JP2005537790A - 新規診断および治療方法およびそのための試薬類 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子によってコードされる核たんぱく質の発現に関連する異常セルサイクル制御を検出または治療する新規方法類、および、そのために有用な新規試薬類に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子またはその発現産物を検出するための新規核酸およびたんぱく質性プローブ類に関し、前記遺伝子の発現または発現増加が癌、ＤＮＡ損傷および細胞に及ぼすプロゲステロンレセプター媒介効果に関連する腫瘍の出現または発生に関連している。本発明はまた、例えば、癌の診断または治療処置において、細胞増殖、ＤＮＡ損傷または細胞に及ぼすプロゲステロンレセプター媒介効果などの遺伝子の発現産物を検出または調節するための試薬類および方法類も提供する。

Description

本発明は、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子によってコードされる核たんぱく質の発現に関連する異常セルサイクル制御を検出または治療する新規方法類、および、そのために有用な新規試薬類に関する。さらに詳細には、本発明は、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子またはその発現産物を検出するための抗体類を含む新規核酸およびたんぱく質性プローブ類に関し、前記遺伝子の発現または発現増加が癌、ＤＮＡ損傷および細胞に及ぼすプロゲステロンレセプター媒介効果に関連する腫瘍の出現または発生に関連している。本発明はまた、例えば、癌の予防または治療処置において前記発現産物類（例 ｍＲＮＡ、たんぱく質またはたんぱく質−たんぱく質複合体類）を標的化するため、または（例 腫瘍中における）細胞増殖を低下させるため、または防止するためまたはプロゲステロンレセプター媒介効果を修飾するための試薬類および方法類に関する。本発明は、別の態様において、例えば、癌、ＤＮＡ損傷または細胞に及ぼすプロゲステロンレセプター媒介効果の診断または治療において前記遺伝子の発現産物類（例 ｍＲＮＡ、たんぱく質、またはたんぱく質−たんぱく質複合体類）を検出または修飾するための試薬類および方法類に関する。本発明は、さらに別の態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子の変異体および前記変異体を検出するための新規試薬類および方法類に関する。
１．一般
この明細書は、本文で請求の範囲の後に示したパテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．１）を用いて得たヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、インディケータ数値＜２１０＞の後に配列番号（例 ＜２１０＞１、＜２１０＞２、＜２１０＞３など）を付し、配列表に示した。各ヌクレオチド配列について配列の長さおよびタイプ（ＤＮＡ、たんぱく質（ＰＲＴ）など）および起源生物は、それぞれインディケータ数値領域＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞中に示した情報により示される。本明細書で述べたヌクレオチド配列は、用語“ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．”の後に配列番号を示す（例 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１は、＜４００＞１として示した配列表中配列を示す）。
本文に述べたヌクレオチド残基の名称は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢバイオケミカルノーメンクラチャーコミッション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の勧告にならい、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ｙはピリミジン残基を示し、Ｒはプリン残基を、Ｍはアデニンまたはシトシンを、Ｋはグアニンまたはチミンを、Ｓはグアニンまたはシトシンを、Ｗはアデニンまたはチミンを、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを、そしてＮは全てのヌクレオチド残基を示す。
本文では、用語“由来の”は、その起源から必ずしも直接得られたというわけでなくてもある特定の起源から特定の完全体を得ることができることを示唆するものと見なす。
他に特に断りがなければ本文全体を通して、用語“含む”、または“含む”または“含んでいる”のようなその変化体は、ある記載の段階または要素または完全体または段階類または要素類または完全体のある群を含むことを意味するが、他のいかなる段階または要素または完全体、または要素類または完全体類のグループを排除することを意味するものではない。
当業者は、本文に記載の発明を具体的に記載した以外にも変化させ修飾できることを理解するであろう。本発明は、このような変化または修飾物をも包含することが理解される。本発明はまた、この明細書に個別にまたはまとめて述べたかまたは示唆した段階、特徴、組成物または化合物のすべて、ならびに前記段階または特徴の全ての組み合わせまたはそのいかなる２種以上の組み合わせを含む。
本発明は、本文に記載の具体的態様によりその範囲を限定されることはなく、それらは、例示のためだけに記載されている。機能的に等価の産物類、組成物類および方法類は、本文に記載の発明の範囲に含まれることは明らかである。
２．関連技術の説明
過増殖性障害の簡便かつ迅速試験がかなりの臨床的有用性を有していることが広く認められている。このような試験は早期診断のために使用できるだけでなく、また、治療後の疾患再発を検出できる。しかし、例えば卵巣癌のような多くの過増殖性障害の診断は、一般的に、この疾患が後期進行段階に到達して初めて可能になる。これまで肺癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌および卵巣癌のような多くの癌についてマーカーが同定され、これらの重篤な疾患の診断および治療にさまざまな努力がなされている一方で、さらにマーカーと治療標的を明らかにする必要が実際にある。ヒトおよび他の哺乳類における過増殖性障害の早期検出と治療を促進するようなマーカーが実際必要とされている。過増殖性障害と対応する因子類を同定識別することが、診断マーカーの同定にとってまず必須である。
過増殖性障害では細胞分裂無制御が起こり、このことは、異常セルサイクル制御との関連を示唆していることは明らかである。異常シグナル伝達は、異常セルサイクル制御と癌のような過増殖性障害およびＤＮＡ損傷の出現に関連している。ＤＮＡ損傷と複製阻害に対応し、セルサイクル進行が重要なセルサイクル制御剤をコントロールすることによって阻止される。もしゲノム損傷が修復されずに放置されると、悪性変換または加齢、壊死またはアポトーシスによる細胞死を起こすことになる。
たとえば、ステロイドホルモン類の作用は一般に、細胞質から核へのホルモンレセプターの移動を起こすシグナル伝達カスケードを起こし、それによって、多くの細胞および組織機能に影響を及ぼす。コレステロール由来４−プレグナン−３，２０−ジオンであるプロゲステロンは、雌の繁殖サイクルの重要構成要素であり、排卵の各サイクルにおけるプロゲステロン血清血漿レベルが変化し、それが、標的組織中における生化学的および分子活性を媒介するのに役立ち、その結果、解剖学的および形態学的変化が起こる。プロゲステロンの分子標的は、細胞内プロゲステロンレセプター（ＰＲ）である。ＰＲは、数個の他のたんぱく質類および因子を含むヘテロコンプレックスとして細胞質に存在し、これは、ＰＲへテロコンプレックス（ＰＲＣ）と称されている。このＰＲは、分子シャペロン類、イムノフィリン類および熱ショックプロテイン類（ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ２７、およびｐ５９（ｈｓｐ５６）、ｐ４８およびｐ２３；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４、１９５６−１９６３、１９９４）により不活性な形態で維持されている。活性ＰＲはプロゲステロンに結合し核に移動し、そこで、転写因子として、プロゲステロン制御遺伝子中に存在する正統なＤＮＡ転写要素と結合する。プロゲステロン制御遺伝子類はまた、分化およびセルサイクル中で（Ｍｏｕｔｓａｔｓｏｕ ａｎｄ Ｓｅｋｅｒｉｓ， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１６、９９−１１５、１９９７）およびある癌でも認められている。
ＰＲＣのインビトロにおけるアセンブリには、ＰＲと少なくとも８個の成分との秩序だった相互作用が必要である。たとえば、ｈｓｐ７０はＰＲに結合し、そのリガンドとの相互作用を防止する；さらに、ｈｓｐ９０は、プロゲステロンが存在していないとＰＲによる核内転移を防止する（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１、３４０−３４４、１９９４）。ｈｓｐ７０とｈｓｐ９０の化学的修飾は、ＰＲ放出を起こす。他のシグナル類も、ｐ２３とｈｓｐ９０の相互作用に影響を及ぼす。インビトロにおけるＰＲＣアセンブリの拘束は、選択的ｈｓｐ９０結合剤ゲルダナマイシン（ＧＡ）によって阻止できる。ｈｓｐ９０とｐ２３を含むがプロゲステロンと結合しない中間ＰＲ複合体は、ＧＡ存在下で形成される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５、６８０４−６８１２、１９９５）。ｈｓｐ７０たんぱく質は変異腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３に結合し、結節のない乳癌組織中におけるＰＲ核内局在低下に関連していた（Ｅｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５４、３７５２−３７５７、１９９４）。
ユビキチン媒介たんぱく質分解が、セルサイクル進行のコントロール（Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４，１６５２−１６５９，１９９６； Ｄｒａｅｔｔａ，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６，８４２−８４６、１９９４； Ｎｅｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．１５， １３０１−１３１２，１９９６）、細胞性シグナルトランスダクション（Ｊｏａｎｚｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６， ３０９−３１２，１９９９；Ｊｏａｎｚｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０２， ５４９−５５２，２０００； Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４００， ６８７−６９３， １９９９），細胞のＤＮＡ損傷応答（Ｂｅａｕｄｅｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９、６９７２−６９７９、１９９９）および転写制御（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２、９３３−９４６、１９９８）を含む多くの重要細胞経路の制御に必要である。細胞中におけるユビキチン化経路が正しく稼動することが適切なシグナル伝達確保に重要な役割を果たし、それによって過増殖性障害の発展に対する保護を補佐している可能性が高いが、このホメオスタシスを維持する明らかな機構はまだ得られていない。
一般に、Ｅ６−ＡＰのＨＥＣＴドメインおよび関連たんぱく質類を有するたんぱく質類（Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、２５６３−２５６７、１９９５；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３、１２１４８−１２１５４、１９９８）がユビキチンの基質たんぱく質への共有結合を触媒するユビキチン化カスケードに関与し、それによって、蛋白分解用に基質たんぱく質を標的化するユビキチンたんぱく質リガーゼ類（Ｅ３酵素類）サブクラスを形成すると考えられている。ＲＩＮＧドメインを含むユビキチンリガーゼ類と異なり、ＨＥＣＴドメインを含む酵素類は、ＨＥＣＴドメイン内の保存システイン残基により可逆的にユビキチンに結合し、直接、ユビキチンを基質たんぱく質に移動させる（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７３、８１−８３、１９９５）。
カルボキシル基末端ＨＥＣＴドメインが存在することに基づき、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖するプロゲスチン誘発遺伝子（以下“Ｅｄｄ”）は、ヒトＥ３酵素として関心を集めてきた（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。しかし、Ｅｄｄ遺伝子によってコードされるこのたんぱく質（ＥＤＤ）の細胞機能詳細については、まだわかっていない。
インビトロ翻訳ＥＤＤたんぱく質の生化学的性質は、それがヒトＥ３酵素であるという証拠を示した（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）が、このたんぱく質の細胞基質類についてはまだ明確になっていない。ＥＤＤたんぱく質の細胞下局在もまた、わかっていない。Ｅｄｄ遺伝子発現のプロゲスチン応答がプロゲスチン媒介シグナル伝達経路またはプロゲスチン応答腫瘍化におけるＥＤＤたんぱく質の一般的役割を示唆しているにもかかわらず、このような経路においてＥＤＤに結合する特定たんぱく質類はまだ明確に示唆されてこなかった。このような効果の媒介に関与するかもしれないＥｄｄ遺伝子の具体的発現パターンまたはＥｄｄ座の変異についても、これまで全く示唆されていない。さらに、このＥｄｄ遺伝子の非プロゲスチン媒介細胞効果についても、なんら示唆されてこなかった。
本発明者らは、本発明につながる研究において、さまざまな腫瘍におけるＥｄｄ遺伝子の発現パターンを調べ、細胞中におけるＥＤＤたんぱく質の基質を決定し、さらにマウスモデルにおけるＥｄｄ遺伝子発現を標的にすることによって、さらにヒト細胞株における阻害性ＲＮＡ手法を用いることによって、ＥＤＤたんぱく質の役割を解明しようとした。本発明者らは、驚くべきことに、Ｅｄｄ遺伝子発現上昇がプロゲスチン応答性およびプロゲスチン非応答性腫瘍化に関連していることを見出し、Ｅｄｄ遺伝子発現を低下させるかまたは阻害することによって細胞が阻害されることを見出した。増殖におよぼすこの効果に付随して、アポトーシスに及ぼす効果もある。細胞増殖に及ぼす効果および細胞に対するアポトーシス効果はＥＤＤにより媒介されるが、これらは緊密に関連している。これらのデータは、異常セルサイクル制御の同定、ならびに例えば過増殖性障害の治療におけるようにセルサイクルの修飾におけるＥｄｄ遺伝子ならびにＥＤＤたんぱく質の一般的有用性を示唆している。
本発明者らは、また、ＥＤＤたんぱく質の多くの核たんぱく質基質類を、プロゲステロン媒介シグナル伝達、腫瘍抑制またはＤＮＡ損傷に関与する酵母ツーハイブリッドスクリーン類を用いて明らかにした。細胞増殖制御におけるＥｄｄ遺伝子発現の重要役割を考慮すれば、これらのデータは異常セルサイクル制御と過増殖性障害のような下流での効果を識別するための極めて特異的な手段を提供する。たんぱく質−たんぱく質相互作用は、また、セルサイクルを調節する化合物類を決定するための極めて特異的な手段を提供する。
したがって、本発明の１つの見地は、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、前記対象試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルまたはその発現産物を決定することを含み、前記核酸または前記ポリペプチドのレベル増加が前記対象における癌を示唆することを特徴とする。
本発明は、１態様において、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）前記対象から得た被験試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルを決定すること；および
（ｉｉ）健常または正常個人から得た参考試料中における前記核酸レベルと（ｉ）における核酸レベルを比較すること
を含み、正常または健常個人の参考試料に対して被験試料中で上昇している（ｉ）における核酸レベルが、前記対象における癌細胞の存在を示唆することを特徴とする。
本発明は、別の態様において、ヒトゲノム領域における対立遺伝子アンバランスを検出するための方法を提供し、前記方法は、ゲノムＤＮＡと核酸プローブまたはプライマーをハイブリダイズさせハイブリダイゼーションを検出することを含み、前記プローブまたはプライマーが、
（ｉ）配列番号５に記載の配列；
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載の配列；
（ｉｖ）配列番号２４に記載の配列；
（ｖ）配列番号２５に記載の配列；および
（ｖｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列
から構成される群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた別の態様において、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）前記対象から得た被験試料中において発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルを決定すること；および
（ｉｉ）健常または正常個人から得た参照試料中で発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルと（ｉ）で決定したｍＲＮＡレベルを比較すること、
を含み、
健常または正常個人から得た参照試料に対して被験試料中で上昇した（ｉ）におけるｍＲＮＡレベルが前記対象中における癌細胞の存在を示唆することを特徴とする。
本発明は、さらに別の態様において、対象における癌を診断するかまたは癌再発を予想する方法を提供し、前記対象試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベルを決定することを含み、前記ｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベル上昇が、前記対象における癌の再発を示唆することを特徴とする。
ひとつの態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡは、ＥＤＤたんぱく質をコードする。好適には、前記ｍＲＮＡは、配列番号１または配列番号３に記載の配列、またはその断片を含む。非常に好適には、前記ｍＲＮＡは、配列番号２または配列番号４に記載の配列またはその断片を含むたんぱく質をコードする。
ひとつの態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるたんぱく質は、ＥＤＤたんぱく質である。好適には、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるたんぱく質は、配列番号２または配列番号４に記載の配列またはその断片を含む。
本発明のさらにひとつの見地は、本文に記載の態様による癌検出用新規核酸プローブ類に関する。
さらに本発明のさらなる見地は、単離されたかまたは組み換えたんぱく質複合体を提供し、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質または腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質部分；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質、または前記ＥＤＤたんぱく質若しくはＥＤＤたんぱく質の前記部分に結合するのに充分な前記たんぱく質部分
を含む。
本発明のさらに別の態様では、単離ペプチド類、ポリペプチド類、抗体類および本発明のＥＤＤ含有たんぱく質複合体に結合する他のリガンド類、および前記たんぱく質複合体を産生するためまたはＥＤＤまたはＥＤＤ部分と、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質またはその部分から構成される群から選択される１種以上の他のポリペプチド類との生物的相互作用の調節剤を同定するためのこれらを含むキット類を提供する。
本発明の別の態様では、適切な細胞源由来のＥＤＤ結合たんぱく質またはそれを含む複合体を単離する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、本文に記載のたんぱく質複合体を組み換え手段によって産生させる方法を提供する。組み換え手段によってペプチド類またはポリペプチド類を発現させるため、たんぱく質をコードするヌクレオチド配列がプロモータまたは無細胞系または細胞系における発現制御可能制御配列と機能可能なように連結して配置されている。
本発明の別の態様では、疾患素質または疾患状態を決定するための予想および診断方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質
を含むたんぱく質複合体を検出することを含む。
さらに本発明の態様は、単離されたまたは組み換えたんぱく質複合体の活性、形成または安定性の調節剤を決定する方法を提供し、前記たんぱく質複合体は、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質または腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合できるＥＤＤたんぱく質部分；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質、または前記ＥＤＤたんぱく質若しくはＥＤＤたんぱく質の前記部分に結合するのに充分な前記たんぱく質部分
を含む。
本発明は、別の態様において、細胞中におけるＥＤＤたんぱく質の発現増加に関連する状態を治療するための方法を提供し、前記方法は、細胞中におけるＥＤＤ発現レベルまたはＥＤＤ発現産物レベルを低下させるために有効な量の化合物を投与することを含む。
本発明はさらに別の態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子変異体および前記変異体を検出するための新規試薬類および方法類に関する。
核酸による診断および新規核酸類
本発明の１態様は、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、前記対象試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルまたはその発現産物を決定することを含み、前記核酸または前記ポリペプチドのレベル増加が前記対象における癌を示唆することを特徴とする。
本文では、用語“癌細胞”とは、単離レベルまたは純度にかかわらず癌細胞を含む全ての生物標本または試料を含み、例えば、初期形質転換段階の細胞または形質転換された細胞を含む組織、臓器、細胞株、体液または組織標本類である。体液は、全血、血清、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）またはバフィーコート分画を含むと理解される。
ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する単離核酸またはその発現産物は、非癌細胞に比較して癌細胞中で高いレベルで存在している。
“癌細胞”の定義は、癌細胞が由来する対象における癌の段階に限定されない（前記患者が寛解中であるとか疾患再発中であるとかにかかわらず、または癌が原発腫瘍であるかまたは転移の結果であるかにかかわらない）。さらに、用語“癌細胞”は、前記癌細胞のセルサイクル段階に限定されない。
ひとつの態様において、前記癌細胞は、由来が上皮性である（すなわち、カルシノーマ）。
前記癌細胞は、別の態様において、卵巣癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、頭頸部の扁平細胞癌、舌の扁平細胞癌、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌の転移、メラノーマの転移、転移性メラノーマの転移、頭頸部の扁平細胞癌の転移、舌の扁平細胞癌の転移、肝細胞癌の転移および乳癌の転移から構成される群から選択される癌由来である。
本文では、用語“卵巣癌”は、上皮起源のいくつかの癌類のいずれか１種以上を称するとみなすべきであり、例えば、漿液性、粘液性、類内膜、クリアセル、乳頭漿液性、ブレナーセルまたは未分化アデノカルシノーマのようなものである。用語“乳癌”は、管性カルシノーマまたは葉性カルシノーマを称すると理解すべきである。用語“肝細胞癌”とは、肝転移から構成される他の肝癌タイプと明確に異なる肝細胞由来の全てのカルシノーマを意味すると理解すべきである。用語“メラノーマ”および“扁平細胞癌”とは、メラニン細胞および扁平細胞のそれぞれの上皮癌類と理解されるであろう。“転移性メラノーマ”とは、メラニン細胞中で生じ、リンパ節および他の体臓器に転移しているメラノーマの最も進行した段階である。
本発明のこの態様は、マップ位置８ｑ２２．３のヒトゲノムの領域近辺において数種の腫瘍タイプの対立遺伝子アンバランスがかなりみられるという、本発明者らの知見によって予想される。特に、このヒトゲノム領域における対立遺伝子アンバランスは、腫瘍３７例中１４例で本発明者らが見出し、前記対立遺伝子アンバランスには、８ｑ２２．３とより広範囲の８ｑ異常を含むアンバランスの分離領域を含む。本発明者らは、対立遺伝子アンバランスが卵巣癌（例 漿液性サブタイプ）、肝細胞癌、舌の扁平細胞癌、乳癌および転移性メラノーマの症例で頻度が高いことを見出した。本発明者らはまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＥＤＤをコードするｍＲＮＡの発現レベルが、乳癌のような癌で頻繁に高いことを見出した。乳癌の場合、Ｅｄｄ遺伝子高発現がＥｄｄ座の増幅に関連していた。このゲノム領域において緊密に関連する遺伝子は、すなわちｐ５３リボヌクレオチドレダクターゼ（ｐ５３Ｒ２）をコードし、これが、癌細胞株で過剰に発現しかつ増幅されることを本発明者らは見出した。したがって、本発明の態様は、ＥＤＤコード核酸の検出に限定されない。
本文では、用語“ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３”とは、ＥＤＤたんぱく質をコードし好適には第１エクソン位置が約８ｑ２３であるクロモゾーム８上にセントロメア配向を有するゲノム遺伝子を含むヒトゲノム領域を称すると理解される。当業者は、“ゲノム遺伝子”が、たんぱく質コード領域（すなわち、エクソン類）と非コード領域（すなわち、プロモータのような５’上流制御領域および５’非翻訳領域、介在配列類またはイントロン類、および３’非翻訳領域）を両者ともに含むことに気づくであろう。したがって、ＥＤＤたんぱく質をコードするゲノム遺伝子は、これらすべての面を含み、単に、そのたんぱく質コード部分のみを含むものではない。
“ＥＤＤたんぱく質”とは、配列番号２または４に記載の配列に少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。命名目的のため、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる第１ＥＤＤたんぱく質に関し、これは、公表された国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９８／００２８０に開示されている。配列番号４に記載の配列は、スプライスバリアントによってコードされる新規ＥＤＤポリペプチドに関し、このバリアントは、配列番号１のヌクレオチド１８個を欠失している。したがって、配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２由来の配列ＶＬＬＬＰＬを含むアミノ酸６個を欠失していることが違っている。好適には、配列番号２または４に対する同一性百分率は、少なくとも約９０％であり、さらに好適には少なくとも約９５％または少なくとも約９９％である。２個のアミノ酸配列がこれらの定義した同一性百分率の限界内であるかどうかを決定するに際して、当業者は、アミノ酸配列をひとつずつ比較することが必要であるとわかるであろう。このような比較または整列において、整列させるために用いたアルゴリズムによって同一でないアミノ酸残基の位置に相違が生じるであろう。本文では２個以上のアミノ酸配列間の同一性または類似性百分率に言及している際には、当業者に公知のいかなる標準的アルゴリズムを用いて決定した前記配列間の同一および類似残基類の数について、それぞれ述べていると見なすべきである。特に、アミノ酸同一性および類似性は、コンピュータジェネティックスグループ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２、３８７−３９５、１９８４）のＧＡＰプログラムを用いて計算され、このプログラムでは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３、１９７０、またはこれとは別に複数整列用Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０、１９９４のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを用い、同一／類似アミノ酸の数を最大にしかつ前記整列における配列ギャップの数および／または長さを最小にする。
ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３「に連鎖する」核酸が、従って、前記核酸と前記ゲノム遺伝子間の組み換え頻度の高さからＥＤＤたんぱく質をコードするゲノム遺伝子に充分に近接し連鎖を示唆していることが、これまでの説明から明らかであろう。当業者には公知であろうが、ＤＮＡ上での２個のマーカーの組み換え頻度は、前記マーカーが遠く離れていればいる程高くなり、最後に、分離群におけるマーカー間の関連が連鎖していないと見なされる程度にまで無作為になる。
ひとつの態様において、マップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸は強く連結しており、前記核酸とＥＤＤポリペプチドをコードするゲノム遺伝子間の組み換え頻度が低いほどである。好適には、前記核酸は、それ自体ヒト染色体の８ｑ２２．３と８ｑ２４．１３の領域に位置しているであろうが、少なくともゲノムＥｄｄとｐ５３Ｒ２遺伝子類またはその部分を含んでいる。
特に断らなければ、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する全ての核酸の発現産物は、本発明の文脈範囲において癌の診断に有用であり、Ｅｄｄ遺伝子の発現産物類またはｐ５３Ｒ２遺伝子の発現産物を含む。本文では、用語“発現産物”とは、スプライス変異体を含む非処理または処理ｍＲＮＡのようなゲノム遺伝子の全ての転写産物、または前駆体ポリペプチド、処理ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む複合体のような全ての翻訳産物を称すると理解されたい。たとえば、ＥＤＤポリペプチドを含むたんぱく質−たんぱく質複合体またはＤＮＡ−たんぱく質複合体は、明らかに、本文で使用した用語“Ｅｄｄ遺伝子の発現産物”または類似用語の範疇に入る。同様に、ｐ５３Ｒ２ポリペプチドを含むたんぱく質−たんぱく質複合体またはＤＮＡ−たんぱく質複合体は、明らかに、本文で使用した用語“ｐ５３Ｒ２遺伝子の発現産物”または類似用語の範疇に入る。
先の検討から、本発明が提供する診断方法が、一方では癌細胞を含む疑いのある組織中においてヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルを調べ、または他方では前記核酸の発現産物レベルを調べるために、ある程度の定量化を必要とすることが明らかであろう。このような定量化は、下記に記載のアッセイ中に健常または正常個人由来の適切な参照試料を含めることで簡単にできる。
したがって、前記参考試料は、ひとつの態様において、個人が健常であるかまたは疾患が寛解した時点で採取した同一対象からの細胞または組織を含む。さらに別の態様において、前記参考試料は、健常または正常個人からの細胞または組織を含む。これらの両者の態様において、前記参考試料および被験試料は両者とも、同一時点である必要は必ずしもないが、処理後に両試料から得たデータを比較する。
これとは別に、もし参考試料が実施した各アッセイに含まれていないならば、前記参考試料は健常または正常個人から得た確立データ群から取ることもできる。したがって、ひとつの態様において、前記参考試料は、例えば、完全体の健常範囲についての統計的有意データを試験するなど、健常個人の試料集団研究からのデータを含む。この態様によれば、参照および被験試料を比較するのは、被験試料解析後に実施し、被験試料から得られたデータを試料群から得られたデータと比較することを含む。
本文脈において、用語“健常個人”とは、癌にかかっていないことがわかっている個人を意味し、このような知識は、限定するわけではないが、本文で記載のそれと異なる癌アッセイを含む個人についての臨床データに由来している。本発明は特に癌の早期発見に有用であるので、健常個人が、特定癌に関連する早期症状に関して無症状であることが望ましい。卵巣癌の場合、周知手技を用いた早期発見はむずかしいが、排尿頻度低下、結腸圧低下、および腹部鼓腸および膨満の低下が、その早期段階にある本疾患と関連しており、その結果、健常個人はこうした症状をひとつも有していない。また、このような“健常対象”がこれらの疾患に関連した多くのリスク因子を有していないことが望ましい。原発性乳癌の早期段階または乳癌の発症しやすさの指標類には、例えば、家族歴、異型過形成、胸部良性状態の発生、特に４５歳以上の女性における胸部密度増加、放射線被曝および異常胸部外見などが含まれる。原発性肝細胞癌の早期段階またはそれにかかりやすさの指標には、例えば、肝硬変、慢性Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎感染、アフラトキシン高含量の食事、腺腫性過形成、腹部（肝）痛または膨満、腹水、脾臓腫脹、ヘモクロマトーシス、アルファ−１−アンチトリプシン欠損、グリコーゲン貯留疾患およびチロシン血症などが含まれる。原発性メラノーマまたは扁平細胞癌の早期段階またはこれらの疾患にかかりやすさの指標には、例えば、皮膚外観の変化、特に太陽に長期にわたりさらされたことまたは放射線損傷に関連している変化、喫煙または噛みタバコ歴、光線性角化症および外陰白板症が含まれる。これら癌のいずれか１つ以上に関連する、例えば皮膚、口腔、咽頭、網、腹部、腹水、リンパ節、肺、肝、脳または骨への転移のような後期症状に苦しんでいる対象または脊髄圧迫、腹部痛または膨満、カルシウムレベル上昇、血清アルファフェトプロテイン増加、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子類または遺伝子発現の変化、慢性痛、または肋骨滲出に苦しんでいる対象もまた、“健常個人”データ群から排除すべきである。
用語“正常個人”とは、前記個人由来の特定試料中においてＥｄｄ遺伝子発現産物レベルが正常な個人を意味すると理解される。当業者には公知であろうが、充分に大きい集団試料から得たデータを正規化し、特定パラメータについて平均レベル決定のためのデータ群を作製できる。従って、Ｅｄｄ遺伝子発現レベルは、いかなる個人集団についても調べることができ、さらに、前記個人由来のいかなる試料についても調べることができ、アッセイした試料について決定した発現産物レベルをその後、比較する。このような正規化したデータ群が信頼できる時には、変動を調製するために行う各アッセイにおいて内部対照を含めるのが望ましい。
本発明は、１態様において、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）前記対象から得た被験試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルを決定すること；および
（ｉｉ）健常または正常個人から得た参照試料中における前記核酸レベルと（ｉ）における核酸レベルを比較すること
を含み、正常または健常個人の参照試料に対して被験試料中で上昇している（ｉ）における核酸レベルが、前記対象における癌細胞の存在を示唆することを特徴とする。
前記試料は、好適には、ある組織、または皮膚、口腔組織、胸部、肝、脾臓、卵巣、前立腺、腎臓、子宮、胎盤、頸管、網、結腸、脳、骨、肺、リンパ、尿、精子、血液、腹水および血清から構成される群から選択した組織由来の細胞を含む。このような組織または細胞由来の細胞調製物または核酸調製物は、排除されない。前記試料を固体マトリックス上に調製し、組織分析を行うか、または、これとは別に、例えば、抽出緩衝液または懸濁緩衝液のような適当な溶液中で調製でき、本発明がこのように調製した生物溶液試験にも拡大できることは明らかである。
好適には、本態様に従って求めた核酸は、ゲノムＤＮＡである。本発明のこの態様は、従って、癌診断としてヒトゲノムの本領域中における対立遺伝子アンバランスを調べるために特に適している。
核酸レベル決定のため、当技術で周知の例えばインサイチュハイブリダイゼーション、ミクロサテライトアナリシス、およびミクロアレイ技術などさまざまなプロトコールも、例えば、核酸プローブをプローブとした組織ミクロアレイ、または核酸プローブをプローブとした核酸ミクロアレイ（すなわち、ゲノムＤＮＡミクロアレイまたは増幅ＤＮＡミクロアレイ）を用いて利用できる。このようなアッセイフォーマット全てが、本発明に包含される。たとえば、癌リスクが高い、特にヒト対象等の対象の公衆衛生スクリーニングのような多数の試料のスクリーニングを高処理速度で行うため、ミクロアレイ技術は好適なアッセイフォーマットである。当業者にはわかるであろうが、核酸ハイブリダイゼーションに基づくかまたは増幅に基づく手法としてミクロサテライトアナリシスなどがあるが、これらは、容易にミクロアレイ技術に適応させることができる。
好適な態様において、核酸レベルは、少なくとも低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で被験試料中のＥＤＤたんぱく質をコードするゲノムＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイズさせることおよび検出手段を用いてこのハイブリダイゼーションを検出することによって、求める。同様に、健常または正常個人から得た参照試料中ＥＤＤたんぱく質をコードするゲノムＤＮＡレベルは、少なくとも低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で前記参照試料中のＥＤＤをコードするゲノムＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイズさせることおよび検出手段を用いてこのハイブリダイゼーションを検出することによって、求める。
核酸ハイブリダイゼーションに基づく手法のため、長い核酸プローブよりも短いプローブを低緊縮ハイブリダイゼーション（すなわち、低温度および／または高塩濃度および／または高界面活性剤濃度）でハイブリダイズさせる。一般的に、ハイブリダイゼーションは、前記プローブを含むＤＮＡ二重鎖の理論的融点（Ｔｍ）よりもはるかに低い温度で行う。たとえば、本文に例示したオリゴヌクレオチドプローブ類は、約５５℃から約６０℃の範囲のＴｍ計算値を有し、このことは、このようなプローブを必要とするハイブリダイゼーションは、室温から約４５℃、好適には約４０℃から約４５℃（すなわち、低緊縮から中度緊縮条件）の範囲の温度で実行しなければならない。この条件は、ヌクレオチド約１００個よりも長い核酸プローブ類について約６５℃の標準的ハイブリダイゼーション温度（すなわち、中度から高度緊縮ハイブリダイゼーション条件）と対照的である。
これらの診断アッセイに使用すべき緊縮レベルを定義する目的で、本文では、低緊縮を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を２８℃の６×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳまたは等価条件下で行うことと定義する。中度緊縮とは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を４５℃から６５℃の範囲の温度で２×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳまたは等価条件下で行うことと定義する。高度緊縮とは、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を少なくとも６５℃の温度で０．１×ＳＳＣ緩衝液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳまたはより低い塩濃度または等価条件下で行うことと定義する。本文で特定レベルの緊縮に言及する際には、当業者に公知のＳＳＣ以外の洗浄／ハイブリダイゼーション溶液を用いる等価条件を包含する。
一般的に、前記緊縮は、ＳＳＣ緩衝液濃度を下げるかおよび／またはＳＤＳ濃度を高めるか、および／またはハイブリダイゼーションおよび／または洗浄温度を高めることによって高める。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を、試料ＤＮＡ支持に用いたハイブリダイゼーションマトリックスの性質または使用したハイブリダイゼーションプローブの種類に応じて変化させることができることがわかるであろう。
ひとつの態様において、前記試料またはプローブを固体マトリックスまたは表面（例 ニトロセルロース）に固定する。高処理スクリーニングのため、前記試料またはプローブは、一般に、ガラスまたは他の固体マトリックス上の核酸アレイを含み、例えば、ＷＯ９６／１７９５８に記載されている。高濃度アレイ作製技術は、例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３、１９９１および米国特許５，１４３，８５４に記載されている。他のアッセイフォーマットの典型的プロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、Ｕｎｉｔ４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）およびＵｎｉｔ１８（ＰＣＲ分析）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． Ａｕｓｕｂｕｌ ｅｔ ａｌ．（編著）、１１９５でわかる。
本発明のこの見地による検出手段は、例えば、核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅反応（例 ＰＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）システム、逆ポリメラーゼチェーン反応（ｉＰＣＲ）またはインサイチュポリメラーゼチェーンリアクションのようないかなる核酸ベース検出手段であってもよい。
前記プローブには、同定可能なシグナルを産生するレポーター分子（例 32Ｐ、35Ｓのような放射性同位元素、または蛍光またはビオチン化分子またはＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＲＯＣなどのような着色色素）により標識できる。この態様によれば、当業者は、前記レポーター分子の検出により、ハイブリダイゼーション反応の後に前記プローブの同定ができ、試料中の対応するヌクレオチド配列の検出が円滑になることに気づく。さらにプローブを用いて、単一プローブを用いて得たアッセイ結果を確認できる。
前記検出手段が、例えばポリメラーゼチェーン反応または核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）システムまたはその修飾物のような増幅反応である場合、少なくとも長さが約２０個の隣接ヌクレオチド類の１種以上の核酸プローブ分子をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、前記テンプレートの核酸コピーを酵素的に増幅する。
当業者は、前記プローブと試料テンプレート分子のヌクレオチド配列に充分に高いヌクレオチド配列同一性が、ハイブリダイゼーションが起こるために必要であることがわかるであろう。先にも述べたように、緊縮条件を選択し、ハイブリダイゼーションを促進できる。
ひとつのフォーマットにおいて、ハイブリダイズしたプローブが干渉領域における核酸の５’から３’への合成を熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の制御下に促進するように位置するように、核酸ＰＣＲは、非相補性プローブ類が二重鎖核酸テンプレート分子（すなわち、ＤＮＡ／ＤＮＡテンプレート）の異なる鎖にハイブリダイズすることを必要とする。本態様によれば、本文に述べたように、１個のセンスプローブと１個のアンチセンスプローブを用いる。
本文に記載の態様のバリエーションが、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．（シリーズ編著、Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ およびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ１−２５３、１９９１によって詳細に記載されている。
前記プローブは、ひとつの態様において、非コード核酸（すなわち、イントロン、５’上流領域または３’非翻訳領域）を検出する。例示のため、配列番号５と６に記載のヌクレオチド配列を用いて、卵巣癌、肝細胞癌、乳癌、扁平細胞癌および転移性メラノーマに関連する８ｑ２２．３と８ｑ２４．１３との間のマップ位置のヒトゲノム領域における対立遺伝子アンバランスをうまく検出する“ＣＥＤＤ”と称されるミクロサテライトを含む核酸を増幅させる。ミクロサテライトＣＥＤＤはまた、漿液性卵巣癌を他の上皮起源の卵巣癌からうまく識別する。
ミクロサテライトＣＥＤＤを含む増幅産物のヌクレオチド配列を配列番号７に記載し、当業者に公知のように、この増幅断片もまた、上記癌、特に卵巣癌診断目的のため本文に記載のアッセイフォーマットにより対象のゲノムＤＮＡに直接ハイブリダイズさせるために有用である。
本文の他の例示的態様において、本発明は、明らかに、乳癌検出のためヒトゲノムのこの領域における対立遺伝子アンバランス検出のため核酸プライマー類および増幅されたプローブ類（例 配列番号２４および２５）を提供するが、これらは、ＥＤＤたんぱく質をコードする遺伝子のイントロン領域を増幅する。ＣＥＤＤミクロサテライトについて述べたように、配列番号２４および２５に記載のプライマー類を用いて増幅した核酸は、ハイブリダイゼーションプローブとして有用であり、本発明はこのような用途も包含することが明らかである。
ひとつの態様において、上記に述べた増幅反応検出手段をさらに旧来のハイブリダイゼーション反応検出手段に結合させ、前記増幅反応に用いたプローブのいずれとも異なるプローブによる増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせることによるなどのように、本発明の感度ならびに特異性をさらに増加させる。
別の態様において、上記で述べた前記ハイブリダイゼーション反応検出手段をさらに、前記第１ハイブリダイゼーション反応に用いたプローブと異なるプローブを用いる第２のハイブリダイゼーション段階に結合させる。
本発明により実施すべき比較には、プローブ産生シグナルの肉眼的比較、またはこれとは別に、例えばサンプル間変動を許容するために補正または正規化したデータのようなシグナルから積算したデータの比較ができる。このような比較は、当業者によって容易に実施できる。
本方法は、ひとつの態様において、さらに、ひとつ以上の適切な対象（すなわち、被験個人および／または参考試料提供に適したひとつ以上の対象）由来被験試料および／または参考試料を単離することを含む。この点において、参考試料および被験試料を同一対象から異なる時点で単離すること、または同一対象の異なる組織から単離することも本発明の範囲に含まれる。好適には、前記被験試料および参考試料は、同一組織種類または同一種類の細胞を含む組織由来である。
ひとつの態様において、被験試料および／または参考試料（類）は、対象（類）から先に得られている。
本発明は、別の態様において、対象における癌を診断するかまたは癌再発を予想する方法を提供し、前記対象試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベルを決定することを含み、前記ｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベル上昇が、前記対象における癌の再発を示唆することを特徴とする。
ひとつの態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡは、ＥＤＤたんぱく質をコードする。好適には、前記ｍＲＮＡは、配列番号１または配列番号３に記載の配列、またはその断片を含む。非常に好適には、前記ｍＲＮＡは、配列番号２または配列番号４に記載の配列またはその断片を含むたんぱく質をコードする。
ひとつの態様において、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるたんぱく質は、ＥＤＤたんぱく質である。好適には、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるたんぱく質は、配列番号２または配列番号４に記載の配列またはその断片を含む。
マップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡまたはたんぱく質の量を決定する方法は、当該技術において周知でありおよび／または本文に記載されている。
本文に例示したように、ＥＤＤ ｍＲＮＡおよびＥＤＤたんぱく質の発現レベルは、卵巣癌の治療を受けた対象における前記癌の再発を予測する。本文では、用語“再発”または“再燃”は、癌の治療後対象がさらに癌を発生させることを意味するとして理解される。再発した癌は、患者が治療を受けた癌と同一形状であることもあるし、または転移した癌の症例の場合のように異なる形状の癌であることもある。
別の態様において、本発明は、ヒトゲノム領域における対立遺伝子アンバランスを検出するための方法を提供し、前記方法は、ゲノムＤＮＡと核酸プローブまたはプライマーをハイブリダイズさせそのハイブリダイゼーションを検出することを含み、前記プローブまたはプライマーが、
（ｉ）配列番号５に記載の配列；
（ｉｉ）配列番号６に記載の配列；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載の配列；
（ｉｖ）配列番号２４に記載の配列；
（ｖ）配列番号２５に記載の配列；および
（ｖｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｉ）から（ｖ）のいずれか１つを用いて増幅産生された核酸断片の配列
から構成される群から選択されたヌクレオチド配列を含む。
核酸検出のための上述の態様類は、本発明のこの態様に対して必要な変更を加えて適用されるべきである。好適には、前記ハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ反応において前記プローブまたはプライマーを用いて核酸を増幅するかまたは前記プローブを適当なレポーター分子で標識し、このレポーター分子が産生したシグナルを検出することによって、検出する。
本発明はまた別の態様において、対象における癌細胞を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）前記対象から得た被験試料中において発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルを決定すること；および
（ｉｉ）健常または正常個人から得た参照試料中で発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルと（ｉ）で決定したｍＲＮＡレベルを比較すること、
を含み、
健常または正常個人から得た参照試料に対して被験試料中で上昇した（ｉ）におけるｍＲＮＡレベルが前記対象中における癌細胞の存在を示唆することを特徴とする。
ひとつの態様において、前記ｍＲＮＡはＥＤＤたんぱく質をコードする。別の態様において、前記ｍＲＮＡは、ｐ５３Ｒ２たんぱく質をコードする。
用語“ＥＤＤたんぱく質をコードするｍＲＮＡ”とは、配列番号２または４と少なくとも約８０％の同一性を有するＥＤＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡを意味し、さらに好適には配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、さらに好適には少なくとも約９５％およびさらに好適には少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを意味する。
ヒトゲノムのこの領域における対立遺伝子アンバランスを検出するための上記で述べた組織試料、一般的ハイブリダイゼーションおよび増幅方法、および検出および分析方法は、いかなる不当な実験を行うこともなく、ｍＲＮＡの検出に必要な変更を加えて適用される。これとは別にまたはさらに、患者試料中においてＥＤＤたんぱく質またはｐ５３Ｒ２たんぱく質をコードするｍＲＮＡレベルは、例えばｍＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、またはＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉ミクロ切断試料について行う）のような当該技術で周知のこれらの操作を修飾して分析する。ミクロアレイ技術は、試料の高処理スクリーニングのためこのような態様に容易に適用される。
ハイブリダイゼーションに基づく手法において、リボプローブの用途は特に好適であり、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりもより安定であることがその理由である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションと同様、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件は、試料ＲＮＡを支持するために用いたハイブリダイゼーションマトリックスの性質または使用したハイブリダイゼーションプローブの種類に応じて変わるであろう。
ＲＴ−ＰＣＲまたはその変形のため、長さが少なくとも約２０個の隣接ヌクレオチド類の１種以上の核酸プローブ分子を、標的ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡにハイブリダイズさせ、核酸プライマーを用いて前記テンプレートの核酸コピーを酵素的に増幅する。ＲＴ−ＰＣＲは、遺伝子発現レベルを決定することを望む時特に有用である。また、ｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子類をこのような増幅反応のテンプレートとして使用することも当業者に公知であり、その結果、第１鎖ｃＤＮＡ合成が増幅反応前に行うことが必要な全てである。本文に記載の態様の変形も、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（シリーズ編著、Ｄ． ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ．ｐｐ．１−２５３、１９９１に詳細に述べられている。
上記方法はさらに、ひとつの態様において、ひとつ以上の適切な対象（すなわち、被験個人および／または参考試料提供に適したひとつ以上の対象）由来被験試料および／または参考試料を単離することを含む。この点において、参考試料および被験試料を同一対象から異なる時点で単離すること、または同一対象の異なる組織から単離することも本発明の範囲に含まれる。好適には、前記被験試料および参照試料は、同一組織種類または同一種類の細胞を含む組織由来である。
ひとつの態様において、被験試料および／または参照試料（類）は、対象（類）から先に得られている。
本文で例示したように、配列番号２６から３０、３３または３４、３７、３８、または４０のいずれかひとつに記載のヌクレオチド配列を有するプローブ類およびプライマー類を用いて乳癌細胞を検出する。ミクロサテライト検出と同様に、配列番号２６から３０、３３または３４、３７、３８、または４０のいずれかひとつに記載の核酸プライマー類をプローブとして用いて、核酸を直接検出する。ミクロサテライト検出と同様に、配列番号２６から３０、３３または３４、３７、３８、または４０のいずれかひとつによって増幅された核酸も、ハイブリダイゼーションプローブとして有用で、本発明がこのような用途を包含することは明らかである。
本発明の別の態様は、上記記載の態様によって癌を検出するための核酸プローブに関する。
本発明は、ひとつの態様において、下記：
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列で、前記アミノ酸配列が配列ＶＬＬＬＰＬを欠損している；
（ｉｉ）配列番号３に記載の配列；
（ｉｉｉ）配列番号５に記載の配列；
（ｉｖ）配列番号６に記載の配列；
（ｖ）配列番号７に記載の配列；
（ｖｉ）配列番号２４に記載の配列；
（ｖｉｉ）配列番号２５に記載の配列；
（ｖｉｉｉ）ＰＣＲにおいて（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を増幅プライマーとして用いる増幅によって産生された核酸断片の配列；
（ｉｘ）配列番号２６に記載の配列；
（ｘ）配列番号２７に記載の配列；
（ｘｉ）ＰＣＲにおいて（ｉｘ）および（ｘ）を増幅プライマーとして用いる増幅によって産生された核酸断片の配列；
（ｘｉｉ）配列番号２８に記載の配列；
（ｘｉｉ）配列番号２９に記載の配列；
（ｘｉｉｉ）配列番号３０に記載の配列；
（ｘｉｖ）ＰＣＲにおいて（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）を増幅プライマーとして用いる増幅によって産生された核酸断片の配列；
（ｘｖ）配列番号３３に記載の配列；
（ｘｖｉ）配列番号３４に記載の配列；
（ｘｖｉｉ）；ＰＣＲにおいて（ｘｖ）および（ｘｖｉ）を増幅プライマーとして用いる増幅によって産生された核酸断片の配列；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号３７に記載の配列；
（ｘｉｘ）配列番号３８に記載の配列；
（ｘｘ）ＰＣＲにおいて（ｘｖｉｉｉ）および（ｘｉｘ）を増幅プライマーとして用いる増幅によって産生された核酸断片の配列；
（ｘｘｉ）配列番号４０に記載の配列；および
（ｘｘｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｉ）までのいずれかひとつに相補性の配列
から構成される群から選択されたヌクレオチド配列を含む癌細胞を検出するための単離核酸分子を提供する。
本文では、用語“核酸”は、全ての一重鎖または二重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドか、またはこれとは別にＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドのアナログを意味する。“核酸”とは、また、ｃＤＮＡ分子と等価の全てのゲノム遺伝子を含む。
本発明の単離核酸は、ヒトまたは非ヒト哺乳類由来の核酸にハイブリダイゼーションするであろう。
ＥＤＤたんぱく質を含むたんぱく質複合体類およびその診断用途
本発明者らは、また、ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する遺伝子の数個の発現産物を同定し、前記発現産物はそれぞれ、腫瘍サプレッサー活性またはセルサイクル調節活性またはＤＮＡ修復活性を有するたんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質、核標的たんぱく質、およびカルシウム／インテグリン結合たんぱく質（ＣＩＢ）から構成される群から選択されるたんぱく質とのＥＤＤたんぱく質のたんぱく質−たんぱく質相互作用から構成される。前記相互作用は、対象における、ＤＮＡ損傷、例えばプロゲスチン感受性腫瘍化または腫瘍増殖のような、細胞におけるプロゲステロン媒介効果、細胞中におけるユビキチン媒介たんぱく分解、または血管形成変化、を検出するために有用な新規たんぱく質−たんぱく質複合体を提供する。新規たんぱく質−たんぱく質複合体類はまた、例えば抗体類のような診断試薬類を作製するために有用である。当業者には公知であろうが、抗体類はまた、治療適用のために有用である。さらに、この新規たんぱく質−たんぱく質複合体類は、例えば、過増殖性障害の治療のため前記たんぱく質−たんぱく質相互作用に対する小分子アゴニスト類またはアンタゴニスト類を含む調節性化合物類を同定するため、細胞増殖を防止し、または損傷ＤＮＡの修復増大のため、または損傷ＤＮＡを有するかおよび／または腫瘍細胞である細胞を標的化するためのアッセイ基盤を形成する。
したがって、本発明の１態様は、単離されたまたは組み換えたんぱく質複合体を提供し、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質または腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合できるＥＤＤたんぱく質部分；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質、または前記ＥＤＤたんぱく質若しくはＥＤＤたんぱく質の前記部分に結合するのに充分な前記たんぱく質部分
を含む。
本文では、用語“腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質”とは、例えば、ＤＮＡ損傷に対する細胞性応答を活性化させるか、ＤＮＡ修復の補助、ＤＮＡ損傷後の（たとえば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２と相互作用し、それらをリン酸化することにより、ＤＮＡ損傷後にＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２が生存を回復できるようにすることによって）生存を回復することによって、または腫瘍細胞の細胞性増殖を（例えば、ｐ５３のような腫瘍サプレッサーたんぱく質を安定化させ、それによってＧ１におけるセルサイクルアレストを起こさせることによって）防止することによって、腫瘍化または腫瘍増殖を抑制するか、低下させるかまたは防止することに関与していることが公知であるか、またはそのように考えられている全てのたんぱく質またはポリペプチドを意味すると理解すべきである。このような機能的振り分けは、当該技術において、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質をコードする遺伝子類において変異の効果を調べるか、または腫瘍化または腫瘍増殖に及ぼす直接効果を示した経験的データによって容易に決定される。好適には、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、核たんぱく質であろう。本文脈において、腫瘍サプレッサー活性を有する例示的たんぱく質には、セリン／スレオニンプロテインキナーゼのＣＤＳ１サブファミリメンバー、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＴＮＦ−アルファ、ＨＳＰ７０、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、ＨＲＡＳ１−ＶＮＴＲ、ＣＨＫ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＩＢ１、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ５、Ｃ１Ｂ、インポーチンアルファ−１、インポーチンアルファ−３、およびインポーチンアルファ−５を含む。
好適な態様において、前記腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１または２３のいずれかひとつに記載の配列に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
命名目的のため、配列番号９に記載のアミノ酸配列は、ヒトインポーチンアルファ−１たんぱく質（すなわち、カリオフェリンアルファ−２）から構成され、それは、配列番号８に記載のヌクレオチド配列の１３３位から１７２２位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号１１に記載のアミノ酸配列は、ヒトインポーチンアルファ−３たんぱく質（すなわち、カリオフェリンアルファ−４）から構成され、それは、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列の１０位から１５７５位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号１３に記載のアミノ酸配列は、ヒトインポーチンアルファ−５たんぱく質（すなわち、カリオフェリンアルファ−１）から構成され、それは、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列の４７位から１６６３位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号１５に記載のアミノ酸配列は、ヒトプロゲステロンレセプターたんぱく質（ＰＲ）から構成され、それは、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列の１７６位から２９７７位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号１７に記載のアミノ酸配列は、ヒトＣＩＢ／ＫＩＰたんぱく質から構成され、それは、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列の６７位から６４２位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号１９に記載のアミノ酸配列は、ヒトＣＨＫ２たんぱく質（すなわち、トランスクリプトバリアント１）から構成され、それは、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列の７６２位から２３９３位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号２１に記載のアミノ酸配列は、ヒトＣＨＫ２たんぱく質（すなわち、トランスクリプトバリアント２）から構成され、それは、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列の７６２位から２３０６位のヌクレオチドによってコードされる。配列番号２３に記載のアミノ酸配列は、ヒトＢＲＣＡ２たんぱく質から構成され、それは、配列番号２２に記載のヌクレオチド配列の２２９位から１０，４８５位のヌクレオチドによってコードされる。
さらに好適には、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、配列番号１９，２１または２３のいずれかひとつに記載の配列に対して少なくとも約８０％の同一性（すなわち、ヒトＣＨＫ２たんぱく質またはヒトＢＲＣＡ２たんぱく質に対して少なくとも８０％の同一性）を有するアミノ酸配列またはＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分なその部分を含むであろう。
当業者は、ＣＨＫ２がセリン／スレオニンたんぱく質キナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリの核セルサイクルチェックポイント制御たんぱく質であり、ＤＮＡ修復機能を有することに気づくであろう。ＣＨＫ２は、ＤＮＡ損傷に対する応答において活性化に必須のフォーク先端部会合たんぱく質相互作用ドメインを含み、複製ブロックとＤＮＡ損傷に応答して迅速にリン酸化される。活性化されると、コードされたたんぱく質は、ＣＤＣ２５Ｃホスファターゼを阻害し、有糸分裂に入るのを防止することが知られている。ＣＨＫ２もまたＢＲＣＡ１たんぱく質と相互作用し、ＢＲＣＡ１をリン酸化させ、それによって、ＢＲＣＡ１がＤＮＡ損傷後も生存を回復できるようにする。ＣＨＫ２はまた、腫瘍サプレッサーたんぱく質ｐ５３（ＴＰ５３）を安定化させることにより、おそらく腫瘍サプレッサー活性を有しており、Ｇ１相でセルサイクルが停止することになる。
当業者は、ＢＲＣＡ２が、若年発生乳癌のリスク上昇に関連付けられているＢＲＣＡ２コード遺伝子における変異、特に微細欠損による腫瘍サプレッサーたんぱく質であることにも気づくであろう。また、ＢＲＣＡ２はまた、二重鎖切断修復および／または相同組み換えの活性化にも関連している。ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２の性質が類似していることは、例えばそれらが生化学的複合体中に共局在していることや機能類似で示され、このことは、これらのたんぱく質類が同一遺伝経路で機能することを示唆している。ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２のアミノ酸配列は、転写活性化たんぱく質ドメインを含む。
“セルサイクル調節活性を有するたんぱく質”とは、このたんぱく質が単独でまたは１種以上の他のたんぱく質類または核酸と共同して機能し、セルサイクル進行を進めるかまたはセルサイクルのある段階から別の段階への進行を阻害することを意味する。好適なセルサイクル調節たんぱく質類は、細胞がＧ１からＧ２相に進行するのを調節するか、または細胞が有糸分裂に入るのを調節する。このような機能的振り分けが、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質をコードする遺伝子中の変異効果を調べることによって、またはセルサイクル進行に及ぼす直接効果を示す経験的データによって、または公知のセルサイクル調節たんぱく質類とのたんぱく質−たんぱく質相互作用を分析することによって、当該技術で容易に決定される。好適には、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質は、核たんぱく質であろう。本文脈内でセルサイクル調節活性を有する例示的たんぱく質類には、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリのメンバー、Ｃｄｃ２５、ＣＤＣ２ａ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、ＣＤＫ阻害剤、分裂促進因子性のサイクリン（例 サイクリンＡ、 サイクリンＢ、 サイクリンＤなど）、ｐ５３（ＴＰ５３）、およびＣＨＫ２が含まれる。
ひとつの好適な態様において、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、配列番号１９または２１のいずれかひとつに記載の配列に少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むであろう。
当業者は、先の記載から、Ｃｄｃ２５、ＣＨＫ２およびＴＰ５３たんぱく質類が本文の文脈内でセルサイクル調節たんぱく質類として作用することに気づくであろう。特に好適な態様において、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質は、ＣＨＫ２（配列番号１９または２１）またはＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分なその部分である。
“ＤＮＡ修復または損傷関連たんぱく質”とは、ＤＮＡ修復調節に機能し、ＤＮＡ損傷によって活性化されるかまたはそうでない場合には二重鎖切断修復、ＤＮＡミスマッチ修復、相同性組み換えまたはＤＮＡ末端連結事象を細胞中でまたはインビトロで活性化する核たんぱく質を意味している。このような機能性振り分けは、前記たんぱく質をコードする遺伝子中の変異効果を調べるか、またはＤＮＡ損傷に応答するかおよび／またはＤＮＡ修復を受けるかおよび／または相同組み換えまたはＤＮＡ末端連結を活性化する細胞能力に及ぼす直接効果を示す経験的データによって、容易に決定される。本文の文脈内でＤＮＡ修復または損傷に関連する例示的たんぱく質類には、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリのメンバー、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＩＢ／ＫＩＰ、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ５およびインポーチンアルファ−５が含まれる。
ひとつの好適な態様において、ＤＮＡ損傷または修復関連たんぱく質は、配列番号１３、１７、１９、２１または２３のいずれかひとつに記載の配列に少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むであろう。
特に好適な態様において、ＤＮＡ損傷または修復に関連するたんぱく質は、ＣＨＫ２たんぱく質（配列番号１９または２１）、ＢＲＣＡ２たんぱく質（配列番号２３）、ＣＩＢたんぱく質（配列番号１７）およびインポーチンアルファ−５たんぱく質（配列番号１３）またはＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分なその部分からなる群より選択される。
当業者は、先の記載から、ＢＲＣＡ２およびＣＨＫ２たんぱく質類がＤＮＡ損傷または修復に関連しており、ＤＮＡ損傷チェックポイント制御たんぱく質類として主に作用することに気づくであろう。当業者らはまた、ＣＩＢたんぱく質がカルシウム結合たんぱく質ファミリのメンバーであり、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼと相互作用し、その結果、当該技術でＤＮＡ末端連結事象のキナーゼ−ホスファターゼ制御において役割を果たすことに気づくであろう。またこのＣＩＢたんぱく質は、インテグリンアルファ（ＩＩｂ）ベータ（３）と相互作用し、このことは、このたんぱく質がインテグリンアルファ（ＩＩｂ）ベータ（３）の制御分子であることを示唆できる。当業者は、また、インポーチンアルファ−５たんぱく質がｄｓ−ＤＮＡ切断修復に関与していることにも気づくであろう。インポーチンアルファ−５はまた、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換え中においてＲＡＧ１が必要とし、このプロセスがイムノグロブリンおよびＴ細胞レセプターをコードする遺伝子が産生させるプロセスである。
“核標的化たんぱく質”とは、サイトゾルから核へのたんぱく質の移動を補佐するシャペロニンたんぱく質を意味する。核へのたんぱく質類の移入には、このたんぱく質が核エンベロープにエネルギー非依存性に結びつくことと、核の孔複合体を介してエネルギー依存的に移動することが必要である。本文の文脈において、核標的化たんぱく質は、これらのプロセスのひとつまたは両者を促進するであろう。このような機能性振り分けは、前記たんぱく質をコードする遺伝子中の変異効果を調べるか、たんぱく質の核局在を促進するたんぱく質の能力に及ぼす直接効果を示す経験的データによって、容易に決定される。例示的核標的化たんぱく質類には、インポーチンアルファ−１（配列番号９）、インポーチンアルファ−３（配列番号１１）およびインポーチンアルファ−５（配列番号１３）が含まれる。
ひとつの好適な態様において、前記核標的化たんぱく質は、配列番号９、１１または１３のいずれかひとつに記載の配列に少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むであろう。
当業者は、インポーチンアルファ−１およびインポーチンアルファ−３がＤＮＡヘリカーゼＱ１たんぱく質の核局在配列（ＮＬＳ）およびＳＶ４０ Ｔ抗原のＮＬＳと相互作用し、前記たんぱく質類をこれらのたんぱく質の核移動において核エンベロープまたは核孔複合体に結びつけることに気づくであろう。これらのインポーチンは、また、当該技術において、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えに役割を果たしていると考えられている。
“核局在配列”すなわち“ＮＬＳ”とは、塩基性アミノ酸類の短い領域またはアミノ酸約１０個分だけ離れて存在する２個のこうした領域を意味し、これは、たんぱく質の核局在、特にインポーチンたんぱく質によって媒介された運搬に必要である。
用語“プロゲステロンレセプターたんぱく質”の機能的意味は、先の記載から明白であろう。プロゲステロンレセプターたんぱく質の構造を定義する目的で、配列番号１５に記載のアミノ酸配列が提供される。配列番号１５の変異体は例えばそれに対して少なくとも約８０％の同一性を有するたんぱく質類であり、これらもまた本発明の範囲に含まれるが、唯一、この変異体が機能性のプロゲステロンレセプターであるか、または機能性プロゲステロンレセプターたんぱく質に由来していることが必須である。ヒトプロゲステロンレセプターたんぱく質は、本発明者らがＥＤＤたんぱく質に結合することを明らかにしている。
“血管形成関連たんぱく質”とは、対象において直接的または間接的に（例えば、血管形成を増大させるたんぱく質の発現を誘発させるか、または血管形成を増大させるかまたは阻害するたんぱく質と相互作用することによって）新規血管発生を増大させるように機能するたんぱく質を意味する。好適には、前記たんぱく質は、血管形成活性に関連しており、それによって、用語“血管形成活性”とは、新規血管をデノボで形成することを意味すると理解される。血管形成プロセスの結果、インサイチュで中胚葉細胞が内皮細胞に分化し、それが初期の血管網に組織化される。多くの強力な腫瘍類（例 メラノーマ腫瘍細胞）もまた、対象において血管形成を誘発可能である。
別の態様では、血管形成関連たんぱく質は、新脈管形成を増大することまたは阻害することができる。“新脈管形成”とは、既存の血管から新しい血管が発生することを意味している。新脈管形成プロセスには、膜類を分泌している既存の血管の内皮細胞が血管基底膜を侵食することが必要になる。その後、内皮細胞が増殖し、新脈管形成シグナルのほうに移動し、新血管を形成するため他の内皮細胞と緊密な細胞接合部を形成する。新脈管形成はたとえば胚発生、創傷治癒、黄体、子宮内膜および胎盤形成中に出現する。しかし、異常な新脈管形成は、腫瘍転移を含むいくつかの障害と関連している。
血管形成関連たんぱく質の機能的振り分けは、血管形成活性を有するたんぱく質をコードする遺伝子中の変異効果を調べることによって、または血管形成に及ぼす直接効果を示す経験的データによって、または公知の血管形成調節たんぱく質類とのたんぱく質−たんぱく質相互作用を分析することによって、当該技術で容易に決定される。例えば、血管形成におよぼすたんぱく質の効果は、当該技術で公知のいかなるアッセイによっても決定することができ、例えば、ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリＣＡＭアッセイ（Ｏ‘Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ、７９（２）：３１５−３２８ １９９４に記載）、マウス角膜アッセイまたはマウス虚血性腎症アッセイ（Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５６（２）：６９７−７０７、２０００に記載）のようなアッセイである。
好適には、血管形成活性を有するたんぱく質は、核たんぱく質であろう。例えば、血管形成活性を有するたんぱく質類には、形質転換増殖因子β、脂質ホスファターゼＬＰＰ３、ｃ−Ｍｙｃ、ジメチルアアルガニンジメチルアミノハイドラーゼ（ＤＤＡＨ）、チトクロームＰ４５０、Ｔｉｅ−２およびＶＥ−カドヘリンが含まれる。
前記たんぱく質複合体は、ひとつの態様において、ＥＤＤたんぱく質を含むヘテロダイマーまたはヘテロ多量体たんぱく質である。当業者は、ヘテロダイマーまたはヘテロ二量体たんぱく質複合体が２つの異なるペプチドまたはポリペプチドサブユニットを含むことがわかるであろう。本文で、用語“ヘテロ多量体”とは、少なくとも３個のペプチドまたはポリペプチドサブユニットを含む高次たんぱく質複合体を意味するものとして使用し、ここで、前記サブユニットのうち少なくとも２個は、異なっている。たとえば、ヘテロ六量体たんぱく質は、６個のペプチドまたはポリペプチドサブユニットを含むことが知られ、本文脈において、３種の異なるホモダイマー、または６種の異なるモノマー、またはダイマー１個、異なるたんぱく質などのテトラマー１個を含むこともできる。したがって、本発明は、前記たんぱく質複合体の組成および大きさによって限定されず、唯一、少なくとも１個のペプチドまたはポリペプチドサブユニットがＥＤＤまたはＥＤＤの部分から構成されるか、または少なくとも１個の他のペプチドまたはポリペプチドサブユニットが腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、核標的たんぱく質およびプロゲステロンレセプターたんぱく質、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質の部分、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質の部分、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質の部分、核標的たんぱく質の部分およびプロゲステロンレセプターたんぱく質の部分から構成される群から選択されるポリペプチドから構成されるということが必須となっている。
前記たんぱく質複合体のたんぱく質サブユニットは、当業者に公知のいかなる手段による物理的関係でも把握される。この物理的関係には、誘発磁場または常磁場形成、ポリペプチドサブユニット間のジスルフィド架橋形成のような共有結合形成、イオン格子で生じるようなイオン相互作用、水素結合または双極子−双極子相互作用、双極子誘発双極子相互作用、誘発双極子−誘発双極子相互作用または反発性相互作用のようなファンデアワールス相互作用、または上記誘引力のあらゆる組み合わせを伴う。これとは別に、前記ペプチドまたはポリペプチドサブユニットは、それらを適宜スペーサーによって分離しそれらが折りたたまれるようにされている融合ポリペプチドとして示すことによる物理的関係で把握することもできる。したがって、前記ペプチドまたはポリペプチドサブユニット間の物理的関係は、互いに結合し誘引されるそれらの能力の結果であることもできるし、またはそれらの産生様式の結果ということもできる。
好適には、前記ペプチド、ポリペプチドまたはたんぱく質パートナー類は、直接物理的関係にある。“直接物理的関係”とは、いかなる干渉たんぱく質部分または非たんぱく質部分もなくても結合パートナー同士が互いに接触することを意味している。しかし、本発明のたんぱく質複合体類は、たとえば、ＥＤＤまたはＥＤＤ部分と他の結合パートナーとの物理的関係を増大させるかまたは安定化させるたんぱく質または非たんぱく質部分のような１個以上の別のたんぱく質部分または非たんぱく質部分を含むことができるのは明白である。
本発明はさらに、結合パートナーの１種以上にたとえば、リン酸化、フコシル化、ミリストイル化、ファルネシル化またはグリコシル化残基のような翻訳後修飾物も含まれるたんぱく質複合体も包含される。このような翻訳後修飾物は、複合体形成を増大させるかまたはいったん形成されるとその複合体を安定化させることができる。セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（例 ＣＨＫ２）のＣＤＳ１サブファミリメンバーになるような、ＥＤＤまたはＣＨＫ２を含む結合パートナーの１種以上に存在する１個以上のセリンまたはチロシン残基によるリン酸化もまた、予想されている。１種以上の結合パートナーのユビキチン化もまた、排除されていない。
好適には、前記たんぱく質複合体の結合パートナーは、哺乳類ポリペプチド類またはたんぱく質類であり、さらに好適には、ヒト起源である。前記結合パートナーが同一起源由来であることは厳密には必要ではないが、このほうが好適であり、その理由は、前記パートナーが互いに物理的非共有会合で会合するかまたは維持される能力が一般的に、それらが同一生物由来であれば増大するからである。
当業者は、たとえば、システイン／ヒスチジン高含量の領域（例 亜鉛結合ドメイン）、ＨＥＣＴドメイン、ＲＩＮＧドメイン、核局在配列（ＮＬＳ）、モノ−またはマルチユビキチンチェーンに結合するＵＢＡドメインまたはアルファヘリックス類を含む領域（例 配列番号２または４のカルボキシ末端アミノ酸６０個）を含む部分のような本発明のたんぱく質複合体を形成できるＥＤＤまたは他のポリペプチドの適当な部分を決定できる位置にあるであろう。これは、例えば、不当な実験を行うことなく２個のたんぱく質類の間の結合を決定する従来の結合アッセイを用いて行うことができる。
同様に、当業者は、ＥＤＤたんぱく質またはその部分に結合するのに充分な他の結合パートナーの部分を容易に決定できる。また、２個のたんぱく質類の間の結合を決定する従来の結合アッセイを用いて、このような部分が適切であろうかどうかをアッセイすることもできる。
好適には、たんぱく質複合体形成に適したＥＤＤたんぱく質または他のたんぱく質の部分は、長さが少なくともアミノ酸約５個、さらに好適には長さが少なくともアミノ酸約１０個、さらにより好適には長さが少なくともアミノ酸約１５個、またさらに好適には長さが少なくともアミノ酸約２０個または３０個または４０個または５０個を含む。
好適な態様において、腫瘍サプレッサー活性またはセルサイクル調節活性を有するたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質の部分は、配列番号２の約１４００位から約２５５０位のアミノ酸残基または配列番号４の対応する領域のアミノ酸残基を含み、さらに好適には、配列番号２の約１４０６位から約２５２６位の領域のアミノ酸残基を含む。
別の態様において、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質の部分は、少なくとも、完全長ＥＤＤたんぱく質のＣ末端部分のアミノ酸残基を含み、例えば、配列番号２の約８８９位から約２７９９位のアミノ酸残基または配列番号４の対応する領域のアミノ酸残基を含むであろう。
別の態様において、核標的たんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質の部分は、少なくとも、ＥＤＤたんぱく質の核局所配列を含む。ひとつの態様において、前記ＥＤＤ ＮＬＳは、少なくとも、配列番号２の約５０２位から約５１７位のアミノ酸残基または配列番号２の約６００位から約６０５位または配列番号２の約１２２２位から約１２４１位または配列番号４の対応する領域のアミノ酸残基を含む。
別の態様において、プロゲステロンレセプターたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質の部分は、少なくとも、ＥＤＤのＮ末端部分を含み、例えば、配列番号２の約１位から約８８９位のアミノ酸残基または配列番号４の対応する領域のアミノ酸残基を含み、さらに好適には、配列番号２の約４２０位から約８８９位または配列番号４の等価領域のアミノ酸残基である。
ＥＤＤたんぱく質と相互作用するＣＨＫ２たんぱく質の好適な部分は、少なくとも、ＣＨＫ２のＦＨＡドメインを含む（配列番号１９の約１１７位から約１５７位のアミノ酸残基または配列番号２１の等価領域であり、さらに好適には、配列番号１９の約１１１位から約１７７位の残基または配列番号２１の等価領域である）。
ＥＤＤたんぱく質と相互作用するプロゲステロンレセプター（ＰＲ）たんぱく質の好適な部分は、少なくとも、ＰＲのＣ末端部分を含み、さらに好適には、その完全長レセプターたんぱく質のヒンジドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド依存性活性化ドメイン−２を含む領域（すなわち、“ＣＤＥ領域”）である。
ＥＤＤたんぱく質と相互作用するインポーチンたんぱく質の好適な部分は、少なくとも、インポーチンのＣ末端ドメインを含み、例えば、配列番号１３の約２２９位から約５３８位のアミノ酸残基または配列番号９の相同領域である。
本発明のさらに別の態様では、単離ペプチド類、ポリペプチド類および前記たんぱく質複合体を産生するため、およびＥＤＤまたはＥＤＤ部分と、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質またはその部分から構成される群から選択される１種以上の他のポリペプチド類との生物的相互作用の調節剤を同定するためのキット類、を提供する。
ひとつの態様において、前記キットは、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されたたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤまたはその部分から構成される第１ポリペプチド、および腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質または前記ＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分なその部分またはＥＤＤたんぱく質の前記部分から構成される群から選択されたたんぱく質から構成される第２のポリペプチドを含む。このようなキット類を用いて、ＥＤＤを含むたんぱく質複合体類を産生できる。
適宜、前記キットはさらに、ＥＤＤに結合するたんぱく質に充分結合するたんぱく質またはその部分を含み、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む。この態様によれば、前記対象キットを用いて、ＥＤＤたんぱく質およびＥＤＤに結合するたんぱく質およびＥＤＤ結合たんぱく質に結合するたんぱく質を含む高次たんぱく質複合体類を産生させる。これとは別に、このようなキット類は、ＥＤＤとＥＤＤ結合たんぱく質に結合するたんぱく質のたんぱく質−たんぱく質複合体形成における競合を分析する際に有用である。たとえば、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびＢＲＣＡ１およびＣＨＫ２を含む複合体を産生できるし、または、ＣＨＫ２との複合体形成におけるＢＲＣＡ１とＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２およびＣＨＫ２を含む複合体を産生できるし、または、ＣＨＫ２との複合体形成におけるＢＲＣＡ２とＥＤＤとの競合またはＢＲＣＡ２との複合体形成におけるＣＨＫ２とＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２およびＢＲＣＡ１を含む複合体を産生できるし、または、ＢＲＣＡ２との複合体形成におけるＢＲＣＡ１とＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびＴＰ５３およびＣＨＫ２を含む複合体を産生できるし、または、ＣＨＫ２との複合体形成におけるＴＰ５３とＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびＣＩＢおよびインテグリンを含む複合体を産生できるし、または、ＣＩＢとの複合体形成におけるインテグリンとＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５およびＲＡＧ１を含む複合体を産生できるし、または、インポーチンアルファ−５との複合体形成におけるＲＡＧ１とＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１／３およびＤＮＡヘリカーゼを含む複合体を産生できるし、または、インポーチンアルファ−１／３との複合体形成におけるＤＮＡヘリカーゼとＥＤＤとの競合を決定することもできる。同様に、前記キットを用いて、ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターおよび前記プロゲステロンレセプターに結合する熱ショックたんぱく質を含む複合体を産生できるし、または、プロゲステロンレセプターとの複合体形成における熱ショックたんぱく質とＥＤＤとの競合を決定することもできる。
前記キットにはさらに、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチド、またはＥＤＤを含む上記たんぱく質複合体類のいずれか１個以上、に結合する１個以上の抗体類またはリガンド類を含み、例えば、組み立てられたたんぱく質複合体または前記たんぱく質複合体の構造をそれぞれのポリペプチド成分類自体よりもむしろ特異的に認識する抗体またはリガンドである。
前記キットは、別の態様において、
（ａ）
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体を形成するのに充分なＥＤＤたんぱく質またはその部分を含む第１コンパートメント；
および
（ｂ）
（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質；
（ｉｉ）ＢＲＣＡ２たんぱく質；
（ｉｉｉ）ＣＩＢたんぱく質；
（ｉｖ）インポーチンアルファ−１たんぱく質；
（ｖ）インポーチンアルファ−３たんぱく質；
（ｖｉ）インポーチンアルファ−５たんぱく質；および
（ｖｉｉ）プロゲステロンレセプターたんぱく質
から構成される群から選択されたたんぱく質に結合する抗体またはリガンド、または
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体に結合する抗体またはリガンド
を含む第２コンパートメント、
を含み、たんぱく質複合体に結合する前記抗体またはリガンドは、それぞれのたんぱく質結合パートナーに結合しない。
前記キットは、別の態様において、
ＥＤＤたんぱく質に結合する抗体またはリガンドを含む第１コンパートメントおよび
（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質；
（ｉｉ）ＢＲＣＡ２たんぱく質；
（ｉｉｉ）ＣＩＢたんぱく質；
（ｉｖ）インポーチンアルファ−１たんぱく質；
（ｖ）インポーチンアルファ−３たんぱく質；
（ｖｉ）インポーチンアルファ−５たんぱく質；および
（ｖｉｉ）プロゲステロンレセプターたんぱく質
から構成される群から選択されるたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分なその部分を含む第２コンパートメントを含む。
別の態様において、前記キットは、
（ａ）
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択された単離または組み換えたんぱく質複合体を含む第１コンパートメント；および
（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質、ＢＲＣＡ２たんぱく質、ＣＩＢたんぱく質、インポーチンアルファ−１たんぱく質、インポーチンアルファ−３たんぱく質、インポーチンアルファ−５たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質およびＥＤＤたんぱく質から構成される群から選択されるポリペプチドに結合する抗体またはリガンド；または（ｉｉ）１個以上のたんぱく質複合体に結合する抗体またはリガンドを含む第２コンパートメントを含む。
本文では、用語“抗体”とは、未改変のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、イムノグロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）分画、ヒト化抗体類、または組み換え一本鎖抗体類ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖのようなその断片を称し、それらは、前記たんぱく質複合体の少なくとも１個の結合パートナーの直線状または構造上のエピトープ、または組み立てられたたんぱく質複合体の構造上のエピトープに結合できる能力を有する。ヒト化抗体とは、ヒト抗体により近似するように非抗原結合領域のアミノ酸を置換しているがそれでもなお元来の結合能を保持している抗体類である。
ひとつの態様において、抗体類は、例えば、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ、ＣＡ９５０６０、ＵＳＡのような市販会社から得られる。他の市販会社なども当業者に周知であろう。
これとは別に、抗体類は従来法で産生される。抗体類産生のためには、未改変のポリペプチドまたは目的の短いアミノ酸配列を有するその部分を免疫抗原すなわちイムノゲンとして用いる。前記イムノゲンは、天然由来、組み換え発現手段またはＲＮＡのインビトロ翻訳、またはＦｍｏｃ化学のような化学的合成による。短いペプチドから構成されるイムノゲン類は、好適には、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、チログロブリンまたはカブトガニヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアたんぱく質に免疫前に結合させる。その後、この結合ペプチドを用いて動物を免疫化する。さまざまな宿主動物類（例 ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、ヒト）にイムノゲンを筋肉内、腹腔内、または静脈内に投与することにより免疫するが、適宜、イムノゲンに対する免疫応答を増大させるためにアジュバント存在下で行う。好適なアジュバントには、例えば、フロインド完全または不完全アジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル類、およびリゾレシチン、プルーロニックポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、オイルエマルジョン、カブトガニヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質類が含まれる。ヒトで使用するアジュバントの中でも、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが好適である。
モノクローナル抗体は、培地中での連続細胞株培養によって抗体分子を産生できるいかなる方法を用いても調製され、例えば、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術である（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５−４９７、１９７５；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１、３１−４２、１９８５；Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０、２０２６−２０３０、１９８３；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６２、１０９−１２０、１９８４）。
キメラ抗体産生のために開発された技術もまた、用いられる。このような技術では、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングし、所望の抗原特異性と生物活性を有する分子を産生することを必要とする（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１、６８５１−６８５５、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１２、６０４−６０８、１９８４；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１４、４５２−４５４、１９８５）。
これとは別に、一本鎖抗体類産生について記載された技術も、当該技術で公知の方法を用いて改良され、所望の特異性を有する一本鎖抗体類を産生させる。
抗体類はまた、リンパ細胞集団にインビボ産生を誘発させるか、イムノグロブリンライブラリまたはＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、３８３３−３８３７、１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４９、２９３−２９９、１９９１に開示されているように高特異的結合試薬類のパネルをスクリーングすることによって、産生される。
例えばＦ（ａｂ’）2断片のような抗体断片は、未改変の抗体分子をペプシンで消化することによって産生される。Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生される。これとは別に、Ｆａｂ発現ライブラリを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速かつ簡便に同定することもできる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４、１２７５−１２８１、１９８９）。
前記抗体類またはリガンド類は、ＥＤＤと別のたんぱく質との間に形成された複合体をその後単離したりまたは検出したりする際に役立つ。第１または第２ポリペプチドの複合体形成に関与していない領域に抗体またはリガンドが結合することがこの目的のためには好適で、唯一、使用に際して、前記リガンドが形成された複合体を破壊しないということが必要である。
好適には、前記リガンドは小分子であるか、またはここで検討したたんぱく質複合体類のひとつの結合パートナーである。本態様による使用に特に好適なリガンド類は、プロゲステロンレセプターに結合する熱ショックたんぱく質、ＢＲＣＡ１、ＴＰ５３、および核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）から構成される群から選択される。
前記抗体またはリガンドは、例えば、蛍光団、発色団または放射性同位元素のような適切なレポーター分子を用いて標識することもできる。抗体類および小分子類の場合、これらは、当業者に公知の操作に従って抗体類を用いて検出することもできる。
適宜、前記キットには使用上の注意書きを同封する。
本発明のキット類は、本発明のたんぱく質複合体類をインビトロまたはインビボで産生させおよび／または検出するために有用である。前記たんぱく質複合体類を産生するため、前記キットの非抗体／リガンド成分類の１個以上を複合体形成が起こるだけ充分な時間と条件下で細胞源に添加する。前記抗体成分類は、特に、このように形成された複合体（類）を単離するために有用である。適宜、前記キット成分類のいずれかひとつをたんぱく質タグで標識し、たんぱく質複合体のその後の単離または精製を促進する。
前記ポリペプチド成分類は使用に際して、複合体形成が起こるに充分な時間と条件下で接触させる。追加のたんぱく質類も細胞または非細胞源から提供でき、本文で具体的に述べたそれら以外のたんぱく質複合体類を形成させる。提供されると、前記抗体またはリガンドを用いて、形成された複合体を検出または単離する。前記リガンドは、形成されたたんぱく質複合体を破壊しないようなものを選択すべきである。
本発明の別の態様において、ＥＤＤたんぱく質を含むたんぱく質複合体、好適には、
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体に結合する単離抗体が提供されるが、ただし、前記抗体は、前記複合体の別のたんぱく質がない場合に前記複合体のそれぞれのたんぱく質に結合しないことが条件である。
好適には、前記抗体が前記たんぱく質複合体の構造上のエピトープを認識する。
本発明の別の態様は、
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体に結合する抗体またはリガンドに結合する抗イディオタイプ抗体を提供するが、ただし、前記抗イディオタイプ抗体は、前記複合体の別のたんぱく質がない場合に前記複合体のそれぞれのたんぱく質に結合する抗体に結合しないことが条件である。
本発明の別の態様は、ＥＤＤ結合たんぱく質またはそれを含む複合体を適切な細胞源から単離するための方法を提供する。
好適には、前記たんぱく質または複合体は、実質的に同種たんぱく質類を含まないで提供され、それが、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによるたんぱく質分析で調べた場合に少なくとも約１〜５％純粋であることを意味する。さらに好適には、前記たんぱく質は少なくとも約１０％、さらに好適には少なくとも約２０％純粋、さらに好適には少なくとも約２５％純粋、さらにより好適には少なくとも約３０％純粋、およびさらに好適には少なくとも約５０％純粋で、またさらに好適には実質的に純粋である。
本発明のたんぱく質複合体を単離するため、ひとつまたは両方の結合パートナー類を、前記結合パートナーの少なくとも１個を異所性に発現するかまたは内部的に発現する同一または異なる細胞源から別々に分離する。単離した結合パートナーをその後、それらの物理的関係を促進するために充分な量と条件下で組み合わせる。このような条件は、たんぱく質化学の当業者が容易に決定できる。結合パートナーを溶液状態に充分保てるだけの緩衝液ｐＨ、イオン強度および温度を選択するのが一般的に好適である。１種以上のプロテアーゼ阻害剤類もまた含ませることができ、単離したポリペプチドの蛋白分解性消化または分解を防止する。
これとは別に、たんぱく質複合体それ自体を、内因的にまたは異所性に両方の結合パートナーを含む細胞源または非細胞源（例 核）から単離することもできる。前記結合パートナーが融合たんぱく質としてまたは明白なポリペプチド類として発現されることは、本態様の範囲内である。
単離ポリペプチド結合パートナーまたはたんぱく質複合体の好適な細胞源には哺乳類細胞全てが含まれ、好適には、ＥＤＤ、およびＣＨＫ２、ＢＲＣＡ２、ＣＩＢ、インポーチンアルファ−１、インポーチンアルファ−３、インポーチンアルファ−５およびプロゲステロンレセプターたんぱく質から構成される群から選択されたたんぱく質を発現することが公知である哺乳類細胞であり、または、前記たんぱく質（類）を発現するように工学的に改良できる細胞である。このような目的のための例示的細胞には、癌細胞類（例 カルシノーマ細胞、ＥＲマイナス乳癌細胞のような乳癌細胞、または扁平上皮癌細胞または卵巣癌細胞、または肝細胞癌細胞）、上皮細胞、中枢神経系細胞、腎細胞、Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、マウス１０Ｔ線維芽細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＴ−４７Ｄ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞またはＨＥＫ−２３９細胞が含まれる。他の細胞類（例 昆虫ｓｆ９またはｓｆ２１細胞、ニワトリ胚細胞など）の使用も、特に非天然のペプチド、ポリペプチドまたは組み換え手段によって発現した複合体の単離のためには排除されない。
好適には、たんぱく質複合体またはその結合パートナーは、ひとつまたは両方の結合パートナーを内因的に発現する細胞株から単離され、例えば、頭頸部癌、メラノーマ、転移メラノーマ、舌の扁平細胞癌、乳癌、アデノカルシノーマ、胚扁平癌、消化管の癌（例 胃、結腸または膵臓癌）、卵巣癌、肝細胞癌、腎細胞癌、膀胱癌、婦人科系のカルシノーマ（例 卵巣癌）、前立腺癌、扁平細胞カルシノーマ、非扁平カルシノーマ、グリア細胞種、および髄芽細胞腫から構成される群から選択される癌細胞である。さらに好適には、前記細胞は、転移メラノーマ細胞、扁平細胞カルシノーマ細胞、乳癌細胞、肝細胞カルシノーマ細胞、または卵巣癌細胞またはこのような癌に由来する細胞株である。特に好適な態様において、前記たんぱく質複合体またはその結合パートナーは、カルシノーマ細胞またはカルシノーマ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、または異所性に１個以上の結合パートナーを発現するＨＥＫ２９３細胞またはＣＯＳ細胞から単離される。
前記ペプチド、ポリペプチドまたはたんぱく質結合パートナー類、またはたんぱく質複合体を単離するための手段には、当業者に公知のたんぱく質単離手段全てが含まれ、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換（陰イオンまたは陽イオン）クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィである。高圧（例 ＨＰＬＣ、ＦＬＰＣ、ＭＡＬＤＩ）および低圧システムも両者ともに使用できる。
前記たんぱく質−たんぱく質相互作用に対する結合パートナーのひとつまたは両者に結合するリガンド類または抗体類を用いるアフィニティ方法は、特に好適である。ＥＤＤたんぱく質またはその結合パートナーのひとつのたんぱく質ドメインに対する抗体類は、ＥＤＤまたはそれを含む複合体の単離に特に有用である。ひとつの態様において、天然または組み換えたんぱく質を、活性化クロマトグラフィレジン（例 ＣＮＢｒ−活性化セファロース、ファルマシア）に結合した抗体を含むマトリックスを提供し、前記レジンをブロックし洗浄して未結合抗体とブロック剤を除去し、前記レジンをペプチドまたはポリペプチドが結合するのに充分な条件下（例 界面活性剤存在下における高イオン強度緩衝液）で抗体が結合した前記ペプチドまたはポリペプチドを含むたんぱく質抽出物と接触させ、前記抗体抗原結合を破壊しないような条件下（例 ｐＨ２〜３の緩衝液または高濃度の尿素またはチオシアナートイオンのようなカオトロピズム）で前記ペプチドまたはポリペプチドを溶出させることによって、同種たんぱく質を含まないように精製する。
先の記載から、小分子類または結合パートナーのひとつに結合できるたんぱく質類もまた、ひとつまたは両者の結合パートナーまたはたんぱく質複合体自体をアフィニティ手段によって単離するために用いることができる。このような単離を可能にする条件は、たんぱく質化学の当業者が容易に決定できる。結合パートナーを溶液状態に保つのに充分な緩衝液ｐＨ、イオン強度および温度を選択するのが一般的に好適である。好適には、１種以上のプロテアーゼ阻害剤類（例 パパイン、ＰＭＳＦ、ロイペプチン）を含め、前記単離ポリペプチドのたんぱく質分解消化または分解を防止する。たとえば、天然または組み換えたんぱく質は、活性化クロマトグラフィレジン（例 ＣＮＢｒ−活性化セファロース、ファルマシア）に結合した小分子またはたんぱく質結合パートナーを含むマトリックスを提供し、前記レジンをブロックし洗浄して未結合抗体とブロック剤を除去し、前記レジンをペプチドまたはポリペプチドが充分に結合できるだけの条件下で抗体が結合した前記ペプチドまたはポリペプチドを含むたんぱく質抽出物と接触させ、前記結合を破壊しないような条件下で前記ペプチドまたはポリペプチドを溶出させることによって、同種たんぱく質を含まないように精製する。
別の態様において、本発明は、本文に記載のたんぱく質複合体を組み換え手段によって産生するための方法を提供する。組み換え手段によってペプチド類またはポリペプチド類を発現させるため、たんぱく質をコードするヌクレオチド配列をプロモータまたは無細胞系または細胞系における他の発現制御可能制御配列と機能可能なように連結して配置されている。
本発明のひとつの態様において、ＥＤＤたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質の部分および腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質から構成される群から選択されたたんぱく質または前記ＥＤＤたんぱく質に結合するのに充分な前記ポリペプチド部分またはＥＤＤたんぱく質の前記部分をコードする配列を含む核酸が、適切なプロモータ配列に機能可能なように連結しており、これが、発現が起こるだけの充分な時間と条件下で適切な細胞中で発現される。
結合パートナーをコードする核酸は、本文に記載の一般的に入手可能なヌクレオチドおよびアミノ酸配列類から容易に誘導できるが、ただし、配列番号３〜７を除く。融合ポリペプチドを産生するため、オープンリーディングフレームを同一リーディングフレーム中で例えば参照によって本文に組み込まれているＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８、１９９２）によって記載されているように標準的クローニング操作を用いて共有結合で連結させる。
適宜、結合パートナーのオープンリーディングフレームの間にスペーサーを入れて、それらの物理的関係を容易にする。好適なスペーサー類は、長さが少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドのたんぱく質コードヌクレオチド配列を含み、好適には、プロリンが高含量のアミノ酸類をコードする配列である。このスペーサーは、前記パートナーのオープンリーディングフレームを妨害しないように設計されている。
本文で“プロモータ”とはその広い意味で理解すべきであり、旧来のゲノム遺伝子の転写制御配列類を含み、ＣＣＡＡＴボックス配列があってもなくてもよい正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックス、および発生および／または外部刺激に応じてまたは組織特異的に遺伝子発現を変化させる他の制御要素類（すなわち、上流活性化配列類、エンハンサー類およびサイレンサー類）が含まれる。本文脈では、用語“プロモータ”とはまた、組み換え、合成または融合分子、または機能可能なように連結しており前記ポリペプチドまたはペプチド断片をコードする核酸分子の発現を起こさせ、活性化させまたは増大させる誘導体類を述べるためにも用いられる。好適なプロモータ類は、１種以上の特異的制御要素類のコピーをさらに含むことができ、前記核酸分子の発現を促進し、および／または空間的発現および／または一時的発現を変化させることができる。
プロモータ配列の制御コントロール下において、すなわちプロモータ配列を“機能可能なように連結させて”核酸分子を配置することは、前記分子を、発現がこのプロモータ配列によってコントロールされるように配置することを意味する。プロモータは、一般的に、コントロールするコード配列の５’（上流）に配置される。異種プロモータ／構造遺伝子の組み合わせを構築するため、一般的に、遺伝子転写開始部位から距離をおいてプロモータを配置するのが好適であり、それは、プロモータとその天然の配置においてコントロールする遺伝子すなわちプロモータが由来する遺伝子の間の距離とおよそ同じである。さらに、プロモータを含む制御要素類は、通常、遺伝子転写開始部位の２ｋｂ以内に配置される。当該技術で公知であるように、この距離はプロモータ機能が失われない範囲で変化させることができる。同様に、そのコントロール下に配置される異種遺伝子に関して制御配列要素の好適な配置は、その天然の配置における前記要素の位置により規定され、すなわち、由来する遺伝子類の位置によって規定される。また、当該技術で公知であるように、この距離にもなんらかの変化を起こすことができる。
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のような細菌中で未改変のポリペプチド類およびペプチド類を産生させるための必須要件は、有効なリボゾーム結合部位を有する強力なプロモータを使用することである。大腸菌のような細菌細胞中での発現に適した典型的プロモータ類には、ｌａｃｚプロモータ、温度感受性λLまたはλRプロモータ類、Ｔ７プロモータまたはＩＰＴＧ誘発ｔａｃプロモータを含むが、これらに限定されるわけではない。大腸菌において本発明の核酸分子を発現するための他のいくつかのベクター系は当該技術で公知で、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８、１９８７）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９）に記載されている。細菌中での発現に適したプロモータ配列と効率的リボゾーム結合部位を有する数多くのプラスミド類が記載されており、とりわけ、例えば、ｐＫＣ３０（λL：Ｓｈｉｍａｔａｋｅ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ２９２、１２８、１９８１）；ｐＫＫ１７３−３（ｔａｃ：Ａｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｏｓｉｕｓ，Ｇｅｎｅ４０，１８３、１９８５）、ｐＥＴ−３（Ｔ７：Ｓｔｕｄｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９，１１３，１９８６）；アラビノース誘発可能プロモータを含むベクターのｐＢＡＤ／ＴＯＰＯまたはｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯシリーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（後者は、また、チオレドキンとの融合たんぱく質類を産生させ発現たんぱく質の溶解性を高めるように設計されている）；発現ベクター類のｐＦＬＥＸシリーズ（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、ＣＴ，ＵＳＡ）；または発現ベクター類のｐＱＥシリーズ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）である。
真核細胞のウイルス類および真核細胞での発現に適した典型的プロモータ類には、とりわけ、ＳＶ４０レートプロモータ、ＳＶ４０アーリプロモータおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＣＭＶ ＩＥ（サイトメガロウイルスイミーディアットアーリ）プロモータが含まれる。哺乳類細胞（例 ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、１０Ｔ細胞、２９３Ｔ細胞）における発現に好適なベクター類には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ供給のｐｃＤＮＡベクターシュート、特にＣＭＶプロモータを含みＣ末端６ｘＨｉｓをコードするｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇおよびＭＹＣｔａｇ；およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１、１７８５、１９９１）があるが、これらに限定されない。ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｓ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、２９３Ｔ細胞においてたんぱく質分泌形態を発現させるために特に好適であり、発現ペプチドまたはたんぱく質は、ニッケルカラムを用いてたんぱく質をＨｉｓ ｔａｇにより結合させる標準的アフィニティ技術を用いて同種たんぱく質を含まないように精製できる。
ポリペプチド結合パートナーまたはその免疫性誘導体類を発現させるために適した広範囲の他の宿主／ベクターシステムが一般的に入手可能であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９）に記載されている。
単離した核酸分子またはそれを含む遺伝子構築体を発現させるために細胞中に導入する手段は、当業者に周知である。ある生物に使用した技術は、公知の成功した技術に依存する。組み換えＤＮＡを動物細胞に導入する手段には、特に、ミクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）および／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてのようなリポゾーム媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、エレクトロポーレーションおよびＤＮＡ被覆タングステンまたは金粒子を用いてのようなミクロパーティクル衝撃（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．、ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。
別の態様において、各結合パートナーをコードする配列を含む核酸をプロモータ配列に機能可能なように連結配置し、適切な細胞中で発現させる。もし前記たんぱく質パートナー類が同一細胞で発現するならば、それらは、前記細胞中で自由に会合でき、本発明のたんぱく質複合体を形成する。もし前記たんぱく質パートナー類が異なる細胞中で産生されるならば、前記細胞を溶解させ、細胞溶解物を、前記結合パートナー類が会合するのに充分な条件下で混合する。
この態様によれば、前記結合パートナー類をコードするヌクレオチド配列類は、同一または異なる核酸分子類に含ませることができ、その結果として、前記結合パートナー類を発現する単一または複数の遺伝子構築体類を用いることも本発明によって明確に包含される。本文に記載したような融合ポリペプチド類を発現させるための要件はまた、この文脈において関連性があり、ただし、スペーサーの必要性についてを除く。一般的に、異なるプロモータ類を用いて、例えばプロモータ類または細胞性転写因子類の制御配列類間のつぶしあいまたは競合を避けるため、各結合パートナーを発現させるであろう。
本発明の別の態様は、疾患または疾患状態を決定するための予後および診断方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質
を含むたんぱく質複合体を検出することを含む。
ひとつの態様において、本文に記載の前記診断および／または予後方法は、
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体を検出する。
ひとつの態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質と腫瘍サプレッサー活性を有する核たんぱく質との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、非制御細胞分割または細胞の過増殖または例えば卵巣癌または肝細胞癌または扁平細胞癌または乳癌または転移性メラノーマのような癌と関連する腫瘍類の出現または発症と関連している。
別の態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質とセルサイクル調節活性を有する核たんぱく質との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、非制御細胞分割または細胞の過増殖または例えば卵巣癌または肝細胞癌または扁平細胞癌または乳癌または転移性メラノーマのような癌と関連する腫瘍類の出現または発症と関連している。
さらに別の態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質とＤＮＡ修復またはＤＮＡ損傷に関連するたんぱく質との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、非制御細胞分割または細胞の過増殖または例えば卵巣癌または肝細胞癌または扁平細胞癌または乳癌または転移性メラノーマのような癌と関連する腫瘍類の出現または発症と関連している。
さらに別の態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質とプロゲステロンレセプターたんぱく質との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、例えば、プロゲステロン媒介腫瘍発生または腫瘍増殖または非制御細胞分割または細胞の過増殖を高めるなどのリガンド依存症においてレセプタを活性化する。
さらに別の態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質と血管形成に関連するたんぱく質との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、対象における新規血管形成に関連している。好適には、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、癌、乾癬、糖尿病性失明、年齢関連黄斑変性症または関節リウマチに苦しむ対象における血管形成性または血管新生に関連している。
さらに別の態様において、本発明は、ＥＤＤたんぱく質とカルシウム／インテグリン結合たんぱく質（ＣＩＢ）またはＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ相互作用性たんぱく質（ＫＩＰ）との特異的相互作用を検出するための試薬類および方法類に関し、前記たんぱく質−たんぱく質相互作用は、ＤＮＡ損傷を受けている細胞中で低下している。
本文で検討した好適な検出システムには、ヒトまたは哺乳類対象から単離した生体試料中におけるたんぱく質−たんぱく質相互作用を、例えば、前記複合体または各結合パートナーに対する１種以上の抗体類またはそのエピトープを用いてのようにして検出する公知の全てのアッセイを含む。これとは別に、前記たんぱく質複合体の非抗体リガンドを用いることもでき、例えば、小分子（例 化学化合物、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリズムの調節剤、複合体形成または解離を調節できるかまたはできない競合的阻害剤または非競合的阻害剤）である。
抗体に基づくアッセイ系の使用が、特に好適である。これらの態様によれば、前記抗体または小分子をたんぱく質複合体またはたんぱく質−たんぱく質相互作用を検出できるいかなる標準的固相または液相アッセイフォーマットにおいて使用することもできる。
たんぱく質複合体に特異的に結合する抗体類を、前記たんぱく質複合体の存在を特徴とする状態または疾患の診断のため、または治療をしているかまたはしていない状態での疾患進行をモニターする予後アッセイにおいて使用する。診断アッセイには、ヒト体液または細胞または組織抽出物中における前記たんぱく質複合体検出抗体および標識を用いる方法が含まれる。抗体を修飾してまたは修飾することなく用いて、共有結合でまたは非共有結合でレポーター分子により標識することもできる。当該技術で公知の広範囲のレポーター分子を用いることができ、そのうちの数種について上記で説明してある。
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含むたんぱく質複合体測定用のさまざまなプロトコールが、当該技術で公知であるかまたは本文に記載されている。このような方法は、疾患関連たんぱく質複合体のレベルを診断するための基盤を提供する。たとえば、ＥＤＤおよび／またはその結合パートナーのひとつ（例 ＥＤＤ／ＣＨＫ２またはＥＤＤ／ＢＲＣＡ２）の過剰発現によって誘発された癌に関係した本発明のたんぱく質複合体は、疾患から生存する予後が悪いことを示す。健常個人の複合体の正常または標準値は、正常または健常対象、好適にはヒト対象から採取した体液または細胞抽出物を組み合わせることによって、確立する。
標準的複合体形成量は、さまざまな方法によって定量化でき、好適には、分光学的手段によってまたは定量的イムノアッセイ（例 ＥＬＩＳＡ）における抗体類を用いて定量化でき、たんぱく質複合体の量は、例えば、ＥＤＤたんぱく質ドメインを含むペプチドのような標準的ペプチドの公知量に対して比較することによって決定する。
生検組織から得た対象試料中で発現したたんぱく質複合体の量を、標準値と比較する。標準と対象値の偏差により、疾患診断または予後確立のためのパラメータを確立する。癌性組織の場合、健常対象で検出されたたんぱく質複合体の標準レベルを超えるたんぱく質複合体のレベルは、疾患を診断させ、生存予後が悪いことを示唆する。
例えばマススペクトロメトリ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサーテクノロジー、エバネッセントファイバーオプティックス、または蛍光共鳴エネルギートランスファ、を用いる光学的または蛍光検出が本発明の範囲に含まれることは明らかである。
バイオセンサー診断装置において、アッセイ基質とディテクター表面は、単一デバイスに組み込む。一般的バイオセンサーでは、電流またはインピーダンス測定要素を併用した電極表面を用いて、たんぱく質−たんぱく質結合事象の存在に応答した電流またはインピーダンスの変化を検出する（例 米国特許第５，５６７，３０１）。重量法によるバイオセンサーでは、ピエゾ電気結晶を用いて表面音波を産生させるが、その周波数、波長および／または共鳴状態が結晶表面上で表面質量に感受性である。音波性質がシフトすることが従って、例えばたんぱく質−たんぱく質結合の結果（例 米国特許第５，４７８，７５６および４，７８９，８０４）として、表面質量の変化を示唆する。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果に基づくバイオセンサー類もまた、例えば米国特許第５，４８５，２７７および５，４９２，８４０において提唱されており、それらは、たんぱく質がＳＰＲ界面に結合した時に起こるＳＰＲ表面反射角のシフトを活用している。最後に、バイオセンサー表面における光学性質変化を利用するさまざまなバイオセンサー類が公知である（例 米国特許第５，２６８，３０５）。
バイオセンサー類は、分離した反応基質とリーダデバイスを有する結合アッセイシステムに比べていくつかの強力な利点を有する。ひとつの重要な利点は、小規模であるが極めて再現性のあるバイオセンサーユニットをマイクロチップ製造法を用いて製造する能力であり、例えば、米国特許第５，２００、０５１および第５，２１２，０５０に記載されている。別の利点は、１個のバイオセンサーユニットに組み込み可能な非常に多数であることもできる異なる分析物質検出領域であり、極めて少量の体液試料により数種の分析物質を高感度で検出できることである。したがって、たんぱく質複合体を形成するそれぞれの結合パートナーを同時に検出すること、または本発明の１個以上のたんぱく質複合体類を同時に検出することが、バイオセンサーを用いて可能となる。
エバネッセントバイオセンサー類は特に好適であり、それらは、未結合物質からたんぱく質複合体を分離することを要せず、それらの用途は、Ｈｉｒｓｃｈｆｉｅｌｄが米国特許第４，４４７、５４６において最初に述べているように、標準的イムノアッセイフォーマットにくみ込むことができる。一般的に、エバネッセントバイオセンサー類は、例えば、プローブ表面近くで結合させた蛍光抗体または小分子のような蛍光分子と相互作用する特定の波長の光に依存し、本発明のたんぱく質複合体が前記抗体または小分子に結合すると別の波長の蛍光を出す。前記バイオセンサーは、前記センサー表面にたんぱく質が非特異的に結合することが原因による感度の劣化から、前記センサー表面を非干渉性たんぱく質溶液に暴露させることによって保護されており、その結果、前記非干渉性たんぱく質は、前記センサー表面に結合し、前記干渉性たんぱく質のその後の結合を防止する。生体たんぱく質類からの表面保護増強は、また、例えば、フッ素化アルカン類を含む溶媒に溶解させたテトラフルオロエチレンおよびビス−２，２−トリフルオロメチル−４，５−ジフルオロ−１，２−ジオキソールの無晶性コポリマーを薄膜保護コーティングとして蒸着適用した保護性コーティングにより表面を完全に被覆することによって可能である（Ｐａｔｏｎらによる米国特許第５，３５６，６６８）。
大量の試料を高処理スクリーニングするための用途に適したアッセイシステム、特に高処理分光共鳴法（例 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレイＭＳまたはナノエレクトロスプレイＭＳ）またはリアルタイム会合／解離定数決定を促進する検出系は、特に考慮される。
別の態様において、診断または予後は、結合パートナー発現レベル（類）を別々に決定することによって行われる。この場合、結合パートナー発現レベルは、標準的たんぱく質基盤検出系、抗体基盤法、または核酸基盤法によって決定される。たとえば、ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターのようなある結合パートナーの発現が高レベルであることは、疾患を示唆でき、あるいは、癌性組織の場合、生存予後が悪いことを示す。このことは、いかなる作用理論または作用方式に拘束されることもなく、プロゲステロンレセプターにトランス作用し、それによってプロゲスチン感受性のまたはプロゲステロンレセプター媒介細胞増殖を増強させるＥＤＤの結果である。
一方、高レベルのＥＤＤに結合した低レベルのＣＨＫ２またはＢＲＣＡ２は疾患を診断できるかまたは予後不良を示唆するが、比較的高レベルのＣＨＫ２および／またはＢＲＣＡ２に結合した低レベルのＥＤＤは一般的に予後良好を示唆する。このことは、いかなる作用理論または作用方式に拘束されることもなく、細胞中における正常なＢＲＣＡ２／ＣＨＫ２機能を防止するＥＤＤの結果である。
ひとつの態様において、ＥＤＤまたは例えば、合成オリゴヌクレオチド、相補性ＲＮＡ、ＲＮＡまたはたんぱく質−核酸（ＰＮＡ）のようなその結合パートナーをコードする核酸を用いて、前記ポリペプチドの発現が疾患と相関している生検組織中における遺伝子発現を検出しかつ定量化する。前記診断アッセイは、前記結合パートナーの不在、存在および過剰発現を識別するため、または最初の診断後または治療干渉中において発現をモニターするために用いることもできる。たんぱく質検出システムによってと同様に、ＥＤＤおよび／またはプロゲステロンレセプターの過剰発現の検出が好適である。
特定細胞、組織または臓器における数種の結合パートナーの発現の共局在化を例えばＦＩＳＨまたは他の発現検出系を用いて検出すると、疾患が同様に示唆される。
ひとつの態様において、結合パートナーをコードする核酸（ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の検出を可能とするＰＣＲプローブ類とのハイブリダイゼーションを用いる。前記プローブの特異性は、そのヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションまたは増幅の緊縮（最大、高、中等度、または低）によって決定される。一般的に、高特異性プローブ類は、より高い緊縮条件での使用に適している。
結合パートナーの発現に関連した疾患診断のための基盤を提供するため、パートナー発現の正常または標準的プロフィールを、例えば、正常対象から得た体液または細胞抽出物を結合パートナーまたはその部分をコードする核酸とハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下で組み合わせることによって、確立する。その際の標準ハイブリダイゼーションは、正常対象から得た値を実質的に精製核酸の公知量を用いて得たシグナルと比較することによって、定量する。正常試料から得た標準値を、次に患者試料から得た値と比較する。標準と対象値の偏差が、疾患を診断する。いったんこの方法または別の方法で診断がなされると、ハイブリダイゼーションアッセイを行って経時的または治療経過中に結合パートナーの発現を評価する。
癌に関して、比較的多量のＥＤＤおよび／またはその認識結合パートナー特にプロゲステロンレセプターをコードするＲＮＡが個人から得た生検組織中に存在することは、前記疾患発生素因を示すかまたは前記疾患の診断ができ、好適には実際に臨床症状が出現する前である。これとは別にまたはさらに、これらの転写体レベルが高いことは、生存予後が不良であることを示唆する。
発現を定量化するために使用する方法には、放射性標識またはビオチン化ヌクレオチド類、対照核酸の同時増幅および実験結果を内挿するための標準曲線使用が含まれる（Ｍｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５９、２３５−２４４、１９９３；Ｄｕｐｌａａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２、２２９−２３６、１９９３）。
たんぱく質複合体形成調節剤同定用スクリーニングアッセイ
さらに本発明の態様は、単離または組み換えたんぱく質複合体の活性、形成または安定性の調節剤を決定する方法を提供し、前記たんぱく質複合体は、
（ｉ）ＥＤＤたんぱく質または腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質部分；および
（ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質、または前記ＥＤＤたんぱく質若しくはＥＤＤたんぱく質の前記部分に結合するのに充分な前記たんぱく質部分
を含む。
ひとつの態様において、前記たんぱく質複合体は、
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択される。
前記調節剤は、複合体形成または安定性を増強するかまたはこれとは別に、部分的にまたは完全にたんぱく質複合体形成を阻害し、複合体形成を防止しまたは細胞中における複合体代謝を増強する。ひとつの態様において、前記調節剤は、ＥＤＤおよび／またはプロゲステロンレセプター代謝を促進または増強し、特に癌細胞中においてそうである。
本発明の方法はその一般的形態において、候補化合物または候補抗体の存在下および不在下においてたんぱく質複合体の会合または解離、または前記複合体の構造を決定することを含む。本文に記載のこの態様によれば、候補化合物または候補抗体存在下における前記たんぱく質複合体の会合、解離または構造の修飾は、前記候補がたんぱく質複合体の調節剤であることを示唆する。
前記複合体の会合、解離または構造は、例えば、前記候補存在下または不在下におけるリアルタイム会合または解離定数を求めること、または前複合体の構造上のエピトープを認識する抗体の結合修飾を求めることによって、直接手段によって決定できる。基本的に上記で説明したようなバイオセンサー類は、候補化合物または抗体の存在下または不在下において、このような適用に特に適している。
これとは別に、前記複合体の会合、解離または構造は、例えば、たんぱく質リクルートシステム、ｎ−ハイブリッドスクリーン、逆ｎ−ハイブリッドスクリーン、平板寒天拡散アッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはたんぱく質−たんぱく質相互作用検出用の他の周知のアッセイフォーマットを用いて間接手段によって決定することもできる。このような間接手段は一般的に、たんぱく質複合体の形成または解離を検出するためのレポーターシステムを用いる。
標準的固相ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットは、特に、たんぱく質−たんぱく質相互作用のアンタゴニストの同定に有用である。この態様によれば、結合パートナーのひとつ（例 ＥＤＤまたはその部分）を、例えばポリマーピンアレイまたはガラスサポートのような固体マトリックスに固定する。従来、固定結合パートナーは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ；例 ＥＤＤ−ＧＳＴ融合体）を含む融合ポリペプチドであり、ここで、ＧＳＴ部分は、固相支持体へのたんぱく質固定を促進する。溶液中の第２の結合パートナー（例 プロゲステロンレセプター、ＣＨＫ２、ＣＩＢ、またはＢＲＣＡ２）を、固定たんぱく質との物理的関係に保ち、たんぱく質複合体を形成させ、その複合体は、第２結合パートナーに対する抗体を用いて検出する。前記抗体は、一般的に蛍光分子で標識するかまたは酵素（例 ホースラディッシュパーオキシダーゼ）に結合させるか、または、第１抗体に結合する第２の標識抗体を用いることもできる。従来、第２結合パートナーは、ＦＬＡＧまたはオリゴ−ヒスチジンペプチドタグまたは他の適切な免疫性ペプチドとの融合ポリペプチドとして発現し、前記ペプチドタグに対する抗体を用いて結合パートナーを検出する。これとは別に、オリゴ−ＨＩＳのタグをつけたたんぱく質複合体類は、ニッケル−ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）に対するそれらの結合によって検出することもでき、またはＦＬＡＧ標識たんぱく質複合体類は、ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティゲル（Ｋｏｄａｋ）に対するそれらの結合によって検出することもできる。当業者には、本文に記載のアッセイフォーマットが結合ペプチドまたは融合たんぱく質のミクロアレイを用いてのように試料の高処理スクリーニングを可能とすることがわかるであろう。
標準的ＥＬＩＳＡタイプアッセイフォーマットの修飾において、結合パートナーは、その上への化学合成のような固体支持体上に固定され、またはビオチン標識され液相で使用することもできる。
ツーハイブリッドアッセイは、参照により本文に取り込まれるＰａｙａｎらの米国特許第６，３１６，２２３に記載されている。Ｐａｒａｎらが記載の基本的メカニズムは、酵母ツーハイブリッドシステムと類似している。ツーハイブリッドシステムにおいて、結合パートナーを２種の異なる融合たんぱく質として哺乳類宿主細胞中で発現させる。本目的に前記標準的ツーハイブリッドシステムを適合させる際、第１の融合たんぱく質は、前記結合パートナーのひとつに融合したＤＮＡ結合ドメインから構成され、第２の融合たんぱく質は、他の結合パートナーに融合した転写活性化ドメインから構成される。前記ＤＮＡ結合ドメインは、ひとつ以上のレポーター遺伝子の発現を制御するオペレータ配列に結合する。転写活性化ドメインは結合パートナー間との機能的相互作用を介してプロモータにリクルートされる。その後、この転写活性化ドメインは細胞の基礎転写機構と相互作用し、それによってレポーター遺伝子（類）の発現を活性化し、その発現を決定できる。結合パートナー間のたんぱく質−たんぱく質相互作用を調節する候補生体活性物質は、宿主細胞とインキュベーションした時のレポーター遺伝子（類）の転写調節能によって同定する。アンタゴニストは、レポーター遺伝子発現を防止するか低下させ、一方、アゴニストは、レポーター遺伝子発現を増強させるであろう。小分子調節剤の場合、これらは、細胞培地に直接添加しレポーター遺伝子発現を決定する。一方、ペプチド調節剤類は、宿主細胞に移入した核酸から発現可能であり、レポーター遺伝子発現を決定する。実際、全ペプチドライブラリを移入細胞中でスクリーニングできる。
これとは別に、逆ツーハイブリッドスクリーンは例えばＶｉｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３、１０３１５−１０３２０、１９９６によって記載されており、これらを用いてアンタゴニスト分子を同定できる。逆ハイブリッドスクリーンは、上記の正スクリーンとそれらがＣＹＨ２またはＬＹＳ２のようなカウンター選択性レポーター遺伝子を使用し、たんぱく質−たんぱく質相互作用に対して選択する点で異なっている。細胞生存または増殖は、産生されたカウンター選択性レポーター遺伝子という非毒性物質存在下で低下するかまたは防止され、それは、前記遺伝子産物によって毒性化合物に変換される。したがって、前記相互作用のアンタゴニスト存在下のような本発明のたんぱく質−たんぱく質相互作用が起こらない細胞は、前記基質存在下において生存するが、それが毒性産物に変換されないであろうということが理由である。たとえば、ＥＤＤは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとのようにＤＮＡ結合ドメイン融合体として発現することができ、ＥＤＤに結合するプロゲステロンレセプターまたはＣＨＫ２またはＢＲＣＡ２の部分は、（例 ＧＡＬ４転写活性化ドメインとの）適当な転写活性化ドメイン融合ポリペプチドとして発現される。前記融合ポリペプチドは、酵母中でＵＲＡ３カウンター選択性レポーター遺伝子と機能的に連結して発現され、ＵＲＡ３の発現には、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの物理的関係を必要とする。この物理的関係は、たとえば、ＧＡＬ４が結合するヌクレオチド配列を含むプロモータの制御下にレポーター遺伝子発現を置くことによって、達成することができる。レポーター遺伝子が発現する細胞はウラシルおよび５−フルオロロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で増殖せず、これは５−ＦＯＡが毒性化合物に変換されることが理由である。候補ペプチド阻害剤（類）は、このような細胞のライブラリ中で発現し、ウラシルおよび５−ＦＯＡの存在下で増殖する細胞は、たとえば候補ペプチド阻害剤（類）をコードする核酸分析のようなさらなる分析のために保持される。相互作用に拮抗する小分子類は、小分子類存在下で細胞をインキュベーションしウラシルおよび５−ＦＯＡ存在下で成長するかまたは生存する細胞を選択することによって、決定される。
これとは別に、Ｋａｒｉｎらの米国特許第５，７７６、６８９に記載のようなたんぱく質リクルートメントシステムを用いる。標準的たんぱく質リクルートメントシステムでは、たんぱく質−たんぱく質相互作用が、転写因子ではないエフェクターたんぱく質を特定の細胞コンパートメントにリクルートすることによって、細胞中で検出される。エフェクターたんぱく質が細胞コンパートメント中に移動すると、そのエフェクターたんぱく質はコンパートメント中に存在するレポーター分子を活性化し、レポーター分子の活性が、たとえば、細胞生存によって検出可能であり、このことは、たんぱく質−たんぱく質相互作用が存在していることを示唆している。さらに詳細には、たんぱく質リクルートメントシステムの成分類には、エフェクターたんぱく質と結合パートナーのひとつ（例 プロゲステロンレセプターまたはその部分またはＣＨＫ２またはその部分またはＢＲＣＡ２またはその部分）を含む第１融合たんぱく質をコードする発現可能第１核酸およびＥＤＤとＮＬＳ未改変物を含む第２たんぱく質をコードする発現可能第２核酸がある。この文脈でのレポーター分子は、エフェクターたんぱく質によって制御される分子または細胞性事象を含むであろう。内因性エフェクターたんぱく質の活性を欠損しているまたは存在していない細胞系統または細胞株（例 酵母細胞または他の非哺乳類細胞）も同様に必要であり、その結果、たんぱく質−たんぱく質相互作用が存在していない場合に前記レポーター分子が発現されない。使用に際して、前記融合ポリペプチドの結合パートナー部分とＥＤＤとの間に複合体が形成され、それによって、ＥＤＤ ＮＬＳに結合しているインポーチンたんぱく質によって媒介された核への前記複合体の移動が誘導され、そのとき、前記フェクターたんぱく質はレポーター分子を活性化する。このようなたんぱく質リクルートメントシステムは、基本的にあらゆるタイプの細胞で実施でき、たとえば、哺乳類、鳥類、昆虫類および細菌細胞中が含まれ、さらにさまざまなエフェクターたんぱく質／レポーター分子システムを用いる。
これとは別に、酵母細胞に基づくアッセイも行うことができ、ＥＤＤとその結合パートナーの１個以上との相互作用の結果、形質膜へグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）がリクルートされることになり、ＧＥＦはＲａｓのようなレポーター分子を活性化させ、それによって、特定の細胞培養条件下では生存しないであろう細胞を生存させることができる。本目的のために適した細胞には、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｃｄｃ２５−２細胞が含まれ、それは、機能的ＧＥＦがその中で発現されたときのみ３６℃で増殖する（Ｐｅｔｉｔｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２４，７９７−８０６，１９９０）。形質膜へのＧＥＦの移送は、形質膜局所ドメインによって促進される。Ｒａｓの活性化は、例えば、細胞中へのサイクリックＡＭＰレベルを市販のアッセイキットおよび／または試薬類を用いて検出される。本発明のたんぱく質−たんぱく質相互作用調節剤を検出するため、細胞中試験化合物存在下または不在下でまたは候補調節ペプチド発現の存在下または不在下で二重インキュベーションを行う。候補化合物または候補ペプチド存在下における細胞生存または増殖の低下は、前記ペプチドまたは化合物が、ＥＤＤとその結合パートナーの１種以上との相互作用のアンタゴニストであることを示唆する。
また、“逆”たんぱく質リクルートメントシステムについても検討し、細胞の生存変化または増殖変化が、候補化合物または候補ペプチドによるたんぱく質−たんぱく質相互作用の破壊においても連続する。たとえば、ＧＥＦ存在下で活性化Ｒａｓを構成的に発現させるＮＩＨ ３Ｔ３細胞を用いることができ、細胞変換がないことが候補化合物またはペプチドによるたんぱく質複合体破壊を示唆する。対照的に、ＧＥＦ存在下で活性化Ｒａｓを構成的に発現させるＮＩＨ ３Ｔ３細胞は、形質転換表現型を有する（Ａｒｏｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．７８、９４９−９６１、１９９４）。
さらに別の態様では、小分子類を、参照により本文に取り込まれるＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ、ＴＩＢＳ １７、３７４−３８１、１９９９に記載の平板寒天拡散アッセイによって本発明のたんぱく質複合体を解離させるその能力を試験する。
さらに別の態様において、
（ｉ）調節剤は候補化合物または候補抗体不在下において
（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；
（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；
（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；
（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；
（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；
（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および
（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体
から構成される群から選択されたたんぱく質複合体レベルを決定すること；および
（ｉｉ）候補化合物存在下または前記候補抗体存在下において前記たんぱく質複合体のレベルを決定すること、を含むプロセスによって決定され、
（ｉ）および（ｉｉ）における前記たんぱく質複合体レベルの差が、候補化合物または候補抗体が前記相互作用の調節剤であることを示唆する。
本発明のこの態様は、前記たんぱく質結合パートナーのあらゆる１個以上の部分を含むたんぱく質複合体の決定にとって、必要な変更を加えて適用される。
当業者は、上記で述べたアンタゴニスト用前記アッセイ方法のいかなる１種以上も、この目的のために適応させることができることを理解するであろう。このことは、候補化合物または抗体の存在下または不在下におけるたんぱく質複合体レベルがＥＬＩＳＡの場合抗体結合に関連しており、またはハイブリッドスクリーンまたはたんぱく質リクルートメントシステムの場合細胞生存または増殖に関連していることが理由である。ＥＬＩＳＡに基づくアッセイフォーマットは、特に、この目的に適しており、抗体が結合するたんぱく質標準の公知量に対して検出システムを校正することによって、それらが容易に定量化可能であることが理由である。このような定量化が、当業者に周知である。
本文に記載の方法を用いて同定された調節剤類は、過増殖性疾患または異常セルサイクル制御関連障害、異常ＤＮＡ損傷または修復、異常血管形成、例えば、異常細胞分割、腫瘍形成、腫瘍転移または腫瘍細胞侵襲のようなプロゲスチン感受性障害またはプロゲステロンレセプター媒介障害の治療または予防的措置に有用である。前記調節剤類は、好適には、扁平細胞癌、肝細胞癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、頭頸部癌、アデノカルシノーマ、扁平肺癌、消化管癌（例 胃、結腸、または膵臓癌）、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、非扁平癌、神経膠芽腫および髄芽腫から構成される群から選択される癌に関連する１種以上の症状の治療に有用である。これとは別にまたはさらに、前記調節剤類は、好適には、強力な癌の一部の形態、糖尿病性失明、年齢関連黄斑変性症、関節リウマチおよび乾癬のような過剰血管形成関連疾患、および、例えば冠動脈疾患、卒中および創傷治癒遅延のような不十分な血管形成に関連する障害のような異常血管形成関連障害または状態の治療に有用である。さらに、前記調節剤は好適には、創傷治癒誘発、臓器再生刺激、黄体中濾胞発生刺激、妊娠中における胎盤成長刺激および妊娠中における胚成長刺激に有用である。
治療適用
別の態様において、本発明は、細胞中におけるＥＤＤたんぱく質発現上昇に関連した状態の治療方法を提供し、前記方法は、細胞中におけるＥＤＤ発現を低下させるために有効な量の化合物を投与することを含む。
ひとつの態様において、ＥＤＤ過剰発現に関連した状態は癌であり、特に、扁平細胞癌、肝細胞癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、頭頸部癌、アデノカルシノーマ、扁平肺癌、消化管癌（例 胃、結腸、または膵臓癌）、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、非扁平癌、神経膠芽腫および髄芽腫から構成される群から選択される癌である。しかし、本発明の方法が、適当な時期にかつ適切な量で投与されれば、あらゆる有糸分裂への細胞進行防止に適していることがわかる。
ひとつの態様において、投与される化合物は、核酸を含む。好適には、前記核酸は、ＥＤＤ発現のアンタゴニストであり、例えば、アンチセンス核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイムまたは干渉性ＲＮＡであり、それは、全体としてまたは部分的に、センス鎖を含む標的分子に対して相補性で、標的分子、特にＥＤＤをコードするＲＮＡにハイブリダイズできる。適切な方法を用いて細胞中に導入されると、このような核酸は、センス鎖によってコードされたＥＤＤ遺伝子発現を阻害する。アンチセンス核酸、リボザイム（例 Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＵＳＳＮ ４，９８７，０７１；Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＵＳＳＮ ５，１１６、７４２；Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１、１４１１−１４１８、１９９３）、トリプルへリックス形成可能な核酸（例 Ｈｅｌｅｎｅ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．６、５６９−５８４、１９９１）、ＰＮＡ（Ｈｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４，５−２３、１９９６；Ｏ‘Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３、１４６７０−１４６７５、１９９６）、干渉ＲＮＡ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１１、４９４−４９８，２００１；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．１５、４８５−４９０、２００１；Ｌｉｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０７、２９７−３０７、２００１；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ １０７、４１５−４１８，２００１）または小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、当業者に周知の標準的技術を用いて、本文に開示の配列に基づき産生させることもできる。
好適には、アンチセンス核酸、リボゾーム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１または配列番号３に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列の少なくとも約１５〜２０個の連続ヌクレオチドに対して相補性の配列（すなわち、ＥＤＤコードｍＲＮＡに対して相補性である）を含み、それにハイブリダイズできる。たとえば、このようなアンタゴニスト核酸は、配列番号１または３またはハイブリダイゼーションするのに充分なその部分を有する標的核酸に相補性であることができる。ＥＤＤをコードするｍＲＮＡの少なくとも約２５または３０または３５または４０または４５または５０個の連続ヌクレオチドに相補性の配列を含む長い分子類も同様に本発明に包含される。
本文に例示したように、干渉ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡを使用することが、細胞におけるＥＤＤ発現を下方に制御しそれによって細胞増殖を阻害し、細胞がセルサイクルのＧ２／Ｍ相に集積するようにさせるか、または変化した細胞−細胞接触、変化した細胞形状および脱組織化を起こさせるようにする。このような干渉ＲＮＡは一般に、二重鎖ＲＮＡを形成可能な自己相補性領域を有するＲＮＡ分子を含む。
ひとつの態様において、アンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む構築体を適切な細胞に導入し、その中でのＥＤＤ発現および／または活性を阻害させることができる。別の態様において、このような構築体を哺乳類細胞の一部またはすべてに導入することができる。アンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡまたは干渉ＲＮＡは、ＥＤＤ発現とその後のＥＤＤたんぱく質を必要とする欠損性たんぱく質−たんぱく質複合体類形成を阻害する。したがって、癌または前記構築体を含む細胞中におけるＥＤＤによって媒介される過増殖性プロセスが、阻害される。
結合活性、シグナル活性および／または細胞性過増殖性応答刺激のようなＥＤＤたんぱく質に特徴的な１個以上の機能を阻害できる抗体類の用途もまた、本発明に包含される。ひとつの態様において、本発明の抗体類は、哺乳類ＥＤＤたんぱく質へのリガンド（すなわち、１個以上のリガンド類）結合を阻害でき、および／またはリガンド結合に応答して哺乳類ＥＤＤたんぱく質媒介の１種以上の機能を阻害できる。特に好適な態様において、前記抗体は、ＥＤＤとプロゲステロンレセプターのような天然のリガンドとの相互作用を阻害（低下または防止）できる。
１種以上の物質を適当な経路で、単独または他の薬剤と併用して宿主に投与できる。有効量の核酸またはアンタゴニストまたはアゴニスト活性を有する抗体物質を投与する。有効量とは、投与条件下において所望の治療または予防効果を達成のに充分な量であり、例えば、ＥＤＤ機能阻害または促進に充分な量である。
癌治療のため、特に、癌組織または細胞のような１種以上の特定細胞または組織中のＥＤＤ発現を標的にするのが好適であり、それによって、活性物質が確実にその細胞／組織に伝達され、全体の細胞増殖を阻害しないことが望ましい。腫瘍特異的抗原を認識する抗体類を用いて、腫瘍に細胞毒性薬物を運搬させてきた。腫瘍特異的抗原を認識する抗体類を活性化合物に連結させるが、しかし固形腫瘍の場合、免疫複合体は腫瘍組織浸透が効果的というわけでない。
Ａｒａｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７９、３７７−３８０、１９９８は、ヒト乳癌移植片に会合させた内皮細胞に局在化させたペプチドを用いて、新脈管形成を阻害することによって間接的に腫瘍成長をブロックした。前記ペプチドに細胞毒性薬物ドクソルビシンを結合させることによって、腫瘍関連血管が選択的に破壊されることを観察した。次に、この結果、腫瘍が壊死しならびに担癌マウスの生存が上昇した。
Ｈｏｎｇら（米国特許公報第２００２０１０２２６５；ＵＳＳＮ ０９／８９９，３７６を公表）は、ヒト扁平癌、および乳癌細胞のような固形腫瘍組織細胞によって特異的に内在性としたペプチド（ＨＮ−１）の単離を記載した。したがって、Ｅｄｄ遺伝子発現産物を標的とする抗癌化合物類をＨＮ−１に連結させ、例えば舌または頭頸部扁平細胞癌、乳癌、神経膠芽腫または星状腫のような（例 口腔、咽頭、のど、鼻傍洞、鼻洞、喉頭、甲状腺、副甲状腺、唾液腺、顔皮膚、頸皮膚、または頸管リンパ節の）扁平細胞癌のような腫瘍組織に特定して投与する。このような連結体は、静注投与、腫瘍内投与、皮下投与、腹腔内投与または局所投与によって運搬させることができる。さらに特定の態様において、前記連結体は、局所、部位または全身投与によっても投与される。
これとは別に、ＥＤＤ発現産物阻害剤をコードする核酸は、たとえば、Ｅｄｄ遺伝子過剰発現を標的とできるかまたはＥＤＤ含有たんぱく質複合体形成を標的とできるｓｉＲＮＡをコードする核酸を、治療を必要とする対象に導入し、適切な腫瘍特異的プロモータ配列の制御下にその中で機能可能に発現される。たとえば、ＲＮＡを発現する感染性組み換えウイルスベクターは、遺伝的または生化学的にウイルス表面を修飾することによって細胞表面レセプターを介して腫瘍細胞に標的化させることができる。これとは別に、癌細胞を転写レベルで、エフェクター遺伝子の発現を限定する系統特異的プロモータ類を用いて、腫瘍細胞ならびに同一発生系統由来関連正常細胞全てに対して標的化させる。このようにして標的とされた腫瘍タイプの例には、結腸癌、肺癌；乳癌、肝細胞癌およびメラノーマが含まれる。腫瘍特異的プロモータ類／エンハンサー類もまた、“ウイルス特異的酵素／プロドラッグ療法”（ＶＤＥＰＴ）と称される治療手技で使用されており、殺腫瘍効率が、正常細胞への副作用低下によって増大される（いわゆる“傍観者効果”）。たとえば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモータ／エンハンサーカセットを用いてアデノウイルスベクターからのＥ１発現を制御し、肝細胞癌に対してのウイルス媒介の腫瘍崩壊性効果を誘発させることができる。したがって、アルファフェトプロテインプロモータを含む腫瘍特異的複製可能アデノウイルス（ＴＳＲＣＡ）ベクターはｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を運搬し、特に好適である。これとは別に、このシステムの変化体として、米国特許公報第２００２０１４２９８９に記載の“相補性アデノウイルスベクターシステム”も用いることができる。
これとは別にまたはさらに、ＥＤＤ発現低下に有効な化合物も、カチオン性リポソームのようなリポソーム形態で投与できる。
さまざまな投与経路が可能であり、必ずしも限定されないが、経口、食事、局所、非経口（例、静注、動脈内、筋肉内、皮下注射）および吸入（例 気管支内、鼻内または口腔吸入、点鼻）投与経路を含み、薬剤および治療すべき疾患または状態に依存する。
投与すべき物質の処方は、選択した投与経路に応じてさまざまであろう（例 溶液、懸濁液、カプセル）。投与すべき物質を含む適切な組成物は、生理学的に許容できる賦形剤またはキャリア中で調製できる。溶液または懸濁の場合、適切な担体には例えば、水性またはアルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝液が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳糖化リンゲルまたは固定オイル類が含まれる。静脈内賦形剤にはさまざまな添加剤類、保存剤類または液体、栄養または電解質レプレニィッシャーなど（総合的には、レミントンの薬学、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、Ｐａ．，１９８５を参照）が含まれる。吸入の場合、前記物質を溶解させ投与に適切なディスペンサーに入れる（例 アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアゾールディスペンサー）。
さらに、前記物質がたんぱく質またはペプチドである時、前記物質を組み換えたんぱく質のインビボ発現により投与できる。インビボ発現は、適切な方法（例米国特許第５，３９９，３４６参照）により体細胞発現により達成できる。この態様において、前記たんぱく質をコードする核酸は、レトロウイルス、アデノウイルス、または他の適切な運搬用ベクター（好適には、複製欠損感染性ベクター）に取り込ませることができるかまたは、運搬のために前記たんぱく質を発現できる形質移入または形質転換宿主細胞に導入することができる。後者の態様において、前記細胞を（単独またはバリアデバイス中で）インプラントするか、注射するかまたはそうでない場合には、治療有効量だけ前記たんぱく質を発現できる有効量だけ導入することができる。
本発明は、ＥＤＤたんぱく質およびＴｏｐＢＰ１単独で構成できるこれまでに開示されたいかなる単離たんぱく質複合体も排除することは明白である。
（実施例）
本発明をさらに、下記の非限定的実施例によって記載する。
実施例１
ヒト癌におけるＥＤＤ遺伝子の異常
１．１ 材料および方法
腫瘍およびＤＮＡ抽出
卵巣癌組織および適合血液または正常卵巣組織を、患者９８例から採取し、ＤＮＡを先に述べたようにして抽出した（Ｏｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、２０９５−２０９７、１９９８）。転移性メラノーマ組織および適合血液または正常皮膚組織を患者２０例から得て、ＤＮＡを先の報告にあるようにして単離した（Ｉｎｄｓｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ １００、６８−７１、１９９８）。ＤＮＡは、適合正常および原発性肝腫瘍患者１９例からミクロ切除した肝細胞癌組織試料から抽出した（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８，９０−９７、１９９８）。Ａｌ分析のため、パラフィン包埋乳癌および正常血液を患者２４例から得た。腫瘍局在は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって決定し、細胞を隣接切片４〜５枚からミクロ切除した。ＤＮＡは、溶解緩衝液中に温度５５℃で８時間抽出（０．４５％ Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、０．２５％ＢＳＡ）し、その後１０分間沸騰させた。ＤＮＡは、ＰｕｒｅｇｅｎｅＤＮＡ単離キットを用いて血液から抽出した（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。
ＲＴ−ＰＣＲのため、乳癌試料を手術時点で採取した。正常胸部組織（組織学的検査に基づく）を、癌切除と同時に影響を受けていない胸部領域から除去した。
腹側舌の扁平細胞癌１２例から得たパラフィン包埋記録保管試料ならびに適合するリンパ節は、Ｂｏｖａら（Ｂｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５、２８１０−２８１９、１９９９）が記載のシリーズに由来していた。悪性扁平細胞の領域を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色スライドから病理学者が識別し、光学顕微鏡下で未染色の隣接切片１０μｍからミクロ切除した。正常組織は、罹患していないリンパ節から得て、および／または、扁平細胞癌を取り巻く正常細胞領域からミクロ切除した。試料を、プロテイナーゼＫ（２ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌにより３７℃で一定に攪拌しながら５日間消化した。消化物をその後フェノールでいったん抽出し、クロロホルムで一度抽出し、ＤＮＡをエタノールで一晩沈殿させ、ＴＥ緩衝液３０μｌ中に再度溶解させた（“ミクロ切除ＤＮＡ”）。
ＥＤＤ結合ミクロサテライトＣＥＤＤおよび５８６Ｆ１８ｂの単離とクローニング
ヒトＰ１ゲノムライブラリ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＣＡ）をＥＤＤコード配列４ｋｂをカバーする２個のｃＤＮＡプローブによりスクリーニングした（Ｃａｌｌａｇｈａｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１７、３４７９−３４９１、１９９８）。陽性クローンからＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｃＩＩで消化し、ゲル電気泳動によって分離し、オリゴヌクレオチドプローブ（ＣＡ）15を用いるサザンブロット法により再度スクリーニングした。陽性ゲノムＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、配列決定し、新規ジヌクレオチド繰り返しミクロサテライトＣＥＤＤ（ＥＤＤ近傍のＣＡ繰り返し）を明らかにした。独自のプライマーをミクロサテライト周辺で設計し、約２２０ｂｐの産物を得た； ＣＥＤＤ正 ５’−ＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＴＣＴＣＡＣＡＴＧＴＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号５）、ＣＥＤＤ逆 ５’−ＡＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＡＧＴＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号６）。その後、ＥＤＤゲノム配列が利用可能となり（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＡＣ０２１００４）、ＣＥＤＤをＥＤＤコード配列の塩基２６１６と２６１７の間のイントロンに局在化させた。ＥＤＤ遺伝子の最小サイズは１００ｋｂであり、少なくとも４６個のエクソンで構成されていた。同一ゲノムクローン内部で、別のＥＤＤ特異的ジヌクレオチド繰り返しミクロサテライトを同定し、５８６Ｆ１８ｂと命名した。独自のプライマーをミクロサテライト周辺で設計し、約２００ｂｐの産物を得た； 正 ５’−ＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＧ−３’（配列番号２４）、逆 ５’−ＴＧＣＡＡＡＡＴＡＡＣＡＡＴＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＡＧ−３’（配列番号２５）。５８６Ｆ１８ｂは、ＥＤＤコード配列の塩基６６３１と６６３２の間のイントロンに局在化される。両方のミクロサテライト類は、ヒト細胞株ＤＮＡを用いて５０〜５５％異型接合性であった（データを示さず）。
ミクロサテライト分析
ミクロサテライト分析を用い、ＣＥＤＤ、５８６Ｆ１８ｂおよびこの領域にマッピングされる他の７個のジヌクレオチドおよびテトラヌクレオチド繰り返し多形マーカー類を用いて、８ｑ２２．３−２４．１３上でＡｌの頻度と分布を決定した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，ｗｗｗ．ｇｂｄ．ｏｒｇ／）（図１）。ＣＥＤＤ、Ｄ８Ｓ３２６、Ｄ８Ｓ２５７、Ｄ８Ｓ３００、Ｄ８Ｓ５４５およびＤ８Ｓ８５を卵巣癌、肝細胞癌、転移性メラノーマおよび舌の扁平細胞癌の分析に用いた。他のマーカー類５８６Ｆ１８ｂ、ＭＹＣ−ＰＣＲ．３およびＤ８Ｓ１９８は、乳癌分析に用いた。プライマーペアは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）とＰａｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｓ（Ｌｉｓｍｏｒｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。卵巣ＤＮＡは、先に述べたような放射性同位元素に基づく方法によって分析した。（Ｏｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８，２０９５−２０９７，１９９８）。他の組織からのＤＮＡについて、各ＰＣＲ反応において、正プライマーは６−ＦＡＭまたはＴＥＴ蛍光標識のいずれかで標識した。反応は、肝細胞癌および転移性メラノーマ由来ＤＮＡ４０〜６０ｎｇ、乳癌抽出ＤＮＡ１μｌまたは舌の扁平細胞癌由来ミクロ切除ＤＮＡ２〜３μｌを用いて実施した。このＰＣＲ反応成分は下記のようであった；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３；５０ｍＭ ＫＣｌ；６６μＭ ｄＮＴＰミックス；１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2；正および逆プライマー類両者について５ｐｍｏｌｅおよびＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ０．８Ｕ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）であった。ミクロサテライトＤ８Ｓ３２６、Ｄ８Ｓ２５７、Ｄ８Ｓ５４５、Ｄ８Ｓ８５、Ｄ８Ｓ１９８およびＭＹＣ−ＰＣＲ．３のＰＣＲ条件は、下記のようであった：９５℃でのホットスタート１２分；（１）９４℃１５秒（２）６０℃１５秒（ＣＥＤＤには６６℃、５８６Ｆ１８ｂには５２℃）および（３）７２℃で３０秒、を３５サイクル（ミクロ切除ＤＮＡについては４０サイクル）；７２℃で５分；４℃に保持。ミクロ切除ＤＮＡ由来ＣＥＤＤミクロサテライトの増幅には、３０秒でのアニーリング段階、１分の伸長段階、および３５サイクルを必要とした。ミクロサテライトＤ８Ｓ３００の増幅は、下記のように行った：９５℃でのホットスタート１２分；（１）９４℃３０秒（２）６０℃３０秒および（３）７２℃で６０秒、を３５サイクル；７２℃で５分；４℃に保持。ＰＣＲ産物は、パラフィン包埋舌癌からＤ８Ｓ３００プライマー類によって回収したＤＮＡから得ることができなかったが、おそらく、ＤＮＡせん断が理由であろう。
二重の蛍光産物を、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で分離し、ＧｅｎｅｓｃａｎおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。あいまいな結果は、分離ゲル上で消失した。肝細胞癌および乳癌中Ａｌは、マッチする正常ＤＮＡに比較して異型接合性対立遺伝子ピークの相対蛍光が少なくとも３０％だけ腫瘍ＤＮＡにおいて低下したことによって、定義した。転移性メラノーマ中の再現性のある２０〜３０％の差は、これらの試料中に存在する挟雑正常ＤＮＡが高レベルであることにより、有意と見なされた。５０％以上の差は、扁平細胞癌ＤＮＡ中のＡｌを表すと見なされ、これらの試料中では正常細胞性ＤＮＡ挟雑レベルが低いことが原因であった。
対立遺伝子アンバランス（Ａｌ）は、対立遺伝子の喪失または増幅のいずれか、および（おそらく）周囲の染色体領域を示唆する。実際には、異型接合性（ＬＯＨ）の喪失はこの方法による増幅からは容易に識別可能ではなく、特に、腫瘍に正常ＤＮＡが有意レベルで挟雑しているときに容易に識別可能ではない。本研究では、染色体増幅率が喪失よりもはるかに頻度高く８ｑで報告されていることからすれば、Ａｌは増幅と解釈された。
ＦＩＳＨ
ＦＩＳＨ分析は、Ｗｏｍｅｎ‘ｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ａｄｅｌａｉｄｅ，ＡｕｓｔｒａｌｉａのＥｒｉｃａ Ｗｏｏｌｌａｔｔが実施した。約１００ｋｂの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に用いたＥＤＤゲノム配列をコードする２個のＰ１プラスミドをビオチン−１４−ｄＡＴＰによりニック翻訳し、最終濃度２０μｇ／μｌで乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３由来中期にハイブリダイズさせた。シングルコピーＦＩＳＨ法は、先に記載のそれ（Ｃａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｇｅｎｅｔ．３３、２１９−２２１、１９９０）を染色体をプロピジウムアイオダイド（カウンターステインとして）およびＤＡＰＩ（染色体同定のため）の両者で分析前に染色した点で変更された。中期調製物の像を、ＣｈｒｏｍｏＳｃａｎイメージ採取および増感システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ）を用いてＣＣＤカメラで捕捉した。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ原発性胸部組織
ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）を用いて試料から抽出した。逆転写を実施後、先に記載のように（Ａｌ−Ｔａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ１７、２０１−２１０、２０００）Ｔａｑｍａｎに基づく方法論を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＥＤＤ用ＰＣＲプライマー類は、ｐｏｌｙＡ付加部位から３００塩基以内に設計した。ＥＤＤ特異的プライマー類の配列は、下記のようであった： 正ＥＤＤ−４０７Ｆ ＧＣＴＡＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＣＴＡＡ（配列番号２６）、逆ＥＤＤ−４９０Ｒ ＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＴＣＡＣＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴ（配列番号２７）、蛍光プローブＥＤＤ−４３３Ｔ ＦＡＭ−ＣＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号２８）。試料をまた、数種の対照遺伝子発現について分析した；ＣＫ１８（上皮内容物）、ＧＡＰＤＨ（細胞代謝）、ＩＦ２Ｂ（一般的転写活性）およびＭＣＭ３（増殖率）。結果を試料当たりのＥＤＤ／３ｅ９総ｃＤＮＡのコピー数として表し、ＩＦ２Ｂについて補正した。
定量的ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ−乳癌細胞株
二重の１５０ｃｍ2フラスコから採取した細胞をプールし、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、先に記載（ＥＤＤｍＲＮＡ配列分析を参照）のように正常胸部上皮細胞株１８４および乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ−５４９、ＢＴ−４８３、ＭＣＦ−７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＺＲ−７５−１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−３３０から作製した。全てのＰＣＲ反応は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ上でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェア３．５（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｙｄｎｅｙ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて行った。ＥＤＤプライマー類の正 ＴＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＣＧ（配列番号２９）、および逆 ＴＧＡＧＧＧＣＡＴＡＧＧＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣ（配列番号３０）、炭酸アンヒドラーゼＩＩの正プライマー ＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧ（配列番号３１）、および逆 ＧＣＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧ（配列番号３２）、ｐ５３リボヌクレオターゼレダクターゼ（ｐ５３Ｒ２）に対する正 ＧＴＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＴＣ（配列番号３３）、および逆 ＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＴＧＣ（配列番号３４）、ＧＡＰＤＨの正 ＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡ（配列番号３５）、および逆 ＴＧＴＣＡＴＡＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣ（配列番号３６）のプライマー類である。全てのプライマー対は少なくとも１個のイントロンだけ離れており、寒天ゲル上で産物を視覚化し、産物の大きさを確認した。全遺伝子の相対的発現を、ＧＡＰＤＨ発現を用いてｃＤＮＡ濃度について補正した。
ＤＮＡは、ＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔａｌｉａ）を用いて上記細胞株から抽出した。ゲノムコピー数を決定するためのＰＣＲは、（断りがなければ）上記の逆プライマーを用いた。ＥＤＤプライマー類は、正 ＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＡＴＣＣＣＴＧＴＧＴＴＧ（配列番号３７）、逆 ＴＡＧＣＣＣＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣ（配列番号３８）、ＣＡＩＩの正 ＡＣＣＣＧＣＣＴＣＡＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＣ（配列番号３９）、ｐ５３Ｒ２の正 ＴＧＴＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧ（配列番号４０）、ベクリンの正 ＴＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＴＧＧ（配列番号４１）、逆 ＡＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧ（配列番号４２）であった。全産物を寒天ゲル上で視覚化し、産物の大きさを確認した。相対的ＤＮＡコピー数は、ＦＩＳＨによって決定した公知のベクリン遺伝子コピー数を用いて補正した（Ａｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５９、５９−６５、１９９９）。
遺伝子発現プロファイリング−原発性卵巣組織
ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて原発性卵巣癌および境界型腫瘍６６例および正常卵巣試料４例から基本的に製造業者の指示に従って単離した。ＲＮＡをその後、さらにＴ７プロモータ配列を含むオリゴ（ｄＴ）アンカーオリゴヌクレオチドを用いて逆転写した。単離したｃＤＮＡをその後インビトロでＴ７ ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って転写した。転写は、ビオチン化ヌクレオチド類（Ｂｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ）により行い、転写核酸の検出を促進した。
癌試料中における遺伝子発現レベルをその後、オリゴヌクレオチドプローブセット５９，６１８個を含むカスタマイズしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ミクロアレイを用いて転写ｃＤＮＡ試料を分析することによって、決定した。これらのプローブセットにより遺伝子クラスター４６，０００個の分析を円滑に行い、予測した発現ゲノムの９０％以上を示していた。
データは正規化し、Ｈｏｌｍ操作を用いて複数試験用に調整したｐ値を有するランク別ペナルティー付加ｔ検定を用いて、遺伝子発現変化を検出した。分析は、ＬＩＭＭＡパッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｄａｔａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｔ ｔｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈから入手可能）を用いて実施した。
体部の異なる組織５２個における遺伝子発現もまた、先に記載の卵巣癌特異的遺伝子発現変化を円滑に識別できる方法を用いて決定した。
ＥＤＤ ｍＲＮＡ配列分析
ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡが、次のヒト細胞株から抽出された：乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＢＴ−２０、Ｔ−４７Ｄ、ＢＴ−５４９、ＢＴ−４８３、ＭＣＦ−７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−Ｂｒ−３、ＺＲ−７５−１、Ｈｓ ５７８Ｔ；正常胸部上皮ＨＢＬ−１００（形質転換ＳＶ−４０）、１８４、ＨＭＥＣ ２１９−４；卵巣癌ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡ−４２０、ＩＧＲＯＶ−１、ＳＫＯＶ３、Ａ２７８０；前立腺癌ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＬｎＣａＰ。ｃＤＮＡが、Ｅｘｐａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して合成された。２μｇ全ＲＮＡおよび２μｌオリゴｄＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が、水によって２２μｌにされ、６５℃で１０分間加熱され、かつ氷の上で冷却され、その後８μｌ Ｅｘｐａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ緩衝液（５ｘ；２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｖ／ｖ）、ｐＨ８．３）、１ｍＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび２μｌ（１００Ｕ） Ｅｘｐａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを添加した。次に逆転写酵素反応が、４２℃で４５〜６０分間行われた。１０のＰＣＲ産物が、ＥＤＤ遺伝子の８．５ｋｂのコーディング領域全体をカバーするために設計された。ＰＣＲ反応には、３μｌ逆転写酵素反応、１０ｐｍｏｌ各プライマー、１．７５単位Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む。増幅は、次の手順を使用して行われた：９４℃での変性２分；１０サイクルの変性３０秒、アニーリング３０秒および７２℃での伸張６０秒；２４サイクルの変性３０秒、アニーリング３０秒および拡張６０秒で、サイクル当たり増加５秒；５分の伸張。アニーリング温度は、使用したプライマーによって決定された（プライマー配列は、申し込みにより入手可能である）。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製し、かつゲル上での視覚化によって計量された。配列決定反応は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で行われ、かつ配列分析および組み立ては、それぞれＥｄｉｔｖｉｅｗおよびＡｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行われた。
ＳＳＣＰ
ＳＳＣＰ分析は、先に記載のように（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３、５８９−５９４、１９９４）、エクソン８個の潜在的機能重要性を有するＥＤＤコード領域、すなわちＨＥＣＴドメイン、核内保留シグナルおよび亜鉛フィンガーモチーフで行われた。プライマーは、２００−３００ｂｐの間でＰＣＲ産物を発生させるために、イントロン配列内で設計された。
ＥＤＤ免疫組織化学
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、パラフィン包埋、ホルマリン固定胸部（正常胸部９例および乳癌４６例）、一般卵巣組織（卵巣癌９４例）および漿液性卵巣癌組織１６５例で行われた。野生型およびＥＤＤ-/-（ノックアウト）マウスのパラフィン包埋胚神経組織が、それぞれ正および負の対照として使用された。ＥＤＤを過剰発現するＷＴ−３０細胞株（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）のパラフィン包埋細胞ペレットが、追加の正の対照として使用された。
切片は、１００℃で３０分、水浴中の標的検索溶液（高ｐＨ：ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）中でアンマスキングする前に、脱ろうされ、かつ再水和される。
ＤＡＫＯ自動染色装置を使用して、内因性パーオキシダーゼ活性は、メタノール中で３％の過酸化水素中で和らげられ、内因性アビジンおよびビオチンは、アビジンビオチンブロック（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってブロックされ、かつ二次抗体の非特異的結合は、無血清たんぱく質ブロック（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によるインキュベーションによってブロックされた。切片は、１：１５０の抗ＥＤＤ（Ｍ１９）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）により３０分、かつその次に１：２００のビオチン化ウマ抗ヤギ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）により１５分インキュベーションされる。ストレプタビジン−ビオチンパーオキシダーゼ検出システムは、製造業者の指示（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従って、基質として３，３’−ジアミノベンジジンにより使用された。対比染色は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンにより行われた（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
染色程度は、別個の観察者２名によって評価され、かつ相違は、会議によって解決された。ＥＤＤ発現スコアは、ＥＤＤを発現する細胞の百分率（１％−１００％の染色細胞に対して１−４の範囲）および染色の強度（０−３の範囲）を組み合わせることによって決定された。０の組み合わせスコアは無発現、１−５の範囲のスコアは低発現、かつ６および７のスコアは高発現と呼ばれた。
漿液性卵巣癌組織中の相対ＥＤＤ発現およびＥＤＤ陽性細胞の比率（百分率）は、ＥＤＤ発現が漿液性卵巣癌の結果の予後マーカーであるか決定するために、（表２に示すように）卵巣疾患の種々の臨床病理学的パラメータと相関した。
１．２ ミクロサテライト分析
ＥＤＤ座（８ｑ２２．３）を囲むＡｌの頻度を、図１に位置を示すミクロサテライト９個を使用して、悪性および前癌性卵巣腫瘍、乳癌、肝細胞癌、転移性メラノーマおよび前舌の扁平細胞癌において調査した。ＣＥＤＤおよび５８６Ｆ１８ｂは、ＥＤＤ遺伝子のイントロン中に位置するので、これらの対立遺伝子を関与させる染色体損失または利得は、ＥＤＤ対立遺伝子の損失または利得と等しいことが考えられ得る。
（非悪性卵巣腫瘍をのぞく）完全な癌セット中で、研究中の８ｑの狭領域中のＡｌの頻度は、注目に値する：６０％（８３／情報のある症例１３９件）が、１つ以上のマーカーでＡｌを有する。個別の頻度（Ａｌを有する症例／情報のある症例）は：Ｄ８Ｓ３２６ ４７／１０３（４６％）；ＣＥＤＤ ３８／９０（４２％）；Ｄ８Ｓ２５７ ２９／９５（３１％）；Ｄ８Ｓ３００ ２７／６９（３９％）；Ｄ８Ｓ５４５ ２８／８７（３２％）；およびＤ８Ｓ８５ ２４／９０（２７％）（表１）。特に、ＣＥＤＤおよび隣接８ｑ２２．３マーカーＤ８Ｓ３２６は、Ａｌの最大頻度を有する。その上、以下のデータからわかるように、ＣＥＤＤミクロサテライトに染色体異常を有するこれらの癌の３０−４０％は、研究した領域のテロメリック末端で１個以上のミクロサテライトの関与を示さない。このことは、ＥＤＤ座のＡｌが、これらの癌におけるより広範囲な異常（すなわち、全染色体腕の損失または利得、またはＭＹＣ発癌遺伝子による共増幅）とは無関係にしばしば生じることを示している。
１．３ 卵巣癌
卵巣腫瘍セットは、数例の癌サブタイプ（主に粘液性、子宮内膜性および漿液性）、境界型および非悪性の良性腫瘍からなった。癌クループ中で、４８％（３４／７１）が、領域中で１つ以上のマーカーでＡｌを表示した（図２）。著しく対照的に、良性かつ境界型腫瘍は、それぞれ１／２３および１／５のみの症例のＡｌを示し、数個のミクロサテライトを関与させたが、ＣＥＤＤまたはＤＳ８２５７は関与させない（表１）。良性および境界型腫瘍における８ｑ２２．３−８ｑ２３．３の低頻度の関与のために、それらは、以下の分析から省略する。
数例の癌は、大きな染色体異常、例えば症例６３、１１４、１５４と一致して、全ての情報のあるマーカーにわたってＡｌを有する。しかしながら、興味深いのは、ＡｌがＥＤＤ座に存在するが、よりテロメリックなマーカーに存在しない、これらの癌である（例えば症例１４、２２、３２、２１１、図２）。このことは、染色体異常の重要な領域が、ＥＤＤ座に近接して位置することを示唆する。実際に、この研究の中心となる発見は、ＣＥＤＤが通常Ａｌによって影響を受ける（１６／２２、情報のある症例の７３％）ミクロサテライトであった、漿液性癌における観察結果である。この非常に高い関与頻度は、よりテロメリックなマーカーＤ８Ｓ８５（６／１８、３３％、ｐ＜０．０１）またはＤ８Ｓ８４５（４／１３、３１％、ｐ＜０．０１）のそれとは著しく異なる。実際に、漿液性癌をその他の卵巣癌と比較すると、ＣＥＤＤは、Ａｌが２グループ間で著しく異なる（ｐ＝０．００１８）唯一のミクロサテライトである。しかしながら、漿液性サブタイプまたは癌セット全体中で、いかなる座および癌等級および段階でも、Ａｌの間では相関が明らかでなかった（データは図示せず）。
開腹の後（すなわち遺伝子発現プロファイルが決定される時点）で疾患結果と相関関係を持つ、これらの遺伝子発現変化を同定するために、種々の卵巣癌（漿液性および上皮の両方）の遺伝子発現プロファイルを分析すると、対象におけるＥＤＤ遺伝子発現の変化が卵巣癌を患う対象の生存に著しく関連する（すなわちｐ＝０．００）ことが証明される。従って、ＥＤＤは明らかに、開腹の後の卵巣癌からの回復の予後マーカーである。
１．４ 肝細胞癌、舌の扁平細胞癌および転移性メラノーマ
３つの癌タイプ全部において、Ａｌは、それぞれ少なくとも１個のミクロサテライトのＡｌを示す癌７４％、３３％および４７％と共通した（表１）。
肝細胞癌１９例において、癌４例が、ＣＥＤＤを含むが、８ｑ２２．３に連続的にテロメリックに伸張しないアンバランス領域を有した（図１Ａ）。同様に転移性メラノーマ１７例の分析（表１）により、Ａｌ領域が８ｑ２２．３にテロメリックなマーカーを関与させない癌３例が発見された（例を図１に示す）。分析した扁平細胞舌癌１２例の内、全部が８ｑ２２．３を関与させたＡｌを有し（ＣＥＤＤおよび／またはＤ８Ｓ３２６）、かつこれら癌の３例において、アンバランス領域は、最もテロメリックなマーカーＤ８Ｓ８５およびＤ８Ｓ５４５に伸張しなかった（例を図１に示す）。このようにして、これら３つの癌タイプにおいて、ＥＤＤ座での染色体領域は、通常、かつしばしば特異的に異常である。
１．５ 乳癌
乳がんＤＮＡのミクロサテライト分析に関して、３つの追加ミクロサテライトが、ＥＤＤ座（５８６Ｆ１８ｂ）およびＭＹＣの周りの８ｑのテロメリック領域（８ｑ２４．１２）でのＡｌに関するより多くの情報を提供するために導入された（Ｄ８Ｓ１９８およびＭＹＣ−ＰＣＲ．３）。研究した他の癌タイプのように、Ａｌは、１つ以上のマーカーでＡｌを示す１６／２４（６７％）の乳癌と８ｑで共通であった（表１）。ＣＥＤＤまたは５８６Ｆ１８ｂは、６／１６（３８％）の情報のある症例で関与した。通常、Ａｌは、乳癌におけるＭＹＣの頻繁な増幅と一致して、ＭＹＣ−ＰＣＲ．３またはＤ８Ｓ１９８を関与させたが、大多数の癌においてＡｌは、８ｑ２２．３から８ｑ２４に連続していなかった（例を図１に示す）。
１．６ 乳癌におけるＥＤＤ ｍＲＮＡ発現
ＥＤＤ ｍＲＮＡ発現レベルは、乳癌４１例、およびこれらの症例１４件に関してマッチする正常胸部組織対照において定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定された（図３Ａ）。大部分の癌は、正常範囲内でＥＤＤ ｍＲＮＡを発現したが、有意の数１１／４１（２７％）は、より高い発現を有した。高くなった発現は、６／１４（４３％）の癌が、ＥＤＤ発現で＞４倍増を有し、１５９倍増の癌１例を含むように、癌をそのマッチする正常組織対照と比較する時に更に明らかであった（差込み、図３Ａ）。試料は、分析した腫瘍の上皮内容物（ＣＫ１８）、細胞代謝（ＧＡＰＤＨ）、一般的転写活性（ＩＦ２Ｂ）または増殖率（ＭＣＭ３）を照合確認する、数例の対照遺伝子の発現に関しても分析された。ＥＤＤ発現は、これらの遺伝子の発現に正規化された時に、著しく変更されなかった。
１．７ 乳癌および卵巣癌におけるＥＤＤたんぱく質発現
ＥＤＤたんぱく質レベルは、正常胸部組織の標本９例、乳癌４６例、および漿液性卵巣癌９４例における免疫組織化学によって決定された。野生型ＥＤＤ胚マウス神経組織（図４Ｂ）の正の対照およびＷＴ−３０細胞（図示せず）は、強い核染色を明らかにし、他方でＥＤＤを含まない胚マウス神経組織（図４Ａ）では、発現は見られなかった。正常胸部試料９例の内、４例は、検出可能な発現を有さず、かつ５例は、低レベルのＥＤＤ発現を有した（図４Ｃ）。乳癌４６例の内、全部がＥＤＤを発現し、かつ低い強度（３７％）または高い強度（６３％）の核染色を示した（図４Ｄ）。漿液性卵巣癌９４例の内、２％がＥＤＤを発現せず、他方で５９％が低発現（図４Ｅ）および３９％が高発現（図４Ｆ）を有した。
漿液性卵巣癌を有する患者１６５例の臨床病理学的パラメータの一変量分析は、疾患段階および癌等級、全体的な患者の健康（動作状態）および外科的減量の後の残留疾患が、全て最終的な患者の結果（すなわち漿液性卵巣癌を有する対象が、生存するか否か）を予測することを示す（表３）。分析は、疾患段階、残留疾患の存在およびＥＤＤ過剰発現が、疾患再発を予測することも示した。従って、ＥＤＤ発現は、漿液性卵巣癌再発を明らかに予後／診断する。
漿液性卵巣癌を有する患者１６５例の臨床病理学的パラメータの多変量分析は、疾患段階および外科的減量の後の残留疾患が、結果不良（すなわち患者の死または癌再発）を予測することを示す（表４）。分析は、疾患段階、残留疾患の存在およびＥＤＤ過剰発現が、疾患再発を予測することも示した。従って、ＥＤＤ発現は、漿液性卵巣癌再発の明らかに独立した予後／診断マーカーである。
１．８ 乳癌細胞株におけるＥＤＤ、ｐ５３Ｒ２およびＣＡ ＩＩ ｍＲＮＡ発現およびゲノムコピー数
公知のＤＮＡコピー数を有する乳癌細胞株１８例の発現プロファイリングは、ＥＤＤがＤＮＡレベルで増幅される時、ＥＤＤがｍＲＮＡレベルで過剰発現される強い傾向を示した（図３Ｂ）。ＥＤＤが過剰発現されるほぼ全ての細胞株は、ゲノムレベルでＥＤＤを増幅し（７／８）、他方で、遺伝子コピー数が２以下の時、ＥＤＤは、まれにしか過剰発現しなかった。このことは、染色体位置８ｑ２３．１でＥＤＤに隣接した遺伝子、ｐ５３リボヌクレオチドレダクターゼ（ｐ５３Ｒ２）の発現に関しても当てはまる。ｐ５３Ｒ２が過剰発現した全ての細胞株は、遺伝子コピー数を増大させた（図３Ｂ）。ＥＤＤおよびｐ５３Ｒ２の相対発現は、高い相関関係を有し（Ｒ２＝０．６２）、両方の遺伝子の類似した過剰発現メカニズムを示唆している。対照的に、８ｑ２２に位置する炭酸アンヒドラーゼＩＩ（ＣＡ ＩＩ）は、ＤＮＡコピー数との関係を示さず（データは図示せず）、１５／１８細胞株が、正常胸部上皮細胞１８４例の１０％未満のＣＡ ＩＩ ｍＲＮＡ発現レベルを有した。
１．９ 細胞株および腫瘍におけるＥＤＤの突然変異分析
癌のＥＤＤ遺伝子における突然変異の頻度を評価するために、ＥＤＤ ｍＲＮＡの完全なコーディング領域（ヌクレオチド８３９７個）が、乳癌、卵巣癌および前立腺がん細胞株２６例に由来するｃＤＮＡを使用して配列決定された。正常胸部上皮細胞株３例もまた配列決定された。同定された変異体配列のリストを表５に示す。２／２５の癌細胞株のみが、翻訳アミノ酸配列へ変化するという結果になる、ＥＤＤ ｍＲＮＡに変異を有した。これらの推定ミスセンス突然変異は、ゲノム配列において確認された。アミノ酸の変化は、機能モチーフを有するＥＤＤたんぱく質の領域にはなく、かつＳＫ−Ｂｒ−３系統におけるＨｉｓ＞Ａｓｎ変化のみが、アミノ酸極性を変更する。細胞株が由来する個体からのマッチする正常ＤＮＡがないので、これらが本当の体細胞突然変異を表すか、または稀な多型を表すか決定することは、可能でない。僅かな多型またはサイレント置換が観察された。保存的配列変異体６例の内、少なくとも５例が、正常細胞株または組織に由来するＲＮＡ、または複数の細胞株において発見されるので、多型である可能性が高い。スプライス変異体も、全ての細胞株において観察された。変異体は、アミノ酸配列ＶＬＬＬＰＬを取り除く、ｎｔ８８４−９０１からの配列の１８ｂｐの欠失により完全長ＥＤＤ ｍＲＮＡとは異なる。このモチーフは、ＥＤＤの推定機能ドメインのいずれにも位置しないが、この配列の除去は、たんぱく質構造を破壊する可能性を有し、酵素機能またはたんぱく質局在を変え得る。
（約１３％のコード配列をカバーする）ＥＤＤのエクソン８例のみが研究されたのであるが、Ａｌを示す卵巣癌２９例、乳癌３７例および大腸癌２９例のＳＳＣＰ分析（図２）により、低頻度のＥＤＤ遺伝子突然変異が確認された。これらのエクソンは、核局在シグナル（ｎｔ１４８２−１５９８）、亜鉛フィンガーモチーフ（ｎｔ３５７３−３８１２）および大多数のＨＥＣＴドメイン（ｎｔ７６０２−８３３９）をコードする（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、２６４６８−２６４７８、２００２）。突然変異は、いかなる癌のコーディング領域またはスプライス接合部位においても発見されなかった（データは図示せず）。
１．１０ 考察
ミクロサテライト対立形質判定（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇ）により、ＥＤＤの座（８ｑ２２．３）を包含する染色体８ｑの狭い領域は、卵巣癌、肝細胞癌、舌の扁平細胞癌、乳癌、および転移性メラノーマにおける染色体異常の有意かつ特異的部位であることが示される。このことは、ＥＤＤ座のＡｌが約７０％の癌で生じる卵巣の漿液性癌において、特に明白である。ＥＤＤ ｍＲＮＡの過剰発現は、有意な割合の乳癌および乳癌細胞株において観察され、ＥＤＤが８ｑのこの領域での増幅の標的であり得るという可能性を示唆している。
ＥＤＤを含む８ｑの領域が、染色体異常の特異的焦点であるという証拠は、ＥＤＤ遺伝子特異的ミクロサテライトＣＥＤＤでのＡｌの頻度（７３％）が、検査した最もテロメリックなミクロサテライトのそれのほぼ二倍である、卵巣の漿液性癌に関して特に明らかである。卵巣癌は通常、他の腫瘍タイプと比較して高レベルの染色体配列換えを示す。このことは、我々の研究で８ｑでのＡｌに当てはまるように、最大の変化を示す漿液性腫瘍、子宮内膜中間および最小の粘液癌に関してサブタイプ特有である（Ｐｉｅｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６４、４３４−４４０、１９９５）。我々の研究において、（等級および段階を含む）臨床データと８ｑでのＡｌの間に相関関係は発見されなかったが、少なくとも１件の研究において、漿液性サブタイプの侵襲可能性は、染色体８への変化と相関関係を有した（Ｄｉｅｂｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５、４７３−４８５、１９９６）。良性および境界型卵巣腫瘍におけるＥＤＤでの非常に低率のＡｌは、この領域が腫瘍進行の後期のみに摂動されることを示し得るが、かかる腫瘍が実際に悪性卵巣腫瘍の前駆損傷であるかは、議論の余地がある。
ＥＤＤ発現分析は、ＥＤＤ ｍＲＮＡレベルが、研究したあらゆるタイプの卵巣癌において患者の生存と相関関係を有することを明らかに示している。更に、ＥＤＤたんぱく質レベルは、疾患再発と著しい相関関係を有する。従って、ＥＤＤ発現レベル（ｍＲＮＡまたはたんぱく質）は、明らかに患者の生存および疾患再発の予測判断材料である。
ＥＤＤ座での異常全体の頻度および共通の遺伝子過剰発現にもかかわらず、ＥＤＤコーディング領域突然変異は、外見上、癌において稀である。大きなＥＤＤ ｍＲＮＡ（８３９７ｎｔ）の配列決定は、アミノ酸変化をもたらす単一ヌクレオチド変化を有する、２／２５の癌細胞株のみを示した。いずれの変化も、明らかに破壊的でなく、かつ予測された機能有意性のないたんぱく質領域で生じなかったので、これらの変性は突然変異よりも稀な多型に相当し得る。スプライシング変異体が、発見されたが、これは、検査した全ての正常および癌細胞タイプにおいて、スプライスされない転写物と共に存在した。同様に、１３％のコーディング領域をカバーし、かつ推定機能ドメインをコードする限られた数のエクソンのＳＳＣＰ分析は、一連の乳癌、卵巣癌および大腸癌における突然変異のどのような証拠も発見しなかった。この配列保存は、細胞機能におけるこの遺伝子の重要な要件、ｈｙｄノックアウト致死性（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６５、５０７−５２６、１９９４）およびマウスにおけるＥＤＤの標的欠失が、胚致死性をもたらすという我々の最近の発見（未発表データ）によって強化される結論を指摘し得る。
実施例２
ＥＤＤ ＨＥＣＴリガーゼの核機能
２．１ 実験手順
プラスミド構築体
インビトロ翻訳、トランスフェクションおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングに使用されたＥＤＤ ｃＤＮＡを図５Ａに示す。ｃＤＮＡは、完全長たんぱく質ＥＤＤ（ａａ１−２７９９）、Ｎ末端ドメインＥＤＤＦ１（ａａ１−８８９）、中央ドメインＥＤＤＦ２（ａａ８８９−１８７７）、カルボキシドメインＥＤＤＦ３（ａａ１８７７−２７９９）、Ｎ末端プラス中央ドメインＥＤＤＦ４（ａａ１−１８７７）および中央プラスＣ末端ドメインＥＤＤＦ５（ａａ８８９−２７９９）をコードする。ＥＤＤＭ、ＥＤＤＦ３ＭおよびＥＤＤＦ５Ｍは、ＨＥＣＴたんぱく質におけるＥ３リガーゼ活性に必要な活性部位システインで突然変異（Ｃｙｓ２７６８からＡｌａ）を含む。ＥＤＤ Ｎ末端のマッピングのために、制限断片クローニングが、インビトロ翻訳構築体発現ＥＤＤ ａａ１−５７７（ＥＤＤＦ１ａ）、５７８−８８９（ＥＤＤＦ１ｂ）、１−４１９（ＥＤＤＦ１ｃ）、および４２０−８８９（ＥＤＤＦ１ｄ）を発生させるために使用された（図５Ａ）。酵母ツーハイブリッドスクリーニングに関して、ベイトとして使用されるＥＤＤ ｃＤＮＡ断片は、ｐＡＳ２．１ベクターのＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、フレームでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＥＤＤからクローニングされた（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。インビトロ翻訳に関して、ＥＤＤ由来ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはｐＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）ベクターから転写された。哺乳類細胞におけるＥＤＤたんぱく質発現に関して、ｐＲｃＣＭＶ中の構築体が先に記載され（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）、かつＦＬＡＧエピトープタグを付したＥＤＤ発現の追加の構築体を、ｐＳＧ５ベクターにおいて製造した。ＧＦＰレポーターベクター（ｐＧＦＰ２０、Ｄｒ Ｓ．Ａｏｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）は、トランスフェクション効率を観察するために同時トランスフェクションされた。ヒトインポーチンα５（ＮＰＩ−１）のアミノ酸２６３−５３８に融合した細菌性プラスミド発現ＧＳＴが、Ｐｅｔｅｒ Ｐａｌｅｓｅ（Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＮＹ、ＵＳＡ）から得られた。マウスインポーチンβ１（ＰＴＡＣ９７）のＧＳＴ融合は、先に記載されたように（Ｈｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）発現し、かつ精製された。完全長ＣＩＢは、ｐＡＣＴ２ベクターから細菌におけるＧＳＴ−ＣＩＢ融合たんぱく質発現のためにｐＧＥＸ２Ｔベクターへ、かつＦＬＡＧタグを付したたんぱく質の哺乳類発現のためにｐＣＭＶＴａｇ２Ｃベクターへクローニングされた。哺乳類細胞におけるＧＦＰタグを付したＥＤＤの発現に関して、完全長ＥＤＤが、（Ｎ末端ＥＧＦＰタグに関して）ｐＥＧＦＰ−Ｃ１および（Ｃ末端ＥＧＦＰタグに関して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに関して）ｐＥＧＦＰ−Ｎ１にクローニングされた。プロゲステロンレセプターの一過性発現のために、ヒトＰＲ ＢをコードするｐｈＰＲ１が、Ｐ．Ｃｈａｍｂｏｎ（ＩＮＳＥＲＭ、Ｆｒａｎｃｅ）から得られた。ＰＲＥルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＭＳＧｌｕｃ）は、ｐＧＬ３−塩基性ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）中にＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターを挿入することによって構築された。ｐｈＰＲ１ベクターは、ＧＳＴ融合たんぱく質発現のために、ｐＧＥＸ４Ｔ２へＰＲ（ＡＢ）（ａａ１−５４６）およびＰＲ（ＣＤＥ）（ａａ４５６−９３３）領域をクローニングするために使用された。ビタミンＤレセプターの一過性発現のために、ｐＯＳ２−ｌｕｃレポーターベクターに加えてｐＣＭＶ−ＶＤＲが、Ｇ．Ｌｅｏｎｇ（Ｇａｒｖａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得られた。エストロゲンレセプターは、ｐＣＭＶ−ＥＲ（Ｖ．Ｃ．Ｊｏｒｄａｎ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）から発現し、かつｐＥＲＥ−ＴＫ−ＧＬ３レポーターベクターが、Ｍ．Ｐａｒｋｅｒ（ＩＣＲＦ、ＵＫ）から得られた。インビトロ翻訳のために、ＳＲＣ−１が、ｐＣＲ３．１−ＳＲＣ１Ａ（Ｂ．Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｔｅｘａｓ）から切断され、かつｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへクローニングされた。
ＥＤＤ相互作用たんぱく質の酵母ツーハイブリッドアッセイ
完全長ＥＤＤ突然変異体およびカルボキシドメイン突然変異体（ＥＤＤＭおよびＥＤＤ５Ｍ）のｃＤＮＡは、酵母ツーハイブリッド法により、ｐＡＣＴ２ベクターにおいてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリに対してスクリーニングされた（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ ２、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ＥＤＤ融合たんぱく質を発現するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｙ１９０の安定した形質転換体が、ｈｉｓ−ｌｅｕ−ｔｒｐ−プレートで選択された２−３×１０6の原発形質転換体および酢酸リチウム法を使用するライブラリによって形質転換された。同じ培地での第２ラウンドの選択の後で、コロニーは、フィルタに基づくアッセイを使用して、β．ガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。ＥＤＤベイトプラスミドの存在下のみでβ．ガラクトシダーゼ陽性である相互作用プラスミドが、更なる分析のために大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換された。手動配列決定が、ｆｍｏｌ Ｃｙｃｌｅ配列決定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）と併せて33Ｐ末端標識プライマーを使用して行われた。配列は、ＧｅｎｂａｎｋのＢｌａｓｔサーチおよびＥＭＢＬデータベースによって分析され、かつ予測されたたんぱく質は、ＩＳＲＥＣ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｓｃａｎ Ｓｅｒｖｅｒ（ｗｗｗ．ｉｓｒｅｃ．ｉｓｂｓｉｂ．ｃｈ）を用いてモチーフに関して分析された。
たんぱく質相互作用の半定量化のために、ｐＡＳ２．１−ＥＤＤ構築体を含むＣＧ１９４５酵母細胞が、ｐＡＣＴ２由来プラスミドを持つＹ１８７酵母細胞と組み合わされた。二倍体は、ｌｅｕ−ｔｒｐ−プレートで選択され、かつ飽和状態まで培養され、１：１０に希釈され、かつ１６時間培養された培養物を植菌するために使用された。酵母細胞は、たんぱく質で採取され、かつβ．ガラクトシダーゼ活性は、液体化学発光アッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で決定された。
組み換えたんぱく質結合アッセイ
ＧＳＴタグを付した融合たんぱく質が、確立した手順（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）に従って大腸菌株ＢＬ２１から調製された。可溶性融合たんぱく質は、グルタチオンアガロースに結合され、かつたんぱく質基準に対するＣｏｏｍａｓｓｉ青色染色を経由して定量された。３５Ｓ標識ＥＤＤたんぱく質および突然変異体またはＳＲＣ−１は、連結インビトロ転写／翻訳システム（ＴＮＴ Ｑｕｉｃｋ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において合成され、かつ１０−２０μｌ反応混合物が、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）中で希釈され、かつ４℃で２時間グルタチオンアガロースビーズに結合された５μｇのＧＳＴ、ＧＳＴ−インポーチンα５、ＧＳＴ−ＰＲ（ＣＤＥ）またはＧＳＴ−ＣＩＢでインキュベーションされた。ビーズは、遠心分離によって回収され、溶解緩衝液中でよく洗浄され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で再度懸濁された。沸騰後、結合たんぱく質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより視覚化された。
細胞培養および一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３およびＴ−４７Ｄは、先に記載されたように保持された（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。ＭＣＦ−７細胞は、５％ＣＯ2中に１０％血清を含むＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に保持された。一過性トランスフェクションによる過剰発現のために、３×１０6ＨＥＫ２９３細胞が、１５ｃｍペトリ皿中に１０％血清を含むＨＭＥＭ中で平板培養された。翌日、ｐＲｃＣＭＶ−ＥＤＤ（１０μｇ）が、３０μｌ Ｆｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に細胞に添加された。
ＧＦＰタグを付した、かつ内因性のＥＤＤたんぱく質の局在化
ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、ＭＣＦ−７またはＴ−４７Ｄ細胞が、１−２×１０5細胞／ウェルで、６ウェルプレート中に播種された。細胞は、２μｇ ｐＥＧＦＰ−ＥＤＤまたはエンプティベクターＤＮＡによってトランスフェクトされ、翌日２４−４８時間チャンバースライドに分配された。スライドは、ＰＢＳ中で洗浄され、３．７％パラホルムアルデヒド中に固定され、ＰＢＳ中で洗浄され、かつ９０％グリセロール中に嵌め込まれる。ＧＦＰは、蛍光顕微鏡によって視覚化される。免疫染色のために、ＨＥＫ２９３細胞またはＥＤＤトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（ＷＴ３０）が、パラフィン中に包埋された。切片は、ＥＤＴＡ／クエン酸緩衝液中でアンマスキングする前に、脱ろうされ、かつ再水和され、かつ次にヤギ抗ＥＤＤ抗体Ｎ１９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）により染色される。ＥＤＤシグナルは、基質として液体３，３’−ジアミノベンジジンＰｌｕｓ（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）により、ＤＡＫＯ ＬＳＡＢ Ｐｌｕｓ Ｌｉｎｋ ａｎｄ Ｌａｂｅｌ（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して検出された。対比染色は、ヘマトキシリンにより行われた。
細胞溶解物中のたんぱく質相互作用
総細胞たんぱく質の抽出物のために、細胞は、先に記載のように、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）中に採取された。Ｔ−４７ＤおよびＭＣＦ−７細胞からの細胞質ｓ１００断片および核たんぱく質の抽出は、発表された方法に従って行われた（Ｄｉｇｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１、１４７５−１４８９、１９８３）。
細胞溶解物からの内因性または組み換えＥＤＤのＧＳＴ融合たんぱく質のプルダウンのために、０．５から１ｍｇ総たんぱく質が、４℃で１−２時間グルタチオンビーズに結合された５μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ融合たんぱく質でインキュベーションされた。ビーズは、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液中でよく洗浄され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解されたたんぱく質を結合し、かつＥＤＤ抗血清でイムノブロッティングした（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。免疫沈降のために、１０μｌのインポーチンα５抗血清（Ｐｅｔｅｒ Ｐａｌｓｅ，Ｍｏｕｎｔ Ｓｉｎａｉ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）が０．５から１ｍｇの細胞溶解物でインキュベーションされた（４℃で１時間）。抗体コンジュゲートは、たんぱく質Ａセファロースビーズに捕獲され（４℃で１時間）、かつ溶解緩衝液中で、よく洗浄された。結合たんぱく質は、ＥＤＤ抗血清でのイムノブロッティングが後に続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解された。
ＥＤＤＭを過剰発現する安定したＨＥＫ２９３細胞は、２４時間、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してｐＣＭＶＴａｇ２Ｃ−ＣＩＢまたはエンプティベクターによりトランスフェクトされた。ＭＧ１３２の存在下での６時間のインキュベーションに続き、細胞は、採取され、かつ溶解物が調製され、かつ１ｍｇ総たんぱく質が、４℃で２時間Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）に結合された抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２によりインキュベーションされた。ビーズは、遠心分離により回収され、かつ溶解緩衝液中で、よく洗浄された。ＥＤＤのウェスタンブロッティングが記載されていた（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。
核レセプタートランス活性化アッセイ
ＨＥＫ２９３またはＣＯＳ７細胞は、６ウェルプレート（２×１０5細胞／ウェル）中で平板培養され、かつ培地は、翌日、２％木炭剥離ＦＣＳに変えた。トランスフェクションは、９０ｎｇレセプター発現ベクター、４５０ｎｇルシフェラーゼレポーターベクターおよびｐＲｃＣＭＶまたはｐＳＧ５またはエンプティベクター中の１．２μｇ ＥＤＤ、ＥＤＤＭまたはＳＲＣ−１ ｃＤＮＡからなる１−２μｇ ＤＮＡ、および２００ｎｇ ＧＦＰ発現ベクターｐＧＦＰ２０を有する３−４μｌ Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行われた。翌日、細胞は、９６ウェルプレート（７×１０3細胞／ウェル）または６ウェルプレート（１．４×１０5細胞／ウェル）に分けられ、かつ２４時間後、薬品が混入された。更に２４時間後、９６ウェルプレート中の細胞は、ルシフェラーゼ活性（Ｌｕｃｌｉｔｅ試薬、Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）、および細胞数（Ｗｓｔ−１試薬、Ｒｏｃｈｅ）に関してアッセイされた。ある実験で、細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標） Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）を使用して観察された。６ウェルプレート中の細胞は、トランスフェクション効率を決定するために、蛍光顕微鏡によってＧＦＰ発現に関して分析され、かつ種々の構築体のたんぱく質発現レベルが、比較され得るように、たんぱく質溶解物調製のためにも使用された。細胞数またはＧＦＰ発現に有意の変動がある実験において、これらのパラメータは、ルシフェラーゼ活性を正規化するために使用された。ある実験で、ｐＲＳＶ−β−ｇａｌまたはｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）ベクターは、ｐＧＦＰ２０の変わりにトランスフェクトされ、かつトランスフェクション効率は、それぞれβ．ガラクトシダーゼまたはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に関してアッセイすることによって観察された。
プロテアソーム阻害実験
プロテアソーム阻害実験のために、ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で補足される、Ｈａｎｋｓ’塩（ＨＭＥＭ）を有する最小基本培地中で、６ウェル皿の３×１０5細胞／ウェルで平板培養された。４８時間後、培地は、２−６時間、２０μＭ ＭＧ１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはＤＭＳＯ賦形剤を含む培地に替えられた。ＣＩＢに対するウェスタンブロッティング用のモノクローナル抗体は、親切にもＵ．Ｐ．Ｎａｉｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＮＣ、ＵＳＡ）によって提供された。
ＤＮＡ傷害剤による細胞治療
ＭＣＦ−７細胞は、６時間の１００μｇ／ｍｌでのフレオマイシン（Ｃａｙｌａ、Ｆｒａｎｃｅ）、２ｍＭでのヒドロキシ尿素（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはＰＢＳ賦形剤の添加前に、１８時間、０．５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ中でインキュベーションされた。細胞は、先に記載のように、総たんぱく質または核たんぱく質抽出物のために採取された。
２．２ ＥＤＤのドメイン構造
ＥＤＤ配列の以前の分析により、カルボキシ末端ＨＥＣＴドメインの存在が示され、ＥＤＤをユビキチンたんぱく質リガーゼのＨＥＣＴファミリのメンバーとして同定した（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８；およびＨｕｉｂｒｅｇｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）（図５Ａ）。ＨＹＤにより同様に高度に保存されるＥＤＤの中央ドメインを更に検査することにより、それぞれＨＹＤおよびマウスＥＤＤにより９５％および１００％保存され（図５Ｂ）、かつ高度のｃａｌｏｓｓｉｎ（プッシュオーバー）との並置、ショウジョウバエにおいて雄の妊性および神経伝達に重要なカルモジュリン結合たんぱく質を示すアミノ酸６８個（ａａ１１７７−１２４５）の延伸が明らかにされた（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２、１２１５−１２２３、１９９６；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３１２９７−３１３０７、１９９８）。この領域中に含まれるのは、システイン／ヒスチジン高含量の推定亜鉛フィンガードメイン、最初に種の範囲からのＮ末端則Ｅ３ユビキチンリガーゼＵＢＲ１ｐ／Ｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｎ中で同定されたｚｆ−ＵＢＲ１（Ｐｆａｍ ＰＦ０２２０７、（Ｂａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８、２６３−２６６、２０００））である（Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．９、３１７９−３１８９、１９９０；Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、Ｃｅｌｌ ６９、７２５−７３５、１９９２；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５、７８９８−７９０３、１９９８）。コンセンサス配列ＣＸ12-16ＣＸ2ＣＸ8-10ＣＸ2ＣＸ4-5ＨＸ2ＨＸ11-14ＣＸＣＸ4-14Ｃは、ＵＢＲ１ｐの別個の領域で同様に発見される、より一般的なＲＩＮＧドメインを連想させる。亜鉛結合ドメインの両方のタイプは、ユビキチン化において確立された役割を有するＲＩＮＧドメインにより、たんぱく質−たんぱく質相互作用に役割を有することが提案されている（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０、８４−８７、２０００；Ｌｏｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１１３６４−１１３６９、１９９９）。ＥＤＤのこの中央領域は、潜在的な二連核局在配列（ＮＬＳ）も含み（ＫＬＫＲＴＳＰＴＡＹＣＤＣＷＥＫＣＫＣＫ、ａａ１２２２−１２４１；配列番号４３）、他方でもう一つの推定ＮＬＳは、潜在的なＳＶ４０の大きなＴ抗原様ＮＬＳ（ＰＹＫＲＲＲ、ａａ６３０−６３５；配列番号４５）上流のＮ末端領域（ＲＫＫＭＬＥＫＡＲＡＫＮＫＫＰＫ、ａａ５０２−５１７；配列番号４４）中に存在する（Ｄｉｎｇｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １６、４７８−７８１、１９９１）。同様にＥＤＤのＮ末端領域中には、たんぱく質−たんぱく質相互作用界面を形成し得る（Ｈｏｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ ２１、１７２−１７３、１９９６）”ＵＢＡドメイン”（ａａ１８８−２２５）と呼ばれる、ＨＹＤにより保存されるもう一つの領域がある。ＨＥＣＴドメインへのアミノ末端（ａａ２３９１−２４５５）は、たんぱく質相互作用を媒介し得る更にもう一つの領域に位置する。この６０アミノ酸延伸は、種の範囲からｐｏｌｙＡ結合たんぱく質のカルボキシ末端（ＰＡＢＰ−Ｃ）中の領域に５０％の相同を示す（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８；Ｋｏｚｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８、４４０９−４４１３、２００１）。ＰＡＢＰおよびＥＤＤ両方におけるこのドメインのＸ線構造が、最近決定され、かつ４つのアルファへリックスからなるたんぱく質相互作用界面を形成する（Ｋｏｚｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８、４４０９−４４１３、２００１；Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８、４４１４−４４１９、２００１）。
２．３ ＥＤＤおよびインポーチンα−５間の相互作用
相互作用たんぱく質を同定するために、ＥＤＤまたはＥＤＤ機能において役割を有する他の会合たんぱく質のユビキチン化標的となり得る酵母ツーハイブリッドアプローチが使用された。最初に、ヒト胎盤ｃＤＮＡ発現ライブラリの酵母ツーハイブリッドスクリーニングが、完全長ＥＤＤまたはＥＤＤの１つ以上の潜在的な相互作用ドメインを含む断片をコードするベイトに対して行われた（図５Ａ参照）。完全長ＥＤＤＭ（Ｃ２７６８Ａ突然変異体）によるスクリーニングは、核内移行たんぱく質インポーチンα５をコードする２個の独立したｃＤＮＡを同定し（ＮＰＩ−１（Ｏ’Ｎｅｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０６、１１６−１２５、１９９５；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９、７７８２−７７９１、１９９９））、一方は、完全長であり、かつ他方はアミノ酸２２９をカルボキシ末端にコードする（アミノ酸５３８）。インポーチンαは、ＮＬＳを認識することにより、核内移行において特異的役割を有し、ＥＤＤ中の１個以上の潜在的なＮＬＳが、実際に機能的であること、およびＥＤＤが、ＥＤＤの細胞質から核への輸送に関与するインポーチンαにより、核内で役割を有し得ることの両方を暗示している。
２．４ インポーチンα−５は、核局在シグナル結果を含むＥＤＤ領域と相互作用する
ＮＰＩ−１／インポーチンα５および完全長ＥＤＤ間に、強い相互作用が発見され、完全長インポーチンα５は、ツーハイブリッドスクリーニングにより単離されるアミノ切断たんぱく質よりも強く相互作用する（図６Ａ）。この差は、ＥＤＤが、塩基性ＮＬＳを含む他のたんぱく質のように、インポーチンαのアルマジロリピートによって認識されるならば、説明され得る：かかるリピート７回のうち４回のみが、切断インポーチンα５クローン中に存在する。プルダウン実験により、アミノ酸２６３−５３８をコードするＧＳＴインポーチンα５融合たんぱく質が、インビトロ翻訳ＥＤＤおよびＥＤＤのＮ末端三分の一をコードする突然変異体に結合できたが、ＥＤＤの中央またはカルボキシ末端領域には結合できないことが示された（図６Ｂ、６Ｃ）。このことは、ＥＤＤの中央領域中の推定ＮＬＳが、核内移行において機能的でないことを示唆した。ＧＳＴインポーチンα５も、内因性ＥＤＤ（Ｔ−４７Ｄ細胞）およびＨＥＫ２９３細胞中で発現する組み換えＥＤＤと相互作用し（図６Ｄ）、相当な割合の入手可能なＥＤＤたんぱく質を沈降させる。更に、抗インポーチンα５抗血清も、これらの溶解物からＥＤＤたんぱく質を免疫沈降させ、ＥＤＤおよびインポーチンα５がインビボで相互作用することを示した（図６Ｄ）。
ＥＤＤたんぱく質のアミノ末端三分の一は、２個の潜在的な塩基性ＮＬＳを含み、１個は二連であり、かつ１個は単純である。インポーチンα結合へのこれらのモチーフの相対的寄与を決定するために、一方、または両方のＮＬＳを含むか、またはいずれのＮＬＳも含まないインビトロ翻訳用の構築体一式が、作成された。ＧＳＴ−インポーチンαは、各ＮＬＳとある程度まで相互作用し、また両方のシグナルの不在下では、相互作用は見られなかった（図６Ｅ）。従って、我々は、完全な結合ポテンシャルには両方のＮ末端シグナルが、必要であるという結論を下す。
我々は、ＥＤＤがインポーチンαおよびβを有する核内移行複合体中にあり得ることを予期し、従って核内移行パートナーインポーチンβ／ｐ９７への結合もテストされた（図６Ｆ）。ＧＳＴ−インポーチンβは、インビトロ翻訳ＥＤＤおよびＥＤＤたんぱく質のアミノ三分の二または三分の一に結合され、利用可能なＥＤＤたんぱく質約５％のプルダウンという結果になった。インビトロ翻訳に使用された抽出物は、内因性インポーチンαを含むので、ＥＤＤおよびインポーチンβの結合は、おそらくインポーチンα／βヘテロダイマーによって媒介される。ＥＤＤおよびインポーチンα５間の相互作用ほうが、著しく強力であったが（データは図示せず）、酵母ツーハイブリッド分析は、インポーチンα１（Ｒｃｈ１）およびインポーチンα３（Ｑｉｐ１）の両方とのＥＤＤ相互作用も示した。全体に、ＥＤＤおよびいくつかのインポーチンαイソ型およびインポーチンβは、核内でのＥＤＤの役割を指摘している。
２．５ ＥＤＤは、核たんぱく質である
ＥＤＤの細胞局在を決定するために、哺乳類発現ベクターが、緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）のＮまたはＣ末端に融合されたＥＤＤ用に作成された。Ｎ末端ＥＤＤ−ＧＦＰ融合によるＨＥＫ２９３細胞またはＭＣＦ−７乳癌細胞のトランスフェクションは、蛍光が、核に限定されることを示した（図７Ａ）。同一の結果が、Ｃ末端融合によって得られた（図示せず）。対照的に、いずれかの株からの細胞が、ｐＥＧＦＰベクターのみでトランスフェクトされた時、全細胞にわたる染色の拡散パターンが観察された。核局在は、ＥＤＤ特異抗体が、ＥＤＤを過剰発現する、ＨＥＫ２９３細胞のＥＤＤまたはＷＴ３０誘導体を内因的に発現する、ＨＥＫ２９３細胞の切片を染色するために使用される時に確認された（図７Ｂ）。同じパターンの染色が、第２ＥＤＤ特異抗体に関して見られた（図示せず）。
２．６ ＥＤＤは、プロゲステロンレセプターＢと相互作用する
以前の研究により、ＨＥＣＴドメインたんぱく質Ｅ６−ＡＰが、ＬＸＸＬＬモチーフを含む領域を通じてＰＲ−Ｂと直接相互作用することが証明されている（Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９、１１８２−１１８９、１９９９）。他の転写コアクチベーター中に存在するこれらのモチーフは、核レセプター相互作用および同時活性化に潜在的に関与する（Ｈｅｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７、７３３−７３６、１９９７）。ＥＤＤたんぱく質が核であり、かつ（アミノ酸２４８、１１０２、１２５５、１３９８および２４２８に）５個のＬＸＸＬＬドメインを含むので、我々は、ＰＲ−Ｂと相互作用し、かつその機能を調整するＥＤＤの能力をテストした。第１に、我々は、ＥＤＤまたはインビトロ合成ＥＤＤ断片のＧＳＴ−ＰＲ融合たんぱく質プルダウンを行った。ＰＲのＮ末端ＡＢ領域は、リガンド非依存性活性化機能１を含み、他方でＰＲのＣ末端ＣＤＥ領域は、ヒンジおよびＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド依存性活性化機能２を含む。ＰＲのＣＤＥ領域、ＰＲ（ＣＤＥ）は、Ｔ−４７Ｄ細胞から内因的に発現したＥＤＤと相互作用した（図８Ａ）。この相互作用は、インビトロ翻訳ＥＤＤたんぱく質断片を使用してマッピングされた。ＥＤＤのアミノ末端領域（ＥＤＤＦ１、ａａ１−８８９）およびＰＲのＣＤＥ領域間に強力な相互作用が検出され、ＳＲＣ−１に関して見られたそれよりも大きい（図８Ｂ）。これらのインビトロアッセイにおいて、ＰＲ（ＣＤＥ）およびＳＲＣ−１またはＥＤＤＦ１間の相互作用は、ＰＲリガンドＯＲＧ２０５８によって影響を受けなかった（データは図示せず）。ＰＲおよびＥＤＤのその他の断片の間に有意な結合は、観察されなかった（図８Ｂ、データは図示せず）。
ＥＤＤのＮ末端領域は、５個のＬＸＸＬＬモチーフの１個を含み、このモチーフの関与を評価するために、相互作用は、更にマッピングされた。ＥＤＤ断片、ＥＤＤＦ１ａ−ＥＤＤＦ１ｄが、そのＧＳＴ−ＰＲ（ＣＤＥ）を結合する能力に関してテストされた。ＥＤＤＦ１ａ（ａａ１−５５７）およびＥＤＤＦ１ｃ（ａａ１−４１９）は、ＬＸＸＬＬモチーフを含んでいたが、最も強力な結合は、ＥＤＤＦ１ｂ（ａａ５５８−８８９）またはＥＤＤＦ１ｄ（ａａ４２０−８８９）およびＰＲ（ＣＤＥ）間に生じ（図８Ｃ）、結合が、両方のＮＬＳを含むが、ＬＸＸＬＬモチーフを含まないアミノ酸４２０−８８９からなるＥＤＤ領域によって媒介されることを示唆している。このことも、この相互作用におけるＵＢＡドメインの関与を除外している。これらのデータは、一緒に考慮すれば、ＥＤＤおよびＰＲ間の相互作用を立証している。
２．７ ＥＤＤは、核レセプターにとって転写コアクチベーターの機能を果たす
ＥＤＤの核局在およびＥＤＤおよびＰＲ−Ｂ間で観察される相互作用は、酵母Ｒｓｐ５、そのヒト相同体ｈＲＰＦ１（Ｉｍｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６、２５９４−２６０５、１９９６）およびＥ６−ＡＰ（Ｈｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、１７１３７−１７１９５、１９９７）のような他のＨＥＣＴドメインたんぱく質が核レセプターのコアクチベーター活性を有するという別個の研究からの証拠と共に、ＥＤＤがＰＲ−Ｂによる転写活性化を高め得るかという調査を促した。このために、内因性ＰＲが欠如するＨＥＫ２９３およびＣＯＳ７細胞は、ＰＲ発現ベクター（ｐＳＧ５／ｈＰＲＢ−１）およびプロゲスチン応答性ＭＭＴＶルシフェラーゼレポーター構築体、並びに正の対照としてＥＤＤまたはＳＲＣ−１の発現ベクターによってトランスフェクトされた。ＥＤＤは、両方の株における制御レベルの３から５倍のプロゲスチン（ＯＲＧ２０５８）誘発ルシフェラーゼ活性を一貫して増大させ、ＳＲＣ−１のそれに匹敵する効果であった（図９Ａ）。添加ＯＲＧ２０５８の不在下で、ＥＤＤおよびＳＲＣ−１も、ルシフェラーゼＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモータの基礎活性を僅かに増大させ、ＣＯＳ７細胞株で、より明白な効果であった。次に、我々は、ＥＤＤの観察された転写効果が、ＥＤＤのユビキチンリガーゼ活性によるものであるかテストした。リガーゼ欠損ＥＤＤ突然変異体（ＥＤＤＭ）がトランスフェクトされた時、相当するコアクチベーター活性が観察され、ＥＤＤのコアクチベーター活性が、そのユビキチンリガーゼ活性と無関係であることを示唆した（図９Ｂ）。
重要なことには、ＰＲトランス活性化に対するＥＤＤの効果は、プロゲスチンアンタゴニストＲＵ４８６存在下では見られず（図示せず）、リガンド結合レセプターの特異性を示している。同様に、ＰＲ不在下でのレポーター遺伝子活性に関するＥＤＤの効果はなく、ＰＲによるトランス活性化の特異的効果を示した（図示せず）。
ｐＲｃＣＭＶ−ＥＤＤの増大量のトランスフェクションにより、プロゲスチン誘発ルシフェラーゼ活性に関する効果の明らかな容量応答が示され（図９Ｃ）、かつＥＤＤが同時発現する時に、１０ｐＭから１００ｎＭのあらゆる濃度でのＯＲＧ２０５８は、ルシフェラーゼ活性を遥かに大きな程度で刺激した（図９Ｄ）。ＥＤＤ同時発現は、ＥＤＤトランスフェクションがなければ、１０ｎＭ ＯＲＧ２０５８が最大応答を与え、他方でこれはＥＤＤ過剰発現による１００倍低い濃度である１００ｐＭで、超えられるような、プロゲスチンの低濃度への非常に増強した応答をもたらした。
これらのデータは、核レセプターコアクチベーターとしてのＥＤＤの細胞機能を初めて明らかにした。興味深いことに、ＥＤＤは、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）によるトランス活性化も三倍に増強した（図９Ｅ）。しかしながら、エストロゲンレセプター（ＥＲ）活性は、ＥＤＤによって増強されず、他方で同じ実験において、ＳＲＣ−１は、コアクチベーターの機能を果たし（図９Ｆ）、ＥＤＤが、ステロイドレセプターを区別することを証明した。総合してこれらのデータは、ＥＤＤが、ＰＲおよびＶＤＲ媒介転写におけるコアクチベーターとして働くことを証明している。
２．８ ＥＤＤは、ＤＮＡ損傷応答に潜在的に関与するたんぱく質であるＣＩＢと相互作用する
更なる酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、ＥＤＤのユビキチン化または同時活性化機能に関与する他のたんぱく質を同定することを目的とした。完全長ＥＤＤＭまたはＥＤＤＦ５Ｍ（ａａ８８９−２７９９）がベイトとして使用された時、カルシウムおよびインテグリン結合たんぱく質／ＤＮＡ依存性たんぱく質キナーゼ相互作用たんぱく質（ＣＩＢ／ＫＩＰ）をコードする３個のクローンが単離された：２個は完全長であり、もう１個は、ＣＩＢ／ＫＩＰ ａａ５−１９１をコードする。ＣＩＢは、細胞質および核において可能な二重の役割を有する可能性のあるたんぱく質である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８５、１３−２０、１９９７；Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、４６５１−４６５４、１９９７；Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １８、５５２８−５５３９、１９９９；Ｓｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４２、７２９−７３５、１９９９）。当初、酵母ツーハイブリッドシステムにおいて検出された、ＣＩＢおよび完全長ＥＤＤ間の相互作用（図１０Ａ）は、ＧＳＴ−ＣＩＢでのインビトロ翻訳ＥＤＤたんぱく質のプルダウンによって確認された（図１０Ｂ）。インビトロ翻訳ＥＤＤ断片を使用するこの相互作用のマッピングは、ＣＩＢが、ＥＤＤたんぱく質のカルボキシ末端部分と相互作用することを示した（ＥＤＤＦ３、ＥＤＤＦ３Ｍ、図１０Ｃ）。細胞における相互作用の証拠を得るために、ＦＬＡＧタグを付したＣＩＢが、ＥＤＤを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において発現し、かつたんぱく質抽出物が調製された。ＥＤＤたんぱく質は、ＦＬＡＧ免疫沈降でこれらの溶解物から検出されたが、ベクタートランスフェクト細胞のそれからは検出されなかった（図１０Ｄ、左パネル）。ＧＳＴ−ＣＩＢ融合たんぱく質も、ＥＤＤの内因性レベルを発現するＭＣＦ−７細胞の核から調製された細胞溶解物においてＥＤＤと相互作用した（図１０Ｄ、右パネル、”対照”）。
ＥＤＤを核内出観察したので、ＣＩＢの可能な核の役割が、調査された。ＣＩＢは、ＤＮＡ損傷感知酵素ＤＮＡ ＰＫと相互作用することが以前発見されたので（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８５、１３−２０、１９９７）、ＤＮＡでの二本鎖破損を引き起こす放射線類似作用フレオマイシンによって処理されたＭＣＦ−７細胞からの溶解物は、ＧＳＴ−ＣＩＢ融合たんぱく質によってインキュベーションされた。結合たんぱく質の捕獲により、細胞が、フレオマイシンによって処理された時、未処理細胞、またはＤＮＡ架橋を引き起こすヒドロキシ尿素によって処理された細胞と比較すると、ＥＤＤおよびＣＩＢ間の著しく少ない会合が明らかになった（図１０Ｄ、右パネル）。結合変化は、不変であるＥＤＤたんぱく質レベルの減少に起因しなかった（図示せず）。
これらの研究は、ＥＤＤが、潜在的なユビキチン化基質ＣＩＢと相互作用し、かつこの相互作用は、ＤＮＡ損傷に敏感であることを示している。これは、ＤＮＡ損傷に応答性である、ＥＤＤまたはＣＩＢを関与させるたんぱく質相互作用の最初の指摘である。
２．９ Ｃｈｋ２ Ｎ末端は、ＨｅＬａ核抽出物においてＥＤＤと相互作用する
ＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ（ａａ１−２２５）（図１１Ａ）が、ＨｅＬａ核抽出物によってインキュベーションされる時、相互作用たんぱく質の一方は、ＥＤＤであるとＭＳ配列決定によって発見された（Ｓｔｅｖｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｉ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／ＣＲＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。我々は、ＭＣＦ−７細胞からのＧＳＴｃｈｋ２−Ｎプルダウンとそれに続くＥＤＤたんぱく質を検出するウェスタンブロッティングによってこのことを確認した（図１１Ｂ）。内因性レベルのｃｈｋ２およびＥＤＤを両方が含む、ＨＥＫ２９３細胞またはＭＣＦ−７細胞から調製された、全細胞抽出物からのｃｈｋ２免疫沈降と、それに続くＥＤＤのイムノブロッティングは、ＥＤＤとｃｈｋ２とのインビボ会合を確認した（図１１Ｃ）。
２．１０ ＥＤＤは、Ｃｈｋ２のＦＨＡドメインと相互作用する
35Ｓ標識インビトロ翻訳ＥＤＤの種々の断片が、ＧＳＴｃｈｋ２−Ｎに結合するためにテストされた時、ＥＤＤのカルボキシ末端三分の二（ＥＤＤＦ５、ａａ８８９−２７９９）が相互作用することが見つかった。この相互作用におけるｃｈｋ２ ＦＨＡドメインの要件を決定するために、ＥＤＤおよびＧＳＴｃｈｋ２−Ｎの間の結合および２個の突然変異体が、評価された。Ｒ１１７Ａ突然変異体は、ＦＨＡドメイン中の置換を含み、かつホスホスレオニン結合に直接必要な残基を伴う。この突然変異体は、ＥＤＤを結合しなかった（図１２Ａ）。Ｉ１５７Ｔリーフラウメニ会合突然変異体は、ホスホスレオニンを結合する能力を保持したが、ｐ５３（Ｆａｌｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０、５５０６−５５１０、２００１）、ｃｄｃ２５Ａ（Ｆａｌｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０、８４２−８４７、２００１）、ＢＲＣＡ１およびｃｄｃ２５Ｃ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ９、１０４５−１０５４、２００２）のようなｃｈｋ２の基質を結合することが不可能であることが示された。興味深いことに、Ｉ１５７Ｔ置換は、ＥＤＤへの結合に効果を有さず（図１２Ａ）、ＥＤＤが、代わりにホスホスレオニン残基を通して結合し得ることを示唆している。これらのデータは、ＭＣＦ−７核抽出物を使用する更なるＧＳＴｃｈｋ２−Ｎプルダウン実験によって支持された（図１２Ｂ）。
ｃｈｋ２ Ｎ末端領域へのＥＤＤ結合のためのＦＨＡドメイン中の非損傷ホスホペプチド結合モチーフの要件は、相互作用が、ＥＤＤたんぱく質中のリン酸化スレオニン残基によって媒介されることを示唆している。関与する残基は、まだ同定されていないが、Ｆｌａｇタグを付したＥＤＤが、32Ｐ標識オルトリン酸塩および調製した細胞溶解物の存在下でＨＥＫ−２９３細胞において過剰発現する時、結果として生じるＦｌａｇ免疫沈降が、ＥＤＤに対応する標識種を含んだので（図１１Ｃ）、ＥＤＤは、細胞中でリン酸化される。更に、ＨＥＫ−２９３またはＭＣＦ−７が、リン酸塩を除去するためにラムダたんぱく質ホスファターゼ存在下でインキュベートされる時、ＥＤＤの電気泳動移動度は、増大し、ＥＤＤたんぱく質におけるリン酸化アミノ酸残基の存在を示している。
ＦＨＡドメインに強力に結合するホスホペプチド（ＲＷＦＤＴ（Ｐ）ＹＬＩＲＲ）（配列番号４６）は、ＥＤＤへのｃｈｋ２ ＦＨＡドメインの親和力を更に調査するために使用された。５０μＭを超える濃度でのこのペプチドによるＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ融合たんぱく質のプレインキュベーションは、ＥＤＤおよびｃｈｋ２−Ｎ間の結合を取り除いた（図１２Ｄ）。
２．１１ ＤＮＡ損傷は、ＥＤＤ−ｃｈｋ２相互作用の破壊を引き起こす
ＤＮＡ損傷応答におけるＥＤＤ−ｃｈｋ２相互作用の役割が、調査された。ＭＣＦ−７細胞は、ＤＮＡでの二本鎖破損およびＡＴＭキナーゼを経由したｃｈｋ２の活性化を引き起こす、放射線類似作用薬物フレオマイシンによって処理された（Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１８９３−１８９７、１９９８）。ｃｈｋ２のＤＮＡ損傷に応答した、リン酸化誘発移動度シフトが、観察された（図１４Ａ）。対照的に、ＭＣＦ−７核抽出物において、ＥＤＤたんぱく質の移動度またはレベルの変化は、検出不可能であった。しかしながら、ｃｈｋ２がこれらの抽出物から免疫沈降する時、会合ＥＤＤの量は、ＤＮＡ損傷の後に著しく減少し、かつこれらの結果は、これらの同じ溶解物からのＧＳＴｃｈｋ２−Ｎプルダウンと一致した（図１４Ｂ）。
２．１２ ＥＤＤ欠乏は、ＣＨＫ２活性化を害する
ＤＮＡ損傷応答におけるＥＤＤ−ＣＨＫ２相互作用の役割を検査するために、ＥＤＤ欠損細胞が、ＤＮＡ損傷でのＣＨＫ２活性化に関して観察された。ＲＮＡ干渉が、（本文で記載するように）ＥＤＤ細胞を欠乏させるために使用され、ＥＤＤ細胞は次に照射され、かつ１．５時間まで回復された。ＥＤＤ欠如細胞において、Ｔ６８でのＣＨＫ２のＤＮＡ損傷誘発リン酸化は、対照細胞と比較して著しく減少した（図１５Ａ）。次に、ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ｃ基質に向かうＣＨＫ２キナーゼ活性が、ＥＤＤの存在下および不在下で種々のＩＲ後の時間でアッセイされた。これらのアッセイは、ＣＨＫ２の活性化が、ＥＤＤ欠如細胞において遅延し、かつこれらの細胞が対照細胞と比較して最大ＣＨＫ２キナーゼ活性に達する能力が害されることを示した（図１５Ｂ）。
２．１３ ｃｈｋ２とのＥＤＤおよびＢＲＣＡ２の相互作用は、ＤＮＡ損傷応答において明確な役割を有し得る
ＥＤＤは、ＢＲＣＡ２とも相互作用をする。ＥＤＤは、ＨｅＬａ細胞の核抽出物から単離された２ＭＤａたんぱく質複合体中でＢＲＣＡ２と共に同定された（Ｒ．Ｓｈｉｅｋｈａｔｔａｒ、Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕ．Ｐｅｎｎ、私信）。我々は、この会合が、ＨＥＫ−２９３細胞溶解物からのＥＤＤおよびＢＲＣＡ２の免疫共沈降によって確認されることを確認した（図１７Ａ）。従って、我々は、ｃｈｋ２およびＢＲＣＡ２間の相互作用の可能性をテストすることに興味を持った。実際に、ｃｈｋ２が、ＭＣＦ−７核抽出物から免疫沈降された時、ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２の両方が、検出された（図１７Ｂ）。ＥＤＤおよびｃｈｋ２間の相互作用は、フレオマイシン処理で減少したが、ｃｈｋ２と会合したＢＲＣＡ２の量には、影響がなかった。ＭＣＦ−７細胞が、複製ブロック誘発剤ヒドロキシ尿素（ＨＵ）に曝された時に、反対の影響が見られた。ｃｈｋ２の複製ブロック誘発活性化は、ＥＤＤとの会合に関して影響を有さなかったが、他方でＢＲＣＡ２会合レベルは、著しく減少した（図１７Ｂ）。これら３種のたんぱく質が、共通の複合体中に存在することは、可能である。そうであれば、二本鎖破損をもたらすＤＮＡ損傷に関して、ＥＤＤは複合体から解離する傾向があり、他方で複製ブロック経路が活性化されると、ＢＲＣＡ２は、解離すると考えられる。従ってＥＤＤおよびＢＲＣＡ２が、ｃｈｋ２との複合体中に共にあるならば、この複合体は、ＤＮＡ損傷の異なるタイプに応答して異なった影響を受けるように見える。ＢＲＣＡ２およびｃｈｋ２間の複合体は、以前に報告されておらず、ＤＮＡ損傷応答において、大きな重要性を有する。
２．１４ ＥＤＤおよびｃｈｋ２間の相互作用のマッピング
ＥＤＤ配列は、リン酸化された時、ＦＨＡ結合の好適な状況において多数のスレオニン残基を含む（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５１３、５８−６６、２００２）。実際の結合部位を含むＥＤＤ領域を特定するために、種々の35Ｓ標識インビトロ翻訳ＥＤＤ欠失突然変異体へのＧＳＴｃｈｋ２−Ｎの結合（図１３Ａ参照）が、検査された。当初の実験において、ｃｈｋ２へのＥＤＤの完全結合は、ＥＤＤのカルボキシ三分の二（ＥＤＤＦ５）を必要とした − ＥＤＤＦ２（中央三分の一）もＥＤＤＦ３（カルボキシ三分の一）も結合には充分でなかった（図１３Ａ）。ＨｅｃｔドメインまたはＲＩＮＧ状ドメインの、ＥＤＤＦ５（それぞれＥＤＤ６およびＥＤＤ７）からの除去は、結合に著しい影響を及ぼさず（図１３Ｂ）、ｃｈｋ２ ＦＨＡドメインに結合するＥＤＤ領域が、アミノ酸１４０６および２５２６の間に位置することを示唆している。
２．１５ ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２間の相互作用をマッピングする
ＢＲＣＡ２の実際の結合部位を含むＥＤＤ領域を特定するために、種々の35Ｓ標識インビトロ翻訳ＥＤＤ欠失突然変異体へのインビトロ翻訳ＢＲＣＡ２の結合（図１３Ａ参照）が、検査された。
その上、ＢＲＣＡ２の欠失突然変異体を製造し、かつ３５Ｓで標識を付された。完全長ＥＤＤたんぱく質の能力は、ＥＤＤが結合するＢＲＣＡ２領域を決定するために、テストされる。かかる情報は、これらの相互作用が、単一複合体（すなわちＢＲＣＡ２−ＥＤＤ−Ｃｈｋ２）を形成するか、または代わりにこれらの相互作用が、個別の複合体を形成するかを決定するための、ＢＲＣＡ２−ＥＤＤ複合体およびＣｈｋ２−ＥＤＤ複合体の分析を容易にする。
ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２間の相互作用を更に特徴付けるために、これらのたんぱく質は両方共、Ｃｈｋ２発現が欠如するＨＣＴ−１５細胞において発現する。ＨＣＴ−１５における両方のたんぱく質発現の後、ＥＤＤへの抗体が免疫沈降実験で使用される。捕獲したたんぱく質複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離され、かつＢＲＣＡ２レベルは、抗ＢＲＣＡ−２抗体を使用して決定された。
ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を発現するＨＣＴ−１５細胞は、次にＣｈｋ２を発現する発現ベクターによってトランスフェクトされ、かつＥＤＤおよびＢＲＣＡ２の会合に対するＣｈｋ２の効果を決定するために、免疫共沈降実験が繰り返された。
２．１６ ＥＤＤ−ＢＲＣＡ２−ＣＨＫ２相互作用の機能的結果
ユビキチン化アッセイが、ＥＤＤがＤＮＡ損傷に応答して活性化されるか、かつＥＤＤがユビキチン化およびその後の分解のためにＢＲＣＡ２を標的とするかを調査するために使用される。アッセイは、インビトロ翻訳または免疫沈降ＥＤＤを使用し、反応は、ＧＳＴまたはＨｉｓタグを付したユビキチン、Ｅ１およびＥ２ ＵｂｃＨ５ｂの存在下で行われ、ＴｏｐＢＰ１を正の対照基質とする。ＥＤＤ活性は、電離放射線の存在下および不在下で決定される。このアッセイは、Ｇｌｉ１、２および３たんぱく質、またはＣＩＢのようなＥＤＤによるユビキチン化用の他の候補基質をテストするためにも使用される。
（本文に記載した）確立したＲＮＡｉ手順を使用してＭＣＦ−７乳癌細胞からＥＤＤを欠乏させることは、ＢＲＣＡ２がユビキチン媒介分解のためにＥＤＤによって標的とされている程度を決定するために、使用される。ＢＲＣＡ２たんぱく質レベルに対するプロテアソーム阻害剤およびＤＮＡ損傷の影響は、ウェスタンブロッティングを使用して観察される。
二本鎖ＤＮＡ損傷のＢＲＣＡ２媒介修復でのＥＤＤの役割を決定するために、正常ＥＤＤレベルまたはＥＤＤ短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によりトランスフェクトされたレベルでのＭＣＦ−７またはＨＥＫ−２９３細胞における放射線誘発ＢＲＣＡ２−ＲＡＤ５１核病巣形成の頻度が、決定される。ＢＲＣＡ２およびＲＡＤ５１間の複合体形成も、免疫共沈降実験によって観察された。
２．１７ ＤＮＡ損傷状況でのＥＤＤ−ＢＲＣＡ２−ＣＨＫ２相互作用
ＡＴＭ媒介経路を経由したＤＮＡ損傷シグナル伝達の状況での相互作用を検査するために、細胞は、電離放射線によって４から１２Ｇｙの線量で処理され、かつ細胞は、０−６時間の期間、回復された。ＣＨＫ２活性化およびＤＮＡ損傷への他の下流応答が、Ｔ６８でリン酸化されるＣＨＫ２のレベルを検出するため、かつ適切な場合、ｐ５３蓄積のために、イムノブロッティングによって観察される。
更に、ＣＨＫ２刺激のＡＴＲ媒介応答経路およびＥＤＤ−ＢＲＣＡ２−ＣＨＫ２相互作用へのその影響を研究するために、ヒドロキシ尿素が使用される。
２．１８ ＥＤＤ−ＢＲＣＡ２−ｃｈｋ２相互作用の重要性 − ワーキングモデル
ＥＤＤは、ＤＮＡ損傷で、ｃｈｋ２から解離する。従って、ＥＤＤは、ｃｈｋ２を正常に調節し得、かつｃｈｋ２活性化のために除去される必要がある。例えば乳癌で観察されるようなＥＤＤ過剰発現は、ＤＮＡ損傷に応答してｃｈｋ２活性化を次に阻害し得、このようにして欠損ＤＮＡの複製または異常染色体組を有する細胞の連続増殖に至る。これらの条件は、更なる突然変異を助長し、かつ癌または腫瘍の進行に至らせ得る。反対に、ＥＤＤ ｓｉＲＮＡを受けるＥＤＤノックアウトマウス胚または細胞において、ｃｈｋ２が、ＥＤＤの阻害効果の不在下で無調節で有り得、かつこのようにして持続性不適性セルサイクル停止を引き起こし得ることを我々は提案する。
従って、ｃｈｋ２−ＥＤＤ−ＢＲＣＡ２相互作用に影響を与える正確な経路を理解することは、重要である。いずれにせよ、これら２種の腫瘍サプレッサーたんぱく質とのＥＤＤの相互作用は、癌発達および進行におけるＥＤＤの潜在的な役割を強調する。特に、ＤＮＡ損傷修復およびセルサイクル停止におけるＣＨＫ２およびＢＲＣＡ２の確立した役割は、ＥＤＤが、かかる経路において役割を果たし得ることを強く示唆している。
２．１９ 考察
この研究は、核たんぱく質ＥＤＤの新規な機能的役割を立証している。プロゲスチン調節遺伝子、ＥＤＤは、それ自体がＰＲ転写活性を可能にする能力を有する。その上、ＥＤＤは、ＤＮＡ損傷に敏感な相互作用である、ＤＮＡ ＰＫ結合たんぱく質、ＣＩＢによる複合体形成によって示唆されるように、ＤＮＡ損傷シグナル伝達において、役割を果たし得る。
本研究は、ＥＤＤが、ＥＤＤのＮ末端中の２個のＮＬＳを経由したインポーチンαとの直接的相互作用におそらく起因する核たんぱく質であることを示した。ＥＤＤおよび他のＥ３リガーゼにおいて可逆ユビキチン結合活性を有するＨＥＣＴドメイン（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）はまた、関連たんぱく質中の転写同時活性化において別個の役割と関連する：Ｒｓｐ５／ｈＲＰＦ１およびＥ６−ＡＰは、リガンド依存性核レセプター活性を同時活性化し（Ｉｍｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６、２５９４−２６０５、１９９６；Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９、１１８２−１１８９、１９９９）、他方でＴｏｍ１ｐは、ある種の酵母遺伝子の転写調節に必要であり（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２、９３３−９４６、１９９８）、かつＵＲＥＢ１は、ラットプレプロダイノルフィン遺伝子からの転写を増強する（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２４、７７−８８、１９９４）が、標的遺伝子のｐ５３トランス活性化を抑制する（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１、２１７５−２１７８、１９９５）。
ＥＤＤは、ｐ１６０コアクチベーターＳＲＣ−１に関して見られるレベルに匹敵するレベルで、ＰＲトランス活性化を可能にする。ＥＤＤは、明白な選択性プロフィールを有し、リガンド依存的に、ＰＲおよびＶＤＲを同時活性化することが可能であるが、ＥＲを同時活性化することは可能でない。このことは、ＥＲ、ＰＲ、ＡＲおよびＧＲを含むホルモンレセプター範囲を同時活性化するＨＥＣＴリガーゼＥ６−ＡＰと対照的である（Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９、１１８２−１１８９、１９９９）。Ｒｓｐ５も、ある種の選択性、ＰＲおよびＧＲによるが、ＥＲによらない同時活性化転写を示す（Ｉｍｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６、２５９４−２６０５、１９９６）。ＥＤＤは、ＨＥＣＴリガーゼの中では独特であるが、しかしながらＥＤＤ自体が、プロゲステロン調節遺伝子であるので、ＥＤＤによるＰＲトランス活性化のその増強において、正のフィードバックループの興味深い可能性を引き起こす（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７、３４７９−３４９１、１９９８）。このように、ある種の乳癌で見られるＥＤＤの過剰発現は、プロゲスチンレベルを低下させるために、ＰＲ陽性腫瘍の感度を増大させ得る。
Ｅ６−ＡＰ、Ｒｓｐ５／ｈＲＰＦ１およびＴｏｍ１ｐのように、ＥＤＤによる同時活性化は、ＨＥＣＴドメインのユビキチン結合能力と無関係である（Ｓａｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２、９３３−９４６、１９９８；Ｉｍｈｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６、２５９４−２６０５、１９９６；Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９、１１８２−１１８９、１９９９）。これらの発見は、ユビキチン化が転写活性化過程に深い関係があるという証拠を考慮すると、多少以外である。他の多くの転写因子のように、ＥＲ、ＰＲおよびＶＤＲを含む幾つかの核レセプターは、２６Ｓプロテアソームによって下方制御され（Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６、１８５８−１８６２、１９９９；Ａｌａｒｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １３、１５２２−１５３４、１９９９；Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７、１０３２−１０３７、２０００；Ｌｏｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５、９３９−９４８、２０００；Ｍａｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ ７１、４２９−４４０、１９９８）、かつコアクチベーター結合は、この分解に必要であるように見える。
プロテアソームの阻害は、ステロイドレセプターＥＲおよびＰＲによる転写活性を減少させ（Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．６、９５４−９５９、２００１）、かつより一般的な暗示が、１９Ｓプロテアソームサブユニットが、転写延長に必要であることを示す研究から生じる（Ｆｅｒｄｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ７、９８１−９９１、２００１）。更に、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシ末端尾部自体が、ユビキチン媒介たんぱく質分解の標的である（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４００、６８７−６９３、１９９９；Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、３６５６−３６６１、１９９７）。ＥＤＤおよびこれら他のＨＥＣＴユビキチンリガーゼは、それ自体が触媒活性ＨＥＣＴドメインを有さずに、ユビキチン化カスケードにおいてある種の機能をなおも実行し得ることがあり得る。ＥＤＤは、ＲＩＮＧ状亜鉛フィンガードメインおよびＨＥＣＴドメインの両方を持つ唯一のＥ３リガーゼであるように見え、また我々は、ＥＤＤによる同時活性化が、ＲＩＮＧ状またはＵＢＡドメインを通じて媒介される可能性を除外できなかった。
ｐ１６０ファミリに関して、Ｅ６−ＡＰによる同時活性化メカニズムは、転写複合体にブリッジングまたは酵素活性を提供する、直接的コアクチベーター−レセプター相互作用に起因すると考えられた。多くのステロイドレセプターコアクチベーターは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性を持つが、ｐ３００と比較すると、僅かなＨＡＴ活性がＥＤＤと会合するか、または会合しない（我々の未発表データ）。Ｅ６−ＡＰの２領域が、ＬＸＸＬＬレセプター結合モチーフを含み、かつこれらの領域の両方が、ＰＲと相互作用する（Ｎａｗａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９、１１８２−１１８９、１９９９）。ＥＤＤ配列の調査により、１個のＮ末端、１個のＣ末端および３個の中心に位置するＬＸＸＬＬドメインが明らかになった（図５Ａ）。更に、Ｎ末端および中心に位置するモチーフは、ＨＹＤへの高い相同性を有する領域に位置する。しかしながら、ＰＲ（ＣＤＥ）への最も強い結合を有する領域中のＮ末端モチーフは、相互作用に必要でなかった。それでも、ＥＤＤおよびＰＲの他のＮ末端配列間の直接相互作用は、ＰＲトランス活性化に関するＥＤＤの観察された影響を部分的に説明し得る。Ｓａｌｇｈｅｔｔｉらは、転写増強におけるユビキチン化の役割の研究において、ＶＰ１６転写活性化ドメインのモノユビキチン化が、転写活性に充分であることを発見した（Ｓａｌｇｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３、１６５１−１６５３、２００１）。興味深いことに、他の研究は、ＵＢＡドメインが、かかるモノユビキチン化たんぱく質を結合し、かつこのようにしてマルチユビキチンチェーンの形成を妨げ得ることを発見し（Ｂｅｒｔｏｌａｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８、４１７−４２２、２００１）、ＥＤＤによるＰＲ安定化を経由した可能な同時活性化メカニズムを提起した。しかしながら、ＥＤＤによるＰＲ同時活性化におけるＵＢＡドメインの別の役割を除外できないが、我々は、ＵＢＡドメインが、ＥＤＤおよびＰＲ間のインビトロ相互作用には必要でないことを発見した。
ＵＢＡドメインに加えて、ＥＤＤのｚｆ−ＵＢＲ１ドメインも、たんぱく質−たんぱく質相互作用に関与する可能性が高い。ｚｆ−ＵＢＲ１ドメインは、ＵＢＲ１たんぱく質におけるタイプ１部位と一致し、Ｎ末端に特異的な結合部位は、塩基性Ｎ末端残基を有する基質を左右する（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５、７８９８−７９０３、１９９８）。このｚｆ−ＵＢＲ１ドメインは、ｃａｌｏｓｓｉｎ状ＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガーたんぱく質、ＢＩＧの機能にとって重要であり、かつそれ故にＥＤＤファミリーメンバーにおいて、基質認識および結合の役割も有し得る。その他のＨＥＣＴは、ＨＥＣＴドメインとは異なる基質相互作用ドメインを有する（例、ＷＷドメイン（Ｈｕｉｂｒｅｇｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４、３６５６−３６６１、１９９７））。残念ながら、ＵＢＡおよびｚｆ−ＵＢＲ１を酵母ツーハイブリッド分析のベイトとして使用する試みは、それぞれ自己活性化および無差別結合のために失敗であり、そのためＥＤＤたんぱく質におけるこれらの領域の正確な機能、および同時活性化におけるその役割は、もしあるならば、理解しにくいままである。
細胞溶解物を使用して、ＥＤＤおよびＣＩＢは、ＭＣＦ−７およびＨＥＫ２９３細胞において相互作用することが認められた。ＣＩＢは、それぞれ他のＥＦハンドたんぱく質、カルモジュリンおよびカルシニューリンＢと５８％および５６％相同であり、かつキナーゼまたはホスファターゼのカルシウム依存性調節サブユニットの役目を果たし得る（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７２、４６５１−４６５４、１９９７）。他のたんぱく質５種とのＣＩＢの相互作用は、記載された：ＤＮＡ ＰＫ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３８５、１３−２０、１９９７）、インテグリンαＩＩｂ（Ｎａｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、４６５１−４６５４、１９９７）、セルサイクル調節ポロ状キナーゼ、ＳｎｋおよびＦｎｋ（Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８、５５２８−５５３９、１９９９；Ｔｓｕｂｏｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、１９１９−１９２３、２００２）およびプレセニリン２（Ｓｔａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５、１２７７−１２９２、１９９９）。ＳｎｋおよびＦｎｋは、成熟カエル卵母細胞中のプロゲステロンによって活性化され（Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２７０、７８−８７、２００１）、かつセルサイクルのＧ１および分裂期の両方で役割を有し、かつＣＩＢは、これらのキナーゼの活性に影響を及ぼし得る。ＣＩＢは、核および細胞質の両方の中で発見され、かつその細胞内局在は、その相互作用パートナーとの会合に、およびカルシウムレベルに影響され得る（Ｋａｕｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１８、５５２８−５５３９、１９９９；Ｓｔａｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５、１２７７−１２９２、１９９９）が、核内でのその役割は、探求されないままである。ＤＮＡ ＰＫとの相互作用は、ＤＮＡ二本鎖破損感知および修復への応答に、ＣＩＢを関係させるであろう。放射線類似作用フレオマイシンによる処理後のＥＤＤのＧＳＴ−ＣＩＢプルダウンは、会合ＥＤＤ量の減少を引き起こし、他方でＥＤＤレベルは、不変のままであることを発見した。興味深いことに、最近の報告は、ＥＤＤおよびＤＮＡ修復に関与する他のたんぱく質、トポイソメラーゼＩＩ会合たんぱく質、ＴｏｐＢＰ１のユビキチン化を結び付けている（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７７、３５９９−３６０５、２００２）。ＣＩＢは、ＣＨＫ２の活性化において、ＰＬＫと相互作用する。これらのデータ、およびＣＩＢがプロテアソームの潜在的な標的であるという我々の発見に照らして、ＤＮＡ損傷への細胞応答におけるＥＤＤおよびＣＩＢの可能な関与決定するために、実験は、現在進行中である。
転写制御およびＤＮＡ損傷におけるＥＤＤの役割を同定するこれらのデータ（Ｈｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７７、３５９９−３６０５、２００２）は、ＥＤＤ-/-マウスにおける胚致死性、および種々のヒト癌におけるＥＤＤ座での頻繁な対立遺伝子アンバランスを立証する我々の他のデータと共に、ＥＤＤは、正常細胞生理学における中枢的役割を演じ、かつ調節されない時に、発達および潜在的に腫瘍形成に関して重大な結果を有するという強力な証拠を提供する。
実施例３
マウスにおけるＥｄｄの標的破壊は、細胞増殖の全身性不全、全身性アポトーシスおよび卵黄嚢の欠損血管新生による胚致死性を引き起こす
３．１ マウスＥｄｄ遺伝子の標的破壊
Ｅｄｄ欠損（ＥＤＤ-/-）マウスは、胚幹（ＥＳ）細胞における相同組み換えにより、製造した。Ｅｄｄ標的構築体は、（ＡＴＧ翻訳開始部位のすぐに下流の）６１ｂｐのエクソン１および次のイントロンからの３．３ｋｂを含む３．４ｋｂのＥｄｄゲノムＤＮＡを欠失させ、かつそれを６．５ｋｂ βＧａｌ−ＧＦＰ−Ｎｅｏr発現カセットと置き換えるように設計された（図１８Ａ）。この置き換えは、有効的に存在しないＥｄｄ対立遺伝子を産生し、かつ正常Ｅｄｄ遺伝子上流調節要素の制御下で、βＧａｌ−ＧＦＰ融合たんぱく質を発現するように設計された。標的化構築体は、１２９／ＳｖＪ ＥＳ細胞に電気穿孔され、かつ数個のネオマイシン耐性クローンが、単離され、かつサザンブロット分析によるＥｄｄ遺伝子の破壊のためにスクリーニングされた（図１８Ｂ）。ＢａｍＨＩによる野生型ゲノムＤＮＡの制限は、６ｋｂ断片を産生した。標的化ベクターによる相同組み換え、および５’ＢａｍＨＩ部位の置き換えに続き、より小さな４．２ｋｂハイブリダイズ断片を、制限後に製造した。従って、正しく標的にされたＥＳ細胞クローンは、ＢａｍＨ１による消化に続き６ｋｂおよび４．２ｋｂ断片を産生し、それぞれ野生型および突然変異した対立遺伝子を表した（図１８Ｂ）。２個の独立して標的にされたＥＳ細胞クローン（１Ｂ２および５Ｃ６）は、胚盤胞期Ｃ５７ＢＬ／６胚への注射によりキメラマウスを生み出すために使用された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの戻し交雑に続き、Ｆ１動物は、突然変異Ｅｄｄ対立遺伝子の生殖細胞系伝達を確認するために、サザンブロッティングにより再度分析された。ＰＣＲによる成体尾部および胚卵黄嚢ＤＮＡの定型の遺伝子特定は、（プライマー１（配列番号５０）および２（配列番号５１）を使用して）野生型ＤＮＡからの６００ｂｐの単位複製配列を生成した。しかしながら、プライマー１認識配列は、標的化ベクター挿入の後に欠失し、かつそれ故に突然変異対立遺伝子が、（プライマー２（配列番号５１）および３（配列番号５２）を使用して）４４０ｂｐの単位複製配列として検出される（図１８Ｂ）。
ノーザンブロット分析は、ヒトＥＤＤの発現パターンと類似した、広範囲の野生型（ＷＴ）成体マウス組織において、Ｅｄｄ ｍＲＮＡ発現を示した。低下したＥｄｄ ｍＲＮＡ発現が、異型接合性（Ｅｄｄ+/-）動物から分析された大部分の組織において観察された（図１８Ｄ）。しかしながら、ウェスタンブロット分析は、Ｅｄｄ+/-成体精巣およびＥ１０．５胚組織において僅かに減少したＥｄｄたんぱく質発現のみを示した（図１５Ｄ）。Ｅｄｄ発現は、ウェスタンブロッティングまたはＩＨＣによってＥｄｄ-/-Ｅ１０．５胚からの組織において検出されず（図１８Ｄおよび１８Ｅ）、標的化戦略の効率を確認している。Ｅｄｄは、造血細胞を除いて、発育中のＷＴ胚の大部分の細胞においてＩＨＣによって検出可能であった（図１８Ｅ）。ＧＦＰ発現もＬａｃＺ発現も、おそらく非常に低いβＧａｌ／ＧＦＰ発現または非機能的融合たんぱく質の産生のために、Ｅｄｄ+/-またはＥｄｄ-/-胚で検出可能でなかった。
３．２ 異型接合体（Ｅｄｄ +/- ）マウスの表現型
混合１２９ＳＶ／Ｊ×Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでの雄および雌の両方のＥｄｄ+/-マウスは、８０週まで加齢させ、明らかな腫瘍形成表現型は示さず、野生型対照に匹敵する受精率および成長率を有した。
３．３ 同型接合性を含まないＥｄｄ突然変異（Ｅｄｄ -/- ）は、胚致死性をもたらす
Ｅｄｄ+/-マウスは、異種交配され、かつ子孫の遺伝子型は、耳、尾部または胚卵黄嚢のＰＣＲ分析によって決定された（図１８Ｂ）。同型接合性突然変異（Ｅｄｄ-/-）動物は、分析した子孫２７４例から検出されず、完全なＥｄｄ欠損（Ｅｄｄを含まない突然変異の同型接合性）が、胚致死性を引き起こすことを示している（表６）。Ｅｄｄ欠損が胚致死性を引き起こす発育期を特徴付けるために、我々は、種々の妊娠期での異型接合性相互交配からの胚を分析した（表６）。メンデル比の野生型、Ｅｄｄ+/-およびＥｄｄ-/-胚が、Ｅ１０．５まで観察された。Ｅ１０．５を超えると可変Ｅｄｄ-/-胚は、観察されなかった。数個のＥｄｄ-/-胚は、Ｅ１１．５でリター中に存在したが、これらは部分的に吸収されており、かつ生育不能と評価された。Ｅ１１．５−１２．５で多数の空の脱落膜が、観察され、これらは妊娠の早い時期でのＥｄｄ-/-胚吸収から生じた可能性がある。これらのデータは、Ｅｄｄを含まない突然変異の同型接合性が、Ｅ１１．５前に胚致死性をもたらすことを立証しており、かつＥｄｄが、移植後の胚発育に必要不可欠であることを示している。
２個の独立して標的にされたＥＳ細胞株から生じた異型接合性マウスおよびＥｄｄ-/-胚は、同一の表現型を示した（データは図示せず）。
更に、Ｅｄｄ-/+マウスをＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子導入マウスと交配することによる、標的対立遺伝子からのネオマイシン耐性（Ｎｅｏr）遺伝子の切除の後でＥｄｄ-/-胚において違いは、観察されなかった。
３．３ Ｅｄｄ -/- 胚の形態
Ｅｄｄ-/-胚は、野生型およびＥｄｄ+/-同腹仔と比較して、早くもＥ７．５で僅かに成長抑制される（図１９）。Ｅ８．５までに、Ｅｄｄ-/-胚は、明らかに発育抑制され、ＷＴおよびＥｄｄ+/-同腹仔の発育より少なくとも０．５日遅延させる。Ｅ９．５およびＥ１０．５までにＥｄｄ-/-胚は、重度の成長欠陥を示し、最も明らかなものは、およそＥ９でＷＴ胚に生じる回転の不在である（図１９）。その上、頭部は小さく、かつあご領域（鰓弓）を形成する胚構造は、著しく低発育である。Ｅｄｄ-/-胚は、胚中の浸透圧アンバランスを示す膨張した心膜によって頻繁に観察される。多くのＥｄｄ-/-胚は、漿尿膜融合および胎盤形成が発生しないことを示す球状の尿膜も表示する（図１９）。組織学的検査をすると、血液細胞プールが、Ｅｄｄ-/-胚の幾つかの領域中で見ることができる。特に、血液細胞プールは心膜腔中に見られ、心膜浸出を示す（データは図示せず）。Ｅｄｄ-/-胚は、ＷＴよりも遥かに中性でない上皮を含むようにも見え、かつ上皮構造は、分裂している。要するに、Ｅｄｄ-/-胚組織中の欠損は、広範囲におよび、かつ特異な器官系または細胞型に限定されるように見えない。
３．４ Ｅｄｄ -/- 胚における増殖不全
Ｅｄｄ-/-胚の成長抑制の原因を評価するために、発育胚における細胞増殖が、Ｓ期中のＢｒｄＵのＤＮＡへの取り込みを測定することにより検査された。妊娠した雌は、犠牲にされる１時間前に、１０μｇ／ｇ ＢｒｄＵを注射され、胚が回収され、かつ４％パラホルムアルデヒド中に固定され、かつ抗ＢｒｄＵ（Ｄａｋｏ）抗体を使用するＩＨＣを、次にパラフィン切片で行った。陽性染色法は、増殖細胞中の新しく合成したＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みを示す。明らかな欠損がＥｄｄ-/-胚で観察された最も早い段階、Ｅ８．５で、ＷＴ（７６％±２．９）およびＥｄｄ-/-胚（７３％±３．８）間の分裂係数で、有意差はなかった（図２１）。Ｅ９．５までに、Ｅｄｄ-/-胚において、際立った増殖減少が観察された。幾つかの増殖細胞が検出された（９％±２．８）が、この数は、ＷＴ同腹仔において観察されたレベル（７３％±３．１）よりも劇的に低い（図２１）。興味深いことに、Ｅ９．５後のＥｄｄ-/-胚中のＢｒｄＵ取り込みは、造血細胞にほぼ独占的に制限される。注目に値すべきことに、これらは、野生型胚においてＥＤＤを発現しないことが発見された唯一の細胞であった（図２０）。増殖は、Ｅ１０．５でＷＴ胚で高いままである（６７％±２．９）が、他方でＥｄｄ-/-胚において、増殖はほとんど検出されない（３％±１．８）。それ故に、完全なＥｄｄ欠損は、Ｅ８．５後の発育マウス胚の大部分の細胞において広範囲な増殖不全をもたらし（図２１）、ＷＴ胚でのＥｄｄの広範囲な発現を反映している。
３．５ Ｅｄｄ -/- 胚における増大したアポトーシス
Ｅ１０．５ Ｅｄｄ-/-胚からの組織学的切片における多数の凝縮核の観察により、増殖ブロックと共に、アポトーシスも、Ｅｄｄ欠損胚で観察される胚致死性に寄与することが示唆された。Ｅ８．５−Ｅ１０．５の間の胚からの組織学的切片におけるアポトーシスを検査するために、ＴＵＮＥＬ染色が使用され、かつ有意差は、Ｅ８．５で多数のＴＵＮＥＬ陽性核において観察されなかった（図２２Ａ）。しかしながら、多数の凝縮核が、Ｅ９．５およびＥ１０．５でＥｄｄ-/-組織において観察され（データは図示せず）、かつ著しく高レベルのＴＵＮＥＬ陽性細胞が、Ｅ９．５およびＥ１０．５でＷＴ同腹仔と比較してＥｄｄ-/-胚で見えた（図２２Ａ）。
Ｅｄｄ-/-胚におけるアポトーシスの明らかな活性化を更に特徴付けるために、カスパーゼ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）の開裂（すなわち活性）形状を検出する抗体を使用するＩＨＣ染色も、行われた。ＢｒｄＵおよびＴＵＮＥＬ染色では、活性カスパーゼ３に関する染色の有意差が、Ｅ８．５でＷＴおよびＥｄｄ-/-胚間で観察されなかった（それぞれ１３％および１６％）。しかしながら、活性カスパーゼ３に関する著しく高い染色が、ＷＴ同腹仔と比較してＥｄｄ-/-胚において、Ｅ９．５（４４％対６％）およびＥ１０．５（４６％対６％）の両方で観察され（図２２Ｂ）、これらの胚における凝縮核およびＴＵＮＥＬ染色両方の増加した存在と一致する。それ故に、カスパーゼ３媒介アポトーシスの活性化は、Ｅｄｄ-/-胚において観察される増殖中のブロックと一致し、Ｅ９．５−Ｅ１０．５で観察された抑制した発育が、減少した細胞増殖および増加した細胞死の組み合わせの結果起きることを示している。
３．６ Ｅｄｄ -/- 胚における欠損卵黄嚢血管新生
Ｅｄｄ-/-胚において観察された広範囲の欠損は、卵黄嚢血管新生または胎盤形成の潜在的不全を示し、破壊された栄養交換に至らせる。従って我々は、Ｅｄｄ-/-およびＷＴ卵黄嚢の形態を検査した。Ｅ９．５以降、Ｅｄｄ-/-卵黄嚢は、明らかにそのＥｄｄ+/-またはＷＴ同腹仔よりも良好に血管が新生しておらず、卵黄嚢血管新生の欠損を示唆している。Ｅ１０．５で、多数の大きな血管がＷＴおよび異型接合性卵黄嚢において見えるが、他方でこの段階で、非常に僅かな、小さな血管がＥｄｄ-/-卵黄嚢で見える（図２３）。
Ｅ９．５でのＷＴおよびＥｄｄ-/-卵黄嚢からの高倍率の組織学的切片（図２４）は、血管細胞（ｂ）を含む明白な血管チャネルを示し、ＷＴ卵黄嚢において見られ、他方でＥＤＤを含まない卵黄嚢は、中胚葉（ｍ）および内胚葉（ｅ）の異常な分離を有する拡大チャネルおよび僅かな血液細胞を表示する。これらのデータは、血管内皮への内臓中胚葉の分化がＥＤＤ欠損によって破壊され得ることを示している。
３．７ Ｅｄｄ -/- 表現型は、ｐ５３非依存性である
ＤＮＡ損傷応答におけるＥｄｄの強力な役割、Ｅｄｄ-/-胚における減少した細胞増殖および増加したアポトーシスにかんがみて、Ｅｄｄおよびｐ５３に遺伝的関係が存在するか、解明することを試みた。Ｅｄｄ+/-マウスが、ｐ５３での切断突然変異のために異型接合性マウスと交配され（Ｊａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ４：１−７、１９９４）、かつＥｄｄ／ｐ５３二重異型接合性動物がその後産生された。これら二重異型接合体相互交配の胚が、検査され、かつｐ５３-/-バックグラウンドでのＥｄｄ-/-胚生存において差は、観察されなかった（表７）。Ｅ１０．５でのＥｄｄ-/-／ｐ５３-/-胚は、Ｅｄｄ-/-／ｐ５３+/+胚と類似した形態を示し、かつＥ１１．５で観察されたすべてのＥｄｄ-/-／ｐ５３-/-胚は、部分的に吸収され、減少した細胞増殖およびＥｄｄ-/-胚でのアポトーシスの活性化がｐ５３非依存性あることを立証している。
実施例４
乳腺発育および腫瘍形成におけるＥＤＤの役割
４．１ マウスＥＤＤ遺伝子の条件付きノックアウトの産生
条件つきＥｄｄ欠損（Ｅｄｄ-/-）マウスを、胚幹（ＥＳ）細胞での相同組み換えによって製造した。Ｅｄｄ標的化構築体は、Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位（ｌｏｘＰ）を有するＥＤＤ遺伝子の（ＥＤＤのＡＴＧ翻訳開始部位を含む）エクソン１の側面に位置するように設計された。対照組織でのＣｒｅリコンビナーゼ発現は、エクソン１の切除を引き起こし、それによりこれらの組織においてＥＤＤのサイレンシングを行った。
標的化構築体は、１２９／ＳｖＪ ＥＳ細胞に電気穿孔された。これら細胞の部分が、次にＣｒｅリコンビナーゼを発現する発現ベクターによって電気穿孔され、かつサザンブロット分析によりＥｄｄ遺伝子の破壊を示すクローンが決定された。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現しなかった選択細胞の部分（すなわち非損傷ＥＤＤ遺伝子を有するこれらの細胞）は、胚盤胞段階Ｃ５７ＢＬ／６胚への注射によってキメラマウスを製造するために使用される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスとの戻し交配に続き、Ｆ１動物は、突然変異Ｅｄｄ対立遺伝子の生殖細胞系伝達を確認するために、サザンブロッティングおよび／またはＰＣＲ（ｌｏｘＰ部位の存在を検出するため）により分析された。
次に乳房組織のみでＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスを製造する。発現は、乳房組織のみでの発現を推進する、ＭＭＴＶ ＬＴＲ（配列番号４８）の制御下でＣｒｅリコンビナーゼをコードする核酸（配列番号４９）により構成する（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５（２１）：４３２３−４３３０、１９９７およびＡｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６２（２４）：７１６６−７１６９、２００２）。この遺伝子構築体は、次に受精卵母細胞の前核に微量注入され、かつ卵母細胞は偽妊娠雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの子宮に導入された。全ての誕生したマウスは、Ｃｒｅをコードする核酸を検出するために、サザンハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲによる導入遺伝子の存在に関してスクリーニングされる。導入遺伝子を担持することが発見されたこれらのマウスは、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配され、かつ後続世代は、抗Ｃｒｅ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用して、乳房組織におけるＣｒｅリコンビナーゼ発現に関してスクリーニングされる。Ｃｒｅ発現が、乳房組織に限定されていることを確実にするために、陽性マウスの複数の組織がその後スクリーニングされる。
Ｃｒｅを発現するトランスジェニックマウスおよびｆｌｏｘｅｄ ＥＤＤを担持するマウスは、次に乳房組織で切除されたＥＤＤのエクソン１を有したマウスを製造するために交配される。（乳房組織を含む）幾つかの組織でのＥＤＤ発現は、実施例３に記載されたように、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学の両方によって決定される。乳房組織でＥＤＤを発現しないマウスは、ＥＤＤが発現することが知られている他の全ての組織でＥＤＤ発現を保持する。これらのマウスは、次に乳房細胞発育および腫瘍形成におけるＥＤＤの役割を確立するために、分析される。
４．２ 乳腺発育におけるＥＤＤの役割
乳房組織でＥＤＤを欠損する雌マウスが、乳腺構造および機能を決定するために分析された。妊娠した雌マウス（ｗｔおよびＥＤＤ-/-）が、妊娠中の５日ごとに犠牲にされた（０日は、交尾後栓が、最初に検出された日と考えられる）。乳房組織は、次にこれらの動物から切開され、かつ終末頂芽密度、節間管の長さ、分枝パターン、および肺胞芽形成を決定し、かつ（特にＨｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７（３）：４６０−４７３、２００３およびその参考文献に記載されたように）これらのパラメータに対するＥＤＤの効果を決定するために、全載顕微鏡法を使用して分析される。その上、ＥＤＤの効果は、週に１度の間隔で、授乳期に３週間かつ５日間隔で、離乳後６週間分析される。
全ての時点で、乳腺は切断され、かつ腺の細胞構造の検査を容易にするために、ヘモトキシリンおよびエオシンで染色される。その上、腺は、ＥＤＤおよび例えばＢＲＣＡ２、ＣＨＫ２、ＴｏｐＢ１およびＣＩＢのようなＥＤＤ相互作用たんぱく質に関して分析される。
最近の研究は、ＥＤＤのショウジョウバエ相同体（ｈｙｄ）が、ハリネズミおよびｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃの発現を調節することが可能であることを示唆し、ＥＤＤ-/-マウスから単離された乳房組織が、ハリネズミシグナル伝達経路成分、例えばｉｈｈ、ｓｈｈ、ｄｈｈ、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびパッチたんぱく質に関して分析される。
（本質的にＮａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｏｒｍａｎｄｙ、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ、２２５（１）：１００−１０５、２００２およびその参考文献に記載されたような）乳房組織の間質および上皮コンパートメントにおけるＥＤＤの効果を決定するために、ＥＤＤ-/-マウスの上皮組織が、ＷＴマウスの脂肪パッドに移植され、かつｗｔマウスからの上皮組織は、ＥＤＤ-/-マウスの脂肪パッドに移植される。
４．３ 乳癌形成におけるＥＤＤの役割
乳腺にＥＤＤ標的破壊を担持するマウスにおける発癌性を評価するために、マウスは、２年間加齢させる。種々の段階で、マウスは、犠牲にされ、かつ自然発生乳癌の発育に関して分析される。これらの段階におけるＥＤＤ-/-マウスおよびｗｔマウスにおける腫瘍発育率は、次に、加齢マウスにおける乳癌発育に関するＥＤＤの効果を決定するために比較される。
その上、ＥＤＤ-/-マウスは、ＭＭＴＶ／ｃ−ｍｙｃトランスジェニックマウス（Ｒｏｍｉｅｕ−Ｍｏｕｒａｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２３（１６）：５７３８−５７５４、２００３）またはＭＭＴＶ／ｗｎｔ−１トランスジェニックマウス（Ｂｏｃｃｈｉｎｆｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９（８）：１８６９−１８７６、１９９９）と交配される（両方共、高発生率の乳癌形成を示す）。ＷＴ、トランスジェニックおよびトランスジェニック／ノックアウトマウスは、次に腫瘍形成の潜在性および頻度に関するＥＤＤの効果を決定するために分析される。乳腺は、妊娠および授乳期の種々の段階、および種々の年齢でマウスから単離され、かつ肥厚肺胞結節、肥厚および腫瘍の数を決定するために全載分析を使用して分析される。
４．４ 乳房組織におけるＥＤＤの過剰発現
乳房組織発育および乳癌形成に関するＥＤＤの効果を決定するために、この組織においてＥＤＤを過剰発現するマウスを製造する。発現は、乳房組織のみでの発現を推進する、ＭＭＴＶ ＬＴＲ（配列番号４８）の制御下でＥＤＤをコードする核酸（配列番号１）を有する発現構築体を産生した。この遺伝子構築体は、次に受精卵母細胞の前核に微量注入され、かつ卵母細胞は偽妊娠雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの子宮に導入された。全ての誕生したマウスは、乳房組織特異的ＥＤＤをコードするトランスジェニック構築体を検出するために、サザンハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲによる導入遺伝子の存在に関してスクリーニングされる。導入遺伝子を担持することが発見されたこれらのマウスは、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配され、かつ後続世代は、実施例３に記載したようにウェスタンブロッティングを使用して、乳房組織におけるＥＤＤ過剰発現に関してスクリーニングされる。ＥＤＤ過剰発現が、乳房組織に限定されていることを確実にするために、陽性マウスの複数の組織がその後スクリーニングされる。
４．５ 乳房発育におけるＥＤＤの役割
乳房組織でＥＤＤを過剰発現する雌マウスが、乳腺構造および機能を決定するために分析された。乳房組織は、妊娠した雌マウス（ｗｔおよびＥＤＤ+/-）から、妊娠中に５日ごとに、加えて授乳期に３週間、週に１度の間隔で、かつ離乳後６週間、５日間隔で単離された。（本質的に実施例４．２に記載されたように）切開された乳房組織は、次に終末頂芽密度、節間管の長さ、分枝パターン、および肺胞芽形成を決定し、かつこれらのパラメータに対するＥＤＤの効果を決定するために、全載顕微鏡法を使用して分析される。
全ての時点で、乳腺は切断され、かつ腺の細胞構造の検査を容易にするために、ヘモトキシリンおよびエオシンで染色される。その上、腺は、ＥＤＤ、およびハリネズミシグナル伝達経路成分、例えばｉｈｈ、ｓｈｈ、ｄｈｈ、Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、Ｇｌｉ３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４およびパッチたんぱく質に加えて例えばＢＲＣＡ２、ＣＨＫ２、ＴｏｐＢ１およびＣＩＢのようなＥＤＤ相互作用たんぱく質に関して分析される。
４．３ 乳癌形成におけるＥＤＤの役割
乳腺にＥＤＤを過剰発現するマウスにおける発癌性を評価するために、マウスは、２年間加齢させる。種々の段階で、マウスは、犠牲にされ、かつ自然発生乳癌の発育に関して分析される。これらの段階におけるｔｇＥｄｄ+/-マウスおよびｗｔマウスにおける腫瘍発育率は、次に、加齢マウスにおける乳癌発育に関するＥＤＤの効果を決定するために比較される。
実施例６
ｓｉＲＮＡを使用するＥＤＤ発現の標的下方制御は、細胞増殖を阻害し、かつ細胞−細胞接触を破壊する
５．１ 方法
ＥＤＤ発現を阻害するために、ｓｉＲＮＡが設計され（配列：センス５’−ＧＣＡＧＵＧＵＵＣＣＵＧＣＣＵＵＣＵＵｄＴｄＴ−３’（配列番号４７）、アンチセンス５’−ｄＴｄＴＣＧＵＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡ−３’（配列番号４８））、ｓｉＲＮＡは、合成され、アニーリングされ、かつ、Ｘｅｒａｇｏｎ（Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によってＨＰＬＣで精製された。２．２×１０6ＭＣＦ−７細胞または２．６×１０6ＨＥＫ−２９３細胞を、１５ｃｍ2の皿で平板培養し、かつ一晩成長させた。正常胸部上皮細胞株ＨＭＥＣ１８４およびＭＣＦ−１０−Ａを、１％下垂体抽出物を添加剤として有するＭＣＤＢ１７０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。
ＭＣＦ−７またはＨＥＫ−２９３のトランスフェクションのために、細胞は、無血清培地により洗浄され、かつ１５ｍｌの無血清培地が、細胞上におかれた。２９μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、２２０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で希釈され（５分間インキュベーションされ）、かつ２０．５μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ）は、２．５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ中で希釈された。ｓｉＲＮＡ溶液およびＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ溶液は、静かに混合され、２４分間インキュベーションされた。組み合わされた溶液は、無血清培地中の１５ｃｍ2の細胞プレートに添加された。４時間後、３０％ウシ胎児血清を含む１５ｍｌの培地は、細胞に添加された。更に２４時間後、細胞は、各時点での処理のために１０ｃｍ2のプレートに分配された。
トランスフェクションのために、ＨＭＥＣ１８４およびＭＣＦ−７細胞は、１．２×１０6細胞／１５ｃｍプレートで平板培養した。トランスフェクション条件は、ＨＭＥＣ１８４およびＭＣＦ１０−Ａ細胞が、下垂体抽出物を含まない培地中でトランスフェクトされ、かつ４時間後２％下垂体抽出物含有培地が添加されることを除き、上記と同じであった。トランスフェクションの８時間後、この培地は、１％下垂体抽出物含有培地に代えられる。
緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡは、負の対照として使用された。
５．２ 結果
全ての細胞株におけるＥＤＤ ＲＮＡｉのトランスフェクションは、抗ＥＤＤ抗体でのウェスタンブロッティングにより評価されたように、実質的なＥＤＤたんぱく質の損失をもたらした（図２５）。ＥＤＤ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、細胞形態の変化が、ＨＭＥＣ１８４細胞およびＭＣＦ−１０Ａ細胞において見られた。この変化は、ＲＮＡ干渉が行われた２日後に最初に観察された。対照細胞と比較して、ＥＤＤ ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞は、減少し、かつ変更した細胞−細胞接触を示し、細胞形状は、変更され、かつ細胞は、分裂した（図２６）。対照細胞は、引き延ばされる傾向にあり、細胞長に沿って隣接細胞と細胞−細胞接触を作り、シートを形成する。ＥＤＤ ｓｉＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞は、隣接細胞とより少ない接触を作り、他方でその、より丸い形状は、細胞長に沿って接触を作ることを妨げている。
細胞形態は、細胞−細胞接触（βカテニン）および細胞骨格の組織（アクチン）に関与するたんぱく質を検出するために、免疫蛍光抗体を使用して更に分析された。ＨＭＥＣ１８４細胞を染色するβカテニンは、ＥＤＤの欠乏後、細胞−細胞接触で差を示した。対照細胞の染色は、細胞−細胞接触に沿ってであり（図２７）、他方でＥＤＤ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞中のこの領域は、減少したβカテニン発現およびよりまだら状の染色を示した（図２７）。（対照における３６％と比較して）ＥＤＤが欠乏する１８４細胞間の細胞−細胞接触の６７％は、まだら状の発現を有した。更なる検査は、ＥＤＤ ＲＮＡｉは、細胞周辺から細胞核へのβカテニンの再局在を引き起こすことを示した（図２８）。
ＨＭＥＣ１８４制御細胞におけるアクチンフィラメントは隣接する細胞のアクチンと統合されるが（図２９）、この周辺細胞間の組織化はＥＤＤ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞では見られない。
βカテニンおよびアクチンの同様の変化が、ＥＤＤが欠乏するＭＣＦ−１０Ａ細胞で見られた。
実施例６
ＥＤＤサイレンシングの下流効果の同定
細胞中のＥＤＤ活性により影響される生化学的経路を確認するために、転写物プロファイリング実験が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＤＮＡミクロアレイを使用して行われた。ＨＭＥＣ１８４およびＭＣＦ−７細胞は、実施例５．１に記載したように、ｓｉＲＮＡ（ＥＤＤまたはＧＦＰ）によってトランスフェクトされた。ＥＤＤ損失は、ウェスタンまたはノーザンブロットによって確認された。
細胞は、２４時間および４８時間後に採取され、かつＲＮＡは、精製された。ＲＮＡは次にＴ７プロモータ配列を追加として含む、オリゴ（ｄＴ）固定オリゴヌクレオチドを使用して逆転写された。単離ｃＤＮＡは、次に製造業者の指示に従い、Ｔ７ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用してインビトロで転写された。転写は、転写核酸の検出を容易にするためにビオチン化ヌクレオチド（Ｂｉｏ−１１−ＣＴＰおよびＢｉｏ−１６−ＵＴＰ）により行われた。
実験は、３組で行われ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ用にプールした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａチップが、全ての実験において使用された。
データ分析は、ＲＮＡｉによるＥＤＤ欠乏に応答してｍＲＮＡ発現を減少または増加させた遺伝子を同定した。
表８に示すように、セルサイクル制御（例、サイクリンＤ３）、癌遺伝子（例、Ｒ−ｒａｓ）に関連する種々の遺伝子、および細胞−細胞接触および細胞形態（例、コラーゲンＩＶα１）に関連する遺伝子の発現は、ＥＤＤのサイレンシングによって修飾される。これらの遺伝子発現の変化は、ＥＤＤサイレンシング（すなわち、変更された細胞増殖、変更された細胞−細胞接触、および変更されたβカテニンおよびアクチン局在）の結果としてＨＭＥＣ１８４およびＭＣＦ−７細胞で観察される形態変化を潜在的に説明する。
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Ａ．数種の癌における対立遺伝子アンバランスで、ＡｌがＥＤＤ座（８ｑ２２．３）にあるが８ｑ２４にまでは伸長していないことを示している。符号：●は対立遺伝子アンバランス灰色の丸印は恐らく対立遺伝子アンバランス○はヘテロ接合体□は情報を与えないホモ接合体を示す。空白は、データが得られていないことを示す。多形ミクロサテライトの位置は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＧＤＢ）から同定した（ｈｔｔｐ：／／ｇｄｂｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ．／）。ミクロサテライトＣＥＤＤおよび５８６Ｆ１８ｂは、ＥＤＤイントロン中でコードされる。ＥＤＤ遺伝子は、８ｑ２２．３に局在し（Ｃａｌｌａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４、３４７９−３４９１、１９９８）およびＭＹＣは８ｑ２４．１２に局在する（ＧＤＢ）。 Ｂ．正常肝細胞組織および肝細胞癌患者８例から得た対立遺伝子アンバランスのミクロサテライト分析（図１Ａ）。対立遺伝子アンバランスは、ミクロサテライトＤ８Ｓ３２６、ＣＥＤＤ、Ｄ８Ｓ５４５およびＤ８Ｓ８５で観察された。矢印は、示した対立遺伝子に比例した有意な増加（＞３０％）を示している。 染色体８ｑ２２．３−２３．３上における卵巣癌の対立遺伝子アンバランス。癌は、組織病理学に従って分類。重なった部分は、組織学的に混在していることを示している。“その他”は、アデノーマ４例および性細胞癌（症例１２４番）を含む。符号：●対立遺伝子アンバランス○ヘテロ接合体□情報を与えないホモ接合体空白は、データが得られていないことを示す。 乳癌、正常胸部組織および胸部上皮細胞株におけるＥＤＤのｍＲＮＡ発現。乳癌４１例および正常胸部組織１４例中におけるＥＤＤの相対的ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。横線は、正常組織発現の上限を示している。挿入：定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた乳癌１４例およびマッチする正常胸部組織中におけるＥＤＤのｍＲＮＡ発現の比較 定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた胸部上皮細胞株におけるＥＤＤ ｍＲＮＡ（黒の棒グラフ）およびｐ５３ Ｒ２ ｍＲＮＡ（白の棒グラフ）の発現。遺伝子コピー数（棒グラフ上にで示した）は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＥＤＤゲノムコピー数は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３でＦＩＳＨ（括弧内に示した）によって決定した。正常胸部上皮細胞株は１８４例で、他は、乳癌細胞株であった（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．ＩＩ、７９−１０６、１９９９）。 乳癌および卵巣癌におけるＥＤＤたんぱく質発現。 組織をポリクローナルＥＤＤ抗体によって染色し、ヘマトキシリンによって逆染色した。 （Ａ）陰性対照、ＥＤＤを含まないマウス胚からの神経組織（神経上皮［ＮＥ］、神経間葉組織［ＮＭ］） （Ｂ）陽性対照、野生型マウス胚からの神経組織 （Ｃ）正常ヒト乳管 （Ｄ）高ＥＤＤ発現のヒト乳癌 （Ｅ）低ＥＤＤ発現のヒト漿液性卵巣癌 （Ｆ）高ＥＤＤ発現のヒト漿液性卵巣癌 ＥＤＤ配列の構造的特徴。 哺乳類発現、酵母ツーハイブリッド分析またはインビトロ翻訳に使用したＥＤＤおよびその誘導体を図示した。ＵＢＡドメイン、３個の推定核局在化配列（ＮＬＳ）、ＨＥＣＴドメインおよびＮ認識亜鉛フィンガー（ｚｆ−ＵＢＲ１）またはｐｏｌｙＡ結合たんぱく質のカルボキシ末端（ＰＡＢＰ−Ｃ）に相同のドメインを示した。潜在的なステロイドレセプター結合モチーフ（ＬＸＸＬＬ）の位置を星印で示した。数値は、断片切断点のアミノ酸位置を示している。ＨＥＣＴドメイン内部に保存されたシステイン（Ｃｙｓ２７６８）は、ＥＤＤＭ、ＥＤＤ３ＭおよびＥＤＤ５Ｍ断片中でアラニン（Ｘ）に変異している。 ＥＤＤたんぱく質中潜在的な亜鉛フィンガー。システイン高含量のドメインは、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｃａｌｏｓｓｉｎ（ｄＣＡＬＯ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＢＩＧたんぱく質類に類似性を示し、Ｎ−レコグニン中で最初に同定確認された亜鉛フィンガー領域として保存されたシステインおよびヒスチジン残基類（四角で囲んだ）の類似配列を有している。示したＮ−レコグニン配列は、酵母由来（ｓｃＵＢＲ１）およびマウス由来（ｍＵＢＲ１）由来である。同等の残基類は黒で示し、保存置換は、より明るい灰色で示した。 ＥＤＤは、２個のＮＬＳを介してインポーチンα５と相互作用する。 酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるＥＤＤとインポーチンα５との相互作用。ＥＤＤの完全コード配列は、酵母ＧＡＬ４ ＤＢＤとフレーム内で融合させた。この構築体またはコントロールベクターｐＡＳ２．１は、コントロールベクター（ｐＡＣＴ２）または二倍体酵母株ＣＧ１９４５／Ｙ１８７中アミノ酸１−５３８（Ｉｍｐα）または２２９−５３８（Ｉｍｐα−Ｃ）をコードするＧＡＬ４ ＡＤ−インポーチンα構築体のいずれかと同時発現させた。たんぱく質抽出物は、６個の独立したコロニーの培養物から調製し、β−ガラクトシダーゼ活性（ｐＡＳ２．１ベクターコントロールに対する増加倍率として示した）を二重アッセイした。 インポーチンαのＥＤＤとのインビトロ相互作用と相互作用のマッピング。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ（Ｂ）またはＥＤＤ断片類（Ｃ）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させた精製したＧＳＴ−インポーチンα５融合たんぱく質またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションし、洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。 インポーチンαのＥＤＤとのインビトロ相互作用と相互作用のマッピング。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ（Ｂ）またはＥＤＤ断片類（Ｃ）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させた精製したＧＳＴ−インポーチンα５融合たんぱく質またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションし、洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。 ＨＥＫ２９３およびＴ−４７Ｄ細胞中インポーチンαとのＥＤＤ相互作用。ＨＥＫ２９３細胞に、完全長ＥＤＤたんぱく質（２９３／ＥＤＤ）をコードするプラスミドを安定に移入した。これらの細胞またはＴ−４７Ｄ細胞の抽出物を、抗インポーチンα５抗体との免疫沈降に供するか（中央パネル）またはグルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴまたはＧＳＴ−インポーチンα５融合たんぱく質とインキュベーション（右パネル）した。両方の操作により得られた結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングを行った。 インポーチンαとＥＤＤのそれぞれのＮＬＳ類との相互作用マッピング。Ｎ末端領域由来のインビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ−インポーチンα５またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションした。結合ＥＤＤは、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで検出した。 インポーチンβとＥＤＤのインビトロ相互作用。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤおよび誘導体類を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ−インポーチンβ融合たんぱく質またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションした。結合ＥＤＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで検出した。投入量（ＩＮＰＵＴ）に対しての結合ＥＤＤ量は、下の百分率で示した。 ＥＤＤは核たんぱく質である。哺乳類細胞株（倍率４０倍）中におけるＥＤＤ−ＧＦＰの細胞下局在。ＥＤＤ ｃＤＮＡは、緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）のアミノ末端に融合させ、ＨＥＫ２９３（左パネル）またはＭＣＦ−７細胞（右パネル）に一時的に移入した。移入細胞は、明場像に矢印先端で示した。拡散細胞染色はＧＦＰ単独で観察されたが、より強い核ＧＦＰ蛍光が両細胞株中でＥＤＤ−ＧＦＰについて観察された。 ＥＤＤ抗体による細胞の免疫染色（倍率４０倍）。ＨＥＫ２９３細胞中内因性ＥＤＤで観察された核染色（左パネル）は、ＥＤＤたんぱく質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞中における（ＷＴ３０、右パネル）よりも強力である。 ＥＤＤはＰＲ−Ｂと相互作用する。ＥＤＤとＰＲのＴ−４７Ｄ細胞中における相互作用。Ｔ−４７Ｄ細胞由来抽出物は、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＲ（ＡＢ）またはＧＳＴ−ＰＲ（ＣＤＥ）融合たんぱく質類のいずれかとインキュベーションした。結合たんぱく質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングした。 ＰＲとＥＤＤとの相互作用のマッピング。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類またはＳＲＣ−１を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ―ＰＲ（ＡＢ）およびＧＳＴ（ＣＤＥ）融合たんぱく質またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションした。ＰＲ−結合ＥＤＤ断片類を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。投入量（ｉｎｐｕｔ）に対する結合ＥＤＤまたはＳＲＣ−１量を、下の百分率で示した。 ＰＲ（ＣＤＥ）とＥＤＤのＮ末端領域との相互作用の詳細なマッピング。前記Ｎ末端領域由来インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴＰＲ（ＣＤＥ）融合たんぱく質またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションした。ＰＲ（ＣＤＥ）結合ＥＤＤ断片類を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。 ＥＤＤによる核レセプタートランス作用活性の増強。 適当な場合にはルシフェラーゼ活性を細胞数と移入効率で補正（方法を参照）し、リガンド化レセプター単独についての値を１００％としてこれに対してグラフとして示した。ＥＤＤは、ＰＲ Ｂトランス作用因子活性を増強する。レポーターアッセイは、ＨＥＫ２９３（左）またはＣＯＳ７（右）細胞のいずれかを用いて、ＥＤＤ、ＳＲＣ１またはエンプティベクターであるトランスフェクションコントロールベクタープラスミド（ｐＧＦＰ２０）、および１ｎＭの合成プロゲスチンＯＲＧ２０５８または同等のエタノール担体（ＥｔＯＨ）のいずれかの存在下において実施した。 ＥＤＤの触媒システインの変異は、ＰＲトランス作用に及ぼすＥＤＤの効果を変化させない。レポーターアッセイは、ＥＤＤ、ＥＤＤＭまたはエンプティベクターと１０ｎＭのＯＲＧ２０５８存在下で、ＨＥＫ２９３を用いて実施した。 ＥＤＤは、ＰＲレポーター遺伝子発現を用量依存性に増強する。ＨＥＫ２９３細胞を、ＥＤＤまたはエンプティベクター（０）のいずれかのための構成発現ベクター量を増加させながら、１ｎＭのＯＲＧ２０５８存在下で標準的レポーターアッセイのために移入した。移入ＤＮＡの量は、エンプティベクターにより１．２μｇに標準化した。細胞数は、増殖アッセイとｐＲＬＴＫとの同時移入とその後のレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼアッセイによる移入効率を用いて、モニターした。 合成プロゲスチンＯＲＧ２０５８への応答に及ぼすＥＤＤの効果。ＨＥＫ２９３細胞は、移入コントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともに移入させ、レポーターアッセイした。ＯＲＧ２０５８濃度を高めながら２４時間処理後に細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイを行った。 ＥＤＤによるＶＤＲレポーター遺伝子発現の増強。ＨＥＫ２９３細胞は、ＥＤＤまたはエンプティベクター用構成発現ベクターおよびトランスフェクションコントロールプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともに、ＶＤＲ用構成発現ベクターとＶＤＲＥ含有ルシフェラーゼレポーターベクターを移入させた。１０ｎＭの１、２５−ジハイドロキシビタミンＤ3による２４時間処理後に細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイを行った。 ＥＤＤは、ＥＲレポーター遺伝子発現を増強しない。ＨＥＫ２９３細胞は、ＥＤＤ、ＳＲＣ１またはエンプティベクター用構成発現ベクターのいずれか、およびトランスフェクションコントロールプラスミド（ｐＧＦＰ２０）とともに、ＥＲ用構成発現ベクターとＥＲＥ含有ルシフェラーゼレポーターベクターを移入させた。１００ｎＭの１７β−エストラジオールによる２４時間処理後に細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイを行った。 ＥＤＤとＣＩＢの相互作用およびＤＮＡ損傷効果。ＥＤＤのカルシウム−インテグリン結合たんぱく質（ＣＩＢ）の酵母ツーハイブリッドアッセイにおける相互作用。ＥＤＤの完全コード配列を、インフレームで酵母ＧＡＬ４ ＤＢＤと融合させた。この構築体またはコントロールベクターｐＡＳ２．１を、コントロールベクター（ｐＡＣＴ２）またはＧＡＬ４ ＡＤ−ＣＩＢと二倍体酵母染色株ＣＧ１９４５／Ｙ１８７中で同時発現させた。 ＣＩＢとＥＤＤのインビトロ相互作用。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤを、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ−ＣＩＢ融合たんぱく質またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合ＥＤＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。 ＣＩＢとＥＤＤの相互作用マッピング。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ−ＣＩＢ融合またはＧＳＴ単独のいずれかとインキュベーションした。結合ＥＤＤ断片類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで分析した。 ＥＤＤとＣＩＢのＨＥＫ２９３細胞およびＭＣＦ−７細胞中での相互作用。左：変異体ＥＤＤを過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｌａｇタグを付したＣＩＢまたはエンプティベクター（ｖｅｃ）をコードするプラスミドを移入させた。これらの細胞からの抽出物を、抗ＦＬＡＧ Ａｂ Ｍ２を用いて免疫沈降させた。右：ＤＮＡ傷害剤フレオマイシン（Ｐｈｌｅｏ）またはハイドロキシウレア（ＨＵ）による処理後ＭＣＦ−７細胞から調製した核抽出物を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴまたはＧＳＴ−ＣＩＢ融合たんぱく質のいずれかとインキュベーションした。両方の操作による結合たんぱく質類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティング解析し、結合量を、投入量に対する百分率で示した。 ＣＩＢのプロテアゾームによる潜在的な制御。ＨＥＫ２９３細胞は、プロテアゾーム阻害剤ＭＧ１３２（２０μＭ）または担体（ＤＭＳＯ）により６時間処理し、全細胞抽出物をＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。たんぱく質類をニトロセルロースに移し、インポーチンα５、ＣＩＢおよびプロテアゾーム性標的たんぱく質ｐ２７についてウェスタンブロッティング解析した。 ＥＤＤおよびｃｈｋ２および結合アッセイに使用したそれらの誘導体類の概略図。ＥＤＤについて、ＵＢＡ（ユビキチン会合）ドメイン、３個の推定核局所配列類（ＮＬＳ）、ＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシ末端に相同）ドメインおよびＮレコグニン亜鉛フィンガー（ｚｆ−ＵＢＲ１）またはｐｏｌｙＡ結合たんぱく質のカルボキシ領域（ＰＡＢＰ−Ｃ）に相同のドメインを示した。潜在的なステロイドレセプター結合モチーフ類（ＬＸＸＬＬ）の位置を星印で示した。数値は、断片切断点におけるアミノ酸位置を示す。ＨＥＣＴドメイン内部の保存システイン（Ｃｙｓ２７６８）は、断片ＥＤＤＭおよびＥＤＤ３Ｍ中でアラニン（Ｘ）に変異している。ｃｈｋ２について、ＡＴＭ族キナーゼ部位を豊富に含むＳＱ／ＴＱドメイン、フォーク状ヘッド結合（ＦＨＡ）ドメインおよびキナーゼドメインを、ｃｈｋ２機能に重要な残基類とともに示した。ドメイン境界もまた、図下の数値として示した。また、プルダウンアッセイで用いた断片ｃｈｋ２（ＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ）を示した。 ＥＤＤは、核抽出物中でｃｈｋ２−Ｎと相互作用する。ＭＣＦ−７細胞由来核抽出物は、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴまたはＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ融合たんぱく質のいずれかとインキュベーションした。よく洗浄した後、結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングした。 ＥＤＤとｃｈｋ２はインビボで会合する。ＨＥＫ２９３細胞またはＭＣＦ−７細胞由来細胞溶解物を、ポリクローナルｃｈｋ２抗体（Ｎ１７）と免疫沈降させた。免疫複合体沈殿後よく洗浄し、結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングした。 ＥＤＤは、ｃｈｋ２ ＦＨＡドメインと相互作用する。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体ＥＤＤＦ５（アミノ酸８８９−２７９９）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ ｃｈｋ２−ＮまたはＲ１１７ＡまたはＩ１５７Ｔ置換を含むＧＳＴ ｃｈｋ２−Ｎ誘導体類、またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合ＥＤＤを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィによって検出した。 ＭＣＦ−７細胞由来核抽出物を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴｃｈｋ２−ＮまたはＲ１１７Ａ置換を含むＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ誘導体と、またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングした。 ＥＤＤをインビボでリン酸化する。エクダイソン（Ｅｃｄｙｓｏｎｅ）レセプターを安定的にトランスフェクションさせたＨＥＫ２９３細胞にベクターを移入し、Ｆｌａｇタグを付したＥＤＤの発現を誘発可能とした。ＥＤＤ発現は、ポナステロンを２４時間添加することによって、誘発した（＋）。培地を、32Ｐ標識オルソリン酸含有リン酸非含有培地と交換し、細胞たんぱく質の標識を進行させた。溶解物を、Ｆｌａｇタグを付したＥＤＤを発現（＋）または発現しない（−）細胞から調製し、抗Ｆｌａｇ抗血清を用いて免疫沈降を実施した。放射性標識（すなわちリン酸化した）ＥＤＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィで検出した（上段）。下段パネルでは、ＨＥＫ２９３またはＭＣＦ−７抽出物を、ラムダたんぱく質ホスファターゼ存在下（＋）または非存在下（−）でインキュベーションした。サンプルは、４．２％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＥＤＤについてウェスタンブロッティングした。ホスファターゼの除去は、ＥＤＤたんぱく質移動度の変化により示した。 ｃｈｋ２ ＦＨＡドメインのホスホペプチド結合界面が、ＥＤＤ結合には必要である。インビトロ翻訳35Ｓ翻訳ＥＤＤ誘導体ＥＤＤＦ５（アミノ酸８８９−２７９９）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ ｃｈｋ２−ＮまたはＲ１１７ＡまたはＩ１５７Ｔ置換を含むＧＳＴ ｃｈｋ２−Ｎ誘導体類と、またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。ＧＳＴｃｈｋ２−ＮまたはＧＳＴ ｃｈｋ２−Ｎ（Ｉ１５７Ｔ）とのインキュベーションは、０、８０または１５０μＭのＦＨＡ結合ホスホペプチドの存在下または非存在下で行った。結合ＥＤＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで検出した。 ＥＤＤとｃｈｋ２間の相互作用マッピング。インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ ｃｈｋ２−ＮまたはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合ＥＤＤを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィによって検出した。 ＥＤＤＦ５のインビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類（ＥＤＤＦ６およびＥＤＤＦ７）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴｃｈｋ２−ＮまたはＲ１１７ＡまたはＩ１５７Ｔ置換を含むＧＳＴｃｈｋ２−Ｎ誘導体類と、またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合ＥＤＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィで検出した。融合たんぱく質付加は、ＧＳＴについてブロッティングすることによってモニターした。 照射前後における核ＥＤＤたんぱく質レベルとＣＨＫ２ Ｔ６８リン酸化。ＭＣＦ−７細胞は、１２ＧｙのＩＲに暴露し、１、４または１２時間回復させた。核抽出物を、コントロールおよび処理細胞から調製し、ＥＤＤ、リン酸化ＣＨＫ２（Ｐ−Ｔ６８）またはｐＲＢ（負荷コントロール）についてウェスタンブロッティングすることによって分析した。 細胞を放射性模擬処理した後におけるＥＤＤとＣＨＫ２の会合低下。放射性模擬フレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＭＣＦ−７細胞からまたはコントロールＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を、ポリクローナルＣＨＫ２抗体（Ｎ１７）と免疫沈降させるかまたは陰性対照としてのヤギＩｇＧとインキュベーションした。免疫複合体沈降後よく洗浄し、結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤまたはＣＨＫ２についてウェスタンブロッティングした。 フレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で培養したＭＣＦ−７細胞からまたはコントロールＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴＣＨＫ２−ＮまたはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤおよびＧＳＴについてイムノブロッティングした。 フレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で１時間培養した後１時間または３時間回復させたＭＣＦ−７細胞からまたはコントロールＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を、ＣＨＫ２抗体（Ｎ１７）とインキュベーションした。免疫複合体を沈降させた後よく洗浄し、結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤまたはＣＨＫ２についてウェスタンブロッティングした。 ＥＤＤとＣＨＫ２の解離は、ＡＴＭキナーゼに依存しない。 放射性模擬フレオマイシン（１００μｇ／ｍｌ）存在下で３時間培養したＭＣＦ−７細胞からまたはウォルトマニン（１０μＭ）存在下または非存在下で培養したコントロールＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴＣＨＫ２−ＮまたはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合たんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤおよびＧＳＴについてイムノブロッティングした。投入溶解物を、ＥＤＤおよび活性ＣＨＫ２（抗Ｐ−Ｔ６８）についてイムノブロッティングした。 ＡＴＭ欠乏細胞（ＦＴｐＥＢＳ７）の核抽出物由来ＣＨＫ２抗体およびマッチするＡＴＭ補体細胞株（ＦＴＹＺ５）との免疫沈降。細胞を、フレオマイシン（２０μｇ／ｍｌ）存在下または非存在下で４時間インキュベーションし、Ｔ６８リン酸化がＡＴＭ依存性に行われるようにした（下パネル）。 ＭＣＦ−７細胞に、ＧＦＰまたはＥＤＤに対して調製した短い干渉ＲＮＡ類を９６時間移入させた。細胞をその後、１２Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）に暴露し、３７℃で９０分間回復させた後採取した。等量の全細胞溶解物からのたんぱく質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＥＤＤ、活性化ＣＨＫ２（Ｐ−Ｔ６８）および総ＣＨＫ２についてイムノブロッティングし分析した。 ＧＳＴ−ｃｄｃ２５Ｃサブフラグメントを基質として用いる照射細胞溶解物から免疫沈降させたＣＨＫ２のキナーゼアッセイ。ＭＣＦ７コントロール細胞またはＥＤＤ欠損細胞（ＥＤＤ ｓｉＲＮＡ）を４Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）に供し、１５または６０分間回復させた後採取した。基質またはＣＨＫ２中への３２−Ｐの取り込みを、オートラジオグラフィで検出した。免疫沈降ＣＨＫ２の量およびＣＨＫ２のスレオニン６８上でのリン酸化効率を、ウェスタンブロッティングによってモニターした。 ＣＨＫ２ ＦＨＡドメインのホスホペプチド結合界面が、ＥＤＤ結合には必要である。ＣＨＫ２ ＦＨＡドメインはＥＤＤに結合する。インビトロ翻訳（ＩＶＴ）35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類ＥＤＤＦ５（アミノ酸８８９−２７９９）およびＥＤＤＦ６（アミノ酸８８９−２５２６）（一番上のパネル）またはＭＣＦ７全細胞抽出物（下パネル）を、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ ＣＨＫ２−Ｎ（ＷＴ）またはＲ１１７ＡまたはＩ１５７Ｔ置換を含むＧＳＴ ＣＨＫ２−Ｎ誘導体類またはＧＳＴ単独とインキュベーションした。結合ＥＤＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ（一番上のパネル）またはウェスタンブロッティング（下のパネル）で検出した。融合たんぱく質付加は、クーマシー染色でモニタリングした。 ＥＤＤの脱リン酸化が、ＣＨＫ２会合を防止する。ＩＶＴ ＥＤＤのプルダウンを図１６Ａに記載のように実施したが、ただし、示されたＩＶＴ ＥＤＤは、ＧＳＴＣＨＫ２−Ｎ融合体とインキュベーションする前に、ラムダたんぱく質ホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）とインキュベーションした。 インビトロ翻訳35Ｓ標識ＥＤＤ誘導体類ＥＤＤＦ５およびＥＤＤＦ６は、グルタチオン−セファロースビーズに結合させたＧＳＴ ＣＨＫ２−Ｎ（ＷＴ）またはＧＳＴ ＣＨＫ２−Ｎ誘導体（Ｉ１５７Ｔ）と、０、２０、５０、または１００μＭのＦＨＡ結合ホスホペプチド存在下または非存在下でインキュベーションした。結合ＥＤＤは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィで検出した。 ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２は細胞中で相互作用する。Ｈｉｓタグを有するＥＤＤを発現するＨＥＫ２９３細胞由来抽出物を、ＥＤＤ抗体（ＡｂＰＥＰ１）との免疫沈降に付した。免疫複合体を沈降させた後よく洗浄し、結合たんぱく質類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＥＤＤ（左パネル）およびＢＲＣＡ２（右パネル）についてウェスタンブロッティングで分析した。 ＥＤＤ、ＢＲＣＡ２およびｃｈｋ２間の相互作用は、ＤＮＡ傷害剤に応答して変化する。放射性模擬フレオマイシンまたはＵＶ模擬ハイドロキシウレア（ＨＵ）存在下で培養したＭＣＦ−７細胞からまたはコントロールＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を、ポリクローナルｃｈｋ２抗体（Ｎ１７）との免疫沈降に供した。免疫複合体を沈降させた後よく洗浄し、結合たんぱく質類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＥＤＤ、ＢＲＣＡ２またはｃｈｋ２についてウェスタンブロッティングで分析した。 マウスＥｄｄの標的化破壊。野生型Ｅｄｄ座（一番上）、標的化ベクター（中央）および相同組み換え後の変異座（一番下）の構造。Ｅｄｄエクソン１は、黒い四角で示し、ＡＴＧコドン位置を示した。ＢａｍＨ１制限部位は、Ｂで示した。遺伝子型決定は、プライマー１、２および３（矢印先端）を用いてＰＣＲによって実施し、また、示した３’プローブ（プローブ）によるサザンブロッティングにより実行した。サザン分析で前記プローブにハイブリダイズするＰＣＲ産物およびＢａｍＨＩ断片の予想された大きさを示した。 標的ＥＳ細胞クローンからのゲノムＤＮＡのサザンブロットおよびＰＣＲ分析。４個のネオマイシン耐性ＥＳ細胞クローン１Ｂ２、３Ｄ５、５Ｃ６および８Ｅ７由来ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、３’プローブとハイブリダイズさせた。野生型（ＷＴ）対立遺伝子に対応する６．０ｋｂの断片（一番上）および変異（ＫＯ）対立遺伝子に対応する４．２ｋｂの断片（一番下）を示した。右パネル：Ｅ１０．５胚のＰＣＲ遺伝子型分析。ＤＮＡサンプルを、プライマー１、２および３を用いてＰＣＲに供した。プライマー１および２によるＷＴ対立遺伝子のＰＣＲ増幅により、６００ｂｐの断片（一番上）を産生し、および、プライマー２と３によるＫＯ対立遺伝子のＰＣＲ増幅は、４４０ｂｐの断片（一番下）を産生する。 ＷＴおよびＥｄｄ+/-マウス由来組織のノーザンブロット分析。総ＲＮＡを抽出し、32Ｐ標識マウスＥｄｄ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。密度測定を行い、ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡによる再プローブ化後のブロットと比較し、値を負荷用に補正した。 ウェスタンブロット分析およびＩＨＣは、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）およびノックアウト（−／−）組織中におけるＥＤＤ発現を示している。ＥＤＤウェスタンブロットは、成熟ＷＴ（＋／＋）およびＥｄｄ+/-（＋／−）マウスおよびＥ１０．５のＷＴ、Ｅｄｄ+/-およびＥｄｄ-/-（−／−）の胚の精巣からの溶解物について行った。 免疫組織化学を、示した神経上皮領域を有するＥ９．５野生型（左パネル）およびＥ９．５ノックアウト（−／−、右パネル）胚切片について行った。免疫組織化学は、抗ＥＤＤ抗体により行った。 Ｅ７．５−Ｅ１０．５の野生型およびノックアウト（Ｅｄｄ-/-）胚の形態。 写真は、切除したばかりのＷＴ胚（＋／＋）およびＥｄｄ-/-胚（−／−）を示している。非常に早いＥ７．５の時期に、Ｅｄｄ-/-胚の発育がわずかに遅れていることを示し、Ｅ８．５までには明確な成長遅延がＷＴに比較してＥｄｄ-/-胚で顕著である。Ｅ９．５以降、最も顕著な発育欠損は、Ｅｄｄ-/-胚の大きさが小さく、ＷＴ胚ではＥ９付近で起こる変換が見られないことである。さらに、多くのＥｄｄ-/-胚は、球頭尿膜を示し、（ａ）胎盤形成が起こっていないことを示している。多くのＥｄｄ-/-胚はまた、心膜滲出（ｐ）が観察された。 マウス胚発生におけるＥｄｄ発現。ｗｔｄ１０．５におけるＥｄｄ発現の免疫組織化学分析。差込図は、主に核で発現していることを高倍率で示している。 Ｅ８．５−Ｅ１０．５におけるＷＴおよびＥｄｄ-/-胚における細胞増殖。ＢｒｄＵ取り込みを用いてＷＴ（＋／＋）およびＥｄｄ-/-（−／−）胚における細胞増殖を測定し、ＢｒｄＵプラス細胞を、免疫組織化学で検出した。ＢｒｄＵ陽性細胞は黒く染色された。 Ｅ８．５−Ｅ１０．５のＥｄｄ-/-胚における細胞増殖の定量。Ｅ８．５のＥｄｄ-/-およびＷＴ胚では同じ数の増殖細胞があるが、Ｅ９．５までにはＥｄｄ-/-胚中細胞の大半が増殖をやめ、ＢｒｄＵを取り込まなかった。グラフは、増殖細胞の平均数を示している（％総±標準誤差）。 Ｅ８．５−Ｅ１０．５におけるＷＴおよびＥｄｄ-/-胚におけるアポトーシス。茶色に染まったＴＵＮＥＬ陽性核によるＴＵＮＥＬアッセイを用いて、胚切片中のアポトーシスを測定した。Ｅ８．５において、同等レベルの染色が、ＷＴ（＋／＋）およびＥｄｄ-/-（−／−）胚の両者において観察できる。Ｅ９．５および１０．５において、ほとんどＴＵＮＥＬ染色細胞を有していないＷＴ胚に比較して、Ｅｄｄ-/-胚は顕著に増大したＴＵＮＥＬ染色レベルを示した。 活性カスパーゼ−３染色もまた胚切片で行い、ＴＵＮＥＬ結果を確認した。カスパーゼ陽性細胞百分率を、各パネルの隅に示した。ＴＵＮＥＬ結果と同様、ＷＴ（＋／＋）およびＥｄｄ-/-胚（−／−）における染色レベルはＥ８．５において極めて類似している。しかし、Ｅ９．５までには、カスパーゼ−３媒介アポトーシスレベルが顕著に増加していることが、Ｅｄｄ-/-胚で観察される。 Ｅｄｄ-/-卵黄嚢中における欠損血管形成。Ｅ９．５−Ｅ１０．５のＷＴ（＋／＋）およびＥｄｄ-/-（−／−）卵黄嚢の形態。Ｅｄｄ-/-卵黄嚢は、それらのＷＴ同腹子に比較して血管形成が有意に低く、卵黄嚢循環が欠損していることを示唆している。さらに、Ｅ１０．５のＥｄｄ-/-胚で血液貯留が観察できる（ｂ）； Ｅ１０．５におけるＥｄｄ-/-およびＷＴ卵黄嚢の高倍率像。ＷＴ卵黄膿は、大きなしかもよく組織された血管（ｖ）を有しているが、Ｅｄｄ-/-卵黄膿は、いくつかの血管（ｖ）を有しており、これらは小さく組織化されておらず、このことは、ＥＤＤ非存在下における欠損のある血管成長を示唆している。 Ｅ９．５のＷＴおよびＥｄｄ-/-卵黄嚢由来組織切片の高倍率像。血球（ｂ）を含む顕著な血管チャンネルが、ＷＴ卵黄嚢で見え、ＥＤＤ欠損卵黄膿は、肥大したチャンネルを示し、中胚葉（ｍ）と内胚葉（ｅ）の異常な分離があり、血球がほとんどないことを示している。 ＭＣＦ−７およびＨＥＫ−２９３細胞株中における抗ＥＤＤ（Ｒ）または抗ＧＦＰ（Ｃ）（コントロール）小型干渉ＲＮＡトランスフェクション後のＥＤＤたんぱく質発現のウェスタンブロット分析。トランスフェクション後の時間は、図の下に時間単位で示してある。 ＲＮＡ干渉後の細胞形態。ＨＭＥＣ１８４細胞を、ＲＮＡ干渉５日後に示した；（左）コントロール細胞：（右）ＥＤＤ ｓｉＲＮＡ移入細胞。細胞形態はＥＤＤ枯渇後変化し、細胞はほとんど接触せず、細胞組織化が妨害されている。（当初の倍率１００倍） ＨＭＥＣ１８４細胞中におけるβ−カテニンの免疫蛍光顕微鏡法。コントロール細胞で染色されたβ−カテニンは細胞−細胞接触に沿って一様である（左）が、ＥＤＤ ｓｉＲＮＡを移入した細胞は、よりパッチ状の染色を示し、β−カテニンレベルも低下した（右）。さらに、細胞−細胞接触数の低下も、ＥＤＤ ｓｉＲＮＡ移入細胞で観察された。 ＥＤＤ ＲＮＡｉ移入後のβカテニンの再局在化。ＨＭＥＣ１８４細胞中におけるβ−カテニンの免疫蛍光顕微鏡法は、ＥＤＤ ＲＮＡｉがβ−カテニンを細胞周縁（左、コントロール細胞）から細胞核（右）へ移動させることを示している。 ＨＭＥＣ１８４細胞中におけるアクチンの免疫蛍光顕微鏡法。コントロール細胞におけるアクチンフィラメント（左）は、より調和がとれ連続的に細胞から細胞へ組織化された。ＥＤＤ ｓｉＲＮＡを移入した細胞（右）は、組織化されていないアクチンフィラメントを示しており、１個の細胞からのアクチンは、その近傍細胞のアクチンに連結されていなかった。
【配列表】
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Claims (74)

  1. 対象における癌細胞の検出方法であって、前記対象の試料におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸またはその発現産物のレベルを決定することを含み、前記核酸または前記ポリペプチドの上昇したレベルが、対象における癌を示唆する方法。
  2. 癌細胞は、上皮由来である請求項１に記載の方法。
  3. 癌細胞は、卵巣癌、メラノーマ、転移性メラノーマ、頭部および頸部扁平細胞癌、舌部扁平細胞癌、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌転移、メラノーマ転移、転移性メラノーマ転移、頭部および頸部扁平細胞癌転移、舌部扁平細胞癌転移、肝細胞癌転移、および乳癌転移からなる群から選択される癌に由来する請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸は、ゲノムＥｄｄおよびｐ５３Ｒ２遺伝子またはその部分を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸は、ＥＤＤたんぱく質をコードするゲノム遺伝子を含む請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. ＥＤＤたんぱく質は、配列番号２または４に示す配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項５に記載の方法。
  7. （ｉ）前記対象から得た被験試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸レベルを決定すること；および
    （ｉｉ）健常または正常個人から得た参考試料中における前記核酸レベルと（ｉ）における核酸レベルを比較すること
    を含み、正常または健常個人の参照試料に対して被験試料中で上昇している（ｉｉ）における核酸レベルが、前記対象における癌細胞の存在を示唆する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 被験試料および参照試料は、皮膚、口腔組織、胸部、肝臓、脾臓、卵巣、前立腺、腎臓、子宮、胎盤、頸管、網、結腸、脳、骨、肺、リンパ、尿、精子、血液、腹水および血清からなる群から選択された組織からの細胞を含む請求項７に記載の方法。
  9. ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸レベルは、厳密なハイブリダイゼーション条件で試料においてＥＤＤたんぱく質をコードするゲノムＤＮＡに核酸プローブをハイブリダイズすること、および検出手段を使用してハイブリダイゼーションを検出することによって決定される請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 検出手段は、核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅反応である請求項９に記載の方法。
  11. ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸レベルは、ゲノムＤＮＡに核酸プローブまたはプライマーをハイブリダイズすること、およびハイブリダイゼーションを検出することによって決定され、プローブまたはプライマーは、
    （ｉ）配列番号５に記載の配列；
    （ｉｉ）配列番号６に記載の配列；
    （ｉｉｉ）配列番号７に記載の配列；
    （ｉｖ）配列番号２４に記載の配列；
    （ｖ）配列番号２５に記載の配列；および
    ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｉ）から（ｖ）のいずれかを用いて増幅産生された核酸断片の配列、
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 試料は、対象から予め得られた請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
  13. ヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖した核酸レベルは、ゲノムＤＮＡに核酸プローブまたはプライマーをハイブリダイズすること、およびハイブリダイゼーションを検出することによって決定され、プローブまたはプライマーは、
    （ｉ）配列番号３に記載の配列；
    （ｉｉ）配列番号５に記載の配列；
    （ｉｉｉ）配列番号６に記載の配列；
    （ｉｖ）配列番号７に記載の配列；
    （ｖ）配列番号２４に記載の配列；
    （ｖｉ）配列番号２５に記載の配列；
    （ｖｉｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｖｉｉｉ）配列番号２６に記載の配列；
    （ｉｘ）配列番号２７に記載の配列；
    （ｘ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｉｘ）および（ｘ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｉ）配列番号２８に記載の配列；
    （ｘｉｉ）配列番号２９に記載の配列；
    （ｘｉｉｉ）配列番号３０に記載の配列；
    （ｘｉｖ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｖ）配列番号３３に記載の配列；
    （ｘｖｉ）配列番号３４に記載の配列；
    （ｘｖｉｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｖ）および（ｘｖｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号３７に記載の配列；
    （ｘｉｘ）配列番号３８に記載の配列；
    （ｘｘ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｖｉｉｉ）および（ｘｉｘ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｘｉ）配列番号４０に記載の配列；および
    （ｘｘｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｉ）のいずれかに相補的な配列、
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  14. 対象における癌細胞を検出する方法であって、
    （ｉ）前記対象から得た被験試料中において発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルを決定すること；および
    （ｉｉ）健常または正常個人から得た参照試料中で発現したヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡのレベルと（ｉ）で決定したｍＲＮＡレベルを比較すること、
    を含み、健常または正常個人から得た参照試料に対して被験試料中で上昇した（ｉ）におけるｍＲＮＡレベルが前記対象中における癌細胞の存在を示唆することを含む方法。
  15. ｍＲＮＡは、ＥＤＤたんぱく質をコードする請求項１４に記載の方法。
  16. ｍＲＮＡは、配列番号２または４に少なくとも約８０％の同一性を有するＥＤＤポリペプチドをコードする請求項１４または請求項１５に記載の方法。
  17. ｍＲＮＡは、配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列に８０％の同一性を有する請求項１５または請求項１６に記載の方法。
  18. ｍＲＮＡは、ｐ５３Ｒ２たんぱく質をコードする請求項１４に記載の方法。
  19. 対象における癌を診断するかまたは癌再発を予想する方法であって、前記対象試料中におけるヒトゲノムのマップ位置８ｑ２２．３に連鎖する核酸によってコードされるｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベルを決定することを含み、前記ｍＲＮＡまたはたんぱく質のレベル上昇が、前記対象における癌の再発を示唆する方法。
  20. 癌細胞は、上皮由来である請求項１９に記載の方法。
  21. 癌細胞は、卵巣癌由来である請求項１９または請求項２０に記載の方法。
  22. ｍＲＮＡは、ＥＤＤたんぱく質をコードする請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
  23. ｍＲＮＡは、配列番号２または４に少なくとも８０％の相同性を有するＥＤＤたんぱく質をコードする請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
  24. たんぱく質は、ＥＤＤたんぱく質である請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
  25. ＥＤＤたんぱく質は、配列番号２または４に少なくとも８０％の相同性を有する請求項２４に記載の方法。
  26. 配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列であって、前記アミノ酸配列が、ＶＬＬＬＰＬ配列を欠く配列；
    （ｉ）配列番号３に記載の配列；
    （ｉｉ）配列番号５に記載の配列；
    （ｉｉｉ）配列番号６に記載の配列；
    （ｉｖ）配列番号７に記載の配列；
    （ｖ）配列番号２４に記載の配列；
    （ｖｉ）配列番号２５に記載の配列；
    （ｖｉｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｖｉ）および（ｖｉｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｖｉｉｉ）配列番号２６に記載の配列；
    （ｉｘ）配列番号２７に記載の配列；
    （ｘ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｉｘ）および（ｘ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｉ）配列番号２８に記載の配列；
    （ｘｉｉ）配列番号２９に記載の配列；
    （ｘｉｉｉ）配列番号３０に記載の配列；
    （ｘｉｖ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｖ）配列番号３３に記載の配列；
    （ｘｖｉ）配列番号３４に記載の配列；
    （ｘｖｉｉ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｖ）および（ｘｖｉ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｖｉｉｉ）配列番号３７に記載の配列；
    （ｘｉｘ）配列番号３８に記載の配列；
    （ｘｘ）ＰＣＲにおける増幅プライマーとしての（ｘｖｉｉｉ）および（ｘｉｘ）を用いて増幅産生された核酸断片の配列；
    （ｘｘｉ）配列番号４０に記載の配列；および
    （ｘｘｉｉ）（ｉ）から（ｘｘｉ）のいずれかに相補的な配列、
    からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む癌細胞を検出するための単離核酸分子。
  27. （ｉ）ＥＤＤたんぱく質、または、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合するのに充分なＥＤＤたんぱく質部分；および
    （ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質から構成される群から選択される核たんぱく質、または前記ＥＤＤたんぱく質若しくはＥＤＤたんぱく質の前記部分に結合するのに充分な前記たんぱく質部分
    を含む、単離または組み換えたんぱく質複合体。
  28. 腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリのメンバー、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＴＮＦ−アルファ、ＨＳＰ７０、エストロゲンレセプター、アンドロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、ＨＲＡＳ１−ＶＮＴＲ、ＣＨＫ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＩＢ１、ＮＡＴ１、ＮＡＴ２、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ５、ＣＩＢ、インポーチンアルファ−１、インポーチンアルファ−３、およびインポーチンアルファ−５からなる群から選択されるたんぱく質である請求項２７に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  29. 腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項２７または請求項２８に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  30. セルサイクル調節活性を有するたんぱく質は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリのメンバー、Ｃｄｃ２５、ＣＤＣ２ａ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、ＣＤＫ阻害剤、分裂促進因子性のサイクリン（例、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤなど）、ｐ５３（ＴＰ５３）、およびＣＨＫ２からなる群から選択される請求項２７に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  31. セルサイクル調節活性を有するたんぱく質は、配列番号１９、および配列番号２１からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項２７または請求項３０に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  32. ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ類のＣＤＳ１サブファミリのメンバー、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＩＢ／ＫＩＰ、ＴＰ５３、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＡＴＭ、ＣＨＫ２、ＸＲＣＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ５およびインポーチンアルファ−５からなる群から選択されるたんぱく質である請求項２７に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  33. ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質は、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項２７または請求項３２に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  34. 核標的たんぱく質は、インポーチンアルファ−１、インポーチンアルファ−３、およびインポーチンアルファ−５からなる群から選択される請求項２７に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  35. 核標的たんぱく質は、配列番号９、１１または１３の群から選択される配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求項２７または請求項３４に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  36. プロゲステロンレセプターたんぱく質は、配列番号１５に少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の単離または組み換えたんぱく質複合体。
  37. ＥＤＤたんぱく質を含むたんぱく質複合体に結合する単離抗体。
  38. 抗体が、ＥＤＤたんぱく質、または、腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質に結合できるＥＤＤたんぱく質部分を含むたんぱく質複合体に結合する請求項３７に記載の単離抗体。
  39. 抗体が、（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択されるたんぱく質複合体に結合する請求項３７または請求項３８に記載の単離抗体。
  40. 抗体は、前記複合体の他のたんぱく質の不在下で、前記複合体のいかなる個別のたんぱく質にも結合しない請求項３７から３９のいずれかに記載の単離抗体。
  41. 抗体は、たんぱく質複合体の構造上のエピトープを認識する請求項３７から４０のいずれかに記載の単離抗体。
  42. 請求項３７から４１のいずれかに記載の抗体に結合する単離抗体。
  43. たんぱく質複合体を検出または産生するキットであって、ＥＤＤポリペプチドまたはＥＤＤポリペプチド部分、および腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質またはその部分からなる群から選択される第２ポリペプチドを含み、第２ポリペプチド部分は、前記ＥＤＤポリペプチドまたは前記ＥＤＤポリペプチド部分に結合するのに充分であるキット。
  44. ＥＤＤ結合たんぱく質に結合するたんぱく質を追加的に含む請求項４３に記載のキット。
  45. ＥＤＤ結合たんぱく質に結合するたんぱく質は、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項４４に記載のキット。
  46. 第１または第２ポリペプチド、または前記第１または第２ポリペプチド間に形成された複合体に結合する抗体またはリガンドを更に含む請求項４３から４５のいずれかに記載のキット。
  47. （ｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質またはその部分からなる群から選択されるたんぱく質複合体を形成するのに充分なＥＤＤたんぱく質またはその部分を含む第１コンパートメントであって、第２ポリペプチド部分は、前記ＥＤＤポリペプチドまたは前記ＥＤＤポリペプチド部分に結合するのに充分な第１コンパートメント；および
    （ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、およびプロゲステロンレセプターたんぱく質またはその部分からなる群から選択されるたんぱく質に結合する抗体またはリガンドを含む第２コンパートメント
    を含む、たんぱく質複合体を検出または産生するキットであって、たんぱく質複合体に結合する前記抗体またはリガンドは、個別のたんぱく質結合パートナーに結合しないキット。
  48. （ｉ）（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択されるたんぱく質複合体を形成するのに充分なＥＤＤたんぱく質またはその部分を含む第１コンパートメント；および
    （ｉｉ）（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質；（ｉｉ）ＢＲＣＡ２たんぱく質；（ｉｉｉ）ＣＩＢＣＩＢたんぱく質；（ｉｖ）インポーチンアルファ−１たんぱく質；（ｖ）インポーチンアルファ−３たんぱく質；（ｖｉ）インポーチンアルファ−５たんぱく質；および（ｖｉｉ）プロゲステロンレセプターたんぱく質からなる群から選択されるたんぱく質に結合する抗体またはリガンド、または（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択されるたんぱく質複合体に結合する抗体またはリガンドを含む第２コンパートメント
    を含むたんぱく質複合体を検出または産生するキットであって、たんぱく質複合体に結合する前記抗体またはリガンドは、個別のたんぱく質結合パートナーに結合しないキット。
  49. （ｉ）ＥＤＤたんぱく質に結合する抗体またはリガンドを含む第１コンパートメント；および
    （ｉｉ）ＥＤＤたんぱく質を結合するのに充分な、（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質；（ｉｉ）ＢＲＣＡ２たんぱく質；（ｉｉｉ）ＣＩＢたんぱく質；（ｉｖ）インポーチンアルファ−１たんぱく質；（ｖ）インポーチンアルファ−３たんぱく質；（ｖｉ）インポーチンアルファ−５たんぱく質；および（ｖｉｉ）プロゲステロンレセプターたんぱく質、またはその部分からなる群から選択されるたんぱく質を含む第２コンパートメント
    を含むたんぱく質複合体を検出または産生するキット。
  50. （ｉ）（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択される単離または組み換えたんぱく質複合体を含む第１コンパートメント；および
    （ｉｉ）（ｉ）ＣＨＫ２たんぱく質、ＢＲＣＡ２たんぱく質、ＣＩＢたんぱく質、インポーチンアルファ−１たんぱく質、インポーチンアルファ−３たんぱく質、インポーチンアルファ−５たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質、およびＥＤＤたんぱく質からなる群から選択されるポリペプチドに結合する抗体またはリガンド；または（ｉｉ）１つ以上のたんぱく質複合体（ａ）に結合する抗体またはリガンドを含む第２コンパートメント
    を含むたんぱく質複合体を検出または産生するキット。
  51. ＥＤＤたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質部分、および腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、および適切な細胞源からのプロゲステロンレセプターたんぱく質からなる群から選択されたたんぱく質を含むたんぱく質複合体を単離する方法であって、一時的に、かつたんぱく質複合体が形成するのに充分である条件で前記たんぱく質に結合するＥＤＤポリペプチドまたはその部分により前記細胞の抽出物に接触すること、および形成されるたんぱく質複合体を単離することを含む方法。
  52. （ｉ）たんぱく質複合体の成分であるたんぱく質を、前記たんぱく質を発現する細胞から単離すること；
    （ｉｉ）たんぱく質複合体の成分である他のたんぱく質を、前記他のたんぱく質を発現する細胞から単離すること；および
    （ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）で単離したたんぱく質を、たんぱく質複合体の形成を容易にするのに充分な量および条件で組み合わせること；
    を含むＥＤＤたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質部分、および腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、および適切な細胞源からのプロゲステロンレセプターたんぱく質からなる群から選択されたたんぱく質を含むたんぱく質複合体を単離する方法。
  53. たんぱく質は、細胞によって内因的に発現する請求項５１または請求項５２に記載の方法。
  54. たんぱく質は、細胞中で異所的に発現する請求項５１または請求項５２に記載の方法。
  55. 疾患素質または疾患状態を決定する方法であって、
    （ｉ）ＥＤＤたんぱく質；および
    （ｉｉ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質および血管形成に関連するたんぱく質から構成される群から選択されるたんぱく質
    を含むたんぱく質複合体を検出することを含み、上昇したレベルの前記たんぱく質複合体は、対象における疾患素質または疾患状態を示唆する方法。
  56. たんぱく質複合体は、（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択される請求項５５に記載の方法。
  57. たんぱく質複合体は、たんぱく質複合体に結合する抗体またはリガンドを使用して検出される請求項５５または請求項５６に記載の方法。
  58. 単離または組み換えたんぱく質複合体の活性、形成または安定性の調節剤を決定する方法であって、
    （ｉ）（ａ）ＥＤＤたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質部分；および（ｂ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質またはその部分からなる群から選択されるたんぱく質、を含むたんぱく質複合体の活性、形成または安定性を決定することであって、第２ポリペプチド部分は、候補化合物または候補抗体の不在下で、前記ＥＤＤポリペプチドまたは前記ＥＤＤポリペプチド部分に結合するために充分であること；および
    （ｉｉ）候補化合物の存在下、または候補抗体の存在下で、前記たんぱく質複合体のレベルを決定すること、
    を含み、（ｉ）および（ｉｉ）での前記たんぱく質複合体のレベル差は、候補化合物または候補抗体が、前記相互作用の調節剤であることを示す方法。
  59. たんぱく質複合体形成レベルの調節剤を決定する方法であって、
    （ｉ）（ａ）ＥＤＤたんぱく質またはＥＤＤたんぱく質部分；および（ｂ）腫瘍サプレッサー活性を有するたんぱく質、セルサイクル調節活性を有するたんぱく質、ＤＮＡ修復または損傷に関連するたんぱく質、核標的たんぱく質、プロゲステロンレセプターたんぱく質またはその部分からなる群から選択されるたんぱく質、を含むたんぱく質複合体レベルを決定することであって、第２ポリペプチド部分は、候補化合物または候補抗体の不在下で、前記ＥＤＤポリペプチドまたは前記ＥＤＤポリペプチド部分に結合するために充分であること；および
    （ｉｉ）候補化合物の存在下、または候補抗体の存在下で、前記たんぱく質複合体のレベルを決定すること、
    を含み、（ｉ）および（ｉｉ）での前記たんぱく質複合体のレベル差は、候補化合物または候補抗体が、前記相互作用の調節剤であることを示す方法。
  60. たんぱく質複合体は、（ｉ）ＥＤＤおよびＣＨＫ２を含む複合体；（ｉｉ）ＥＤＤおよびＢＲＣＡ２を含む複合体；（ｉｉｉ）ＥＤＤおよびＣＩＢを含む複合体；（ｉｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−１を含む複合体；（ｖ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−３を含む複合体；（ｖｉ）ＥＤＤおよびインポーチンアルファ−５を含む複合体；および（ｖｉｉ）ＥＤＤおよびプロゲステロンレセプターを含む複合体からなる群から選択される請求項５８または請求項５９に記載の方法。
  61. 調節剤は、複合体の活性、形成または安定性を増強する請求項５８から６０のいずれかに記載の方法。
  62. 調節剤は、複合体の活性、形成または安定性を部分的にまたは完全に阻害する請求項５８から６０のいずれかに記載の方法。
  63. 細胞中でのＥＤＤたんぱく質の上昇した発現に関連する条件を処理する方法であって、細胞中でＥＤＤ発現を減少させることに有効な量の化合物を投与することを含む方法。
  64. ＥＤＤ過剰発現に関連した条件は、癌である請求項６３に記載の方法。
  65. 癌は、癌細胞は、扁平細胞癌、肝細胞癌、卵巣癌、乳癌、メラノーマ、頭部および頸部癌、腺癌、扁平肺癌、胃腸癌、（例、胃、大腸、または膵臓癌）、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、非扁平癌、膠芽腫および髄芽腫からなる群からから選択される請求項６４に記載の方法。
  66. 投与化合物は、核酸を含む請求項６１から６５のいずれかに記載の方法。
  67. 核酸は、アンチセンス核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイムまたは干渉性ＲＮＡであり、それは、全体としてまたは部分的に、ＥＤＤをコードするＲＮＡに相補的である請求項６６に記載の方法。
  68. アンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１または配列番号３に少なくとも８０％の同一性を有する配列の少なくとも約１５−２０個の近接ヌクレオチドに相補的である配列を含む請求項６７に記載の方法。
  69. 配列番号４７に少なくとも８０％の相同性を有する配列を含むアンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ。
  70. 細胞中のＥＤＤ発現を減少させるための、請求項６９に記載のアンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用。
  71. 細胞増殖を阻害するための、請求項６９に記載のアンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用。
  72. 請求項６９に記載のアンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ、干渉性ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む薬剤組成物。
  73. 細胞中のＥＤＤ発現を減少させるための、請求項７２に記載の組成物の使用。
  74. 細胞増殖を阻害するための、請求項７２に記載の組成物の使用。

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