病期を表すインプットとして使用する方法に関する。情報は、アメリカ癌合同委員会(www.Cancerstaging.org掲載)のTNMシステム(TNM system American Joint Committee on Cancer www.cancerstaging.org)を含む当技術分野で周知のいずれの分類法で、また、同様の遺伝子発現プロファイルを有する患者に該当する病期との比較に用いられる。
乳癌患者の治療法を決定する方法は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーによって遺伝子サンプル中の遺伝子発現レベルを測定する方法であって、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが、前記再発の防止に推奨される治療の程度およびタイプを医師が決定できるほど十分に骨転移リスクを示す方法に関する。
乳癌患者を治療する方法は、乳癌患者から生体サンプルを入手し、マーカーによってサンプル中の遺伝子発現レベルを測定し、所定カットオフレベル以上または以下の遺伝子発現レベルが、高い骨への再発リスクを示し、当該患者が高リスク患者である場合、当該患者をアジュバント療法で治療することに関する。
上記の方法は、さらに、サンプル中に構成的に発現される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルの測定を含むことができる。
上記の方法は、好ましくは、少なくとも40％の特異性および少なくとも80％の感度を有する。
上記方法は、骨への再発をきたした乳癌患者を示す発現パターンと遺伝子の発現パターンを比較する場合に使用できる。比較は、パターン認識法で実施される発現パターンの比較を含めて、技術上周知のいずれの方法によることもできる。パターン認識法は、PAM分析、および、別法として、Coxの比例ハザード分析を含めた当技術分野で周知のいずれの方法であることもできる。
好ましくは、本発明で使用される遺伝子マーカーの上方および下方制御レベルは、ハイブリダイズマイクロアレープローブ(hybridized microarray probes)の強度測定値の発現差(fold changes)に基づいて区別される。いずれにしても、本発明の方法、キット、ポートフォリオおよびそれらにおいてで実施される測定および分析は、骨再発のない患者のサンプルと比較したサンプル中の少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現を表す所定のカットオフレベルを用いる。好ましくは、当該所定カットオフレベルは、骨再発のない患者と比較して骨再発を有する患者のサンプルの過剰発現量が少なくとも統計的に有意なp-値を有する。さらに好ましくは、当該p-値は、0.05未満である。このように区別するには、2.0倍の差の方が好ましい。即ち、非再発患者に比較して再発患者のサンプル中で遺伝子が差次的に発現されたと言えるまでは、再発患者のサンプルは、非再発患者のサンプルよりも少なくとも2倍高い、もしくは、2倍低い強度を生じることが認められる。遺伝子のp-値が臨床的観点から受容可能である(即ち、骨への再発と密接に関連する)という条件付きで、倍数の差が大きなほど、診断ツールまたは予後判定ツールとしてその遺伝子の使用は好ましい。本発明の遺伝子発現プロファイル用に選択される遺伝子は、臨床検査器具を使ってバックグラウンドを上回る量で非再発または非調節遺伝子のシグナルから区別できるシグナルを生じる発現レベルを有する。
上記の方法は、遺伝子発現をマイクロアレーまたは遺伝子チップで測定する場合に使用できる。ここでの使用に適した遺伝子チップおよびマイクロアレーも、本発明に含まれる。当該マイクロアレーは、cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーであることができ、さらに、1つ以上の内部対照試薬(internal control reagents)を含有できる。
上記方法は、同様に、遺伝子発現を核酸増幅および検出法で決定する場合に使用できる。好ましくは、当該方法は、サンプルから抽出されたRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。PCRは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)であることができる。RT-PCRは、さらに、1つ以上の内部対照試薬を含有できる。
上記の方法は、遺伝子発現を、当該遺伝子によってコード化されたタンパクを測定または検出することによって検出する場合に使用できる。当該タンパクに特異的な抗体による検出および当該遺伝子の特性の測定を含めて、当技術分野で周知のいずれかの方法を使用できる。適切な特性は、DNA増幅、メチル化、突然変異および対立遺伝子変異を含むが、それらに制約されない。
本発明の方法は、骨への再発の予測を可能にする骨再発確率スコアの生成を包含する。この方法は、統計的に有意な数の患者の生体サンプルから遺伝子発現データを入手し、下述の通りにPAM分析を適用することによって実施できる。本発明の別の実施態様では、標準化Cox回帰係数を使ったCox回帰式の適用によって、骨再発確率スコアを得ることができる。
本発明の、乳癌予後患者報告書(骨への再発について)の作成法は、患者から生体サンプルを入手し、サンプルの遺伝子発現量を測定し、結果に骨再発確率スコアを適用し、得られた結果を使用して報告書を作成することによって実施される。当該報告書は、患者群に比較した患者転帰(patient outcome)および/またはリスク確率の評価を含むことができる。
本発明の組成物は、少なくとも1つのマーカーのプローブセットを含む。本組成物は、さらに、マイクロアレー、増幅またはプローブ主体分析を実施するための試薬、および、核酸配列、その補体またはそれらの一部をアッセイする媒体を含有することができる。
生体サンプルにおいて乳癌の予後を決定するアッセイ実施用の本発明のキットは、マーカー検出材料を含む。当該キットは、さらに、マイクロアレー、増幅またはプローブ主体分析を実施するための試薬、および、核酸配列、その補体またはそれらの一部をアッセイする媒体を含有することができる。
本発明の乳癌の病態を評価する用品は、マーカー検出用材料を含む。当該用品は、さらに、マイクロアレー、増幅またはプローブ主体分析を実施するための試薬、および、前記核酸配列、その補体またはそれらの一部をアッセイする媒体を含有することができる。
本発明の方法、用品およびキットに有用なマイクロアレーは、マーカーを含有することができ、その場合、併用が、乳癌の病態または骨への再発リスクを特徴付けるのに申し分ない。
好ましいキット、用品およびマイクロアレーは、プローブを固定または結合し、ターゲットマーカーが結合または連結するので、当該マーカーを検出できる基質を含む。これらの基質は、本明細書に記述されるアッセイ実施のみに適する、あるいは、不連続な数の関連アッセイ(少数のパネルを含有する)の実施に適するのが最も好ましい。
本発明は、マーカーの診断/予後ポートフォリオを包含し、その場合、併用が、サンプル中で乳癌の病態または骨への再発リスクを特徴付けるのに申し分ない。
好ましい遺伝子発現プロファイル確立法は、タンパクまたはペプチドを解読できる遺伝子によって産生されるRNA量の決定を含む。これは、逆転写酵素PCR(RT-PCR)、競合RT-PCR、リアルタイムRT-PCR、ディファレンシャルディスプレー(differential display)RT-PCR、ノーザンブロット分析および他の関連検査法によって達成される。これらの技術を個別のPCR反応を使用して実施することは可能であるが、mRNAから産生される相補的DNA(cDNA)もしくは相補的RNA(cRNA)を増幅し、マイクロアレーによってそれを分析するのが最も良い。多数の種々のアレーの立体配置およびそれらの製造法は、当業者に周知であり、以下の米国特許に記述されている：第5,445,934号；第5,532,128号；第5,556,752号；第5,242,974号；第5,384,261号；第5,405,783号；第5,412,087号；第5,424,186号；第5,429,807号；第5,436,327号；第5,472,672号；第5,527,681号；第5,529,756号；第5,545,531号；第5,554,501号；第5,561,071号；第5,571,639号；第5,593,839号；第5,599,695号；第5,624,711号；第5,658,734号；および第5,700,637号。
マイクロアレー技術は、それによって同時に数千の遺伝子の定常状態mRNAレベルの測定を可能にし、無秩序な細胞増殖の開始、停止または調節などの作用を識別する強力なツールである。2種類のマイクロアレー技術が、目下、汎用されている。第一の技術はDNAアレーで、第二の技術は、オリゴヌクレオチドアレーである。これらのチップの構成は異なるが、基本的に、全ての下流データ分析およびアウトプットは同一である。これらの分析の成果は、典型的には、マイクロアレー上の既知の位置で核酸配列にハイブリダイズするサンプルからのcDNAを検出するのに使用される標識プローブから受けるシグナル強度の測定である。典型的には、シグナル強度は、サンプルの細胞に発現されるcDNAおよび、それによるmRNAの量に比例する。当該技術の大半は、利用可能であり、有用である。好ましい遺伝子発現の決定法は、米国特許第6,271,002号；第6,218,122号；第6,218,114号；および第6,004,755号に記述されている。
発現レベルの分析は、シグナル強度を比較し、これらの測定値を統計学的アルゴリズムに供することによって実施する。対照サンプル(control sample)中の発現強度と比較した被験サンプル(test sample)中の遺伝子発現強度の比の行列を得るのがこれらの方法の1つである。例えば、被験組織からの遺伝子発現強度を、対象病態の患者の同種の組織(例、骨再発患者の腫瘍組織対非再発患者の腫瘍組織)から得られる発現強度と比較できる。これらの発現強度の比は、被験サンプルと対照サンプルの間の遺伝子発現の発現差(fold-change)を表す。
遺伝子発現プロファイルも、多数の方法によって表示できる。最も一般的な方法は、生の蛍光強度または比の行列を、グラフィックデンドログラム(graphical dendogram)に配列することで、行が被験サンプルを、列が遺伝子を示す。データが配列されるので、類似の発現プロファイルを有する遺伝子は、互いに近接する。各遺伝子の発現量比は、色で可視化される。例えば、1未満の比(下方制御(downregulation)を示す)は、スペクトルの青色部分で表すことができ、一方、1以上の比(上方制御(upregulation)を示す)は、スペクトルの赤色部分で表すことができる。当該データを表示するには、アジレント・テクノロジーズ(Agilent Technologies)の遺伝子スプリング(GeneSpring)、ならびに、パルテック(Partek)(登録商標)のパルテック・ディスカバー(Partek Discover)(登録商標)およびパルテック・インファー(Partek Infer)(登録商標)ソフトウェアを含めた市販のコンピューターソフトウェアプログラムが利用できる。
本発明の方法で使用する調節遺伝子(modulated genes)は、実施例に記述されている。乳癌の骨再発患者では、非再発患者と比較して、差次的に発現された遺伝子が、上方または下方制御される。上方制御および下方制御は、相対的用語で、一部のベースラインに比較して、遺伝子発現量に検出可能な差(発現量の測定に使用される装置でのノイズの寄与を上回る)が認められることを意味する。この場合、ベースラインは、非再発患者の測定遺伝子発現量である。次に、同じ測定法を使用して、罹病細胞(再発患者)中の対象遺伝子を、(非骨再発患者の)ベースラインレベルと比較して上方または下方制御する。対象病態のパターンと一致する遺伝子発現パターンを有する患者(骨再発尤度)は、当該病態を有すると評価され、適宜治療を受ける。治療モニタリングで、遺伝子発現を経時的に比較することによって一定コースの治療の効果について臨床判定が下され、遺伝子発現プロファイルが変化したか、あるいは、非再発患者の組織により近いパターンに変化しつつあるかが決定される。
非調節遺伝子およびノイズから調節遺伝子を確実に区別し、遺伝子プロファイルを確立するには、統計値を使用できる。多様なサンプル群間で最も有意に差がある遺伝子を見出す当該統計検定の1つは、スチューデントのT-検定に基づく。あるクラスの遺伝子への特定遺伝子の参入に関してp-値が得られる。p-値が低いほど、遺伝子が各種群間の差を示しているという証拠がさらに有力になる。マイクロアレーは、一度に1個以上の遺伝子を測定するので、一度に数万の統計検定を実施でき、それによって、偶然だけで小p-値を確認する可能性がない。シダック修正(Sidak correction)の使用、ならびに、無作為化(randomization)/並べ替え検定(permutation test)を調整できる。T-検定で0.05未満のp-値は、遺伝子が有意差を示す証拠である。さらに有力な証拠は、シダック修正を計算に入れた後の0.05未満のp-値である。各群の大部分のサンプルについて、無作為/並べ替え検定後の0.05未満のp-値は、有意差の最も有力な証拠である。
非調節遺伝子またはノイズよりも強いシグナルを発する遺伝子の選択に使用できる別のパラメーターは、絶対シグナル差の測定値の使用である。好ましくは、調節遺伝子発現によって生じたシグナルは、非調節遺伝子または非再発患者の遺伝子の場合とは少なくとも20％差がある(絶対値換算)。当該遺伝子は、非調節遺伝子の場合よりも少なくとも30％差がある発現パターンを生じるのがはるかに好ましい。
群分けされ、それによって、その群の遺伝子セットについて得られる情報が、診断、予後、または、治療の選択などの臨床関連判定を行う確かな基礎となる遺伝子は、本発明のポートフォリオが構築する。この場合、当該ポートフォリオに裏付けられた判定は、乳癌およびその骨への再発の可能性を含む。
好ましくは、ポートフォリオを構築し、その結果、当該ポートフォリオ中の組み合わせ遺伝子が、個々の遺伝子または遺伝子の無作為に選択された組合せに比較して、感度および特異性の改善を示す。本発明の文脈上、骨再発のない患者に比較して、骨再発した患者の状態では、遺伝子の発現によって提示される発現差にポートフォリオの感度を反映することができる。特異性は、遺伝子発現のシグナリングの対象病態との相関の統計学的測定値に反映させることができる。例えば、当該測定値として標準偏差を使用できる。ポートフォリオに加えるためにある遺伝子群を検討するに当って、発現測定値の小標準偏差は、高めの特異性と相関する。相関係数などの他の変動測定値も使用できる。
本発明の遺伝子ポートフォリオは、SAM分析によって決定した。遺伝子発現パターンは、PAM分析を使用して分析する。SAM(マイクロアレーの有意性分析(Significance Analysis of Microarrays))は、発現パターンがサンプルセットの具体的特性と有意に関連する遺伝子を識別する統計手法である。この方法は、スタンフォード大学(Stanford University)で開発されたソフトウェアに具体化されており、一般に利用可能である。SAMは、遺伝子特異的T-検定セットを取り入れることによって、統計的に有意な発現の変化で遺伝子を識別する。当該方法は、2001年3月19日に出願されたトゥシェ(Tusher)らへの米国特許出願第20020019704号に記述されており、本明細書にその全体が組み入れられている。「イオン化放射線反応に適用されるマイクロアレーの有意性分析(Significance Analysis of Microarrays Applied to the Ionizing Radiation Response)」; トゥシェ(Tusher)、ティブシラニ(Tibshirani)およびチュウ(Chu), 5116-5121ページ, 米国科学アカデミー紀要(PNAS), 2001年4月24日発刊, 第98巻9号(April 24, 2001_vol.98_no.9)にも記述されている。
SAM分析において、アッセイされた各遺伝子は、その遺伝子の反復測定値の標準偏差に比較した遺伝子発現の変化に基づいてスコアを指定される。閾値以上のスコアの遺伝子は、有意の可能性ありと考えられる。偶然識別される当該遺伝子のパーセンテージは、過誤発見率(false discovery rate(FDR))である。FDRを推定するには、測定値の並べ替えを分析して、ナンセンス遺伝子(nonsense genes)を識別する。より小さなまたはより大きな遺伝子セットを識別するために閾値を調整し、セット毎にFDRを算出する。
遺伝子発現で「相対差」またはd(i)と呼ぶ数値は、その遺伝子のデータにおける標準偏差に対する遺伝子発現変化の比に基づく。「遺伝子特異的散乱(gene-specific scatter)」s(i)は、反復発現測定値の標準偏差である。変動係数d(i)は、s(i)の関数としてコンピューター処理する。遺伝子発現の有意な変化を見出すには、そのd(i)の大きさによって遺伝子を順位付けし、それによって、d(1)が最大相対差、d(2)が2番目の最大相対差、d(i)がi番目の最大相対差となる。各並べ替えについては、相対差dp(i)も算出し、その遺伝子を順位付けし、やはり、それによって、並べ替えpに対してdp(i)が最大相対差となる。推定相対差dE(i)は、バランスのとれた並べ替え(balanced permutation)の平均値と定義する。
予想される有意な発現変化を識別するには、実測相対差d(i)対推定相対差dE(i)の散乱図を使用できる。大半の遺伝子に関して、d(i)はdE(i)にほぼ等しいが、一部の遺伝子は、閾値を上回る距離でd(i)=dE(i)直線から変位した点に表される。SAMで作成された擬似的有意な(falsely significant)遺伝子数を決定する場合、水平カットオフ値(horizontal cutoff)は、有意に誘導されたとされる遺伝子間での最小d(i)、また、有意に抑制されたとされる遺伝子間での最小の負の数値d(i)と定める。各並べ替えに対応する擬似的有意な遺伝子数は、誘導および抑制遺伝子の水平カットオフ値を超える遺伝子数をカウントすることによって、コンピューター処理する。擬似的有意な遺伝子の推定数は、全並び替えから有意とされる遺伝子数の平均である。この閾値設定法は、誘導および抑制遺伝子に非対称なカットオフ値を提供する。別法は、標準t-検定で、これは、誘導遺伝子でc以上のd(i)、抑制遺伝子でc未満のd(i)によって対称な水平カットオフ値(symmetric horizontal cutoff)を与える。しかし、非対称のカットオフ値が好ましい。それは、誘導遺伝子および抑制遺伝子に対するd(i)が、当該非対称カットオフ値に一部の生物学的実験で異なる挙動を示す可能性があるからである。
PAM(マイクロアレー予測分析(Predictive Analysis of Microarrays))分析は、最短重心法(nearest centroid method)の変法である。この方法は、スタンフォード大学研究所(Stanford University Labs)で開発され、統計パッケージR(Statistical Package R)を使用して実施されるのが典型的である。当該方法は、その発現が各診断クラスを特徴付け、クロスバリデーションによって予測誤差を推定する有意な遺伝子のリストを提供する。当該方法は、最短収縮重心法(nearest shrunken centroid methodology)である。当該方法は、「遺伝子発現の最短収縮重心法による複数の癌タイプの診断(Diagnosis of Multiple Cancer Types by Shrunken Centroids of Gene Expression)」; ナラシマンおよびチュウ(Narashiman and Chu), 米国科学アカデミー紀要(PNAS), 2002年, 第99巻; 6567-6572ページ(2002 99:6567-6572)(2002年5月14日発刊(May 14, 2002))に記述されている。
この方法では、標準化重心をクラス毎にコンピューター処理する。これは、遺伝子毎に、その遺伝子のクラス内標準偏差で除した平均遺伝子発現量である。最短重心(nearest centroid)分類は、新規サンプルの遺伝子発現プロファイルを得て、それをこれらのクラス重心それぞれと比較する。重心が平方距離にして最短であるクラスは、その新規サンプルに対して予測されるクラスである。最短収縮重心(Nearest shrunken centroid)分類は、閾値と呼ばれる量によって、各々のクラス重心を全クラスの全体的重心の方向に収縮させる。この収縮は、閾値による重心のゼロへの移動、ゼロにヒットした場合、それをゼロに等しいと定めることから成る。例えば、閾値が2.0である場合、3.2の重心は1.2に収縮され、-3.4の重心は-1.4に収縮され、1.2の重心はゼロに収縮されることになる。重心の収縮後、新規サンプルが、通常の最短重心規則によって分類されるが、収縮クラス重心を使用する。この収縮は、ノイズ遺伝子の影響を減じることによってクラシファイヤーをさらに正確にすることができ、自動的な遺伝子選択を提供する。特に、遺伝子が全クラスでゼロまで収縮される場合、それは、予測規則から除外される。別法として、１つのクラスを除く全クラスについてゼロに設定することができ、その遺伝子の高いまたは低い発現量がそのクラスを特徴付ける、と分かる。ユーザーは、閾値用に使用する数値を決定する。典型的には、多数の異なる選択を検討する。この選択の中で誘導するには、PAMは、ある範囲の閾値についてK-倍クロスバリデーションを実施する。サンプルを、無作為にK個のほぼ等しいサイズのパーツに分割する。順にパーツ毎に、他のK-1パーツ上にクラシファイヤーを構築し、その後、残りのパーツについて検定する。これを、ある範囲の閾値について実施し、閾値毎にクロスバリデートされた誤分類過誤率を報告する。典型的には、ユーザーは、最小クロスバリデート誤分類過誤率を生じる閾値を選択する。
別法として、株式ポートフォリオの確立に汎用される平均分散アルゴリズムなどの最適化アルゴリズムの使用によって、遺伝子発現ポートフォリオを確立できる。この方法は、米国特許公報第20030194734号に詳細に記述されている。基本的に、当該方法は、利益の変動性を最小化しながら、それを使用するために受け取る利益(例、生じるシグナル)を最適化するインプットセット(金融利用における株式、ここでは強度で測定した場合の発現量)の確立を必要とする。多くの市販ソフトウェアプログラムは、このような演算の実施に利用できる。本明細書全体で「ワグナーソフトウェア(Wagner Software)」と称する「ワグナーアソシエーツ平均分散最適化アプリケーション(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application)」が好ましい。このソフトウェアは、「ワグナーアソシエーツ平均分散最適化ライブラリ(Wagner Associates Mean-Variance Optimization Library)」からの関数を使用し、有効フロンティアを決定するが、マーコウィッツ理論(Markowitz sense)にある最適なポートフォリオを決定する。この種のソフトウェアを使用する場合、本来の金融分析の目的で当該ソフトウェアを使用する際に株収益およびリスク評価を用いるように、インプットとして処理できるように、マイクロアレーデータを変換することが必要である。
ポートフォリオの選択プロセスは、発見的規則の応用を含むこともできる。好ましくは、当該規則は、生物学、および、臨床結果の入手に使用される技術の理解を土台にして考え出されている。さらに好ましくは、それらは、最適化法からのアウトプットに応用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散法を、乳癌患者において差次的に発現される多数の遺伝子のマイクロアレーデータに応用できる。当該方法からのアウトプットは、末梢血、ならびに、罹病組織に発現される一部の遺伝子を含むことができる最適化遺伝子セットであろう。検査法で使用されるサンプルが末梢血から得られ、乳癌の場合に差次的に発現される特定の遺伝子が、末梢血中に差次的に発現される場合、末梢血に差次的に発現される遺伝子を除く有効フロンティアからポートフォリオを選択する発見的規則を応用できる。当然、当該規則は、有効フロンティア形成前に、例えば、データの予備選択中に当該規則を適用することによって応用できる。
問題の生物学に必ずしも関連しない他の発見的規則を応用できる。例えば、特定遺伝子または遺伝子群がポートフォリオを所定の割合だけを代表することができる規則を応用できる。ワグナーソフトウェア(Wagner Software)などの市販のソフトウェアは、これらのタイプの経験則に適合し易い。これは、例えば、確度および精度以外の要因(例、予想ライセンス料)が、1個以上の遺伝子を含めることが望ましいかどうかに影響を与える場合に、有用である。
本発明のある方法は、各種遺伝子(またはポートフォリオ)の遺伝子発現プロファイルを比較し、予後を決定付けることに関する。ポートフォリオを含む遺伝子各々の遺伝子発現プロファイルをコンピューター読取り可能媒体などの媒体で固定する。これは、多数の形態を取ることができる。例えば、表を作成し、対象病態(高い骨への再発確率)を示すシグナル(例、強度測定値)の範囲をインプットすることができる。次に、実際の患者のデータを表の数値と比較し、患者サンプルからの骨への再発の尤度を決定することができる。さらに高度な実施態様では、発現シグナル(例、蛍光強度)のパターンをデジタルまたはグラフで記録する。
次に、患者サンプルと併せて使用する遺伝子ポートフォリオからの遺伝子発現パターンを当該発現パターンと比較する。その後、パターン比較ソフトウェアを使用して、患者サンプルが骨再発を示すパターンを有するか否かを決定する。当然、これらの比較は、患者が骨再発をきたす可能性がないか否かの決定にも使用できる。次に、サンプルの発現プロファイルを、対照細胞のポートフォリオと比較する。サンプルの発現パターンが乳癌の骨再発の発現パターンと一致する場合、(対抗治療法を考慮せずに)このような再発患者を治療するように患者を治療する。サンプルの発現パターンが、正常/対照細胞の発現パターンと一致する場合、乳癌陰性であると患者は診断される。
患者の遺伝子発現パターンを使用して、Coxのハザード分析プログラムの利用により、乳癌の予後(骨再発に関して)を決定できる。当該分析は、好ましくは、Sプラス(S-Plus)ソフトウェア(インサイトフル・コーポレーション(Insightful Corporation)から市販中)を使用して実施できる。当該方法を使用して、遺伝子発現プロファイルを、確実に骨再発を示すプロファイルのそれと比較する(即ち、プロファイル中の組み合わせ遺伝子の発現レベルが骨再発を示す)。確定した閾値を有するCoxのハザードモデルを使用して、2つのプロファイルの類似性を比較し(既知の骨再発対患者)、次に、患者のプロファイルが当該閾値を上回るか否かを決定する。上回る場合、患者を、骨に再発することになる患者として分類し、アジュバント療法、ビスフォスフォネート療法などの治療法、または、他の適切な治療法を実施する。患者のプロファイルが当該閾値を上回らない場合、当該患者を骨再発のない患者として分類する。線形判別分析(linear discriminate analysis)、ロジスティック回帰法(logistic regression)およびニューラルネットワーク法(neural network approaches)などの他の分析ツールを使用して、同じ疑問に答えることもできる。
多数の他の周知のパターン認識法が利用できる。以下の参考文献が若干の実例を提供する：
重みつき多数決法：ゴラブら(1999年)(Weighted Voting: Golub et al. (1999).)
サポートベクターマシン：スーら(2001年)およびラマスワミら(2001年)(Support Vector Machines: Su et al. (2001); and Ramaswamy et al. (2001))
k−近隣法：ラマスワミ(2001年)(K-nearest Neighbors: Ramaswamy (2001))
相関係数：ヴァント・ヴィアら(2002年)(Correlation Coefficients: van 't Veer et al. (2002))
重みつき多数決法：ゴラブら(1999年)(Weighted Voting: Golub et al. (1999).)
サポートベクターマシン：スーら(2001年)およびラマスワミら(2001年)(Support Vector Machines: Su et al. (2001); and Ramaswamy et al. (2001))
k−近隣法：ラマスワミ(2001年)(K-nearest Neighbors: Ramaswamy (2001))
相関係数：ヴァント・ヴィアら(2002年)(Correlation Coefficients: van 't Veer et al. (2002))
本発明の遺伝子発現プロファイルは、癌の診断、予後または治療モニタリングに有用な他の非遺伝子診断法と併せて使用することもできる。例えば、ある状況では、血清タンパクマーカー(例、癌抗原27.29(「CA27.29」))などの普通のマーカーからのデータと、上述の遺伝子発現主体方法の診断力を併用するのが有益である。CA27.29などの分析物を含めたある範囲のマーカーが存在する。当該方法の1つでは、治療患者から定期的に血液を採取し、上記の血清マーカーの1つについて酵素イムノアッセイに供する。当該マーカーの濃度が、腫瘍の再発または治療不全を示す場合、遺伝子発現分析に適したサンプル源を入手する。疑わしい腫塊が存在する部分では、細針吸引(FNA)を行い、次に、当該腫塊から得た細胞の遺伝子発現プロファイルを上記のとおりに分析する。別法として、腫瘍が予め除去された組織に隣接する部分から、組織サンプルを入手できる。この手法は、他の検査結果があいまいな場合に、特に有用である。
本発明の用品は、治療、診断、予後判定、および、その他、乳癌患者が骨への再発をきたす可能性があるか否かの評価に有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらのプロファイル表示は、コンピューター読み取り可能媒体などの機械によって自動的に読取ることができる媒体(磁気、光学系など)に簡略化できる。本用品は、当該媒体で遺伝子発現プロファイルを評価する説明書を含むこともできる。例えば、本用品は、上記の遺伝子ポートフォリオの遺伝子発現プロファイルの比較をコンピューター上で説明するCD ROMを含むことができる。本用品は、患者サンプルからの遺伝子発現データと比較できるように、そこのデジタル記録された遺伝子発現プロファイルを有することもできる。別法として、プロファイルを様々な表示フォーマットで記録できる。グラフでの記録は、当該フォーマットの1つである。上記のパルテック(Partek)(登録商標)からのパルテック・ディスカバー(Partek Discover)(登録商標)およびパルテック・インファー(Partek Infer)ソフトウェアに組み入れられたものなどのクラスタリングアルゴリズム(Clustering algorithms)は、当該データの視覚化に最も役立つと思われる。
本発明に従った各種製造品は、遺伝子発現プロファイルを明らかにするために使用される媒体またはフォーマット化アッセイである。これらは、例えば、マイクロアレーを含むことができ、当該マイクロアレーでは、配列補体またはプローブがマトリックスに貼り付けられ、そのマトリックスに問題の遺伝子を示す配列が、読み取り可能な、その存在の決定因子を結合する。別法として、本発明に従った用品は、乳癌検出のために問題の遺伝子のハイブリダイゼーション、増幅、および、発現レベルを示すシグナル発生を実施する試薬キットにすることができる。
本発明に従って製造するキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するフォーマット化アッセイを含む。これらは、試薬や解説書など、当該アッセイの実施に必要な材料の全部または一部を含む。
本発明を、さらに、以下の制約のない実施例で説明する。本明細書に引用する全参考文献は、参照することによって本明細書に組み入れられている。
〔実施例〕
本発明に従って分析する遺伝子は、典型的には、タンパクまたはペプチドの産生を解読する完全長核酸配列に関連する。完全長配列の識別は、分析の観点から必要ではないことを、当業者は、認識することになる。即ち、周知の原理に従って、配列またはESTの一部を選択でき、相当する遺伝子の遺伝子発現の評価にプローブを指定できる。
本発明に従って分析する遺伝子は、典型的には、タンパクまたはペプチドの産生を解読する完全長核酸配列に関連する。完全長配列の識別は、分析の観点から必要ではないことを、当業者は、認識することになる。即ち、周知の原理に従って、配列またはESTの一部を選択でき、相当する遺伝子の遺伝子発現の評価にプローブを指定できる。
〔実施例１〕
先に確定している遠隔再発プロファイルのためのサンプルの取扱いおよびマイクロアレー作業
本実施例は、総じて再発リスクの高い(即ち、骨再発に限定されない)乳癌患者の識別のための遺伝子ポートフォリオの確立について述べる。
先に確定している遠隔再発プロファイルのためのサンプルの取扱いおよびマイクロアレー作業
本実施例は、総じて再発リスクの高い(即ち、骨再発に限定されない)乳癌患者の識別のための遺伝子ポートフォリオの確立について述べる。
1980〜1995年の間に治療を受けたが、全身性ネオアジュバント療法では治療されなかったリンパ節陰性患者の凍結腫瘍標本をエラスムス大学医学部(Erasmus Medical Center)(ロッテルダム、オランダ(Rotterdam, Netherlands))の腫瘍バンクから選択した。ステロイドホルモンレセプターの測定のために、25箇所の地域病院から全腫瘍サンプルが委託研究所に提出された。一次治療のガイドラインは、全病院で同様であった。偏りを起こさない方法で、腫瘍が選択された。5年再発25〜30％、品質管理上の理由での実質的損失があったという前提で、浸潤腫瘍436例が処理された。臨床転帰(clinical outcome)が不良、中程度、良好の患者が対象とされた。腫瘍量不十分(53)、RNAの品質不良(77)、あるいは、チップの品質不良(20)から、サンプルが拒否され、分析遂行に適したサンプル286個が残った。
手術(乳房温存手術：219名；胸筋温存乳房切除術：67名)時の患者の年令中央値は、52才(範囲、26〜83才)であった。施設内プロトコルに従って、248名(87％)に放射線療法が実施された。この試験は、識別のタイプの手術やアジュバント放射線療法の可能な効果を検討することが目的ではなかったので、患者は、放射線療法の状況に関係なく、試験対象となった。さらに、放射線療法は、癌の遠隔再発に明確な効果がない、と各種試験が認めている。初期乳癌試験者共同グループ(Early Breast Cancer Trialists)(1995年)。リンパ節陰性は、地域病理医が実施する病理検査に基づいた。フォークンズら(Foekens et al)(1989年a)。
対象に加える前、腫瘍サンプル全286個が、H&E染色5μm凍結切片において、十分な(＞70％)腫瘍および均質な腫瘍発生を有することが確認された。ER(およびPgR)レベルをリガンド結合アッセイまたは酵素イムノアッセイ(EIA)(フォークンズら(Foekens et al)(1989年b))、または、免疫組織化学検査(腫瘍9個)で測定した。ERおよびPRについて陽性または陰性として患者を分類する上で使用するカットオフ値は、10fmol/mgタンパクまたは10%陽性腫瘍細胞であった。術後経過観察は、最初の2年間は3ヶ月毎、3〜5年目までは6ヶ月毎、5年目以降は12ヶ月毎の診察を含んだ。転移の診断日は、患者が症状を報告した後の転移確認日、臨床徴候検出日または定期経過観察日と規定した。生存患者(n=198)の経過観察期間中央値は、101ヶ月であった(範囲、20〜171)。対象患者286名中、93名(33％)は、5年以内に遠隔転移の証拠を示し、無遠隔転移生存率(distant metastasis-free survival)(DMFS)の分析で不全と見なされた。5名(2％)は、疾患の証拠なく死亡し、最終経過観察時に打ち切った。83名(29％)は、先の再発後に死亡した。そのため、合計88名(31％)は、総合生存率(OS)の分析において不全であった。
〔実施例２〕
実施例1で得られたデータの遺伝子発現分析
RNAzol B(カンプロ・サイエンティフィック、フェーネンダール、オランダ(Campro Scientific, Veenendaal, Netherlands))で厚さ30μm(50〜100 mg)のクリオスタット切片20〜40個から総RNAを単離した。公開されている方法(アフィメトリクス、カリフォルニア州、リプシュッツら(Affymetrix, CA, Lipshutz et al)(1999年))を使用してビオチニル化ターゲット(Biotinylated targets)を調製し、アフィメトリクスオリゴヌクレオチドマイクロアレーU133a遺伝子チップ(GeneChip)にハイブリダイズした。標準アフィメトリクスプロトコルを使用してアレーをスキャンした。各プローブセットを個別遺伝子として処理した。アフィメトリクス遺伝子チップ分析ソフトウェアMAS 5.0を使用して、発現値を算出した。平均強度が＜40、または、バックグラウンドシグナルが＞100である場合、チップを不合格とした。チップシグナルを標準化するため、プローブセットをターゲット強度600に合わせ、スケールマスクファイルを選択しなかった。
実施例1で得られたデータの遺伝子発現分析
RNAzol B(カンプロ・サイエンティフィック、フェーネンダール、オランダ(Campro Scientific, Veenendaal, Netherlands))で厚さ30μm(50〜100 mg)のクリオスタット切片20〜40個から総RNAを単離した。公開されている方法(アフィメトリクス、カリフォルニア州、リプシュッツら(Affymetrix, CA, Lipshutz et al)(1999年))を使用してビオチニル化ターゲット(Biotinylated targets)を調製し、アフィメトリクスオリゴヌクレオチドマイクロアレーU133a遺伝子チップ(GeneChip)にハイブリダイズした。標準アフィメトリクスプロトコルを使用してアレーをスキャンした。各プローブセットを個別遺伝子として処理した。アフィメトリクス遺伝子チップ分析ソフトウェアMAS 5.0を使用して、発現値を算出した。平均強度が＜40、または、バックグラウンドシグナルが＞100である場合、チップを不合格とした。チップシグナルを標準化するため、プローブセットをターゲット強度600に合わせ、スケールマスクファイルを選択しなかった。
〔実施例３〕
実施例2で識別された遺伝子の統計分析
遺伝子発現データをフィルターにかけ、2個以上のサンプル中に「存在する」とされる遺伝子を対象とした。17,819個の遺伝子がこのフィルターを通過し、階層型クラスタリング(hierachical clustering)に使用した。クラスタリング前、各遺伝子の発現レベルを、患者の発現レベル中央値で除した。この標準化段階は、遺伝子の発現規模の影響を制限し、クラスタリング分析において、同様の発現パターンを持つ遺伝子を合わせて群分けした。患者サブグループを識別するため、我々は、遺伝子スプリング(GeneSpring)6.0を使用して、遺伝子とサンプル両方に対して群平均階層型クラスタリングを実施した。
実施例2で識別された遺伝子の統計分析
遺伝子発現データをフィルターにかけ、2個以上のサンプル中に「存在する」とされる遺伝子を対象とした。17,819個の遺伝子がこのフィルターを通過し、階層型クラスタリング(hierachical clustering)に使用した。クラスタリング前、各遺伝子の発現レベルを、患者の発現レベル中央値で除した。この標準化段階は、遺伝子の発現規模の影響を制限し、クラスタリング分析において、同様の発現パターンを持つ遺伝子を合わせて群分けした。患者サブグループを識別するため、我々は、遺伝子スプリング(GeneSpring)6.0を使用して、遺伝子とサンプル両方に対して群平均階層型クラスタリングを実施した。
5年間無転移であった患者から遠隔転移を発症した患者を判別する遺伝子を識別するため、2 種類の管理された(supervised)クラス予測法を使用した。第一の手法では、患者286名を、それぞれ、80名と206名のトレーニングおよびテスティングセットに無作為に割り付けた。当該2セットのカプラン−マイヤー(Kaplan-Meier)生存率曲線(カプランら(Kaplan et al.)(1958年))を検討し、トレーニングセットとテスティングセットの無作為選択によって有意差がなく、偏りが生じていないことを保証した。第2の手法では、ER状況で層化した2つのサブグループのどちらかに割り当てた。
マーカーを選択する目的で、各患者サブグループを個別に分析した。ER陽性サブグループの患者は、80名と129名のトレーニングセットおよびテスティングセットにそれぞれ無作為に割り当てた。ER陰性サブグループの患者は、35名と42名のトレーニングセットおよびテスティングセットにそれぞれ無作為に分けた。各サブグループトレーニングセットから選択したマーカーを合わせて、単一シグネチャーを形成し、その後の独立バリデーションで、ER-陽性およびER-陰性患者の腫瘍転移を予測した。
トレーニングセットのサンプルサイズを、統計的信頼レベルを確保するリサンプリング法によって決定した。手短にいうと、トレーニングセットの患者数は、15名で始まり、5名ずつ増加させた。一定のサンプルサイズについては、無作為に選択した患者のトレーニングセット10セットを定めた。遺伝子シグネチャーを各トレーニングセットから構成した後、指定したテスティングセット患者で、5年以内遠隔転移を定義点として受診者動作特性(receiver operating characteristic)(ROC)曲線の分析によって当該シグネチャーを検定した。一定サンプルサイズについての曲線下面積(AUC)の平均値および変動係数(CV)を算出した。平均AUCがプラトーに達し、10 AUCのCVが5％未満である点で、トレーニングセットに必要とされる最小数の患者を選択した。
遺伝子は、次のように選択した。最初に、単変量Cox比例ハザード回帰を使用して、発現量(log2尺度で)がDMFSの長さと相関する遺伝子を識別した。多重検定の影響を軽減し、選択した遺伝子の頑健性を検証するために、Coxモデルをトレーニングセットの患者のブートストラップで構成した。エフロンら(Efron et al.)(1981年)。手短にいうと、それぞれ、交替(replacement)によって無作為選択した80名の患者で、トレーニングセットのブートストラップサンプル400個を構築した。Coxモデルをブートストラップサンプルのそれぞれについて作動させた。最高および最低5%p-値を除いた後、残りのブートストラップp-値の逆数を平均することによって、遺伝子毎にブートストラップスコアを得た。このスコアを使用して、遺伝子を順位付けた。多重遺伝子シグネチャーを構築するには、順位に従って一度に１個の遺伝子を足すことによって、遺伝子マーカーの組合せを検定した。定義点として５年以内遠隔転移を使ったROC分析を実施し、最大AUC値に達するまで遺伝子数を増加させながら、シグネチャー毎の曲線下面積AUCを算出した。
再発スコア(RS)を使用して、各患者の遠隔転移リスクを算出した。スコアを、重みとしての標準化Cox回帰係数との重み付け発現シグナルの線形組合せであると定義した。
式中、
I=ERレベル＞10 fmol/mgタンパクの場合、1
I=ERレベル≦10 fmol/mgタンパクの場合、0
AおよびBは定数であり、
wiは、ER+マーカーの標準化Cox回帰係数であり、
xiは、log2尺度でのER+マーカーの発現値であり、
wjは、ER−マーカーの標準化Cox回帰係数であり、
xjは、log2尺度でのER−マーカーの発現値である。
式中、
I=ERレベル＞10 fmol/mgタンパクの場合、1
I=ERレベル≦10 fmol/mgタンパクの場合、0
AおよびBは定数であり、
wiは、ER+マーカーの標準化Cox回帰係数であり、
xiは、log2尺度でのER+マーカーの発現値であり、
wjは、ER−マーカーの標準化Cox回帰係数であり、
xjは、log2尺度でのER−マーカーの発現値である。
トレーニングセットのROC曲線から閾値を決定し、100％感度および最高特異性を確保した。定数A313.5、定数B280の数値を選択し、ER-陽性およびER-陰性患者に対するRSの閾値を0に集中させた。正のRSスコアを有する患者を予後不良群、負のRSスコアを有する患者を予後良好群に分類した。テスティングセットで、遺伝子シグネチャーおよびカットオフをバリデートした。カプラン−マイヤー(Kaplan-Meier)生存率プロットおよび対数順位検定を使用して、予測される高および低リスク群の遠隔転移までの時間の差を評価した。オッズ比(OR)は、再発が予測される患者と再発なしと予測される患者の間の遠隔転移オッズ比として算出した。
Coxの比例ハザード回帰による単変量および多変量分析を、遺伝子シグネチャーのある場合とない場合で、独立臨床変量について実施した。HRおよびその95％信頼区間(CI)をこれらの結果から導いた。全統計分析は、Sプラス(S-Plus) 6.1ソフトウェア(インサイトフル、ヴァージニア州(Insightful, VA))を使用して実施した。
〔実施例４〕
実施例3で識別された遺伝子の経路分析
実施例1〜3(非骨特異的再発)に述べた予後シグネチャー遺伝子の遺伝子それぞれに、機能クラスを割り当てた。インジェヌイティ(Ingenuity) 1.0ソフトウェア(インジェヌイティ・システムズ、カリフォルニア州(Ingenuity Systems, CA))で経路分析を実施した。当該ソフトウェアが構築した生物学的ネットワークの検索に、インプットとしてアフィメトリックス(Affymetrix)プローブを使用した。当該プログラムによって識別された生物学的ネットワークを、GOオントロジー分類によって一般機能クラスとの関連で評価した。予後シグネチャーの遺伝子2個以上を有する経路を選択し、評価した。
実施例3で識別された遺伝子の経路分析
実施例1〜3(非骨特異的再発)に述べた予後シグネチャー遺伝子の遺伝子それぞれに、機能クラスを割り当てた。インジェヌイティ(Ingenuity) 1.0ソフトウェア(インジェヌイティ・システムズ、カリフォルニア州(Ingenuity Systems, CA))で経路分析を実施した。当該ソフトウェアが構築した生物学的ネットワークの検索に、インプットとしてアフィメトリックス(Affymetrix)プローブを使用した。当該プログラムによって識別された生物学的ネットワークを、GOオントロジー分類によって一般機能クラスとの関連で評価した。予後シグネチャーの遺伝子2個以上を有する経路を選択し、評価した。
〔実施例５〕
実施例1〜4の結果
患者および腫瘍特性
実施例1〜3の患者286名の臨床および病理像を表1に要約する。
実施例1〜4の結果
患者および腫瘍特性
実施例1〜3の患者286名の臨床および病理像を表1に要約する。
年令、閉経状況に差がなかった。ER-陰性トレーニング群は、ER-陽性トレーニング群よりも、大きめの腫瘍の割合が若干高く、予想どおり、重症度が不良の腫瘍が多かった。171名のバリデーション群(ER-陽性129名、ER-陰性42名)は、患者もしくは腫瘍特性のいずれに関しても、全群286名と差がなかった。
2種類の手法を使用して、疾患再発を予測するマーカーを識別した。最初に、全286名(ER-陽性患者とER-陰性患者を合わせて)をトレーニングセットとテスティングセットに割り当てるように、データを無作為に分割した。35個の遺伝子をトレーニングセットの80名から選択し、遠隔転移の発生を予測するCoxモデルを構築した。中程度予後値が認められた。表2。教師なしクラスター分析は、腫瘍ER状況と顕著に相関する2つの異なるサブグループを示した(χ2-検定、p＜0.0001)。
マーカーを選択するため、各サブグループを分析した。トレーニングセットの患者から76個の遺伝子を選択した(ER-陽性群で60個、ER-陰性群で16個)。遺伝子およびER状況と合わせて、癌(骨に限定しない)の再発を予測するCoxモデルを構築した。171名のテスティングセットの76-遺伝子予測因子のバリデーションは、AUC値0.694、感度93％(52/56)、特異性48％(55/115)のROCを生じた。予後シグネチャーの閾値を上回る再発スコアを有する患者は、11.9倍OR(95％CI：4.04〜35.1；p＜0.0001)を有し、5年以内の遠隔転移を発症する。対照として、無作為選択した76-遺伝子セットを得た。これらは、テスティング群において、AUC値0.515、感度91％、特異性12％のROCを生じた。当該遺伝子セットで層化した患者は、転移発症について1.3(0.50〜3.90；p=0.8)のオッズ比を有し、無作為分類を示していると思われる。さらに、76-遺伝子シグネチャーの関数としての無遠隔転移生存率(DMFS)および総生存率(OS)のカプラン−マイヤー(KaplanMeier)分析は、予後良好および不良であると予測される群間の転移までの時間に顕著な有意差を示した。60ヶ月目および80ヶ月目、予後良好および不良と予測される群間のそれぞれの絶対DMFS差は、40％(93%対53%)と39％(88％対49％)であり、OSの絶対DMFS差は、それぞれ、27％(97％対70％)と32％(95％対63％)であった。
76-遺伝子プロファイルは、閉経前患者84名(HR：9.60)、閉経後患者87名(HR：4.04)および腫瘍サイズ10〜20 mmの患者79名(HR：14.1)のサブグループでの遠隔転移発症の強力な予後因子でもあった。
単変量(univariate)および多変量(multivariable)Cox回帰分析を表3に要約する。
単変量分析では、76-遺伝子シグネチャー以外に、重症度だけが有意であり、中程度/良好の鑑別は、良好なDMFSと関連した。5年以内の腫瘍転移発生についてのHRの多変量回帰推定は5.55(p＜0.0001)であり、76-遺伝子セットが、より高い腫瘍転移リスクと強く関連する独立予後シグネチャーであることが指摘された。単変量および多変量分析を、ER-陽性およびER-陰性患者についても別に実施し、76-シグネチャーもER状況で層化したサブグループにおける独立予後変量であった。
非骨特異的予後シグネチャーにおける76個の遺伝子(表4)の機能を分析し、遺伝子を生物学的経路に関連付けた。
76個の遺伝子中18個は、機能が不明であったが、細胞死、細胞周期および増殖、DNA複製および修復および免疫応答など、適切に表示される数種の経路または生化学活性が識別された(表5)。
カルパイン2、複製開始点認識タンパク(origin recognition protein)、二重特異性フォスファターゼ、Rho-GDP解離阻害因子、TNFスーパーファミリータンパク、補体成分3、微小管関連タンパク、タンパクフォスファターゼ1およびアポトーシス調節因子BCL-Gを含めて、疾患の進行に関与する遺伝子が認められた。さらに、サイクリンE2 (キヨマルシら(Keyomarsi et al)(2002年))およびCD44 (ヘレラ‐ゲイオールら(Herrera-Gayol et al.)(1999年))などのこれまでに特徴付けられた予後遺伝子が、遺伝子シグネチャー中にあった。
サンプル提供患者は、アジュバント全身療法を受けなかったので、予後の多重遺伝子評価は、全身療法に関連する予測因子による潜在的な交絡の寄与(confounding contributions)を受けなかった。この分析から、76-遺伝子シグネチャーは、骨再発の特異的な予後判定手段ではない遠隔腫瘍再発を正確に予測する。このシグネチャーは、年令、腫瘍サイズおよび重症度およびER状況とは無関係に、全再発乳癌患者に適用できる。DMFSのCox多変量分析では、76-遺伝子シグネチャーは、唯一の有意な変量で、重症度を含めて、臨床変量に取って代わるものである。5年後、76-遺伝子シグネチャーが良好な患者と不良な患者の間のDMFSおよびOSの絶対差は、それぞれ、40％と27％であった。予後良好シグネチャーを有する患者のうち、7％は遠隔転移を発症し、3％は5年以内に死亡した。バリデーションが進めば、この予後シグネチャーは、乳癌患者の再発率を25％と仮定すると、37％の陽性予測値と95％の陰性予測値を得ることになる。特に、このシグネチャーは、T1腫瘍(＜2 cm)の割合の増加に対する再発リスクを規定する上で重要となり得る。ザンクト・ガレン(St Gallen)およびNIHガイドラインとの比較は、有益である。ザンクト・ガレン(St Gallen)およびNIHガイドラインと比較すると、高リスク患者で必要な治療を受けるのは、確実に同数になるが、低リスク患者では、76-遺伝子シグネチャーが全身性アジュバント化学療法を推奨するのは、52％にすぎず、ザンクト・ガレン(St. Gallen)およびNIHガイドラインによれば、それぞれ、90％と89％である(表6)。
よって、76-遺伝子シグネチャーは、不必要なアジュバント全身療法の受療を勧められる低リスク再発患者数を減少させる。
予後シグネチャーにおける76-遺伝子は、多くの機能クラスに属し、異なる経路が疾患の進行を招く可能性があることを示唆している。当該シグネチャーは、十分に特徴付けられた遺伝子と18個の未知の遺伝子を含む。この所見は、他の予後因子に比較して、このシグネチャーの優れた性能の説明になるといえる。細胞死、細胞増殖および転写調節に関与する遺伝子は、ER状況で層化された両患者群に認められたが、ER-陽性群用に選択された遺伝子60個、および、ER-陰性群用に選択された遺伝子16個は重複していなかった。この結果は、疾患進行の不均質度と基礎となるメカニズムが、乳癌患者のこれら2つのERによるサブグループで異なる可能性があるという考えを裏付ける。
ヴァン・デ・ヴィジュヴァーら(van de Vijver et al.)(2002年)による研究結果とのこれらの結果の比較は、患者、技術および使用材料が異なるため、困難である。ヴァン・デ・ヴィジュヴァーら(van de Vijver et al.)は、アジュバント全身療法を受療した、受療しなかったリンパ節陰性およびリンパ節陽性患者で、53才未満の女性のみを含んだ。さらに、各研究で使用されるマイクロアレープラットフォームは、異なり、アフィメトリックス(Affymetrix)対アジレント(Agilent)であった。ヴァント・ヴィア(van't Veer)(2002年)の研究の70個の遺伝子のうち、48個のみがアフィメトリックス(Affymetrix)U133aアレーに供されているが、本プロファイルの76個の遺伝子のうち、アジレント(Agilent)アレーに供したのは38個にすぎなかった。これら2種類のシグネチャー間には、3-遺伝子の重複が見られる(サイクリンE2、複製開始点認識複合体およびTNFスーパーファミリータンパク)。見掛けの差にもかかわらず、両シグネチャーは、腫瘍再発に関与すると思われる数種の共通経路を識別する遺伝子を含んだ。この所見は、遺伝子メンバーに冗長性(redundancy)があると思われるが、有効なシグネチャーは、特異的経路の表示を含むことを必要とするといえる。
ヴァン・デ・ヴィジュヴァーら(van de Vijver et al.)(2002年)の研究と比較した上記の研究の長所は、未治療再発患者数がより多く(286名対141名)、年令、閉経状況および腫瘍サイズに関して76-遺伝子シグネチャーが独立性を有することである。この手法における患者のバリデーションセットは、他の報告が90％であるのとは対照的にトレーニングセットとの重複がまったくない。ランソホフ(Ransohoff)(2004年)。
結論として、未治療患者の約30〜40％だけが腫瘍再発をきたすので、予後シグネチャーは、低リスク患者を識別する強力なツールを提供し、かなりの数の患者において治療で防止できる。この予後シグネチャーは、今後、原発性乳癌患者におけるアジュバント全身性療法の推奨するようになることができる。(総じて、再発リスクに関する)実施例1〜5で述べた好ましいプロファイルは、SEQ ID NOs：1〜35の遺伝子から成る35-遺伝子ポートフォリオ、ER-陽性患者の予後の予測に使用するのが最も良いSEQ ID NOs：36〜95の遺伝子から成る60-遺伝子ポートフォリオ、ならびに、ER-陰性患者の予後の予測に使用するのが最も良いSEQ ID NOs：96〜111の遺伝子から成る16-遺伝子ポートフォリオである。
〔実施例６〕
病期I/IIの乳癌においてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとバルク組織から作成した乳癌腫瘍遺伝子プロファイルの比較
遺伝子-発現プロファイリングは、多様な癌型の強力な診断および予後ツールであることが立証されている。ほぼ全例で、チップ上でのハイブリダイゼーションにバルク腫瘍RNAを使用した。エストロジェンは、ホルモン依存性腫瘍の発症および増殖に重要な役割を果たす。
病期I/IIの乳癌においてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションとバルク組織から作成した乳癌腫瘍遺伝子プロファイルの比較
遺伝子-発現プロファイリングは、多様な癌型の強力な診断および予後ツールであることが立証されている。ほぼ全例で、チップ上でのハイブリダイゼーションにバルク腫瘍RNAを使用した。エストロジェンは、ホルモン依存性腫瘍の発症および増殖に重要な役割を果たす。
約75％の乳癌は、エストロジェンレセプター(ER)を発現するが、これは、(アジュバント)タモキシフェン療法の指標であり、患者の転帰と関連する。
乳房上皮細胞においてエストロジェンが引き起こすメカニズムおよびその腫瘍形成との関連を洞察するために、レーザーキャプチャーマイクロダイゼーション(laser capture microdissection)(LCM)を遺伝子チップ(GeneChip)発現分析と併用して、初期原発性乳房腫瘍29例から組織学的に均質な腫瘍細胞群を入手した。腫瘍サイトゾル上での定量的リガンド結合または酵素イムノアッセイによれば、これらの29名の患者のうち、11名はER-陰性、17名はER-陽性であった。比較のため、同じ29名の患者群から単離したバルク腫瘍RNAも使用して、遺伝子発現プロファイリングを得た。
乳房腫瘍のために外科的治療を受け、ネオアジュバント全身療法を受けなかったリンパ節陰性乳癌患者29名から、新鮮凍結組織サンプルを収集した。患者の各組織サンプルについて、最初にH&E染色スライド(H&E slide)を使用して、細胞形態を評価した。クリオスタット切片上で実施したLCM(PALM)から入手した両腫瘍細胞から、また、同じ腫瘍の完全クリオスタット切片、即ちバルク組織から、RNAを単離した。RNAサンプルの品質は、アジレント・バイオアナライザ(Agilent BioAnalyzer)で分析した。当該RNAサンプルを、約22,000プローブセットを含有するアフィメトリックス・ヒューマン(Affymetrix human)U133Aチップにハイブリダイズした。蛍光を定量し、その強度を標準化した。クラスタリング分析および主成分分析を使用して、類似遺伝子発現プロファイルを有する患者をグループ分けした。ER-陽性サンプルとER-陰性サンプルの間で差次的に発現された遺伝子を選別した。
LCMで入手した乳癌細胞から単離した総RNAを、対象調製物中で2-ラウンドT7主体増幅に供し、それとの比較で、バルク組織RNAで1-ラウンド増幅を実施した。21個の対照遺伝子(表7)の発現レベルを、LCMデータセットとバルク組織セットの間で比較し、線形増幅の忠実度(fidelity)を実証した。
得られた結果を表8に示す。
5121個の遺伝子に基づく階層型クラスタリングは、LCMおよびバルク組織両サンプルが総RNA発現プロファイルに基づいて完全に分離されていることを示した。LCMによって得られたRNAに使用された線形増幅の追加ラウンドに供されたLCMサンプルとバルク組織からのRNA単離体中の対照遺伝子21個の発現レベルは、当該対照遺伝子の差次的発現を引き起こさなかった。LCM、バルク組織の両サンプル中のER-陽性サブクラスターとER-陰性サブクラスターの間の差次的発現遺伝子を、遺伝子オントロジーによるスチューデントのt-検定経路分析によって、もっぱらLCMサンプルのERと関連する遺伝子、もっぱらバルク組織中のERと関連する遺伝子について規定し、また、LCM、バルク組織の両方に共通する遺伝子について実施した。
得られた結果は、いくつかの重要な結論を示している。第一に、バルク組織データセットにおいても、LCMデータセットにおいてもER−/ER＋患者に、細胞増殖およびエネルギー代謝に関連する遺伝子が差次的に発現されるのが認められた。第二に、LCMを介した乳癌細胞の富化によって、細胞表面レセプター結合シグナル導入、RASシグナル導入、JAK-STATシグナル導入およびアポトーシスに関与する遺伝子は、ER状況に関連するのが判明した。これらの遺伝子は、バルクデータセットでは識別されなかった。第三に、マイクロダイセクションは、上皮腫瘍細胞の検討に高感度な方法を提供し、エストロジェンレセプターに関連するシグナリング経路を理解させた。そのため、LCM単離腫瘍細胞への本明細書記述の遺伝子発現プロファイルの応用は、不均質バルク組織から得られた結果と整合する。
〔実施例７〕
乳癌における76-遺伝子予後シグネチャーのバリデーションおよび経路分析
本実施例は、76-遺伝子シグネチャーを使用して、別々の4施設から得た患者132名の転帰を予測したバリデーション試験の結果を報告する。
乳癌における76-遺伝子予後シグネチャーのバリデーションおよび経路分析
本実施例は、76-遺伝子シグネチャーを使用して、別々の4施設から得た患者132名の転帰を予測したバリデーション試験の結果を報告する。
さらに、この遺伝子シグネチャーの頑健性を評価するために、この実施例では、さらに、当該シグネチャーの代替可能な成分の識別を提供し、当該代替がどのようにして有効シグネチャーの主要経路の識別につながるかについて述べる。
乳房腫瘍の外科的治療を受け、アジュバント全身療法を受けなかった患者132名から、新鮮な凍結組織サンプルを収集した。使用した患者のサンプルは、1980〜1996年に収集したものであった。患者の組織サンプル毎に、H&E染色スライドを使用して、細胞形態を評価した。その後、総RNAサンプルを調製し、当該サンプルの品質をアジレント・バイオアナライザ(Agilent BioAnalyzer)で分析した。RNAサンプルは、マイクロアレー分析で分析した。蛍光を定量し、強度を標準化した。76-遺伝子シグネチャーの発現レベルに基づいて、患者毎に再発ハザードスコアを算出した。患者は、良好転帰群と不良転帰群に分類した。
この遺伝子シグネチャーの頑健性を評価するために、2つの統計分析法を設計し、使用した。第一に、76-遺伝子シグネチャーの発見に使用した遺伝子選択法およびシグネチャー構築法を反復した。表8に示すように、合計286名の患者から、それぞれ、115名のトレーニングセット10セットを無作為に選択した。残りの患者は、テスティングセットとした。
第二に、トレーニングセットの患者数を286名の80％まで増加させ、残りの20％をテスティングセットとして使用した。この選択法を10回反復した。両手法において、カプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）生存率曲線を使用して、トレーニング、テスティングペア間で無病生存率に有意差のないことを確認した。Cox比例ハザード回帰を使用して、当該トレーニングセットのそれぞれから遺伝子を選択し、シグネチャーを構築した。対応するテスティングセットで、各シグネチャーをバリデートした。さらに、GOオントロジー分類を使用して、76-遺伝子予後シグネチャーを機能群に割り付けた。当該シグネチャーの有意遺伝子数を網羅する経路を選択した(p-値＜0.05および＞2ヒット)。各種トレーニングセットからも導いた全予後シグネチャーにおいて、選択した経路を評価した。
本実施例で得られた結果は、以下の結果を示している：
・76-遺伝子シグネチャーは、132名の個々の患者でバリデーションに成功し、4箇所の独立した施設の再発乳癌患者132名において0.757のAUC値を示した。当該シグネチャーは、感度88％、特異性41％を示す。
・代替シグネチャーの平均AUCは、0.64(95％CI：0.53〜0.72)であった。この結果は、76-遺伝子予測因子(0.69のAUC(AUC of 0.69))のそれと一致する。76-遺伝子シグネチャーにおいて過剰表示された21経路は、他の予後シグネチャー全部にも認められ、腫瘍再発に共通の生物学的経路が関与することが示唆された。
・これらの結果は、遺伝子発現プロファイルが患者転帰のリスク評価を実施する強力な手法を提供することを示唆している。データは、患者に腫瘍再発の定量的測定を提供する分子予後アッセイの実行可能性を浮き彫りにしている。
・76-遺伝子シグネチャーは、132名の個々の患者でバリデーションに成功し、4箇所の独立した施設の再発乳癌患者132名において0.757のAUC値を示した。当該シグネチャーは、感度88％、特異性41％を示す。
・代替シグネチャーの平均AUCは、0.64(95％CI：0.53〜0.72)であった。この結果は、76-遺伝子予測因子(0.69のAUC(AUC of 0.69))のそれと一致する。76-遺伝子シグネチャーにおいて過剰表示された21経路は、他の予後シグネチャー全部にも認められ、腫瘍再発に共通の生物学的経路が関与することが示唆された。
・これらの結果は、遺伝子発現プロファイルが患者転帰のリスク評価を実施する強力な手法を提供することを示唆している。データは、患者に腫瘍再発の定量的測定を提供する分子予後アッセイの実行可能性を浮き彫りにしている。
〔実施例８〕
骨再発シグネチャー
遠隔再発の予測のための76-遺伝子プロファイルの確立に使用したサンプルセットから、107個のサンプルを選択し、骨再発の検討を進めた。これらのサンプルは、再発部位が明らかであるため、全て選択し、当該サンプルを骨および非骨遠隔再発セットに群分けした。骨再発サンプルと分類されたサンプルは、骨再発を呈し、身体の他の部分にも再発している可能性があるサンプルを含んだ。残りの再発患者サンプルは、非骨と表示した。
骨再発シグネチャー
遠隔再発の予測のための76-遺伝子プロファイルの確立に使用したサンプルセットから、107個のサンプルを選択し、骨再発の検討を進めた。これらのサンプルは、再発部位が明らかであるため、全て選択し、当該サンプルを骨および非骨遠隔再発セットに群分けした。骨再発サンプルと分類されたサンプルは、骨再発を呈し、身体の他の部分にも再発している可能性があるサンプルを含んだ。残りの再発患者サンプルは、非骨と表示した。
これらの分析に使用したサンプルに関する詳細を表10に示す。
2つの異なる分析を実施した。第一に、マイクロアレー有意分析(Significance Analysis of Microarrays)(SAM)を使用して、他部位への再発(即ち、非骨)と比較した骨再発の事例における差次的発現遺伝子を識別した。第二の分析では、骨再発予測因子を確定し、患者の骨での再発の尤度を決定した。このシグネチャーは、マイクロアレー予測分析(Prediction Analysis of Microarrays)(PAM)と称する。
SAM分析の場合、300種のデータの並べ替えを使用して、過誤発見率(false discovery rate)(FDR)を算出した。FDRが5％未満である場合、また、発現レベルの最小1.7倍差が認められた場合、遺伝子を有意と見なした。骨再発の可能性のある患者(再発の可能性のある患者のうち)の識別に有用と思われる診断プロファイルを構築するため、サンプルを再発部位、ERタンパクレベルおよび無転移期間で層化したトレーニングセット(n=72、骨再発46名および非骨再発26名)とテスティングセット(n=35、骨再発23名および非骨再発12名)に分けた。最適カットオフ手法を使った遺伝子選択段階をトレーニングセットのサンプルで実施した。1個の遺伝子の全測定発現レベルをカット点として使用し、特定のサンプルで遺伝子が「高」である、または、「低」である、に割り付け、1群当り最低20個のサンプルを保持した。これらのサンプルの再発部位を確認後、カットオフ毎にカテゴリー高/骨、低/骨、高/非骨および低/骨の頻度をカウントした。χ2分布を使用して最適カットオフを決定した。マクロアレー予測分析(PAM)での分析において最高χ2スコアが10.827以上(p＜0.001)である場合、遺伝子を対象とした。
この手法で確立した遺伝子プロファイルの中で、TFF1は、最も有意な遺伝子であった(統計的観点から)。以下のプライマーペアTGGAGCAGAGAGGAGGCAATおよびACGAACGGTGTCGTCGAAACを使用して、定量RT-PCRによるTFF1mRNAレベルを測定する実験をさらに進めた。RT-PCR試験用に選択したサンプルは、表10に挙げた患者および腫瘍特性に適合した。遺伝子発現レベルを一群のハウスキーパー遺伝子と比較して表示し、2log変換した。TFF1の遺伝子発現レベルの差を2つの再発群と相関させ、クラスカル‐ウォリス分散分析(Kruskal-Wallis anova)、χ2近似値を使ってp-値を算出し、タイについて補正した。統計分析は、アナライズ−イット(Analyse-it)ソフトウェア(アナライズ-イット・ソフトウェア・リミテッド、リーズ、英国(Analyse-it Software Ltd, Leeds, United Kingdom))を使って実施した。
〔結果〕
SAM分析
再発部位に従って、上記のサンプルを分類し、69個のサンプルを骨と表示し、38個を非骨と表示した。SAMを使って、69個の特異な遺伝子を表示する73プローブセットは、骨サンプルと非骨サンプルの間で有意に差次的に発現されることが分かった。5個の最高ランクの遺伝子は、TFF1、TFF3、AGR2、NAT1およびCRIP1であり、これらは、すべて、骨再発サンプルで、より高い発現を示した。最高ランクの遺伝子TFF1は、定量RT-PCR1によって122例の個別乳房腫瘍で検討した。TFF1発現は、再発部位と有意に関連し(p=0.0015)し、TFF1の相対発現レベル中央値および95％CIは、骨再発群と非骨再発群が、それぞれ、3.02(1.41〜4.66)と‐1.63(‐5.44〜2.49)であった。SEQ ID No.s112〜147に相当する遺伝子は、骨再発サンプル中で、より高く発現された。残りは、低めに発現された。
SAM分析
再発部位に従って、上記のサンプルを分類し、69個のサンプルを骨と表示し、38個を非骨と表示した。SAMを使って、69個の特異な遺伝子を表示する73プローブセットは、骨サンプルと非骨サンプルの間で有意に差次的に発現されることが分かった。5個の最高ランクの遺伝子は、TFF1、TFF3、AGR2、NAT1およびCRIP1であり、これらは、すべて、骨再発サンプルで、より高い発現を示した。最高ランクの遺伝子TFF1は、定量RT-PCR1によって122例の個別乳房腫瘍で検討した。TFF1発現は、再発部位と有意に関連し(p=0.0015)し、TFF1の相対発現レベル中央値および95％CIは、骨再発群と非骨再発群が、それぞれ、3.02(1.41〜4.66)と‐1.63(‐5.44〜2.49)であった。SEQ ID No.s112〜147に相当する遺伝子は、骨再発サンプル中で、より高く発現された。残りは、低めに発現された。
PAM分析
サンプルを、再発部位、ERタンパクレベルおよび無転移期間で層化したトレーニングセット(n=72)とテスティングセット(n=35)に分けた。最適カットオフ手法を使用して、PAM分析でのインプット用に、有効遺伝子588個を選択した。テスティングセットにおいて骨再発サンプルを識別できるトレーニングセットの10分割クロスバリデーション後、感度100％、特異性50％で31-遺伝子予測因子を選択した。予測因子は、79.3％陽性予測値を示し、サンプルの17％を誤分類した。TFF1を含めたプロファイルの17個の遺伝子は、SAM遺伝子リストにも存在した(全31個の遺伝子は表11のPAM欄に収載されている)。
サンプルを、再発部位、ERタンパクレベルおよび無転移期間で層化したトレーニングセット(n=72)とテスティングセット(n=35)に分けた。最適カットオフ手法を使用して、PAM分析でのインプット用に、有効遺伝子588個を選択した。テスティングセットにおいて骨再発サンプルを識別できるトレーニングセットの10分割クロスバリデーション後、感度100％、特異性50％で31-遺伝子予測因子を選択した。予測因子は、79.3％陽性予測値を示し、サンプルの17％を誤分類した。TFF1を含めたプロファイルの17個の遺伝子は、SAM遺伝子リストにも存在した(全31個の遺伝子は表11のPAM欄に収載されている)。
遺伝子セットの妥当性を確認するために、100個の無作為に選択した遺伝子の50セットも分析した。同トレーニングセットおよびテスティングセットを使ったPAM分析でのインプット用に、これらの無作為遺伝子を使用した。サンプル誤分類の平均パーセンテージは、28.5％であった(標準偏差SD4.3％)。これは、実際のPAM遺伝子リストによって認められた17％の誤分類サンプルは、無作為データセットよりも有意に低い(ｚ-値 2.67、両側検定p=0.008)ことを指摘している。
骨再発シグネチャーの経路分析
差次的発現遺伝子を、遺伝子オントロジーおよびKEGGデータベースに認められるものと比較した。KEGGデータベース注釈付きの、SAMリストからの遺伝子は、わずか8個であったので、そのリストを最近発表された骨転移プロファイルと合わせた。その研究では、カンら(Kang et al.)が、マウスに注入すると、骨への再発が不良、あるいは、効率的再発であったER-陰性乳癌細胞系MDA-MB-231のサブクローンからプロファイルを作成した。それらの2種のサブタイプ間の差次的発現遺伝子を骨再発シグネチャーと見なした。カンら(Kang et al.)は、上記の実施例で使用したものと同じマイクロアレーを使用したので、その127プローブセットリスト(122個のユニーク遺伝子)をSAM遺伝子リスト(n=69)と合わせるのが便利であった。2種のプロファイルは、1個の遺伝子(BENE)を共有するにすぎないが、それらは、共通の経路が関与する可能性がある。そのために、両リストをKEGGデータベース上にマッピングした。合計20個のKEGG-注釈付き遺伝子は、遺伝子20個中5個(FGF5, SOS1およびDUSP1(カン(Kang)リスト)およびFGFR3およびDUSP4 (SAM))をFGFR-p42/44 MAP-キナーゼ経路に配置した。この遺伝子数は、ランダムデータセットとは統計的に差がある(p＜0.0001)。5個の全遺伝子を、骨転移細胞/腫瘍で上方制御した。遺伝子オントロジーデータベースの注釈付きの、併記リストからの142個の遺伝子を検討した。U133aチップ上にプリントされた全遺伝子に比べて、遺伝子オントロジー記述が、併合SAM/カン(Kang)リストにおいて、過剰表示されたか否かを決定した。過剰表示注釈は、生物学的経路を指し示し、これが、再発部位にリンクすると思われる。例えば、「細胞外(extracellular)」という記述は、骨マーカーリストからの142個(14.8％)の遺伝子のうちの21個にリンクしたが、U133aチップの16367個の遺伝子のうちで、この記述に注釈付きであるのは、1350個(8.2％)であった。これは、「細胞外」が、骨再発リストで1.8倍過剰表示されている(p=0.0006、χ2分布)ことを意味する。他の例は、「細胞接着(cell adhesion)」(17個の遺伝子、p=0.0007)および「細胞構成(cell organization)および生物発生(biogenesis)」(22個の遺伝子、p=2.3 10-5)は、それぞれ、2.2倍と2.4倍過剰表示されることが分かった。さらに「免疫応答(immune response)」は、有意であった(p=8.7 10-5)が、上記の記述とは対照的に、「免疫応答」にリンクする遺伝子は、主に、カン(Kang)リストに由来した。
差次的発現遺伝子を、遺伝子オントロジーおよびKEGGデータベースに認められるものと比較した。KEGGデータベース注釈付きの、SAMリストからの遺伝子は、わずか8個であったので、そのリストを最近発表された骨転移プロファイルと合わせた。その研究では、カンら(Kang et al.)が、マウスに注入すると、骨への再発が不良、あるいは、効率的再発であったER-陰性乳癌細胞系MDA-MB-231のサブクローンからプロファイルを作成した。それらの2種のサブタイプ間の差次的発現遺伝子を骨再発シグネチャーと見なした。カンら(Kang et al.)は、上記の実施例で使用したものと同じマイクロアレーを使用したので、その127プローブセットリスト(122個のユニーク遺伝子)をSAM遺伝子リスト(n=69)と合わせるのが便利であった。2種のプロファイルは、1個の遺伝子(BENE)を共有するにすぎないが、それらは、共通の経路が関与する可能性がある。そのために、両リストをKEGGデータベース上にマッピングした。合計20個のKEGG-注釈付き遺伝子は、遺伝子20個中5個(FGF5, SOS1およびDUSP1(カン(Kang)リスト)およびFGFR3およびDUSP4 (SAM))をFGFR-p42/44 MAP-キナーゼ経路に配置した。この遺伝子数は、ランダムデータセットとは統計的に差がある(p＜0.0001)。5個の全遺伝子を、骨転移細胞/腫瘍で上方制御した。遺伝子オントロジーデータベースの注釈付きの、併記リストからの142個の遺伝子を検討した。U133aチップ上にプリントされた全遺伝子に比べて、遺伝子オントロジー記述が、併合SAM/カン(Kang)リストにおいて、過剰表示されたか否かを決定した。過剰表示注釈は、生物学的経路を指し示し、これが、再発部位にリンクすると思われる。例えば、「細胞外(extracellular)」という記述は、骨マーカーリストからの142個(14.8％)の遺伝子のうちの21個にリンクしたが、U133aチップの16367個の遺伝子のうちで、この記述に注釈付きであるのは、1350個(8.2％)であった。これは、「細胞外」が、骨再発リストで1.8倍過剰表示されている(p=0.0006、χ2分布)ことを意味する。他の例は、「細胞接着(cell adhesion)」(17個の遺伝子、p=0.0007)および「細胞構成(cell organization)および生物発生(biogenesis)」(22個の遺伝子、p=2.3 10-5)は、それぞれ、2.2倍と2.4倍過剰表示されることが分かった。さらに「免疫応答(immune response)」は、有意であった(p=8.7 10-5)が、上記の記述とは対照的に、「免疫応答」にリンクする遺伝子は、主に、カン(Kang)リストに由来した。
表12では、本明細書で参照した配列を識別する。
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〔実施の態様〕
(１) 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。
(２) 乳癌患者の病期を分類する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが乳癌病期を示す、段階と、
を含む、方法。
(３) 実施態様2に記載の方法において、
前記病期がTNMシステムによる分類に該当する、
方法。
(４) 実施態様2に記載の方法において、
前記病期が、類似遺伝子発現プロファイル(similar gene expression profiles)を有する患者に該当する、
方法。
(５) 乳癌患者治療プロトコルを決定する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが、骨での再発のリスクを十分に示し、骨での再発を防止または治療するために推奨される治療法の程度およびタイプを医師が決定できるようにする、段階と、
を含む、方法。
(６) 乳癌患者を治療する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の高リスクを示す、段階と、
c.前記患者が高リスク患者である場合、アジュバント療法、ビスフォスフォネート療法、または他の適切な療法で前記患者を治療する段階と、
を含む、方法。
(７) 実施態様1に記載の方法において、
バルク組織調製物が生検または手術標本から入手される、
方法。
(８) 実施態様1に記載の方法において、
前記マーカーが、SEQ ID NOs：112〜198に該当するもの全てを含む、
方法。
(９) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプル中に構成的に発現される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定する段階をさらに含む、
方法。
(１０) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプルのエストロジェンレセプター(ER)の状態を決定する段階をさらに含む、
方法。
(１１) 実施態様10に記載の方法において、
前記ERの状態が、ERの状態を示す少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定することによって決定される、
方法。
(１２) 実施態様11に記載の方法において、
前記ERの状態が、前記サンプル中のERの存在を測定することによって決定される、
方法。
(１３) 実施態様12に記載の方法において、
前記ERの存在が、免疫組織化学検査で測定される、
方法。
(１４) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプルが原発腫瘍から得られる、
方法。
(１５) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
特異性が少なくともほぼ40％である、
方法。
(１６) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
感度が少なくともほぼ90％である、
方法。
(１７) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記遺伝子の発現パターンが、骨での再発をきたした乳癌患者を示す発現パターンと比較される、
方法。
(１８) 実施態様17に記載の方法において、
前記発現パターンの比較が、パターン認識法で実施される、
方法。
(１９) 実施態様18に記載の方法において、
前記パターン認識法が骨再発予測因子スコア(bone relapse predictor score)の使用を含む、
方法。
(２０) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、非骨再発患者(nonbone relapsing patients)の細胞または組織と比較して、前記サンプル中で少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現(underexpression)である、
方法。
(２１) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、非骨再発患者の細胞または組織と比較して、転移細胞を有する前記サンプル中に少なくとも統計的に有意なp-値の過剰発現を有する、
方法。
(２２) 実施態様21に記載の方法において、
前記p-値が0.05未満である、
方法。
(２３) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレーまたは遺伝子チップで測定される、
方法。
(２４) 実施態様23に記載の方法において、
前記マイクロアレーがcDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーである、
方法。
(２５) 実施態様23に記載の方法において、
前記マイクロアレーまたは遺伝子チップが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
(２６) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出したRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施する核酸増幅によって決定される、
方法。
(２７) 実施態様26に記載の方法において、
前記PCRが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である、
方法。
(２８) 実施態様27に記載の方法において、
前記RT-PCRが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
(２９) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコード化されるタンパクを測定または検出することによって検出される、
方法。
(３０) 実施態様29に記載の方法において、
前記タンパクが、前記タンパクに特異的な抗体によって検出される、
方法。
(３１) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特性を測定することによって検出される、
方法。
(３２) 実施態様31に記載の方法において、
測定される前記特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異(mutation)および対立遺伝子変異(allelic variation)から成る群から選択される、
方法。
(３３) 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。
(３４) 乳癌予後を決定するアッセイの実施用キットにおいて、
生体サンプル中にマーカーを含む、
キット。
(３５) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
キット。
(３６) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
キット。
(３７) 実施態様35に記載のキットにおいて、
SEQ ID NOs 117〜198の1つ以上に該当するマーカーを含む、
キット。
(３８) 実施態様34に記載のキッにおいて、
SEQ ID NOs 112〜198の全てに該当するマーカーを含む、
キット。
(３９) 実施態様34に記載のキットにおいて、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
キット。
(４０) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または、前記核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、
キット。
(４１) 乳癌の病態を評価する用品において、
マーカーを含む、
用品。
(４２) 実施態様41に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
用品。
(４３) 実施態様41に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
用品。
(４４) 実施態様41に記載の用品において、
SEQ ID NOs 117〜198の1つ以上に該当するマーカーを含む、
用品。
(４５) 実施態様41に記載の用品において、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
用品。
(４６) 実施態様41に記載の用品においてにおいて、
前記核酸配列、その補体またはその一部をアッセイする媒体をさらに含む、
用品。
(４７) 実施態様1、2、5または6に記載の方法を実施するためのマイクロアレーまたは遺伝子チップ。
(４８) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
生体サンプルから乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
マイクロアレー。
(４９) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
マイクロアレー。
(５０) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
マイクロアレー。
(５１) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
マイクロアレー。
(５２) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーを含む、
マイクロアレー。
(５３) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
マイクロアレー。
(５４) 診断/予後ポートフォリオ(diagnostic/prognostic portfolio)において、
生体サンプル中の乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
ポートフォリオ。
(５５) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
ポートフォリオ。
(５６) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
ポートフォリオ。
(５７) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
ポートフォリオ。
(１) 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。
(２) 乳癌患者の病期を分類する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが乳癌病期を示す、段階と、
を含む、方法。
(３) 実施態様2に記載の方法において、
前記病期がTNMシステムによる分類に該当する、
方法。
(４) 実施態様2に記載の方法において、
前記病期が、類似遺伝子発現プロファイル(similar gene expression profiles)を有する患者に該当する、
方法。
(５) 乳癌患者治療プロトコルを決定する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが、骨での再発のリスクを十分に示し、骨での再発を防止または治療するために推奨される治療法の程度およびタイプを医師が決定できるようにする、段階と、
を含む、方法。
(６) 乳癌患者を治療する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の高リスクを示す、段階と、
c.前記患者が高リスク患者である場合、アジュバント療法、ビスフォスフォネート療法、または他の適切な療法で前記患者を治療する段階と、
を含む、方法。
(７) 実施態様1に記載の方法において、
バルク組織調製物が生検または手術標本から入手される、
方法。
(８) 実施態様1に記載の方法において、
前記マーカーが、SEQ ID NOs：112〜198に該当するもの全てを含む、
方法。
(９) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプル中に構成的に発現される少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定する段階をさらに含む、
方法。
(１０) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプルのエストロジェンレセプター(ER)の状態を決定する段階をさらに含む、
方法。
(１１) 実施態様10に記載の方法において、
前記ERの状態が、ERの状態を示す少なくとも1個の遺伝子の発現レベルを測定することによって決定される、
方法。
(１２) 実施態様11に記載の方法において、
前記ERの状態が、前記サンプル中のERの存在を測定することによって決定される、
方法。
(１３) 実施態様12に記載の方法において、
前記ERの存在が、免疫組織化学検査で測定される、
方法。
(１４) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記サンプルが原発腫瘍から得られる、
方法。
(１５) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
特異性が少なくともほぼ40％である、
方法。
(１６) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
感度が少なくともほぼ90％である、
方法。
(１７) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記遺伝子の発現パターンが、骨での再発をきたした乳癌患者を示す発現パターンと比較される、
方法。
(１８) 実施態様17に記載の方法において、
前記発現パターンの比較が、パターン認識法で実施される、
方法。
(１９) 実施態様18に記載の方法において、
前記パターン認識法が骨再発予測因子スコア(bone relapse predictor score)の使用を含む、
方法。
(２０) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、非骨再発患者(nonbone relapsing patients)の細胞または組織と比較して、前記サンプル中で少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現(underexpression)である、
方法。
(２１) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
前記所定のカットオフレベルが、非骨再発患者の細胞または組織と比較して、転移細胞を有する前記サンプル中に少なくとも統計的に有意なp-値の過剰発現を有する、
方法。
(２２) 実施態様21に記載の方法において、
前記p-値が0.05未満である、
方法。
(２３) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、マイクロアレーまたは遺伝子チップで測定される、
方法。
(２４) 実施態様23に記載の方法において、
前記マイクロアレーがcDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーである、
方法。
(２５) 実施態様23に記載の方法において、
前記マイクロアレーまたは遺伝子チップが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
(２６) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記サンプルから抽出したRNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施する核酸増幅によって決定される、
方法。
(２７) 実施態様26に記載の方法において、
前記PCRが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)である、
方法。
(２８) 実施態様27に記載の方法において、
前記RT-PCRが、1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
方法。
(２９) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子によってコード化されるタンパクを測定または検出することによって検出される、
方法。
(３０) 実施態様29に記載の方法において、
前記タンパクが、前記タンパクに特異的な抗体によって検出される、
方法。
(３１) 実施態様1、2、5または6に記載の方法において、
遺伝子発現が、前記遺伝子の特性を測定することによって検出される、
方法。
(３２) 実施態様31に記載の方法において、
測定される前記特性が、DNA増幅、メチル化、突然変異(mutation)および対立遺伝子変異(allelic variation)から成る群から選択される、
方法。
(３３) 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。
(３４) 乳癌予後を決定するアッセイの実施用キットにおいて、
生体サンプル中にマーカーを含む、
キット。
(３５) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
キット。
(３６) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
キット。
(３７) 実施態様35に記載のキットにおいて、
SEQ ID NOs 117〜198の1つ以上に該当するマーカーを含む、
キット。
(３８) 実施態様34に記載のキッにおいて、
SEQ ID NOs 112〜198の全てに該当するマーカーを含む、
キット。
(３９) 実施態様34に記載のキットにおいて、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
キット。
(４０) 実施態様34に記載のキットにおいて、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または、前記核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、
キット。
(４１) 乳癌の病態を評価する用品において、
マーカーを含む、
用品。
(４２) 実施態様41に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
用品。
(４３) 実施態様41に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
用品。
(４４) 実施態様41に記載の用品において、
SEQ ID NOs 117〜198の1つ以上に該当するマーカーを含む、
用品。
(４５) 実施態様41に記載の用品において、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
用品。
(４６) 実施態様41に記載の用品においてにおいて、
前記核酸配列、その補体またはその一部をアッセイする媒体をさらに含む、
用品。
(４７) 実施態様1、2、5または6に記載の方法を実施するためのマイクロアレーまたは遺伝子チップ。
(４８) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
生体サンプルから乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
マイクロアレー。
(４９) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
マイクロアレー。
(５０) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
マイクロアレー。
(５１) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
マイクロアレー。
(５２) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーを含む、
マイクロアレー。
(５３) 実施態様47に記載のマイクロアレーにおいて、
1種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
マイクロアレー。
(５４) 診断/予後ポートフォリオ(diagnostic/prognostic portfolio)において、
生体サンプル中の乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
ポートフォリオ。
(５５) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
ポートフォリオ。
(５６) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
ポートフォリオ。
(５７) 実施態様54に記載のポートフォリオにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
ポートフォリオ。
Claims (29)
- 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。 - 乳癌患者の病期を分類する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが乳癌病期を示す、段階と、
を含む、方法。 - 乳癌患者治療プロトコルを決定する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが、骨での再発のリスクを十分に示し、骨での再発を防止または治療するために推奨される治療法の程度およびタイプを医師が決定できるようにする、段階と、
を含む、方法。 - 乳癌患者を治療する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の高リスクを示す、段階と、
c.前記患者が高リスク患者である場合、アジュバント療法、ビスフォスフォネート療法、または他の適切な療法で前記患者を治療する段階と、
を含む、方法。 - 乳癌の病態を評価する方法において、
a.乳癌患者から生体サンプルを入手する段階と、
b.マーカーによって前記サンプル中の遺伝子の発現レベルを測定する段階であって、所定のカットオフレベル以上または以下の前記遺伝子の発現レベルが骨での再発の尤度を示す、段階と、
を含む、方法。 - 乳癌予後を決定するアッセイの実施用キットにおいて、
生体サンプル中にマーカーを含む、
キット。 - 請求項６に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
キット。 - 請求項６に記載のキットにおいて、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
キット。 - 請求項７に記載のキットにおいて、
SEQ ID NOs 117〜198の１つ以上に該当するマーカーを含む、
キット。 - 請求項６に記載のキットにおいて、
SEQ ID NOs 112〜198の全てに該当するマーカーを含む、
キット。 - 請求項６に記載のキットにおいて、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
キット。 - 請求項６に記載のキットにおいて、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または、前記核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、
キット。 - 乳癌の病態を評価する用品において、
マーカーを含む、
用品。 - 請求項１３に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116のいずれかに該当する、
用品。 - 請求項１３に記載の用品において、
前記マーカーがSEQ ID NO 112〜116の全てに該当する、
用品。 - 請求項１３に記載の用品において、
SEQ ID NOs 117〜198の１つ以上に該当するマーカーを含む、
用品。 - 請求項１３に記載の用品において、
マイクロアレー分析の実施用試薬をさらに含む、
用品。 - 請求項１３に記載の用品において、
前記核酸配列、前記核酸配列の補体、または、前記核酸配列の一部をアッセイする媒体をさらに含む、
用品。 - 請求項１、２、３または４に記載の方法を実施するためのマイクロアレーまたは遺伝子チップ。
- 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
生体サンプルから乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
マイクロアレー。 - 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
マイクロアレー。 - 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
マイクロアレー。 - 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
マイクロアレー。 - 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
cDNAアレーまたはオリゴヌクレオチドアレーを含む、
マイクロアレー。 - 請求項１９に記載のマイクロアレーにおいて、
１種類以上の内部対照試薬をさらに含む、
マイクロアレー。 - 診断／予後ポートフォリオにおいて、
生体サンプル中の乳癌の病態または骨での再発のリスクを特徴付けるのに十分なマーカーを含む、
ポートフォリオ。 - 請求項２６に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定または前記特徴付けが、少なくとも1.7倍の過剰発現または過少発現である、
ポートフォリオ。 - 請求項２６に記載のポートフォリオにおいて、
前記測定が、統計的に有意なp-値の過剰発現または過少発現を提供する、
ポートフォリオ。 - 請求項２６に記載のポートフォリオにおいて、
前記p-値が0.05未満である、
ポートフォリオ。
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