PT1924600E - Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia - Google Patents

Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia Download PDF

Info

Publication number
PT1924600E
PT1924600E PT67918789T PT06791878T PT1924600E PT 1924600 E PT1924600 E PT 1924600E PT 67918789 T PT67918789 T PT 67918789T PT 06791878 T PT06791878 T PT 06791878T PT 1924600 E PT1924600 E PT 1924600E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
nucleic acid
associated antigen
tumor associated
expression
quot
Prior art date
Application number
PT67918789T
Other languages
English (en)
Inventor
Oezlem Tuereci
Ugur Sahin
Dirk Usener
Michael Koslowski
Original Assignee
Ganymed Pharmaceuticals Ag
Johannes Gutenberg Uni Mainz Vertreten Durch Den Praesidenten
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ganymed Pharmaceuticals Ag, Johannes Gutenberg Uni Mainz Vertreten Durch Den Praesidenten filed Critical Ganymed Pharmaceuticals Ag
Publication of PT1924600E publication Critical patent/PT1924600E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia"
Apesar das abordagens interdisciplinares e utilizações exaustivas de procedimentos terapêuticos clássicos, os cancros estão ainda entre as principais causas de morte. Conceitos terapêuticos mais recentes visam a incorporação do sistema imunitário do paciente no conceito terapêutico global por utilização de vacinas tumorais recombinantes e outras medidas especificas tais como a terapia com anticorpos. Um pré-requisito para o sucesso de uma tal estratégia é o reconhecimento de antigénios ou epítopos específicos de tumores ou associados a tumores pelo sistema imunitário do paciente cujas funções efectoras se pretendem intervencionalmente reforçadas. As células tumorais, biologicamente, diferem substancialmente das suas células de origem não maligna. Estas diferenças são devidas a alterações genéticas adquiridas durante o desenvolvimento do tumor e resultam, inter alia, também na formação de estruturas moleculares qualitativa ou quantitativamente alteradas nas células cancerosas. As estruturas associadas a tumores deste tipo que são reconhecidas pelo sistema imunitário específico do hospedeiro portador do tumor são referidas como antigénios associados a tumores. 0 reconhecimento específico de antigénios associados a tumores envolve mecanismos celulares e humorais que são duas unidades funcionalmente interligadas: os linfócitos T CD4+ e CD8+ reconhecem os antigénios processados apresentados nas moléculas do MHC (complexo principal de histocompatibilidade) das classes II e I, respectivamente, enquanto os linfócitos B produzem moléculas de anticorpos circulantes que se ligam directamente a antigénios não processados. A potencial importância clínico-terapêutica de antigénios associados a tumores resulta do facto de que o reconhecimento de antigénios em células neoplásticas pelo sistema imunitário conduz à iniciação de mecanismos efectores citotóxicos e, na presença de células T auxiliares, pode causar a eliminação das células cancerosas (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Deste modo, um objectivo central da imunologia tumoral consiste em definir molecularmente estas estruturas. A natureza molecular destes antigénios foi 2 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ enigmática durante muito tempo. Apenas após o desenvolvimento de técnicas de clonagem apropriadas foi possível rastrear sistematicamente bibliotecas de expressão de ADNc de tumores quanto a antigénios associados a tumores por análise das estruturas alvo de linfócitos T citotóxicos (CTL) (van der Bruggen et ai., Science 254:1643-7, 1991) ou utilizando auto- anticorpos circulantes (Sahin et al. , Curr. Opin. Immunol. 9:709-16, 1997) como sondas. Para este fim, foram preparadas bibliotecas de expressão de ADNc a partir de tecido tumoral fresco e expressas recombinantemente na forma de proteínas em sistemas adequados. Imunoefectores isolados de pacientes, nomeadamente clones de CTL com padrões de lise específicos de tumores, ou auto-anticorpos circulantes foram utilizados para a clonagem dos antigénios respectivos.
Em anos recentes foram definidos uma multiplicidade de antigénios em várias neoplasias através destas abordagens.
Contudo, as sondas utilizadas para a identificação de antigénios nos métodos clássicos são imunoefectores (auto-anticorpos circulantes ou clones de CTL) de pacientes usualmente possuindo cancro já avançado. Vários dados indicam que os tumores podem conduzir, por exemplo, a desenvolvimento de tolerância e anergia de células T e que, no decurso da doença, especialmente as especificidades que poderiam causar um reconhecimento imunitário eficaz são perdidas do repertório imunoefector. Os actuais estudos de pacientes ainda não produziram nenhuma evidência sólida de uma acção real dos antigénios associados a tumores previamente encontrados e utilizados. Deste modo, não se pode excluir que proteínas que evocam respostas imunitárias espontâneas sejam as estruturas alvo erradas.
Foi o objecto da presente invenção proporcionar estruturas alvo para um diagnóstico e terapia de cancros.
Este objecto é conseguido pela matéria objecto das reivindicações.
De acordo com a invenção, são identificados genes que são selectiva ou aberrantemente expressos em células tumorais e assim, proporcionam antigénios associados a tumores. Estes 3 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ genes e/ou os seus produtos genéticos são úteis como estruturas alvo para abordagens terapêuticas e de diagnóstico.
Num aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica, compreendendo um ou mais componentes seleccionados do grupo que consiste em: (i) um anticorpo que se liga à porção extracelular de um antigénio associado a tumores, (ii) um ácido nucleico anti-sentido que híbrida especificamente com um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores, e (iii) um ARNip (em inglês siRNA) dirigido contra um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) , para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores.
Numa concretização, o cancro é um tumor pulmonar, um tumor mamário, um tumor da próstata, um melanoma, um tumor do cólon, um tumor gástrico, um tumor pancreático, um tumor otorrinolaringológico, um carcinoma de células renais ou um carcinoma cervical, um carcinoma do cólon ou um carcinoma mamário.
Numa concretização, o antigénio associado a tumores compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, e 7-11. 4 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
Numa concretização, ο anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em outras concretizações, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado, um fragmento de um anticorpo natural ou um anticorpo sintético. 0 anticorpo pode estar acoplado a um agente útil terapeuticamente ou em diagnóstico, também denominado aqui agente terapêutico ou de diagnóstico.
Numa concretização, o ácido nucleico anti-sentido compreende uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30, nucleótidos contíguos do ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores.
Em concretizações particulares do ARNip que tem como alvo o ácido nucleico de acordo com SEQ ID NO:l, a cadeia de ARN de sentido directo possui a sequência de SEQ ID NO:12 e a cadeia de ARN anti-sentido possui a sequência de SEQ ID NO: 13, ou a cadeia de ARN de sentido directo possui a sequência de SEQ ID NO:14 e a cadeia de ARN anti-sentido possui a sequência de SEQ ID NO:15 A composição farmacêutica pode compreender um transportador e/ou um adjuvante farmaceuticamente compatíveis. A invenção também se refere a um método in vitro de diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, método esse que compreende a detecção ou a determinação da quantidade (i) de um ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores, e/ou (ii) do antigénio associado a tumores, numa amostra biológica isolada de um paciente, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:l, 5
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) . A amostra biológica preferivelmente é isolada de um paciente possuindo a referida doença cancerosa, que se suspeita possuir ou adoecer com a referida doença cancerosa ou possuindo um potencial para a referida doença cancerosa. Os meios para a realização da referida detecção e/ou determinação da quantidade estão aqui descritos e serão evidentes para o perito na especialidade.
Preferivelmente, a presença do referido ácido nucleico e/ou do referido antigénio associado a tumores e/ou de uma quantidade do referido ácido nucleico e/ou do referido antigénio associado a tumores que está aumentada comparativamente com um paciente sem a referida doença cancerosa é indicativa da presença da referida doença cancerosa ou de um potencial para um desenvolvimento da referida doença cancerosa.
Os métodos de diagnóstico e/ou monitorização da invenção também incluem concretizações em que por detecção ou determinação da quantidade do referido ácido nucleico e/ou do referido antigénio associado a tumores é possível avaliar e/ou prognosticar o comportamento metastático da referida doença cancerosa, em que, preferivelmente, a presença do referido ácido nucleico e/ou do referido antigénio associado a tumores e/ou uma quantidade do referido ácido nucleico e/ou do referido antigénio associado a tumores que está aumentada comparativamente com um paciente sem a referida doença cancerosa ou sem uma metástase da referida doença cancerosa são indicativas de um comportamento metastático da referida doença cancerosa ou de um potencial para um comportamento metastático da referida doença cancerosa.
Em concretizações particulares, a referida detecção ou determinação da quantidade compreende (i) o contacto de uma 6 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ amostra biológica com um agente que se liga especificamente ao referido ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores ou ao referido antigénio associado a tumores e (ii) a detecção da formação ou a determinação da quantidade de um complexo entre o agente e o ácido nucleico ou do antigénio associado a tumores. Numa outra concretização, a amostra biológica isolada do paciente é comparada com uma amostra biológica normal comparável.
Os métodos de monitorização de acordo com a invenção preferivelmente compreendem a detecção e/ou a determinação da quantidade, numa primeira amostra num primeiro ponto temporal e numa outra amostra num segundo ponto temporal, em que o decurso da doença é determinado por comparação das duas amostras.
De acordo com a invenção, a detecção de um ácido nucleico ou a determinação da quantidade de um ácido nucleico podem ser realizadas utilizando uma sonda oligo- ou polinucleotídica que híbrida especificamente com o referido ácido nucleico ou podem ser realizadas por amplificação selectiva do referido ácido nucleico, e.g. por meio de amplificação por PCR. Numa concretização, a sonda oligo- ou polinucleotídica compreende uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30, nucleótidos contíguos do referido ácido nucleico.
Em concretizações particulares, o antigénio associado a tumores que se pretende detectar ou a sua quantidade que se pretende determinar nos métodos da presente invenção está presente intracelularmente, na superfície da célula ou num complexo com uma molécula do MHC. De acordo com a invenção, a detecção de um antigénio associado a tumores ou a determinação da quantidade de um antigénio associado a tumores podem ser realizadas utilizando um anticorpo que se liga especificamente ao referido antigénio associado a tumores.
Um agente que é utilizado para a detecção ou determinação da quantidade nos métodos da invenção tal como uma sonda oligo- ou polinucleotídica, ou um anticorpo, é preferivelmente marcado de uma maneira detectável, em particular através de um marcador detectável tal como um marcador radioactivo ou um marcador enzimático. 7
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT A invenção também se refere a um anticorpo para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização, i.e. determinação da regressão, progressão, decurso e/ou inicio de, uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) , em que o anticorpo se liga à porção extracelular do referido antigénio associado a tumores e está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico.
Numa concretização, o agente terapêutico ou de diagnóstico é uma toxina. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Em outras concretizações, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado ou um fragmento de um anticorpo natural.
Em certas concretizações, os métodos de diagnóstico ou de monitorização de uma doença cancerosa são realizados com uma amostra biológica contendo, ou que se suspeita conter, células tumorais disseminantes ou células tumorais metastáticas. Estas amostras biológicas incluem, por exemplo, sangue, soro, medula óssea, expectoração, aspirado bronquial e/ou lavagem bronquial.
De acordo com a invenção, o termo "ligação" refere-se preferivelmente a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agente, tal como um anticorpo, se liga mais fortemente a um alvo, tal como um epítopo, para o qual é 8
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT específico, comparativamente com a ligação a outro alvo. Um agente liga-se mais fortemente a um primeiro alvo comparativamente com um segundo alvo quando se liga ao primeiro alvo com uma constante de dissociação (KD) que é inferior à constante de dissociação para o segundo alvo. Preferivelmente, a constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente se liga especif icamente é mais do que 10 vezes, preferivelmente mais do que 20 vezes, mais preferivelmente mais do que 50 vezes, ainda mais preferivelmente mais do que 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes ou 1000 vezes inferior à constante de dissociação (KD) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente.
Estes anticorpos específicos podem, por exemplo, ser obtidos por imunização utilizando os péptidos supramencionados. A invenção também se refere a um conjugado entre um anticorpo e um agente terapêutico ou de diagnóstico, em que o anticorpo se liga especificamente à porção extracelular de uma proteína ou de um polipéptido, sendo os referidos proteína ou polipéptido codificados por um ácido nucleico seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão da proteína ou do polipéptido.
Numa concretização, o agente terapêutico ou de diagnóstico é uma toxina. A invenção também se refere à utilização de um kit para o diagnóstico in vitro de uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, kit esse que 9
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT compreende agentes para a detecção ou determinação da quantidade (i) de um ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores, e/ou (ii) do antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1 (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) .
Numa concretização, os agentes para a detecção do ácido nucleico são moléculas de ácido nucleico para a amplificação selectiva do referido ácido nucleico, que compreendem, em particular, uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30, nucleótidos contíguos do referido ácido nucleico.
Descrição detalhada da invenção
De acordo com a invenção, uma "referência" tal como uma amostra de referência ou um organismo de referência, pode ser utilizada para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos aqui descritos com uma amostra de teste ou organismo de teste, i.e. um paciente. Tipicamente o organismo de referência é um organismo saudável, em particular um organismo que não sofre de cancro.
Um "valor de referência" pode ser determinado a partir de uma referência empiricamente por medição de um número suficientemente grande de referências. Preferivelmente, o valor de referência é determinado por medição de pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3, preferivelmente pelo menos 5, preferivelmente pelo menos 8, preferivelmente pelo menos 12, preferivelmente pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30, 10 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ preferivelmente pelo menos 50, ou preferivelmente pelo menos 100 referências. "Derivado" de um ácido nucleico significa, de acordo com a invenção, que estão presentes no referido ácido nucleico substituições, deleções e/ou adições únicas ou múltiplas tais como pelo menos 2, pelo menos 4, ou pelo menos 6 e preferivelmente até 3, até 4, até 5, até 6, até 10, até 15 ou até 20 nucleótidos. Adicionalmente, o termo "derivado" também compreende a derivatização química de um ácido nucleico na base, no açúcar ou no fosfato de um nucleótido. O termo "derivado" também compreende ácidos nucleicos que contêm nucleótidos e análogos de nucleótidos que não ocorrem naturalmente.
De acordo com a invenção, um ácido nucleico é preferivelmente ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (ARN). Os ácidos nucleicos compreendem, de acordo com a invenção, moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm, produzidas recombinantemente e sintetizadas quimicamente. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode estar presente na forma de uma molécula de cadeia simples ou de cadeia dupla e linear ou circular covalentemente fechada.
Como aqui se utiliza, o termo "ARN" significa uma molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleótido. "Ribonucleótido" significa um nucleótido com um grupo hidroxilo na posição 2' de uma porção beta-D-ribo-furanose. O termo inclui ARN de cadeia dupla, ARN de cadeia simples, ARN isolado tal como ARN parcialmente purificado, ARN essencialmente puro, ARN sintético, ARN produzido recombinantemente, assim como ARN alterado que difere do ARN de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. Estas alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como na(s) extremidade(s) de um ARN ou internamente, por exemplo em um ou mais nucleótidos do ARN. Os nucleótidos nas moléculas de ARN podem também compreender nucleótidos não Standard, tais como nucleótidos que não ocorrem naturalmente ou nucleótidos ou desoxinucleótidos sintetizados quimicamente. Estes ARN alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de ARN de ocorrência natural. 11 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
Os ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção foram preferivelmente isolados. A expressão "ácido nucleico isolado" significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo por reacção em cadeia pela polimerase (PCR), (ii) produzido recombinantemente por clonagem, (iii) purificado, por exemplo por clivagem e fraccionamento electroforético em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação por técnicas de ADN recombinante.
Um ácido nucleico é "complementar" de outro ácido nucleico se as duas sequências são capazes de hibridar e formar um dúplex estável uma com a outra, sendo a hibridação preferivelmente realizada sob condições que permitem a hibridação específica entre polinucleótidos (condições rigorosas). As condições rigorosas estão descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ou em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York e referem-se, por exemplo, a hibridação a 65°C em tampão de hibridação (SSC 3,5x, Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina sérica bovina a 0,02%, NaH2P04 2,5 mM (pH 7), SDS a 0,5%, EDTA 2 mM) . O SSC é cloreto de sódio 0,15 M/ citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridação, a membrana para a qual o ADN foi transferido é lavada, por exemplo, com SSC 2x à temperatura ambiente e depois com SSC 0,l-0,5x/SDS 0,1χ a temperaturas até 68°C.
De acordo com a invenção, os ácidos nucleicos complementares possuem pelo menos 40%, em particular pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e preferivelmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, nucleótidos idênticos.
Com a expressão "percentagem de identidade" pretende-se denotar uma percentagem de nucleótidos ou de resíduos de aminoácido que são idênticos entre as duas sequências em comparação, obtida após o melhor alinhamento, sendo esta 12 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ percentagem puramente estatística e estando as diferenças entre as duas sequências distribuídas aleatoriamente e ao longo de todo o comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos são convencionalmente realizadas comparando estas sequências após as ter alinhado de forma óptima, sendo a referida comparação realizada por segmentos ou por "janelas de comparação" de modo a identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. 0 alinhamento óptimo das sequências para comparação pode ser produzido, para além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que utilizam estes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.). A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências que se estão a comparar, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando o resultado obtido por 100 de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.
Os ácidos nucleicos que codificam para antigénios associados a tumores podem, de acordo com a invenção, estar presentes isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos, em particular ácidos nucleicos heterólogos. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico está funcionalmente ligado a sequências de controlo da expressão ou sequências reguladoras que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao referido ácido nucleico. Uma sequência de codificação e uma sequência reguladora estão "funcionalmente" ligadas uma à outra, se estiverem covalentemente ligadas uma à outra de maneira a que a expressão ou a transcrição da referida sequência de codificação esteja sob o controlo ou sob a influência da referida sequência reguladora. Se a sequência de codificação vai ser traduzida numa proteína funcional, então, com uma sequência reguladora funcionalmente ligada à 13 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT referida sequência de codificação, a indução da referida sequência reguladora resulta na transcrição da referida sequência de codificação, sem provocar um desvio de enquadramento na sequência de codificação ou que a referida sequência de codificação não possa ser traduzida na proteína ou péptido desejados.
As expressões "sequência de controlo da expressão" ou "sequência reguladora" compreendem, de acordo com a invenção, promotores, potenciadores e outros elementos de controlo que regulam a expressão de um gene. Em concretizações particulares da invenção, as sequências de controlo da expressão podem ser reguladas. A estrutura exacta das sequências reguladoras pode variar em função da espécie ou do tipo de célula, mas geralmente compreende sequências não transcritas a 5' e não traduzidas a 5' que estão envolvidas na iniciação da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como a caixa TATA, sequência de remate, sequência CAAT, e similares. Mais especificamente, as sequências reguladoras não transcritas a 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controlo da transcrição do gene funcionalmente ligado. As sequências reguladoras podem também compreender sequências potenciadoras ou sequências activadoras a montante.
De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode adicionalmente estar presente em combinação com outro ácido nucleico que codifica para um péptido que controla a secreção da proteína ou do péptido codificados pelo referido ácido nucleico a partir de uma célula hospedeira. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode também estar presente em combinação com outro ácido nucleico que codifica para um péptido que faz com que a proteína ou o péptido codificados fiquem ancorados na membrana celular da célula hospedeira ou compartimentados em organelos particulares da referida célula. Similarmente, é possível uma combinação com um ácido nucleico que represente um gene repórter ou qualquer "marcador".
Numa concretização preferida, uma molécula de ácido nucleico recombinante é, de acordo com a invenção, um vector, quando apropriado com um promotor, que controla a expressão de um ácido nucleico, por exemplo um ácido nucleico que codifica 14
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT para um antigénio associado a tumores identificado de acordo com a invenção. O termo "vector" é aqui utilizado com o seu significado mais geral e compreende qualquer veiculo intermediário para um ácido nucleico que permita que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procariotas e/ou eucariotas e, quando apropriado, seja integrado num genoma. Os vectores deste tipo são preferivelmente replicados e/ou expressos nas células. Um veiculo intermediário pode estar adaptado, por exemplo, à utilização em electroporação, em bombardeamento com microprojécteis, em administração lipossómica, na transferência com o auxilio de agrobactérias ou em inserção por via de vírus de ADN ou de ARN. Os vectores compreendem plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos ou genomas virais.
Os ácidos nucleicos que codificam para um antigénio
associado a tumores aqui descrito podem ser utilizados para transfecção de células hospedeiras. Os ácidos nucleicos aqui significam tanto ARN como ADN recombinantes. 0 ARN recombinante pode ser preparado por transcrição in vitro de um molde de ADN. Adicionalmente, pode ser modificado com sequências de estabilização, remate e poliadenilação, antes da aplicação.
De acordo com a invenção, a expressão "célula hospedeira" refere-se a qualquer célula que possa ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. A expressão "células hospedeiras" compreende, de acordo com a invenção, células procariotas (e.g. E. coli) ou eucariotas (e.g. células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levedura e células de insecto). É dada particular preferência a células de mamífero tais como células de seres humanos, de ratinhos, de hamsters, de porcos, de cabras, de primatas. As células podem ser derivadas de uma multiplicidade de tipos de tecidos e compreender células primárias e linhas celulares. Os exemplos específicos compreendem queratinócitos, leucócitos de sangue periférico, células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias. Em outras concretizações, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antigénio, em particular uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago. Um ácido nucleico pode estar presente na célula hospedeira na forma de 15
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT uma única cópia ou de duas ou mais cópias e, numa concretização, é expresso na célula hospedeira.
De acordo com a invenção, o termo "expressão" é utilizado com o seu significado mais geral e compreende a produção de ARN ou de ARN e proteína. Compreende também a expressão parcial de ácidos nucleicos. Adicionalmente, a expressão pode ser realizada de forma transiente ou estável. Os sistemas de expressão preferidos em células de mamífero compreendem pcDNA3.1 e pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contêm um marcador seleccionável tal como um gene que confere resistência a G418 (e assim permite que as linhas celulares transfectadas de forma estável selam seleccionadas) e as sequências potenciadoras-promotoras de citomegalovírus (CMV).
Nos casos em que uma molécula do MHC apresenta um antigénio associado a tumores ou uma sua parte, um vector de expressão pode também compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica para a referida molécula do MHC. A sequência de ácido nucleico que codifica para a molécula do MHC pode estar presente no mesmo vector de expressão que o ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores ou a sua parte, ou os dois ácidos nucleicos podem estar presentes em diferentes vectores de expressão. Neste último caso, os dois vectores de expressão podem ser cotransfectados para uma célula. Se uma célula hospedeira não expressa nem o antigénio associado a tumores ou a sua parte nem a molécula do MHC, ambos os ácidos nucleicos que os codificam podem ser transfectados para a célula quer no mesmo vector de expressão quer em diferentes vectores de expressão. Se a célula já expressa a molécula do MHC, apenas a sequência de ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores ou a sua parte pode ser transfectada para a célula.
Os kits para amplificação de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores compreendem, por exemplo, um par de iniciadores de amplificação que hibridam com o ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores. Os iniciadores preferivelmente compreendem uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30 nucleótidos contíguos do ácido nucleico e não são sobrepostos, de modo a evitar a formação de dímeros de 16
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT iniciadores. Um dos iniciadores irá hibridar com uma cadeia do ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores, e o outro iniciador irá hibridar com a cadeia complementar num arranjo que permite a amplificação do ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores. "Moléculas anti-sentido" ou "ácidos nucleicos anti-sentido" podem ser utilizados para regular, em particular reduzir, a expressão de um ácido nucleico. As expressões "molécula anti-sentido" ou "ácido nucleico anti-sentido" referem-se, de acordo com a invenção, a um oligonucleótido que é um oligorribonucleótido, um oligodesoxirribonucleótido, um oligorribonucleótido modificado ou um oligodesoxirribo-nucleótido modificado e que híbrida sob condições fisiológicas com ADN compreendendo um gene particular ou com ARNm do referido gene, desse modo inibindo a transcrição do referido gene e/ou a tradução do referido ARNm. De acordo com a invenção, uma "molécula anti-sentido" também compreende uma construção que contém um ácido nucleico ou uma sua parte na orientação inversa em relação ao seu promotor natural. Um transcrito anti-sentido de um ácido nucleico ou de uma sua parte podem formar um dúplex com o ARNm de ocorrência natural especificando a enzima e desse modo prevenindo a acumulação ou a tradução do ARNm na enzima activa. Outra possibilidade é a utilização de ribozimas para inactivação de um ácido nucleico. Os oligonucleótidos anti-sentido preferidos de acordo com a invenção possuem uma sequência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30, nucleótidos contíguos do ácido nucleico alvo e preferivelmente são completamente complementares ao ácido nucleico alvo ou a uma sua parte.
Em concretizações preferidas, o oligonucleótido anti-sentido híbrida com um local N-terminal ou a montante 5' tal como um local de iniciação da tradução, um local de iniciação da transcrição ou um local promotor. Em outras concretizações, o oligonucleótido anti-sentido híbrida com uma região não traduzida a 3' ou um local de splicing do ARNm.
Numa concretização, um oligonucleótido consiste em ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos ou uma sua combinação, estando a extremidade 5' de um nucleótido e a extremidade 3' de outro nucleótido ligadas uma à outra por uma ligação 17 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT fosfodiéster. Estes oligonucleótidos podem ser sintetizados da maneira convencional ou ser produzidos recombinantemente.
Em concretizações preferidas, um oligonucleótido é um oligonucleótido "modificado". Aqui, o oligonucleótido pode ser modificado de maneiras muito diferentes, sem prejudicar a sua capacidade de se ligar ao seu alvo, de modo a aumentar, por exemplo, a sua estabilidade ou eficácia terapêutica. De acordo com a invenção, a expressão "oligonucleótido modificado" significa um oligonucleótido em que (i) pelo menos dois dos seus nucleótidos estão ligados um ao outro por uma ligação internucleósidos sintética (i.e. uma ligação internucleósidos que não é uma ligação fosfodiéster) e/ou (ii) um grupo químico que usualmente não se encontra em ácidos nucleicos está ligado covalentemente ao oligonucleótido. As ligações internucleósidos sintéticas preferidas são fosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, alquilfosfonotioatos, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, carboximetilésteres e péptidos. A expressão "oligonucleótido modificado" também compreende oligonucleótidos possuindo uma base e/ou um açúcar covalentemente modificados. Os "oligonucleótido modificados" compreendem, por exemplo, oligonucleótidos com resíduos de açúcar que estão covalentemente ligados a grupos orgânicos de baixo peso molecular diferentes de um grupo hidroxilo na posição 3' e um grupo fosfato na posição 5'. Os oligonucleótido modificados podem compreender, por exemplo, um resíduo de ribose 2'-O-alquilado ou outro açúcar em vez de ribose, tal como arabinose.
Deve entender-se que todas as concretizações acima descritas em relação aos oligonucleótidos podem também aplicar-se a polinucleótidos. "ARN de interferência pequeno" ou "ARNip", como aqui se utilizam, significam uma molécula de ARN isolada, preferivelmente com mais do que 10 nucleótidos de comprimento, mais preferivelmente mais do que 15 nucleótidos de comprimento, e o mais preferivelmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleótidos de comprimento, que é 18 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT utilizada para identificar um gene ou um ARNm alvo a degradar. Uma gama de 19-25 nucleótidos é a dimensão mais preferida para os ARNip.
Os ARNip de acordo com a invenção podem compreender ARN parcialmente purificado, ARN substancialmente puro, ARN sintético ou ARN produzido recombinantemente, assim como ARN alterado que difere do ARN de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleótidos. Estas alterações podem incluir a adição de material não nucleotidico, tal como à(s) extremidade(s) do ARNip ou a um ou mais nucleótidos internos do ARNip; modificações que tornam o ARNip resistente a digestão por nucleases (e.g., a utilização de ribonucleótidos 2'-substituidos ou modificações no esqueleto de açúcar-fosfato); ou a substituição de um ou mais nucleótidos no ARNip por desoxirribonucleótidos. Adicionalmente, o ARNip pode ser modificado para aumentar a sua estabilidade, como descrito acima para os oligonucleótidos modificados, em particular por introdução de uma ou mais ligações fosforotioato.
Uma ou ambas as cadeias do ARNip podem também compreender uma protuberância a 3'. Como aqui se utiliza, uma "protuberância a 3'" refere-se a pelo menos um nucleótido desemparelhado que se prolonga da extremidade 3' de uma cadeia de ARN. Assim, numa concretização, o ARNip compreende pelo menos uma protuberância a 3' de 1 a cerca de 6 nucleótidos (o que inclui ribonucleótidos ou desoxinucleótidos) de comprimento, preferivelmente de 1 a cerca de 5 nucleótidos de comprimento, mais preferivelmente de 1 a cerca de 4 nucleótidos de comprimento, e com particular preferência de cerca de 2 a cerca de 4 nucleótidos de comprimento. Na concretização em que ambas as cadeias da molécula de ARNip compreendem uma protuberância a 3', o comprimento das protuberâncias pode ser igual ou diferente para cada cadeia. Numa concretização mais preferida, a protuberância a 3' está presente em ambas as cadeias do ARNip, e tem 2 nucleótidos de comprimento. Por exemplo, cada cadeia do ARNip da invenção pode compreender protuberâncias a 3' de ácido didesoxitimidilico ("TT") ou ácido diuridilico ("uu"). 19
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT
De modo a melhorar a estabilidade do ARNip, as protuberâncias a 3' podem ser também estabilizadas contra a degradação. Numa concretização, as protuberâncias são estabilizadas incluindo nucleótidos de purina, tais como nucleótidos adenosina ou guanosina. Alternativamente, a substituição de nucleótidos de pirimidina por análogos modificados, e.g., a substituição de nucleótidos de uridina nas protuberâncias a 3' por 2'-desoxitimidina, é tolerada e não afecta a eficiência da degradação do ARNi. Em particular, a ausência de um 2'-hidroxilo na 2'-desoxitimidina aumenta significativamente a resistência a nucleases da protuberância a 3' em meio de cultura de tecidos.
As cadeias de sentido directo e anti-sentido do ARNip podem compreender duas moléculas de ARN complementares, de cadeia simples, ou podem compreender uma única molécula em que duas porções complementares têm as bases emparelhadas e estão covalentemente ligadas por uma área em "gancho-de-cabelo" de cadeia simples. Ou seja, a região de sentido directo e a região anti-sentido podem estar unidas covalentemente por meio de uma molécula ligante. A molécula ligante pode ser um ligante polinucleotídico ou não nucleotidico. Sem pretender a ligação a qualquer teoria, crê-se que a área em gancho-de-cabelo deste último tipo de molécula de ARNip é clivada intracelularmente pela proteína "Dicer" (ou seu equivalente) para formar um ARNip de duas moléculas individuais de ARN com bases emparelhadas.
Como aqui se utiliza, "ARNm alvo" refere-se a uma molécula de ARN que é um alvo para infra-regulação. 0 ARNip pode ser expresso a partir de vectores de expressão de pol III sem alteração no local de direccionamento, pois crê-se que a expressão de ARN a partir de promotores de pol III é apenas eficiente quando o primeiro nucleótido transcrito é uma purina. 0 ARNip de acordo com a invenção pode ter como lavo qualquer trecho de aproximadamente 19-25 nucleótidos contíguos em qualquer das sequências de ARNm alvo (a "sequência alvo"). As técnicas para a selecção de sequências alvo para ARNip são dadas, por exemplo, em Tuschl T. et ai., "The siRNA User 20 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
Guide", revisto em 11 de Out., 2002, cuja divulgação completa é aqui incorporada por referência. "The siRNA User Guide" está disponível na world wide web num website mantido por Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, EUA, e pode ser encontrado acedendo ao website da Rockefeller University e pesquisando com a palavra-chave "siRNA". Assim, a cadeia de sentido directo do presente ARNip compreende uma sequência de nucleótidos substancialmente idêntica a qualquer trecho contíguo de cerca de 19 a cerca de 25 nucleótidos no ARNm alvo.
Geralmente, uma sequência alvo no ARNm alvo pode ser seleccionada de uma determinada sequência de ADNc correspondente ao ARNm alvo, preferivelmente começando 50 a 100 nt a jusante (i.e., no sentido 3') do codão de início. A sequência alvo pode, contudo, estar localizada nas regiões não traduzidas a 5' ou a 3' , ou na região próxima do codão de início. O ARNip pode ser obtido utilizando várias técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. Por exemplo, o ARNip pode ser sintetizado quimicamente ou produzido recombinantemente utilizando métodos conhecidos na especialidade, tais como o sistema in vitro de Drosophila descrito no pedido publicado U.S. 2002/0086356 de Tuschl et al., cuja divulgação completa é aqui incorporada por referência.
Preferivelmente, o ARNip é sintetizado quimicamente utilizando ribonucleósido-fosforamiditos apropriadamente protegidos e um sintetizador convencional de ADN/ARN. O ARNip pode ser sintetizado na forma de duas moléculas separadas, complementares, de ARN, ou na forma de uma única molécula de ARN com duas regiões complementares.
Alternativamente, o ARNip pode também ser expresso a partir de plasmídeos de ADN lineares ou circulares recombinantes utilizando qualquer promotor adequado. Estas concretizações estão incluídas de acordo com a presente invenção quando é feita referência aqui à administração de ARNip ou à incorporação de ARNip em composições farmacêuticas. 21 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
Os promotores adequados para a expressão de ARNip da invenção a partir de um plasmídeo incluem, por exemplo, as sequências promotoras pol III de ARN U6 ou Hl e o promotor de citomegalovírus. A selecção de outros promotores adequados faz parte dos conhecimentos dos peritos na especialidade. Os plasmideos recombinantes podem também compreender promotores indutiveis ou reguláveis para a expressão do ARNip num tecido particular ou num ambiente intracelular particular. 0 ARNip expresso a partir de plasmideos recombinantes pode ser isolado a partir dos sistemas de expressão em células de cultura por técnicas-padrão, ou pode ser expresso intracelularmente. A utilização de plasmideos recombinantes para entregar o ARNip a células in vivo está discutida com mais detalhes adiante. 0 ARNip pode ser expresso a partir de um plasmídeo recombinante na forma de duas moléculas separadas, complementares, de ARN, ou na forma de uma única molécula de ARN com duas regiões complementares. A selecção de plasmideos adequados para a expressão do ARNip, os métodos para a inserção de sequências de ácido nucleico para a expressão do ARNip no plasmídeo e os métodos de entrega do plasmídeo recombinante às células de interesse, fazem parte dos conhecimentos do perito na especialidade. 0 ARNip pode também ser expresso a partir de vectores virais recombinantes intracelularmente in vivo. Os vectores virais recombinantes compreendem sequências que codificam o ARNip e qualquer promotor adequado para a expressão das sequências do ARNip. Os vectores virais recombinantes podem também compreender promotores indutiveis ou reguláveis para a expressão do ARNip num tecido particular ou num ambiente intracelular particular. 0 ARNip pode ser expresso a partir de um vector virai recombinante na forma de duas moléculas separadas, complementares, de ARN, ou na forma de uma única molécula de ARN com duas regiões complementares. 0 termo "péptido" compreende oligo- e polipéptidos e refere-se a substâncias compreendendo dois ou mais, preferivelmente 3 ou mais, preferivelmente 4 ou mais, 22 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ preferivelmente 6 ou mais, preferivelmente 8 ou mais, preferivelmente 10 ou mais, preferivelmente 13 ou mais, preferivelmente 16 ou mais, preferivelmente 21 ou mais e até preferivelmente 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por ligações peptídicas. O termo "proteína" refere-se a grandes péptidos, preferivelmente a péptidos com mais do que 100 resíduos de aminoácido, mas em geral os termos "péptidos" e "proteínas" são sinónimos e são utilizados aqui indiferentemente.
Preferivelmente, as proteínas e péptidos descritos de acordo com a invenção foram isolados. As expresses "proteína isolada" ou "péptido isolado" significam que a proteína ou o péptido foram separados do seu ambiente natural. Uma proteína ou um péptido isolados podem estar num estado essencialmente purificado. A expressão "essencialmente purificado" significa que a proteína ou o péptido estão essencialmente isentos de outras substâncias com as quais estão associados na natureza ou in vivo.
Estas proteínas e péptidos podem ser utilizados, por exemplo, na produção de anticorpos e num ensaio imunológico ou de diagnóstico ou como terapêuticos. As proteínas e péptidos descritos de acordo com a invenção podem ser isolados de amostras biológicas tais como tecido ou homogenatos celulares e podem também ser expressos recombinantemente numa multiplicidade de sistemas de expressão procariotas ou eucariotas.
Para os fins da presente invenção, "derivados" de uma proteína ou de um péptido ou de uma sequência de aminoácidos, compreendem variantes de inserção de aminoácidos, variantes de deleção de aminoácidos e/ou variantes de substituição de aminoácidos.
As variantes de inserção de aminoácidos compreendem fusões amino- e/ou carboxi-terminais e também inserções de um ou dois ou mais aminoácidos numa sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácido são inseridos num local particular numa sequência de aminoácidos, embora seja também possível a inserção aleatória com rastreio 23 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT apropriado do produto resultante. As variantes de deleção de aminoácidos são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência. As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência ser removido e outro resíduo ser inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre proteínas ou péptidos homólogos e/ou à substituição de aminoácidos por outros que possuem propriedades similares tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, electronegatividade, volume da cadeia lateral e similares (substituição conservativa). As substituições conservativas, por exemplo, referem-se à permuta de um aminoácido por outro aminoácido enumerado adiante no mesmo grupo que o aminoácido substituído: 1. resíduos pequenos alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly) 2. resíduos negativamente carregados e suas amidas: Asn, Asp, Glu, Gin 3. resíduos positivamente carregados: His, Arg, Lys 4. resíduos grandes alifáticos, não polares: Met, Leu, Ile, Vai (Cys) 5. resíduos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp.
Devido ao seu papel particular na arquitectura da proteína, três resíduos estão mostrados entre parêntesis. Gly é o único resíduo sem uma cadeia lateral e portanto confere flexibilidade à cadeia. Pro possui uma geometria invulgar que restringe grandemente a cadeia. Cys pode formar uma ponte de dissulfureto.
As variantes de aminoácidos descritas acima podem ser prontamente preparadas com o auxílio de técnicas conhecidas de síntese peptídica tais como, por exemplo, por síntese em fase sólida (Merrifield, 1964) e métodos similares ou por manipulação de ADN recombinante. A manipulação de sequências de ADN para a preparação de proteínas e péptidos possuindo substituições, inserções ou deleções, está descrita com detalhes em Sambrook et al. (1989), por exemplo.
De acordo com a invenção, "derivados" de proteínas e péptidos também compreendem substituições, deleções e/ou 24 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ adições únicas ou múltiplas de quaisquer moléculas associadas à proteína ou ao péptido, tais como hidratos de carbono, lípidos e/ou proteínas ou péptidos. 0 termo "derivado" também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais das proteínas e dos péptidos referidos.
De acordo com a invenção, uma parte ou fragmento de um antigénio associado a tumores possui preferivelmente uma propriedade funcional da proteína ou do péptido de que foi derivado. Estas propriedades funcionais compreendem a interacção com anticorpos, a interacção com outros péptidos ou proteínas, a ligação selectiva de ácidos nucleicos e uma actividade enzimática. Uma propriedade particular é a capacidade de formar um complexo com moléculas do MHC e, quando apropriado, gerar uma resposta imunitária, preferivelmente por estimulação de células T auxiliares ou citotóxicas. Uma parte ou fragmento de um antigénio associado a tumores compreende preferivelmente uma sequência de pelo menos 6, em particular pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30 ou pelo menos 50, aminoácidos consecutivos do antigénio associado a tumores. Uma parte ou fragmento de um antigénio associado a tumores compreende preferivelmente uma sequência de até 8, em particular até 10, até 12, até 15, até 20, até 30 ou até 55, aminoácidos consecutivos do antigénio associado a tumores. Uma parte ou fragmento de um antigénio associado a tumores é preferivelmente uma parte do antigénio associado a tumores que corresponde à porção não transmembranar, em particular à porção extracelular do antigénio, ou está nela compreendida.
As partes ou fragmentos preferidos de um antigénio associado a tumores de acordo com a invenção são, em particular, adequadas para a estimulação de linfócitos T citotóxicos in vivo, mas também para a produção de linfócitos T expandidos e estimulados para a transferência adoptiva terapêutica ex vivo.
Uma parte ou um fragmento de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores referem-se, de acordo com a invenção, à parte do ácido nucleico que codifica pelo menos para o antigénio associado a tumores e/ou para uma parte ou um fragmento do referido antigénio associado a 25
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT tumores, como definido acima. Uma parte ou um fragmento de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores é preferivelmente a parte do ácido nucleico correspondente ao quadro de leitura aberto.
Anti-soros que contêm anticorpos específicos que especificamente se ligam à proteína alvo podem ser preparados por vários processos padrão; veja-se, por exemplo, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" de Philip Shepherd,
Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 e "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Assim, é também possível gerar anticorpos afins e específicos que reconhecem proteínas membranares complexas na sua forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J.
Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Isto é, em particular, relevante para a preparação de anticorpos que se pretendem utilizar terapeuticamente, mas também para muitas aplicações em diagnóstico. A este respeito, é possível imunizar com a proteína completa, com sequências parciais extracelulares assim como com células que expressam a molécula alvo na forma fisiologicamente dobrada. Os anticorpos monoclonais são tradicionalmente preparados utilizando a tecnologia dos hibridomas. (Para detalhes técnicos veja-se: "Monoclonal
Antibodies: A Practical Approach" de Philip Shepherd,
Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" de Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447) .
Sabe-se que apenas uma pequena parte de uma molécula de anticorpo, o parátopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epítopo (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc são, por exemplo, efectoras da cascata do complemento mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo do qual a região pFc' foi enzimaticamente removida ou que foi produzido sem a região pFc', referido como fragmento F(ab')2/ 26 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ é portador de ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo completo. Similarmente, um anticorpo do qual a região Fc foi enzimaticamente removida ou que foi produzido sem a referida região Fc, referido como fragmento Fab, é portador de um local de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo intacta. Adicionalmente, os fragmentos Fab consistem numa cadeia leve de um anticorpo covalentemente ligada e parte da cadeia pesada do referido anticorpo, referida como Fd. Os fragmentos Fd são os principais determinantes da especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode estar associado a até dez diferentes cadeias leves, sem alteração da especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd, quando isolados, retêm a capacidade de se ligar a um epitopo.
Localizadas no interior da parte de ligação ao antigénio de um anticorpo estão as regiões determinantes de complementaridade (CDR) que interactuam directamente com o epitopo do antigénio e as regiões de esqueleto (FR) que mantêm a estrutura terciária do parátopo. Tanto o fragmento Fd da cadeia pesada como a cadeia leve de imunoglobulinas IgG contêm quatro regiões de esqueleto (FR1 a FR4) que estão separadas em cada caso por três regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3) . As CDR e, em particular, as regiões CDR3 e, ainda mais particularmente, a região CDR3 da cadeia pesada, são responsáveis em grande extensão pela especificidade do anticorpo.
Sabe-se que as regiões que não as CDR, de um anticorpo de mamífero, são susceptíveis de serem substituídas por regiões similares de anticorpos com a mesma ou uma diferente especificidade, sendo retida a especificidade para com o epitopo do anticorpo original. Isto torna possível o desenvolvimento de anticorpos "humanizados" em que CDR não humanas estão covalentemente ligadas a regiões de FR e/ou Fc/pFc' humanas para produzir um anticorpo funcional. A titulo de outro exemplo, WO 92/04381 descreve a produção e a utilização de anticorpos RSV murinos humanizados em que pelo menos parte das regiões FR murinas foram substituídas por regiões FR de origem humana. Os anticorpos deste tipo, incluindo fragmentos de anticorpos intactos com 27 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ capacidade de ligaçao ao antigénio, sao frequentemente referidos como anticorpos "quiméricos".
De acordo com a invenção, o termo "anticorpo" também inclui fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd de anticorpos, anticorpos quiméricos, em que as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 sequências quiméricos e/ou CDR2 sequências quiméricos e/ou CDR2 sequências quiméricos e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por homólogas humanas ou não humanas, anticorpos de fragmento F(ab')2 em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por homólogas humanas ou não humanas, anticorpos de fragmento Fab em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR3 da cadeia leve foram substituídas por homólogas humanas ou não humanas, e anticorpos de fragmento Fd em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. 0 termo "anticorpo" também compreende anticorpos de "cadeia simples".
Proteínas e péptidos que se ligam especificamente aos antigénios associados a tumores podem ser proporcionados, por exemplo, por bibliotecas peptídicas degeneradas que podem ser preparadas simplesmente em solução numa forma imobilizada ou sob a forma de bibliotecas de exibição em fagos. Do mesmo modo é possível preparar bibliotecas combinatórias de péptidos com um ou mais aminoácidos. Podem ser também preparadas bibliotecas de resíduos sintéticos peptóides e não peptídicos.
Os anticorpos podem também ser acoplados a substâncias específicas para diagnóstico para exibir células e tecidos que expressam antigénios associados a tumores. Podem também ser acoplados a substâncias terapeuticamente úteis.
As substâncias de diagnóstico incluem qualquer marcador que funcione para: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interactuar com um segundo marcador para modificar o sinal detectável proporcionado pelo primeiro ou pelo segundo marcador, e.g. FRET (Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência); (iii) afectar a mobilidade, e.g. mobilidade electroforética, pela carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos, ou (iv) proporcionar uma porção de captura, e.g., afinidade, anticorpo/antigénio ou complexação 28 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT iónica. São adequadas como marcador as estruturas, tais como marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, preferivelmente marcadores isotópicos estáveis, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, em particular marcadores de partículas metálicas, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, moléculas orgânicas pequenas tais como biotina, ligandos de receptores ou moléculas de ligação tais como proteínas de adesão celular ou lectinas, sequências marcadoras compreendendo ácidos nucleicos e/ou resíduos de aminoácido que podem ser detectadas utilizando agentes de ligação, etc. As substâncias de diagnóstico compreendem, de maneira não limitante, sulfato de bário, ácido iocetâmico, ácido iopanóico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e radiodiagnóstico, incluindo emissores de positrões tais como flúor-18 e carbono-11, emissores gama tais como iodo-123, tecnécio-99m, iodo-131 e índio-111, nuclídeos para ressonância magnética nuclear, tais como flúor e gadolínio.
De acordo com a invenção, a expressão "substância terapeuticamente útil" significa qualquer molécula que possa exercer um efeito terapêutico. De acordo com a invenção, uma substância terapeuticamente útil é preferivelmente guiada selectivamente para uma célula que expressa um ou mais antigénios associados a tumores e inclui agentes anticancerosos, compostos marcados com iodo radioactivo, toxinas, fármacos citostáticos ou citolíticos, etc. Os agentes anticancerosos compreendem, por exemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, bussulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatina, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, taxol, etoposido, fluorouracilo, interferão-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HC1, tioguanina, sulfato de vinblastina e sulfato vincristina. Outros agentes anticancerosos estão descritos, por exemplo, em Goodman e Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., em particular Chapter 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). As toxinas podem ser proteínas tais como proteína antiviral de fitolaca, toxina da cólera, toxina 29
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT da tosse convulsa, ricina, gelonina, abrina, exotoxina da difteria ou exotoxina de Pseudomonas. Os resíduos de toxinas podem também ser radionuclidos emissores de alta energia tais como cobalto-60. A expressão "complexo principal de histocompatibilidade" ou "MHC" refere-se a um complexo de genes presente em todos os vertebrados. As proteínas ou moléculas do MHC estão envolvidas na sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antigénios em reacções imunitárias normais por ligação a péptidos e sua apresentação para reconhecimento por receptores de células T (TCR) . As moléculas do MHC ligam péptidos no interior de um compartimento de processamento intracelular e apresentam estes péptidos na superfície de células apresentadoras de antigénio para reconhecimento por células T. A região do MHC humano, também denominada HLA, está localizada no cromossoma 6 e inclui a região de classe I e de classe II. Numa concretização preferida uma molécula do MHC é uma molécula de HLA. "Reduzir" ou "inibir", como aqui se utilizam, significam a capacidade para causar uma diminuição global, preferivelmente de 20% ou mais, mais preferivelmente de 50% ou mais, e o mais preferivelmente de 75% ou mais, no nível, e.g. no nível de proteína ou ARNm comparativamente com uma amostra de referência (e.g., uma amostra não tratada com ARNip). Esta redução ou inibição da expressão de ARN ou proteína pode ocorrer através de clivagem ou degradação de ARNm alvo. Os ensaios para a expressão de proteína ou expressão de ácido nucleico são conhecidos na especialidade e incluem, por exemplo, ELISA, análise Western blot para a expressão de proteínas, e Northern blotting ou ensaios de protecção de ARNase para ARN. O termo "paciente" significa, de acordo com a invenção, um ser humano, um primata não humano ou outro animal, em particular um mamífero tal como uma vaca, um cavalo, um porco, uma ovelha, uma cabra, um cão, um gato, ou um roedor tal como um ratinho e um rato. Numa concretização particularmente preferida, o paciente é um ser humano. 30 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ "Expressão anómala" significa, de acordo com a invenção, que a expressão está alterada, preferivelmente aumentada, comparativamente com o estado num indivíduo saudável.
De acordo com a invenção os termos "aumentado" ou "quantidade aumentada" referem-se preferivelmente a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. A quantidade de uma substância é também aumentada numa amostra de teste tal como uma amostra biológica comparativamente com uma amostra de referência se for detectável na amostra de teste mas estiver ausente ou não for detectável na amostra de referência.
De acordo com a invenção, o termo "doença" refere-se a qualquer estado patológico em que antigénios associados a tumores são expressos ou anomalamente expressos. "Expressão anómala" significa, de acordo com a invenção, que a expressão está alterada, preferivelmente aumentada, comparativamente com o estado num indivíduo saudável. Um aumento na expressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Numa concretização, o antigénio associado a tumores é expresso apenas em tecido de um indivíduo doente, enquanto a expressão num indivíduo saudável é reprimida. Um exemplo de uma destas doenças é o cancro, em que o termo "cancro", de acordo com a invenção, compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cancro rectal, cancro endométrico, cancro renal, cancro supra-renal, cancro da tiróide, cancro sanguíneo, cancro cutâneo, cancro do cérebro, cancro cervical, cancro intestinal, cancro hepático, cancro do cólon, cancro do estômago, cancro do intestino, cancro da cabeça e pescoço, cancro gastrointestinal, cancro dos nódulos linfáticos, cancro do esófago, cancro colorrectal, cancro pancreático, cancro do ouvido, nariz e garganta (otorrinolaringológico, ou, do inglês, ENT), cancro da mama, cancro da próstata, cancro do útero, cancro ovariano e cancro do pulmão e as suas metástases. Os exemplos destes são carcinomas do pulmão, carcinomas da mama, carcinomas da próstata, carcinomas do cólon, carcinomas de células renais, carcinomas cervicais, ou metástases dos tipos de cancro ou tumores descritos acima. O termo cancro, de acordo com a invenção, também compreende metástases cancerosas. 31 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ "Tumor" significa um grupo anormal de células ou tecido que crescem por proliferação celular rápida, descontrolada, e continuam a crescer após cessarem os estímulos que iniciaram o novo crescimento. Os tumores apresentam uma ausência parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e formam usualmente uma massa de tecido distinta, que pode ser benigna ou maligna. "Metástase" significa a disseminação de células cancerosas a partir do seu local original para outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende do destacamento de células malignas a partir do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetração das membranas basais endoteliais para entrar na cavidade corporal e vasos, e depois, após transporte pelo sangue, infiltração dos órgãos alvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogénese. A metástase tumoral ocorre frequentemente mesmo após a remoção do tumor primário porque as células ou componentes tumorais podem permanecer e desenvolver potencial metastático. Numa concretização, o termo "metástase", de acordo com a invenção, refere-se a "metástase distante", que se refere a uma metástase que é remota relativamente ao tumor primário e ao sistema regional de nódulos linfáticos.
De acordo com a invenção, uma amostra biológica pode ser uma amostra de tecido, incluindo fluidos corporais, e/ou uma amostra celular e pode ser obtida da maneira convencional tal como por biópsia de tecidos, incluindo biopsia por punção, e por recolha de sangue, aspirado brônquico, expectoração, urina, fezes ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, a expressão "amostra biológica" também inclui fracções de amostras biológicas.
De acordo com a invenção, o termo "célula imunorreactiva" significa uma célula que pode maturar numa célula imunitária (tal como uma célula B, uma célula T auxiliar ou células T citolíticas) com estimulação adequada. As células imunorreactivas compreendem células estaminais hematopoiéticas CD34+, células T imaturas e maduras e células B imaturas e maduras. Se for desejada a produção de células T citolíticas 32 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT ou auxiliares que reconhecem um antigénio associado a tumores, a célula imunorreactiva é colocada em contacto com uma célula que expressa um antigénio associado a tumores sob condições que favorecem a produção, a diferenciação e/ou a selecção de células T citolíticas e de células T auxiliares. A diferenciação de precursores de células T em células T citolíticas, quando expostos a um antigénio, é similar à selecção clonal do sistema imunitário.
As expressões "célula T" e "linfócito T" são aqui utilizadas indiferentemente e incluem células T auxiliares e células T citotóxicas que compreendem células T citolíticas.
Alguns métodos terapêuticos são baseados numa reacção do sistema imunitário de um paciente, que resulta na lise de células apresentadoras de antigénio tais como células de cancro que presentam um ou mais antigénios associados a tumores. A este respeito, por exemplo, linfócitos T citotóxicos autólogos específicos para um complexo de um antigénio associado a tumores e uma molécula do MHC são administrados a um paciente possuindo uma anomalia celular. A produção destes linfócitos T citotóxicos in vitro é conhecida. Um exemplo de um método de diferenciação de células T pode ser encontrado em WO-A-9633265. Geralmente, uma amostra contendo células tais como células sanguíneas é tomada do paciente e as células são colocadas em contacto com uma célula que apresenta o complexo e que pode provocar a propagação de linfócitos T citotóxicos (e.g. células dendríticas). A célula alvo pode ser uma célula transfectada tal como uma célula COS. Estas células transfectadas apresentam o complexo desejado na sua superfície e, quando colocadas em contacto com linfócitos T citotóxicos, estimulam a propagação destes últimos. Os linfócitos T citotóxicos autólogos expandidos clonalmente são então administrados ao paciente.
Em outro método de selecção de linfócitos T citotóxicos específicos do antigénio, tetrâmeros fluorogénicos de complexos molécula do MHC de classe I/péptido são utilizados para obter clones específicos de linfócitos T citotóxicos (Altman et al., Science 274: 94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8:413-416, 1998) . 33 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ
Em métodos terapêuticos referidos como transferência adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917, 1986; Riddel et ai., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989), células apresentando o complexo desejado (e.g. células dendriticas) são combinadas com linfócitos T citotóxicos do paciente a tratar, resultando numa propagação de linfócitos T citotóxicos específicos. Os linfócitos T citotóxicos propagados são então administrados a um paciente possuindo uma anomalia celular caracterizada por células anómalas particulares que apresentam o complexo específico. Os linfócitos T citotóxicos lisam então as células anómalas, desse modo atingindo um efeito terapêutico desejado.
Adicionalmente, as células que apresentam o complexo desejado (e.g. células dendriticas) podem ser combinadas com linfócitos T citotóxicos de indivíduos saudáveis ou de outra espécie (e.g. de ratinho) que podem resultar na propagação de linfócitos T citotóxicos específicos com elevada afinidade. O receptor de células T de elevada afinidade destes linfócitos T específicos propagados pode ser clonado e opcionalmente humanizado numa extensão diferente, e os receptores de células T assim obtidos são então transduzidos por transferência de genes, por exemplo utilizando vectores retrovirais, em células T de pacientes. A transferência adoptiva pode então ser realizada utilizando estes linfócitos T geneticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).
Os linfócitos T citotóxicos podem também ser gerados in vivo de uma maneira conhecida per se. Um método utiliza células não proliferativas que expressam o complexo. As células aqui utilizadas serão aquelas que usualmente expressam o complexo, tais como células tumorais irradiadas ou células transfectadas com um ou ambos os genes necessários para a apresentação do complexo (i.e. o péptido antigénico e a molécula do MHC apresentadora). Outra forma preferida é a introdução do antigénio associado a tumores na forma de ARN recombinante que pode ser introduzido em células por transferência lipossómica ou por electroporação, por exemplo. As células resultantes apresentam o complexo de interesse e 34 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ são reconhecidas por linfócitos T citotóxicos autólogos que então se propagam.
Pode ser conseguido um efeito similar por combinação do antigénio associado a tumores ou um seu fragmento com um adjuvante de modo a tornar possivel a incorporação em células apresentadoras de antigénio in vivo. 0 antigénio associado a tumores ou um seu fragmento podem ser representados como proteínas, como ADN (e.g. no interior de um vector) ou como ARN. 0 antigénio associado a tumores é processado para produzir um parceiro peptídico para a molécula do MHC, enquanto um seu fragmento pode ser apresentado sem a necessidade de outro processamento. Este último é o caso particular quando se podem ligar a moléculas do MHC. É dada preferência a formas de administração em que o antigénio
completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, uma vez que isto pode também produzir respostas de células T auxiliares que são necessárias para uma resposta imunitária eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett., 74:75-9, 2000;
Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187:693-702, 1998). Em geral, é possivel administrar uma quantidade eficaz do antigénio associado a tumores a um paciente por injecção intradérmica, por exemplo. Contudo, a injecção pode também ser realizada intranodalmente num nódulo linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sei USA 98:3299-303, 2001).
De acordo com a invenção, os termos "imunização" ou "vacinação" referem-se preferivelmente a um aumento ou activação de uma resposta imunitária a um antigénio. É possivel utilizar modelos animais para testar um efeito imunizante no cancro utilizando um antigénio associado a tumores ou um ácido nucleico que o codifica. Por exemplo, células cancerosas humanas podem ser introduzidas num ratinho para gerar um tumor, e podem ser administrados um ou mais ácidos nucleicos que codificam para antigénios associados a tumores. 0 efeito sobre as células cancerosas (por exemplo redução da dimensão do tumor) pode ser medido como medida da eficácia de uma imunização pelo ácido nucleico.
Como parte da composição para uma imunização ou uma vacinação, preferivelmente um ou mais antigénios associados a tumores ou seus fragmentos estimulantes, são administrados 35 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ conjuntamente com um ou mais adjuvantes para induzir uma resposta imunitária ou para aumentar uma resposta imunitária. Um adjuvante é uma substância que é incorporada no antigénio ou administrada conjuntamente com este último e que aumenta a resposta imunitária. Os adjuvantes podem aumentar a resposta imunitária proporcionando um reservatório de antigénio (extracelularmente ou em macrófagos), activando macrófagos e/ou estimulando linfócitos particulares. Os adjuvantes são conhecidos e compreendem, de uma maneira não limitante, monofosforil-lípido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas tais como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 e QS-L1 (So et al. , Mol. Cells 7:178-186, 1997), adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, vitamina E, montanida, alúmen, oligonucleótidos CpG (cf. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) e várias emulsões de água-em-óleo preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis tais como esqualeno e/ou tocoferol. Preferivelmente, os péptidos são administrados numa mistura com DQS21/MPL. A razão entre DQS21 e MPL é tipicamente de cerca de 1:10 a 10:1, preferivelmente de cerca de 1:5 a 5:1 e em particular de cerca de 1:1. Para administração a seres humanos, uma formulação de vacina tipicamente contém DQS21 e MPL numa gama de cerca de 1 pg a cerca de 100 pg.
Podem também ser administradas outras substâncias que estimulam uma resposta imunitária do paciente. É possível, por exemplo, utilizar citóquinas numa vacinação, devido às suas propriedades regulatórias em linfócitos. Estas citóquinas compreendem, por exemplo, interleucina-12 (IL-12) que se mostrou aumentar as acções protectoras de vacinas (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
Existem vários compostos que aumentam uma resposta imunitária e que portanto podem ser utilizados numa vacinação. Os referidos compostos compreendem moléculas de co-estimulação proporcionadas na forma de proteínas ou ácidos nucleicos tais como B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86, respectivamente).
As proteínas e os péptidos podem ser administrados de uma maneira conhecida per se. Numa concretização, os ácidos nucleicos são administrados por métodos ex vivo, i.e. por remoção de células de um paciente, modificação genética das 36 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT referidas células de modo a incorporarem um antigénio associado a tumores e reintrodução das células alteradas no paciente. Isto geralmente compreende a introdução de uma cópia funcional de um gene nas células de um paciente in vitro e reintrodução das células geneticamente alteradas no paciente. A cópia funcional do gene está sob o controlo funcional de elementos reguladores que permitem que o gene seja expresso nas células geneticamente alteradas. Os métodos de transfecção e de transdução são conhecidos dos especialistas. Os ácidos nucleicos podem ser administrados in vivo utilizando vectores tais como virus e lipossomas controlados pelo alvo. Se, de acordo com a invenção, é feita referência a administração ou a incorporação de ácidos nucleicos em composições farmacêuticas, isto inclui concretizações em que o ácido nucleico está presente nestes vectores.
Numa concretização preferida, um virus ou um vector virai para administração de um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores é seleccionado do grupo que consiste em adenovirus, virus adeno-associados, poxvirus, incluindo virus vaccinia e poxvirus atenuados, virus da Floresta Semliki, retrovirus, virus Sindbis e partículas semelhantes a vírus Ty. É dada preferência particular a adenovirus e retrovirus. Os retrovirus são tipicamente deficientes para replicação (i.e. são incapazes de gerar partículas infecciosas).
Os métodos de introdução de ácidos nucleicos em células in vitro ou in vivo compreendem a transfecção de precipitados de ácido nucleico com fosfato de cálcio, a transfecção de ácidos nucleicos associados a DEAE, a transfecção ou infecção com os vírus acima portadores dos ácidos nucleicos de interesse, a transfecção mediada por lipossomas, e similares. Em concretizações particulares, é dada preferência ao direccionamento do ácido nucleico para células particulares. Nestas concretizações, um transportador utilizado para administração de um ácido nucleico a uma célula (e.g. um retrovirus ou um lipossoma) pode ter uma molécula de controlo pelo alvo ligada. Por exemplo, uma molécula, tal como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície sobre a célula alvo ou um ligando para um receptor sobre a célula alvo, pode ser incorporada em, ou ligada ao 37 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ transportador de ácido nucleico. Os anticorpos preferidos compreendem anticorpos que se ligam selectivamente a um antigénio associado a tumores. Se for pretendida a administração de um ácido nucleico por via de lipossomas, a ligação de proteínas a uma proteína da membrana da superfície associada a endocitose pode ser incorporada na formulação lipossómica de modo a tornar possível o controlo e/ou a assimilação pelo alvo. Estas proteínas compreendem proteínas da cápside ou seus fragmentos que são específicos para um tipo de células particular, anticorpos para proteínas que são internalizadas, proteínas que abordam um local intracelular, e similares.
As composições terapêuticas podem ser administradas em preparações farmaceuticamente compatíveis. Estas preparações podem usualmente conter concentrações farmaceuticamente compatíveis de sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores, substâncias de suplementação que aumentam a imunidade tais como adjuvantes, e.g. oligonucleótidos CpG, citóquinas, quimioquinas, saponina, GM-CSF e/ou ARN e, quando apropriado, outros compostos terapeuticamente activos.
Os compostos terapeuticamente activos podem ser administrados através de qualquer via convencional, incluindo por injecção ou infusão. A administração pode ser realizada, por exemplo, por via oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou transdérmica. Preferivelmente, os anticorpos são administrados terapeuticamente por meio de um aerossol pulmonar. Os ácidos nucleicos anti-sentido são preferivelmente administrados por administração intravenosa lenta.
As composições aqui descritas são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade que consegue uma reacção desejada ou um efeito desejado, isoladamente ou em conjunto com outras doses. No caso de tratamento de uma doença particular ou de uma condição particular caracterizadas por expressão de um ou mais antigénios associados a tumores, a reacção desejada refere-se preferivelmente a inibição do decurso da doença. Isto compreende retardar a progressão da doença e, em particular, interromper ou inverter a progressão da doença. A reacção 38 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT desejada num tratamento de uma doença ou de uma condição pode também ser retardar o início ou prevenir o início da referida doença ou da referida condição. De acordo com a invenção, um diagnóstico ou tratamento de cancro pode também incluir o diagnóstico ou o tratamento de metástases de cancro que já se formaram ou que se irão formar. De acordo com a invenção, o termo "tratamento" compreende tratamento terapêutico e profiláctico, i.e. prevenção.
Uma quantidade eficaz de uma composição dependerá da condição a tratar, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, dimensão e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia concomitante (se presente), da via de administração especifica e de factores similares.
As composições farmacêuticas são preferivelmente estéreis e contêm uma quantidade eficaz da substância terapeuticamente activa para gerar a reacção desejada ou o efeito desejado.
As doses administradas das composições podem depender de vários parâmetros tais como o tipo de administração, a condição do paciente, o período de administração desejado, etc. No caso em que uma reacção num paciente seja insuficiente com uma dose inicial, podem ser utilizadas doses superiores (ou doses efectivamente superiores conseguidas por uma via de administração diferente, mais localizada).
As composições farmacêuticas são geralmente administradas em quantidades farmaceuticamente compatíveis e em composições farmaceuticamente compatíveis. A expressão "farmaceuticamente compatível" refere-se a um material não tóxico que não interactua com a acção do componente activo da composição farmacêutica. As preparações deste tipo podem conter usualmente sais, substâncias tampão, conservantes, transportadores e, quando apropriado, outros compostos terapeuticamente activos. Quando utilizados em medicina, os sais deverão ser farmaceuticamente compatíveis. Contudo, sais que não são farmaceuticamente compatíveis podem ser utilizados para a preparação de sais farmaceuticamente compatíveis e estão incluídos na invenção. Os sais farmacológica e farmaceuticamente compatíveis deste tipo compreendem, de uma 39 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ maneira não limitante, os que são preparados a partir dos seguintes ácidos: ácidos cloridrico, bromidrico, sulfúrico, nitrico, fosfórico, maleico, acético, salicilico, citrico, fórmico, malónico, succinico, e similares. Os sais farmaceuticamente compatíveis podem também ser preparados sob a forma de sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.
Uma composição farmacêutica pode compreender um transportador farmaceuticamente compatível. De acordo com a invenção, a expressão "transportador farmaceuticamente compatível" refere-se a um ou mais enchimentos, diluentes ou substâncias encapsulantes, sólidos ou líquidos, compatíveis, que são adequados para administração a seres humanos. 0 termo "transportador" refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de natureza natural ou sintética, em que o componente activo é combinado para facilitar a aplicação. Os componentes da composição farmacêutica são usualmente tais que não ocorra nenhuma interacção que prejudique substancialmente a eficácia farmacêutica desejada.
As composições farmacêuticas podem conter substâncias tampão adequadas tais como ácido acético num sal, ácido cítrico num sal, ácido bórico num sal e ácido fosfórico num sal.
As composições farmacêuticas podem, quando apropriado, conter também conservantes adequados tais como cloreto de benzalcónio, clorobutanol, parabeno e timerosal.
As composições farmacêuticas são usualmente proporcionadas numa forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de uma maneira conhecida per se. As composições farmacêuticas podem estar na forma de cápsulas, comprimidos, pastilhas, soluções, suspensões, xaropes, elixires ou na forma de uma emulsão, por exemplo.
As composições adequadas para administração parentérica compreendem usualmente uma preparação estéril, aquosa ou não aquosa, do composto activo, que é preferivelmente isotónica relativamente ao sangue do beneficiário. São exemplos de 40 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ transportadores e solventes compatíveis a solução de Ringer e a solução isotónica de cloreto de sódio. Em adição, óleos fixos, usualmente estéreis, são utilizados como meio de solução ou de suspensão. A presente invenção é descrita com detalhes pelas figuras e exemplos adiante, que são utilizados apenas para fins de ilustração e não se pretendem limitantes. Tendo em conta a descrição e os exemplos, outras concretizações que estão do mesmo modo incluídas na invenção são acessíveis ao trabalhador especialista.
Figuras:
Fig. 1. Expressão de ARNm de ISC-468 A. Investigações por RT-PCR com iniciadores específicos de ISC-468 não mostraram expressão significativa no interior de nenhum dos tecidos normais testados excepto a placenta. B. Expressão de ARNm de ISC-468 em carcinomas da cabeça e pescoço, do fígado, do rim e do cólon. C. Expressão de ARNm de ISC-468 em carcinomas da mama, ovariano e do estômago.
Fig. 2. Análise por PCR quantitativa da expressão de ARNm de ISC-468 em tecidos de controlo normais e cancros da mama A investigação por PCR em tempo real com iniciadores específicos de ISC-468 mostrou expressão selectiva de ARNm em testículos, placenta, estômago e PBMC normais, e em todas as biópsias de carcinoma da mama.
Fig. 3. Expressão de ARNm de ISC-468 (A) RT-PCR e B) PCR em tempo real (investigação com iniciadores específicos de ISC-468 mostrou expressão selectiva de ARNm em testículos, placenta normais, e em 80% das biópsias de carcinoma da mama.
Fig. 4. Análise por imunofluorescência da expressão de ISC-468 (A) A especificidade de anticorpos anti-ISC-468 foi confirmada por coloração de células transfectadas com ISC-468-eGFP. (B) Coloração de células fixadas em MeOH, transfectadas 41 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ com dúplices de ARNip específico de ISC-468, ou com dúplices de controlo não silenciadoras. (C) Coloração de células não fixadas, transfectadas com dúplices de ARNip especifico de ISC-468 ou com dúplices de controlo não silenciadoras.
Fig. 5. Análise imuno-histoquímica da expressão de ISC-468 Não foi detectada nenhuma expressão em tecido da mama normal (A) ΙΟΟχ, (B) 200x. Pelo contrário, foi observada uma coloração forte e homogénea da membrana em espécimes de carcinoma da mama (C) lOOx, (D) 200x.
Fig. 6. Knock-down induzido por iARN da expressão de ARNm de ISC-468 A transfecção de células com dúplices de ARNip especifico de ISC-468 resultou no knock-down distinto da expressão de ARNm de ISC-468 comparativamente com células de controlo.
Fig. 7. Análise de proliferação celular A transfecção de células com dúplices de ARNip especifico de ISC-468 resultou no prejuízo distinto da proliferação celular comparativamente com células de controlo.
Fig. 8. Análise do ciclo celular A transfecção de células com dúplices de ARNip específico de ISC-468 resultou em paragem Gl/S em células de carcinoma da mama (A) MCF-7 e (B) BT-549 comparativamente com células de controlo.
Fig. 9. Fosforilação de AKT A transfecção de células com dúplices de ARNip específico de ISC-468 resultou no prejuízo distinto da fosforilação de AKT comparativamente com células de controlo.
Fig. 10. Inibição da proliferação mediada por anticorpos A incubação de células de carcinoma da mama HCF-7 com anticorpos específicos de ISC-468 resultou em proliferação reduzida comparativamente com células incubadas com um anticorpo irrelevante de controlo.
Fig. 11. Análise de proliferação celular A transfecção de células com dúplices de ARNip específico de ISC-468 resultou no prejuízo distinto de (A) quimiotaxia, 42 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ (Β) quimiocinese, e (C) invasão, comparativamente com células de controlo.
Fig. 12. Correlação com receptores de estrogénio
Os níveis de expressão de ARNm de ISC-468 em amostras de carcinoma da mama correlacionam-se com o estado dos receptores de estrogénio. Estão mostradas a mediana, os 10° e 90° percentis com barras de erro.
Fig. 13. Tratamento com 17B-estradiol A expressão de ARNm de ISC-468 foi induzida por tratamento da linha celular MCF-7 de carcinoma da mama positiva para receptores de estrogénio com 17h-estradiol lOOnM. Não foi observada qualquer indução na linha celular MDA-MB-231 negativa para receptores de estrogénio.
Fig. 14. Sequências
Estão mostradas as sequências às quais é aqui feita referência.
Exemplos:
Material e métodos
As técnicas e métodos aqui mencionados são realizados de uma maneira conhecida per se e estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos os métodos incluindo a utilização de kits e reagentes são realizados de acordo com a informação dos fabricantes.
Extracção de ARN, preparação de ADNc iniciado com poli-d(T) e análise por RT-PCR convencional O ARN total foi extraído de material de tecido nativo utilizando isotiocianato de guanídio como agente caotrópico (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Após extracção com fenol acidico e precipitação com isopropanol, o referido ARN foi dissolvido em água tratada com DEPC. 43
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT A síntese de ADNc da primeira cadeia a partir de 4 yg de ARN total foi realizada numa mistura reaccional de 20 μΐ por meio de Superscript II (Invitrogen), de acordo com a informação do fabricante. O iniciador utilizado foi um oligonucleótido dT(18). A integridade e a qualidade do ADNc foram verificadas por amplificação de p53 numa PCR de 30 ciclos ((SEQ ID NO:5, 6)), temperatura de hibridação de 6 7 °C) .
Foi preparado um arquivo de ADNc da primeira cadeia a partir de um número de tecidos normais e entidades tumorais. Para estudos de expressão, 0,5 μΐ destes ADNc foram amplificados numa mistura reaccional de 30 μΐ, utilizando iniciadores específicos de GOI (veja-se adiante) e 1 U de ADN-polimerase HotStarTaq (Qiagen). Cada mistura reaccional continha 150μΜ de dNTP, 0,3 μΜ de cada iniciador e 3 μΐ de tampão de reacção lOx. Os iniciadores foram seleccionados de modo a estarem localizados em dois exões diferentes, e a eliminação da interferência por ADN genómico contaminante como razão de resultados falsos-positivos foi confirmada testando o ADN transcrito não inversamente como molde. Após 15 minutos a 95°C para activar a ADN-polimerase HotStarTaq, foram realizados 35 ciclos de PCR (0,5 min a 94°C, 0,5 min à temperatura de hibridação particular, 0,5 min a 72°C e alongamento final a 72°C durante 6 min) . 20 μΐ desta mistura reaccional foram fraccionados e analisados num gel de agarose corado com brometo de etídio.
Reparação de ADNc iniciado por hexâmeros aleatórios e PCR quantitativa em tempo real
A expressão de vários genes foi quantificada por PCR em tempo real. Os produtos da PCR foram detectados utilizando verde SYBR como corante repórter intercalante. A fluorescência repórter de Verde SYBR é suprimida em solução e o corante é activo apenas após ligação a fragmentos de ADN de cadeia dupla. O aumento da fluorescência do Verde SYBR em resultado da amplificação específica utilizando iniciadores específicos de GOI após cada ciclo de PCR é utilizado para a quantificação. A expressão do gene alvo é quantificada de forma absoluta ou relativa à expressão de um gene de controlo com expressão constante nos tecidos em investigação. A expressão foi medida após normalização das amostras contra ARN 44
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT de 18s, ο denominado gene de manutenção ("housekeeping") utilizando o método ΔΔ-Ct (PE Biosystems, EUA) . As reacções foram realizadas em duplicado e determinadas em triplicado. 0 kit de PCR com Verde SYBR QuantiTect (Qiagen, Hilden) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. 0 ADNc foi sintetizado com iniciadores aleatórios (Invitrogen) utilizando o protocolo descrito acima. Cada uma das porções de 5 μΐ do ADNc diluido foi empregue num volume total de 30 μΐ para a PCR: iniciador de sentido directo 300 nM, iniciador anti-sentido 300 nM; desnaturação inicial a 95°C durante 15 min; 95°C durante 30 s; hibridação durante 30 s; 72°C durante 30 s; 40 ciclos. As sequências dos iniciadores utilizados estão indicadas nos exemplos respectivos.
Clonagem e análise da sequência A clonagem de fragmentos de genes e comprimentos completos ocorreu por métodos convencionais. Para determinar a sequência, os correspondentes antigenes foram amplificados utilizando a polimerase de revisão ("proofreading") pfu (Stratagene). Após conclusão da PCR, ligou-se adenosina por meio de ADN-polimerase HotStarTaq às extremidades do amplicão de modo a clonar os fragmentos de acordo com as instruções do fabricante no vector TOPO-TA. A sequenciação foi realizada através de um serviço comercial. As sequências foram analisadas utilizando programas e algoritmos convencionais de previsão.
Análise de proliferação celular 24 h após a transfecção com dúplices de ARNip, cultivaram-se lxlO4 células em meio suplementado com várias concentrações de FCS durante 48 h. A proliferação foi analisada medindo a incorporação de BrdU nas cadeias recém-sintetizadas de ADN utilizando o Kit de proliferação celular DELFIA (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante num contador múltiplo Wallac Victor2 multilabel (Perkin Elmer).
Análise do ciclo celular e da apoptose
Cultivaram-se células em meio suplementado com FCS em várias concentrações, colheram-se após 48 h e coraram-se com 45 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ iodeto de propídio antes da análise do teor de ADN por citometria de fluxo. As células apoptóticas e as células nas fases S/G2/M do ciclo celular foram quantificadas utilizando o Software CellQuest (Becton Dickinson).
Migração celular
Ensaios de migração celular foram conduzidos em câmaras Transwell com membranas de poros de 8,0 pm (BD Biosciences) com células cultivadas em meio isento de soro durante 12 h antes das experiências. Para a experiências com ARNip as células foram transferidas para condições isentas de soro 24 h após a transfecção com dúplices de ARNip como descrito acima. Adicionaram-se 4xl04 células em 400 μΐ de meio de cultura isento de soro à câmara superior. As câmaras inferiores continham 800 μΐ de meio de cultura suplementado com FCS, com PDGF-BB (Sigma-Aldrich) ou com SDF-Ia/CXCL12 (R&D Systems) como quimioatractores. Após 24 horas, as células que tinham migrado para o lado inferior da membrana foram fixadas em metanol gelado; as membranas foram excisadas, colocadas em lâminas de microscópio e montadas com Hoechst (Dako) para microscopia de fluorescência. Foram contadas para cada membrana as células em cinco campos visuais aleatórios (ampliação lOOx). Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os efeitos sobre a quimiocinese das células foram analisados utilizando o mesmo cenário experimental (i) sem quimioatractor adicionado às câmaras superior e inferior e (ii) com quimioatractor adicionado a ambas as câmaras, superior e inferior.
Ensaio de invasão in vitro
Os ensaios de invasão in vivo foram conduzidos em câmaras Transwell com membranas de poros de 8,0 pm (BD Biosciences) com células cultivadas em meio isento de soro durante 12 h antes das experiências. As câmaras superiores foram preparadas com 100 μΐ de Matrigel (BD Biosciences) diluído para 1 mg/ml com meio isento de soro. As câmaras foram incubadas a 37°C durante 5 h para gelificação. Para experiências com ARNip, as células foram transferidas para condições isentas de soto 24 h após a transfecção com dúplices de ARNip como descrito acima. Adicionaram-se lxlO5 células em 400 μΐ de meio de cultura 46 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ isento de soro à câmara superior. As câmaras inferiores continham 800 μΐ de meio de cultura suplementado com FCS como quimioatractor. Após 24 horas as células invasoras do lado inferior da membrana foram fixadas em metanol gelado; as membranas foram excisadas, colocadas em lâminas de microscópio e montadas com Hoechst (Dako) para microscopia de fluorescência. Para cada membrana, contaram-se as células em cinco campos visuais aleatórios (ampliação lOOx). Todas as experiências foram realizadas em triplicado.
Exemplo 1: Identificação de ISC-468 como alvo terapêutico e de diagnóstico de cancro O ISC-468 (SEQ ID NO:l) codifica uma proteína de 212 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) e com um peso molecular de 23,6 kDa. Foi previamente descrita como proteína específica da placenta expressa durante a gravidez (Fant et al., Mol Reprod Dev. 63:430-6, 2002)
Prevê-se que a proteína tenha um péptido de sinal clivável do aa 1-23, seguido por um domínio transmembranar putativo curto (aa 25-47) como analisado por ferramentas de bioinformática (TMpred, SOUSI). Prevê-se que o restante da proteína seja extracelular e possa portanto ser utilizado de acordo com a invenção como estrutura alvo para anticorpos monoclonais.
De acordo com a invenção, foi utilizado um par de iniciadores especifico do gene (SEQ ID NO:3, 4) para ISC-468 em análises por RT-PCR para amplificar o ADNc derivado de um painel abrangente de tecidos normais e tumorais. Como esperado, a placenta foi confirmada como o único tecido saudável que expressa este gene (fig. 1). Não foi detectada nenhuma expressão significativa em nenhum outro tecido de órgãos normais. Mais surpreendentemente, quando foram investigados espécimes de cancro, encontrámos níveis elevados e significativos de expressão em vários tipos de tumores diferentes, incluindo os carcinomas do cólon, pancreático, esofágico, do estômago, do pulmão, da mama, ovariano, da cabeça & pescoço, do rim, da próstata e do fígado (fig. 1 e 2 assim como tab. 1). A análise quantitativa por RT-PCR em tempo real da expressão de ISC-468 em 60 amostras de carcinoma da 47 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ mama revelou que 80% de todas as amostras expressam níveis significativos de ISC-468 (fig. 3A, B).
Tab. 1: Expressão de ISC-468 em tecidos normais e tumorais
Tecidos normais Expressão Cérebro - Miocárdio - Músculo-esquelético - Miocárdio - Estômago - Cólon - Pâncreas - Rim - Fígado - Testículos - Timo - Mama - Ovário - Útero - Pele - Pulmão - Placenta + + + Nódulos linfáticos - Baço - PBMC - Próstata -
Tipo de tumor Expressão Carcinoma do cólon + Carcinoma pancreático + Carcinoma esofágico + Carcinoma do estômago + Cancro do pulmão + Cancro da mama + + + Carcinoma ovariano + Cancro da Cabeça & pescoço + Cancro do rim + Carcinoma da próstata + Carcinoma do fígado + + A expressão selectiva e elevada de transcritos de ISC-468 em tumores não era previamente conhecida e pode ser utilizada de acordo com a invenção para métodos moleculares de diagnóstico tais como RT-PCR para detecção de células tumorais disseminadas no soro e na medula óssea e para detecção de metástases em outros tecidos. Esta molécula pode ser adicionalmente utilizada como alvo especifico para abordagens terapêuticas.
Os seguintes péptidos, inter alia, foram seleccionados para a produção de anticorpos específicos de ISC-468 de acordo com a invenção: SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 2. A especificidade dos anticorpos foi confirmada por análise por imunofluorescência de células transfectadas com ISC-468-eGFP (fig. 4A). 48 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ A localização subcelular de ISC-468 nas linhas celulares de carcinoma da mama endogenamente expressoras MCF-7 e BT-549 foi analisada por análises por imunofluorescência. A coloração de células fixadas em MeOH (fig. 4B) ou não fixadas (fig. 4C) revelou que a ISC-468 está localizada nas membranas plasmáticas das células expressoras. A especificidade da coloração foi confirmada por knock-down induzido por iARN da expressão de ISC-468, resultando na perda de coloração da membrana plasmática.
Adicionalmente, utilizaram-se anticorpos específicos de ISC-468 para a análise imuno-histoquímica da expressão de ISC-468 em amostras clínicas de mama normal e carcinomas da mama. A expressão de ISC-468 não foi detectável em espécimes de mama normal (fig. 5A, B). Pelo contrário, os espécimes de carcinoma da mama apresentavam expressão forte e homogénea de ISC-468 (fig. 5C, D). Os sinais estavam acentuados na membrana plasmática das células cancerosas expressoras, confirmando que a ISC-468 é uma proteína membranar selectivamente expressa em células cancerosas.
Os domínios extracelulares de ISC-468 podem ser utilizados de acordo com a invenção como estrutura alvo para imunodiagnóstico e terapia por meio de anticorpos monoclonais. Em adição, a ISC-468 pode ser empregue como vacina (ARN, ADN, proteína, péptidos) para indução de respostas imunitárias específicas para o tumor (respostas imunitárias mediadas por células T e B). 0 knock-down induzido por iARN da expressão de ISC-468 foi conseguido por transfecção de células com dúplices de ARNip especificamente direccionadas para ARNm de ISC-468 (SEQ ID NO:12-15). A transfecção das linhas celulares de carcinoma da mama endogenamente expressoras MCF-7 e BT-549 resultou na redução estável e específica da expressão de ARNm de ISC-468 (fig. 6).
Para obter conhecimento sobre o papel fisiológico da expressão de ISC-468 foram realizados vários ensaios celulares in vitro baseados em iARN. A transfecção das linhas celulares de carcinoma da mama MCF-7 e BT-549 com dúplices de ARNip resultou numa redução distinta da proliferação celular 49 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ comparativamente com os controlos respectivos, como analisado num ensaio de proliferação baseado em BrdU (fig. 7) . A análise do ciclo celular baseada em FACS mostrou que a ab-rogação da proliferação celular resultou de uma paragem Gl/S (fig. 8A, B). Adicionalmente, pode-se mostrar que o knock-down induzido por iARN de ISC-468 afecta profundamente a via de sinalização de AKT em células cancerosas endogenamente expressoras por inibição da fosforilação de AKT (fig. 9). Adicionalmente, a proliferação de células MCF-7 foi atenuada quando as células foram incubadas com anticorpos específicos de ISC-468 gerados contra péptidos específicos de ISC-468 (SEQ ID NO:10, 11) comparativamente com um anticorpo irrelevante de controlo (fig. 10). Estes resultados indicam que a ISC-468 constitui um factor crítico para a proliferação de células cancerosas presumivelmente por mediação da activação induzida por factores de crescimento da via de sinalização de AKT e outros. A própria ISC-468 pode representar um receptor, um co-receptor ou um chaperone ligado à membrana para factores de crescimento, quimioquinas ou outras substâncias.
Adicionalmente, foi analisado o impacto da expressão de ISC-468 sobre a capacidade migratória de células cancerosas. O knock-down induzido por iARN da expressão de ISC-468 nas linhas celulares de carcinoma da mama MCF-7 e BT-549 resultou no prejuízo distinto da quimiotaxia, da quimiocinese e da invasão das células, como determinado em ensaios de migração Transwell (fig. 11A, B, C) . A quimiotaxia, a quimiocinese e a invasão são factores críticos para a metástase de células cancerosas para outros órgãos. Portanto, a expressão de ISC-468 em células cancerosas pode ser um factor positivo para a metástase de células cancerosas.
Em carcinomas da mama, pode-se demonstrar que a expressão de ISC-468 está correlacionada com o estado dos receptores de estrogénio do tumor. A análise por RT-PCR em tempo real quantitativa da expressão de ISC-468 em 60 amostras de carcinoma da mama revelou que os carcinomas da mama positivos para receptores de estrogénio apresentaram níveis significativamente superiores de expressão de ISC-468 relativamente a tumores negativos para os receptores (fig. 12). Deste modo, a expressão de ISC-468 pode ser induzida na linha celular de carcinoma da mama positive para 50
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT 17fi- receptores de estrogénios MCF-7 por tratamento com estradiol (fig. 13).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. para <120> Identificação de antigénios associados a tumores diagnóstico e terapia
<130> 342-28PCT <140> <141> 2006-09-06 <150> EP05019786.2 <151> 2005-09-12 <160> 15 <170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 1126 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 60 120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1126 atatatcaga ccatcagaag gatttgtata aagagtgact ctcctatgaa ggtaaaggcc acccctcttc agttccagtg actgagatac atttttccaa tcctgggggc aaatacagac acagcaagtt ccttcttccc tttggaaatt tggeagctgc cttcaccagt gagcacaaag ccacatttca aaggaaactg acaaattatc cecagctgccagaagaagaa atcctcactg gacggcttcc tgtttcctgt ggttcattat ctgattggct gcagggatga aagtttttaa gttcatagga etgatgatcc tcctcacctc tgcgttttca gccggttcag gacaaagtcc aatgactgtg ctgtgctcca tagactggtt catggtcaca gtgcacccct tcatgctaaa caacgatgtg tgtgtacact ttcatgaact acacttgggc ctgggttgcc ccccaaacca tgttcagcca cacgcctacc agttcaccta ccgtgttact gaatgtggca tcagggccaa agctgtctct caggacatgg ttatctacag cactgagata cactactctt ctaagggcae gccatctaag tttgtgatcc cagtgtcatg tgctgccccc caaaagtccc catggctcac caagccctgc tccatgagag tagccagcaa gagcagggcc acagcccaga aggatgagaa atgctacgag gtgttcagct tgtcacagtc cagtcaaagg cccaactgcg attgtccacc ttgtgtcttc agtgaagaag agcataccca ggtcccttgt caccaagcag gggctcagga ggctcaacct.ctgcagccat ctcactttcttgatatttct gaggattggt ctctteaeac agatgatatg attgggtcca tgtgatcctc aggtttgggg tctcctgaag atgctatttc tagaattagt atatagtgta caaatgtctg acaaataagt gctcttgtga ccctcatgtg agcacttttg agaaagagaa acctatagca acttcatgaa ttaagccttt ttctatattt ttatattcat gtgtaaacaa aaaataaaat aaaattctga tcgcat
<210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens 51 ΕΡ 1 924 600/ΡΤ <400> 2
Met Lys vai Phe Lys Phe xle Gly Leu Met lie Leu Leu Thr ser Ala 1 5 10 15
Phe Ser Ala Gly Ser Cly Gin Ser pro Met Thr vai Leu Cys ser lie 20 25 30
Asp Trp Phe Met vai Thr vál His pro Phe Met Leu Asn Asn Asp vai 35 40 45
Cys vai h1s Phe His Glu Leu His Leu Gly Leu Gly cys pro Pro Asn 50 55 60
His vai Gin Pro His Ala tyr Gin Phe Thr Tyr Arg vai Thr Glu cys 65 70 75 80
Gly ile Árg Ala Lys Ala vai ser Gin Asp Met vai ile Tyr ser thr
85 90 9S
Glu lie His Tyr ser ser Lys Gly thr Pro ser Lys Phe vai lie Pro 100 10S 110 vai Ser c^s Ala Ala Pro Gin ^s Ser Pro Trp Leu Thr Lys Pro cys
Ser Met Arg vai Ala Ser Lys Ser Arg Ala thr Ala Gin uys asp Glu 130 135 140
Lys Cys tyr Glu vai Phe ser Leu ser Gin ser ser Gin Arg pro Asn 145 150 155 160 cys Asp cys pro pro cys vai rtie ser Glu Glu Glu His Thr Gin vai 165 170 175 pro cys His Gin Ala Gly Ala Gin Glu Ala Gin pro Leu Gin pro ser 180 185 190
His Phe Leu Asp ile ser Glu Asp Trp ser Leu His Thr Asp Asp Met 195 200 205 lie Gly^ser Met 210
<210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 3 aaatttggca gctgccttca c 21
<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido 52 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT <400> 4 tgatgccaca ttcagtaaca c 21
<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 5 cgtgagcgct tcgagatgttcc g 21
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de sequência artificial: Oligonucleótido <400> 6 cctaaccagc tgcccaactg tag 23
<210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Ala pro cln Lys |er ppo Trp Leu Thr Lgs Pro cys <210 > 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Cys pro Leu Gin Pro ser His Phe Leu Asp lie Ser Glu Asp 1 S 10
<210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Cys lie Tyr Ser Thr Glu lie His Tyr Ser Ser Lys 1 S 10
<210 > 10 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Ala pro Glr> Lys Ser Pro rrp Leu Thr Lys Pro l . s a·.· 10 53
ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT
<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 pro Leu Gin Pro Ser h1s >he Leu Asp xle ser Glu Asp ' 1 5 10
<210 > 12 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> cadeia de sentido directo de ARNip <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases ribonucleotidicas <400> 12 ccaugagagu agccagcaat t 21
<210 > 13 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> cadeia anti-sentido de ARNip <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases ribonucleotidicas <400> 13 uugcuggcua cucucaugga g 21
<210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> cadeia de sentido directo de ARNip <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases ribonucleotidicas <400> 14 gguucaggac aaaguccaat t 21
<210 > 15 <211> 21 <211> ADN <213> Sequência Artificial 54 ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT <220> <223> cadeia anti-sentido de ARNip <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases ribonucleotídicas <400> 15 uuggacuuug uccugaaccg g 21
Lisboa, 2013-11-08

Claims (22)

  1. ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT 1/6 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica, compreendendo um ou mais componentes seleccionados do grupo que consiste em: (i) um anticorpo que se liga à porção extracelular de um antigénio associado a tumores, (ii) um ácido nucleico anti-sentido que híbrida especificamente com um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores, e (iii) um ARNip dirigido contra um ácido nucleico que codifica para um antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a), (b) ou (c) para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores.
  2. 2. Composição farmacêutica como reivindicada na reivindicação 1 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com reivindicação 1, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado, ou é um fragmento de um anticorpo.
  3. 3. Composição farmacêutica como reivindicada na reivindicação 1 ou 2 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com reivindicação 1, em que o anticorpo está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico. ΕΡ 1 924 600/ΡΤ 2/6
  4. 4. Composição farmacêutica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-3 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é um tumor pulmonar, um tumor mamário, um tumor da próstata, um melanoma, um tumor do cólon, um tumor gástrico, um tumor pancreático, um tumor otorrinolaringológico (ENT), um carcinoma de células renais ou um carcinoma cervical, um carcinoma do cólon ou um carcinoma mamário.
  5. 5. Composição farmacêutica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-4 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 1, em que o antigénio associado a tumores compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID N0:2, e 7-11.
  6. 6. Método in vitro de diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, método esse que compreende a detecção ou a determinação da quantidade (i) de um ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores, e/ou (ii) do antigénio associado a tumores, numa amostra biológica isolada de um paciente, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a), (b) ou (c). ΕΡ 1 924 6 Ο Ο/PT 3/6
  7. 7. Método como reivindicado na reivindicação 6, em que a detecção ou a determinação da quantidade compreende (i) o contacto da amostra biológica com um agente que se liga especificamente ao ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores ou ao antigénio associado a tumores, e (ii) a detecção da formação, ou determinação da quantidade, de um complexo entre o agente e o ácido nucleico ou o antigénio associado a tumores.
  8. 8. Método como reivindicado na reivindicação 7, em que o agente que se liga especificamente ao ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores é um oligonucleótido ou um polinucleótido que híbrida especificamente com o referido ácido nucleico.
  9. 9. Método como reivindicado na reivindicação 7, em que o agente que se liga especificamente ao antigénio associado a tumores é um anticorpo que se liga especificamente ao referido antigénio associado a tumores.
  10. 10. Método como reivindicado em qualquer das reivindicações 6 a 9 em que a referida monitorização da referida doença cancerosa compreende a determinação da regressão, do decurso ou do início da referida doença numa amostra de um paciente que tem a referida doença ou se suspeita estar a adoecer com a referida doença.
  11. 11. Método como reivindicado na reivindicação 10, que compreende uma detecção ou determinação da quantidade, numa primeira amostra num primeiro ponto temporal e numa outra amostra num segundo ponto temporal, e a comparação das duas amostras.
  12. 12. Método como reivindicações 7-11, em maneira detectável. reivindicado que o agente em está qualquer marcado de das uma
  13. 13. Método como reivindicado em qualquer das reivindicações 6-12, em que a amostra compreende um fluido corporal e/ou um tecido corporal. ΕΡ 1 924 600/ΡΤ 4/6
  14. 14. Método como reivindicado em qualquer das reivindicações 6-13, em que o antigénio associado a tumores compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID N0:2, e 7-11.
  15. 15. Anticorpo para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a) , (b) ou (c) , em que o anticorpo se liga à porção extracelular do referido antigénio associado a tumores e está acoplado a um agente terapêutico ou de diagnóstico.
  16. 16. Anticorpo como reivindicado na reivindicação 15 para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 15, que é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado, ou é um fragmento de um anticorpo.
  17. 17. Anticorpo como reivindicado na reivindicação 15 ou 16 para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 15, em que o antigénio associado a tumores compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, e 7-11. ΕΡ 1 924 600/ΡΤ 5/6
  18. 18. Anticorpo como reivindicado em qualquer das reivindicações 15, 16 ou 17 para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 15, em que o agente terapêutico ou de diagnóstico é uma toxina.
  19. 19. Composição farmacêutica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1-5 para utilização num método de tratamento ou prevenção de cancro caracterizado por expressão do antigénio associado a tumores de acordo com a reivindicação 1, para inibição do desenvolvimento do cancro num paciente, em que a composição farmacêutica se destina a administração numa quantidade eficaz.
  20. 20. Conjugado entre um anticorpo e um agente terapêutico ou de diagnóstico, em que o anticorpo se liga especificamente à porção extracelular de uma proteína ou de um polipéptido, sendo os referidos proteína ou polipéptido codificados por um ácido nucleico seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:l, (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a), (b) ou (c) para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão da proteína ou do polipéptido.
  21. 21. Conjugado como reivindicado na reivindicação 20 para utilização num método de tratamento, prevenção, diagnóstico ou monitorização de uma doença cancerosa caracterizada por expressão da proteína ou do polipéptido de acordo com a reivindicação 20, em que o agente terapêutico ou de diagnóstico é uma toxina. ΕΡ 1 924 600/ΡΤ 6/6
  22. 22. Utilização de um kit para diagnóstico in vitro de uma doença cancerosa caracterizada por expressão de um antigénio associado a tumores, kit esse que compreende agentes para a detecção ou determinação da quantidade (i) de um ácido nucleico que codifica para o antigénio associado a tumores, e/ou (ii) do antigénio associado a tumores, o referido antigénio associado a tumores possuindo uma sequência codificada por um ácido nucleico que é seleccionado do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID N0:1 (b) um ácido nucleico que híbrida com o ácido nucleico de (a) sob condições rigorosas, (c) um ácido nucleico que é degenerado em relação ao ácido nucleico de (a) ou (b), e (d) um ácido nucleico que é pelo menos 95% idêntico ao ácido nucleico de (a), (b) ou (c). Lisboa, 2013-11-08
PT67918789T 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia PT1924600E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20050019786 EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2005-09-12 Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT1924600E true PT1924600E (pt) 2013-11-18

Family

ID=35285406

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT110038833T PT2433954E (pt) 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia
PT67918789T PT1924600E (pt) 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia
PT151539517T PT2894162T (pt) 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT110038833T PT2433954E (pt) 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT151539517T PT2894162T (pt) 2005-09-12 2006-09-06 Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia

Country Status (21)

Country Link
US (5) US20090202530A1 (pt)
EP (14) EP1762575A1 (pt)
JP (5) JP6037593B2 (pt)
KR (2) KR101359697B1 (pt)
CN (1) CN101305020B (pt)
AU (1) AU2006291717B2 (pt)
BR (1) BRPI0616827A2 (pt)
CA (2) CA2820201C (pt)
CY (3) CY1114661T1 (pt)
DK (3) DK2894162T3 (pt)
ES (4) ES2664386T3 (pt)
HK (3) HK1168608A1 (pt)
HR (3) HRP20131047T1 (pt)
HU (1) HUE037307T2 (pt)
LT (1) LT2894162T (pt)
PL (3) PL1924600T3 (pt)
PT (3) PT2433954E (pt)
RS (3) RS53988B1 (pt)
RU (2) RU2485974C2 (pt)
SI (3) SI1924600T1 (pt)
WO (1) WO2007031222A2 (pt)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
AU2013206613B2 (en) * 2005-09-12 2017-03-02 Biontech Ag Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
EP1970384A1 (en) * 2007-03-14 2008-09-17 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
AU2016201637B2 (en) * 2007-10-23 2017-05-25 Biontech Ag Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
EP2060583A1 (en) * 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
AU2015205868B2 (en) * 2008-09-16 2017-04-27 Ganymed Pharmaceuticals Ag Monoclonal antibodies for treatment of cancer
EP2166021A1 (en) 2008-09-16 2010-03-24 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
EP2371864A1 (en) 2010-03-23 2011-10-05 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
CA2800424C (en) * 2010-06-04 2018-10-23 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) B1,2 cyclic beta glucan compound for use to enhance adaptive immunity by activation of dendritic cells
NZ730355A (en) 2011-05-24 2022-10-28 Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh Individualized vaccines for cancer
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
EP3417874A1 (en) 2012-11-28 2018-12-26 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
SG11201606439VA (en) 2014-02-07 2016-09-29 Dong Wha Pharm Co Ltd Anticancer adjuvant composition containing rip3 expression promoter as active ingredient, method for screening for anticancer adjuvant enhancing sensitivity of anticancer drug by promoting rip3 expression, and method for monitoring sensitivity of anticancer drug
AU2015315005B9 (en) 2014-09-10 2021-08-12 Genentech, Inc. Immunogenic mutant peptide screening platform
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
RU2620306C2 (ru) * 2015-01-15 2017-05-24 Олег Викторович Бухтояров Способ прогнозирования рецидива злокачественного опухолевого заболевания
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP3310808A1 (en) * 2015-06-16 2018-04-25 Targovax Asa Mutated fragments of the ras protein
GB201516047D0 (en) 2015-09-10 2015-10-28 Cancer Rec Tech Ltd Method
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
EP4299136A3 (en) 2015-12-16 2024-02-14 Gritstone bio, Inc. Neoantigen identification, manufacture, and use
US10712310B2 (en) 2016-01-22 2020-07-14 Temple University—Of the Commonwealth System of Higher Education Protein quantification by near infrared spectral imaging
CN107266552B (zh) * 2016-03-30 2022-02-08 香雪生命科学技术（广东）有限公司 源自于prame的肿瘤抗原短肽
US10808113B2 (en) 2016-05-20 2020-10-20 Arlanxeo Netherlands B.V. Rubber composition
DE102016115246C5 (de) * 2016-08-17 2018-12-20 Immatics Biotechnologies Gmbh Neue t-zellrezeptoren und deren verwendung in immuntherapie
CN108250289B (zh) * 2016-12-28 2021-10-08 香雪生命科学技术（广东）有限公司 源自于mage b6的肿瘤抗原短肽
TWI676483B (zh) * 2017-08-06 2019-11-11 強普生技股份有限公司 醫藥套組及其用途
AU2018348165A1 (en) 2017-10-10 2020-05-21 Gritstone Bio, Inc. Neoantigen identification using hotspots
EP3714275A4 (en) 2017-11-22 2021-10-27 Gritstone bio, Inc. REDUCTION OF JUNCTION EPITOPIC PRESENTATION FOR NEOANTIGENS
JP7082556B2 (ja) 2018-09-28 2022-06-08 三和シヤッター工業株式会社 シャッター装置

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) * 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) * 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) * 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) * 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) * 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) * 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) * 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) * 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) * 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) * 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) * 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) * 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) * 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) * 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) * 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) * 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
AU612370B2 (en) * 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) * 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) * 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5108921A (en) * 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) * 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) * 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5383851A (en) * 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3095175B2 (ja) * 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5744585A (en) * 1995-03-16 1998-04-28 Medenica; Rajko D. Human monoclonal antibody against lung carcinoma
US6121022A (en) * 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6277375B1 (en) * 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US20020065394A1 (en) * 1998-03-18 2002-05-30 Kenneth Jacobs Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9826143D0 (en) 1998-11-27 1999-01-20 Ludwig Inst Cancer Res Tumour rejection antigens
CA2360382C (en) * 1999-01-13 2011-05-24 Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag Use of antibodies for the vaccination against cancer
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
PT2796553T (pt) 2000-03-30 2019-09-27 Massachusetts Inst Technology Mediadores de interferência de arn específicos de sequência de arn
US6974667B2 (en) * 2000-06-14 2005-12-13 Gene Logic, Inc. Gene expression profiles in liver cancer
US20020192748A1 (en) * 2000-07-18 2002-12-19 Luca Rastelli Novel polynucleotides and polypeptides encoded thereby
CA2634294A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-14 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
TWI313299B (en) 2000-11-30 2009-08-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US20020177547A1 (en) * 2001-01-16 2002-11-28 Karin Molling Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2448146A1 (en) * 2001-05-25 2002-12-05 Incyte Genomics, Inc. Secreted proteins
AU2002324700A1 (en) * 2001-08-14 2003-03-03 Bayer Ag Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
AU2003209459A1 (en) * 2002-03-06 2003-09-16 Hybrigenics Protein-protein interactions in human tumours involving bcmp-7 and bcmp-11
WO2003102159A2 (en) * 2002-06-04 2003-12-11 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US7053201B2 (en) * 2002-08-30 2006-05-30 National Defense Medical Center Nucleic acid molecules and polypeptides related to h-ADAM7
TW200413539A (en) * 2002-09-30 2004-08-01 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to prostate cancers
CN101928344B (zh) 2002-10-17 2014-08-13 根马布股份公司 抗cd20的人单克隆抗体
CA2504903A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-27 Sequenom, Inc. Method for identifying risk of melanoma and treatments thereof
CN101260429B (zh) * 2003-01-17 2011-03-30 香港中文大学 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA
AU2004210986A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 Wyeth Methods for monitoring drug activities in vivo
WO2005049806A2 (en) * 2003-03-14 2005-06-02 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20050255114A1 (en) * 2003-04-07 2005-11-17 Nuvelo, Inc. Methods and diagnosis for the treatment of preeclampsia
RU2256924C2 (ru) * 2003-09-03 2005-07-20 Торопова Надежда Ефимовна Способ дифференциальной диагностики злокачественных опухолей простаты
WO2005079490A2 (en) * 2004-02-13 2005-09-01 Nuvelo, Inc. Methods of therapy and diagnosis using targeting of cells that express steap2 polypeptides
CN1663603A (zh) * 2004-03-02 2005-09-07 北京大学 一种肿瘤－胎盘抗原蛋白及其dna在肿瘤治疗中的应用
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
EP1970384A1 (en) 2007-03-14 2008-09-17 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
EP2166021A1 (en) 2008-09-16 2010-03-24 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
EP2221063A1 (en) * 2009-02-20 2010-08-25 Ganymed Pharmaceuticals AG Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
PL2398902T3 (pl) * 2009-02-20 2024-02-26 Astellas Pharma Inc. Sposoby i kompozycje do diagnozowania i leczenia nowotworu złośliwego
EP2371864A1 (en) 2010-03-23 2011-10-05 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
US20140017254A1 (en) 2014-01-16
EP1762575A1 (en) 2007-03-14
KR20130121198A (ko) 2013-11-05
RS53988B1 (en) 2015-10-30
SI2894162T1 (en) 2018-05-31
EP1924600A2 (en) 2008-05-28
ES2532410T3 (es) 2015-03-26
RS53009B (en) 2014-04-30
CY1120096T1 (el) 2018-12-12
US20090202530A1 (en) 2009-08-13
JP2016166175A (ja) 2016-09-15
EP2433957A2 (en) 2012-03-28
EP2433960A2 (en) 2012-03-28
EP2966082A1 (en) 2016-01-13
EP2894162B1 (en) 2018-01-03
EP2433962B1 (en) 2015-03-25
ES2434945T3 (es) 2013-12-18
PL2433954T3 (pl) 2015-07-31
US9919036B2 (en) 2018-03-20
CN101305020B (zh) 2015-09-02
US20170080068A1 (en) 2017-03-23
JP6196338B2 (ja) 2017-09-13
RU2485974C2 (ru) 2013-06-27
PT2433954E (pt) 2015-06-02
EP2433954A2 (en) 2012-03-28
SI2433954T1 (sl) 2015-06-30
EP2433956A3 (en) 2012-07-04
EP2433962A3 (en) 2012-07-04
SI1924600T1 (sl) 2013-12-31
LT2894162T (lt) 2018-04-10
DK1924600T3 (da) 2013-11-11
EP2433957A3 (en) 2012-07-04
ES2535500T3 (es) 2015-05-12
PL2894162T3 (pl) 2018-06-29
RS57080B1 (sr) 2018-06-29
JP6037593B2 (ja) 2016-12-07
CA2820201A1 (en) 2007-03-22
HK1118840A1 (en) 2009-02-20
JP5913547B2 (ja) 2016-04-27
HK1168608A1 (en) 2013-01-04
HK1211606A1 (en) 2016-05-27
ES2664386T3 (es) 2018-04-19
AU2006291717B2 (en) 2013-06-06
EP2902412A1 (en) 2015-08-05
RU2008114318A (ru) 2009-10-20
HRP20131047T1 (hr) 2013-12-06
KR20080052664A (ko) 2008-06-11
EP2433962A2 (en) 2012-03-28
PT2894162T (pt) 2018-04-02
EP2433959A3 (en) 2012-06-27
EP2433954B1 (en) 2015-02-25
EP2433956A2 (en) 2012-03-28
EP2433961A3 (en) 2012-06-27
US8975375B2 (en) 2015-03-10
KR101359697B1 (ko) 2014-02-07
EP2433958B1 (en) 2015-02-25
CA2620712A1 (en) 2007-03-22
EP2894162A1 (en) 2015-07-15
DK2433954T3 (en) 2015-05-04
HRP20180507T1 (hr) 2018-05-04
EP2433960B1 (en) 2015-03-04
EP2433954A3 (en) 2012-07-04
WO2007031222A2 (en) 2007-03-22
JP5750433B2 (ja) 2015-07-22
EP2433958A2 (en) 2012-03-28
EP2966082B1 (en) 2017-08-30
EP2433960A3 (en) 2012-07-04
EP2433961A2 (en) 2012-03-28
EP2433955A2 (en) 2012-03-28
CY1114661T1 (el) 2016-10-05
JP2016102116A (ja) 2016-06-02
US20150197576A1 (en) 2015-07-16
EP2433958A3 (en) 2012-07-04
JP2013136579A (ja) 2013-07-11
DK2894162T3 (en) 2018-04-16
CA2820201C (en) 2018-07-17
HUE037307T2 (hu) 2018-08-28
EP2902412B1 (en) 2018-02-21
HRP20150432T1 (hr) 2015-09-25
EP2433954B8 (en) 2015-05-13
US20110189179A1 (en) 2011-08-04
RU2013113439A (ru) 2014-10-10
EP2433955A3 (en) 2012-07-04
RU2644686C2 (ru) 2018-02-13
JP2015120691A (ja) 2015-07-02
AU2006291717A1 (en) 2007-03-22
JP2009507868A (ja) 2009-02-26
EP2433959A2 (en) 2012-03-28
EP1924600B1 (en) 2013-08-28
CN101305020A (zh) 2008-11-12
CY1116951T1 (el) 2017-04-05
BRPI0616827A2 (pt) 2011-07-05
WO2007031222A3 (en) 2007-07-26
PL1924600T3 (pl) 2014-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT1924600E (pt) Identificação de antigénios associados a tumores para diagnóstico e terapia
AU2008315929B2 (en) Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
EP2249159A1 (en) Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
AU2017203332B2 (en) Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
AU2014202125B2 (en) Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
AU2016201637A1 (en) Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
MX2008003464A (en) Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy