JPH11292900A

JPH11292900A - ヒト悪性腫瘍の診断および治療の基礎としてのｅ−カドヘリンの突然変異体

Info

Publication number: JPH11292900A
Application number: JP10042794A
Authority: JP
Inventors: Heinz Hoefler; ハインツ・ヘーフラー; Karl-Friedrich Dr Becker; カール−フリードリッヒ・ベッカー; Elisabeth Dr Kremmer; エリーザベト・クレマー; Manfred Dr Eulitz; マンフレート・オイリッツ; Christoph Dr Schuhmacher; クリストーフ・シューマッハー
Original assignee: Gsf Forschungszentrum fur Umwelt & Gesundheit GmbH; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Gsf Forschungszentrum fur Umwelt & Gesundheit GmbH; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1998-01-20
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 1999-10-26

Abstract

(57)【要約】【課題】胃癌、特に散在性胃癌の検出に特に適したモ
ノクローナル抗体を提供する。【解決手段】塩基トリプレットもしくはその多量体の
欠失または塩基トリプレットの１もしくは２のヌクレオ
チドの交換による枠内突然変異したＥ−カドヘリンのア
ミノ酸配列に特異的に向けられたモノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、突然変異した膜貫
通Ｅ−カドヘリンに対して特異的に向けられ、胃癌の測
定に有用なモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】死亡原因の統計的見積りは悪性腫瘍が世
界的に第一位であることを示す。これらの腫瘍のうち、
国際的に胃癌は死に至る腫瘍の第二位を占める。ミクロ
サテライトの不安定性および遺伝子ｐ５３ＡＰＣＤ
ＣＣの改変を含めたいくつかの遺伝的改変が胃癌に関連
して報告されている（ＴａｈａｒａＥ：ヒト胃腸管癌
における遺伝子改変Ｃａｎｃｅｒ１９９５；７５：
１４１０−１４１７）。組織形態学的には、２つのタイ
プの胃癌が区別され得る（ＬａｕｒｅｎＰ．：「胃癌
の２つの組織学的主要タイプ：散在性およびいわゆる腸
−タイプの癌」ＡｃｔａＰａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１９６５：６４：３１−４９）：
１つのタイプは腺分化を有する腸癌であり、他のタイプ
は組織構造が破壊された散在性癌からなる。これまで、
この二元的進展および形態についての遺伝的基礎は明確
とはされていない。恐らくは、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃ
ａｄｈｅｒｉｎ）分子の改変がこの点で重要であろう：
Ｅ−カドヘリンは上皮組織の相互作用で鍵となる役割を
演じる血友病膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）細
胞接着分子である。１６のエクソンからなるＥ−カドヘ
リン遺伝子の初期の分子生物学研究は、突然変異が胃癌
の形態および成長のタイプに寄与し得ることを示した
（ＢｅｃｋｅｒＫ−Ｆ，ＡｔｋｉｎｓｏｎＭＪ，Ｒ
ｅｉｃｈＵ，ＢｅｃｋｅｒＩ，ＮｅｋａｒｄａＨ，
ＳｉｅｗｅｒｔＪＲ，ＨｏｆｌｅｒＨ：「Ｅ−カド
ヘリン遺伝子突然変異は散在性タイプの胃癌に対する糸
口を与える」ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９４：５４
（１４）：３８４５−３８５２）。

【０００３】基本的には、悪性腫瘍の改変は挙動のある
種の生物学的パターンの説明で興味がある；これらの現
象は特別の特徴として、従って、腫瘍マーカーとして使
用できる。これらの特徴は、直接的または間接的に評価
できる細胞産物および細胞表面の典型的な特性を含む。
今日まで、腫瘍細胞のみに制限された表面抗原または細
胞産物の単離は成功していない。現在まで、正常組織に
対する身体におけるある種の細胞特性（表面抗原、細胞
内蛋白質、分泌された細胞産物）の増大した出現が悪性
疾患の診断および治療の基礎として使用されてきた。

【０００４】診断および治療におけるＥ−カドヘリンの
使用状態最初の公表は、特異的抗体を用いる免疫組織化学によっ
て検出されたＥ−カドヘリンは腫瘍細胞において改変さ
れた発現パターンを示したことを報告している。Ｅ−カ
ドヘリンの免疫反応性は腫瘍組織では部分的に低下して
いるか、あるいは存在しない（表１参照）。他の著者
は、この事実は腫瘍における蛋白質の生産の減少（「下
降調節」）の原因であると考えた（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅ
ｒ，ＤＥ−Ａ−４１１０４０５Ａ１参照）。

【０００５】

【表１】

【０００６】表１において、^ａ調べた患者の数を示す^ｂ「正常」組織と同様のＥ−カドヘリンの免疫反応性示
す。^ｃ減少したまたは存在しない腫瘍におけるＥ−カドヘリ
ン免疫反応性を示す。表１の文献：１：ＳｈｉｎｏＹ．，ＷａｔａｎａｂｅＡ．，Ｙａ
ｍａｄａＹ．，ＴａｎａｂｅＭ．，Ｙａｍａｄａ
Ｔ．，ＨａｔｓｕｄａＭ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ
Ｊ．，ＴａｔｓｕｍｉＭ．，ＭｉｗａＴ．，Ｎａｋ
ａｎｏＨ．：「ヒト胃癌における免疫組織化学的Ｅ−
カドヘリン発現の臨床病理学的評価」Ｃａｎｃｅｒ１９９５；７６：２１９３−２２０１２：ＢｒｉｔｏＭ．Ｊ．，ＪａｃｉｎｔｏＬ．，Ｊ
ａｎｋｏｗｓｋｉＪ．，Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ
Ｍ．，ＦｉｌｉｐｅＭ．Ｔ．：「胃癌におけるＥ−カドヘリン（細胞接着分子）」Ｐａｔｈ．ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９９５；１９１：６
２８（アブストラクト）３：ＭａｔｓｕｉＳ．，ＳＨｉｏｚａｋｉＨ．，Ｉ
ｎｏｕｅＭ．，ＴａｍｕｒａＳ．，Ｄｏｋｉ
Ｙ．，ＫａｄｐｗａｋｉＴ．，Ｉｗａｚａｗａ
Ｔ．，ＳｈｉｍａｙａＫ．，Ｎａｇａｆｕｃｈｉ
Ａ．，ＴｓｕｋｉｔａＳ．，ＭｏｒｉＴ．：「ヒト胃癌におけるアルファ−カテニンの免疫組織化学
的評価」ＶｉｒｃｈｏｗｓＡｒｃｈｉｖ１９９４：４２４：
３７５−３８１４：ＭａｙｅｒＢ．，ＪｏｈｎｓｏｎＪ．Ｐ．，Ｌ
ｅｉｔｌＦ．，ＪａｕｃｈＫ．Ｗ．，Ｋｅｉｓｓ
Ｍ．Ｍ．，ＳｃｈｉｄｂｅｒｇＦ．Ｗ．，Ｂｉｒｃｈ
ｍｅｉｅｒＷ．，ＦｕｎｋｅＩ：「主要な転移性胃癌におけるＥ−カドヘリン発現：下降
調節は細胞分化および腺崩壊と相関する」ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９３；５３：１６９０−１
６９５５：ＳｈｉｍｏｙａｍａＹ．，Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ
Ｓ．：「胃癌におけるＥ−およびＰ−カドヘリンの発現」ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９１：５１（８）：２１８
５−２１９２

【０００７】これらの現象に関する我々自身の考えは、
まず、完全無欠のＥ−カドヘリン遺伝子を目指した。Ｒ
ＮＡ抽出、逆転写および直接ＤＮＡ配列決定の後、胃癌
組織の分子生物学調査はＥ−カドヘリン遺伝子における
欠陥を明らかとした。散在性サブタイプの胃癌をＥ−カ
ドヘリン遺伝子の一部（エクソン６−１０および１３−
１６）における遺伝子改変につき調べた。エクソン８お
よび９の喪失、エクソン１０の部分的喪失、またはエク
ソン８の領域における点突然変異が観察された（Ｂｅｃ
ｋｅｒＫ−Ｆ，ＡｔｋｉｎｓｏｎＭ．Ｊ．，Ｒｅｉ
ｃｈＵ．，ＢｅｃｋｅｒＩ．，Ｎｅｋａｒｄａ
Ｈ．，ＳｉｅｗｅｒｔＪ．Ｒ．，ＨｏｆｌｅｒＨ：
「Ｅ−カドヘリン遺伝子突然変異は散在性胃癌に対する
糸口を提供する」ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９４；５
４（１４）：３８４５−３８５２）。腸サブタイプ腫瘍
は構造的改変に導く突然変異を示さなかった。見い出さ
れた突然変異の解析は、いくぶん高い頻度で個々の欠失
が起こったが、点突然変異またはより小さい欠失が観察
できたことを明らかとした。突然変異したＥ−カドヘリ
ンに関するケースのいくつかの免疫組織化学的染色（抗
体：ＨＥＣＤ−１、ＴａｋａｒａＢｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ，日本国、形態学セクション参照）は、腫瘍細胞
の膜貫通染色および非腫瘍粘膜の染色を顕著に示した。
本発明者らは、腫瘍細胞の標識が野生型Ｅ−カドヘリン
または突然変異Ｅ−カドヘリンの検出に対応するのかを
区別することができなかった。一方、突然変異蛋白質が
継続的に細胞膜に取り込まれ、Ｅ−カドヘリンに対する
抗体（ＨＥＣＤ−１）が突然変異領域から離れたエピト
ープを認識する可能性があった。さらなる説明は、第２
の突然変異していない対立遺伝子によって生成し、腫瘍
細胞でやはり生産されている野生型Ｅ−カドヘリンへの
該抗体の結合であり得た。まず、腫瘍のいくつかが染色
を示さなかったという事実は、蛋白質の翻訳または安定
性に影響を有するかも知れない、調べたエクソン６−１
０および１３−１６から離れたさらなる突然変異の存在
を我々に示唆した。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、胃
癌、特に散在性胃癌の検出に特に適したモノクローナル
抗体を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この目的は請求項１によ
り詳しく特徴付けたモノクローナル抗体に係る本発明に
よって達成される。本発明の好ましい実施態様は従属し
た二次的な請求項群に従って示される。

【００１０】

【発明の実施の形態】これまで調べられていなかったＥ
−カドヘリンの領域（エクソン１−５、１１および１
２）の解析、および散在性胃癌の１０のさらなるケース
のＥ−カドヘリンのｃＤＮＡの配列決定は、散在性胃癌
においてさらなる突然変異を明らかとした（「方法セク
ション」参照）。これらの新しく見い出された突然変異
（表２）は、驚くべきことに、典型的なパターンを継続
的に示した。全てのケースにおいて、これらの突然変異
は読枠に影響しない塩基トリプレットの多重体である
か、あるいはそれらは点突然変異であった。これらの研
究によって、本発明者らは、免疫反応性の喪失が翻訳−
破壊突然変異によって引き起こされ得るという免疫組織
化学的調査の後になされた示唆を排除することができ
た。胃癌の調査と平行して、他の上皮腫瘍も解析した。
乳癌、食道ガン、および大腸癌のケースは胃癌のそれに
対応するパターンは示さなかった。

【００１１】

【表２】

【００１２】突然変異の特徴付けならびにさらなる腫瘍
の配列決定に関して行ったさらなる研究は、未だ報告さ
れておらず、癌のケースではユニークである原理に導い
た：散在性胃癌におけるＥ−カドヘリンの改変は枠内突
然変異であって（読枠の破壊ではない）。この結果は診
断および治療目的で有用である。

【００１３】以下、図面を参照して、本発明をさらに詳
しく説明する。

【００１４】図１は、現在まで公知の散在性胃癌におけ
るＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。散在性胃癌
におけるＥ−カドヘリン突然変異は、典型的には、枠内
欠失である。突然変異は以下のものを表す：矢印は検出
された突然変異を表す；翻訳されたＥ−カドヘリン配列
は陰影を付した；数字を付したボックスはエクソンを表
す；アミノ酸、続いてのコドン位置は「ミスセンス突然
変異」を表す；接頭辞のない数字は欠失（ｄｅｌ）の位
置を示し、「ｄｅｌ」の後の数字は失われた塩基対の数
である。

【００１５】図２は、免疫蛍光による突然変異Ｅ−カド
ヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カドヘリン
蛋白質（エクソン９欠失）はトランスフェクトされた細
胞の細胞結合部（明るい線）で検出することができる。

【００１６】図３は、免疫電子顕微鏡検による突然変異
Ｅ−カドヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カ
ドヘリン蛋白質（矢印）はトランスフェクトされた細胞
の膜で検出することができる。

【００１７】図４は、本発明によるＥ−カドヘリン突然
変異の迅速な診断のフローダイアグラムである。

【００１８】図５は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン
抗体７Ｅ６によって染色されたウェスタンブロット図で
ある。突然変異−特異的ではないＥ−カドヘリン抗体Ｈ
ＥＣＤ−１とは対照的に、突然変異−特異的抗体７Ｅ６
は突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質ｄｅｌ９、エクソン９
欠失Ｅ−カドヘリンを絶対的に検出する。ＷＴ，野生
型；−、トランスフェクトされていないもの。

【００１９】図６は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン
抗体７Ｅ６によって染色された免疫組織化学を表す。突
然変異−特異的７Ｅ６は散在型胃癌の腫瘍細胞（矢印）
を絶対的に検出する。非腫瘍腺（矢印の頭）は標識され
ていない。

【００２０】本発明者らは、散在性胃癌において突然変
異の典型的な形態−枠内突然変異（各々、塩基トリプレ
ットの多量体の欠失または点突然変異）の証拠を供する
に成功した（図１参照）。

【００２１】これらの特徴的突然変異により、我々は、
改変された蛋白質が全てのケースで生じ、さらに細胞に
よって発現されると結論することができた。この示唆の
証拠はＥ−カドヘリンを欠く細胞系（ＭＤＡ乳癌細胞）
（方法についての補足参照）への突然変異遺伝子のトラ
ンスフェクションによって得られた。安定にトランスフ
ェクトした細胞は細胞膜において突然変異蛋白質を発現
し；突然変異蛋白質の膜への位置付けは、試料としてエ
クソン９欠失を用いる免疫蛍光（図２）および電子顕微
鏡検（図３）によって明確に証明された。突然変異蛋白
質の乱されない膜への位置付けは診断および治療におけ
るさらなる使用で非常に重要である。

【００２２】塩基配列の喪失または点突然変異の存在
は、各々、転写の連続性を維持しつつ新しくてユニーク
で誤りのないＲＮＡ配列を生じる。次いで、この「誤
り」は引き続いての転写の間に改変されたアミノ酸配列
によって蛋白質中に繋ぎ止められる。突然変異によって
生じた新しい蛋白質配列は表３に詳細にリストする。

【００２３】個々の腫瘍細胞はこれらの配列によって、
すなわちそれらの突然変異したＥ−カドヘリン遺伝子に
よって誤りなく標識される。いくつかの遺伝子データバ
ンク（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯ
Ｔ／ＰＤＢを介する、リリース３２．０）で行ったサー
チ（相同性の比較）により、現在までに知られているい
ずれの配列に対する類似性も供されなかった。初期の胃
癌を突然変異事象のクローン性に関して調べた。これら
のケースにおいても突然変異は検出できたので（自身の
観察）、Ｅ−カドヘリンにおける突然変異は腫瘍進展の
経過における初期の事象であるに違いなく、恐らくは元
の悪性クローンに復帰する。

【００２４】

【表３】

【００２５】表３において、ダッシュ（／）は欠失の位
置を示し；蛋白質配列はこの位置から出発して改変され
る；下線を施した文字は点突然変異によって変化したア
ミノ酸を示す。

【００２６】表３に示したＥ−カドヘリン突然変異なら
びにさらに未だ未知の突然変異を例えば以下の診断およ
び治療目的で使用できる。

【００２７】迅速なＲＮＡ抽出およびそれに続くＰＣＲ
による突然変異の検出：記載した突然変異の特徴（主と
して欠失）は迅速な特異的テストに極めて適する：迅速
なＲＮＡ抽出（「方法」参照）と組み合わせた、突然変
異したエクソン領域を含む適当なプライマー（「方法」
参照）によるｃＤＮＡの分泌の増幅は、本発明の臨床的
利用を可能とする（時間因子）。この場合において、検
出は組織（例えば、バイオプシー、刺穿、サイトロジ
ー）および体液（例えば、血液）につき行うことができ
る。

【００２８】例として、胃癌患者のバイオプシーおよび
腹腔洗浄をＥ−カドヘリン遺伝子の突然変異につき調べ
た。８時間内に（図４参照）、Ｅ−カドヘリンにおける
改変を特異的に測定し、それにより、臨床問題に対して
イン−タイム情報を供することが可能である。ここに、
さらなる説明（「抗体／療法」参照）の文脈から分かる
ように、治療計画を迅速に行うことが可能であろう。基
本的には、この方法は胃癌の特異的初期検出に使用する
こともできる。また、それを未知の一次腫瘍（例えば、
乳癌）の場合において他の悪性腫瘍の異なる診断（例え
ば、転移のバイオプシー）で使用することが可能であ
る。

【００２９】抗体突然変異したＥ−カドヘリン蛋白質の膜位置決めおよび
腫瘍特異性の組合せは、まず、腫瘍細胞に排他的に向け
られたモノクローナル抗体の特異的生産を可能とした。

【００３０】本発明によって提供される腫瘍−特異的遺
伝子配列によって、まず、その配列が腫瘍細胞に排他的
に制限される対応する蛋白質を表すアミノ酸を検出する
ことが可能である。これによって、Ｅ−カドヘリンの突
然変異した領域に選択的に向けられた抗体を生成させる
ことができる。この仮説を証明するために、本発明者ら
は、例としてエクソン９欠失を用いて新しく生じた配列
を介して、短鎖化された膜貫通蛋白質に対するモノクロ
ーナル抗体を得ようとまず試みた（方法についての補足
参照）。この場合、突然変異領域が抗原決定基として適
しているか否かは明らかでなかった。というのは、この
エピトープの立体配置は未知だからである。２３のハイ
ブリドーマ（抗体産生クローン）が得られ、それらの特
異性をイン・ビトロでテストした（補足参照）。１のク
ローン（７Ｅ６−１）はエクソン９−欠失Ｅ−カドヘリ
ン蛋白質を認識することがウェスタンブロットでおよび
免疫蛍光によって判明した。７Ｅ６抗体は「正常」Ｅ−
カドヘリンを検出しない（図５）。７Ｅ６抗体を産生す
るこの細胞系はＤＳＭに寄託されている（受託番号ＤＳ
ＭＡＣＣ２２７７）（参照記号：デルタＣＡＤ−
９、クローン７Ｅ６−１）。７Ｅ６抗体は突然変異した
１２３２ｄｅｌ１８３を認識する。

【００３１】この抗体がホルマリン中に固定され、パラ
フィン中に封埋された物質に関して機能的であろうこと
は予測できなかった。まず、これは免疫組織化学的方法
による組織学的切片上の腫瘍細胞の特異的検出を可能と
する（図６）。同一切片上の非腫瘍細胞は標識されなか
った。それにより、突然変異分子を個々の細胞に割り当
てることが可能となった。本発明者らの知識によると、
匹敵する特異性を持つ腫瘍マーカーは未だ記載されてい
ない。

【００３２】受託番号ＡＣＣ２２７７の下でＤＳＭに
寄託されたハイブリドーマ細胞系は、本発明によって提
供されるモノクローナル抗体を産生する細胞系について
の例を表すに過ぎない。本発明によると、枠内突然変異
を認識するさらなる抗体が既に産生された。これらの抗
体を供することは当該分野で働く当業者の技量の範囲内
のものである。７Ｅ６モノクローナル抗体ならびにＥ−
カドヘリン突然変異に特異的に向けられた産生されたい
ずれの他の抗体も以下に記載する診断および治療で用い
ることができる。

【００３３】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体を用
いる診断免疫組織化学によるＥ−カドヘリンにおける欠陥に関す
るホルマリン固定されパラフィン封埋された組織の遡及
的調査見込みのある以下のイン・ビトロ試験：病気の進行の間
の可能なマーカーとしての腫瘍細胞の手術前、中、後の
播種性の評価のための散在性胃ＣＡについての基礎的ス
クリーニングとしての循環腫瘍細胞の検出用の血液；手
術前（ネオアジュバント）、手術中（腹膜、門静脈）お
よび手術後（添加剤またはアジュバント）治療にための
計画に関する突然変異Ｅ−カドヘリンの治療前検出のた
めの腫瘍バイオプシー；腫瘍細胞の測定（例えば、切除
の程度を保証する、除去の縁）のためのＯＰ調製；転移
および腫瘍細胞の検出（例えば、ミクロエンボルブメン
ト（ｍｉｃｒｏｅｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ））のためのリ
ンパ節；腹腔における播種性腫瘍細胞の測定のための洗
浄；播種性腫瘍細胞の測定（免疫組織化学）のための組
織；疑われる組織試料の鑑別診断評価のための特徴的Ｅ
−カドヘリン突然変異の免疫組織化学的測定のための癌
の鑑別診断；血液細胞（ＤＮＡ）におけるＥ−カドヘリ
ン突然変異の高危険群（「癌家系」）測定のスクーニン
グ；イン・ビボ前提要件：イムノシンチグラフィーによる腫
瘍細胞の治療使用特異的測定のための抗体のヒト化：治
療の間の対照のための、または、各々、成功した治療の
確認のためのおよび病気の治療後の対照のための手術計
画／治療計画の設定のための予備治療；突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による治療：突然
変異−特異的抗体に対する照射源の免疫照射治療カップ
リング；抗体に対するトキシン（例えば、シュードモナ
ス・トキシン）のイムノトキシン治療カップリング。突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による体細胞遺伝
子治療：ウイルス遺伝子発現系（例えば、アデノウイル
ス、またはＭＶＡ、ワクシニア−誘導発現ベクターとカ
ップリングさせた；非ウイルス遺伝子発現系（例えば、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ＋Ｔ７ＤＮＡベクター）と
カップリングさせた；特異的遺伝子導入のための可能な
方法；遺伝子工学：内因性免疫系についての腫瘍細胞を
標識するための補因子（例えば、Ｂ７）の取り込み；内
因性Ｔ細胞を活性化し、突然変異Ｅ−カドヘリン「少数
抗原」を有する腫瘍細胞に対する免疫反応を開始させる
ためのアロ抗原（外来性ＨＬＡ抗原、「主要抗原」）の
取り込み；アポトーシスを誘導する因子（例えば、ｐ５
３）の特異的取り込みによる腫瘍細胞の殺傷；野生型癌
遺伝子／サプレッサー遺伝子（例えば、Ｅ−カドヘリン
それ自体）の特異的取り込みによる悪性表現型の変換；
酵素の特異的包含により毒性を形成させるためのプロト
キシンの活性化（例えば、デアミナーゼ、５−フルオロ
シトシンの毒性５−フルオロウラシルへの変換）を用い
る可能な治療アプローチ。リボザイム例えば、マルチ薬物−耐性トランスポーターをコードす
るＲＮＡの部位特異的破壊Ｅ−カドヘリン突然変異の使用の分野を示すさらなる例骨髄パーチング：イン・ビトロ処理した骨髄における腫
瘍細胞の特異的測定および（例えば、抗体に結合したト
キシンによる）骨髄からの腫瘍細胞の特異的排除のため
の抗体の同時使用；抗原提示のための（腫瘍細胞に特異
的に向けられたＴ細胞クローンの活性化）突然変異Ｅ−
カドヘリンペプチド配列（表３参照）を樹状細胞にチャ
ージする免疫治療。

【００３４】蛋白質の細胞内変性は異なる長さを有する
ペプチドを生じさせる。９−１１アミノ酸の長さを持つ
ペプチドは細胞のＭＨＣによって「チェックされ」（ペ
プチド結合領域における結合能力は、個々のアミノ酸の
特定の配置に依存し、「非自己」および「自己」の間を
識別する）、もし特定の配列が非自己として認識されれ
ば、細胞表面に提示される。共刺激体の作用によって、
これは免疫反応に至り得る。本発明者らによって初めて
記載された突然変異Ｅ−カドヘリンおよび突然変異によ
って生じる他のペプチドのペプチド配列については、そ
れらのいくつかは非自己ペプチドとしてＭＨＣによって
提示されることが予測できる。この事象は患者において
免疫反応を刺激しないという事実は、抗原を提示するの
が乏しい腫瘍細胞の特性によって説明できるであろう。
見い出された突然変異スキャンニングペプチドを専門的
な抗原提示細胞（樹状細胞）に種々の長さで取り付ける
ことができる。この細胞に全ての必要な共刺激体が存在
するため、かかるＭＨＣ−ペプチド複合体に対する対応
するＴ細胞刺激が達成される。このようにして、免疫系
によって最初は無視された腫瘍細胞も次いで非自己とし
て認識され、排除される。

【００３５】この使用は特定の突然変異−特異的抗体を
必要としないが、本発明により記載される新しく生成し
たペプチドの配列についての知識を必要とする。

【００３６】本発明によると、以下の目的および方法
は、ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、および／またはｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く；突然変異したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に
向けられたモノクローナル抗体よりなる。

【００３７】ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生
じ、ＲＮＡレベルでエクソン８、エクソン９、またはオ
クソン１０における少なくとも１つの塩基トリプレット
またはその多量体の喪失に導く突然変異Ｅ−カドヘリン
の配列に向けられたモノクローナル抗体。

【００３８】以下の群：（式中、「／」は欠失の位置を示し、下線を施した文字
は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は
野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）の
少なくとも１つから選択された、野生型Ｅ−カドヘリン
と比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じた前記
アミノ酸配列の１以上の内の少なくとも１つの配列領域
を認識するモノクローナル抗体。

【００３９】また、本発明は、前記したモノクローナル
の少なくとも２種の混合物よりなる。

【００４０】本発明は、特に、突然変異した膜貫通Ｅ−
カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられた前記モ
ノクローナル抗体よりなる。

【００４１】本発明のさらなる具体例は、本発明の少な
くとも１つのモノクローナル抗体を含む胃癌細胞の検出
用免疫テストよりなる。

【００４２】さらに、本発明は以下の実施態様を含む：
ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、および／またはｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く；突然変異した配列を特異的に含むように選択されたＥ−
カドヘリンの突然変異したエクソン領域のＤＮＡおよび
ｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプロセス用のプライ
マーよりなる。

【００４３】突然変異した配列を特異的に含むように選
択され、かつ以下の群：の少なくとも１つのプライマーから遣択されたＥ−カド
ヘリンの突然変異したエクソンのＤＮＡおよびｃＤＮＡ
配列の増幅のためのＰＣＲプロセス用のプライマー。

【００４４】本発明は、突然変異したＥ−カドヘリンの
ＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはそれから誘導されたＲＮ
Ａに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸
を有効物質として含有し、ここに該ＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａが、ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、および／またはｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く；枠内突然変異を示す治療または診断手段よりなるのが特
に好ましい。

【００４５】さらに、本発明は、ストレンジェント条件
下で、以下のＤＮＡ配列もしくはその相補的鎖またはそ
れから誘導されるＲＮＡ配列の少なくともいくつかにハ
イブリダイズする核酸を含有し、ここに、少なくとも枠
内突然変異によって生じる配列領域も含まれる治療また
は診断手段よりなる。

【００４６】さらに、本発明により、ストリンジェント
条件下で前記核酸にハイブリダイズする核酸を有効物質
として含有する治療または診断手段よりなる。

【００４７】本発明の精神内にあるストレンジェント条
件は、本発明により定義された核酸への核酸の選択的か
つ検出可能な特異的結合を可能とする条件と定義され
る。ストレンジェント条件下でのこの種のハイブリダイ
ゼーションは、好ましくは、水性溶液中にて６８℃で、
あるいは５０％ホルムアミド中にて４２℃で行われるハ
イブリダイゼーション、および続いての水性溶液中での
６５℃の温度におけるフィルターの洗浄を意味し、しか
る後に、本発明により定義される核酸またはそれから誘
導されるＲＮＡへのプローブの結合を依然検出すること
ができる。要すれば、厳格さが低いハイブリダイゼーシ
ョンおよび／または洗浄条件を使用することもできる。

【００４８】本発明によって提供されるモノクローナル
抗体は胃癌、特に散在性胃癌の診断および治療に有用で
ある。

【００４９】治療では、本発明のモノクローナル抗体
を、例えば、胃癌細胞のすくなくともいくらかの選択的
排除のための手段に結合させることができる。この手段
は、好ましくは、トキシンまたは照射源を含むことがで
きる。

【００５０】また、本発明は、請求項でより詳細に特徴
付けたＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチド
よりなる。これらは腫瘍、特に胃癌の免疫治療に有用で
ある。

【００５１】本発明のさらなる実施態様において、以下
の工程：ａ．ヒト細胞を含有する試料物質を供し、ｂ．ヒト細胞からｍＲＮＡを回収し、ｃ．ｍＲＮＡを逆転写し、ｄ．請求項８または９記載のプライマーを用いてポリメ
ラーゼ鎖反応を行い、ｅ．ポリメラーゼ鎖反応の反応生成物を分離し分析す
る；ことによってヒト細胞を含有する試料物質中の腫瘍細胞
を測定する方法が記載される。

【００５２】また、本発明は、本発明によって提供され
るオリゴヌクレオチド配列を含有するベクターよりな
る。

【００５３】かくして、Ｅ−カドヘリンの枠内突然変異
を胃癌の診断および治療で使用できることが本発明によ
って判明した。「枠内突然変異」なる用語は、ＤＮＡレ
ベルで起こるＥ−カドヘリンにおける突然変異または欠
失を意味することを意図し、これはＲＮＡレベルで欠失
または塩基交換に導くが、該欠失または該突然変異も読
枠置換には至らない。

【００５４】方法１．新しいＥ−カドヘリン突然変異についての調査胃癌に罹った６３人の患者の組織を調べた。切除後の新
鮮な腫瘍組織を液体窒素中で深−凍結した。深−凍結組
織試料の全ＲＮＡを標準的な手法（シソチオシアン酸グ
アニジウム抽出およびＣｓＣｌ遠心）を用いて単離し
た。２μｇのＲＮＡの逆転写に続き、ＰＣＲによってＥ
−カドヘリンｃＤＮＡの全暗号領域を増幅した。使用し
たＰＣＲプライマーを表４にリストする。全てのＰＣＲ
反応についての増幅条件は以下の通りである：９４℃に
おける１分間の変性；５５℃における１分間のプライマ
ーアニーリング；および７２℃における１分間の伸長。
Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅緩衝液（１．５ｍＭＭ
ｇＣｌ２）はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｏｒｐ．，Ｆ
ｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。Ｂ
ｉｏｍｅｄＰＣＲデバイス（Ｂｉｏｍｅｄ−Ｌａｂｏ
ｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｌ，Ｏｂｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｅ
ｉｍ）を用いた。増幅の産物はアガロースゲル電気泳動
によってチェックし、引き続いてガラスミルク（Ｇｅｎ
ｅＣｌｅａｎＩＩ，Ｂｉｏ１０１Ｉｎｃ．，ＬａＪ
ｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製した。しかる
後、単離したＤＮＡ増幅体の全長を配列決定した（Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０／ＵＳＢ，Ｃ
ｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ，ＵＳＡ）。

【００５５】

【表４】

【００５６】「ヌクレオチド位置」はＥＭＢＬ／Ｇｅｎ
Ｂａｎｋデータバンク、アクセス番号Ｚ１３００９で利
用できるＥ−カドヘリン配列をいう。

【００５７】２．免疫組織化学的試験（突然変異−特異
的ではない）ホルマリン中に固定し、パラフィン中に封埋された組織
の保存物質を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン
酸およびマイクロ波での処理に続き、組織試料を１％Ｈ
２Ｏ２中にて１５分間インキュベートして、内因性ペル
オキシダーゼをブロックした。Ｅ−カドヘリン−特異的
免疫反応性の測定のために、組織をモノクローナル抗体
ＨＥＣＤ−１（ＴａｋａｒａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ
ｓ，日本国，１：５００希釈）と共に４℃で１６時間イ
ンキュベートした。抗体結合の可視化はアビジン−ビオ
チン複合体（ＡＢＣ）およびペルオキシダーゼ方法（Ａ
ＢＣＥｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇ
ｇａｍｅ，ＣＡ；ＳｉｇｍａＦａｓｔＤＡＢ，Ｓｉ
ｇｍａｎＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を用いて行った。
核小体の逆染色にはｈｅｍａｌｕｍを用いた。また、全
ての腫瘍切片は対照としての非悪性粘膜の一部を示し
た。陰性対照はＨＥＣＤ−１抗体をリン酸緩衝化ＮａＣ
ｌによって置き換えることによって行った。

【００５８】３．Ｅ−カドヘリンの発現ベクターへのク
ローニング突然変異Ｅ−カドヘリンの細胞内位置を調べるために、
突然変異分子を発現ベクターにクローン化した。例とし
て、ヒト野生型Ｅ−カドヘリンに加えてＥ−カドヘリン
ｍＲＮＡの４つの異なる突然変異体を発現ベクターにク
ローン化した。これらの４つの突然変異のうち２つがエ
クソンのうちの１つの完全に喪失、エクソン８（１２９
ｂｐ）の欠失またはエクソン９（１８３ｂｐ）の欠失い
ずれかを呈した。もう１つの突然変異はエクソン１０
（６３ｂｐ）の部分的欠失を示す。第４の突然変異はエ
クソン８における塩基交換よりなり、これは潜在的なカ
ルシウム結合部位破壊する。発現クローニングニ考えら
れた突然変異の全てはＥ−カドヘリンの細胞内領域にあ
る（全ての突然変異につき図１参照）。

【００５９】クローニングのための出発物質は、各突然
変異（前記参照）が同定された散在性胃癌の新鮮な物質
から単離した全ＲＮＡであった。逆転写の後に得られた
野生型Ｅ−カドヘリンおよび突然変異の各ｃＤＮＡを２
つの部分的断片（Ａ＋Ｂ）の形態で増幅した（図７参
照）。一緒にすると、２つの部分的断片は２６４９ｂｐ
（野生型）よりなるＥ−カドヘリンの完全な暗号領域よ
りなる。断片Ａ（５’領域）の増幅はプライマーＡＴＧ
およびｒＥＸ１０を用いて行った（表５参照）。野生型
ｍＲＮＡの３’断片（Ｂ）、エクソン９欠失、エクソン
１０における部分的欠失、およびエクソン８における点
突然変異の増幅には、プライマーＥｘ８−ｒ３’／２／
ｎｅｕの対を使用した。エクソン８欠失突然変異体の断
片Ｂ’の増幅は対Ｅｘ９／１−ｒ３’／２／ｎｅｕを用
いて行った。

【００６０】増幅された部分的断片ＡおよびＢを、各
々、ＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にク
ローン化した。これらのベクターを用い、特異的ＴＡ塩
基対合によって生じたＰＣＲの直接的かつ効果的なクロ
ーニングが達成された。全ての５つのカドヘリンｃＤＮ
Ａ（野生型＋４つの突然変異体）の２つの部分的ｃＤＮ
Ａ断片を、本明細書には詳細に記載しないが十分に当業
者の技量内にある異なるクローニング戦略を用いるクロ
ーニングによって一緒に適当に連結した。このようにし
て、ＰＣＲＩＩベクターにおける全ての５つのｃＤＮＡ
の構築体が得られた。

【００６１】増幅の間に主として生成したかも知れない
クローニング人工物（Ｔａｑの誤り）を排除するため
に、全ての５つのｃＤＮＡを、ベクター／カドヘリン連
結領域を含めたそれらの全長の配列を決定することによ
って調べた。

【００６２】［以下余白］

【表５】

【００６３】さらなる工程において、配列決定によって
確認されたカドヘリン構築体を真核生物発現ベクターに
クローン化した。一方、所望のｃＤＮＡの発現に加え
て、発現された細胞クローンの選択（ネオマイシン耐性
遺伝子の発現）を可能とする商業的に入手可能なベクタ
ーｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を選択し、
他方、第２のベクターとして、ネズミ野生型Ｅ−カドヘ
リン構築体のトランスフェクションで既に成功して使用
たれｐＢＡＴベクターを用いた（Ｎｏｓｅ，Ａ．，Ｎａ
ｇａｆｕｃｈｉ，Ａ．，Ｔａｋｅｉｃｈｉ，Ｍ．，「発
現された組換えカドヘリンはモデル系において細胞ソー
ティングを媒介する」Ｃｅｌｌ１９８８，５４：９９
３−１００１）。

【００６４】４．一過性トランスフェクションおよびウ
ェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電子顕微
鏡検によるＥ−カドヘリンの検出トランスフェクションのためにＣａＰＯ_４沈殿が確立さ
れている。該方法のトランスフェクション効率は対照と
してｐＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用
いて評価した。該ベクターは、色素Ｘ−ｇａｌ（青色）
への変換後に該ベクターが取り込まれた細胞の検出を可
能とするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該方
法の効率は１０％の範囲にあり、これは一過性トランス
フェクションには非常に良好な値である。

【００６５】ｃＤＮＡの上流に転写認識領域（Ｋｏｚａ
ｋ配列）およびそのクローニング部位を含有する５’非
翻訳領域の増幅後の発現実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−
４３５Ｓ細胞、ＭＩＡＰａＣａ−２、Ｅ−カドヘリン
を欠く膵臓細胞系において、およびＮｅｕｒｏ２Ａ
（神経繊維芽細胞）細胞において、一過的に改変したＥ
−カドヘリンｃＤＮＡ構築体を発現させることができ
た。

【００６６】細胞培養におけるＥ−カドヘリンの測定
は、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電
子顕微鏡検によって行った。まず、（トランスフェクト
したまたはトランスフェクトしてない）細胞のＳＤＳ溶
解を行って、ウェスタンブロッティング用の全細胞溶解
物を調製した。これを行うのに、本発明者らは、引き続
いてのゲル泳動の間に溶解物の調査に必要な不規則電解
質移動度を得た。別法として、トリトンＸ−１００溶解
による細胞抽出物をテストした。ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動およびクーマシー染色による抽出物の調査
は、細胞の破壊が効果的であることを示した。従って、
トリトン溶解を全ての引き続いての実験で用いた。

【００６７】本発明者らは、Ｅ−カドヘリンの特異的測
定のためにＥ−カドヘリンに対する４つの異なるモノク
ローナル抗体（ＨＥＣＤ−１，ＴａｋａｒａＢｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌｓ，日本；ＡＭＳＴ１０，ＳａｘｏｎＢ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ；ＤＥＣＭＡ−１，Ｓｉｇｍａ；
ＡＮＴＩ−Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ，ＡｆｆｉｎｉｔｙＲ
ｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔＬｉｍｉｔｅｄ）を
用いた。ウェスタンブロッティングの間の抗原−抗体複
合体の検出は第２のペルオキシダーゼ標識抗体を用いて
ルミネッセンス反応（ＥＣＬ−Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ）によって行った。それらは異なる強度で反
応したが、テストした抗体の全ては、Ｅ−カドヘリン陽
性対照細胞系Ａ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）を含む、
および野生型Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクト
されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を含む細胞抽出物に
おいて特異的反応を示した。トランスフェクトしていな
い系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＩＡＰａＣａ−２お
よびＮｅｕｒｏ２Ａの抽出物では陽性シグナルは検出
できなかった。

【００６８】免疫蛍光を行うためには、カバーグラス上
に撒いた細胞をメタノールによって固定し、Ｅ−カドヘ
リンに特異的な抗体ＨＥＣＤ−１（野生型Ｅ−カドヘリ
ンおよび突然変異した、例えばエクソン９が欠失したＥ
−カドヘリンを認識）によって標識した。二次抗体とし
て、ローダミン−（ＴＲＩＴＣ−）カップリングのヤギ
抗−マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。

【００６９】トランスフェクションが成功したか否かを
免疫蛍光によって判断するために、トランスフェクトし
ていないＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、および突然変異
Ｅ−カドヘリンによって、および野生型Ｅ−カドヘリン
によってトランスフェクトした細胞を同時に調べた。固
定およびＥ−カドヘリンに特異的な金標識抗体（ＨＥＣ
Ｄ−１）とのインキュベーションの後、標識細胞をｅｐ
ｏｎ中に封埋し、酢酸ウラニル／鉛でコントラストを着
けた。トランスフェクトしていないＭＤＡ−ＭＢ−４３
５Ｓ細胞では標識は検出されず、他方、トランスフェク
トした細胞系は膜と結合した金標識を示した。すなわ
ち、野生型Ｅ−カドヘリンならびに突然変異したＥ−カ
ドヘリン（例えば、エクソン９欠失を有する、図３参
照）が膜に繋ぎ止められた。

【００７０】５．Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞
系本発明者らは野生型ならびに突然変異したＥ−カドヘリ
ンを一過的にトランスフェクトした細胞で同定するのに
成功した後、Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞の調
製を開始した。これは、各ｐＢＡＴ構築（「クローニン
グ」参照）およびＥ−カドヘリンを含まないが代わりに
ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＡＴベクターでＭＤ
Ａ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を共トランスフェクトするこに
よって行った。ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のエクソン９
の欠失を呈する３つの細胞系（Ｄｅｌ９）および野生型
ヒトＥ−カトヘリンを保有する３つの系（ＷＴ）が確立
された。Ｄｅｌ９系およびＷＴ系のＲＴ−ＰＣＲによる
ｍＲＮＡの調査は、予期された断片サイズ（野生型につ
いての正常サイズのｍＲＮＡ（７７９ｂｐ）；Ｄｅｌ−
９系についての短鎖化ｍＲＮＡ（５９６ｂｐ）、この場
合、野生型Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡは発現されなかっ
た）を示した。ＰＣＲ増幅はプライマーＥｘ７およびｒ
ＥＸ１１（表５参照）を用いて行った。安定にトランス
フェクトされたＤｅｌ−９系の、およびＷＴ系のうちの
１つの抽出物のウェスタンブロッティングは明らかにＥ
−カドヘリン蛋白質を検出した。

【００７１】免疫蛍光を用いるＷＴ系におけるＥ−カド
ヘリン発現の調査は、隣接細胞への接触部位において予
期された特徴の分布を明らかにした。ＨＥＣＤ−１抗体
を用い、Ｄｅｌ−９細胞系も細胞−細胞結合においてＥ
−カドヘリンの標識を示した（図２）。

【００７２】６．（例として腹腔洗浄を用いる）迅速な
ＲＮＡ抽出および引き続くＰＣＲによる突然変異の測定洗浄凋製物中の細胞の沈降およびＲＮＡ抽出（Ｒｎｅａ
ｓｙＲａｐｉｄ抽出キット、Ｑｕｉａｇｅｎ）の後、
ＲＮＡを逆転写し、得られたＥ−カドヘリンｃＤＮＡの
全長をＰＣＲ（プライマーおよび条件は前記）によって
増幅する。Ｅ−カドヘリン突然変異は主として枠内欠失
を含むので、これらはアガロースゲル電気泳動によって
迅速かつ安全に検出される。かくして、洗浄を受容して
既に９時間経った後、Ｅ−カドヘリンにおける可能な欠
失、例えば、エクソン８またはエクソン９の喪失が検出
でき、それにより、腹腔中の播種性腫瘍細胞の検出が可
能である。この情報のため、臨床判断のクールに直接影
響し得る（例えば、さらなる腹腔内治療）。

【００７３】これにより、検出の高度に特異的な方法を
迅速かつ安全に、また少量の腫瘍細胞でもって行うこと
ができる。Ｅ−カドヘリン突然変異の腫瘍特異性は、炎
症中皮細胞のごとき「腫瘍様」形態を持つ細胞に関する
曖昧性を排除することを可能とする。

【００７４】７．（例としてエクソン９欠失に特異的な
抗体７Ｅ６を用いる）突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン
抗体の調製およびテストペプチド合成。モデル４３０Ａペプチド合成器（Ａｐｐ
ｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙ，ＣＡ，速−Ｆｍｏｃ修飾に適合）（ペプチド配
列：エクソン９のＥ−カドヘリン欠失、表３１２３２
ｄｅｌ１８３参照）を用いて以下のペプチドを合成し
た：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ。アミノ酸Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＡｓｐおよびＧｌｕ
は側鎖を保護して合成した。９５％トリフルオロ酢酸中
でペプチドを合成樹脂から切り離し、ｔｅｒｔ−ブチル
エーテルで沈殿させ、凍結乾燥した。しかる後、原料生
成物を０．１％トリフルオロ酢酸に溶解させ、７０％ア
セトニトリル中の直線グラジエントにての逆相カラム
（Ａｑｕａｐｏｒｅ３００Ａ，ＣＳ，Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。生成物の
純度を電気スプレイイオン化によってモデルＡＰ１００
マススペクトロメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）
でテストした。

【００７５】担体へのカップリングおよび免疫化：Ｍｅ
ｇａｔｈｕｒａｃｒｅｎｕｌａｔａからのキイホール
リンペットヘモシアニン（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂａ
ｄＳｏｄｅｎ）を免疫化のための担体蛋白質として用
い、室温にて１−エチル−３−（ジメチルアミノ−プロ
ピル）カルボジイミドを用い、０．５ＭＮ−メチルイ
ミダゾール緩衝液（Ｓｇｉｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ
ｅｉｎｈｅｉｍ）ｐＨ７．０中でペプチドに結合させ
た。合計して、２．８ｍｇのペプチドを２．０ｍｇのヘ
モシアニンにカップリングさせた。リン酸緩衝化生理食
塩水（ＰＢＳ）に対する透析の後、得られた溶液を免疫
化に用いた。同一の方法を、２ｍｇのペプチドの２ｍｇ
の４×結晶化ウシ血清アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅ
ｒｋｅ，Ｍａｒｂｕｒｇ）へのカップリングに用い、こ
れをＥＬＩＳＡテストにおけるハイブリドーマ培養上清
をテストするのに用いた。免疫化はＬｏｕ／Ｃラットで
行い、５０μｇのＫＬＨがカップリングしたヘプチドを
５００μｌＰＢＳを用いて希釈し、同一量のＣＦＡに
よって乳化した。５００μｌの得られたエマルジョン
を、各々、腹腔内および皮下適用した。３カ月後、ＣＦ
Ａ無しでＫＬＨにカップリングしたペプチドを用いてブ
ースター注射を行った。ブースター注射の３日後に注入
を行った。ネズミ形質細胞腫細胞系Ｐ３×６３Ａｇ
８．６５３を注入細胞系として供した。ＥＬＩＳＡを行
って、特異的ペプチドについて、および対照として供す
る同一のカップリング化学を用いてＢＳＡにカップリン
グさせた無関係ペプチドにつきテストした。特異的ペプ
チドと絶対的に反応するハイブリドーマを凍結し、その
上清をさらなる分析に付した。サブクラス−特異的モノ
クローナル抗体を用いてサブクラスを測定した。

【００７６】ＦＡＣＳ分析：エクソン９欠失Ｅ−カドヘ
リン（前記参照）でトランスフェクトした２００，００
０のＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞またはトランスフェク
トしなかった２００，０００ののＭＤＡ−ＭＢ−４３５
Ｓ細胞を、各々、５０μｌのハイブリドーマ上清と一緒
にインキュベートした。５０μｌの安定に希釈したヤギ
−抗−ラットＦＩＴＣを３０分間で添加して、結合抗体
を検出した。細胞をＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ）で
分析した。ｍａｂ７Ｅ６は「ラットＩｇＧ１」サブク
ラスに属し、ＦＡＣｓｃａｎで最高の強度を示す。

【００７７】免疫蛍光：免疫蛍光を行うため、カバーグ
ラス上に撒いた細胞（各々、エクソン９欠失Ｅ−カドヘ
リンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細
胞、またはトランスフェクトしなかったＭＤＡ−ＭＢ−
４３５Ｓ細胞）をメタノールで固定し、Ｅ−カドヘリン
突然変異につき特異的な抗体７Ｅ６によって標識した。
二次抗体として、ＦＩＴＣがカップリングしたヤギ−抗
−ラット抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。

【００７８】ウェスタン−ブロッティング：Ｅ−カドヘ
リンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細
胞（野生型またはエクソン９欠失Ｅ−カドヘリンいずれ
かでトランスフェクトしたもの）の、およびさらなる細
胞系の細胞抽出物を、ウェスタンブロット上にて突然変
異−特異的抗体によって調べた。抗体７Ｅ６を用い、ト
ランスフェクトしなかった系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、
ＭＩＡＰａＣａ−２（ヒト膵臓癌）、Ｎｅｕｒｏ２
Ａ、およびＡ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）の抽出物で
は陽性シグナルは検出できなかった。また、野生型Ｅ−
カドヘリンでトランスフェクトした細胞は７Ｅ６でシグ
ナルを示さなかった。突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン
抗体７Ｅ６と反応した唯一の細胞系はエクソン９欠失Ｅ
−カドヘリンによってトランスフェクトしたＭＤＡ−Ｍ
Ｂ−４３５Ｓであった。

【００７９】免疫組織化学：Ｅ−カドヘリンのエクソン
９の喪失が分子生物学によって検出された、胃癌患者の
保存物質（ホルマリン固定し、パラフィン封埋した組
織）を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン酸およ
びマイクロ波での処理の後、組織試料を１％Ｈ_２Ｏ_２中
で１５分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼ
をブロックした。Ｅ−カドヘリン突然変異−特異的免疫
反応性の検出には、組織を４℃で７Ｅ６モノクローナル
抗体と共に１６時間にわたってインキュベートした。抗
体の結合をアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）および
ペルオキシダーゼ方法（ＡＢＣＥｌｉｔｅキット、Ｖ
ｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ；Ｓｉｇｍａ
ＦａｓｔＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｍｈｏｆ
ｅｎ）を用いて可視化した。核小体の逆染色はｈｅｍａ
ｌｕｍを用いて行った。腫瘍切片の全ては対照としての
非悪性粘膜の部分を示した。陰性対照はリン酸緩衝化Ｎ
ａＣｌによって７Ｅ６抗体を置き換えることによって行
った。

【００８０】

【発明の効果】本発明により、散在性胃癌の特異的検出
に有用なモノクローナル抗体が提供される。また、散在
性胃癌の検出および治療に有用な治療および診断手段が
提供される。［以下余白］

【００８１】

【配列表】

（１）一般情報（ｉ）出願人：（Ａ）名称：ＧＳＦ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒ
ｕｍｆｕｅｒＵｍｗｅｌｔｕｎｄＧｅｓｕｎｄｈ
ｅｉｔＧｍｂＨ（Ｂ）通り：ＩｎｇｏｌｓｔａｅｄｔｅｒＬａｎｄ
ｓｔｒ．１（Ｃ）都市名：Ｏｂｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ（Ｅ）国名：ドイツ国（Ｆ）郵便番号：８５７６４（ｉｉ）発明の名称：ヒト悪性腫瘍の診断および治療
の基礎としてのＥ−カドヘリンの突然変異体（ｉｉｉ）配列の数：４１（ｖ）コンピューターが読み込むことのできる形態：（Ａ）媒体種：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／Ｍ
Ｓ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩ
ｎ）リリース＃１．０、バージョン＃１．３０（ＥＰＯ）（ｖｉ）前出願の情報：（Ａ）出願番号：ＤＥ１９６２９９３８．１（Ｂ）出願日：１９９６年７月２４日

【００８２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

【００８３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【００８４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”突然変異”Ｅ−カド
ヘリン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１０３６ｄｅｌ１５（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

【００８５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１１０３ｄｅｌ１２９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：

【００８６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
５の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１２３２ｄｅｌ１８３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：５：

【００８７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１４１４ｄｅｌ６９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：６：

【００８８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：Ａｓｐ３７０Ａｌａ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：７：

【００８９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：Ｖａｌ５９８Ｇｌｎ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：８：

【００９０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：Ａｒｇ５９８Ｇｌｎ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：９：

【００９１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：８２６ｄｅｌ９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０：

【００９２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ａｔｇ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１：

【００９３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （Ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）ライブラリー名：Ｅｘ８（ｘｉ）配列：ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１２：

【００９４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ９／１（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１３：

【００９５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ１０（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１４：

【００９６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒ３’／２／ｎｅｕ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１５：

【００９７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）類の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ７（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１６：

【００９８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”プライマー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ１１（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１７：

【００９９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”順方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ＡＴＧ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８：

【０１００】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
１９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ２４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”順方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ５（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１９：

【０１０１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”順方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ９／２ａ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２０：

【０１０２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”順方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ１０／２（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２１：

【０１０３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”順方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：Ｅｘ１３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２２：

【０１０４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”逆方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ６（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２３：

【０１０５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”逆方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ１０／２（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２４：

【０１０６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”逆方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ１１（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２５：

【０１０７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”逆方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒＥｘ１３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２６：

【０１０８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：他の核酸（Ａ）配列の種類：／ｄｅｓｃ＝”逆方向プライマ
ー” （ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ｒ３ｐｒｉｍｅ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２７：

【０１０９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：５６３ｄｅｌ６３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２８：

【０１１０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
２９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：７０６ｄｅｌ１９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２９：

【０１１１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１０３６ｄｅｌ１５（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３０：

【０１１２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１１０３ｄｅｌ１２９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３１：

【０１１３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１２３２ｄｅｌ１８３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３２：

【０１１４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：５７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：１４１４ｄｅｌ６９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３３：

【０１１５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体土の位置：Ａｓｐ３７０Ａｌａ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３４：

【０１１６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：Ｖａｌ４７３Ａｓｐ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３５：

【０１１７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：Ａｒｇ５９８Ｇｌｎ（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３６：

【０１１８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：６０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎮状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：８２６ｄｅｌ９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３７：

【０１１９】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：５６３ｄｅｌ６３（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３８：

【０１２０】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
３９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名：突然変異Ｅ−カドヘリ
ン（ｖｉｉｉ）：ゲノム内での位置：（Ｂ）：染色体上の位置：７０６ｄｅｌ９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３９：

【０１２１】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４０の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４０：

【０１２２】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４１：

【０１２３】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４２：

【０１２４】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４３：

【０１２５】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４４：

【０１２６】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４５：

【０１２７】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４６：

【０１２８】（２）配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：
４７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：ヒト（Ｃ）個体．単離クローン名： ”正常”Ｅ−カドヘリ
ン（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４７：［以下余白］

【図面の簡単な説明】

【図１】典型的には枠内欠失である散在性胃癌におけ
るＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。

【図２】免疫蛍光による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜
位置を表す顕微鏡写真である。

【図３】免疫電子顕微鏡検による突然変異Ｅ−カドヘ
リンの膜位置を表す顕微鏡写真である。

【図４】本発明によるＥ−カドヘリン突然変異の迅速
な診断のフローダイアグラムである。

【図５】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６
によって染色されたウェスタンブロットを示す写真であ
る。

【図６】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６
によって染色された免疫組織を表す顕微鏡写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/09 ＺＮＡ 33/574 ＤＣ１２Ｐ 21/08 ＡＣ１２Ｑ 1/68 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/00 Ｃ 33/577 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者カール−フリードリッヒ・ベッカードイツ・Ｄ−85748・ガルシング・バイ・ミュンヘン・ローゼンシュトラーセ・37 (72)発明者エリーザベト・クレマードイツ・Ｄ−85354・フライジング・ウンテレ・ハウプトシュトラーセ・28 (72)発明者マンフレート・オイリッツドイツ・Ｄ−81677・ミュンヘン・ツァウバーシュトラーセ・39 (72)発明者クリストーフ・シューマッハードイツ・Ｄ−80639・ミュンヘン・ローマンシュトラーセ・４

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡレベルでの枠内突然変異によって
生じ、少なくとも、ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、またはｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く、突然変異したＥ−カド
ヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたモノクロー
ナル抗体。
【請求項２】前記抗体が、ＤＮＡレベルでの枠内突然
変異によって生じ、ＲＮＡレベルでエクソン８、エクソ
ン９、またはエクソン１０における少なくとも１つの塩
基トリプレットまたはその多量体の喪失に導く突然変異
したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に向けられたことを
特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】該抗体が、以下の群：（式中、「／」は欠失の位置を示し、下線を施した文字
は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は
野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）の
少なくとも１つから選択される、野生型Ｅ−カドヘリン
と比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じた前記
アミノ酸配列の少なくとも１つ内の配列領域を認識する
ことを特徴とする請求項１または２記載のモノクローナ
ル抗体。
【請求項４】請求項３記載の少なくとも１のアミノ酸
配列に特異的に向けられた少なくとも２つのモノクロー
ナル抗体の混合物からなるモノクローナル抗体。
【請求項５】前記抗体が突然変異した膜貫通Ｅ−カド
ヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたことを特徴
とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】細胞系がハイブリドーマ細胞系デルタＣ
ＡＤ−９、クローン７Ｅ６−１、受託番号ＤＳＭＡＣ
Ｃ２２７７であることを特徴とする請求項１記載のモ
ノクローナル抗体を産生する細胞系。
【請求項７】請求項１記載の少なくとも１つのモノク
ローナル抗体を含む胃癌細胞の検出用免疫試験方法。
【請求項８】ＤＮＡレベルでの枠内突然変異によって
生じ、少なくともａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導ぎ、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、またはｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く、突然変異した配列を特
異的に含むように選択されたＥ−カドヘリンの突然変異
したエクソン領域のＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列の増幅の
ためのＰＣＲプロセス用プライマー。
【請求項９】突然変異したＥ−カドヘリン配列を特異
的に含むように選択され、かつ以下の群：の少なくとも１つのプライマーから選択されるＥ−カド
ヘリンの突然変異したエクソンのＤＮＡおよびｃＤＮＡ
配列の増幅のための請求項８記載のＰＣＲプロセス用プ
ライマー。
【請求項１０】突然変異したＥ−カドヘリンのＤＮＡ
もしくはｃＤＮＡまたはそれから誘導されたＲＮＡに特
異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を有効
物質として含有し、該ＤＮＡまたはｃＤＮＡか、少なく
ともａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続い
て野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失に導く、またはｂ．ＲＮＡレベルてエクソン中に少なくとも１つの塩基
トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導
き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくと
も１つのアミノ酸の交換に導く、枠内突然変異に導くこ
とを特徴とする治療または診断手段。
【請求項１１】前記手段が、少なくともストレンジェ
ント条件下で、下記のＤＮＡ配列：もしくはその相補的鎖またはそれから誘導されるＲＮＡ
配列の少なくともいくつかにハイブリダイズする少なく
とも１の核酸を有効物質として含有し、少なくとも枠内
突然変異によって生じる配列領域も含まれることを特徴
とする請求項１０記載の手段。
【請求項１２】前記核酸がストリンジェント条件下で
ハイブリダイズすることを特徴とする請求項１０または
１１記載の手段。
【請求項１３】胃癌の診断および治療のための１以上
の請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗
体の使用。
【請求項１４】治療用のモノクローナル抗体が少なく
とも複数の胃癌細胞の選択的排除のための手段に結合す
ることを特徴とする請求項１３記載の使用。
【請求項１５】モノクローナル抗休をトキシンまたは
照射源に結合することを特徴とする請求項１４記載の使
用。
【請求項１６】以下の群：（式中、「／」は欠失の位置を示し、下線を施した文字
は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は
野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）の
少なくとも１つの配列から選択される、野生型Ｅ−カド
ヘリンと比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じ
た前記オリゴヌクレオチドの１つの少なくともアミノ酸
配列領域をコードすることを特徴とするＤＮＡオリゴヌ
クレオチド。
【請求項１７】請求項１６記載のＤＮＡオリゴヌクレ
オチドの１つに少なくともストリンジェント条件下でハ
イブリダイズすることを特徴とするＤＮＡオリゴヌタレ
オチド。
【請求項１８】以下の群：（式中、「／」は欠失の位置を示し、下線を施した文字
は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は
野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）の
少なくとも１つの配列から選択される、野生型Ｅ−カド
ヘリンと比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じ
た前記アミノ酸配列の少なくとも１つの少なくとも配列
領域を含有することを特徴とするオリゴペプチド。
【請求項１９】ａ．ヒト細胞を含有する試料物質を供
し、ｂ．ヒト細胞からｍＲＮＡを回収し、ｃ．ｍＲＮＡを逆転写し、ｄ．請求項８または９記載のプライマーを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応を行い、ｅ．ポリメラーゼ連鎖反応の反応生成物を分離し分析す
る；工程からなるヒト細胞を含む試料物質中の腫瘍細胞の検
出方法。
【請求項２０】腫瘍細胞が胃癌細胞であることを特徴
とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】腫瘍の免疫療法のための請求項１６ま
たは１７記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２２】胃癌細胞の免疫療法のための請求項２
１記載の使用。