JP4617257B2 - ヒト癌関連遺伝子、それがコードする産物および適用 - Google Patents
ヒト癌関連遺伝子、それがコードする産物および適用 Download PDFInfo
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Description
そして
1)配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号6のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド:
2)配列表の配列番号4、配列番号5、または配列番号7のペプチド配列(タンパク配列)をコードするポリヌクレオチド
3)配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号6により規定されるDNA配列に対して90%より高い相同性を有するDNA配列。これらDNA配列は同一または類似の機能を備えたタンパク質(ポリペプチド)をコードすることができる。
57症例の肝細胞癌患者、50人の男性および7人の女性は、年齢35〜70才であった。平均年齢は54±6.0であった。試験組織は、外科的に切除した試料から得た。コントロールグループの血液サンプルは、臨床試験により症状も癌もみられない同年齢の206人から、および209人の新生児の臍静脈から集めた。
カイ二乗(Χ2)測定および単一因子ANOVA分散を、データの処理および分析のために使用した。
種々の増殖および分化状態にある4タイプの肝臓組織を選択した。これらは、正常な成人の肝臓(NL、ほとんど増殖せず高度に分化している)、胎児肝臓(FL、活発に増殖し低度に分化している)、肝細胞癌(HCC、増殖がコントロールされておらず異常に分化している)、および対照の非癌性肝臓(PNL、一般に活発な増殖状態の前癌期である)から得た。これら組織における遺伝子の転写を検出するためにノザンブロット分析を使用した。RNAサンプルは、外科的切除により新たに得た5つの正常な成人肝臓組織、流産胎児由来の5つの肝臓組織、55個のHCC組織、および55個の対照の非癌性肝臓組織から抽出した。RNAサンプルを電気泳動により分離した後、ナイロンフィルムに移し、Digラベルのプローブとハイブリダイズさせた。フィルムを68℃で洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルをマニュアルに従って現像した。その結果を図1に示す。バンド1は、胎児肝臓由来のサンプルであった。バンド2は、正常な成人の肝臓サンプル由来であった。バンド3、5、7、および9は、HCC由来のサンプルであった。バンド4、6、8、10は、PNL組織由来であった。その結果より、種々の肝臓組織におけるLAPTM4Bの発現は、以下の順であることが示される:HCC組織>PNL組織および胎児肝臓組織>正常な成人の肝臓組織。
2−1 LAPTM4B遺伝子のクローニング
蛍光ディファレンシャルディスプレイ技術を使用することにより、未知の遺伝子cDNAセグメント(LC27)を、正常な成人の肝臓(NL)、胎児の肝臓(FL)、癌性肝臓(HCC)、および対照の非癌性肝臓(PNL)など様々な増殖および分化状態にある4タイプのヒト肝臓組織におけるディファレンシャルディスプレイスペクトルから得た。LC27セグメント(426 bp)は、5’方向へのESTによる相同配列のスプライシング、その後のRACE(cDNA端の迅速増幅)および高温のRT−PCR技術により伸張した。2つの全長cDNA配列、すなわち配列番号2および3が産生され、その後、配列決定およびBLASTプログラム分析により確認した。
5’末端にあるLAPTM4B遺伝子の第一エキソンの上流領域の配列を、バイオインフォマティクスにより得、プライマーF1およびR1を設計した。鋳型としてHCC由来のヒトゲノムDNAを用いて、LAPTM4Bプロモーターおよびその上流配列を、Platinum Pfx DNAポリメラーゼを用いたPCRにより得た。Xho IおよびHind III酵素で切断した後、pGL3-Basicvectorに挿入してpGL3-PF1を形成し、その配列を決定した(すなわち、試験結果は図16の分図aに示す)。
2−3−1. DNAの分離
ゲノムDNAは、標準的なフェノール−クロロホルム法に従って、肝細胞癌および食道癌の外科的切除に由来する血液リンパ球または癌組織のサンプルから抽出した。
プロモーター配列のクローニングと同じ手法を用いることにより、2つのプライマー、F1:5’GCGCTCGAGGCTCCAGGTG GAAGAGTGTGC 3’(下線で示されるとおり5’末端配列にXhoI酵素切断部位を含む)、およびR1:5’GCGAAGCTT GGACTTGGCCATGTGACCCG 3’(下線で示されるとおり5’末端配列にXhoI酵素切断部位を含む) を、LAPTM4B遺伝子配列の配列番号3に基づいて設計し、合成した。その後、プロモーター配列およびLAPTM4Bの第一エキソンにあるその前方配列を、PCRによりヒトゲノムDNAからクローニングした。種々のヒトゲノムDNAから構築したpGL3-PF1ベクターを、LAPTM4B対立遺伝子をスクリーニングするために配列決定した。元のLAPTM4B配列をLAPTM4B*1と名付けた。他方をLAPTM4B*2と名付け、これはすなわち配列表の配列番号6である。図9(A)は、LAPTM4Bプロモーターおよびその第一エキソンの概略図を示す。長方形のフレームは、第一エキソンを示し、黒色領域はコード領域を表し、白色は非コード領域であり、グレー領域は19 bp DNA配列を示す。水平な線は、プロモーター部分を表し、F1、F2、R1、およびR2は、4つのプライマーが位置するところである。開始コドンATGの“A”は、配列の+1と定義される。図9(B)は、LAPTM4B対立遺伝子の部分配列およびその配列決定グラフィックスペクトルを示す。下線部は、19 bp DNA配列である。この結果より、LAPTM4B*1は、1コピーの19 bp DNA配列を含有し、LAPTM4B*2は、LAPTM4B*1の第一エキソンの非コード領域(nt-33−-15)で連結された2コピーの19 bp DNA配列を含有することが明らかである。
E2(5’GCCGACTAGGGGACTGGCGGA 3’) およびR2 (5’CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC 3’) プライマーを設計し、合成した。LAPTM4Bの第一エキソンの部分配列を、正常なヒト、肝細胞癌、および食道癌組織に由来するゲノムDNAを鋳型として用いてPCRにより増幅した。PCR条件は以下のとおりとした:96℃で前変性5分間;94℃で30秒間、68℃で30秒間、72℃で1分間を35サイクル;72℃で5分間。その後PCR産物に、2%アガロースゲル電気泳動分析を行った。図10は、ヒト集団におけるLAPTM4B遺伝子の*1/*1、*1/*2、および*2/*2の3つのタイプを示す。
LAPTM4Bプロモーター−5’UTR、エキソンの35bpコード配列およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を種々の長さで備えた上流配列を含有する一連のベクターを構築した。すなわち、LAPTM4B遺伝子プロモーターおよび上流配列を、Xho IおよびHind III酵素により切断し、pGL3-Basicベクターに連結してpGL3-PF1を形成し、配列決定により同定した。その後、pGL3-PF1を鋳型として使用し、プライマーF2、F3、およびF4 vs.R1を使用してPCRによりそれぞれ増幅し、種々の長さのプロモーターセグメントおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターpGL3-PF2、pGL3-PF3、およびpGL3-PF4を構築した。これら構築物は配列決定により同定した。
F1: 5’’’GCGCTCGAG GCTCCAGGTGGA AGAGTGTGC 3 (nt -1341- -1321)
F2: 5’’’GCGCTCGAG TAA AAACGCTGTGCCAGGCGT 3’’’(nt -881- -861)
F3: 5’’’CCGCTCGAG TACCGGAAGCACAGCGAGGAT 3’’’(nt -558- -538)
F4: 5’’’GCGCTCGAG AGTAGAAGGGAAGAAAATCGC 3’’’(nt -38- -18)
R1: 5’’’GCGAAGCTT GGACTTGGCCATGTGACCCG 3’’’(nt 172-191)
これらベクターを使用して、BEL-7402細胞およびHLE細胞を別々にトランスフェクトし、プロモーター活性を測定した。図17bに示されるとおり、ベクターでトランスフェクトした細胞はすべて、様々な強度でルシフェラーゼ活性を有する。pGL3-PF3は、BEL-7402細胞およびHLE細胞の両細胞において同様の活性を示し、これはSV40プロモーター(pGL3-Promoter)活性の約27%であった。しかし、これをpGL3-PF4活性と比較すると、BEL-7402細胞ではほとんど差がなかった。HLE細胞においてpGL3-PF3活性は、pGL3-PF4より7倍高かった。図17aに示されるとおり、pGL3-PF3(−41〜−558)は、転写因子に対する多くの潜在的な結合部位を有する。それらの一つまたは複数、とりわけc-Ets-1が、HLE細胞において調節的な役割を果たし、HLE細胞においてpGL3-PF3およびpGL3-PF4トランスフェクタントのルシフェラーゼ活性を著しく異なったものにすることができる。pGL3-PF3活性は、BEL-7402細胞およびHLE細胞の両細胞においてpGL3-PF1およびpGL3-PF2活性より高く、このことは幾つかの負の調節因子が存在することを暗示する。これらの負の調節因子の一つまたは複数は、プロモーター上流ターゲット配列(-558上流)に結合し、ダウンレギュレートされたLAPTM4B遺伝子発現を引き起こす。この抑制効果は、7402細胞よりもHLE細胞において強かった。このことは、HLE細胞がLAPTM4Bの発現を強力に抑制する幾つかの因子を含有し得ることを意味する。また、図1−Bに示されるノザンブロット分析は、HLE細胞におけるLAPTM4Bの低い発現を示し、これは上記仮説を裏付けるものである。pGL3-PF2ベクターは、2つのDNA繰り返しフラグメント(−41〜 −328, −574〜 −859)を含有し、pGL3-PF3よりDNAフラグメント(−574〜 −859)が一つ多い。pGL3-PF3は、何れの細胞においてもpGL3-PF2より高い活性を示す。この結果は、2つの繰り返し配列が遺伝子発現を負に調節することを示す。これらは、転写因子に対する多くの潜在的な結合配列を有し、負の調節因子それぞれに対して2つの結合部位を提供する。多くの転写因子はしばしばダイマーを形成するため、これらは、機能を果たすためには2つのターゲット配列と結合しなければならない。pGL3-PF3の場合、一つの結合部位しか提供できないため、機能は現れない。pGL3-PF3トランスフェクタントは、脱抑制効果を有しているため、その活性は他のベクタートランスフェクタントより高い。
組織サンプルを氷上に置き、はさみで小片に切断した。0.1グラムのウェット組織を選択し、手動ホモジナイザーに置いた。各チューブに1 mL溶解バッファーを添加し、その混合物を完全にホモジナイズした。溶解物を新たなチューブに移し、4℃、12000 gで10分間遠心分離し、残渣を除去した。細胞を使用した場合、培養皿の細胞を0.25%トリプシンバッファーで処理し、その後PBSで2回洗い、500 gで3分間遠心分離した。透明の上清を集め、上清中のタンパク質をSDS-PAGE電気泳動により分離し、次いでNCメンブレンに移した。そのメンブレンを、0.05% Tween 20を含有するTBSバッファー中の5%脱脂粉乳を用いて、4℃で一晩ブロックした。その後、それを、ウサギポリクローナル抗体、LAPTM4B-EC2 232-241-pAb (1:500希釈) またはマウス抗-FLAG M2モノクローン抗体 (Sigma, 1:750希釈) と室温で2時間インキュベートし、その後TBSで3回洗った。ペルオキシダーゼ結合二次抗体(IgG)、たとえばヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス (1:3000希釈) と2時間更にインキュベートし、その後TBSバッファー (pH 8.0、0.05% Tween 20含有) で3回洗った。最後の洗浄は、Tween 20を含有しないバッファーを用いた。陽性のバンドを露呈するためにECL (Santa Cruz) を使用した(製造元の指示どおり実施した)。1つのメンブレンに2つの抗体を連続してハイブリダイズさせる場合、ECLで露呈したメンブレンは、まずTBSで洗い、その後30 mL TBS (2% SDSおよび210μL β-メルカプトエタノール) を用いて室温で30分間洗浄した。この30分のTBS洗浄により、第二のハイブリダイゼーションに使用可能なメンブレンにおいて、先の抗体およびそのシグナルが除去される。図3は、LAPTM4B-35がHCC組織およびHCC細胞株で過剰発現したことを示す。
鋳型としてpGEMT-E2E7プラスミドを使用し、プライマーAまたはBおよびE、およびPfx DNAポリメラーゼを用いたPCRにより、LAPTM4B遺伝子の全長もしくは部分cDNA、またはリーディングフレームを増幅した。BamHI酵素切断部位(GGATCC)およびリボソーム結合部位配列(GCCACC)は、5’末端においてプライマーAおよびBで導入し、EcoRI酵素切断部位(GAATTC)は、プライマーEで組み込んだ。増幅産物AEおよびBEを制限酵素BamHIおよびEcoRIにより制限処理し、精製し、pcDNA 3.0ベクターにライゲートした。これらをDH5 E.coliに慣用的な手法で形質転換し、ポジティブクローンを選択し、構築されたプラスミドの配列を同定のために決定した。構築されたプラスミドは、それぞれpcDNA3/AEおよび-BEと名付けた。pcDNA3/AEは、全長ORFを含有するが、pcDNA3/BEは、第二のATGから始まりTAAまでのORFを含有する。pcDNA3/BEによりコードされるタンパク質は、pcDNA3/AEと比較すると、N末端において91のアミノ酸を欠損している。
6週齢のオスマウスを無作為に選抜し3グループに分けた。第一のコントロールグループでは、マウスに生理食塩水を注射した。第二のコントロールグループでは、マウスにpcDNA3 MOCK(プラスミドを保持しない)トランスフェクト細胞を接種した。試験グループでは、すべてのマウスにpcDNA/AE(全長cDNA含有プラスミド)トランスフェクトNIH3T3細胞を接種した。各マウスに2×106細胞を皮下接種した。各グループのマウスは4〜6匹であった。接種から21日後にマウスを屠殺し解剖した。図7に示すとおり、試験グループの2匹のマウス(接種されたマウスの半数)は、明らかに中程度の悪性線維肉腫を発症し(A、B);他の2匹のマウスは、接種部位にリンパ組織が確認された(C、D)。対照的に、2つのコントロールグループの12匹のマウスは、接種後86日間、腫瘍形成の徴候を示さなかった。
96ウェル培養プレートを、HCC患者および既知の合意による正常なヒトに由来する種々の希釈率の血清を用いて4℃で一晩コートした。各ウェルを0.5% Tween-20洗浄溶液で洗浄し、次いで室温で1時間ブロッキングのために2% BSAを添加した。その後、LAPTM4B-EC2-pAb抗体を種々の希釈率で添加し、室温で2時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、ホースラディシュペルオキシダーゼによりラベルされたヤギ抗ウサギ抗体(1:1000倍希釈)を添加した。室温に2時間置き、PBSで1回洗浄した後、1 g/mL o-フェニルジアミンを10-15分間添加して発色させ、反応を停止させるためにH2SO4を使用した。酵素分析用のマイクロタイターを使用し、490 nmでODを測定し、抗原レベルを評価した。その結果を図8に示す。明らかに、肝細胞癌患者の血清は、正常なヒトの血清より高いレベルのLAPTM4B抗原を含有しており、これは、LAPTM4Bが肝細胞癌を診断するための新規マーカーとなる可能性があることを示唆する。
細胞溶解物を例4の方法に従って調製した。一次抗体を上清に添加した。4℃で1時間振盪した後、50μLタンパク質G-アガロース懸濁液を添加し、その混合物を4℃で少なくとも3時間または一晩振盪した。免疫複合体の沈殿を、12000 gで20秒間遠心分離した後に収集した。その複合体を、1 mL洗浄バッファーIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪した。その混合物を12000 gで20秒間遠心分離し、上清を注意して取り除いた。この工程を1回繰り返した。その後、その複合体を、洗浄バッファーIIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪し、12000 gで20秒間遠心分離した。上清を注意して取り除いた。最後の2つの工程を1回繰り返した。その複合体を、洗浄バッファーIIIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪し、12000 gで20秒間遠心分離した。上清を完全に取り除いた。沈殿に50μL 1×SDSローディングバッファーを添加し、その混合物を100℃の温浴で5分間ボイルして、サンプル中の免疫複合体を変性し解離させた。12000 gで20秒間遠心分離した後、上清を取り除き、SDS-PAGE装置で分析した。
正常な個人および肝細胞癌患者の血液に由来するゲノムDNAのLAPTM4B遺伝子型を、PCRにより検出した。2つのプライマーを、LAPTM4B遺伝子配列3の19 bp DNA配列のフランキング配列に従って設計し、合成した:
F2: 5’GCCGACTAGGGGACTGGCGGA 3’
R2: 5’CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC 3’
第一エキソンの部分配列を、ゲノムDNAを鋳型として用いて増幅した。PCR条件は以下のとおりとした:96℃のプレ変性5分、94℃で30秒、68℃で30秒、72℃で1分を35サイクル、72℃の伸長5分。PCR産物を2%アガロースゲル電気泳動により分析し、その結果を図10に示す。レーン1、6、12、および13は、LAPTM4B*1/*1の204 bpヌクレオチドセグメントを表す。レーン5、8、9、14、および15は、LAPTM4B*2/*2の223 bpヌクレオチドセグメントを表す。レーン2、3、4、7、10、および11は、LAPTM4B*1/*2の204 bpおよび223 bpヌクレオチドセグメントを表す。ラインMはマーカーである。この結果は、ホモ接合の遺伝子ペア*1/*1または*2/*2では、204 bpまたは223 bp DNAセグメントの何れかが増幅されたが、*1/*2のハイブリッド遺伝子ペアでは、204 bpおよび223 bp DNAセグメントの両方が同時に増幅されたことを示す。従って、中国人のLAPTM4Bの遺伝子型は、LAPTM4B*1/*1、*1/*2、および*2/*2に分類することができる(図10)。
本発明の態様の一つにおいて、209人の正常な中国人および57人の肝細胞癌患者におけるLAPTM4B遺伝子型の存在頻度を、表2で分析し、比較した。ハーディ-ワインベルグの等式を用いて予測分析値を得た。肝細胞癌患者のLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の頻度は、正常なヒトとは有意に異なる。その比は、それぞれ0.5175:0.6746および0.4825:0.3254である。正常なヒト集団におけるLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の存在頻度は、0.6746および0.3253であるが、肝細胞癌患者におけるLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の存在頻度は、0.5175および0.4825である。肝細胞癌患者のグループにおける遺伝子型*1/*1 (p=0.029) および*2/*2 (p=0.003) の存在頻度は、コントロールグループとは統計的に有意な差がある。肝細胞癌患者グループでは、*1/*1は29.8%のみであるが、正常なコントロールグループでは、*1/*1は45.93%である。肝細胞癌患者グループにおける*2/*2遺伝子型の存在頻度は、コントロールグループの11.01%と比較して26.32%であり、その存在頻度は有意に高い(p<0.01)。この分析は、*2/*2遺伝子型の個人がHCCに罹患するリスクは、他の遺伝子型が肝細胞癌を発症するリスクの2.89倍高いことを示す。このように、LAPTM4B*2/*2遺伝子型は、肝細胞癌を発症する感受性と互いに関係がある。
LAPTM4B遺伝子型が他の癌を発症する感受性と関連があるかどうか研究するため、同じ位置から採取した116人の正常なヒトおよび109人の食道癌患者の血液に由来するゲノムDNAを分析した。表4に示すとおり、食道癌患者のLAPTM4B遺伝子型は、正常なヒト集団のコントロールグループと有意な差がない。LAPTM4B対立遺伝子は、食道癌を発症する感受性とは関連がない。
LAPTM4B-35タンパク質の発現と他の癌との関係を、免疫組織化学的手法により調べた。食道癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、および直腸癌のポジティブ組織およびネガティブコントロールの非癌性組織に由来する固定標本を、外科的な切除により得、以下の工程に従って処理した:
1.キシレンによる標本の脱ワックス
2.様々な濃度のエタノール、100%−95%−90%−80%−70%を用いたカトクロミー(katocromy)。内在性ペルオキシダーゼを除去するためにPBSを使用した
3.クエン酸ナトリウムにより抗原の修復
4.2回のPBS洗浄
5.通常のヤギ血清ブロッキング
6.LAPTM4B-N1-99pAbを37℃で1時間保つ
7.3回のPBS洗浄
8.HRP標識のヤギ抗ウサギ抗体を37℃で1時間保つ
9.3回のPBS洗浄
10.DABによる発色
11.ヘマトキシリンを用いた核の保持
12.様々な濃度(70%−80%−90%−95%−100%)のエタノールによる脱水の上昇
13.マウンティング
図11に示されるとおり、11−Aは正常な食道組織(ネガティブ)を示し、Bは食道癌組織(ポジティブ)であり、Cは正常な乳房組織(ネガティブ)であり、Dは乳癌組織(ポジティブ)であり、Eは正常な肺組織(ネガティブ)であり、Fは肺癌組織(ポジティブ)であり、Gは正常な胃組織(ネガティブ)であり、Hは胃癌組織(ポジティブ)である。図から分かるとおり、LAPTM4Bは肺癌、胃癌、および乳癌の組織で明らかに発現していたが、食道癌および大腸癌で明らかに発現していなかった。
Claims (14)
- 配列表の配列番号4のペプチド配列からなるヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35。
- 癌促進機能を備える請求項1記載のヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35。
- 配列表の配列番号7のペプチド配列からなるヒト癌関連ポリペプチド。
- 癌感受性機能を備える請求項3記載のヒト癌関連ポリペプチド。
- 癌が肝臓がんおよび上皮起源のである請求項1、2又は5のいずれかに記載のヒト癌関連ポリペプチド。
- 1)配列表の配列番号1、2、3または6により規定されるポリヌクレオチド
2)請求項2及び4に記載の配列表の配列番号4または7のいずれかをコードするポリヌクレオチドからなり、
上記配列の一つからなるヒト癌関連ポリヌクレオチド。 - 癌が肝臓がんおよび上皮起源のである請求項6記載のヒト癌関連ポリヌクレオチド。
- プロモータとしてLAPTM4B遺伝子の発現をレギュレイトする配列表の配列番号8からなるヒト癌関連ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35の抗体。
- 請求項6に記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドの発現ベクター。
- 請求項6記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドをトランスフェクトし突然変異した細胞株。
- 配列表の配列番号1、2又は3に記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドを用いるがん診断の試薬の製造に使用するヒト癌関連ポリヌクレオチドの使用方法。
- 請求項3または請求項6に記載のヒト癌関連ポリペプチド又はヒト癌関連ポリヌクレオチドの使用方法において、前記ヒト癌関連ポリヌクレオチドが配列表の配列番号6のヒト癌関連ポリヌクレオチドであり、及び前記ポリペプチドが配列番号7のポリペプチドからなり、いずれか一つを肝臓がんに感受性のある個人を同定するために使用する方法。
- 請求項1又は3のヒト癌関連ポリペプチドの使用方法であって、該ポリペプチドが配列番号4及び7であって、癌診断のための試薬の製造に使用される方法。
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