JP3623342B2 - ヒト悪性腫瘍の診断および治療の基礎としてのｅ−カドヘリンの突然変異体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、突然変異した膜貫通Ｅ−カドヘリンに対して特異的に向けられ、胃癌の測定に有用なモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
死亡原因の統計的見積りは悪性腫瘍が世界的に第一位であることを示す。これらの腫瘍のうち、国際的に胃癌は死に至る腫瘍の第二位を占める。ミクロサテライトの不安定性および遺伝子ｐ５３ ＡＰＣ ＤＣＣの改変を含めたいくつかの遺伝的改変が胃癌に関連して報告されている（Ｔａｈａｒａ Ｅ：ヒト胃腸管癌における遺伝子改変 Ｃａｎｃｅｒ １９９５；７５：１４１０−１４１７）。組織形態学的には、２つのタイプの胃癌が区別され得る（Ｌａｕｒｅｎ Ｐ．： 「胃癌の２つの組織学的主要タイプ：散在性およびいわゆる腸−タイプの癌」 Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． １９６５：６４：３１−４９）：１つのタイプは腺分化を有する腸癌であり、他のタイプは組織構造が破壊された散在性癌からなる。これまで、この二元的進展および形態についての遺伝的基礎は明確とはされていない。恐らくは、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）分子の改変がこの点で重要であろう：Ｅ−カドヘリンは上皮組織の相互作用で鍵となる役割を演じる血友病膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）細胞接着分子である。１６のエクソンからなるＥ−カドヘリン遺伝子の初期の分子生物学研究は、突然変異が胃癌の形態および成長のタイプに寄与し得ることを示した（Ｂｅｃｋｅｒ Ｋ−Ｆ， Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＪ， Ｒｅｉｃｈ Ｕ， Ｂｅｃｋｅｒ Ｉ， Ｎｅｋａｒｄａ Ｈ， Ｓｉｅｗｅｒｔ ＪＲ， Ｈｏｆｌｅｒ Ｈ： 「Ｅ−カドヘリン遺伝子突然変異は散在性タイプの胃癌に対する糸口を与える」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４：５４（１４）：３８４５−３８５２）。
【０００３】
基本的には、悪性腫瘍の改変は挙動のある種の生物学的パターンの説明で興味がある；これらの現象は特別の特徴として、従って、腫瘍マーカーとして使用できる。これらの特徴は、直接的または間接的に評価できる細胞産物および細胞表面の典型的な特性を含む。今日まで、腫瘍細胞のみに制限された表面抗原または細胞産物の単離は成功していない。現在まで、正常組織に対する身体におけるある種の細胞特性（表面抗原、細胞内蛋白質、分泌された細胞産物）の増大した出現が悪性疾患の診断および治療の基礎として使用されてきた。
【０００４】
診断および治療におけるＥ−カドヘリンの使用状態
最初の公表は、特異的抗体を用いる免疫組織化学によって検出されたＥ−カドヘリンは腫瘍細胞において改変された発現パターンを示したことを報告している。Ｅ−カドヘリンの免疫反応性は腫瘍組織では部分的に低下しているか、あるいは存在しない（表１参照）。他の著者は、この事実は腫瘍における蛋白質の生産の減少（「下降調節」）の原因であると考えた（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，ＤＥ−Ａ−４１ １０ ４０５ Ａ１参照）。
【０００５】
【表１】
【０００６】
表１において、
ａ調べた患者の数を示す
ｂ「正常」組織と同様のＥ−カドヘリンの免疫反応性示す。
ｃ減少したまたは存在しない腫瘍におけるＥ−カドヘリン免疫反応性を示す。
表１の文献：
１：Ｓｈｉｎｏ Ｙ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ａ．，Ｙａｍａｄａ Ｙ．， Ｔａｎａｂｅ Ｍ．， Ｙａｍａｄａ Ｔ．， Ｍａｔｓｕｄａ Ｍ．， Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．， Ｔａｔｓｕｍｉ Ｍ．， Ｍｉｗａ Ｔ．， Ｎａｋａｎｏ Ｈ．：
「ヒト胃癌における免疫組織化学的Ｅ−カドヘリン発現の臨床病理学的評価」
Ｃａｎｃｅｒ １９９５； ７６：２１９３−２２０１
２：Ｂｒｉｔｏ Ｍ．Ｊ．， Ｊａｃｉｎｔｏ Ｌ．， Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ Ｊ．， Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ Ｍ．， Ｆｉｌｉｐｅ Ｍ．Ｔ．：
「胃癌におけるＥ−カドヘリン（細胞接着分子）」
Ｐａｔｈ． ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９９５；１９１：６２８（アブストラクト）
３：Ｍａｔｓｕｉ Ｓ．， ＳＨｉｏｚａｋｉ Ｈ．， Ｉｎｏｕｅ Ｍ．， Ｔａｍｕｒａ Ｓ．， Ｄｏｋｉ Ｙ．， Ｋａｄｐｗａｋｉ Ｔ．， Ｉｗａｚａｗａ Ｔ．， Ｓｈｉｍａｙａ Ｋ．， Ｎａｇａｆｕｃｈｉ Ａ．， Ｔｓｕｋｉｔａ Ｓ．， Ｍｏｒｉ Ｔ．：
「ヒト胃癌におけるアルファ−カテニンの免疫組織化学的評価」
Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ １９９４： ４２４： ３７５−３８１
４：Ｍａｙｅｒ Ｂ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ．Ｐ．， Ｌｅｉｔｌ Ｆ．， Ｊａｕｃｈ Ｋ．Ｗ．， Ｋｅｉｓｓ Ｍ．Ｍ．，Ｓｃｈｉｄｂｅｒｇ Ｆ．Ｗ．， Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ．， Ｆｕｎｋｅ Ｉ：
「主要な転移性胃癌におけるＥ−カドヘリン発現：下降調節は細胞分化および腺崩壊と相関する」
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９３； ５３：１６９０−１６９５
５：Ｓｈｉｍｏｙａｍａ Ｙ．， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ．：
「胃癌におけるＥ−およびＰ−カドヘリンの発現」
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９１：５１（８）：２１８５−２１９２
【０００７】
これらの現象に関する我々自身の考えは、まず、完全無欠のＥ−カドヘリン遺伝子を目指した。ＲＮＡ抽出、逆転写および直接ＤＮＡ配列決定の後、胃癌組織の分子生物学調査はＥ−カドヘリン遺伝子における欠陥を明らかとした。散在性サブタイプの胃癌をＥ−カドヘリン遺伝子の一部（エクソン６−１０および１３−１６）における遺伝子改変につき調べた。エクソン８および９の喪失、エクソン１０の部分的喪失、またはエクソン８の領域における点突然変異が観察された（Ｂｅｃｋｅｒ Ｋ−Ｆ， Ａｔｋｉｎｓｏｎ Ｍ．Ｊ．， Ｒｅｉｃｈ Ｕ．， Ｂｅｃｋｅｒ Ｉ．， Ｎｅｋａｒｄａ Ｈ．， Ｓｉｅｗｅｒｔ Ｊ．Ｒ．， Ｈｏｆｌｅｒ Ｈ：「Ｅ−カドヘリン遺伝子突然変異は散在性胃癌に対する糸口を提供する」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４；５４（１４）：３８４５−３８５２）。腸サブタイプ腫瘍は構造的改変に導く突然変異を示さなかった。見い出された突然変異の解析は、いくぶん高い頻度で個々の欠失が起こったが、点突然変異またはより小さい欠失が観察できたことを明らかとした。突然変異したＥ−カドヘリンに関するケースのいくつかの免疫組織化学的染色（抗体：ＨＥＣＤ−１、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， 日本国、形態学セクション参照） は、腫瘍細胞の膜貫通染色および非腫瘍粘膜の染色を顕著に示した。本発明者らは、腫瘍細胞の標識が野生型Ｅ−カドヘリンまたは突然変異Ｅ−カドヘリンの検出に対応するのかを区別することができなかった。一方、突然変異蛋白質が継続的に細胞膜に取り込まれ、Ｅ−カドヘリンに対する抗体（ＨＥＣＤ−１）が突然変異領域から離れたエピトープを認識する可能性があった。さらなる説明は、第２の突然変異していない対立遺伝子によって生成し、腫瘍細胞でやはり生産されている野生型Ｅ−カドヘリンへの該抗体の結合であり得た。まず、腫瘍のいくつかが染色を示さなかったという事実は、蛋白質の翻訳または安定性に影響を有するかも知れない、調べたエクソン６−１０および１３−１６から離れたさらなる突然変異の存在を我々に示唆した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、胃癌、特に散在性胃癌の検出に特に適したモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は請求項１により詳しく特徴付けたモノクローナル抗体に係る本発明によって達成される。本発明の好ましい実施態様は従属した二次的な請求項群に従って示される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
これまで調べられていなかったＥ−カドヘリンの領域（エクソン１−５、１１および１２）の解析、および散在性胃癌の１０のさらなるケースのＥ−カドヘリンのｃＤＮＡの配列決定は、散在性胃癌においてさらなる突然変異を明らかとした（「方法セクション」参照）。これらの新しく見い出された突然変異（表２）は、驚くべきことに、典型的なパターンを継続的に示した。全てのケースにおいて、これらの突然変異は読枠に影響しない塩基トリプレットの多重体であるか、あるいはそれらは点突然変異であった。これらの研究によって、本発明者らは、免疫反応性の喪失が翻訳−破壊突然変異によって引き起こされ得るという免疫組織化学的調査の後になされた示唆を排除することができた。胃癌の調査と平行して、他の上皮腫瘍も解析した。乳癌、食道ガン、および大腸癌のケースは胃癌のそれに対応するパターンは示さなかった。
【００１１】
【表２】
【００１２】
突然変異の特徴付けならびにさらなる腫瘍の配列決定に関して行ったさらなる研究は、未だ報告されておらず、癌のケースではユニークである原理に導いた：散在性胃癌におけるＥ−カドヘリンの改変は枠内突然変異であって（読枠の破壊ではない）。この結果は診断および治療目的で有用である。
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１４】
図１は、現在まで公知の散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異は、典型的には、枠内欠失である。突然変異は以下のものを表す：矢印は検出された突然変異を表す；翻訳されたＥ−カドヘリン配列は陰影を付した；数字を付したボックスはエクソンを表す；アミノ酸、続いてのコドン位置は「ミスセンス突然変異」を表す；接頭辞のない数字は欠失（ｄｅｌ）の位置を示し、「ｄｅｌ」の後の数字は失われた塩基対の数である。
【００１５】
図２は、免疫蛍光による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質（エクソン９欠失）はトランスフェクトされた細胞の細胞結合部（明るい線）で検出することができる。
【００１６】
図３は、免疫電子顕微鏡検による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質（矢印）はトランスフェクトされた細胞の膜で検出することができる。
【００１７】
図４は、本発明によるＥ−カドヘリン突然変異の迅速な診断のフローダイアグラムである。
【００１８】
図５は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色されたウェスタンブロット図である。突然変異−特異的ではないＥ−カドヘリン抗体ＨＥＣＤ−１とは対照的に、突然変異−特異的抗体７Ｅ６は突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質ｄｅｌ９、エクソン９欠失Ｅ−カドヘリンを絶対的に検出する。ＷＴ，野生型；−、トランスフェクトされていないもの。
【００１９】
図６は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色された免疫組織化学を表す。突然変異−特異的７Ｅ６は散在型胃癌の腫瘍細胞（矢印）を絶対的に検出する。非腫瘍腺（矢印の頭）は標識されていない。
【００２０】
本発明者らは、散在性胃癌において突然変異の典型的な形態−枠内突然変異（各々、塩基トリプレットの多量体の欠失または点突然変異）の証拠を供するに成功した（図１参照）。
【００２１】
これらの特徴的突然変異により、我々は、改変された蛋白質が全てのケースで生じ、さらに細胞によって発現されると結論することができた。この示唆の証拠はＥ−カドヘリンを欠く細胞系（ＭＤＡ乳癌細胞）（方法についての補足参照）への突然変異遺伝子のトランスフェクションによって得られた。安定にトランスフェクトした細胞は細胞膜において突然変異蛋白質を発現し；突然変異蛋白質の膜への位置付けは、試料としてエクソン９欠失を用いる免疫蛍光（図２）および電子顕微鏡検（図３）によって明確に証明された。突然変異蛋白質の乱されない膜への位置付けは診断および治療におけるさらなる使用で非常に重要である。
【００２２】
塩基配列の喪失または点突然変異の存在は、各々、転写の連続性を維持しつつ新しくてユニークで誤りのないＲＮＡ配列を生じる。次いで、この「誤り」は引き続いての転写の間に改変されたアミノ酸配列によって蛋白質中に繋ぎ止められる。突然変異によって生じた新しい蛋白質配列は表３に詳細にリストする。
【００２３】
個々の腫瘍細胞はこれらの配列によって、すなわちそれらの突然変異したＥ−カドヘリン遺伝子によって誤りなく標識される。いくつかの遺伝子データバンク（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＤＢを介する、リリース３２．０）で行ったサーチ（相同性の比較）により、現在までに知られているいずれの配列に対する類似性も供されなかった。初期の胃癌を突然変異事象のクローン性に関して調べた。これらのケースにおいても突然変異は検出できたので（自身の観察）、Ｅ−カドヘリンにおける突然変異は腫瘍進展の経過における初期の事象であるに違いなく、恐らくは元の悪性クローンに復帰する。
【００２４】
【表３】
【００２５】
表３において、ダッシュ（／）は欠失の位置を示し；蛋白質配列はこの位置から出発して改変される；下線を施した文字は点突然変異によって変化したアミノ酸を示す。
【００２６】
表３に示したＥ−カドヘリン突然変異ならびにさらに未だ未知の突然変異を例えば以下の診断および治療目的で使用できる。
【００２７】
迅速なＲＮＡ抽出およびそれに続くＰＣＲによる突然変異の検出：
記載した突然変異の特徴（主として欠失）は迅速な特異的テストに極めて適する：迅速なＲＮＡ抽出（「方法」参照）と組み合わせた、突然変異したエクソン領域を含む適当なプライマー（「方法」参照）によるｃＤＮＡの分泌の増幅は、本発明の臨床的利用を可能とする（時間因子）。この場合において、検出は組織（例えば、バイオプシー、刺穿、サイトロジー）および体液（例えば、血液）につき行うことができる。
【００２８】
例として、胃癌患者のバイオプシーおよび腹腔洗浄をＥ−カドヘリン遺伝子の突然変異につき調べた。８時間内に（図４参照）、Ｅ−カドヘリンにおける改変を特異的に測定し、それにより、臨床問題に対してイン−タイム情報を供することが可能である。ここに、さらなる説明（「抗体／療法」参照）の文脈から分かるように、治療計画を迅速に行うことが可能であろう。基本的には、この方法は胃癌の特異的初期検出に使用することもできる。また、それを未知の一次腫瘍（例えば、乳癌）の場合において他の悪性腫瘍の異なる診断（例えば、転移のバイオプシー）で使用することが可能である。
【００２９】
抗体
突然変異したＥ−カドヘリン蛋白質の膜位置決めおよび腫瘍特異性の組合せは、まず、腫瘍細胞に排他的に向けられたモノクローナル抗体の特異的生産を可能とした。
【００３０】
本発明によって提供される腫瘍−特異的遺伝子配列によって、まず、その配列が腫瘍細胞に排他的に制限される対応する蛋白質を表すアミノ酸を検出することが可能である。これによって、Ｅ−カドヘリンの突然変異した領域に選択的に向けられた抗体を生成させることができる。この仮説を証明するために、本発明者らは、例としてエクソン９欠失を用いて新しく生じた配列を介して、短鎖化された膜貫通蛋白質に対するモノクローナル抗体を得ようとまず試みた（方法についての補足参照）。この場合、突然変異領域が抗原決定基として適しているか否かは明らかでなかった。というのは、このエピトープの立体位置は未知だからである。２３のハイブリドーマ（抗体産生クローン）が得られ、それらの特異性をイン・ビトロでテストした（捕捉参照）。１のクローン（７Ｅ６−１）はエクソン９−欠失Ｅ−カドヘリン蛋白質を認識することがウェスタンブロットで及び免疫蛍光によって判明した。７Ｅ６抗体は「正常」Ｅ−カドヘリンを検出しない（図５）。７Ｅ６抗体を産生するこの細胞系はブタペスト条約に基づきＤＳＭに国際寄託されている（受託番号 ＤＳＭ ＡＣＣ ２２７７）（参照記号デルタＣＡＤ−９、クローン７Ｅ６−１）。７Ｅ６抗体は突然変異した１２３２ｄｅｌ１１８３を認識する。
【００３１】
この抗体がホルマリン中に固定され、パラフィン中に封埋された物質に関して機能的であろうことは予測できなかった。まず、これは免疫組織化学的方法による組織学的切片上の腫瘍細胞の特異的検出を可能とする（図６）。同一切片上の非腫瘍細胞は標識されなかった。それにより、突然変異分子を個々の細胞に割り当てることが可能となった。本発明者らの知識によると、匹敵する特異性を持つ腫瘍マーカーは未だ記載されていない。
【００３２】
受託番号ＡＣＣ ２２７７の下でＤＳＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系は、本発明によって提供されるモノクローナル抗体を産生する細胞系についての例を表すに過ぎない。本発明によると、枠内突然変異を認識するさらなる抗体が既に産生された。これらの抗体を供することは当該分野で働く当業者の技量の範囲内のものである。７Ｅ６モノクローナル抗体ならびにＥ−カドヘリン突然変異に特異的に向けられた産生されたいずれの他の抗体も以下に記載する診断および治療で用いることができる。
【００３３】
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体を用いる診断
免疫組織化学によるＥ−カドヘリンにおける欠陥に関するホルマリン固定されパラフィン封埋された組織の遡及的調査
見込みのある以下のイン・ビトロ試験：
病気の進行の間の可能なマーカーとしての腫瘍細胞の手術前、中、後の播種性の評価のための散在性胃ＣＡについての基礎的スクリーニングとしての循環腫瘍細胞の検出用の血液；
手術前（ネオアジュバント）、手術中（腹膜、門静脈）および手術後（添加剤またはアジュバント）治療にための計画に関する突然変異Ｅ−カドヘリンの治療前検出のための腫瘍バイオプシー；
腫瘍細胞の測定（例えば、切除の程度を保証する、除去の縁）のためのＯＰ調製；
転移および腫瘍細胞の検出（例えば、ミクロエンボルブメント（ｍｉｃｒｏｅｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ））のためのリンパ節；
腹腔における播種性腫瘍細胞の測定のための洗浄；
播種性腫瘍細胞の測定（免疫組織化学）のための組織；
疑われる組織試料の鑑別診断評価のための特徴的Ｅ−カドヘリン突然変異の免疫組織化学的測定のための癌の鑑別診断；
血液細胞（ＤＮＡ）におけるＥ−カドヘリン突然変異の高危険群（「癌家系」）測定のスクーニング；
イン・ビボ前提要件：イムノシンチグラフィーによる腫瘍細胞の治療使用特異的測定のための抗体のヒト化：治療の間の対照のための、または、各々、成功した治療の確認のためのおよび病気の治療後の対照のための手術計画／治療計画の設定のための予備治療；
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による治療：突然変異−特異的抗体に対する照射源の免疫照射治療カップリング；
抗体に対するトキシン（例えば、シュードモナス・トキシン）のイムノトキシン治療カップリング。
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による体細胞遺伝子治療：
ウイルス遺伝子発現系（例えば、アデノウイルス、またはＭＶＡ、ワクシニア−誘導発現ベクターとカップリングさせた；非ウイルス遺伝子発現系（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ＋Ｔ７ ＤＮＡベクター）とカップリングさせた；
特異的遺伝子導入のための可能な方法；
遺伝子工学：内因性免疫系についての腫瘍細胞を標識するための補因子（例えば、Ｂ７）の取り込み；内因性Ｔ細胞を活性化し、突然変異Ｅ−カドヘリン「少数抗原」を有する腫瘍細胞に対する免疫反応を開始させるためのアロ抗原（外来性ＨＬＡ抗原、「主要抗原」）の取り込み；アポトーシスを誘導する因子（例えば、ｐ５３）の特異的取り込みによる腫瘍細胞の殺傷；野生型癌遺伝子／サプレッサー遺伝子（例えば、Ｅ−カドヘリンそれ自体）の特異的取り込みによる悪性表現型の変換；酵素の特異的包含により毒性を形成させるためのプロトキシンの活性化（例えば、デアミナーゼ、５−フルオロシトシンの毒性５−フルオロウラシルへの変換）を用いる可能な治療アプローチ。
リボザイム
例えば、マルチ薬物−耐性トランスポーターをコードするＲＮＡの部位特異的破壊
Ｅ−カドヘリン突然変異の使用の分野を示すさらなる例
骨髄パーチング：イン・ビトロ処理した骨髄における腫瘍細胞の特異的測定および（例えば、抗体に結合したトキシンによる）骨髄からの腫瘍細胞の特異的排除のための抗体の同時使用；
抗原提示のための（腫瘍細胞に特異的に向けられたＴ細胞クローンの活性化）突然変異Ｅ−カドヘリンペプチド配列（表３参照）を樹状細胞にチャージする免疫治療。
【００３４】
蛋白質の細胞内変性は異なる長さを有するペプチドを生じさせる。９−１１アミノ酸の長さを持つペプチドは細胞のＭＨＣによって「チェックされ」（ペプチド結合領域における結合能力は、個々のアミノ酸の特定の配置に依存し、「非自己」および「自己」の間を識別する）、もし特定の配列が非自己として認識されれば、細胞表面に提示される。共刺激体の作用によって、これは免疫反応に至り得る。本発明者らによって初めて記載された突然変異Ｅ−カドヘリンおよび突然変異によって生じる他のペプチドのペプチド配列については、それらのいくつかは非自己ペプチドとしてＭＨＣによって提示されることが予測できる。この事象は患者において免疫反応を刺激しないという事実は、抗原を提示するのが乏しい腫瘍細胞の特性によって説明できるであろう。見い出された突然変異スキャンニングペプチドを専門的な抗原提示細胞（樹状細胞）に種々の長さで取り付けることができる。この細胞に全ての必要な共刺激体が存在するため、かかるＭＨＣ−ペプチド複合体に対する対応するＴ細胞刺激が達成される。このようにして、免疫系によって最初は無視された腫瘍細胞も次いで非自己として認識され、排除される。
【００３５】
この使用は特定の突然変異−特異的抗体を必要としないが、本発明により記載される新しく生成したペプチドの配列についての知識を必要とする。
【００３６】
本発明によると、以下の目的および方法は、ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
突然変異したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたモノクローナル抗体よりなる。
【００３７】
ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、ＲＮＡレベルでエクソン８、エクソン９、またはオクソン１０における少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導く突然変異Ｅ−カドヘリンの配列に向けられたモノクローナル抗体。
【００３８】
以下の群：
（式中、「／」は欠失の位置を示し、下線を施した文字は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）
の少なくとも１つから選択された、野生型Ｅ−カドヘリンと比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じた前記アミノ酸配列の１以上の内の少なくとも１つの配列領域を認識するモノクローナル抗体。
【００３９】
また、本発明は、前記したモノクローナルの少なくとも２種の混合物よりなる。
【００４０】
本発明は、特に、突然変異した膜貫通Ｅ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられた前記モノクローナル抗体よりなる。
【００４１】
本発明のさらなる具体例は、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む胃癌細胞の検出用免疫テストよりなる。
【００４２】
さらに、本発明は以下の実施態様を含む：
ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
突然変異した配列を特異的に含むように選択されたＥ−カドヘリンの突然変異したエクソン領域のＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプロセス用のプライマーよりなる。
【００４３】
突然変異した配列を特異的に含むように選択され、かつ以下の群：
の少なくとも１つのプライマーから選択されたＥ−カドヘリンの突然変異したエクソンのＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプロセス用のプライマー。
【００４４】
本発明は、突然変異したＥ−カドヘリンのＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはそれから誘導されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を有効物質として含有し、ここに該ＤＮＡまたはｃＤＮＡが、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
枠内突然変異を示す治療または診断手段よりなるのが特に好ましい。
【００４５】
さらに、本発明は、ストレンジェント条件下で、以下のＤＮＡ配列もしくはその相補的鎖またはそれから誘導されるＲＮＡ配列の少なくともいくつかにハイブリダイズする核酸を含有し、ここに、少なくとも枠内突然変異によって生じる配列領域も含まれる治療または診断手段よりなる。
【００４６】
さらに、本発明により、ストリンジェント条件下で前記核酸にハイブリダイズする核酸を有効物質として含有する治療または診断手段よりなる。
【００４７】
本発明の精神内にあるストレンジェント条件は、本発明により定義された核酸への核酸の選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件と定義される。ストレンジェント条件下でのこの種のハイブリダイゼーションは、好ましくは、水性溶液中にて６８℃で、あるいは５０％ホルムアミド中にて４２℃で行われるハイブリダイゼーション、および続いての水性溶液中での６５℃の温度におけるフィルターの洗浄を意味し、しかる後に、本発明により定義される核酸またはそれから誘導されるＲＮＡへのプローブの結合を依然検出することができる。要すれば、厳格さが低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を使用することもできる。
【００４８】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は胃癌、特に散在性胃癌の診断および治療に有用である。
【００４９】
治療では、本発明のモノクローナル抗体を、例えば、胃癌細胞のすくなくともいくらかの選択的排除のための手段に結合させることができる。この手段は、好ましくは、トキシンまたは照射源を含むことができる。
【００５０】
また、本発明は、請求項でより詳細に特徴付けたＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドよりなる。これらは腫瘍、特に胃癌の免疫治療に有用である。
【００５１】
本発明のさらなる実施態様において、以下の工程：
ａ．ヒト細胞を含有する試料物質を供し、
ｂ．ヒト細胞からｍＲＮＡを回収し、
ｃ．ｍＲＮＡを逆転写し、
ｄ．請求項８または９記載のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応を行い、
ｅ．ポリメラーゼ鎖反応の反応生成物を分離し分析する；
ことによってヒト細胞を含有する試料物質中の腫瘍細胞を測定する方法が記載される。
【００５２】
また、本発明は、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド配列を含有するベクターよりなる。
【００５３】
かくして、Ｅ−カドヘリンの枠内突然変異を胃癌の診断および治療で使用できることが本発明によって判明した。「枠内突然変異」なる用語は、ＤＮＡレベルで起こるＥ−カドヘリンにおける突然変異または欠失を意味することを意図し、これはＲＮＡレベルで欠失または塩基交換に導くが、該欠失または該突然変異も読枠置換には至らない。
【００５４】
方法
１．新しいＥ−カドヘリン突然変異についての調査
胃癌に罹った６３人の患者の組織を調べた。切除後の新鮮な腫瘍組織を液体窒素中で深−凍結した。深−凍結組織試料の全ＲＮＡを標準的な手法（シソチオシアン酸グアニジウム抽出およびＣｓＣｌ遠心）を用いて単離した。２μｇのＲＮＡの逆転写に続き、ＰＣＲによってＥ−カドヘリンｃＤＮＡの全暗号領域を増幅した。使用したＰＣＲプライマーを表４にリストする。全てのＰＣＲ反応についての増幅条件は以下の通りである：９４℃における１分間の変性；５５℃における１分間のプライマーアニーリング；および７２℃における１分間の伸長。Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。Ｂｉｏｍｅｄ ＰＣＲデバイス（Ｂｉｏｍｅｄ−Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｌ， Ｏｂｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｅｉｍ）を用いた。増幅の産物はアガロースゲル電気泳動によってチェックし、引き続いてガラスミルク（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩ， Ｂｉｏ１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて精製した。しかる後、単離したＤＮＡ増幅体の全長を配列決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０／ＵＳＢ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ， ＵＳＡ）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
「ヌクレオチド位置」はＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータバンク、アクセス番号Ｚ１３００９で利用できるＥ−カドヘリン配列をいう。
【００５７】
２．免疫組織化学的試験（突然変異−特異的ではない）
ホルマリン中に固定し、パラフィン中に封埋された組織の保存物質を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン酸およびマイクロ波での処理に続き、組織試料を１％Ｈ２Ｏ２中にて１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。Ｅ−カドヘリン−特異的免疫反応性の測定のために、組織をモノクローナル抗体ＨＥＣＤ−１（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， 日本国，１：５００希釈）と共に４℃で１６時間インキュベートした。抗体結合の可視化はアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）およびペルオキシダーゼ方法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ， Ｂｕｒｌｉｎｇｇａｍｅ， ＣＡ； Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＤＡＢ， Ｓｉｇｍａｎ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を用いて行った。核小体の逆染色にはｈｅｍａｌｕｍを用いた。また、全ての腫瘍切片は対照としての非悪性粘膜の一部を示した。陰性対照はＨＥＣＤ−１抗体をリン酸緩衝化ＮａＣｌによって置き換えることによって行った。
【００５８】
Ｅ−カドヘリンの発現ベクターへのクローニング
突然変異Ｅ−カドヘリンの細胞内位置を調べるために、突然変異分子を発現ベクターにクローン化した。例として、ヒト野生型Ｅ−カドヘリンに加えてＥ−カドヘリンｍＲＮＡの４つの異なる突然変異体を発現ベクターにクローン化した。これらの４つの突然変異のうち２つがエクソンのうちの１つの完全に喪失、エクソン８（１２９ｂｐ）の欠失またはエクソン９（１８３ｂｐ）の欠失いずれかを呈した。もう１つの突然変異はエクソン１０（６３ｂｐ）の部分的欠失を示す。第４の突然変異はエクソン８における塩基交換よりなり、これは潜在的なカルシウム結合部位破壊する。発現クローニングニ考えられた突然変異の全てはＥ−カドヘリンの細胞内領域にある（全ての突然変異につき図１参照）。
【００５９】
クローニングのための出発物質は、各突然変異（前記参照）が同定された散在性胃癌の新鮮な物質から単離した全ＲＮＡであった。逆転写の後に得られた野生型Ｅ−カドヘリンおよび突然変異の各ｃＤＮＡを２つの部分的断片（Ａ＋Ｂ）の形態で増幅した（図７参照）。一緒にすると、２つの部分的断片は２６４９ｂｐ（野生型）よりなるＥ−カドヘリンの完全な暗号領域よりなる。断片Ａ（５’領域）の増幅はプライマーＡＴＧおよびｒＥＸ１０を用いて行った（表５参照）。野生型ｍＲＮＡの３’断片（Ｂ）、エクソン９欠失、エクソン１０における部分的欠失、およびエクソン８における点突然変異の増幅には、プライマーＥｘ８−ｒ３’／２／ｎｅｕの対を使用した。エクソン８欠失突然変異体の断片Ｂ’の増幅は対Ｅｘ９／１−ｒ３’／２／ｎｅｕを用いて行った。
【００６０】
増幅された部分的断片ＡおよびＢを、各々、ＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。これらのベクターを用い、特異的ＴＡ塩基対合によって生じたＰＣＲの直接的かつ効果的なクローニングが達成された。全ての５つのカドヘリンｃＤＮＡ（野生型＋４つの突然変異体）の２つの部分的ｃＤＮＡ断片を、本明細書には詳細に記載しないが十分に当業者の技量内にある異なるクローニング戦略を用いるクローニングによって一緒に適当に連結した。このようにして、ＰＣＲＩＩベクターにおける全ての５つのｃＤＮＡの構築体が得られた。
【００６１】
増幅の間に主として生成したかも知れないクローニング人工物（Ｔａｑの誤り）を排除するために、全ての５つのｃＤＮＡを、ベクター／カドヘリン連結領域を含めたそれらの全長の配列を決定することによって調べた。
【００６２】
［以下余白］
【表５】
【００６３】
さらなる工程において、配列決定によって確認されたカドヘリン構築体を真核生物発現ベクターにクローン化した。一方、所望のｃＤＮＡの発現に加えて、発現された細胞クローンの選択（ネオマイシン耐性遺伝子の発現）を可能とする商業的に入手可能なベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を選択し、他方、第２のベクターとして、ネズミ野生型Ｅ−カドヘリン構築体のトランスフェクションで既に成功して使用たれｐＢＡＴベクターを用いた（Ｎｏｓｅ， Ａ．， Ｎａｇａｆｕｃｈｉ， Ａ．， Ｔａｋｅｉｃｈｉ，Ｍ．， 「発現された組換えカドヘリンはモデル系において細胞ソーティングを媒介する」 Ｃｅｌｌ １９８８， ５４：９９３−１００１）。
【００６４】
４．一過性トランスフェクションおよびウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電子顕微鏡検によるＥ−カドヘリンの検出
トランスフェクションのためにＣａＰＯ４沈殿が確立されている。該方法のトランスフェクション効率は対照としてｐＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて評価した。該ベクターは、色素Ｘ−ｇａｌ（青色）への変換後に該ベクターが取り込まれた細胞の検出を可能とするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該方法の効率は１０％の範囲にあり、これは一過性トランスフェクションには非常に良好な値である。
【００６５】
ｃＤＮＡの上流に転写認識領域（Ｋｏｚａｋ配列）およびそのクローニング部位を含有する５’非翻訳領域の増幅後の発現実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｅ−カドヘリンを欠く膵臓細胞系において、およびＮｅｕｒｏ ２Ａ（神経繊維芽細胞）細胞において、一過的に改変したＥ−カドヘリンｃＤＮＡ構築体を発現させることができた。
【００６６】
細胞培養におけるＥ−カドヘリンの測定は、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電子顕微鏡検によって行った。まず、（トランスフェクトしたまたはトランスフェクトしてない）細胞のＳＤＳ溶解を行って、ウェスタンブロッティング用の全細胞溶解物を調製した。これを行うのに、本発明者らは、引き続いてのゲル泳動の間に溶解物の調査に必要な不規則電解質移動度を得た。別法として、トリトンＸ−１００溶解による細胞抽出物をテストした。ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシー染色による抽出物の調査は、細胞の破壊が効果的であることを示した。従って、トリトン溶解を全ての引き続いての実験で用いた。
【００６７】
本発明者らは、Ｅ−カドヘリンの特異的測定のためにＥ−カドヘリンに対する４つの異なるモノクローナル抗体（ＨＥＣＤ−１，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， 日本；ＡＭＳＴ１０，Ｓａｘｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ； ＤＥＣＭＡ−１，Ｓｉｇｍａ； ＡＮＴＩ−Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ， Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いた。ウェスタンブロッティングの間の抗原−抗体複合体の検出は第２のペルオキシダーゼ標識抗体を用いてルミネッセンス反応（ＥＣＬ−Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって行った。それらは異なる強度で反応したが、テストした抗体の全ては、Ｅ−カドヘリン陽性対照細胞系Ａ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）を含む、および野生型Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を含む細胞抽出物において特異的反応を示した。トランスフェクトしていない系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２およびＮｅｕｒｏ ２Ａの抽出物では陽性シグナルは検出できなかった。
【００６８】
免疫蛍光を行うためには、カバーグラス上に撒いた細胞をメタノールによって固定し、Ｅ−カドヘリンに特異的な抗体ＨＥＣＤ−１（野生型Ｅ−カドヘリンおよび突然変異した、例えばエクソン９が欠失したＥ−カドヘリンを認識）によって標識した。二次抗体として、ローダミン−（ＴＲＩＴＣ−）カップリングのヤギ抗−マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。
【００６９】
トランスフェクションが成功したか否かを免疫蛍光によって判断するために、トランスフェクトしていないＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、および突然変異Ｅ−カドヘリンによって、および野生型Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトした細胞を同時に調べた。固定およびＥ−カドヘリンに特異的な金標識抗体（ＨＥＣＤ−１）とのインキュベーションの後、標識細胞をｅｐｏｎ中に封埋し、酢酸ウラニル／鉛でコントラストを着けた。トランスフェクトしていないＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞では標識は検出されず、他方、トランスフェクトした細胞系は膜と結合した金標識を示した。すなわち、野生型Ｅ−カドヘリンならびに突然変異したＥ−カドヘリン（例えば、エクソン９欠失を有する、図３参照）が膜に繋ぎ止められた。
【００７０】
５．Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞系
本発明者らは野生型ならびに突然変異したＥ−カドヘリンを一過的にトランスフェクトした細胞で同定するのに成功した後、Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞の調製を開始した。これは、各ｐＢＡＴ構築（「クローニング」参照）およびＥ−カドヘリンを含まないが代わりにネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＡＴベクターでＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を共トランスフェクトするこによって行った。ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のエクソン９の欠失を呈する３つの細胞系（Ｄｅｌ９）および野生型ヒトＥ−カドヘリンを保有する３つの系（ＷＴ）が確立された。Ｄｅｌ９系およびＷＴ系のＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの調査は、予期された断片サイズ（野生型についての正常サイズのｍＲＮＡ（７７９ｂｐ）；Ｄｅｌ−９系についての短鎖化ｍＲＮＡ（５９６ｂｐ）、この場合、野生型Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡは発現されなかった）を示した。ＰＣＲ増幅はプライマーＥｘ７およびｒＥＸ１１（表５参照）を用いて行った。安定にトランスフェクトされたＤｅｌ−９系の、およびＷＴ系のうちの１つの抽出物のウェスタンブロッティングは明らかにＥ−カドヘリン蛋白質を検出した。
【００７１】
免疫蛍光を用いるＷＴ系におけるＥ−カドヘリン発現の調査は、隣接細胞への接触部位において予期された特徴の分布を明らかにした。ＨＥＣＤ−１抗体を用い、Ｄｅｌ−９細胞系も細胞−細胞結合においてＥ−カドヘリンの標識を示した（図２）。
【００７２】
６．（例として腹腔洗浄を用いる）迅速なＲＮＡ抽出および引き続くＰＣＲによる突然変異の測定
洗浄調製物中の細胞の沈降およびＲＮＡ抽出（Ｒｎｅａｓｙ Ｒａｐｉｄ 抽出キット、Ｑｕｉａｇｅｎ）の後、ＲＮＡを逆転写し、得られたＥ−カドヘリンｃＤＮＡの全長をＰＣＲ（プライマーおよび条件は前記）によって増幅する。Ｅ−カドヘリン突然変異は主として枠内欠失を含むので、これらはアガロースゲル電気泳動によって迅速かつ安全に検出される。かくして、洗浄を受容して既に９時間経った後、Ｅ−カドヘリンにおける可能な欠失、例えば、エクソン８またはエクソン９の喪失が検出でき、それにより、腹腔中の播種性腫瘍細胞の検出が可能である。この情報のため、臨床判断のクールに直接影響し得る（例えば、さらなる腹腔内治療）。
【００７３】
これにより、検出の高度に特異的な方法を迅速かつ安全に、また少量の腫瘍細胞でもって行うことができる。Ｅ−カドヘリン突然変異の腫瘍特異性は、炎症中皮細胞のごとき「腫瘍様」形態を持つ細胞に関する曖昧性を排除することを可能とする。
【００７４】
７．（例としてエクソン９欠失に特異的な抗体７Ｅ６を用いる）突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体の調製およびテスト
ペプチド合成。モデル４３０Ａペプチド合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， 速−Ｆｍｏｃ修飾に適合）（ペプチド配列：エクソン９のＥ−カドヘリン欠失、表３ １２３２ｄｅｌ１８３参照）を用いて以下のペプチドを合成した：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ。アミノ酸Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＡｓｐおよびＧｌｕは側鎖を保護して合成した。９５％トリフルオロ酢酸中でペプチドを合成樹脂から切り離し、ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで沈殿させ、凍結乾燥した。しかる後、原料生成物を０．１％トリフルオロ酢酸に溶解させ、７０％アセトニトリル中の直線グラジエントにての逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ ３００Ａ， ＣＳ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。生成物の純度を電気スプレイイオン化によってモデルＡＰ１００マススペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でテストした。
【００７５】
担体へのカップリングおよび免疫化：Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａからのキイホールリンペットヘモシアニン（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ）を免疫化のための担体蛋白質として用い、室温にて１−エチル−３−（ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドを用い、０．５Ｍ Ｎ−メチルイミダゾール緩衝液（Ｓｇｉｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）ｐＨ７．０中でペプチドに結合させた。合計して、２．８ｍｇのペプチドを２．０ｍｇのヘモシアニンにカップリングさせた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対する透析の後、得られた溶液を免疫化に用いた。同一の方法を、２ｍｇのペプチドの２ｍｇの４×結晶化ウシ血清アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ， Ｍａｒｂｕｒｇ）へのカップリングに用い、これをＥＬＩＳＡテストにおけるハイブリドーマ培養上清をテストするのに用いた。免疫化はＬｏｕ／Ｃラットで行い、５０μｇのＫＬＨがカップリングしたヘプチドを５００μｌ ＰＢＳを用いて希釈し、同一量のＣＦＡによって乳化した。５００μｌの得られたエマルジョンを、各々、腹腔内および皮下適用した。３カ月後、ＣＦＡ無しでＫＬＨにカップリングしたペプチドを用いてブースター注射を行った。ブースター注射の３日後に注入を行った。ネズミ形質細胞腫細胞系Ｐ３×６３ Ａｇ ８．６５３を注入細胞系として供した。ＥＬＩＳＡを行って、特異的ペプチドについて、および対照として供する同一のカップリング化学を用いてＢＳＡにカップリングさせた無関係ペプチドにつきテストした。特異的ペプチドと絶対的に反応するハイブリドーマを凍結し、その上清をさらなる分析に付した。サブクラス−特異的モノクローナル抗体を用いてサブクラスを測定した。
【００７６】
ＦＡＣＳ分析：エクソン９欠失Ｅ−カドヘリン（前記参照）でトランスフェクトした２００，０００のＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞またはトランスフェクトしなかった２００，０００ののＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を、各々、５０μｌのハイブリドーマ上清と一緒にインキュベートした。５０μｌの安定に希釈したヤギ−抗−ラットＦＩＴＣを３０分間で添加して、結合抗体を検出した。細胞をＦＡＣｓｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ）で分析した。ｍａｂ ７Ｅ６は「ラットＩｇＧ１」サブクラスに属し、ＦＡＣｓｃａｎで最高の強度を示す。
【００７７】
免疫蛍光：免疫蛍光を行うため、カバーグラス上に撒いた細胞（各々、エクソン９欠失Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、またはトランスフェクトしなかったＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞）をメタノールで固定し、Ｅ−カドヘリン突然変異につき特異的な抗体７Ｅ６によって標識した。二次抗体として、ＦＩＴＣがカップリングしたヤギ−抗−ラット抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。
【００７８】
ウェスタン−ブロッティング：Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞（野生型またはエクソン９欠失Ｅ−カドヘリンいずれかでトランスフェクトしたもの）の、およびさらなる細胞系の細胞抽出物を、ウェスタンブロット上にて突然変異−特異的抗体によって調べた。抗体７Ｅ６を用い、トランスフェクトしなかった系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（ヒト膵臓癌）、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、およびＡ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）の抽出物では陽性シグナルは検出できなかった。また、野生型Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトした細胞は７Ｅ６でシグナルを示さなかった。突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６と反応した唯一の細胞系はエクソン９欠失Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓであった。
【００７９】
免疫組織化学：Ｅ−カドヘリンのエクソン９の喪失が分子生物学によって検出された、胃癌患者の保存物質（ホルマリン固定し、パラフィン封埋した組織）を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン酸およびマイクロ波での処理の後、組織試料を１％Ｈ２Ｏ２中で１５分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロックした。Ｅ−カドヘリン突然変異−特異的免疫反応性の検出には、組織を４℃で７Ｅ６モノクローナル抗体と共に１６時間にわたってインキュベートした。抗体の結合をアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）およびペルオキシダーゼ方法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ； Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＤＡＢ， Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｍｈｏｆｅｎ）を用いて可視化した。核小体の逆染色はｈｅｍａｌｕｍを用いて行った。腫瘍切片の全ては対照としての非悪性粘膜の部分を示した。陰性対照はリン酸緩衝化ＮａＣｌによって７Ｅ６抗体を置き換えることによって行った。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、散在性胃癌の特異的検出に有用なモノクローナル抗体が提供される。また、散在性胃癌の検出および治療に有用な治療および診断手段が提供される。
［以下余白］
【００８１】
【配列表】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
［以下余白］
【図面の簡単な説明】
【図１】典型的には枠内欠失である散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。
【図２】免疫蛍光による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置を表す顕微鏡写真である。
【図３】免疫電子顕微鏡検による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置を表す顕微鏡写真である。
【図４】本発明によるＥ−カドヘリン突然変異の迅速な診断のフローダイアグラムである。
【図５】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色されたウェスタンブロットを示す写真である。
【図６】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色された免疫組織を表す顕微鏡写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、突然変異した膜貫通Ｅ−カドヘリンに対して特異的に向けられ、胃癌の測定に有用なモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
死亡原因の統計的見積りは悪性腫瘍が世界的に第一位であることを示す。これらの腫瘍のうち、国際的に胃癌は死に至る腫瘍の第二位を占める。ミクロサテライトの不安定性および遺伝子ｐ５３ ＡＰＣ ＤＣＣの改変を含めたいくつかの遺伝的改変が胃癌に関連して報告されている（Ｔａｈａｒａ Ｅ：ヒト胃腸管癌における遺伝子改変 Ｃａｎｃｅｒ １９９５；７５：１４１０−１４１７）。組織形態学的には、２つのタイプの胃癌が区別され得る（Ｌａｕｒｅｎ Ｐ．： 「胃癌の２つの組織学的主要タイプ：散在性およびいわゆる腸−タイプの癌」 Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． １９６５：６４：３１−４９）：１つのタイプは腺分化を有する腸癌であり、他のタイプは組織構造が破壊された散在性癌からなる。これまで、この二元的進展および形態についての遺伝的基礎は明確とはされていない。恐らくは、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）分子の改変がこの点で重要であろう：Ｅ−カドヘリンは上皮組織の相互作用で鍵となる役割を演じる血友病膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）細胞接着分子である。１６のエクソンからなるＥ−カドヘリン遺伝子の初期の分子生物学研究は、突然変異が胃癌の形態および成長のタイプに寄与し得ることを示した（Ｂｅｃｋｅｒ Ｋ−Ｆ， Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＪ， Ｒｅｉｃｈ Ｕ， Ｂｅｃｋｅｒ Ｉ， Ｎｅｋａｒｄａ Ｈ， Ｓｉｅｗｅｒｔ ＪＲ， Ｈｏｆｌｅｒ Ｈ： 「Ｅ−カドヘリン遺伝子突然変異は散在性タイプの胃癌に対する糸口を与える」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４：５４（１４）：３８４５−３８５２）。
【０００３】
基本的には、悪性腫瘍の改変は挙動のある種の生物学的パターンの説明で興味がある；これらの現象は特別の特徴として、従って、腫瘍マーカーとして使用できる。これらの特徴は、直接的または間接的に評価できる細胞産物および細胞表面の典型的な特性を含む。今日まで、腫瘍細胞のみに制限された表面抗原または細胞産物の単離は成功していない。現在まで、正常組織に対する身体におけるある種の細胞特性（表面抗原、細胞内蛋白質、分泌された細胞産物）の増大した出現が悪性疾患の診断および治療の基礎として使用されてきた。
【０００４】
診断および治療におけるＥ−カドヘリンの使用状態
最初の公表は、特異的抗体を用いる免疫組織化学によって検出されたＥ−カドヘリンは腫瘍細胞において改変された発現パターンを示したことを報告している。Ｅ−カドヘリンの免疫反応性は腫瘍組織では部分的に低下しているか、あるいは存在しない（表１参照）。他の著者は、この事実は腫瘍における蛋白質の生産の減少（「下降調節」）の原因であると考えた（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，ＤＥ−Ａ−４１ １０ ４０５ Ａ１参照）。
【０００５】
【表１】
表１において、
ａ調べた患者の数を示す
ｂ「正常」組織と同様のＥ−カドヘリンの免疫反応性示す。
ｃ減少したまたは存在しない腫瘍におけるＥ−カドヘリン免疫反応性を示す。
表１の文献：
１：Ｓｈｉｎｏ Ｙ．，Ｗａｔａｎａｂｅ Ａ．，Ｙａｍａｄａ Ｙ．， Ｔａｎａｂｅ Ｍ．， Ｙａｍａｄａ Ｔ．， Ｍａｔｓｕｄａ Ｍ．， Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｊ．， Ｔａｔｓｕｍｉ Ｍ．， Ｍｉｗａ Ｔ．， Ｎａｋａｎｏ Ｈ．：
「ヒト胃癌における免疫組織化学的Ｅ−カドヘリン発現の臨床病理学的評価」
Ｃａｎｃｅｒ １９９５； ７６：２１９３−２２０１
２：Ｂｒｉｔｏ Ｍ．Ｊ．， Ｊａｃｉｎｔｏ Ｌ．， Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ Ｊ．， Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ Ｍ．， Ｆｉｌｉｐｅ Ｍ．Ｔ．：
「胃癌におけるＥ−カドヘリン（細胞接着分子）」
Ｐａｔｈ． ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９９５；１９１：６２８（アブストラクト）
３：Ｍａｔｓｕｉ Ｓ．， ＳＨｉｏｚａｋｉ Ｈ．， Ｉｎｏｕｅ Ｍ．， Ｔａｍｕｒａ Ｓ．， Ｄｏｋｉ Ｙ．， Ｋａｄｐｗａｋｉ Ｔ．， Ｉｗａｚａｗａ Ｔ．， Ｓｈｉｍａｙａ Ｋ．， Ｎａｇａｆｕｃｈｉ Ａ．， Ｔｓｕｋｉｔａ Ｓ．， Ｍｏｒｉ Ｔ．：
「ヒト胃癌におけるアルファ−カテニンの免疫組織化学的評価」
Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈｉｖ １９９４： ４２４： ３７５−３８１
４：Ｍａｙｅｒ Ｂ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｊ．Ｐ．， Ｌｅｉｔｌ Ｆ．， Ｊａｕｃｈ Ｋ．Ｗ．， Ｋｅｉｓｓ Ｍ．Ｍ．，Ｓｃｈｉｄｂｅｒｇ Ｆ．Ｗ．， Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ Ｗ．， Ｆｕｎｋｅ Ｉ：
「主要な転移性胃癌におけるＥ−カドヘリン発現：下降調節は細胞分化および腺崩壊と相関する」
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９３； ５３：１６９０−１６９５
５：Ｓｈｉｍｏｙａｍａ Ｙ．， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ．：
「胃癌におけるＥ−およびＰ−カドヘリンの発現」
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９１：５１（８）：２１８５−２１９２
【０００７】
これらの現象に関する我々自身の考えは、まず、完全無欠のＥ−カドヘリン遺伝子を目指した。ＲＮＡ抽出、逆転写および直接ＤＮＡ配列決定の後、胃癌組織の分子生物学調査はＥ−カドヘリン遺伝子における欠陥を明らかとした。散在性サブタイプの胃癌をＥ−カドヘリン遺伝子の一部（エクソン６−１０および１３−１６）における遺伝子改変につき調べた。エクソン８および９の喪失、エクソン１０の部分的喪失、またはエクソン８の領域における点突然変異が観察された（Ｂｅｃｋｅｒ Ｋ−Ｆ， Ａｔｋｉｎｓｏｎ Ｍ．Ｊ．， Ｒｅｉｃｈ Ｕ．， Ｂｅｃｋｅｒ Ｉ．， Ｎｅｋａｒｄａ Ｈ．， Ｓｉｅｗｅｒｔ Ｊ．Ｒ．， Ｈｏｆｌｅｒ Ｈ：「Ｅ−カドヘリン遺伝子突然変異は散在性胃癌に対する糸口を提供する」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４；５４（１４）：３８４５−３８５２）。腸サブタイプ腫瘍は構造的改変に導く突然変異を示さなかった。見い出された突然変異の解析は、いくぶん高い頻度で個々の欠失が起こったが、点突然変異またはより小さい欠失が観察できたことを明らかとした。突然変異したＥ−カドヘリンに関するケースのいくつかの免疫組織化学的染色（抗体：ＨＥＣＤ−１、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， 日本国、形態学セクション参照） は、腫瘍細胞の膜貫通染色および非腫瘍粘膜の染色を顕著に示した。本発明者らは、腫瘍細胞の標識が野生型Ｅ−カドヘリンまたは突然変異Ｅ−カドヘリンの検出に対応するのかを区別することができなかった。一方、突然変異蛋白質が継続的に細胞膜に取り込まれ、Ｅ−カドヘリンに対する抗体（ＨＥＣＤ−１）が突然変異領域から離れたエピトープを認識する可能性があった。さらなる説明は、第２の突然変異していない対立遺伝子によって生成し、腫瘍細胞でやはり生産されている野生型Ｅ−カドヘリンへの該抗体の結合であり得た。まず、腫瘍のいくつかが染色を示さなかったという事実は、蛋白質の翻訳または安定性に影響を有するかも知れない、調べたエクソン６−１０および１３−１６から離れたさらなる突然変異の存在を我々に示唆した。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、胃癌、特に散在性胃癌の検出に特に適したモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この目的は請求項１により詳しく特徴付けたモノクローナル抗体に係る本発明によって達成される。本発明の好ましい実施態様は従属した二次的な請求項群に従って示される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
これまで調べられていなかったＥ−カドヘリンの領域（エクソン１−５、１１および１２）の解析、および散在性胃癌の１０のさらなるケースのＥ−カドヘリンのｃＤＮＡの配列決定は、散在性胃癌においてさらなる突然変異を明らかとした（「方法セクション」参照）。これらの新しく見い出された突然変異（表２）は、驚くべきことに、典型的なパターンを継続的に示した。全てのケースにおいて、これらの突然変異は読枠に影響しない塩基トリプレットの多重体であるか、あるいはそれらは点突然変異であった。これらの研究によって、本発明者らは、免疫反応性の喪失が翻訳−破壊突然変異によって引き起こされ得るという免疫組織化学的調査の後になされた示唆を排除することができた。胃癌の調査と平行して、他の上皮腫瘍も解析した。乳癌、食道ガン、および大腸癌のケースは胃癌のそれに対応するパターンは示さなかった。
【００１１】
【表２】
突然変異の特徴付けならびにさらなる腫瘍の配列決定に関して行ったさらなる研究は、未だ報告されておらず、癌のケースではユニークである原理に導いた：散在性胃癌におけるＥ−カドヘリンの改変は枠内突然変異であって（読枠の破壊ではない）。この結果は診断および治療目的で有用である。
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１４】
図１は、現在まで公知の散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異は、典型的には、枠内欠失である。突然変異は以下のものを表す：矢印は検出された突然変異を表す；翻訳されたＥ−カドヘリン配列は陰影を付した；数字を付したボックスはエクソンを表す；アミノ酸、続いてのコドン位置は「ミスセンス突然変異」を表す；接頭辞のない数字は欠失（ｄｅｌ）の位置を示し、「ｄｅｌ」の後の数字は失われた塩基対の数である。
【００１５】
図２は、免疫蛍光による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質（エクソン９欠失）はトランスフェクトされた細胞の細胞結合部（明るい線）で検出することができる。
【００１６】
図３は、免疫電子顕微鏡検による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置の決定を表す。突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質（矢印）はトランスフェクトされた細胞の膜で検出することができる。
【００１７】
図４は、本発明によるＥ−カドヘリン突然変異の迅速な診断のフローダイアグラムである。
【００１８】
図５は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色されたウェスタンブロット図である。突然変異−特異的ではないＥ−カドヘリン抗体ＨＥＣＤ−１とは対照的に、突然変異−特異的抗体７Ｅ６は突然変異Ｅ−カドヘリン蛋白質ｄｅｌ９、エクソン９欠失Ｅ−カドヘリンを絶対的に検出する。ＷＴ，野生型；−、トランスフェクトされていないもの。
【００１９】
図６は、突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色された免疫組織化学を表す。突然変異−特異的７Ｅ６は散在型胃癌の腫瘍細胞（矢印）を絶対的に検出する。非腫瘍腺（矢印の頭）は標識されていない。
【００２０】
本発明者らは、散在性胃癌において突然変異の典型的な形態−枠内突然変異（各々、塩基トリプレットの多量体の欠失または点突然変異）の証拠を供するに成功した（図１参照）。
【００２１】
これらの特徴的突然変異により、我々は、改変された蛋白質が全てのケースで生じ、さらに細胞によって発現されると結論することができた。この示唆の証拠はＥ−カドヘリンを欠く細胞系（ＭＤＡ乳癌細胞）（方法についての補足参照）への突然変異遺伝子のトランスフェクションによって得られた。安定にトランスフェクトした細胞は細胞膜において突然変異蛋白質を発現し；突然変異蛋白質の膜への位置付けは、試料としてエクソン９欠失を用いる免疫蛍光（図２）および電子顕微鏡検（図３）によって明確に証明された。突然変異蛋白質の乱されない膜への位置付けは診断および治療におけるさらなる使用で非常に重要である。
【００２２】
塩基配列の喪失または点突然変異の存在は、各々、転写の連続性を維持しつつ新しくてユニークで誤りのないＲＮＡ配列を生じる。次いで、この「誤り」は引き続いての転写の間に改変されたアミノ酸配列によって蛋白質中に繋ぎ止められる。突然変異によって生じた新しい蛋白質配列は表３に詳細にリストする。
【００２３】
個々の腫瘍細胞はこれらの配列によって、すなわちそれらの突然変異したＥ−カドヘリン遺伝子によって誤りなく標識される。いくつかの遺伝子データバンク（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＤＢを介する、リリース３２．０）で行ったサーチ（相同性の比較）により、現在までに知られているいずれの配列に対する類似性も供されなかった。初期の胃癌を突然変異事象のクローン性に関して調べた。これらのケースにおいても突然変異は検出できたので（自身の観察）、Ｅ−カドヘリンにおける突然変異は腫瘍進展の経過における初期の事象であるに違いなく、恐らくは元の悪性クローンに復帰する。
【００２４】
【表３】
表３において、ダッシュ（／）は欠失の位置を示し；蛋白質配列はこの位置から出発して改変される；下線を施した文字は点突然変異によって変化したアミノ酸を示す。
【００２６】
表３に示したＥ−カドヘリン突然変異ならびにさらに未だ未知の突然変異を例えば以下の診断および治療目的で使用できる。
【００２７】
迅速なＲＮＡ抽出およびそれに続くＰＣＲによる突然変異の検出：
記載した突然変異の特徴（主として欠失）は迅速な特異的テストに極めて適する：迅速なＲＮＡ抽出（「方法」参照）と組み合わせた、突然変異したエクソン領域を含む適当なプライマー（「方法」参照）によるｃＤＮＡの分泌の増幅は、本発明の臨床的利用を可能とする（時間因子）。この場合において、検出は組織（例えば、バイオプシー、刺穿、サイトロジー）および体液（例えば、血液）につき行うことができる。
【００２８】
例として、胃癌患者のバイオプシーおよび腹腔洗浄をＥ−カドヘリン遺伝子の突然変異につき調べた。８時間内に（図４参照）、Ｅ−カドヘリンにおける改変を特異的に測定し、それにより、臨床問題に対してイン−タイム情報を供することが可能である。ここに、さらなる説明（「抗体／療法」参照）の文脈から分かるように、治療計画を迅速に行うことが可能であろう。基本的には、この方法は胃癌の特異的初期検出に使用することもできる。また、それを未知の一次腫瘍（例えば、乳癌）の場合において他の悪性腫瘍の異なる診断（例えば、転移のバイオプシー）で使用することが可能である。
【００２９】
抗体
突然変異したＥ−カドヘリン蛋白質の膜位置決めおよび腫瘍特異性の組合せは、まず、腫瘍細胞に排他的に向けられたモノクローナル抗体の特異的生産を可能とした。
【００３０】
本発明によって提供される腫瘍−特異的遺伝子配列によって、まず、その配列が腫瘍細胞に排他的に制限される対応する蛋白質を表すアミノ酸を検出することが可能である。これによって、Ｅ−カドヘリンの突然変異した領域に選択的に向けられた抗体を生成させることができる。この仮説を証明するために、本発明者らは、例としてエクソン９欠失を用いて新しく生じた配列を介して、短鎖化された膜貫通蛋白質に対するモノクローナル抗体を得ようとまず試みた（方法についての補足参照）。この場合、突然変異領域が抗原決定基として適しているか否かは明らかでなかった。というのは、このエピトープの立体位置は未知だからである。２３のハイブリドーマ（抗体産生クローン）が得られ、それらの特異性をイン・ビトロでテストした（捕捉参照）。１のクローン（７Ｅ６−１）はエクソン９−欠失Ｅ−カドヘリン蛋白質を認識することがウェスタンブロットで及び免疫蛍光によって判明した。７Ｅ６抗体は「正常」Ｅ−カドヘリンを検出しない（図５）。７Ｅ６抗体を産生するこの細胞系はブタペスト条約に基づきＤＳＭに国際寄託されている（受託番号 ＤＳＭ ＡＣＣ ２２７７）（参照記号デルタＣＡＤ−９、クローン７Ｅ６−１）。７Ｅ６抗体は突然変異した１２３２ｄｅｌ１１８３を認識する。
【００３１】
この抗体がホルマリン中に固定され、パラフィン中に封埋された物質に関して機能的であろうことは予測できなかった。まず、これは免疫組織化学的方法による組織学的切片上の腫瘍細胞の特異的検出を可能とする（図６）。同一切片上の非腫瘍細胞は標識されなかった。それにより、突然変異分子を個々の細胞に割り当てることが可能となった。本発明者らの知識によると、匹敵する特異性を持つ腫瘍マーカーは未だ記載されていない。
【００３２】
受託番号ＡＣＣ ２２７７の下でＤＳＭに寄託されたハイブリドーマ細胞系は、本発明によって提供されるモノクローナル抗体を産生する細胞系についての例を表すに過ぎない。本発明によると、枠内突然変異を認識するさらなる抗体が既に産生された。これらの抗体を供することは当該分野で働く当業者の技量の範囲内のものである。７Ｅ６モノクローナル抗体ならびにＥ−カドヘリン突然変異に特異的に向けられた産生されたいずれの他の抗体も以下に記載する診断および治療で用いることができる。
【００３３】
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体を用いる診断
免疫組織化学によるＥ−カドヘリンにおける欠陥に関するホルマリン固定されパラフィン封埋された組織の遡及的調査
見込みのある以下のイン・ビトロ試験：
病気の進行の間の可能なマーカーとしての腫瘍細胞の手術前、中、後の播種性の評価のための散在性胃ＣＡについての基礎的スクリーニングとしての循環腫瘍細胞の検出用の血液；
手術前（ネオアジュバント）、手術中（腹膜、門静脈）および手術後（添加剤またはアジュバント）治療にための計画に関する突然変異Ｅ−カドヘリンの治療前検出のための腫瘍バイオプシー；
腫瘍細胞の測定（例えば、切除の程度を保証する、除去の縁）のためのＯＰ調製；
転移および腫瘍細胞の検出（例えば、ミクロエンボルブメント（ｍｉｃｒｏｅｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ））のためのリンパ節；
腹腔における播種性腫瘍細胞の測定のための洗浄；
播種性腫瘍細胞の測定（免疫組織化学）のための組織；
疑われる組織試料の鑑別診断評価のための特徴的Ｅ−カドヘリン突然変異の免疫組織化学的測定のための癌の鑑別診断；
血液細胞（ＤＮＡ）におけるＥ−カドヘリン突然変異の高危険群（「癌家系」）測定のスクーニング；
イン・ビボ前提要件：イムノシンチグラフィーによる腫瘍細胞の治療使用特異的測定のための抗体のヒト化：治療の間の対照のための、または、各々、成功した治療の確認のためのおよび病気の治療後の対照のための手術計画／治療計画の設定のための予備治療；
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による治療：突然変異−特異的抗体に対する照射源の免疫照射治療カップリング；
抗体に対するトキシン（例えば、シュードモナス・トキシン）のイムノトキシン治療カップリング。
突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体による体細胞遺伝子治療：
ウイルス遺伝子発現系（例えば、アデノウイルス、またはＭＶＡ、ワクシニア−誘導発現ベクターとカップリングさせた；非ウイルス遺伝子発現系（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ＋Ｔ７ ＤＮＡベクター）とカップリングさせた；
特異的遺伝子導入のための可能な方法；
遺伝子工学：内因性免疫系についての腫瘍細胞を標識するための補因子（例えば、Ｂ７）の取り込み；内因性Ｔ細胞を活性化し、突然変異Ｅ−カドヘリン「少数抗原」を有する腫瘍細胞に対する免疫反応を開始させるためのアロ抗原（外来性ＨＬＡ抗原、「主要抗原」）の取り込み；アポトーシスを誘導する因子（例えば、ｐ５３）の特異的取り込みによる腫瘍細胞の殺傷；野生型癌遺伝子／サプレッサー遺伝子（例えば、Ｅ−カドヘリンそれ自体）の特異的取り込みによる悪性表現型の変換；酵素の特異的包含により毒性を形成させるためのプロトキシンの活性化（例えば、デアミナーゼ、５−フルオロシトシンの毒性５−フルオロウラシルへの変換）を用いる可能な治療アプローチ。
リボザイム
例えば、マルチ薬物−耐性トランスポーターをコードするＲＮＡの部位特異的破壊
Ｅ−カドヘリン突然変異の使用の分野を示すさらなる例
骨髄パーチング：イン・ビトロ処理した骨髄における腫瘍細胞の特異的測定および（例えば、抗体に結合したトキシンによる）骨髄からの腫瘍細胞の特異的排除のための抗体の同時使用；
抗原提示のための（腫瘍細胞に特異的に向けられたＴ細胞クローンの活性化）突然変異Ｅ−カドヘリンペプチド配列（表３参照）を樹状細胞にチャージする免疫治療。
【００３４】
蛋白質の細胞内変性は異なる長さを有するペプチドを生じさせる。９−１１アミノ酸の長さを持つペプチドは細胞のＭＨＣによって「チェックされ」（ペプチド結合領域における結合能力は、個々のアミノ酸の特定の配置に依存し、「非自己」および「自己」の間を識別する）、もし特定の配列が非自己として認識されれば、細胞表面に提示される。共刺激体の作用によって、これは免疫反応に至り得る。本発明者らによって初めて記載された突然変異Ｅ−カドヘリンおよび突然変異によって生じる他のペプチドのペプチド配列については、それらのいくつかは非自己ペプチドとしてＭＨＣによって提示されることが予測できる。この事象は患者において免疫反応を刺激しないという事実は、抗原を提示するのが乏しい腫瘍細胞の特性によって説明できるであろう。見い出された突然変異スキャンニングペプチドを専門的な抗原提示細胞（樹状細胞）に種々の長さで取り付けることができる。この細胞に全ての必要な共刺激体が存在するため、かかるＭＨＣ−ペプチド複合体に対する対応するＴ細胞刺激が達成される。このようにして、免疫系によって最初は無視された腫瘍細胞も次いで非自己として認識され、排除される。
【００３５】
この使用は特定の突然変異−特異的抗体を必要としないが、本発明により記載される新しく生成したペプチドの配列についての知識を必要とする。
【００３６】
本発明によると、以下の目的および方法は、ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
突然変異したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたモノクローナル抗体よりなる。
【００３７】
ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、ＲＮＡレベルでエクソン８、エクソン９、またはオクソン１０における少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導く突然変異Ｅ−カドヘリンの配列に向けられたモノクローナル抗体。
【００３８】
以下の群：
の少なくとも１つから選択された、野生型Ｅ−カドヘリンと比較して欠失またはアミノ酸変化によって生じた前記アミノ酸配列の１以上の内の少なくとも１つの配列領域を認識するモノクローナル抗体。
【００３９】
また、本発明は、前記したモノクローナルの少なくとも２種の混合物よりなる。
【００４０】
本発明は、特に、突然変異した膜貫通Ｅ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられた前記モノクローナル抗体よりなる。
【００４１】
本発明のさらなる具体例は、本発明の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む胃癌細胞の検出用免疫テストよりなる。
【００４２】
さらに、本発明は以下の実施態様を含む：
ＤＮＡレベルで枠内突然変異によって生じ、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
突然変異した配列を特異的に含むように選択されたＥ−カドヘリンの突然変異したエクソン領域のＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列の増幅のためのＰＣＲプロセス用のプライマーよりなる。
【００４３】
突然変異した配列を特異的に含むように選択され、かつ以下の群：
【００４４】
本発明は、突然変異したＥ−カドヘリンのＤＮＡもしくはｃＤＮＡまたはそれから誘導されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を有効物質として含有し、ここに該ＤＮＡまたはｃＤＮＡが、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、および／または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く；
枠内突然変異を示す治療または診断手段よりなるのが特に好ましい。
【００４５】
さらに、本発明は、ストレンジェント条件下で、以下のＤＮＡ配列もしくはその相補的鎖またはそれから誘導されるＲＮＡ配列の少なくともいくつかにハイブリダイズする核酸を含有し、ここに、少なくとも枠内突然変異によって生じる配列領域も含まれる治療または診断手段よりなる。
さらに、本発明により、ストリンジェント条件下で前記核酸にハイブリダイズする核酸を有効物質として含有する治療または診断手段よりなる。
【００４７】
本発明の精神内にあるストレンジェント条件は、本発明により定義された核酸への核酸の選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件と定義される。ストレンジェント条件下でのこの種のハイブリダイゼーションは、好ましくは、水性溶液中にて６８℃で、あるいは５０％ホルムアミド中にて４２℃で行われるハイブリダイゼーション、および続いての水性溶液中での６５℃の温度におけるフィルターの洗浄を意味し、しかる後に、本発明により定義される核酸またはそれから誘導されるＲＮＡへのプローブの結合を依然検出することができる。要すれば、厳格さが低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を使用することもできる。
【００４８】
本発明によって提供されるモノクローナル抗体は胃癌、特に散在性胃癌の診断および治療に有用である。
【００４９】
治療では、本発明のモノクローナル抗体を、例えば、胃癌細胞のすくなくともいくらかの選択的排除のための手段に結合させることができる。この手段は、好ましくは、トキシンまたは照射源を含むことができる。
【００５０】
また、本発明は、請求項でより詳細に特徴付けたＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドよりなる。これらは腫瘍、特に胃癌の免疫治療に有用である。
【００５１】
本発明のさらなる実施態様において、以下の工程：
ａ．ヒト細胞を含有する試料物質を供し、
ｂ．ヒト細胞からｍＲＮＡを回収し、
ｃ．ｍＲＮＡを逆転写し、
ｄ．請求項８または９記載のプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応を行い、
ｅ．ポリメラーゼ鎖反応の反応生成物を分離し分析する；
ことによってヒト細胞を含有する試料物質中の腫瘍細胞を測定する方法が記載される。
【００５２】
また、本発明は、本発明によって提供されるオリゴヌクレオチド配列を含有するベクターよりなる。
【００５３】
かくして、Ｅ−カドヘリンの枠内突然変異を胃癌の診断および治療で使用できることが本発明によって判明した。「枠内突然変異」なる用語は、ＤＮＡレベルで起こるＥ−カドヘリンにおける突然変異または欠失を意味することを意図し、これはＲＮＡレベルで欠失または塩基交換に導くが、該欠失または該突然変異も読枠置換には至らない。
【００５４】
方法
１．新しいＥ−カドヘリン突然変異についての調査
胃癌に罹った６３人の患者の組織を調べた。切除後の新鮮な腫瘍組織を液体窒素中で深−凍結した。深−凍結組織試料の全ＲＮＡを標準的な手法（シソチオシアン酸グアニジウム抽出およびＣｓＣｌ遠心）を用いて単離した。２μｇのＲＮＡの逆転写に続き、ＰＣＲによってＥ−カドヘリンｃＤＮＡの全暗号領域を増幅した。使用したＰＣＲプライマーを表４にリストする。全てのＰＣＲ反応についての増幅条件は以下の通りである：９４℃における１分間の変性；５５℃における１分間のプライマーアニーリング；および７２℃における１分間の伸長。Ｔａｑポリメラーゼおよび増幅緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。Ｂｉｏｍｅｄ ＰＣＲデバイス（Ｂｉｏｍｅｄ−Ｌａｂｏｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｌ， Ｏｂｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｅｉｍ）を用いた。増幅の産物はアガロースゲル電気泳動によってチェックし、引き続いてガラスミルク（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩ， Ｂｉｏ１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて精製した。しかる後、単離したＤＮＡ増幅体の全長を配列決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０／ＵＳＢ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ， ＵＳＡ）。
【００５５】
【表４】
「ヌクレオチド位置」はＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータバンク、アクセス番号Ｚ１３００９で利用できるＥ−カドヘリン配列をいう。
【００５７】
２．免疫組織化学的試験（突然変異−特異的ではない）
ホルマリン中に固定し、パラフィン中に封埋された組織の保存物質を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン酸およびマイクロ波での処理に続き、組織試料を１％Ｈ２Ｏ２中にて１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。Ｅ−カドヘリン−特異的免疫反応性の測定のために、組織をモノクローナル抗体ＨＥＣＤ−１（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， 日本国，１：５００希釈）と共に４℃で１６時間インキュベートした。抗体結合の可視化はアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）およびペルオキシダーゼ方法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ， Ｂｕｒｌｉｎｇｇａｍｅ， ＣＡ； Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＤＡＢ， Ｓｉｇｍａｎ Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）を用いて行った。核小体の逆染色にはｈｅｍａｌｕｍを用いた。また、全ての腫瘍切片は対照としての非悪性粘膜の一部を示した。陰性対照はＨＥＣＤ−１抗体をリン酸緩衝化ＮａＣｌによって置き換えることによって行った。
【００５８】
Ｅ−カドヘリンの発現ベクターへのクローニング
突然変異Ｅ−カドヘリンの細胞内位置を調べるために、突然変異分子を発現ベクターにクローン化した。例として、ヒト野生型Ｅ−カドヘリンに加えてＥ−カドヘリンｍＲＮＡの４つの異なる突然変異体を発現ベクターにクローン化した。これらの４つの突然変異のうち２つがエクソンのうちの１つの完全に喪失、エクソン８（１２９ｂｐ）の欠失またはエクソン９（１８３ｂｐ）の欠失いずれかを呈した。もう１つの突然変異はエクソン１０（６３ｂｐ）の部分的欠失を示す。第４の突然変異はエクソン８における塩基交換よりなり、これは潜在的なカルシウム結合部位破壊する。発現クローニングニ考えられた突然変異の全てはＥ−カドヘリンの細胞内領域にある（全ての突然変異につき図１参照）。
【００５９】
クローニングのための出発物質は、各突然変異（前記参照）が同定された散在性胃癌の新鮮な物質から単離した全ＲＮＡであった。逆転写の後に得られた野生型Ｅ−カドヘリンおよび突然変異の各ｃＤＮＡを２つの部分的断片（Ａ＋Ｂ）の形態で増幅した（図７参照）。一緒にすると、２つの部分的断片は２６４９ｂｐ（野生型）よりなるＥ−カドヘリンの完全な暗号領域よりなる。断片Ａ（５’領域）の増幅はプライマーＡＴＧおよびｒＥＸ１０を用いて行った（表５参照）。野生型ｍＲＮＡの３’断片（Ｂ）、エクソン９欠失、エクソン１０における部分的欠失、およびエクソン８における点突然変異の増幅には、プライマーＥｘ８−ｒ３’／２／ｎｅｕの対を使用した。エクソン８欠失突然変異体の断片Ｂ’の増幅は対Ｅｘ９／１−ｒ３’／２／ｎｅｕを用いて行った。
【００６０】
増幅された部分的断片ＡおよびＢを、各々、ＰＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。これらのベクターを用い、特異的ＴＡ塩基対合によって生じたＰＣＲの直接的かつ効果的なクローニングが達成された。全ての５つのカドヘリンｃＤＮＡ（野生型＋４つの突然変異体）の２つの部分的ｃＤＮＡ断片を、本明細書には詳細に記載しないが十分に当業者の技量内にある異なるクローニング戦略を用いるクローニングによって一緒に適当に連結した。このようにして、ＰＣＲＩＩベクターにおける全ての５つのｃＤＮＡの構築体が得られた。
【００６１】
増幅の間に主として生成したかも知れないクローニング人工物（Ｔａｑの誤り）を排除するために、全ての５つのｃＤＮＡを、ベクター／カドヘリン連結領域を含めたそれらの全長の配列を決定することによって調べた。
【００６２】
［以下余白］
【表５】
さらなる工程において、配列決定によって確認されたカドヘリン構築体を真核生物発現ベクターにクローン化した。一方、所望のｃＤＮＡの発現に加えて、発現された細胞クローンの選択（ネオマイシン耐性遺伝子の発現）を可能とする商業的に入手可能なベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を選択し、他方、第２のベクターとして、ネズミ野生型Ｅ−カドヘリン構築体のトランスフェクションで既に成功して使用たれｐＢＡＴベクターを用いた（Ｎｏｓｅ， Ａ．， Ｎａｇａｆｕｃｈｉ， Ａ．， Ｔａｋｅｉｃｈｉ，Ｍ．， 「発現された組換えカドヘリンはモデル系において細胞ソーティングを媒介する」 Ｃｅｌｌ １９８８， ５４：９９３−１００１）。
【００６４】
４．一過性トランスフェクションおよびウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電子顕微鏡検によるＥ−カドヘリンの検出
トランスフェクションのためにＣａＰＯ４沈殿が確立されている。該方法のトランスフェクション効率は対照としてｐＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて評価した。該ベクターは、色素Ｘ−ｇａｌ（青色）への変換後に該ベクターが取り込まれた細胞の検出を可能とするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該方法の効率は１０％の範囲にあり、これは一過性トランスフェクションには非常に良好な値である。
【００６５】
ｃＤＮＡの上流に転写認識領域（Ｋｏｚａｋ配列）およびそのクローニング部位を含有する５’非翻訳領域の増幅後の発現実験において、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ−２、Ｅ−カドヘリンを欠く膵臓細胞系において、およびＮｅｕｒｏ ２Ａ（神経繊維芽細胞）細胞において、一過的に改変したＥ−カドヘリンｃＤＮＡ構築体を発現させることができた。
【００６６】
細胞培養におけるＥ−カドヘリンの測定は、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光および免疫電子顕微鏡検によって行った。まず、（トランスフェクトしたまたはトランスフェクトしてない）細胞のＳＤＳ溶解を行って、ウェスタンブロッティング用の全細胞溶解物を調製した。これを行うのに、本発明者らは、引き続いてのゲル泳動の間に溶解物の調査に必要な不規則電解質移動度を得た。別法として、トリトンＸ−１００溶解による細胞抽出物をテストした。ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシー染色による抽出物の調査は、細胞の破壊が効果的であることを示した。従って、トリトン溶解を全ての引き続いての実験で用いた。
【００６７】
本発明者らは、Ｅ−カドヘリンの特異的測定のためにＥ−カドヘリンに対する４つの異なるモノクローナル抗体（ＨＥＣＤ−１，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， 日本；ＡＭＳＴ１０，Ｓａｘｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ； ＤＥＣＭＡ−１，Ｓｉｇｍａ； ＡＮＴＩ−Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ， Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いた。ウェスタンブロッティングの間の抗原−抗体複合体の検出は第２のペルオキシダーゼ標識抗体を用いてルミネッセンス反応（ＥＣＬ−Ｗｅｓｔｅｒｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって行った。それらは異なる強度で反応したが、テストした抗体の全ては、Ｅ−カドヘリン陽性対照細胞系Ａ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）を含む、および野生型Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトされたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を含む細胞抽出物において特異的反応を示した。トランスフェクトしていない系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２およびＮｅｕｒｏ ２Ａの抽出物では陽性シグナルは検出できなかった。
【００６８】
免疫蛍光を行うためには、カバーグラス上に撒いた細胞をメタノールによって固定し、Ｅ−カドヘリンに特異的な抗体ＨＥＣＤ−１（野生型Ｅ−カドヘリンおよび突然変異した、例えばエクソン９が欠失したＥ−カドヘリンを認識）によって標識した。二次抗体として、ローダミン−（ＴＲＩＴＣ−）カップリングのヤギ抗−マウス抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。
【００６９】
トランスフェクションが成功したか否かを免疫蛍光によって判断するために、トランスフェクトしていないＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、および突然変異Ｅ−カドヘリンによって、および野生型Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトした細胞を同時に調べた。固定およびＥ−カドヘリンに特異的な金標識抗体（ＨＥＣＤ−１）とのインキュベーションの後、標識細胞をｅｐｏｎ中に封埋し、酢酸ウラニル／鉛でコントラストを着けた。トランスフェクトしていないＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞では標識は検出されず、他方、トランスフェクトした細胞系は膜と結合した金標識を示した。すなわち、野生型Ｅ−カドヘリンならびに突然変異したＥ−カドヘリン（例えば、エクソン９欠失を有する、図３参照）が膜に繋ぎ止められた。
【００７０】
５．Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞系
本発明者らは野生型ならびに突然変異したＥ−カドヘリンを一過的にトランスフェクトした細胞で同定するのに成功した後、Ｅ−カドヘリンを安定に発現する細胞の調製を開始した。これは、各ｐＢＡＴ構築（「クローニング」参照）およびＥ−カドヘリンを含まないが代わりにネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＢＡＴベクターでＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を共トランスフェクトするこによって行った。ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のエクソン９の欠失を呈する３つの細胞系（Ｄｅｌ９）および野生型ヒトＥ−カドヘリンを保有する３つの系（ＷＴ）が確立された。Ｄｅｌ９系およびＷＴ系のＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの調査は、予期された断片サイズ（野生型についての正常サイズのｍＲＮＡ（７７９ｂｐ）；Ｄｅｌ−９系についての短鎖化ｍＲＮＡ（５９６ｂｐ）、この場合、野生型Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡは発現されなかった）を示した。ＰＣＲ増幅はプライマーＥｘ７およびｒＥＸ１１（表５参照）を用いて行った。安定にトランスフェクトされたＤｅｌ−９系の、およびＷＴ系のうちの１つの抽出物のウェスタンブロッティングは明らかにＥ−カドヘリン蛋白質を検出した。
【００７１】
免疫蛍光を用いるＷＴ系におけるＥ−カドヘリン発現の調査は、隣接細胞への接触部位において予期された特徴の分布を明らかにした。ＨＥＣＤ−１抗体を用い、Ｄｅｌ−９細胞系も細胞−細胞結合においてＥ−カドヘリンの標識を示した（図２）。
【００７２】
６．（例として腹腔洗浄を用いる）迅速なＲＮＡ抽出および引き続くＰＣＲによる突然変異の測定
洗浄調製物中の細胞の沈降およびＲＮＡ抽出（Ｒｎｅａｓｙ Ｒａｐｉｄ 抽出キット、Ｑｕｉａｇｅｎ）の後、ＲＮＡを逆転写し、得られたＥ−カドヘリンｃＤＮＡの全長をＰＣＲ（プライマーおよび条件は前記）によって増幅する。Ｅ−カドヘリン突然変異は主として枠内欠失を含むので、これらはアガロースゲル電気泳動によって迅速かつ安全に検出される。かくして、洗浄を受容して既に９時間経った後、Ｅ−カドヘリンにおける可能な欠失、例えば、エクソン８またはエクソン９の喪失が検出でき、それにより、腹腔中の播種性腫瘍細胞の検出が可能である。この情報のため、臨床判断のクールに直接影響し得る（例えば、さらなる腹腔内治療）。
【００７３】
これにより、検出の高度に特異的な方法を迅速かつ安全に、また少量の腫瘍細胞でもって行うことができる。Ｅ−カドヘリン突然変異の腫瘍特異性は、炎症中皮細胞のごとき「腫瘍様」形態を持つ細胞に関する曖昧性を排除することを可能とする。
【００７４】
７．（例としてエクソン９欠失に特異的な抗体７Ｅ６を用いる）突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体の調製およびテスト
ペプチド合成。モデル４３０Ａペプチド合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， 速−Ｆｍｏｃ修飾に適合）（ペプチド配列：エクソン９のＥ−カドヘリン欠失、表３ １２３２ｄｅｌ１８３参照）を用いて以下のペプチドを合成した：Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ。アミノ酸Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ＡｓｐおよびＧｌｕは側鎖を保護して合成した。９５％トリフルオロ酢酸中でペプチドを合成樹脂から切り離し、ｔｅｒｔ−ブチルエーテルで沈殿させ、凍結乾燥した。しかる後、原料生成物を０．１％トリフルオロ酢酸に溶解させ、７０％アセトニトリル中の直線グラジエントにての逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ ３００Ａ， ＣＳ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。生成物の純度を電気スプレイイオン化によってモデルＡＰ１００マススペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でテストした。
【００７５】
担体へのカップリングおよび免疫化：Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａからのキイホールリンペットヘモシアニン（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｂａｄ Ｓｏｄｅｎ）を免疫化のための担体蛋白質として用い、室温にて１−エチル−３−（ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドを用い、０．５Ｍ Ｎ−メチルイミダゾール緩衝液（Ｓｇｉｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）ｐＨ７．０中でペプチドに結合させた。合計して、２．８ｍｇのペプチドを２．０ｍｇのヘモシアニンにカップリングさせた。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対する透析の後、得られた溶液を免疫化に用いた。同一の方法を、２ｍｇのペプチドの２ｍｇの４×結晶化ウシ血清アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ， Ｍａｒｂｕｒｇ）へのカップリングに用い、これをＥＬＩＳＡテストにおけるハイブリドーマ培養上清をテストするのに用いた。免疫化はＬｏｕ／Ｃラットで行い、５０μｇのＫＬＨがカップリングしたヘプチドを５００μｌ ＰＢＳを用いて希釈し、同一量のＣＦＡによって乳化した。５００μｌの得られたエマルジョンを、各々、腹腔内および皮下適用した。３カ月後、ＣＦＡ無しでＫＬＨにカップリングしたペプチドを用いてブースター注射を行った。ブースター注射の３日後に注入を行った。ネズミ形質細胞腫細胞系Ｐ３×６３ Ａｇ ８．６５３を注入細胞系として供した。ＥＬＩＳＡを行って、特異的ペプチドについて、および対照として供する同一のカップリング化学を用いてＢＳＡにカップリングさせた無関係ペプチドにつきテストした。特異的ペプチドと絶対的に反応するハイブリドーマを凍結し、その上清をさらなる分析に付した。サブクラス−特異的モノクローナル抗体を用いてサブクラスを測定した。
【００７６】
ＦＡＣＳ分析：エクソン９欠失Ｅ−カドヘリン（前記参照）でトランスフェクトした２００，０００のＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞またはトランスフェクトしなかった２００，０００ののＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞を、各々、５０μｌのハイブリドーマ上清と一緒にインキュベートした。５０μｌの安定に希釈したヤギ−抗−ラットＦＩＴＣを３０分間で添加して、結合抗体を検出した。細胞をＦＡＣｓｃａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ）で分析した。ｍａｂ ７Ｅ６は「ラットＩｇＧ１」サブクラスに属し、ＦＡＣｓｃａｎで最高の強度を示す。
【００７７】
免疫蛍光：免疫蛍光を行うため、カバーグラス上に撒いた細胞（各々、エクソン９欠失Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、またはトランスフェクトしなかったＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞）をメタノールで固定し、Ｅ−カドヘリン突然変異につき特異的な抗体７Ｅ６によって標識した。二次抗体として、ＦＩＴＣがカップリングしたヤギ−抗−ラット抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いた。
【００７８】
ウェスタン−ブロッティング：Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞（野生型またはエクソン９欠失Ｅ−カドヘリンいずれかでトランスフェクトしたもの）の、およびさらなる細胞系の細胞抽出物を、ウェスタンブロット上にて突然変異−特異的抗体によって調べた。抗体７Ｅ６を用い、トランスフェクトしなかった系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ、ＭＩＡ ＰａＣａ−２（ヒト膵臓癌）、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、およびＡ４３１（類表皮癌、ＡＴＣＣ）の抽出物では陽性シグナルは検出できなかった。また、野生型Ｅ−カドヘリンでトランスフェクトした細胞は７Ｅ６でシグナルを示さなかった。突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６と反応した唯一の細胞系はエクソン９欠失Ｅ−カドヘリンによってトランスフェクトしたＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓであった。
【００７９】
免疫組織化学：Ｅ−カドヘリンのエクソン９の喪失が分子生物学によって検出された、胃癌患者の保存物質（ホルマリン固定し、パラフィン封埋した組織）を脱パラフィンおよび脱水に付した。クエン酸およびマイクロ波での処理の後、組織試料を１％Ｈ２Ｏ２中で１５分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロックした。Ｅ−カドヘリン突然変異−特異的免疫反応性の検出には、組織を４℃で７Ｅ６モノクローナル抗体と共に１６時間にわたってインキュベートした。抗体の結合をアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）およびペルオキシダーゼ方法（ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ； Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＤＡＢ， Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｍｈｏｆｅｎ）を用いて可視化した。核小体の逆染色はｈｅｍａｌｕｍを用いて行った。腫瘍切片の全ては対照としての非悪性粘膜の部分を示した。陰性対照はリン酸緩衝化ＮａＣｌによって７Ｅ６抗体を置き換えることによって行った。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、散在性胃癌の特異的検出に有用なモノクローナル抗体が提供される。また、散在性胃癌の検出および治療に有用な治療および診断手段が提供される。
［以下余白］
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】典型的には枠内欠失である散在性胃癌におけるＥ−カドヘリン突然変異を表す図である。
【図２】免疫蛍光による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置を表す顕微鏡写真である。
【図３】免疫電子顕微鏡検による突然変異Ｅ−カドヘリンの膜位置を表す顕微鏡写真である。
【図４】本発明によるＥ−カドヘリン突然変異の迅速な診断のフローダイアグラムである。
【図５】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色されたウェスタンブロットを示す写真である。
【図６】突然変異−特異的Ｅ−カドヘリン抗体７Ｅ６によって染色された免疫組織を表す顕微鏡写真である。
Claims (9)
- ＤＮＡレベルでの枠内突然変異によって生じ、少なくとも、
ａ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失に導く、または
ｂ．ＲＮＡレベルでエクソン中に少なくとも１つの塩基トリプレットの１または２のヌクレオチドの交換に導き、引き続いて野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質の少なくとも１つのアミノ酸の交換に導く、突然変異したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたモノクローナル抗体であって、該抗体が、以下の群：
「配列表１」
（式中、「/」は欠失の位置を示し、下線を施した文字は点突然変異によって変化したアミノ酸を示し、各々は野生型Ｅ−カドヘリン蛋白質と比較したものである）の少なくとも１つから選択され、野生型Ｅ−カドヘリンと比較して欠失またはアミノ酸交換によって生じた前記アミノ酸配列の少なくとも１つ内の配列領域を少なくとも認識することを特徴とするモノクローナル抗体。 - 前記抗体が、ＤＮＡレベルでの枠内突然変異によって生じ、ＲＮＡレベルでエクソン８、エクソン９、またはエクソン１０における少なくとも１つの塩基トリプレットまたはその多量体の喪失に導く突然変異したＥ−カドヘリンのアミノ酸配列に向けられたことを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１記載の少なくとも１のアミノ酸配列に特異的に向けられた少なくとも２つのモノクローナル抗体の混合物からなるモノクローナル抗体。
- 前記抗体が突然変異した膜貫通Ｅ−カドヘリンのアミノ酸配列に特異的に向けられたことを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
- 細胞系がハイブリドーマ細胞系デルタＣＡＤ−９、クローン７Ｅ６−１、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２７７であることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体を産生する細胞系。
- 請求項１から４のいずれか一項記載の少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む胃癌細胞の検出用免疫試験キット。
- １以上の請求項１から４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む、胃癌の診断および治療のための薬剤。
- 前記のモノクローナル抗体が少なくとも複数の胃癌細胞の選択的排除のための手段に結合していることを特徴とする請求項７記載の薬剤。
- 前記のモノクローナル抗体がトキシンまたは照射源に結合されていることを特徴とする請求項８記載の薬剤。
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