BRPI0616827A2 - composição farmacêutica, método de diagnóstico ou monitoramento de doença, usos de agente, de anticorpo e de células t citolìticas ou que liberam citocina, agente, anticorpo, conjugado e kit - Google Patents

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BRPI0616827A2
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Abstract

COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE DIAGNóSTICO OU MONITORAMENTO DE DOENçA, USOS DE AGENTE, DE ANTICORPO E DE CéLULAS T CITOLìTICAS OU QUE LIBERAM CITOCINA, AGENTE, ANTICORPO, CONJUGADO E KIT. A presente invenção refere-se a produtos genéticos, a expressão dos quais está associada com doenças cancerígenas. A invenção também refere-se à terapia e diagnóstico de doenças nas quais os produtos genéticos são expressos ou anormalmente expressos, em particular doenças cancerigenas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE DIAGNÓSTICO OU MONITORA-MENTO DE DOENÇA, USOS DE AGENTE, DE ANTICORPO E DE CÉLU-LAS T CITOLÍTICAS OU QUE LIBERAM CITOCINA, AGENTE, ANTICORPO, CONJUGADO E KIT".
A despeito de abordagens interdisciplinares e uso exaustivo deprocedimentos terapêuticos clássicos, cânceres ainda estão entre as principaiscausas de morte. Conceitos terapêuticos mais recentes objetivam a incorpora-ção do sistema imune do paciente no conceito terapêutico global através deuso de vacinas recombinantes contra tumor e outras medidas específicas, talcomo terapia com anticorpo. Um pré-requisito para o sucesso de tal estratégia éo reconhecimento de antígenos ou epítopos tumor-específicos ou associadosao tumor pelo sistema imune do paciente, cujas funções efetuadoras têm de serintervencionalmente intensificadas. Células tumorígenas diferem biologicamen-te de suas células de origem não malignas de modo substancial. Essas diferen-ças são em virtude de alterações genéticas adquiridas durante o desenvolvi-mento do tumor e resultam, inter alia, também na formação de estruturas mole-culares qualitativa ou quantitativamente alteradas nas células cancerígenas.
Estruturas associadas ao tumor desse tipo as quais são reconhecidas pelo sis-tema imune específico do hospedeiro abrigando tumor são referidas como antí-genos associados ao tumor. O reconhecimento específico de antígenos associ-ados ao tumor envolve mecanismos celulares e humorais os quais são duasunidades funcionalmente interconectadas: linfócitos T CD4+ e CD8+ reconhe-cem os antígenos processados apresentados sobre as moléculas das classes Ile I do MHC (principal complexo de histocompatibilidade), respectivamente, en-quanto que linfócitos B produzem moléculas de anticorpo em circulação asquais se ligam diretamente a antígenos não processados. A importância clí-nica-terapêutica potencial de antígenos associados ao tumor resulta do fatode que o reconhecimento de antígenos sobre células neoplásicas pelo sis-tema imune leva ao início de mecanismos efetuadores citotóxicos e, na pre-sença de células T auxiliares, pode causar eliminação das células cancerí-genas (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). Conseqüentemente, um objetivocentral de imunologia de tumor é definir molecularmente essas estruturas. Anatureza molecular desses antígenos tem sido enigmática durante muitotempo. Somente após o desenvolvimento de técnicas de clonagem apropria-das foi possível selecionar bibliotecas de expressão de cDNA de tumoressistematicamente para antígenos associados ao tumor através de análisedas estruturas alvo de linfócitos T citotóxicos (CTL) (van der Bruggen e ou-tros, Science 254: 1643-7, 1991) ou através de uso de auto-anticorpos emcirculação (Sahin e outros, Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997) como son-das. Para essa finalidade, bibliotecas de expressão de cDNA foram prepara-das a partir de tecido tumorígeno fresco e recombinantemente expressascomo proteínas em sistemas adequados. Imunoefetuadores isolados de pa-cientes, isto é, clones de CTL com padrões de Iise tumor-específicos, ou au-to-anticorpos em circulação, foram utilizados para clonagem dos respectivosantígenos.
Em anos recentes, uma multiplicidade de antígenos foram defi-nidos em várias neoplasias através dessas abordagens.
Contudo, as sondas utilizadas para identificação de antígeno nosmétodos clássicos são imunoefetuadores (auto-anticorpos em circulação ouclones de CTL) de pacientes usualmente já tendo câncer avançado. Umasérie de dados indicam que tumores podem levar, por exemplo, à tolerizaçãoe anergização de células T e que, durante o curso da doença, especialmenteaquelas especificidades as quais poderiam causar reconhecimento imuneefetivo são perdidas do repertório imunoefetuador. Estudos atuais com paci-entes ainda não produziram qualquer evidência sólida de uma ação real dosantígenos associados ao tumor anteriormente descobertos e utilizados. Con-seqüentemente, não se pode ter como uma regra que proteína que estimu-lam respostas imunes espontâneas são as estruturas alvo erradas.
Era o objetivo da presente invenção proporcionar estruturas alvopara diagnóstico e terapia de cânceres.
Esse objetivo é obtido pelo assunto em questão das reivindicações.
De acordo com a invenção, são identificados genes os quais sãoseletiva ou anormalmente expressos em células tumorígenas e, assim, pro-porcionam antígenos associados ao tumor. Esses genes e/ou seus produtosgenéticos e/ou os derivados e/ou fragmentos dos mesmos são úteis comoestruturas alvo para abordagens diagnosticas e terapêuticas.
Os antígenos associados ao tumor identificados de acordo coma invenção têm uma seqüência de aminoácido codificada por um ácido nu-cleíco o qual é selecionado do grupo consistindo em (a) um ácido nucleíco oqual compreende uma seqüência de ácido nucleíco selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45,49, 61, 62 e 64-67 da listagem de seqüência, uma parte da mesma ou umderivado da mesma, (b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza ao ácido nu-cleíco de (a) sob condições estringentes, (c) um ácido nucleíco o qual é de-generado com relação ao ácido nucleíco de (a) ou (b) e (d) um ácido nucleí-co o qual é complementar ao ácido nucleíco de (a), (b) ou (c). Em uma mo-dalidade preferida, um antígeno associados ao tumor identificado de acordocom a invenção tem uma seqüência de aminoácido codificada por um ácidonucleíco o qual é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67 da listagem de seqüência. Em uma outra modalidade preferida, um antígeno associados aotumor identificado de acordo com a invenção compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14,18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 e 69 dá listagem de seqüên-cia, uma parte ou derivado da mesma.
A presente invenção refere-se, de modo gerai, ao uso de antíge-nos associados ao tumor identificados de acordo com a invenção ou de par-tes ou derivados dos mesmos, de ácidos nucleícos que codificam os antíge-nos associados ao tumor identificados de acordo com a invenção ou de par-tes ou derivados dos mesmos ou de ácidos nucleícos dirigidos contra os re-feridos antígenos associados ao tumor identificados de acordo com a inven-ção ou partes ou derivados dos mesmos e/ou de células hospedeiras ex-pressando os antígenos associados ao tumor identificados de acordo com ainvenção ou partes ou derivados dos mesmos para terapia, profilaxia, diag-nóstico e/ou monitoramento de doenças neoplásicas. Isso também pode en-volver o uso de uma combinação de dois ou mais desses antígenos, ácidosnucleícos, anticorpos, células T e/ou células hospedeiras, em uma modali-dade também em combinação com outros antígenos associados ao tumorque não aqueles identificados de acordo com a invenção, ácidos nucleícosque codificam os mesmos ou ácidos nucleícos dirigidos contra os referidosácidos nucleícos de codificação, anticorpos ou células T dirigidos contra osreferidos antígenos associados ao tumor e/ou células hospedeiras expres-sando os referidos antígenos associados ao tumor.
Naquelas modalidades da invenção referentes ao uso de anti-corpos dirigidos contra os antígenos associados ao tumor identificados deacordo com a invenção ou partes ou derivados dos mesmos, também recep-tores de células T dirigidos contra os antígenos associados ao tumor identifi-cados de acordo com a invenção ou partes ou derivados dos mesmos, op-cionalmente em um complexo com moléculas do MHC1 podem ser usados.
Especialmente adequada para terapia, profilaxia, diagnósticoe/ou monitoramento é uma parte dos antígenos associados ao tumor identifi-cados de acordo com a invenção a qual corresponde à porção não-transmembrana, em particular à porção extracelular dos antígenos associa-dos ao tumor ou é compreendida da mesma. Portanto, de acordo com a in-venção, uma parte dos antígenos associados ao tumor identificados de a-cordo com a invenção a qual corresponde à porção não-transmembrana, emparticular à porção extracelular dos antígenos associados ao tumor ou écompreendida da mesma ou uma parte correspondente dos ácidos nucleícosque codificam os antígenos associados ao tumor identificados de acordocom a invenção é preferida para terapia, profilaxia e/ou monitoramento. Simi-larmente, o uso de anticorpos é preferido, os quais são dirigidos contra umaparte dos antígenos associados ao tumor identificados de acordo com a in-venção os quais correspondem à porção não-transmembrana, em particularà porção extracelular dos antígenos associados ao tumor ou é compreendidada mesma.
Doenças preferidas para uma terapia, profilaxia e/ou diagnósticosão aquelas nas quais um ou mais dos antígenos associados ao tumor iden-tificados de acordo com a invenção são seletivamente expressos ou anor-malmente expressos.
Além disso, a invenção refere-se a ácidos nucleícos e proteínaou peptídeos os quais resultam de união alterada (variantes com união) degenes conhecidos ou tradução alterada usando redes de leitura aberta alter-nativas. Nesse aspecto, a invenção refere-se a ácidos nucleícos os quaiscompreendem uma seqüência de ácido nucleíco selecionada do grupo con-sistindo em SEQ ID NOs: 28 e 49 da listagem de seqüência. Além disso,nesse aspecto, a invenção refere-se à proteína ou peptídeos os quais com-preendem uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindoem SEQ ID NOs: 29 e 50 da listagem de seqüência.
União alterada de um gene resulta em uma seqüência de trans-crito alterada (variante com união). Tradução de uma variante com união naregião de sua seqüência alterada resulta em uma proteína alterada a qualpode ser distintamente diferente, quanto à estrutura e função, de sua proteí-na original. Variantes com união associadas ao tumor podem produzir trans-critos associados ao tumor e proteínas/antígenos associados ao tumor. Es-ses podem ser utilizados como marcadores moleculares para detecção decélulas tumorígenas e para objetivação terapêutica de tumores. Detecção decélulas tumorígenas em uma amostra de um paciente pode ser realizada deacordo com a invenção, por exemplo, após extração de ácidos nucleícosatravés de amplificação por PCR com oligonucleotídeos variante com união-específicos.
De acordo com a invenção, todos os sistemas de detecção se-qüência-dependentes são adequados para detecção. Esses são, além dePCR, por exemplo, sistemas de lasca/microarranjo de gene, Northern blot,ensaios de proteção com RNAse (RDA) e outros. Todos os sistemas de de-tecção têm em comum que a detecção é baseada em uma hibridização es-pecífica com pelo menos uma seqüência de ácido nucleíco variante com u-nião-específica. Contudo, células tumorígenas também podem ser detecta-das de acordo com a invenção por anticorpos os quais reconhecem um epí-topo específico codificado pela variante com união. Os referidos anticorpospodem ser preparados usando peptídeos de imunização os quais são espe-cíficos para a referida variante com união. Adequadas para imunização são,particularmente, as seqüências de aminoácido as quais são distintamentediferentes da(s) variante(s) do produto genético, a(s) qual(is) é(são) produzi-da(s) em células saudáveis. Detecção de células tumorígenas com anticor-pos pode ser realizada aqui sobre uma amostra isolada do paciente ou comoformação de imagem com anticorpos intravenosamente administrados.
Além de utilidade diagnostica, variantes com união tendo epíto-pos novos ou alterados são alvos atraentes para imunoterapia, uma vez queesses epítopos podem ser utilizados para objetivação de anticorpos ou linfó-citos T conforme descrito aqui. Em imunoterapia passiva, anticorpos ou Iin-fócitos T os quais reconhecem epítopos variantes com união-específicos sãoadotivamente transferidos aqui. Conforme no caso de outros antígenos, anti-corpos podem ser gerados também usando tecnologias padrões com utiliza-ção de polipeptídeos os quais incluem esses epítopos. Alternativamente, épossível utilizar, para imunização, ácidos nucleícos que codificam peptídeosos quais contêm os referidos epítopos. Várias técnicas para geração in vitroou in vivo de linfócitos T epítopo-específicos são conhecidas e foram descri-tas em detalhes (por exemplo, Kessler JH, e outros 2001, Sahin e outros,1997) e são, da mesma forma, baseadas em utilização de peptídeos osquais contêm os epítopos variante com união-específicos ou ácidos nucleí-cos que codificam os referidos peptídeos também podem ser usados comosubstâncias farmaceuticamente ativas em imunoterapia ativa (por exemplo,vacinação, terapia com vacina).
Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição farma-cêutica compreendendo um agente o qual reconhece um antígeno associadoao tumor identificado de acordo com a invenção ou um ácido nucleíco quecodifica o antígeno associado ao tumor e o qual é, de preferência, seletivopara células as quais têm expressão ou expressão anormal de um antígenoassociado ao tumor identificado de acordo com a invenção. Em um outroaspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreen-dendo um agente o qual (I) inibe expressão ou atividade de um antígeno as-sociado ao tumor identificado de acordo com a invenção e/ou (II) tem ativi-dade de inibição de tumor ou destruição de tumor e é seletivo para célulasexpressando ou expressando anormalmente um antígeno associados aotumor identificado de acordo com a invenção e/ou (III) quando administrada,aumenta seletivamente a quantidade de complexos entre uma molécula doMHC e um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com a inven-ção ou uma parte do mesmo, tal como um epítopo peptídico. Em modalida-des particulares, o referido agente pode causar indução de morte celular,redução no crescimento celular, dano à membrana celular ou secreção decitocinas e, de preferência, tem uma atividade de inibição de tumor. Em umamodalidade, o agente é um agente anti-sentido o qual se hibridiza seletiva-mente com o ácido nucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor. Emuma outra modalidade, o agente é um siRNA de preferência compreendendouma fita de RNA sentido e uma fita de RNA anti-sentido, em que as fitas deRNA sentido e anti-sentido formam uma dupla de RNA e em que a fita deRNA sentido compreende uma seqüência de nucleotídeo substancialmenteidêntica a uma seqüência alvo de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeoscontínuos em um ácido nucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor,de preferência mRNA que codifica o antígeno associado ao tumor. Em umaoutra modalidade, o agente é um anticorpo o qual se liga seletivamente aoantígeno associado ao tumor, em particular um anticorpo toxina-conjugadoou complemento-ativado o qual se liga seletivamente ao antígeno associadoao tumor. Em uma modalidade preferida, o anticorpo o qual se liga seletiva-mente ao antígeno associado ao tumor é acoplado a uma substância tera-peuticamente útil e/ou recruta mecanismos efetuadores naturais ou artificiaisà referida célula expressando ou expressando anormalmente o referido antí-geno associado ao tumor. Em uma outra modalidade, o agente é um linfócitoT citotóxico o qual reconhece o antígeno associado ao tumor ou uma partedo mesmo ligado por uma molécula do MHC sobre uma célula e submete ascélulas rotuladas dessa forma à lise. Em uma outra modalidade, o agente éum linfócito T auxiliar o qual intensifica funções efetuadoras de outras célu-las que reconhecem especificamente o referido antígeno associado ao tumorou uma parte do mesmo.
Em uma outra modalidade, o agente compreende dois ou maisagentes os quais reconhecem, cada um, diferentes antígenos associados aotumor e/ou inibem a expressão ou atividade de diferentes antígenos associ-ados ao tumor e/ou têm atividade de inibição de tumor ou destruição de tu-mor e são seletivos para células expressando ou expressando anormalmen-te diferentes antígenos associados ao tumor e/ou, quando administrados,aumentam seletivamente a quantidade de complexos entre moléculas doMHC e diferentes antígenos associados ao tumor ou partes dos mesmos,em que pelo menos um dos referidos diferentes antígenos associados aotumor é um antígeno associados ao tumor identificado de acordo com a in-venção. De preferência, um antígeno associado ao tumor seletivamente limi-tado a tumores serve como um rótulo para recrutamento de mecanismosefetuadores a esse local específico. A invenção inclui modalidades em que oagente em si não tem uma capacidade de inibir a atividade de um antígenoassociado ao tumor ou uma atividade de inibição de tumor ou destruição detumor, mas media tal efeito, em particular através de recrutamento de meca-nismos efetuadores, em particular aqueles tendo potencial de dano celular, aum local específico, em particular um tumor ou células tumorígenas.
A atividade de um antígeno associado ao tumor identificado deacordo com a invenção pode ser qualquer atividade de uma proteína ou umpeptídeo. Em uma modalidade, essa atividade é uma atividade enzimática.
De acordo com a invenção, a frase "inibição de expressão ouatividade" inclui uma inibição completa ou essencialmente completa de ex-pressão ou atividade e uma redução na expressão ou atividade.
O agente o qual, quando administrado, aumenta seletivamente aquantidade de complexos entre uma molécula do MHC e um antígeno asso-ciado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou uma parte domesmo, compreende um ou mais componentes selecionados do grupo con-sistindo em (i) o antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, (ii)um ácido nucleíco o qual codifica o referido antígeno associado ao tumor ouuma parte do mesmo, (iii) uma célula hospedeira a qual expressa o referidoantígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo e (iy) complexos iso-lados entre epítopos peptídicos do referido antígeno associado ao tumor euma molécula do MHC.
A invenção, além disso, refere-se a uma composição farmacêu-tica a qual compreende um ou mais componentes selecionados do grupoconsistindo em (i) um antígeno associado ao tumor identificado de acordocom a invenção ou uma parte do mesmo, (ii) um ácido nucleíco o qual codifi-ca um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com a invençãoou uma parte do mesmo, (iii) um anticorpo o qual se liga a um antígeno as-sociado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou a uma parte domesmo, (iv) um ácido nucleíco anti-sentido o qual se hibridiza especifica-mente com um ácido nucleíco que codifica um antígeno associado ao tumoridentificado de acordo com a invenção, (v) um siRNA dirigido contra um áci-do nucleíco que codifica um antígeno associado ao tumor identificado deacordo com a invenção, (vi) uma célula hospedeira a qual expressa um antí-geno associado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou uma par-te do mesmo e (vii) complexos isolados entre um antígeno associado ao tu-mor identificado de acordo com a invenção ou uma parte do mesmo e umamolécula do MHC.
Em uma modalidade, um ácido nucleíco que codifica um antíge-no associado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou uma partedo mesmo está presente na composição farmacêutica em um vetor de ex-pressão e funcionalmente ligado a um promotor. Em uma outra modalidade,um ácido nucleíco que codifica um antígeno associado ao tumor identificadode acordo com a invenção ou uma parte do mesmo está presente na com-posição farmacêutica em um vírus, conforme ainda descrito abaixo.
Em uma outra modalidade, uma célula hospedeira presente emuma composição farmacêutica da invenção secreta ou antígeno associadoao tumor ou a parte do mesmo, expressa sobre sua superfície e, de prefe-rência, adicionalmente, expressa uma molécula do MHC a qual se liga aoreferido antígeno associado ao tumor ou referida parte do mesmo. Em umamodalidade, a célula hospedeira expressa a molécula do MHC endogena-mente. Em uma outra modalidade, a célula hospedeira expressa a moléculado MHC e/ou o antígeno associado ao tumor ou a parte do mesmo de umamaneira recombinante. A célula hospedeira é, de preferência, não proliferati-va. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula apre-sentando antígeno, em particular uma célula dendrítica, um monócito ou ummacrófago.
Em uma outra modalidade, um anticorpo presente em uma com-posição farmacêutica da invenção é um anticorpo monoclonal. Em outrasmodalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado, umfragmento de um anticorpo natural ou um anticorpo sintético. O anticorpopode ser acoplado a um agente terapêutico ou diagnosticamente útil tambémdenominado agente terapêutico ou diagnóstico aqui.
Um ácido nucleíco anti-sentido presente em uma composiçãofarmacêutica da invenção pode compreender uma seqüência de 6-50, emparticular 10-30, 15-30 e 20-30 nucleotídeos contínuos do ácido nucleícoque codifica o antígeno associado ao tumor identificado de acordo com ainvenção.
Em outras modalidades, um antígeno associado ao tumor ouuma parte do mesmo, proporcionado por uma composição farmacêutica dainvenção diretamente ou via expressão de um ácido nucleíco, se liga à mo-léculas do MHC sobre a superfície de células, a referida ligação, de prefe-rência, causando uma resposta citolítica e/ou induzindo-à liberação de cito-cina.
Em modalidades particulares do siRNA que objetiva o ácido nu-cleíco de acordo com SEQ ID NO: 1, a fita de RNA sendo tem a seqüênciade SEQ ID NO: 70 e a fita de RNA anti-sentido tem a seqüência de SEQ IDNO: 71 ou a fita de RNA sendo tem a seqüência de SEQ ID NO: 72 e a fitade RNA anti-sentido tem a seqüência de SEQ ID NO: 73.
Uma composição farmacêutica da invenção pode compreenderum veículo e/ou um adjuvante farmaceuticamente compatível.
Uma composição farmacêutica da invenção é, de preferência,usada para o tratamento ou prevenção de uma doença caracterizada porexpressão seletiva ou expressão anormal de um antígeno associado ao tu-mor. Em uma modalidade preferida, a doença é uma doença neoplásica, depreferência câncer.
Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica dainvenção está na forma de uma vacina a qual pode ser usada terapêutica ouprofilaticamente. Tal vacina compreende, de preferência, um antígeno asso-ciado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou uma parte domesmo e/ou um ácido nucleíco o qual codifica um antígeno associado aotumor identificado de acordo com a invenção ou uma parte do mesmo. Emmodalidades particulares, o ácido nucleíco está presente em um vírus oucélula hospedeira.
A invenção, além disso, refere-se a métodos de tratamento, pre-venção, diagnóstico ou monitoramento, isto é, determinação da regressão,progressão, curso e/ou início de uma doença caracterizada por expressãoou expressão anormal de um ou mais antígenos associados ao tumor identi-ficados de acordo com a invenção, de preferência uma doença neoplásica,em particular câncer. Em uma modalidade, o tratamento ou prevenção com-preende administração de uma composição farmacêutica da invenção.
Os referidos métodos de diagnóstico e/ou de monitoramento deacordo com a invenção geralmente refere-sem à detecção e/ou determina-ção da quantidade de um ou mais parâmetros selecionados do grupo consis-tindo em (i) um ácido nucleíco, o qual codifica um antígeno associado aotumor selecionado do grupo consistindo em (i) um ácido nucleíco o qual co-difica um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com a inven-ção ou uma parte do mesmo, (ii) um antígeno associado ao tumor identifica-do de acordo com a invenção ou uma parte do mesmo, (iii) um anticorpocontra um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com a inven-ção ou uma parte do mesmo e (iv) linfócitos T, de preferência linfócitos Tcitotóxicos ou auxiliares, os quais são específicos para um antígeno associ-ado ao tumor identificado de acordo com a invenção ou uma parte do mes-mo e uma molécula do MHC, em uma amostra biológica isolada de um paci-ente, de preferência de um paciente tendo a referida doença, sendo suspeitade ter ou ficar enfermo com a referida doença ou tendo um potencial para areferida doença. Meios para realizar a referida detecção e/ou determinaçãoda quantidade são descritos aqui e serão evidentes para aqueles habilitadosna técnica.
De preferência, a presença do referido ácido nucleíco, do referi-do antígerio associado ao tumor ou da referida parte do mesmo, do referidoanticorpo e/ou referidos linfócitos T e/ou uma quantidade do referido ácidonucleíco, do referido antígeno associado ao tumor ou da referida parte domesmo, do referido anticorpo e/ou dos referidos linfócitos T a qual é aumen-tada comparado com um paciente sem a referida doença é indicativa da pre-sença da referida doença ou um potencial para desenvolvimento da referidadoença.
Os métodos de diagnóstico e/ou monitoramento da invençãotambém incluem modalidades em que, através de detecção ou determinaçãoda quantidade do referido ácido nucleíco, do referido antígeno associado aotumor ou da referida parte do mesmo, do referido anticorpo e/ou do referidolinfócito T é possível avaliar e/ou prognosticar o comportamento metastáticoda referida doença, em que, de preferência, a presença do referido ácidonucleíco, do referido antígeno associado ao tumor ou da referida parte domesmo, do referido anticorpo e/ou dos referidos linfócitos T e/ou uma quan-tidade do referido ácido nucleíco, do referido antígeno associado ao tumorou da referida parte-do mesmo, do referido anticorpo e/ou do referido linfóci-to T a qual é aumentada comparado com um paciente sem a referida doençaou sem uma metástase da referida doença é indicativa de um comportamen-to metastático da referida doença ou um potencial por um comportamentometastático da referida doença.
Em modalidades particulares, à referidas detecção ou determi-nação da quantidade compreende (i) contato de uma amostra biológica comum agente o qual se liga especificamente ao referido ácido nucleíco que co-difica o antígeno associado ao tumor ou a referida parte do mesmo, ao refe-rido antígeno associado ao tumor ou a referida parte do mesmo, ao referidoanticorpo ou a referida parte do mesmo ou as referidos linfócitos T e (ii) de-tecção da formação de ou determinação da quantidade de um complexo en-tre o agente e o ácido nucleíco ou a parte do mesmo, o antígeno associadoao tumor ou a parte do mesmo, ou anticorpo ou a parte do mesmo ou ós Iin-fócitos T. Em uma modalidade, a doença é caracterizada pela expressãoanormal de dois ou mais diferentes antígenos associados ao tumor ou departes dos mesmos, de dois ou mais anticorpos que se ligam aos referidosdois ou mais antígenos associados ao tumor ou à partes dos mesmos e/oude dois ou mais linfócitos T específicos para os referidos dois ou mais antí-genos associados ao tumor diferentes ou partes dos mesmos, ou complexosdos mesmos com moléculas do MHC. Em uma outra modalidade, a amostrabiológica isolada do paciente é comparada com um amostra biológica normalcomparável.
Os métodos de monitoramento de acordo com a invenção com-preendem, de preferência, uma detecção de e/ou determinação da quanti-dade de um ou mais dos parâmetros mencionados acima em uma primeiraamostra em um primeiro ponto de tempo e em uma outra amostra em umsegundo ponto de tempo, em que o curso da doença é determinado atravésde comparação das duas amostras.
De acordo com a invenção, repetição de um ácido nucleíco oude uma parte do mesmo ou determinação da quantidade de um ácido nucle-íco ou de uma parte do mesmo pode ser realizada usando uma sonda deoligo- ou polinucleotídeo a qual se hibridiza-especificamente ao referido áci-do nucleíco ou à referida parte do mesmo ou pode ser realizada através deamplificação seletiva do referido ácido nucleíco ou da referida parte domesmo, por exemplo, por meio de amplificação por PCR. Em uma modali-dade, a sonda de oligo- ou polinucleotídeo compreende uma seqüência de6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30, nucleotídeos contínuos do referidoácido nucleíco.
Em modalidades particulares, o antígeno associado ao tumor ouparte do mesmo o qual tem de ser detectado ou a quantidade do qual tem deser determinada nos métodos da presente invenção está presente intracelu-larmente, sobre a superfície da célula ou em um complexo com uma molécu-la do MHC. De acordo com a invenção, detecção de um antígeno associadoao tumor ou de uma parte do mesmo ou determinação da quantidade de umantígeno associado ao tumor ou de uma parte do mesmo pode ser realizadausando um anticorpo que se liga especificamente ao referido antígeno asso-ciado ao tumor ou referida parte do mesmo.
De acordo com a invenção, detecção de um anticorpo ou deter-minação da quantidade de um anticorpo pode ser realizada usando uma pro-teína ou peptídeo que se liga especificamente a um referido anticorpo.
De acordo com a invenção, detecção de ou determinação daquantidade de linfócitos T os quais são específicos para üm antígeno asso-ciado ao tumor ou uma parte do mesmo e/ou um complexo do mesmo comuma molécula do MHC pode ser realizada usando uma célula que apresentao complexo entre o referido antígeno associado ao tumor ou a referida partedo mesmo e uma molécula do MHC. Linfócitos T podem, adicionalmente, serdetectados através de detecção de sua proliferação, sua produção de citoci-na e sua atividade citotóxica disparada através de estimulação específicacom um complexo de uma molécula do MHC e um antígeno associado aotumor ou uma parte do mesmo. Linfócitos T também podem ser detectadoscom o auxílio de uma molécula do MHC recombinante ou um complexo deduas ou mais moléculas do MHC carregadas com fragmentos imunogênicosde um ou mais antígenos associados ao tumor.
Um agente Qqual é usado para detecção ou determinação daquantidade nos métodos da invenção, tal como uma sonda de oligo- ou poli-nucleotídeo, um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo ou uma célula é, depreferência, rotulado de uma maneira detectável, em particular através deum marcador detectável, tal como um marcador radioativo ou um marcadorenzimático.
Em um aspecto particular, a invenção refere-se a um método detratamento, prevenção, diagnóstico ou monitoramento de uma doença carac-terizada por expressão ou expressão anormal de um antígeno associado aotumor identificado de acordo com a invenção, método o qual compreendeadministração de um anticorpo o qual se liga ao referido antígeno associadoao tumor ou uma parte do mesmo e o qual é acoplado á um agente terapêu-tico ou diagnóstico. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Em ou-tras modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado ouum fragmento de um anticorpo natural.
Em determinadas modalidades, os métodos da invenção de di-agnóstico ou monitoramento de uma doença caracterizada por expressão ouexpressão anormal de um antígeno associado ao tumor identificado de acor-do com a invenção são realizadas com uma amostra biológica contendo oususpeita de conter células tumorígenas de disseminação ou células tumorí-genas metastáticas. Tais amostras biológicas incluem, por exemplo, sangue,soro, medula óssea, escarro, aspirado brônquico e/ou lavagem brônquica.
Em um aspecto particular, a invenção refere-se a um método detratamento de um paciente tendo uma doença caracterizada pela expressãoou expressão anormal de um antígeno associado ao tumor identificado deacordo com a invenção, método o qual compreende (i) fornecimento de umaamostra contendo células imuno - reativas, quer obtidas do referido pacienteou de outro indivíduo da mesma espécie, em particular um indivíduo saudá-vel ou em um indivíduo de uma espécie diferente, (ii) contato da referidaamostra com uma célula hospedeira expressando o referido antígeno asso-ciado ao tumor ou uma parte do mesmo, sob condições as quais favorecema produção de células T citolíticas contra o referido antígeno associado aotumor ou uma parte do mesmo e (iii) introdução das células T citolíticas nopaciente em uma quantidade adequada para Iise das células expressando oantígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo. Em uma modalidade,o método inclui clonagem do receptor de células T de célula T citolíticas ob-tidas e transferência do ácido nucleíco que codifica o receptor de células Tpara células T, quer obtidas do referido paciente ou de outro indivíduo damesma espécie, em particular um indivíduo saudável ou um indivíduo deuma espécie diferente, células T as quais, assim, recebem a especificidadedesejada e, conforme sob (iii), podem ser introduzidas no paciente.
Em uma modalidade, a célula hospedeira expressa endogena-mente uma molécula do MHC. Em uma outra modalidade a célula hospedei-ra expressa recombinantemente uma molécula do MHC e/ou o antígeno as-sociado ao tumor ou uma parte do mesmo. De preferência, a célula hospe-deira apresenta o antígeno associado ao tumor ou parte do mesmo atravésde moléculas do MHC sobre sua superfície. A célula hospedeira é, de prefe-rência, não proliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeiraé uma célula apresentando antígeno, em particular, uma célula dendrítica,um monócito ou um macrófago.
A invenção também refere-se a um método de tratamento deuma doença caracterizada por expressão ou expressão anormal de um antí-geno associado ao tumor identificado de acordo com a invenção, método oqual compreende (i) identificação de células do paciente as quais expressamquantidades anormais do antígeno associado ao tumor, (ii) isolamento deuma amostra das referidas células, (iii) cultura das referidas células e (iv)introdução das referidas células no paciente em uma quantidade adequadapara disparar uma resposta imune às células.
A presente invenção, além disso, refere-se a um ácido nucleícoselecionado do grupo consistindo em (a) um ácido nucleíco o qual compre-ende uma seqüência de ácido nucleíco selecionada do grupo consistindo emSEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou derivado das mesmas, (b) um ácido nucleíco o qual se hi-bridiza com o ácido nucleíco de (a) sob condições estringentes, (c) um ácidonucleíco o qual é degenerado com relação ao ácido nucleíco de (a) ou (b) e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleíco de (a), (b) ou(c). A invenção, além disso, refere-se a um ácido nucleíco o qual codificauma proteína ou polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoáci-do selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22,26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 e 69 ou uma parte ou derivado dasmesmas.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula deácido nucleíco recombinante, em particular, uma molécula de DNA ou RNA,a qual compreende um ácido nucleíco da invenção.
A invenção também refere-se a células hospedeiras as quaiscontêm um ácido nucleíco ou molécula de ácido nucleíco recombinante dainvenção.
A célula hospedeira também pode compreender um ácido nucle-íco que codifica uma molécula do MHC. Em uma modalidade, a célula hos-pedeira expressa endogenamente a molécula do MHC. Em uma outra moda-lidade, a célula hospedeira expressa recombinantemente a molécula doMHC e/ou o ácido nucleíco ou molécula de ácido nucleíco recombinante dainvenção ou uma parte da mesma. De preferência, a célula hospedeira é nãoproliferativa. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célu-la apresentando antígeno, em particular uma célula dendrítica, um monócitoou um macrófago.
Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a oligonucleotí-deos os quais se hibridizam com um ácido nucleíco identificado de acordocom a invenção e os quais podem ser usados como sondas genéticas oucomo moléculas "anti-sentido". Molécula de ácido nucleíco na forma de inici-adores de oligonucleotídeo ou sondas competentes, as quais se hibridizamcom um ácido nucleíco identificado de acordo com a invenção ou partes domesmo, podem ser usadas para encontrar ácidos nucleícos os quais sãohomólogos ao referido ácido nucleíco identificado de acordo com a invenção,por exemplo, através de amplificação por PCR, hibridização de Southern eNorthern. Hibridização pode ser realizada sob condições de baixa estringên-cia, mais preferivelmente, sob média estringência e, ainda mais preferivel-mente, sob condições de alta estringência.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma PTR ou pep-tídeo o qual é codificado por um ácido nucleíco selecionado do grupo consis-tindo em (a) um ácido nucleíco compreende uma seqüência de ácido nucleí-co selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25,28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou derivado das mes-mas, (b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleíco de (a)sob condições estringentes, (c) um ácido nucleíco o qual é degenerado comrelação ao ácido nucleíco de (a) ou (b) e (d) um ácido nucleíco o qual é com-plementar ao ácido nucleíco de (a), (b) ou (c). A invenção, além disso, refe-re-se a um ácido nucleíco o qual codifica uma proteína ou polipeptídeo com-preendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistin-do em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60,63, 68 e 69 ou uma parte ou derivado das mesmas.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento imu-nogênico de um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com ainvenção. O referido fragmento, de preferência, se liga a uma molécula deMHC ou um anticorpo, de preferência, a um receptor de HLA humano ou umanticorpo humano. De acordo com a invenção, um fragmento compreende,de preferência, uma seqüência de pelo menos 6, em particular pelo menos8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo me-nos 30 ou pelo menos 50 aminoácidos.
Nesse aspecto, a invenção refere-se em particular, a um peptí-deo o qual tem ou compreende uma seqüência selecionada do grupo consis-tindo em SEQ ID NOs: 51-60, 68 e 69 da listagem de seqüência, uma parteou derivado das mesmas.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um agente o qualse liga a um antígeno associado ao tumor identificado de acordo com a in-venção ou a uma parte do mesmo. Em uma modalidade preferida, o agenteé uma proteína ou peptídeo, em particular um anticorpo, um receptor de cé-lulas T ou uma molécula de MHC. Em outras~modalidades, o anticorpo é umanticorpo monoclonal. quimérico ou humanizado, um anticorpo produzidoatravés de técnicas combinatórias ou um fragmento de um anticorpo. Emuma modalidade preferida, a invenção refere-se a um anticorpo o qual seliga a um complexo de (i) um antígeno associado ao tumor identificado deacordo com a invenção ou uma parte do mesmo e (ii) uma molécula do MHCà qual o referido antígeno associado ao tumor identificado de acordo com ainvenção ou a referida parte do mesmo se liga, com o referido anticorpo nãose ligando a (i) ou (ii) apenas.
Em particular, a invenção de refere a tal agente em particular umanticorpo, o qual se liga especificamente a um peptídeo o qual tem ou com-preende uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:51-60, 68 e 69 da listagem de seqüência, uma parte dás mesmas ou deriva-do das mesmas.
De acordo com a invenção, o termo "ligação" refere-se, de prefe-rência a uma ligação específica. "Ligação específica" significa que um agen-te, tal como um anticorpo, se liga mais forte a um alvo, tal como um epítopopara o qual ele é específico comparado com a ligação a outro alvo. Um a-gente se liga mais forte a um primeiro alvo comparado com um segundo alvose ele se liga a um primeiro alvo com uma constate de dissociação (Kd) aqual é menor do que a constante de dissociação para o segundo alvo. Depreferência, a constante de dissociação (K0) para o alvo ao qual o agente seliga especificamente é mais do que 10-vezes, de preferência, 20-vezes, maispreferivelmente mais de 50-vezes, ainda mais preferivelmente mais de 100-vezes, 200- vezes, 500-vezes ou 1000-vezes menor do que a constante dedissociação (Kd) para o alvo ao qual o agente não se liga especificamente.
Tais anticorpos específicos podem, por exemplo, ser obtidos a-través de imunização usando os peptídeos antes mencionados.
A invenção, além disso, refere-se a um conjugado entre um a-gente da invenção o qual se liga a um antígeno associado ao tumor identifi-cado de acordo com a invenção ou a uma parte do mesmo ou um anticorpoda invenção e um agente terapêutico ou diagnóstico. Em uma modalidade, oagente terapêutico ou diagnóstico é uma toxina.
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit para detec-ção de expressão ou expressão anormal de um antígeno associado ao tu-mor identificado de acordo com a invenção, kit o qual compreende agentespara detecção ou determinação da quantidade (i) do ácido nucleíco o qualcodifica o antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, (ii) do antí-geno associado ao tumor ou uma parte do mesmo (iii) de anticorpos os quaisse ligam ao antígeno associado ao tumor ou a uma parte do mesmo e/ou (iv)de células T as quais são específicas para o antígeno associado ao tumor ouuma parte do mesmo ou um complexo do mesmo com uma molécula doMHC. Em uma modalidade, os agentes para detecção do ácido nucleíco oude parte dos mesmos são moléculas de ácido nucleíco para amplificaçãoseletiva do referido ácido nucleíco as quais compreendem, em particular,uma seqüência de 6-50, em particular 10-30, 15-30 e 20-30 nucleotídeoscontínuos do referido ácido nucleíco.
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com a invenção, uma "referência", tal como uma a-mostra de referência ou um organismo de referência, pode ser usada paracorrelacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da invenção apartir de uma mostra de teste ou organismo de teste, isto é, um paciente.Tipicamente, o organismo de referência é um organismo saudável, em parti-cular um organismo o qual não sofre de câncer.
Um "valor de referência" pode ser determinado a partir de umareferência empiricamente através de medição de um número suficientemen-te grande de referências. De preferência, o valor de referência é determina-do através de medição de pelo menos 2, de preferência pelo menos 3, depreferência pelo menos 5, de preferência pelo menos 8, de preferência pelomenos 12, de preferência pelo menos 20, de preferência pelo menos 30, depreferência pelo menos 50, ou de preferência pelo menos 100 referências.
"Derivado" de um ácido nucleíco significa, de acordo com a in-venção, que uma única ou múltiplas, tal como pelo menos 2, pelo menos 4,ou pelo menos 6 e de preferência até 3, até4, até 5, até 6, até 10, até 15, ouaté 20 substituições, deleções e/ou adições de nucleotídeo estão presentesno referido-ácido nucleíco. Além disso, o termo "derivado"-também é com-preende derivatização química de um ácido nucleíco em uma base de nu-cleotídeo, sobre o açúcar ou sobre o fosfato. O termo "derivado" tambémcompreende ácidos nucleícos os quais contém nucleotídeos e análogos denucleotídeo que não ocorrem naturalmente.
De acordo com a invenção, um ácido nucleíco é, de preferência,um ácido deoxiribonucleíco (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA). Ácidos nu-cleícos compreendem, de acordo com a invenção, DNA genômico, cDNA,mRNA, moléculas recombinantemente produzidas e quimicamente sintetizadas.
De acordo com a invenção, um ácido nucleíco pode estar pre-sente como uma molécula fita simples ou fita dupla e linear ou covalente-mente fechada de modo circular.
Conforme usado aqui, o termo "RNA" significa uma moléculacompreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. Por "ribonucleo-tídeo" entenda-se um nucleòtídeo com um grupo hidroxila na posição 2' deuma porção beta-D-ribo-furanose. O termo inclui RNA fita dupla, RNA fitasimples, RNA isolado tal como RNA parcialmente purificado, RNA essenci-almente puro, RNA sintético, RNA recombinantemente produzido, bem comoRNA alterado que difere do RNA que ocorre naturalmente através da adição,deleçâo, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alte-rações podem incluir adição de um material de não-nucleotídeo, tal comoà(s) extremidade(s) de uma RNA ou internamente, por exemplo, em um oumais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos em moléculas de RNA tambémpodem compreender nucleotídeos não padrões, tais como nucleotídeos quenão ocorrem naturalmente ou nucleotídeos ou deoxinucleotídeos quimica-mente sintetizados. Esses RNAs podem ser referidos como análogo ou aná-logo de RNA que ocorre naturalmente.
Os ácidos nucleícos descritos de acordo com a invenção foram,de preferência, isolados. O termo "ácido nucleíco isolado" significa, de acor-do a invenção, que o ácido nucleíco foi (i) amplificado in vitro, por exemplo,através de reação em cadeia de polimerase (PCR), (ii) recombinante produ-zido através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo, através de clivagem efracionamento eletroforética em gel ou (iv) ou sintetizado, por exemplo, atra-vés de síntese química. Um ácido nucleíco isolado é um ácido nucleíco oqual está disponível para manipulação através de técnicas de DNA recombi-nante.
Um ácido nucleíco é "complementar" a outro ácido nucleíco seas duas seqüências são capazes de hibridização e formação de uma duplaestável uma com a outra, com hibridização sendo, de preferência, realizadasob condições as quais permitem hibridização específica entre polinucleotí-deos (condições estringentes). Condições estringentes são descritas, porexemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook e outros,Editores, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Har-bor, New York, 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Au-subel e outros, Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York que refere-sem,por exemplo, à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5 χ SSC,Ficoll a 0,02%, polivinilpirrolidona a 0,02%, albumina de soro bovino a0,02%, NaH2PO4 a 2,5 mM (pH de 7), SDS a 0,5, EDTA a 2 nM). SSC é clo-reto de sódio a 0,15 M/citrato de sódio a 0,15 M, pH de 7. Após hibridização,a membrana para qual o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 χSSC em temperatura ambiente e, então, em 0,1-0,5 * SSC/0,1 * SDS emtemperaturas de até 68°C.
De acordo com a invenção, ácidos nucleícos complementarestêm pelo menos 40%, em particular pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelomenos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de preferência pelo menos95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de nucleotídeos idênticos.
O termo "identidade percentual" se destina a denotar um percen-tual de nucleotídeos ou resíduos de aminoácido os quais são idênticos entreas duas seqüências a serem comparadas, obtidas após o melhor alinhamen-to, esse percentual sendo puramente estatístico e as diferenças entre asduas seqüências sendo distribuídas aleatoriamente e sobre seu comprimen-to inteiro. Comparações de seqüência entre duas seqüências de nucleotídeoou aminoácido são, convencionalmente realizadas através de comparaçãodessas-seqüências após ter-alinhado as mesmas otimamente, a referidacomparação sendo realizada através de segmento ou através de "janela decomparação" de forma a identificar e comparar regiões locais de similaridadede seqüência. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação podeser produzido, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologialocal de Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por meio do algo-ritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. MoL. Biol. 48,443, por meio do método de busca por similaridade de Pearson e Lipman,1988, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85, 2444 ou por meio de programas decomputador os quais usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA,BLAST P, BLAST N e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison1 Wis.).
A identidade percentual é calculada através de determinação donúmero de posições idênticas entre as duas seqüências que estão sendocomparadas, dividindo esse número pelo número de posições comparadas emultiplicando o resultado obtido por 100, de modo a obter a identidade per-centual entre essas duas seqüências.
Ácidos nucleícos que codificam um antígeno associado ao tumorpodem, de acordo com a invenção, estar presentes sozinhos ou em combi-nação com outros ácidos nucleícos, em particular ácidos nucleícos heterólo-gos. Em modalidades preferidas, um ácido nucleíco é funcionalmente ligadoàs seqüências de controle de expressão ou seqüências regulatórias as quaispodem ser homólogas ou heterólogas com relação ao referido ácido nucleí-co. Uma seqüência de codificação e uma seqüência regulatória são "funcio-nalmente" ligadas uma ã outra, se elas são covalentemente ligadas uma àoutra de uma forma tal que expressão ou transcrição da referida seqüênciade codificação está sob o controle ou sob a influência da referida seqüênciaregulatória. Se a seqüência de codificação tem de ser traduzida em uma pro-teína funcional, então, com uma seqüência regulatória funcionalmente ligadaà referida seqüência de codificação, indução da referida seqüência regulató-ria resulta em transcrição da referida seqüência de codificação, sem causarum desvio de rede na seqüência de codificação ou a referida seqüência decodificação não sendo capaz de ser traduzida na proteína ou peptídeo dese-jado.
O termo "seqüência de controle de expressão" ou "seqüênciaregulatória" compreende, de acordo com a invenção, promotores, intensifi-cadores e outros elementos de controle os quais regulam a expressão de umgene. Em modalidades particulares da invenção, as seqüências de controlede expressão podem ser reguladas. A estrutura exata de seqüências regula-tórias pode variar como uma função da espécie ou tipo de célula, mas, emgeral, .compreende seqüências não traduzidas 5' e não transcritas 5' as quaisestão envolvidas em início de transcrição e tradução, respectivamente, talcomo caixa TATA, seqüência de revestimento, seqüência CAAT e semelhan-tes. Mais especificamente, seqüências regulatórias não transcritas 5' com-preendem uma região promotora a qual incluem uma seqüência promotorapara controle transcricional do gene funcionalmente ligado. Seqüências re-gulatórias também compreender seqüências intensificadoras ou seqüênciasativadoras a montante.
De acordo com a invenção, um ácido nucleíco pode, além disso,estar presente em combinação com outro ácido nucleíco o qual codifica umpeptídeo que controla a secreção da proteína ou peptídeo codificado peloreferido ácido nucleíco a partir de uma célula hospedeira. De acordo com ainvenção, um ácido nucleíco pode também estar presente em combinaçãocom outro ácido nucleíco o qual codifica um peptídeo, fazendo com que aproteína ou peptídeo codificado seja ancorado sobre a membrana celular dacélula hospedeira ou compartimentalizado em organelas particulares da refe-rida célula. Similarmente, uma combinação com um ácido nucleíco é possí-vel, a qual representa um gene repórter ou qualquer "tag".
Em uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucleícorecombinante é, de acordo com a invenção, um vetor, onde apropriado, comum promotor, o qual controla a expressão de um ácido nucleíco, por exem-plo, um ácido nucleíco que codifica um antígeno associado ao tumor identifi-cado de acordo com a invenção. O termo "vetor" é usado aqui em seu signi-ficado mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um áci-do nucleíco o-que-permite- que o-referido ácido nucleíco por exemplo, sejaintroduzido em células procariotas e/ou eucariotas e, onde apropriado, sejaintegrado em um genoma. Vetores desse tipo são, de preferência, replicadose/ou expressos nas células. Um veículo intermediário pode ser adaptado,por exemplo, ao uso em eletroporação, em bombardeamento com micropro-jéteis em administração lipossômica, na transferência com o auxílio de agro-bactérias ou em inserção via vírus de RNA ou DNA. Vetores compreendemplasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos ou genomas virais.
Os ácidos nucleícos que codificam um antígeno associado aotumor identificado de acordo com a invenção podem ser usados para trans-fecção de células hospedeiras. Ácidos nucleícos aqui, significa DNA e RNArecombinante. RNA recombinante pode ser preparado através de transcriçãoin vitro de um templato de DNA. Além disso, ele pode ser modificado atravésde seqüências de estabilização, revestimento e poliadenilação antes de apli-cação.
De acordo com a invenção, o termo "célula hospedeira" refere-se à qualquer célula a qual pode ser transformada ou transfectada com umácido nucleíco exógeno. O termo "células hospedeiras" compreende, de a-cordo com a invenção, células procariotas (por exemplo, E. coli) ou eucario-tas (por exemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS,célula K562, células de Ievedo e células de inseto). Preferência particular édada às células de mamífero tais como células de seres humanos, camun-dongos, hamsters, porcos, cabras, primatas. As células podem ser derivadasde uma multiplicidade de tipos de tecido e compreendem células primárias elinhagens de células. Exemplos específicos compreendem queratinócitos,leucócitos de sangue periférico, células tronco da medula óssea e célulastronco embriônicas. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célu-la apresentando antígeno, em particular, uma célula dendrítica, monócito ouum macrófago. Um ácido nucleíco pode estar presente na célula hospedeirana forma de uma única cópia ou de duas ou mais cópias ou de duas ou maiscópias e, em uma modalidade é expresso na célula hospedeira.
De acordo com a invenção, o termo "expressão" é usado em seusignificado mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e prote-ína. Ele também compreende expressão parcial de ácidos nucleícos. Alémdisso, expressão pode ser4 realizada transitoriamente ou estavelmente. Sis-temas de expressão preferidos em células de mamíferos compreendempcDNA3.1 e pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), os quais contém um mar-cador selecionável, tal como um gene que confere resistência a G418 (e,assim, permite que linhagens de célula estavelmente transfectadas sejamselecionadas) e seqüências de intensificador - promotor do citomegalovírus(CMV).
Naqueles casos da invenção nos quais uma molécula do MHCapresenta um antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, umvetor de expressão também pode compreender uma seqüência de ácido nu-cleíco que codifica a referida molécula do MHC. A seqüência de ácido nucle-íco que codifica a molécula do MHC pode estar presente sobre o mesmovetor de expressão que o ácido nucleíco que codifica o antígeno associadoao tumor ou parte do mesmo ou ambos os ácidos nucleícos podem estarpresentes sobre diferentes vetores de expressão. No último caso, os doisvetores de expressão podem ser co-transfectados em uma célula. Se umacélula hospedeira não expressa o antígeno associado ao tumor ou a partedo mesmo ou a molécula de MHC, ambos os ácidos nucleícos que codificama mesma podem ser transfectados na célula sobre o mesmo vetor de ex-pressão ou sobre vetores de expressão diferentes. Se a célula já expressa amolécula do MHC, apenas a seqüência de ácido nucleíco que codifica o an-tígeno associado ao tumor ou parte do mesmo pode ser transfectada na célula.
A invenção também compreende kits para amplificação de umácido nucleíco que codifica um antígeno associado ao tumor. Tais kits com-preendem por exemplo, um par de iniciadores de amplificação o qual se hi-bridiza ao ácido nucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor. Osiniciadores, de preferência, compreendem uma seqüência de 6-50, em parti-cular 10-30, 15-30 e 20-30 nucleotídeos contínuos do ácido nucleíco e sãode não - sobreposição, de forma a evitar a formação de dímeros de iniciado-res. Um dos iniciadores-se hibridizará a uma fita do ácido nucleíco que codi-fica o antígeno associado ao tumor e o outro iniciador se hibridizará à fitacomplementar em uma disposição a qual permite em amplificação do ácidonucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor.
"Moléculas anti-sentido" ou "ácidos nucleícos anti-sentido" po-dem ser usados para regulação, em particular, redução da expressão de umácido nucleíco. O termo "moléculas anti-sentido" ou "ácido nucleíco anti-sentido" refere-se, de acordo com a invenção a um oligonucleotídeo o qual éum oligorribonucleotídeo, oligodeoxirribonucleotideo, oligoribonucleotídeomodificado ou oligodeoxirribonucleotideo modificado e o qual se hibridizasob condições fisiológicas ao DNA compreendendo um gene particular ou aomRNA do referido gene, desse modo inibindo a transcrição do referido genee/ou a tradução do referido mRNA. De acordo com a invenção, uma "molé-cula anti-sentido" também compreende uma estrutura a qual contém um áci-do nucleíco ou uma parte do mesmo na orientação inversa com relação aseu promotor natural. Um transcrito anti-sentido de um ácido nucleíco ou deuma parte do mesmo pode formar uma dupla com o mRNA que ocorre natu-ralmente especificando a enzima e, assim, impedir acúmulo de ou traduçãodo mRNA na enzima ativa. Outra possibilidade é o uso de ribozimas parainativação de um ácido nucleíco. Oligonucleotídeos anti-sentido preferidosde acordo com a invenção têm uma seqüência de 6-50, em particular 10-30,15-30 e 20-30 nucleotídeos contínuos do ácido nucleíco alvo e, de preferên-cia, são totalmente complementares ao ácido nucleíco alvo ou a uma partedo mesmo.
Em modalidades preferidas, o oligonucleotídeo anti-sentido sehibridiza com um sítio N-terminal ou 5' a montante, tal como um sítio detranscrição, um sítio de início de tradução ou um sítio promotor. Em outrasmodalidades, o oligonucleotídeo anti-sentido se hibridiza com uma regiãonão traduzida 3' ou um sítio de união de mRNA.
Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção consisteem ribonucleotídeos, deoxirribonucleotídeos ou uma combinação dos mes-mos, com a extremidade 5' de um nucleotídeo e a extremidade 3' de outroflucleotídeo sendo ligadas uma-a outra através de uma ligação de fosfodiés-ter, Esses oligonucleotídeos podem ser sintetizados de uma maneira con-vencional ou produzidos recombinantemente.
Em modalidades preferidas, um oligonucleotídeo da invenção éum oligonucleotídeo "modificado". Aqui, o oligonucleotídeo pode ser modifi-cado de formas muito diferentes, sem prejudicar sua capacidade de se ligarao seu alvo, de forma a aumentar por exemplo, sua estabilidade ou eficáciaterapêutica. De acordo com a invenção, o termo "oligonucleotídeo modifica-do" significa um oligonucleotídeo no qual (i) pelo menos dois de seus nucleo-tídeos são ligados um ao outro através de uma ligação internucleosídeo sin-tética (isto é, uma ligação inter-nucleosídeo a qual não uma ligação de fos-fodiéster) e/ou (ii) um grupo químico o qual usualmente não é encontrado emácidos nucleícos é covalentemente ligado a oligonucleotídeo. Ligações inter-nucleosídeo sintéticas preferidas são fosforotioatos, alquil fosfonatos, fosfo-roditioatos, ésteres de fosfato, alquil fosfonotioatos, fosforamidatos, carba-matos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, carboximetil ésterese peptídeos.
O termo "oligonucleotídeo modificado" também compreende oli-gonucleotídeos tendo uma base e/ou açúcar covalentemente modificado "o-ligonucleotídeos modificados" compreendem, por exemplo, oligonucleotí- deos com resíduos de açúcar os quais são covalentemente ligados a outrosgrupos orgânicos de baixo peso molecular que não um grupo hidroxila naposição 3' e um grupo fosfato na posição 5'. Oligonucleotídeos modificadospodem compreender, por exemplo, um resíduo de ribose 2'-0-alquilado ououtro açúcar ao invés de ribose, tal como arabinose.
Deve ser também compreendido que todas as modalidades des-critas acima com relação ao oligonucleotídeos também podem se aplicar apolinucleotídeos.
Por "pequeno RNA de interferência" ou "siRNA", conforme usadoaqui, entende-se uma molécula de RNA isolada, de preferência maior do que10 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente maior do que 15 nu-cleotídeos de comprimento e, ainda, mais preferivelmente 18,19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30-nucleotídeos de comprimento que é usadapara identificar um gene alvo ou mRNA a ser degradado. Uma faixa de 19-25 nucleotídeos é o tamanho mais preferido para siRNAs.
siRNA de acordo com a invenção pode compreender RNA parci-almente purificado, RNA substancialmente puro, RNA sintético ou RNA re-combinantemente produzido, bem como RNA alterado que difere do RNAque ocorre naturalmente através de adição, deleção, substituição e/ou alte-ração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir adição dematerial de não-nucleotídeo, tal como à(s) extremidade(s) do siRNA ou a umou mais nucleotídeos internos do siRNA; modificações que tornam o siRNAresistente à digestão por nuclease (por exemplo, o uso de ribonucleotídeos2'-substituídos ou modificações na parte principal de âçúcar-fosfato); ou asubstituição de um ou mais nucleotídeos no siRNA por deoxirribonucleotí-deos. Além disso, o siRNA pode ser modificado para aumentar a estabilida-de do mesmo conforme descrito acima para oligonucleotídeos modificados,em particular através de introdução de um ou mais ligações de fosforotioato.
Uma ou ambas as fitas do siRNA também pode compreenderuma saliência 3'. Conforme usado aqui, uma "saliência 3" refere-se a pelomenos um nucleotídeo não emparelhado se estendendo da extremidade 3'de uma fita dè RNA. Assim, em uma modalidade, o siRNA compreende pelomenos uma saliência 3' de 1 a cerca de 6 nucleotídeos (os quais incluemribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos) de comprimento, de preferência de 1a cerca de 5 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente de 1 a cer-ca de 4 nucleotídeos de comprimento e, particularmente, de preferência, decerca de 2 a cerca de 4 nucleotídeos de comprimento. Em uma modalidadena qual ambas as fitas da molécula de siRNA compreendem uma saliência3', o comprimento das saliências pode ser o mesmo ou diferente para cadafita. Em uma modalidade mais preferida, a saliência 3' está presente sobreambas as fitas do siRNA e tem 2 nucleotídeos de comprimento. Por exem-plo, cada fita do siRNA da invenção pode compreender saliências 3' de áci-do dideoxitimidílico ("TT") ou ácido diuridílico ("uu").
De forma a intensificar a estabilidade do siRNA, as saliências 3'também podem ser estabilizadas contra degradação. Em uma modalidade,as saliências são estabilizadas através de inclusão de nucleotídeos de puri-na, tais como nucleotídeos de adenosina ou guanosina. Alternativamente,substituição de nucleotídeos de pirimidina por análogos modificados, porexemplo, substituição de nucleotídeo de uridina nas saliências 3' por 2'-deoxitimidina, é tolerada e não afeta a eficiência de degradação de RNAi.Em particular, a ausência de uma 2'-hidroxila na 2'-deoxitimidina intensificasignificativamente a resistência à nuclease da saliência 3' em meio de cultu-ra tecidual.
As fitas sentido e anti-sentido do siRNA podem compreenderduas moléculas de RNA fita simples complementares ou podem compreen-der uma única molécula na qual duas porções complementares são empare-lhadas por base e são covalentemente ligadas através de uma área de "ha-irpina" fita simples, isto é, a região sentido e a região anti-sentido podem sercovalentemente conectadas via uma molécula ligante. A molécula Iigantepode ser um polinucleotídeo ou um ligante de não-nucleotídeo. Sem desejarestar preso a qualquer teoria, acredita-se que a área de hairpina do últimotipo de molécula de siRNA é clivada intracelularmente por uma proteína "Di-cer" (ou seus equivalentes) para formar um siRNA de duas moléculas deRNA base-emparelhãdas individuais.
Conforme usado aqui, "mRNA alvo" refere-se a uma molécula deRNA que é um alvo para sub-regulação. siRNA pode ser expresso a partir devetores de expressão pol Ill sem uma alteração no sítio de objetivação, umavez que acredita-se que a expressão de RNAs a partir de promotores pol Illé eficiente apenas quando o primeiro nucleotídeo transcrito é uma purina.
siRNA de acordo com a invenção pode ser objetivado a qualquertrecho de aproximadamente 19-25 nucleotídeos contínuos em que qualqueruma das seqüências de mRNA alvo (a "seqüência-alvo"). Técnicas para se-leção de seqüências alvo para siRNA são fornecidas, por exemplo, em Tus-chl T. e outros, "The siRNA User Guide", revisada 11 de outubro de 2002, adescrição completa da qual é aqui incorporada por referência. O "The siRNAUser Guide" está disponível na world wide web no website mantido pelo Dr.Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller Univer-sity, New York, EUA e pode ser encontrado acessando o website da Rocke-feller University e buscando pela palavra chave "siRNA". Assim, a fita senti-do do presente siRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo substan-cialmente idêntica a qualquer trecho continuo de cerca de 19 a cerca de 25nucleotídeos no RNA alvo.
Geralmente, uma seqüência-alvo sobre o mRNA alvo pode serselecionada de uma determinada seqüência de cDNA correspondendo aomRNA alvo, de preferência, começando 50 a 100 nt a jusante (isto é, na di-reção 3') a partir do códon inicial. A seqüência-alvo pode, contudo, estar lo-calizada nas regiões não traduzidas 5' ou 3' ou na região próxima ao códoninicial.
siRNA pode ser obtido usando uma série de métodos conheci-dos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, siRNA pode ser quimi-camente sintetizado ou recombinantemente produzido usando métodos co-nhecidos na técnica, tal como o sistema in vitro de Drosophila descrito nopedido publicado U.S. 2002/0086356 of Tuschl e outros, a divulgação com-pleta do qual é aqui incorporada por referência.
De preferência, siRNA é quimicamente sintetizado usando fosfo-ramiditas de ribonucleosídeo apropriadamente protegidas e um sintetizadorde DNA/RNA convencional. SiRNA pode ser sintetizado como duas molécu-las de RNA complementares distintas ou como uma única molécula de RNAcom duas regiões complementares.
Alternativamente, siRNA também pode ser expresso a partir deplasmídeos de DNA circulares ou lineares recombinantes usando qualquerpromotor adequado. Tais moléculas são incluídas de acordo com a presenteinvenção quando referência é feita aqui à administração de siRNA ou à in-corporação de siRNA em composições farmacêuticas. Promotores adequa-dos para expressão de siRNA da invenção de um plasmídeo incluem, porexemplo, as seqüências do promotor pol Ill de RNA U6 ou Hl e o promotordo citomegalovírus.
Seleção de outros promotores adequados está dentro da capa-cidade da técnica. Os plasmídeos recombinantes da invenção também po-dem compreender promotores reguláveis ou induzíveis para expressão dosiRNA em um tecido em particular ou em um ambiente intracelular em parti-cular.
O siRNA expresso a partir de plasmídeos recombinantes podeser isolado de sistemas de expressão de células cultivados através de técni-cas padrões ou pode ser expresso intracelularmente. O uso de plasmídeosrecombinantes para distribuir siRNA às células in vivo é discutido em maio-res detalhes abaixo. siRNA pode ser expresso a partir de um plasmídeo re-combinante quer como duas moléculas de RNA complementares distintas oucomo uma única molécula de RNA com duas regiões complementares.Seleção de plasmídeos adequados para expressão de siRNA,métodos para inserção de seqüências de ácido nucleíco para expressão dosiRNA no plasmídeo e métodos de distribuição do plasmídeo recombinanteàs células de interesse estão dentro da capacidade da técnica.
siRNA também pode ser expresso de vetores virais recombinan-tes intracelularmente in vivo. Os vetores virais recombinantes compreendemseqüências que codificam o siRNA e qualquer promotor adequado para ex-pressão das seqüências de siRNA. Os vetores virais recombinantes tambémpodem compreender promotores induzíveis ou reguláveis para expressão dosiRNA ou em um ambiente intracelular em particular. siRNA pode ser ex-presso a partir de um vetor viral recombinantes quer como duas moléculasde RNA complementares distintas ou como uma única molécula de RNAcom duas regiões complementares.
O termo "peptídeo" compreende oligo- e polipeptídeo e refere-seà substâncias compreendendo dois ou mais, de preferência 3 ou mais, depreferência 4 ou mais, de preferência 6ou mais, de preferência 8 ou mais, depreferência 10 ou mais, de preferência 13 ou mais, de preferência 16 oumais, de preferência 21 ou mais e até de preferência 8, 10, 20, 30, 40 ou 50,em particular 100 aminoácidos unidos covalentemente através de ligaçõespeptídicas. O termo "proteína" refere-se a grandes peptídeos, de preferênciaa peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos mas, em geral, ostermos "peptídeos" e "proteínas-são sinônimos e são usados permutavel-mente aqui.
De preferência, as proteínas e peptídeos descritos de acordocom a invenção foram isolados. Os termos "proteína isolada" ou "peptídeoisolado" significam que a proteína ou peptídeo foi separado de seu ambientenatural. Uma proteína ou peptídeo isolado pode estar em um estado essen-cialmente purificado. O termo "essencialmente purificado" significa que aproteína ou peptídeo é essencialmente isento de outra substâncias com asquais eles estão associados na natureza ou in vivo.
Tais proteínas e peptídeos podem ser usados, por exemplo, naprodução de anticorpos e em um ensaio imunológico ou diagnóstico ou co-mo produtos terapêuticos. Proteínas e peptídeos descritos de acordo com ainvenção podem ser isolados de amostras biológicas, tal como tecido ouhomogenatos de célula e também podem ser expressos recombinantementeem uma multiplicidade de sistemas de expressão pro- ou eucariotas.
Para fins da presente invenção, "derivados" de uma proteína oupeptídeo ou de uma seqüência de aminoácido compreende variantes cominserção de aminoácido, variantes com deleção de aminoácido e/ou varian-tes com substituição de aminoácido.
Variantes com inserção de aminoácido compreendem fusõesamino- e/ou carbóxi- terminais e também inserções de um único ou de doisou mais aminoácidos em uma seqüência de aminoácido em particular. Nocaso de variantes de seqüência de aminoácido tendo uma inserção, um oumais resíduos de aminoácido são inseridos em um local em particular emuma seqüência de aminoácido, embora a inserção aleatória com inserçãoapropriada do produto resultante também seja possível. Variantes com dele-ção de aminoácido são caracterizadas pela remoção de um ou mais amino-ácido da seqüência. Variantes com substituição de aminoácido são caracte-rizadas por pelo menos um resíduo na seqüência sendo removido e outroresíduo sendo inserido em seu lugar, De preferência é dada à modificaçõessendo imposições na seqüência de aminoácido as quais são não conserva-das entre proteínas ou peptídeos homólogos e/ou substituição de aminoáci-dos por outros tendo propriedades similares, tais corno hidrofobicidade, hi-drofilicidade, eletronegatividade, volume da cadeia lateral e semelhantes(substituição conservativa). Substituições conservativas, por exemplo, refe-re-sem à troca de um aminoácido por outro aminoácido listado abaixo nomesmo grupo que o aminoácido a ser substituído:
1. pequenos resíduos alifáticos, não polares ou ligeiramentepolares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
2. resíduos negativamente carregados e suas amidas: Asn,Asp, Glu, Gln
3. resíduos positivamente carregados: His, Arg, Lys
4. grandes resíduos alifáticos não polares: Met, Leu, lie, Vai,Cys
5. grandes resíduos aromáticos: Phe1Tyr, Trp
Levando-se em consideração sua parte particular na arquiteturada proteína, três resíduos são mostrados entre parênteses. Gly é o únicoresíduo sem uma cadeia lateral e, assim, confere flexibilidade à cadeia. Protem uma geometria incomum a qual restringe grandemente a cadeia. Cyspode formar uma ligação em ponte de dissulfeto.
As variantes de aminoácido descritas acima podem ser pronta-mente preparadas cõm o auxílio de técnicas de síntese de peptídeo conhe-cidas tais como, por exemplo, através de síntese fase sólida (Merrifield,1964) e métodos similares ou através de manipulação de DNA recombinan-te. A manipulação de seqüências de DNA para preparo de proteínas e peptí-deo tendo substituições, inserções ou deleções, é descrito em Sambrook eoutros (1989), por exemplo.
De acordo com a invenção, "derivados" de proteínas e peptídeostambém compreendem uma única ou múltiplas substituições, deleções e/ouadições de quaisquer moléculas associadas à proteína ou peptídeo, tais co-mo carboidratos, lipídeos e/ou proteínas ou peptídeos.
O termo "derivado" também se estende a todos os equivalentesquímicos funcionais das referidas proteínas e peptídeos.
De acordo com a invenção, uma parte ou fragmento de um antí-geno associado ao tumor tem, de preferência, uma propriedade funcional daproteína ou peptídeo do qual ele foi derivado. Tais propriedades funcionaiscompreendem a interação com anticorpos, a interação com outros peptídeosou proteínas, a ligação seletiva de ácidos nucleícos e uma atividade enzimá-tica. Uma propriedade particular é a capacidade de formar um complexo commoléculas do MHC e, onde apropriado gerar uma resposta imune, de prefe-rência, através de estimulação de células T auxiliares ou citotóxicas. Umaparte ou fragmento de um antígeno associado ao tumor da invenção com-preende, de preferência, uma seqüência de pelo menos 6, em particular pelomenos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20,pelo menos 30 ou pelo menos 50 aminoácidos consecutivos do antígenoassociado ao tumor. Uma parte ou fragmento de um antígeno associado aotumor da invenção compreende, de preferência, uma seqüência até 8, emparticular até 10, até 12, até 15, até 20, até 30 ou até 55 aminoácidos con-secutivos do antígeno associado ao tumor. Uma parte ou fragmento de umantígeno associado ao tumor é, de preferência, uma parte do antígeno asso-ciado ao tumor a qual corresponde à porção não- transmembrana em parti-cular a porção extracelular do antígeno ou é compreendida do mesmo.
Partes ou fragmentos preferidos de um antígeno associado aotumor de acordo com a invenção são, em particular adequados para estimu-lação de linfócitos T citotóxicos in vivo, mas também para produção de linfó-citos T expandidos e estimulados para a transferência adotiva terapêutica exvivo.
Uma parte ou um fragmento de um ácido nucleíco que codificaum antígeno associado ao tumor refere-se, de acordo com a invenção, àparte do ácido nucleíco a qual codifica pelo menos o antígeno associado aotumor e/ou uma parte e um fragmento do referido antígeno associado aotumor, conforme definido acima. Uma parte ou fragmento de um ácido nucle-íco que codifica um antígeno associado ao tumor é, de preferência, aquelaparte do ácido nucleíco correspondendo à rede de leitura aberta.
De acordo com a invenção, modalidades particulares considera-das envolvem fornecimento de proteínas ou peptídeos "dominantes negati-vos" derivados de antígenos associados ao tumor, uma proteína ou peptídeodominante negativo é uma variante de proteína ou peptídeo inativa a qual, omeio de interação com a maquinaria celular, impede a proteína ou peptídeoativo de sua interação com a maquinaria celular o qual compete com a prote-ína ou peptídeo ativo, desse modo, reduzindo o efeito da referida proteínaativa.
Anti-soros os quais contêm anticorpos específicos que se ligamà proteína alvo podem ser preparados através de vários processos padrão;veja, por exemplo, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" por PhilipShepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A LaboratoryManual" por Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 e "Using Antibodies:A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" por Edward Harlow, David La-ne, Ed Harlow ISBN 0879695447. Desse modo, também é possível geraranticorpos afins e específicos os quais reconhecem proteínas na membranacomplexa em sua forma nativa (Azorsa e outros, J. Immunol. Methods 229:35-48, 1999; Anderson e outros, J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gards-voll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Isto é, em particular, relevan-te para o preparo de anticorpos os quais têm de ser usados terapeuticamen-te, mas também para muitas aplicações diagnósticos. A esse respeito, épossível imunizar com a proteína inteira, com seqüências extracelulares par-ciais, bem como com células as quais expressam a molécula alvo na formafisiologicamente duplicada.
Anticorpos monoclonais são, tradicionalmente, preparados u-sando a tecnologia de hibridoma (para detalhes técnicos veja: "MonoclonalAntibodies: A Practical Approach" por Philip Shepherd, Christopher DeanISBN 0-19-963722-9; "Antibodies: A Laboratory Manual" por Ed Harlow, Da-vid Lane ISBN: 0879693142; "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Por-table Protocol NO" por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN:0879695447).
Sabe-se que somente uma pequena parte de uma molécula deanticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo a seu epítopo(cf. Clark, W. R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immuno-logy, Wiley & Sons, Inc., New Yorlq-Reittl-I. (1991), EssentiaNmmunoIogy, 7ãEdição, Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc1 e Fc são,por exemplo, efetuadores da cascata de complemento, mas não estão en-volvidas na ligação a antígeno. Um anticorpo do qual a região pFc' foi enzi-maticamente removida ou o qual tenha sido produzido sem a região pFc',referido como um fragmento F(ab')2, trás ambos os sítios de ligação a antí-geno de um anticorpo completo. Similarmente um anticorpo do qual a regiãoFc tenha sido enzimaticamente removida ou o qual foi produzido sem a refe-rida região Fc, referido como um fragmento Fab, trás um sítio de ligação aantígeno de uma molécula de anticorpo intacta. Além disso, fragmentos Fabconsistem de uma cadeia leve covalentemente ligada de um anticorpo e par-te da cadeia pesada do referido anticorpo, referida como Fd. Os fragmentosFd são os principais determinantes de especificidade do anticorpo (um únicofragmento Fd pode estar associado com até dez cadeias leves diferentes,sem alterar a especificidade do anticorpo) e fragmentos Fd1 quando isolados,retém a capacidade de se ligar a um epítopo.
Localizadas dentro da parte de ligação a antígeno de um anti-corpo, estão regiões de determinação de complementaridade (CDRs) asquais interagem diretamente com o epítopo do antígeno e regiões de estru-tura (FRs) as quais mantém a estrutura terciária do paratopo. Ambos osfragmentos Fd da cadeia pesada e da cadeia leve de imunoglobulinas deIgG contêm quatro regiões de estrutura (FR1 a FR4) as quais são separa-das, em cada caso, por três regiões de determinação de complementaridade(CDR1 a CDR3). As regiões de CDRs e, em particular, a CDR3 e, ainda,mais particularmente a região CDR3 da cadeia pesada, são responsáveis,até grande ponto, pela especificidade do anticorpo.
Regiões de não-CDR de um anticorpo de mamífero são conhe-cidas por serem capazes de ser substituídas por regiões similares de anti-corpos com a mesma ou com uma especificidade diferente, com a especifi-cidade pelo epítopo do anticorpo original sendo retida. Isso torna possível odesenvolvimento de anticorpos "humanizados" nos quais CDRs não huma-nas são covalentemente ligadas à FR humana e/ou regiões Fc/pFc' paraproduzir um anticorpo funcional.
Como outro exemplo, o WO 92/04381 descreve a produção euso de anticorpos ao RSV de murino humanizados nos quais pelo menosparte das regiões FR de murino foram substituídas por regiões FR de origemhumana. Anticorpos desse tipo, incluindo fragmentos de anticorpos intactoscom capacidade de ligação a antígeno, são freqüentemente referidos comoanticorpos "quiméricos".
De acordo com a invenção, o termo "anticorpo" também incluifragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd de anticorpos, anticorpos quiméricos, nosquais as regiões Fc e/ou FR e/ou CDRI e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeialeve foram substituídas por seqüências humanas ou não humanas homólo-gas, anticorpos de fragmento F(ab') 2 quiméricos os quais as regiões FRe/ou CDRI e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por se-qüências humanas ou não humanas homólogas, anticorpos de fragmentoFab quiméricos nas quais as regiões FR e/ou CDRI e/ou CDR2 e/ou CDR3de cadeia leve foram substituídas por seqüências humanas e não humanashomólogas e anticorpos de fragmento Fd quiméricos nos quais as regiõesFR e/ou CDRI e/ou CDR2 foram substituídas por seqüências humanas ounão humanas homólogas. O termo "anticorpo" também compreende anticor-pos com "cadeia simples".
A invenção também compreende proteínas e peptídeos os quaisse ligam especificamente a antígenos associados ao tumor. Substâncias deligação desse tipo podem ser proporcionadas, por exemplo, através de bibli-otecas de peptídeos degenerados as quais podem ser preparadas simples-mente em solução em uma forma imobilizada ou como bibliotecas de fago-display. Da mesma forma, é possível preparar bibliotecas combinatoriais depeptídeos com um ou mais aminoácidos. Bibliotecas de peptóides e resíduossintéticos não peptídicos também podem ser preparadas.
Anticorpos podem também ser acoplados à substâncias diag-nosticas específicas para visualização de células e tecidos expressando an-tígenos associados ao tumor. Eles também podem ser acoplados a substân-cias terapeuticamente úteis.
Substâncias diagnosticas incluem qualquer rótulo que-funcionapara: (i) proporcionar um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo rótu-lo para modificar o sinal detectável proporcionado pelo primeiro ou o segun-do rótulo, por exemplo, FRET (Transferência de Energia por Ressonância deFluorescência); (iii) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforéti-ca, através da carga hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicosou (iv) proporcionar uma porção de captura, por exemplo, formação de com-plexo por afinidade, anticorpo/antígeno ou iônico. Adequadas com rótulossão estruturas, tais como rótulos fluorescentes, rótulos luminescentes, rótu-los de cromóforo, rótulos radioisotópicos, rótulos isotópicos, de preferência,rótulos isotópicos estáveis, rótulos isobáricos, rótulos enzimáticos, rótulos departícula, em particular, rótulos de partículas de metal, rótulos de partículamagnéticas, rótulos de partícula poliméricas, pequenas moléculas orgânicas,tais como biotina, Iigantes de receptores ou moléculas de ligação, tais comoproteínas ou Iectinas de adesão celular, rótulo - seqüências compreendendoácidos nucleícos e/ou resíduos de aminoácido os quais podem ser detecta-dos através de uso de agentes de ligação, etc. Substâncias diagnosticascompreendem, de uma maneira não Iimitativa1 sulfato de bário, ácido icetâ-mico, ácido iopanóico, hipodato de cálcio, diatrixoato de sódio, diatrixoato demeglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e radio diagnósticos, incluindoemissores de positron, tais como flúor - 18 e carbono - 11, gama emissores,tais como iodo - 123, tecnécio - 99m, iodo -131 e índio- 111, nuclídeos pararessonância magnética nuclear, tais como flúor e gadolínio.
De acordo com a invenção, o termo "substância terapeuticamen-te útil" significa qualquer molécula a qual pode exercer um efeito terapêutico. De acordo com a invenção, uma substância terapeuticamente útil é, de pre-ferência, seletivamente orientada a uma célula a qual expressa um ou maisantígenos associados ao tumor e inclui agentes anticâncer, compostos rotu-lados com iodo radioativo, toxinas, fármacos citostáticos ou citolíticos, etc.Agentes anticâncer compreendem, por exemplo, aminoglutetimida, azatio-prina, sulfato de bleomicina, busulfan, carmüstina, clorambucil, cisplatina,ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbazina, dactinomicina, dau--norrubina, doxorubicina, taxol, etoposídeo, fluorouracil, interferon-α, Iomusti-na, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbazina HCI1 tioguanina,sulfato de vinblastina e sulfato de vincristina. Outros agentes anticâncer são descritos, por exemplo, em Goodman e Gilman, "The Pharmacological Basisof Therapeutics", 8â Edição, 1990, McGraw-HiII, Inc., em particular Capítulo52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi e Bruce A. Chabner). Toxinas po-dem ser proteínas tais como proteína antiviral de "pokeweed", toxina do có-lera, toxina pertussis, ricina, gelonina, abrina, exotoxina de difteria ou exoto-xina de Pseudomonas. Resíduos de toxina podem também ser radionuclí-deos que emitem alta energia, tal como cobalto - 60.
O termo "principal complexo de histocompatibilidade" ou "MHC"refere-se a um complexo de genes em todos os vertebrados. Proteínas oumoléculas do MHC estão envolvidas na sinalização entre linfócitos e célulasque apresentam antígeno em reações imunes normais por peptídeos de li-gação e apresentando os mesmos para reconhecimento por receptores decélulas T (TCR). Moléculas do MHC se ligam a peptídeos dentro de umcompartimento de processamento intracelular e apresentam esses peptídeossobre a superfície de células apresentando antígeno para reconhecimentopor células Τ. A região do MHC humana, também denominada HLA1 estálocalizada sobre o cromossoma 6 e inclui a região das classe I e classe II.Em uma modalidade preferida de todos os aspectos da invenção, uma molé-cula do MHC é uma molécula de HLA.
"Reduzir" ou "inibir", conforme usado aqui significa a capacidadede causar uma diminuição global, de preferência de 20% ou mais, mais pre-ferivelmente de 50% ou mais e, ainda mais preferivelmente, de 75% oumais, no nível, por exemplo, no nível de proteína ou mRNA quando compa-rado com uma mostra de referência (por exemplo, uma amostra não tratadacom siRNA). Essa redução ou inibição de expressão de RNA ou proteínapode ocorrer através de clivagem ou degradação do mRNA alvo. Ensaiospara expressão de proteína ou expressão de ácido nucleíco são conhecidosna técnica e incluem, por exemplo, ELISA, análise por Western blot para ex-pressão de proteína e northern blotting ou ensaios de proteção com RNasepara RNA.
O termo "paciente" significa, de acordo com a invenção, um serhumano, um primata não humano ou outro animal, em particular um mamífe-ro, tal como uma vaca, cavalo, porco, ovelha, cabra, cão, gato ou um roedor,tal como um camundongo ou um rato. Em uma modalidade particularmentepreferida, o paciente é um ser humano.
"Expressão anormal" significa, de acordo com a invenção, que aexpressão é alterada, de preferência aumentada, comparado com o estadoem um indivíduo saudável.
De acordo com a invenção, o termo "aumentada" ou "quantidadeaumentada" refere-se, de preferência, a um aumento de pelo menos 10%,em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Aquantidade de uma substância também é aumentada em uma mostra deteste, tal como uma amostra biológica, comparado com uma amostra de re-ferência, se ela é detectável na amostra de teste, mas está ausente ou não édetectável na amostra de referência.
De acordo com a invenção, o termo "doença" refere-se a qual-quer estado patológico no qual antígenos associados ao tumor são expres-sos ou anormalmente expressos. "Expressão anormal" significa, de acordocom a invenção, que a expressão é alterada, de preferência aumentada,comparado com o estado em um indivíduo saudável. Um aumento na ex-pressão refere-se a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelomenos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Em uma modalidade, oantígeno associado ao tumor é expresso apenas em tecido de um indivíduodoente, enquanto que expressão em um indivíduo saudável é reprimida. Umexemplo de tal doença é câncer, em que o termo "câncer", de acordo com ainvenção, compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, Iin-fomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer endometrial, câncer derim, câncer adrenal, câncer da tiróide, câncer de sangue, câncer de pele,câncer do cérebro, câncer cervical, câncer intestinal, câncer de fígado, cân-cer de colón, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de cabeça epescoço, câncer gastrointestinal, câncer do módulo linfático, câncer esôfago,câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer do ouvido, nariz e garganta(ENT), câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer depulmão e as metástases dos mesmos. Exemplos dos mesmos são carcino-mas de pulmão, carcinomas de próstata, carcinomas de colón, carcinomasde células renais, carcinomas cervicais ou metástases dos tipos de câncerou tumores descritos acima. O termo câncer, de acordo com a invenção,também compreende metástases cancerígenas.
Por "tumor" entende-se um grupo anormal de células ou tecidoque cresce através de proliferação celular rápida descontrolada e continua acrescer após o estímulo que iniciou o novo crescimento cessa. Tumoresmostram falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenaçãofuncional com o tecido normal e usualmente formam uma massa distinta detecido, a qual pode ser benigna ou maligna.
Por "metástase" entende-se a disseminação de células cancerí-genas de seu local original para outra parte do corpo. A formação de metás-tase é um processo muito complexo e depende de desprendimento de célu-las malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, penetraçãodas membranas de base endoteliais para entrar na cavidade corporal e va-sos e, então, após serem transportadas pelo sangue, infiltração de órgãosalvo. Finalmente, o crescimento de um novo tumor no local alvo depende de angiogênese. Metástase de tumor freqüentemente ocorre mesmo após aremoção do tumor primário porque as células ou componentes tumorígenospodem permanecer e desenvolver potencial metastático. Em uma modalida-de, o termo "metástase", de acordo com a invenção, refere-se à "metástase"distante, a qual refere-se à metástase que é remota do tumor primário e aosistema de nódulo linfático regional.
De acordo com a invenção, uma amostra biológica pode ser umaamostra de tecido, incluindo fluidos corporais e/ou uma amostra celular epode ser obtida da maneira convencional tal como através de biópsia tecidu-al, incluindo biópsia por pulsão e coletando sangue, aspirado brônquico, es-carro, urina, fezes, ou outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, otermo "amostra biológica" também inclui frações de amostras biológicas.
De acordo com a invenção, o termo "célula imunorreativa" signi-fica uma célula a qual pode maturar em uma célula imune (tal como umacélula B, célula T auxiliar ou célula T citolítica) com estimulação adequada.células imunorreativas compreendem células tronco hematopoiéticas CD34+,células T maduras e imaturas e células B maduras e imaturas. Se produçãode células T auxiliares ou citolíticas que reconhecem um antígeno associadoao tumor é desejada a célula imunorreativa é contatada com um célula ex-pressando um antígeno associado ao tumor sob condições as quais favore-cem a produção, diferenciação e/ou seleção de células T citolíticas ou célu-las T auxiliares. A diferenciação de precursores de células T em uma célulaT citolítica, quando exposta a um antígeno, é similar à seleção clonal do sis-tema imune.
Os termos "célula T" e "linfócito T" são usados permutavelmenteaqui e incluem células T auxiliares e células T citotóxicas as quais compre-endem células T citolíticas.
Alguns métodos terapêuticos são baseados em uma reação dosistema imune de um paciente, o que resulta em uma Iise de células apre-sentando antígeno, tais como células cancerígenas, as quais apresentamum ou mais antígenos associados ao tumor. A esse respeito, por exemplo,linfócitos T citotóxicos autólogos específicos para um complexo de um antí-geno associado ao tumor e uma molécula do MHC são administrados a umpaciente tendo uma anormalidade celular. A produção de tais linfócitos Tcitotóxicos in vitro é conhecida um exemplo de um método de diferenciaçãode células T pode ser encontrado no WO-A-9633265. Geralmente, uma a-mostra contendo células tais como células sangüíneas, é tomada do pacien-te e as células são contatadas com uma célula a qual apresenta o complexoe a qual pode causar propagação de linfócitos T citotóxicos (por exemplo,células dendríticas). A célula alvo pode ser uma célula transfectada, tal comouma célula COS. Essas células transfectadas apresentam o complexo dese-jado sob sua superfície e, quando contatadas com linfócitos T citotóxicos,estimulam a propagação dos últimos. Os linfócitos T citotóxicos autólogosclonalmente expandidos são, então, administrados ao paciente.
Em outro método de seleção de linfócitos T citotóxicos antígenosespecíficos, tetrâmeros fluorogênicos de complexos de peptídeo/moléculada classe I do MHC são usados para obtenção de clones específicos de Iin-fócitos T citotóxicos (Altman e outros, Science 274: 94-96, 1996; Dunbar eoutros, Curr. Biol. 8: 413-416, 1998).
A presente invenção também inclui métodos terapêuticos referi-dos como transferência adotiva (Greenberg, J. SmmunoL 136(5): 1917, 1986;Riddel e outros, Science 257: 238, 1992; Lynch e outros, Eur. J. Immunol.21: 1403- 1410, 1991; Kast e outros, Cell 59: 603-614, 1989), em que célulasapresentando o complexo desejado (por exemplo, células dendríticas) sãocombinadas com linfócitos T citotóxicos do paciente a ser tratado, resultandoem uma propagação de linfócitos T citotóxicos específicos. Os linfócitos Tcitotóxicos propagados são, então, administrados a um paciente tendo umaanomalia celular caracterizada por células anormais particulares que apre-sentam o complexo específico. Os linfócitos T citotóxicos, então, submetemas células anormais à lise, desse modo, obtendo um efeito terapêutico dese-jado.
Além disso, células apresentando o complexo desejado (por e-xemplo, células dendríticas) podem ser condenadas com linfócitos T citotóxi-cos específicos com alta afinidade. O receptor de células T de alta afinidadeespecíficos propagados pode ser clonado e opcionalmente humanizado atéuma extensão diferente e os receptores de célula T assim obtidos, então,transduzidos via transferência de gene, por exemplo, usando vetores retrovi-rais, em células T de pacientes. Transferência adotiva pode, então, ser reali-zada usando esses linfócitos T geneticamente alterados (Stanislawski e ou-tros, Nat Immunol. 2: 962- 70, 2001; Kessels e outros, Nat Immunol. 2: 957-61,2001).
Transferência adotiva não é a única forma de terapia a qual po-de ser aplicada de acordo com a invenção. Linfócitos T citotóxicos tambémpodem ser gerados in vivo de uma maneira conhecida per se. Um método usa células não proliferativas expressando o complexo. As células usadasaqui serão aquelas as quais usualmente expressam o complexo, tais comocélulas tumorígenas irradiadas ou células transfectadas com um -ou ambosos genes necessários para apresentação do complexo (isto é, o peptídeoantigênico e a molécula do MHC apresentando antígeno). Outra forma prefe-rida é a introdução do antígeno associado ao tumor na forma de RNA re-combinante o qual pode ser introduzido em células através de transferêncialipossômica ou através de eletroporação, por exemplo. As células resultan-tes apresentam o complexo de interesse e são reconhecidas por linfócitos Tcitotóxicos autólogos os quais, então, propagam.
Um efeito similar pode ser obtido através de combinação do an-tígeno associado ao tumor ou um fragmento do mesmo com um adjuvantede forma a tornar a incorporação em células que apresentam antígeno invivo possível. O antígeno associado ao tumor ou um fragmento do mesmopode ser representado com uma proteína, um DNA (por exemplo, dentro deum vetor) ou como RNA. O antígeno associado ao tumor é processado paraproduzir um parceiro peptídico para a molécula do MHC, enquanto que umfragmento do mesmo pode ser apresentado sem a necessidade de outroprocessamento. O último é o caso, em particular, se esse pode se ligar àmoléculas do MHC. Preferência é dada à formas de administração nas quaiso antígeno completo é processado in vivo por uma célula dendrítica, umavez que essa também pode produzir respostas de células T auxiliar as quaissão necessárias para uma resposta imune e eficaz (Ossendorp e outros,Immunol Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendorp e outros, J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998). Em geral, é possível administrar uma quantidade eficaz do antí-geno associado ao tumor a um paciente através de injeção intradérmica, porexemplo, contudo, injeção também pode ser realizada intranodalmente emum nódulo linfático (Maloy e outros, Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303, 2001).
Composições farmacêuticas e métodos de tratamento descritosde acordo com a invenção também podem ser usados para imunização ouvacinação para tratar ou prevenir terapeuticamente uma doença descritaaqui. De acordo com a invenção, os termos "imunização" ou "vacinação" re-fere-sem, de preferência, a um aumentcJ em ou ativação de uma respostaimune a um antígeno. É possível usar modelos-com animais para testagemde um efeito de imunização sobre câncer usando um antígeno associado aotumor ou um ácido nucleíco que codifica o mesmo. Por exemplo, células decâncer humano podem ser introduzidas em um camundongo para gerar umtumor e um ou mais ácidos nucleícos que codificam antígenos associadosao tumor podem ser administrados. O efeito sobre células cancerígenas (porexemplo, redução no tamanho do tumor) pode ser medido como uma medi-da de eficácia de uma imunização pelo ácido nucleíco.
Uma parte da composição para uma imunização ou uma vacina-ção, de preferência um ou mais antígenos associados ao tumor ou fragmen-tos de estimulação dos mesmos é administrada junto com um ou mais adju-vantes para indução de uma resposta imune ou para aumento de uma res-posta imune. Um adjuvante é uma substância a qual é incorporada no antí-geno ou administrada junto com o último e a qual intensifica a resposta imu-ne. Adjuvantes podem intensificar a resposta imune através de fornecimentode um reservatório de antígenos (extracelularmente ou em macrófagos), ati-vação de macrófagos e/ou estimulação de linfócitos em particular. Adjuvan-tes são conhecidos e compreendem, de uma forma não limitativa, monofos-foril lipídio A (MPL, SmithKIine Beecham), saponinas, tais como QS21 (Smi-thKline Beecham), DQS21 (SmithKIine Beecham; WO 96/33739), QS7,QS17, QS18 e QS-L1 (So e outros, Mol. Cells 7: 178-186, 1997), adjuvanteincompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, vitamina E, montani-da, alume, oligonucleotídeos CpG (cf. Kreig e outros, Nature 374: 546-9,1995) e várias emulsões água-em-óleo preparadas a partir de óleos biologi-camente degradáveis, tais como esqualeno e/ou tocoferol. De preferência,os peptídeos são administrados em uma mistura com DQS21/MPL. A pro-porção de DQS21 para MPL é, tipicamente, cerca de 1:10 a 10:1, de prefe-rência cerca de 1:5 a 5:1 e, em particular, cerca de 1:1. Para administração aseres humanos, uma formulação de vacina contém, tipicamente, DQS21 eMPL em uma faixa de cerca de 1 μg a cerca de 100 μg.
Outras substâncias as quais estimulam uma resposta imune dopaciente também podem ser administradas. É possível, pòr exemplo, usarcitocinas em uma vacinação, levando-se em-consideração suas proprieda-des regulatórias sobre linfócitos. Tais citocinas compreendem, por exemplo,interleucina-12 (IL-12), a qual foi mostrado aumentar as ações proliferativasde vacinas(cf. Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.
Existe uma série de compostos os quais intensificam uma res-posta imune e os quais, portanto, podem ser usados em uma vacinação. Osreferidos compostos compreendem moléculas de co-estimulação proporcio-nadas na forma de proteínas ou ácidos nucleícos, tais como B7-1 e B7-2(CD80 e CD86, respectivamente).
A invenção também proporciona a administração de ácidos nu-cleícos, proteínas ou peptídeos. Proteínas e peptídeos podem ser adminis-trados de uma maneira conhecida per se. Em uma modalidade, ácidos nu-cleícos sâo administrados através de métodos ex vivo, por exemplo, atravésde remoção de células de um paciente, modificação genética das referidascélulas de forma a incorporar um antígeno associado ao tumor e reintro-dução das células alteradas no paciente. Isso, em geral, compreende intro-dução de uma cópia funcional de um gene nas células de um paciente invitro e reintrodução das células geneticamente alteradas no paciente. A có-pia funcional do gene está sob o controle funcional de elementos regulató-rios os quais permitem que o gene seja expresso nas células geneticamentealteradas. Métodos de transfecção e transdução são conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. A invenção também proporciona a administração deácidos nucleícos in vivo usando vetores, tais como vírus e Iipossomas alvo-controlados. Se, de acordo com a invenção, referência é feita à administra-ção ou incorporação em composições farmacêuticas de ácidos nucleícos,isso inclui modalidades em que o ácido nucleíco está presente em tais veto-res.
Em uma modalidade preferida, um vírus ou vetor viral para ad-ministração de um ácido nucleíco que codifica um antígeno associado aotumor é selecionado do grupo consistindo em adenovírus, vírus adenoasso-ciados, pox vírus, incluindo vírus da varíola e pox vírus atenuados, vírusSemliki Forest, retrovírus, vírus Sindbis e partículas semelhantes a vírus Ty. 'Preferência-particularé dada-aadenovíruseretrovírus.-Os retrovírus são,tipicamente, replicação-deficientes (isto é, eles são incapazes de gerar partí-culas infecciosas).
Métodos de introdução de ácidos nucleícos em células in vitro ouin vivo compreendem transfecção de precipitados de fosfato de cálcio deácido nucleíco, transfecção de ácidos nucleícos associados com DEAE,transfecção ou infecção com os vírus acima trazendo os ácidos nucleícos deinteresse, transfecção lipossoma-mediada e semelhantes. Em modalidadesparticulares, preferência é dada a direcionamento do ácido nucleíco à célu-las em particular. Em tais modalidades, um veículo usado para administra-ção de um ácido nucleíco a uma célula (por exemplo, um retrovírus ou umlipossoma) pode ter uma molécula de controle alvo ligada. Por exemplo, umamolécula tal como um anticorpo específico para uma proteína na membranade superfície sobre a célula alvo ou um Iigante para um receptor sobre a cé-lula alvo pode ser incorporado em ou preso ao veículo de ácido nucleíco.
Anticorpos preferidos compreendem anticorpos os quais se ligam seletiva-mente a um antígeno associado ao tumor. Se administração de um ácidonucleíco via Iipossomas é desejada, proteínas de ligação a uma proteína namembrana de superfície associada à endocitose podem ser incorporadas naformulação de lipossoma de modo a tornas controle e/ou captação de alvo possível. Tais proteínas compreendem proteínas de capsídeo ou fragmentosdas mesmas os quais são específicos para um tipo de célula em particular,anticorpos às proteínas as quais são internalizadas, proteínas dirigidas a umsítio intracelular e semelhantes.
As composições terapêuticas da invenção podem ser adminis-tradas em preparados farmaceuticamente compatíveis. Tais preparados u-sualmente podem conter concentrações farmaceuticamente compatíveis desais, substâncias tampão, conservantes, veículos, substâncias para intensifi-cação de imunidade de suplementação, tais como adjuvantes, por exemplo,oligonucleotídeos CpG, citocinas, quimiocinas, saponina, GM-CSF e/ou RNA e, onde apropriado, outros compostos terapeuticamente ativos.
Os compostos terapeuticamente ativos da invenção podem ser- administrados -através de-qualquer-via-convencional, incluindo através deinjeção ou infusão. A administração pode ser realizada, por exemplo, oral-mente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcu- taneamente ou transdermicamente. De preferência, anticorpos são terapeu-ticamente administrados por meio de um aerossol pulmonar. Ácidos nucleí-cos anti-sentido são, de preferência, administrados através de administraçãointravenosa lenta.
As composições da invenção são administradas em quantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" refere-se à quantidade a qual obtém umareação desejada ou um efeito desejado sozinha ou junto com outras doses.No caso de tratamento de uma doença em particular ou de uma condiçãoem particular caracterizada pela expressão de um ou mais antígenos asso-ciados ao tumor, a reação desejada refere-se, de preferência, à inibição docurso da doença. Isso compreende diminuição do progresso da doença e,em particular, interrupção ou reversão do progresso da doença. A reaçãodesejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição tambémpode ser retardo do início ou uma prevenção do início da referida doença ouda referida condição. De acordo com a invenção, um diagnóstico ou trata-mento de câncer também pode incluir o diagnóstico ou tratamento de metás-tases de câncer as quais já se formaram ou se formarão. De acordo com ainvenção, o termo "tratamento" compreende tratamento terapêutico e profilá-tico, isto é, prevenção.
Uma quantidade eficaz de uma composição da invenção depen-derá da condição a ser tratada, da gravidade da doença, dos parâmetrosindividuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e pe-so, da duração de tratamento, do tipo de uma terapia associada (se presen-te), da via específica de administração e fatores similares.
As composições farmacêuticas da invenção são, de preferência,estéreis e contêm uma quantidade eficaz da substância terapeuticamenteativa para gerar a reação desejada ou o efeito desejado.
As doses administradas das composições da invenção podemdepender de vários parâmetros; tais como o tipo de administração, a condi-ção-do paciente, o período desejado de administração, etc. No caso em queuma reação em um paciente é insuficiente com uma dose inicial, doses mai-ores (ou doses efetivamente maiores obtidas através de uma via diferentemais localizada de administração) podem ser usadas.
Geralmente, doses do antígeno associado ao tumor de 1 ng a 1mg, de preferência de 10 ng a 100 μg, são formuladas e administradas paraum tratamento ou para a geração ou aumento de uma resposta imune. Se aadministração de ácidos nucleícòs (DNA e RNA) que codificam os antígenosassociados ao tumor é desejada, doses de 1 ng a 0,1 mg são formuladas eadministradas.
As composições farmacêuticas da invenção são, em geral, ad-ministradas em quantidades farmaceuticamente compatíveis e em composi-ções farmaceuticamente compatíveis. O termo "farmaceuticamente compatí-vel" refere-se a um material não tóxico o qual não interage com a ação docomponente ativo da composição farmacêutica. Preparados desse tipo usu-almente podem conter sais, substâncias tampão, conservantes, veículos e,onde apropriado, outros compostos terapeuticamente ativos. Quando usadosem medicina, os sais deverão ser farmaceuticamente compatíveis. Contudo,sais os quais não são farmaceuticamente compatíveis podem ser usadospara preparo de sais farmaceuticamente compatíveis e estão incluídos nainvenção. Sais farmacológica e farmaceuticamente compatíveis desse tipocompreendem, de uma forma não limitativa, aqueles preparados a partir dosseguintes ácidos: ácido clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, ma-léico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico e semelhantes.Sais farmaceuticamente compatíveis também podem ser preparados comosais de metal alcalino ou sais de metal alcalino-terroso, tais como sais desódio, sais de potássio ou sais de cálcio.
Uma composição farmacêutica da invenção pode compreenderum veículo farmaceuticamente compatível. De acordo com a invenção, otermo "veículo farmaceuticamente compatível" refere-se a um ou mais en-chimentos, diluentes ou substâncias de encapsulação sólidas ou líquidas, asquais são adequadas para administração a seres humanos. O termo "veícu-Io" refere-se a-um eomponente orgânico ou inorgânico de uma natureza na-tural ou sintética no qual o componente ativo é combinado de modo a facili-tar a aplicação. Os componentes da composição farmacêutica da invençãosão, usualmente, de modo que nenhuma interação ocorre, a qual prejudicasubstancialmente a eficácia farmacêutica desejada.
As composições farmacêuticas da invenção podem conter subs-tâncias tampão adequadas, tais como ácido acético em um sal, ácido cítricoem um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal.As composições farmacêuticas podem, ónde apropriado, tam-bém conter conservantes adequados, tais como cloreto de benzalcônio, clo-robutanol, parabeno e timerosal.As composições farmacêuticas são, usualmente, proporcionadasem uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas de uma manei-ra conhecida per se. Composições farmacêuticas da invenção podem estarna forma de cápsulas, comprimidos, losangos, soluções, suspensões, xaro- pes, elixires ou na forma de uma emulsão, por exemplo.
Composições adequadas para administração parenteral usual-mente compreendem um preparado aquoso ou não aquoso estéril do com-posto ativo o qual é, de preferência, isotônico ao sangue do recipiente. E-xemplos de veículos e solventes compatíveis são solução de Ringer e solu-ção de cloreto de sódio isotônica. Além disso, usualmente, óleos fixos esté-reis são usados como meio de solução ou suspensão.
A presente invenção é descrita em detalhes pelas figuras e e-xemplos abaixo, os quais são usados apenas para fins de ilustração e nãose destinam a ser limitativos. Levando-se em conta a descrição e os exem-pios, outras modalidades as quais provavelmente são incluídas na invençãosão acessíveis para aqueles habilitados na técnica.Figuras:
Figura 1. Expressão de mRNA de ISC-468
A. Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-468-
específicos não mostrou expressão significativa dentro de
todos os tecidos normais testados, exceto placenta.............B. Expressão de mRNA de ISC-468 em carcinomas de cabe-ça e pescoço, fígado, rim e cólon.
C. Expressão de mRNA de ISC-468 em carcinomas de mama,ovariano e dè estômago.
Figura 2. Análise por PCR Quantitativa de expressão demRNA de ISC-468 em tecidos de controle normais e cânceres de mama
Investigação por PCR em tempo real com iniciadores ISC-468-específicos mostrou expressão seletiva de mRNA em testículo, placenta, estômago e PBMC normais e em todas as biópsias de carcinoma da mama.
Figura 3. Expressão de ISC-507 específica em testículo nor-mal e carcinoma de próstataAnálise por RT-PCR com inicíadores gene de ISC-507-específi-cos mostra amplificação de cDNA exclusivamente em testículo normal (A) eem biópsias de carcinoma de próstata (B).
Figura 4. Expressão quantitativa de ISC-507
RT-PCR quantitativa com iniciadores ISC-507-específicos mos-trou expressão seletiva em amostras de testículo, nódulo linfático e próstatae amostras de câncer de próstata.
Figura 5. Expressão de ISC-466 em testículo normal e váriasamostras de tumor
Análise por RT-PCR com iniciadores ISC-466-específicos nãomostrou expressão dentro de tecidos normais, exceto placenta (A), mas ex-pressão em biópsias de carcinoma de cabeça e pescoço e em biópsias decarcinoma de rim (B). Expressão distinta também foi detectada em linhagensde células de carcinoma de mama e pulmão, bem como em linhagens decélulas de carcinoma ovariano (C e D).
Figura 6. Expressão de mRNA de ISC-518
Análise por RT-PCR com iniciadores ISC-518-específicos nãomostrou expressão dentro de tecidos normais, exceto testículo.
Figura 7. Expressão quantitativa de ISC-518
RT-PCR quantitativa mostrou expressão alta e seletiva em testí-culo normal e em um reservatório de carcinoma de fígado.
Figura 8. Expressão-de ISC-477 em tecidos normais e tumo-rígenos
Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-477-específicosmostrou expressão seletiva em tecido normal de placenta e ovário (A) e altapressão em carcinomas de estômago investigados (B), carcinomas de ma-ma, cólon e pulmão (C), bem como em amostras de carcinoma de pâncrease ovariano (D).
Figura 9. Expressão de mRNA de ISC-489
Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-489-específicosmostraram expressão seletiva em tecido placentário de controle e, adicio-nalmente, vários níveis de expressão em amostras de carcinoma de pulmão(A, C), carcinomas de estômago (Β, C), tumores de cabeça e pescoço (C) eamostras de carcinoma de fígado (C).
Figura 10. Expressão de ISC-461 em testículo normal e vá-rias amostras de tumor
Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-461-específicosmostraram expressão seletiva em tecido placentário de controle e, adicio-nalmente, vários níveis de expressão em carcinomas de mama e melano-mas (B)1 bem como em carcinoma de mama, carcinoma de pulmão e linha-gens de células de melanoma (C) e linhagens de células de carcinoma ovariano(P).
Figura 11. Expressão de mRNA de ISC-465 em placenta eamostras derivadas de câncer
Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-465-específicosmostraram expressão seletiva em placenta (A) e em algumas linhagens decélula derivadas de câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão ou cân-cer de estômago (B).
Figura 12, Expressão quantitativa de Mem-030
A. RT-PCR quantitativa com iniciadores Mem-030-específicosmostrou uma superexpressão significativa em todas asamostras de carcinoma de cabeça e pescoço investigadas.
Os seguintes tecidos normais foram analisados: bexiga, cé-rebro, medula óssea, cérvix^ cólon, duodeno, coração,pulmão, nódulo linfático, mama, músculo, ovário, PBMC,PBMC ativada, placenta, próstata, retina, baço, estômago,testículo, timo e tonsila.
B. Prevalência de Mem-030 em carcinomas esofageal, defígado, útero e tecidos derivados de melanoma.
Figura 13. Expressão quantitativa de Mem-055
RT-PCR quantitativa com iniciadores Mem-055-específicos mos-tra expressão alta e seletiva em tecidos de controle normais e uma superex-pressão significativa em tecidos derivados de câncer de estômago e pulmão(A). Mem-055 também é superexpressa em amostras de carcinomas de fí-gado, carcinomas ovarianos e câncer de mama (B).
Figura 14. Expressão de mRNA de Mem-062Análise por RT-PCR com iniciadores Mem-064-específicos mos-trou expressão seletiva em testículo e fraca expressão em tecidos derivadosde câncer de pulmão (A). Níveis de expressão fortes, significativos de trans-critos de Mem-064 foram detectáveis em vários tumores ovarianos (B).
Figura 15. Expressão Mem-068-específica em testículo nor-mal e carcinomas de células renais
Análise por RT-PCR com iniciadores Mem-068 gene-específicosmostra amplificação de cDNA em testículo normal, fraca em placenta (A), emcarcinomas de célula renal e em cânceres de estomago (B).
Figura 16. Expressão de Mem-071 em testículo normal e vá-rias amostras de tumor
Análise por RT-PCR com iniciadores Mem-071-específicos nãomostrou expressão dentro de tecidos normais, exceto testículo (A). Expres-são distinta foi também detectada em amostras de carcinoma de células re-nais e em cânceres de estômago (B).
Figura 17. Expressão de mRNA de Mem-072
Análise por RT-PCR com iniciadores Mem-072-específicos nãomostrou expressão dentro de tecidos normais (A) e expressão significativaem várias amostras de câncer de pulmão (A+B).
Figura 18. Expressão de Mem-106 em tecidos normais e tu-morígenos
Investigações por RT-PCR com iniciadores Mem-106 específicosnão mostraram expressão dentro de tecidos normais, exceto em testículo (A)e alta expressão foram investigados em carcinomas ovariano e de próstata,bem como em melanomas e linhagens de células de câncer de cólon (B).
Figura 19. Expressão de mRNA de Mem-131
Investigações por RT-PCR com iniciadores Mem-131-específi-cos não mostraram expressão significativa dentro de todos os tecidos nor-mais testados, exceto PBMC ativada. Expressão de mRNA de Mem-131 emcarcinomas de mama e pulmão. Expressão de mRNA de Mem-131 em car-cinomas de pulmão e ovariano.
Figura 20. Expressão de mRNA de ISC-468
Investigações por (A) RT-PCR e (B) PCR em tempo real cominiciadores ISC-468-específicos mostraram expressão de mRNA seletiva emtestículo normal, placenta e em 80% das biópsias de carcinoma de mama.
Figura 21. Análise por imunofluorescência de expressão deISC-468
(A) Especificidade de anticorpos anti-ISC-468 foi confirmadaatravés de coloração de células transfectadas com ISC-468-eGFP. (B) Colo-ração de células MeOH-fixadas transfectadas com duplas de RNAi ISC-468-específicas ou duplas de controle de não-silenciamento. (C) Coloração decélulas não-fixadas transfectadas com duplas de RNAi ISC-468-específicasou duplas de controle de não-silenciamento.
Figura 22. Análise imunohistoquímica de expressão de ISC-468
Nenhuma expressão foi detectável em tecido de mama normal(A) 100x, (B) 200x. Em contraste, coloração de membrana forte e homogê-nea foi observada em espécimes de carcinoma de mama (C) 100x, (D) 200x.
Figura 23. A diminuição RNAi-induzido de expressão demRNA de ISC-468
Transfecção de células com duplas de SiRNA ISC-468-especí-ficas resultou em a diminuição distinto de expressão de mRNA de ISC-468comparado com células de controle.
Figura 24. Análise de proliferação celularTransfecção de células com duplas de siRNA ISC-468-espe-cíficas resultou em dano distinto de proliferação celular comparado com cé-lulas de controle.
Figura 25. Análise de ciclo celular
Transfecção de células com duplas de siRNA ISC-468-espe-cíficas resultou em interrupção de G1/S em células de carcinoma de mama(A) MCF-7 e (B) BT-549 comparado com células de controle.
Figura 26. Fosforilação de AKTTransfecção de células com duplas de siRNA ISC-468-espe-cíficas resultou em dano distinto de fosforilação de AKT comparado com cé-lulas de controle.
Figura 27. Inibição de proliferação anticorpo-mediada
Inibição de células de carcinoma de mama MCF-7 com anticor-,pos ISC-468-específicos resultou em proliferação reduzida comparado comcélulas incubadas com um anticorpo de controle irrelevante.
Figura 28. Análise de proliferação celular
Transfecção de células com duplas de siRNA ISC-468 especí-ficas resultou em dano distinto de (A) quimiotaxia, (B) quimiocinese e (C)invasão comparado com células de controle.
Figura 29. correlação ao receptor de estrogênio
Os níveis de expressão de mRNA de ISC-468 mRNA em amos-tras de carcinoma de mama se correlacionam com o estado do receptor deestrogênio. São mostrados a mediana, 10° e 90° percentis com as barras deerro.
Figura 30. Tratamento com 17p-estradiol
Expressão de mRNA de ISC-468 foi induzida através de trata-mento da linhagem de células de carcinoma de mama receptor-positivaMCF-7 com 17p-estradiol a 100 nM. Nenhuma indução foi observada na li-nhagem de células receptor de estrogênio-negativa MDA-MB-231.
Figura 31. Seqüências
As seqüências às quais referência é feita aqui são mostradas.
Exemplos:
Material e métodos
As técnicas e métodos mencionados aqui são realizados de umamaneira conhecida per se e são descritos, por exemplo, em Sambrook e ou-tros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2§ Edição (1989) Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y. Todos os métodos, in-cluindo o uso de kits e reagentes, são realizados de acordo com a informa-ção dos fabricantes.
Extração de RNA, preparo de cDNA primed com poli-d(T) eanálise por RT-PCR convencional
RNA total foi extraído de um material tecidual nativo usando iso-tiocianato de guanidínio como agente caotrópico (Chomczynski & Sacchi,Anal. Biochem. 162: 156-9, 1987).
Após extração com fenol ácido e precipitação com isopropanol, oreferido RNA foi dissolvido em água tratada com DEPC.
Síntese de cDNA de primeira fita a partir de 4 μg de RNA total foirealizada em 20 μΙ de mistura de reação por meio do Superscript Il (Invitro-gen), de acordo com a informação do fabricante. O iniciador usado era um dT(18) oligonucleotídeo. A integridade e qualidade do cDNA foram verifica-das através de amplificação de p53 em uma PCR com 30 ciclos (SEQ IDNO: 33, 34), temperatura de hibridização de 67°C. Um arquivo de cDNA deprimeira fita foi preparado a partir de uma série de tecidos normais e entida-des tumorígenas. Para estudos de expressão, 0,5 μΙ desses cDNAs foi am- plificado em 30 μΙ de mistura de reação, usando iniciadores GOI-específicos(veja abaixo) e 1 U de DNA polimerase HotStarTaq (Qiagen). Cada misturade reação continha dNTPs a 150 μΜ, 0,3 μΜ de cada iniciador e 3 μΙ de 10 *tampão de reação. Os iniciadores foram selecionados de modo a estaremlocalizados em dois éxons diferentes e eliminação da interferência por DNAgenômico contaminante como a razão para resultados falso-positivos foiconfirmada através de testagem de DNA não inverso-transcrito como tem--plato. Após 15 minutos-a 95°C para ativar a DNA-polimerase HotStarTaq, 35ciclos de PCR foram realizados (0,5 min a 94°C, 0,5 min na temperatura dehibridização em particular, 0,5 min a 72°C e um alongamento final a 72°Cdurante 6 min). 20 μΙ dessa reação foram fracionados e analisados sobre umgel de agarose corado com brometo de etídio.
Preparo de cDNA primed com hexâmero aleatório e PCR emtempo real quantitativa
A expressão de vários genes foi quantificada através de PCR em tempo real. Os produtos de PCR foram detectados usando SYBR Greencomo corante repórter de intercalamento. A fluorescência do repórter deSYBR Green é suprimida em solução e o corante é ativo apenas após liga-ção a fragmentos de DNA de fita dupla. O aumento na fluorescência de SY-BR Green como um resultado da amplificação específica usando iniciadoresGOI-específicos após cada ciclo de PCR é utilizado para quantificação. Ex-pressão do gene alvo é quantificada absolutamente ou com relação à ex-pressão de um gene de controle com expressão constante nos tecidos a se- .rem investigados. Expressão foi medida após padronização das amostrascontra 18s RNA como o assim denominado gene "de preparo" usando o mé-todo ΔΔ-Ct (PE Biosystems, EUA). As reações foram realizadas em duplica-tas e determinadas em triplicatas. O kit de PCR QuantiTect SYBR Green(Qiagen, Hilden) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. OcDNA foi sintetizado com iniciadores aleatórios (Invitrogen) usando o proto-colo descrito acima. Cada porção de 5 μΙ do cDNA diluído foi empregada emum volume total de 30 μΙ para a PCR: iniciador sentido a 300 nM, iniciadoranti-sentido a 300 nM; desnaturação inicial a 95°C durante 15 min; 95°C du-rante 30 seg; anelamento durante 30 seg; 72°C durante 30 seg; 40 ciclos. Asseqüências dos iniciadores usados são indicadas nos respectivos exemplos.
Clonagem e análise de seqüência
Clonagem de fragmentos de gene e de comprimento total ocor-reu através de métodos convencionais. Para determinar a seqüência, antí-genos correspondentes foram amplificados usando a polimerase pfu à provade leitura (Stratagene). Após término da PCR, adenosina foi ligada por meiode DNA polimerase HotStarTaq às extremidades do amplicon de forma àclonar os fragmentos, de acordo com as instruções do fabricante, no vetorTOPO-TA. O seqüenciamento foi realizado através de um serviço comercial.As seqüências foram analisadas usando programas e algoritmos convencio-nais de previsão.
Análise de proliferação celular 24 h após transfecção comduplas de siRNA
1x104 células foram cultivadas em meio suplementado com con-centrações variadas de FCS durante 48 h. Proliferação foi analisada atravésde medição da incorporação de BrdU em fitas de DNA recentemente sinteti-zadas usando o kit de proliferação celular DELFIA (Perkin Elmer) de acordocom as instruções do fabricante sobre um contador Wallac Victor2 Multi-Iabel(Perkin Eímer).
Análise de ciclo celular e apoptose
Células foram cultivadas em meio suplementado com FCS emconcentrações variadas, coletadas após 48 h e coradas com iodeto de pro-pídio antes de análise do teor de DNA através de citometria de fluxo. Célulasapoptóticas e células nas fases S/G2/M do ciclo celular foram quantificadasusando CeIIQuest-Software (Becton Dickinson).
Migração celular
Ensaios de migração celular foram conduzidos em câmaras comtranscavidade com membranas com poro de 8,0 μητι (BD Biosciences) comcélulas cultivadas em meio isento de soro durante 12h antes dos experimen-tos. Para experimentos com siRNA, as células foram transferidas para con-dições isentas de soro 24 h após transfecção com duplas de siRNA confor- me descrito acima. 4 χ 104 células em 400 μΙ de meio de cultura isento desoro foram adicionadas à camada superior. As camadas inferiores conti-nham 800 μΙ de meio de cultura suplementado com FCS1 PDGF-BB (Sigma-Aldrich) ou SDF-1oe/CXCL12 (R&D Systems) como quimioatraentes. Após 24horas, as células que tinham migrado para o lado inferior da membrana fo- ram fixadas em metanol gelado; as membranas foram excisadas, colocadassobre lâminas de microscópio e montadas com Hoechst (Dako) para micros-copia por fluorescência. As células em cinco campos visuais aleatórios (am-pliação de 100x) foram contadas para cada membrana. Todos os experimen-tos foram feitos em triplicatas. Os efeitos sobre a quimiocinese de célulasforam analisados usando o mesmo ambiente experimental (i) sem nenhumquimioatraente adicionado às câmaras superior e inferior e (ii) com quimioa-traente adicionado às câmaras superior e inferior.
Ensaio de invasão in vitro
Ensaios de invasão in vitro foram conduzidos em câmaras comtranscavidade com membranas com poro de 8,0 μιτι (BD Biosciences) comcélulas cultivadas em meio isento de soro durante 12 h antes dos experi-mentos. As câmaras superiores foram preparadas com 100 μΙ de Matrigel(BD Biosciences) diluída para 1 mg/ml em meio isento de soro. As câmarasforam incubadas a 37°C durante 5 h para gelificação. Para experimentoscom siRNA, as células foram transferidas para condições isentas de soro24h após transfecção com duplas de siRNA, conforme descrito acima. 1 χ105 células em 400 μΙ de meio de cultura isento de soro foram adicionadas àcâmara superior. As câmaras inferiores continham 800 μΙ de meio de culturasuplementado com FCS como quimioatraente. Após 24 horas, as célulasque invadiram o lado inferior da membrana foram fixadas em metanol gela-do; as membranas foram excisadas, colocadas sobre lâminas de microscó-pio θ montadas com Hoechst (Dako) para microscopia por fluorescência. Ascélulas em cinco campos visuais aleatórios (ampliação de 100x) foram con-tadas para cada membrana. Todos os experimentos foram feitos em triplica-tas.
Exemplo 1: Identificação de ISC-468 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-468 (SEQ ID NO: 1) codifica uma proteína de 212 aminoáci-dos (SEQ ID NO: 2) e com um peso molecular de 23,6 kDa.
Ela foi anteriormente descrita como uma proteína placenta-específica expressa durante a gravidez (Fant e outros, Mol Reprod Dev. 63:430-6,2002).
A proteína é prevista como tendo um peptídeo sinalizador clivá-vel do aa 1-23, seguido por um domínio transmembrana putativo curto (aa25-47), conforme analisado através de ferramentas de bioinformátiça (TM-pred, SOUSI). A proteína restante é prevista como sendo extracelular e po-de, portanto, ser usada de acordo com a invenção como uma estrutura alvopara anticorpos monoclonais.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 3, 4) for ISC-468 foi usado em análises de RT-PCR para ampli-ficar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais ê tumo-rígenos. Conforme esperado, placenta foi confirmada como o único tecidosaudável expressando esse gene (figura 1). Nenhuma expressão significati-va, contudo, foi detectada em qualquer outro tecido de órgão normal. Maissurpreendentemente, quando espécimes de câncer foram investigadas, nósencontramos níveis altos e significativos de expressão em uma série de dife-rentes tipos de tumor, incluindo carcinomas de cólon, pancreático, esofageal,estômago, pulmão, mama, ovariano, cabeça & pescoço, rim, próstata e fíga-do (figura 1 e 2, bem como Tabela 1). Análise por RT-PCR quantitativa emtempo real de expressão de ISC-468 em 60 amostras de carcinoma de ma-ma revelou que 80% de todas as amostras expressavam níveis significativosde ISC-468 (figura 20A, B).
Tabela 1: Expressão de ISC-468 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 62</column></row><table>A expressão seletiva e alta de transcritos de ISC-468 em tumo-res não era anteriormente conhecida e pode ser utilizada, de acordo com ainvenção, para métodos diagnósticos moleculares, tal como RT-PCR, paradetecção de disseminação de células tumorígenas no soro e medula óssea epara detecção de metástases em outros tecidos. Essa molécula pode ainda .ser usada como um alvo específico para abordagens terapêuticas.
Os peptídeos a seguir, inter alia, foram selecionados para pro-dução de anticorpos ISC-468-específicos de acordo com a invenção: SEQ IDNO: 58, 59, 60, 68, 69, 2. A especificidade dos anticorpos foi confirmada a-través de análise por imunofluorescência de células transfectadas com ISC-468-eGFP (figura 21 A).
A localização subcelular da ISC-468 em linhagens de células decarcinoma de mama de expressão endógena MCF-7 e BT-549 foi analisadaatravés de análises por imunofluorescência. Coloração de células MeOH-fixadas (figura 21B) ou não-fixadas (figura 21C) revelou que a ISC-468 estálocalizada nas membranas plasmáticas das células de expressão. Especifi-camente, a coloração foi confirmada através de a diminuição RNAi-induzidode expressão de ISC-468, resultando na perda de coloração da membranaplasmática.
Além disso, anticorpos ISC-468-específicos foram usados paraanálise imuno-histoquímica de expressão de ISC-468 em amostras clínicasde carcinomas de mama e mama-normaL Expressão de-ISC-468 não eradetectável em espécimes de mama normal (figura 22A, B). Em contraste,espécimes de carcinoma de mama mostraram expressão forte e homogêneade ISC-468 (figura 22C, D). Sinais eram acentuados na membrana plasmáti-ca das células cancerígenas de expressão, confirmando que a ISC-468 éuma proteína na membrana seletivamente expressa em células canceríge-nas.
Os domínios extracelulares da ISC-468 podem ser usados deacordo com a invenção como uma estrutura alvo para imunodiagnóstico eterapia por meio de anticorpos monoclonais. Além disso, a ISC-468 pode serempregada de acordo com a invenção como uma vacina (RNA, DNA, proteí-na, peptídeos) para indução de respostas imunes tumor-específicas (respos-tas imunes células T e B-mediadas).
A diminuição RNAi-induzido de expressão de ISC-468 foi obtidoatravés de transfecção de células com duplas de siRNA que objetivam espe-cificamente o mRNA da ISC-468 (SEQ ID NOs: 70-73). Transfecção de li-nhagens de células de carcinoma de mama de expressão endógena MCF-7e BT-549 resultou em redução estável e específica de expressão de mRNAde ISC-468 (figura 23).
Para obter uma percepção sobre o papel fisiológico de expres-são de ISC-468, vários ensaios celulares in vitro RNAi-baseados foram reali-zados. Transfecção de linhagens de células de carcinoma de mama MCF-7e BT-549 com duplas de siRNA resultou em uma redução distinta de prolife-ração celular comparado com os respectivos controles, conforme analisadoem um ensaio de proliferação BrdU-baseado (figura 24). Análise do ciclocelular FACS-baseada mostrou que a anulação de proliferação celular resul-tou de uma interrupção de G1/S (figura 25A, B). Adicionalmente/pôde sermostrado que a diminuição RNAi-induzido de ISC-468 afeta profundamentea via de sinalização AKT em células cancerígenas expressando endogena-mente através de inibição de fosforilação de AKT (figura 26). Além disso, aproliferação de células MCF-7 foi atenuada quando as células foram incuba-das com anticorpos ISC-468-específicos gerados contra peptídeos ISC-468-específicos (SEQ ID NO: 68, 69) comparado com um anticorpo de controleirrelevante (figura 27). Esses resultados indicam que a ISC-468 é um fatorcrítico para a proliferação de células cancerígenas presumivelmente atravésde mediação da ativação fator de crescimento-induzida da via de sinalizaçãoAKT e outras. A ISC-468 em si poderia representar um receptor, co-receptorou chaperona membrana-ligada para fatores de crescimento, quimiocinas ououtras substâncias.
Além disso, o impacto da expressão de ISC-468 sobre a capaci-dade migratória de células cancerígenas foi analisada. A diminuição RNAi-induzido de expressão de ISC-468 em linhagens de células de carcinoma demama MCF-7 e BT-549 resultou em um prejuízo distinto da quimiotaxia,quimicinese e invasão das células, conforme avaliado em ensaios de migra-ção transcavidade (figura 28A, B, C). Quimiotaxia, quimiocinese e invasãosão fatores críticos para a metástase de células cancerígenas a outros ór-gãos. Portanto, expressão de ISC-468 em células cancerígenas poderia serum fator positivo para metástase de células cancerígenas.
Em carcinomas de mama, pôde ser mostrado que a expressãode ISC-468 está correlacionada com o estado do receptor de estrogênio dotumor. Análise por RT-PCR quantitativa em tempo real de expressão de ISC-468 em 60 amostras de carcinoma de mama revelou que carcinomas demama positivos ao receptor de estrogênio mostravam níveis significativa-mente maiores de expressão de ISC-468 do que tumores receptor-negativos(figura 29).
Conseqüentemente, expressão de ISC-468 pôde ser identificadana linhagem de células de carcinoma de mama receptor de estrogênio-positiva MCF-7 através de tratamento com 17p-estradiol (figura 30).
Exemplo 2 : Identificação de ISC-507 como alvo terapêuticoe diagnóstico para câncer
ISC-507 (SEQ ID NO: 5) codifica uma proteína de 754 aa (SEQID NO: 6) com um peso molecular de 85,6 kDa. ISC-507 é um membro deuma família de proteínas de ligação a zinco com atividades de desintegrina emetaloprotease que pode funcionar como proteínas e/ou endopeptidases deadesão^Membros dessas família foram descritos como estando envolvidosem uma série de processos biológicos, incluindo fertilização, neurogênese,desenvolvimento muscular e resposta imune (Seals e outros, Genes Dev.17(1): 7-30,2003)
ISC-507 tem um domínio transmembrana (aa 671-687), umagrande região extracelular N-terminal e uma região C-terminal citoplasmáticamais curta.
Expressão de ISC-507 foi reportada como estando especifica-mente restrita ao epidídimo de mamíferos, a pequena glândula adjacente aotestículo, a qual está criticamente envolvida em maturação de esperma. Deacordo com a literatura, a ISC-507 é transferida do epidídimo para a superfí-cie do esperma e redistribuída na cabeça do espermâ durante reação deacrossoma (Adachi e outros, Mol Reprod Dev. 64: 414-21, 2003).
Investigações por RT-PCR com iniciadores ISC-507-específicos(SEQ ID NO: 7, 8) confirmaram a expressão seletiva no testículo e ausênciade ISC-507 em qualquer outro tecido normal (Tabela 2, Figura. 3), excetofraca expressão em tecidos derivados da próstata e nódulo linfático (Tabela2, Figura. 4).
Contudo e mais surpreendentemente, nós observou-se expres-são de ISC-507 em um número significativo de cânceres de próstata (figura3, 4). Essa proteína não tinha sido reportada antes como estando envolvidaem câncer.
Tabela 2: Expressão de ISC-507 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table>
A ausência de toxicidade relevante em tecidos normais e a ex-pressão freqüente e significativa de ISC-507 em cânceres de próstata tornaessa proteína de acordo com a invenção um marcador diagnóstico e tera-pêutico valiosos. Isso inclui, de acordo com a invenção, a detecção de célu-Ias tumorígenas disseminadas no soro, medula óssea, urina e a detecção demetástases em outros órgãos por meio de RT-PCR. Além disso, os domíniosextracelulares da ISC-507 podem ser usados de acordo com a invenção co-mo uma estrutura alvo para imunodiagnóstico e terapia por meio de anticor-pos monoclonais. Além disso, a ISC-507 pode ser empregada de acordocom a invenção como uma vacina (RNA, DNA, proteína, peptídeos) paraindução de respostas imunes tumor-específicas (respostas imunes células Te B-mediadas).
"Anticorpos para detecção de ISC-507 poderiam ser produzidoscom os seguintes peptídeos e proteínas: SEQ ID NO: 51, 52, 53, 54, 55, 6,56 e 57.
De acordo com a invenção, um anticorpo o qual se liga à ISC-507 poderia ser útil para fins terapêuticos ou diagnósticos.
Exemplo 3: Identificação de ISC-466 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-466 (SEQ ID NO: 9) codifica uma proteína de 426 aa (SEQID NO: 10) com um peso molecular de 48,2 kDA. Ela pertence à família deglicoproteínas gravidez-específica. As glicoproteínas gravidez humana-específicas (PSGs) são um grupo de moléculas que são produzidas princi-palmente pelos sinciotiotrofoblastos placentários durante a gravidez e sãoparte da superfamília de imunoglobulina (Beauchemin e outros, Exp CellRes. 252(2): 243-9, 1999). Como outras PSGs, a ISC-466 também foi repor-tada como estando restrita à placenta.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 11, 12) para ISC-466 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais etumorígenos. A análise de RT-PCR revela expressão de transcritos de ISC-466 em placenta normal e fraca expressão em timo e ovário (Tabela 3, Figu-ra. 5Á). Nenhuma expressão significativa foi detectada em qualquer outrotecido de órgão normal.
Mais surpreendentemente, quando linhagens de células cance-rígenas foram investigadas, nós encontramos níveis altos e significativos deexpressão em uma série de tipos de tumor, incluindo câncer de mama (figu-ra 5C), câncer de pulmão (figura 5C), carcinoma ovariano (figura 5D) e car-cínomas de cabeça e pescoço e rim (figura 5B).
Tabela 3: Expressão de ISC-466 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table>
Em contraste à observação de que a ISC-466 está envolvida emcarcinomas colorretais (Salahshor e outros, BMC Câncer. 5: 66, 2005), asinvestigações revelaram a ISC-466 de acordo com a invenção como ummarcador diagnóstico e terapêutico para câncer de cabeça & pescoço, ma-ma, ovariano, próstata e melanoma.
Exemplo 4: Identificação de ISC-518 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-518 (SEQ ID NO: 13) codifica um produto da tradução de237 aa (SEQ ID NO: 14). Contudo, nenhum dados com relação à distribuiçãotecidual e nenhuma conexão com câncer está disponível até agora.
A ISC-518 é uma proteína/gene bioinformaticamente previstohipotético. Análise de seqüência revelou que a proteína tem um domíniotransmembrana (aa 102-118). O C-término extracelular se caracteriza porum domínio funcional, o qual ocorre em glicoproteínas na superfície celular.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 15, 16) para ISC-518 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais etumorígenos. O único tecido normal que foi descoberto expressar esse genefoi o testículo, enquanto que nenhuma expressão significativa de ISC-518era detectável em qualquer outro órgão normal (figura 6). Mais surpreenden-temente, quando espécimes de câncer foram investigadas, encontraram-seníveis altos e significativos de expressão em hepatocarcinomas (figura 7).
Tabela 4: Expressão de ISC-518 em tecidos normais e tumorí-genos
<table>table see original document page 70</column></row><table>
Investigações por bioinformática mostraram que a proteína codi-ficada pela ISC-518 representa uma molécula na superfície celular. A ex-pressão seletiva previamente desconhecida dessa molécula na superfície atorna um alvo para fins terapêuticos e para o desenvolvimento de métodosdiagnósticos para a detecção de células tumorígenas e métodos terapêuti-cos para a eliminação de células tumorígenas.
Exemplo 5: Identificação de ISC-477 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-477 (SEQ ID NO: 17) codifica um produto da tradução de130 aa (SEQ ID NO: 18). ISC-477 é uma proteína hipotética. Nenhum dadocom relação à distribuição tecidual e nenhuma conexão ao câncer estavapublicamente disponível. Análise estrutural revela uma região hidrofóbica, aqual poderia ser uma região transmembrana ou um peptídeo sinalizador.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 19, 20) para ISC-477 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais etumorígenos. Os únicos tecidos normais que foi descoberto expressar essegene eram placenta e ovário. Em contraste, nenhuma expressão significativade ISC-477 era detectável em qualquer outro órgão normal (figura 8A). Maissurpreendentemente, quando espécimes de câncer foram investigadas, en-contraram-se níveis altos e significativos de expressão em câncer de pul-mão, ovariano, cólon e estômago (figuras 8A-D). Os níveis de expressão sãoclaramente maiores do que a expressão em ovário normal.
Tabela 5: Expressão de ISC-477 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 71</column></row><table>Continuação
<table>table see original document page 72</column></row><table>
Exemplo 6: Identificação de ISC-489 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-489 (SEQ ID NO: 21) codifica um produto da tradução de363 aa (SEQ ID NO: 22). A proteína é um membro recentemente descrito dafamília de receptores acoplados à proteína G. Contudo, nenhum dado comrelação à distribuição tecidual e nenhuma conexão com câncer estava publi-camente disponível.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 23, 24) para ISC-489 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificaçãô o cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos nor-mais e tumorígenos. Os únicos tecidos normais que nós descobrimos queexpressa esse gene eram placenta e esôfago (fraca expressão). Em contras-te, nenhuma expressão significativa de ISC-498 foi detectável em qualqueroutro órgão normal (figura 9A). Mais surpreendentemente, quando espéci-mes de câncer foram investigadas, encontraram-se níveis altos e significati-vos de expressão em cânceres de cabeça e pescoço e estômago (figuras9B, 9C).
Como membro da família de receptor acoplado à proteína G, aISC-489 é uma proteína da membrana integral com 7 domínios transmem-brana e vários Ioops extracelulares, os quais podem ser objetivados sobre asuperfície celular.
Tabela 6: Expressão de ISC-489 em tecidos normais e tumorí-genos
<table>table see original document page 73</column></row><table>A expressão pronunciada e a incidência inesperadamente altade ISC-489 em carcinomas da cabeça e pescoço torna essa proteína de a-cordo com antígeno um marcador diagnóstico e terapêutico altamente inte-ressante.
Exemplo 7: Identificação de ISC-461 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-461 (SEQ ID NO: 25) codifica uma proteína de 419 aa (SEQID NO: 26) com um peso molecular de 47,1 kDA. Ela pertence à família deglicoproteínas gravidez-específica. As glicoproteínas gravidez humana-específicas (PSGs) são um grupo de moléculas que são produzidas princi-palmente pelos sinciotiotrofoblastos placentários durante a gravidez e sãoparte da superfamília de imunoglobulina (Beauchemin e outros, Exp CellRes. 252(2): 243-9, 1999). Como outras PSGs, a ISC-461 também foi repor-tada como estando restrita à placenta.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 11, 27) para ISC-461 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais etumorígenos. Conforme esperado, placenta foi confirmado como expressan-do esse gene, além de fraca expressão em testículo e ovário (figuras 10A e 10B).
Nenhuma expressão significativa, contudo, foi detectada emqualquer outro tecido de órgão normal. Mais surpreendentemente, quandotecidos derivados de câncer e linhagens de células cancerígenas foram in-vestigados, encontraram-se níveis altos e significativos de expressão emuma série de tipos de tumor, incluindo câncer de mama (figura 10C), carci-noma ovariano (figura 10D) e melanoma (figuras 10B, 10C).Tabela 7: Expressão de ISC-461 em tecidos normais e tumorí-genos
<table>table see original document page 75</column></row><table> Um outro objetivo de acordo com a invenção foi identificar vari-antes com união para ISC-461 as quais podem ser utilizadas para diagnósti-co e para terapia. Quando de investigação de variantes com união, podem-se identificar uma forma com união (SEQ ID NO: 28) e a proteína codificadapela mesma (SEQ ID NO: 29).
Exemplo 8: Identificação de ISC-465 como alvo terapêutico ediagnóstico para câncer
ISC-465 (SEQ ID NO: 30) codifica uma proteína de 419 aa (SEQID NO: 31) com um peso molecular de 47,0 kDA.
Ela pertence à família de glicoproteínas gravidez-específica. Asglicoproteínas gravidez humana-específicas (PSGs) são um grupo de molé-culas que são produzidas principalmente pelos sinciotiotrofoblastos placentá-rios durante a gravidez e são parte da superfamília de imunoglobulina (Be-auchemin e outros, Exp Cell Res. 252(2): 243-9, 1999). Como outras PSGs,a ISC-465 também foi reportada como estando restrita à placenta.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 11, 32) para ISC-465 foi usado em análises de RT-PCR paraamplificar cDNA derivado de um painel compreensivo de tecidos normais etumorígenos. Conforme esperado, placenta foi confirmada como expressan-do esse gene, além de fraca expressão em ovário normal (figura 1.1 A). Ne-nhuma expressão significativa, contudo, foi detectada em qualquer outro te-cido de órgão normal. Mais surpreendentemente, quando tecidos derivadosde câncer e linhagens de células cancerígenas foram investigados, nós en-contramos níveis altos e significativos de expressão em uma série de tiposde tumor (figuras 11 A, 11B), especialmente câncer de mama (figura 11B).
Tabela 8: Expressão de ISC-465 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 76</column></row><table>Continuação
<table>table see original document page 77</column></row><table>
A expressão seletiva e elevada de transcritos de ISC-465 emtumores não era previamente conhecida e pode ser utilizada de acordo coma invenção para métodos diagnósticos moleculares, tal como RT-PCR, paradetecção de disseminação de células tumorígenas no soro e medula óssea epara detecção de metástases em outros tecidos. Essa molécula pode serainda usada como um alvo específico para abordagens terapêuticas.
Exemplo 9: Identificação de Mem-030 como alvo terapêuticoe diagnóstico para câncer
Mem-030 (SEQ ID NO: 35) codifica uma proteína de 592 aa(SEQ ID NO: 36) com um peso molecular de 67,9 kDA.
Mem-030 pertence às proteínas GBP, as quais são grandesGTPases sendo capaz de se ligar a GTP1 GDP e GMP e catalisar a hidrólisede GTP em GDP, bem como GMP (Cheng e outros, J Biol.'Chem. 260:15834-9, 1985). GTPases exercem um papel importante em proliferação ce-lular, diferenciação, transdução de sinal e transporte de proteína intracelulare são interferon-induzíveis (Boehm e outros, J Immunol. 161 (12): 6715-23,1998). Também, Mem-030 contra-atua o efeito proliferativo de citocinas in-flamatórias, tais como IFG-g, interleucina 1-b (IL-Ib) e fator-α de necrose detumor (TNF-α) sobre células endoteliais (Guenzi e outros, EMBO J. 20(20):5568-77,2001).
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 37, 38) para Mem-038 foi usado em análises de RT-PCR emtempo real para amplificar cDNA derivado de um painel compreensivo detecidos normais e tumorígenos. Mem-030 mostra um padrão de expressãoabundante (figura 12A, Tabela 9).
Mais surpreendentemente, quando tecidos derivados de câncere linhagens de células cancerígenas foram investigadas, foram descobertos níveis altos e significativos de superexpressão em uma série de tipos de tu-mor (figura 12A, 12B), especialmente carcinomas de cabeça e pescoço.
Tabela 9: Expressão de Mem-030 em tecidos normais e tumorí-genos
<table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table>
Em virtude de análise por bioinformática e literatura, um genehomólogo de Mem-030 também poderia ser um alvo terapêutico atraente(SEQ ID NO: 39) e codifica uma proteína de 586 aa (SEQ ID NO: 40) comum peso molecular de 66,6 kDA.
Investigações por bioinformática mostraram que ambas as prote-ínas representam moléculas na superfície celular. A superexpressão seletivapreviamente desconhecida dessa molécula na superfície celular a torna umalvo para fins terapêuticos e para o desenvolvimento de métodos diagnósti-cos para a detecção de células tumorígenas e métodos terapêuticos para aeliminação de células tumorígenas.
Exemplo 10: Identificação de Mem-055 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-055 (SEQ ID NO: 41) codifica uma proteína de 250 aa(SEQ ID NO: 42) com um peso molecular de 27,9 kDA. A proteína codificadapor esse gene é uma reductase de tiol lisossômica que, em baixo pH, podereduzir as ligações de dissulfeto da proteína. A enzima é expressa constituti-vamente em células apresentando antígeno e induzida pelo gama-interferonem outros tipos de célula. Essa enzima tem um papel importante em proces-samento de antígeno classe Il do MHC-restrito (Arunachalam e outros, ProcNatl Acad Sci USA. 97 (2): 745-50, 2000).
A localização de Mem-055 e a topologia de proteína foram pre-vistos através de análise das seqüências sinalizadoras putativas e domíniostransmembrana com ferramentas de bioinformática (TMPRED, SOUSI).Mem-055 poderia ter um C-término extracelular.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 43, 44) para Mem-055 foi usado em análises de RT-PCR emtempo real para amplificar cDNA derivado de um painel compreensivo detecidos normais e tumorígenos. Mem-055 mostrou um padrão de expressãoabundante (figura 13A, Tabela 10).
Mais surpreendentemente, quando expressão de Mem-055 den-tro de tecidos derivados de câncer foi investigada, foram descobertos níveisaltos e significativos de superexpressão em uma série de tipos de tumor (fi-guras 13A, 13B), especialmente cânceres de estômago.
Tabela 10: Expressão de Mem-055 em tecidos normais e tumo-rígenos
<table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>
Mem-055 é uma estrutura alvo para fins terapêuticos e diagnós-ticos, em virtude do domínio extracelular putativo e da superexpressão ines-perada em diferentes tipos de carcinoma.
Exemplo 11: Identificação de Mem-062 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-062 (SEQ ID NO: 45) codifica uma proteína de 271 aa(SEQ ID NO: 46) com um peso molecular de 30,7 kDA. Através de um méto-do de seleção baseado em computador, Mem-062 pôde ser previamenteidentificado e foi descrito como especificamente expresso em testículo, prós-tata e placenta (Bera e outros, Biochem Biophys Res Commun. 312 (4):1209-15,2003).
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específico(SEQ ID NO: 47, 48) para Mem-062 foi usado em análises de RT-PCT. Sur-preendentemente, Mem-062 mostrou um padrão de expressão câncer detestículo-específico (figura 14A, Tabela 11). Nenhuma expressão foi detec-tada em qualquer outro tecido de órgão normal. Mais surpreendentemente,quando tecidos derivados de câncer foram investigados, foram descobertosníveis significativos de expressão de Mem-062 (figura 14B), especialmenteem carcinomas ovarianos.Tabela 11: Expressão de Mem-062 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 82</column></row><table>
União alternativa resulta em um transcrito alternativo (SEQ IDNO: 49) e seu produto da tradução correspondente (SEQ ID NO: 50).
Exemplo 12 : Identificação de Mem-068 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-068 (SEQ ID NO: 61) é um clone de cDNA recentementeidentificado. Através de uma abordagem de previsão por bioinformática(Genscan), Mem-068 pôde ser descrito como um gene com múltiplos éxonssobre o cromossoma 9 (SEQ ID NO: 62). A seqüência de proteína deduzida(SEQ ID NO: 63) tem 751 aa e forma uma proteína com um peso molecularde 82,4 kDA.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específicopara Mem-068 foi usado em análises de RT-PCR. Surpreendentemente,Mem-068 mostrou um padrão de expressão câncer de testículo-específico(figura 15A, Tabela 12). Nenhuma expressão foi detectada em qualquer ou-tro tecido de órgão normal, exceto placenta (fraca expressão). Mais surpre-endentemente, quando tecidos derivados de câncer foram investigados, fo-ram descobertos níveis significativos de Mem-068 expresso (figura 15B),especialmente em carcinomas de célula renal e em cânceres de estômago.
Tabela 12: Expressão de Mem-068 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 83</column></row><table>
De acordo com o programa de previsão de transmembrana TM-pred, Mem-068 poderia ser expresso na superfície celular, o que o torno umalvo interessante para fins terapêuticos ou diagnósticos.
Exemplo 13: Identificação de Mem-071 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-071 (SEQ ID NO: 64) é um novo clone de cDNA, o qual écodificado em 2 éxons sobre o cromossoma 1.
De acordo com a invenção, um par de iniciador gene-específicopara Mem-071 foi usado em análises de RT-PCR para amplificar cDNA deri-vado de um painel compreensivo de tecidos normais e tumorígenos. O únicotecido normal que nós descobrimos expressar esse gene era o testículo (fi-gura Ϊ6Α). Em contraste, quando espécimes de câncer foram investigados,nós encontramos níveis altos e significativos de expressão em carcinomasde célula renal e cânceres de estômago (figura 16B).
Tabela 13: Expressão de Mem-071 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 84</column></row><table>
A alta incidência inesperada de Mem-071 em carcinomas de cé-lula renal torna essa proteína de acordo com a invenção um marcador diag-nóstico e terapêutico altamente interessante.
Exemplo 14: Identificação de Mem-072 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-072 (SEQ ID NO: 65) é um gene recentemente identifica-do, o qual é codificado em 3 éxons sobre o cromossoma 16. De acordo coma invenção, um par de iniciador gene-específico para Mem-072 foi usado emanálises de RT-PCR para amplificar cDNA derivado de um painel compreen-sivo de tecidos normais e tumorígenos. Nenhuma expressão dentro de todosos tecidos normais testados pôde ser encontrada (figura 17A, Tabela 14).
Quando tecidos derivados de câncer e linhagens de células cancerígenasforam investigados, nós encontramos níveis altos e significativos de expres-são em amostras de câncer de pulmão (figura 17B).
Tabela 14 : Expressão de Mem-072 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 85</column></row><table>
A expressão seletiva e elevada de Mem-072 em tumores depulmão não era anteriormente conhecida e pode ser utilizada de acordo coma invenção para métodos diagnósticos moleculares, tal como RT-PCR, paradetecção da disseminação de células tumorígenas no soro e medula óssea epara detecção de metástases em outros tecidos. Essa molécula pode serainda usada como um alvo específico para abordagens terapêuticas.
Exemplo 15: Identificação de Mem-106 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-106 (SEQ ID NO: 66) é um cDNA recentemente identifica-do, o qual é sem íntrons, codificado sobre o cromossoma 2.De acordo com a invenção, um par de iniciàdor gene-específicopara Mem-106 foi usado em análises de RT-PCR. Surpreendentemente,Mem-106 mostrou um padrão de expressão câncer de testículo-específica(figura 18A, Tabela 15). Nenhuma expressão foi detectada em qualquer ou-tro tecido de órgão normal. Mais surpreendentemente, quando tecidos deri-vados de câncer foram investigados, foram descobertos níveis significativosde expressão de Mem-106 (figura 18B), especialmente em carcinomas ova-rianos.
Tabela 15: Expressão de Mem-106 em tecidos normais e tumorígenos
Expressão
<table>table see original document page 86</column></row><table>
Mem-106 é uma estrutura alvo para fins terapêuticos e diagnós-ticos em virtude da superexpressão inesperada em diferentes tipos de carci-noma.
Exemplo 16: Identificação de Mem-131 como alvo terapêuti-co e diagnóstico para câncer
Mem-131 (SEQ ID NO: 67) é um clone de cDNA recentementeidentificado. Mem-131 é um gene com 2 éxons sobre o cromossoma 15.
De acordo com a invenção, um par de iniciàdor gene-específicopara Mem-131 foi usado em análises de RT-PCR para amplificar cDNA deri-vado de um painel compreensivo de tecidos normais e tumorígenos. A análi-se de RT-PCR revela expressão de transcritos de Mem-131 apenas emPBMCs ativadas normais (Tabela 16, figura. 19A). Nenhuma expressão sig-nificativa foi detectada em qualquer outro tecido de órgão normal. Mais sur-preendentemente, quando amostras de câncer foram investigadas, foramdescobertos níveis altos e significativos de expressão em uma série de tiposde tumor, incluindo câncer de mama (figura 19B), câncer de pulmão (figura19B + C) e carcinoma ovariano (figura 19C).
Tabela 16: Expressão de Mem-131 em tecidos normais e tumorígenos
<table>table see original document page 87</column></row><table>
As investigações revelam Mem-131 de acordo com a invençãocomo marcador diagnóstico e terapêutico para cânceres de pulmão, mama eovariano.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> GANYMED PHARMACEUTICALS AG et al.
<12 0> IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS AO ASSOCIADOS TDMOR PASA DIAGNÓSTICO ETERAPIA
<130> 342-28pct
<140>
<141> 2006-09-06
<150> EP05019786.2<151> 2005-09-12
<160> 73
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 1126
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atatatcaga ccatcagaag gatttgtata aagagtgact ctcctatgaa ggtaaaggcc 60
acccctcttc agttccagtg actgagatac atttttccaa tcctgggggc aaatacagac 120
acagcaagtt ccttcttccc tttggaaatt tggcagctgc cttcaccagt gagcacaaag 180
ccacatttca aaggaaactg acaaattatc cccagctgcc agaagaagaa atcctcactg 240
gacggcttcc tgtttcctgt ggttcattat ctgattggct gcagggatga aagtttttaa 300
gttcatagga ctgatgatcc tcctcacctc tgcgttttca gccggttcag gacaaagtcc 360
aatgactgtg ctgtgctcca tagactggtt catggtcaca gtgcacccct tcatgctaaa 420
caacgatgtg tgtgtacact ttcatgaact acacttgggc ctgggttgcc ccccaaacca 480
tgttcagcca cacgcctacc agttcaccta ccgtgttact gaatgtggca tcagggccaa 540
agctgtctct caggacatgg ttatctacag cactgagata cactactctt ctaagggcac 600
gccatctaag tttgtgatcc cagtgtcatg tgctgccccc caaaagtccc catggctcac 660
caagccctgc tccatgagag tagccagcaa gagcagggcc acagcccaga aggatgagaa 720
atgctacgag gtgttcagct tgtcacagtc cagtcaaagg cccaactgcg attgtccacc 780
ttgtgtcttc agtgaagaag agcataccca ggtcccttgt caccaagcag gggctcagga 840
ggctcaacct ctgcagccat ctcactttct tgatatttct gaggattggt ctcttcacac 900
agatgatatg attgggtcca tgtgatcctc aggtttgggg tctcctgaag atgctatttc 960
tagâattagt atatagtgta caaatgtctg acaaataagt gctcttgtga ccctcatgtg 1020
agcacttttg agaaagagaa acctatagca acttcatgaa ttaagccttt ttctatattt 1080
ttatattcat gtgtaaacaa aaaataaaat aaaattctga tcgcat 1126
<210> 2
<211> 212
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2Met Lys vai Phe Lys Phe Ile Gly Leu Met Ile Leu Leu Thr Ser Ala1 5 10 15
Phe Ser Ala Gly Ser Gly Gln ser Pro Met Thr Val Leu Cys Ser lie20 25 30
Asp Trp Phe Met vai Thr Val His Pro Phe Met Leu Asn Asn Asp vai35 40 45
Cys vai His Phe His Glu Leu His Leu Gly Leu Gly Cys Pro Pro Asn50 55 60
His Val Gln Pro His Ala Tyr Gln Phe Thr Tyr Arg Val Thr Glu Cys65 70 75 80
Gly lie Arg Ala Lys Ala vai Ser Gln Asp Met vai lie Tyr Ser Thr85 90 95
Glu Ile His Tyr ser Ser Lys Gly Thr Pro Ser Lys Phe Val Ile Pro100 105 110
vai Ser Cys Ala Ala Pro Gln Lys Ser Pro Trp Leu Thr Lys Pro Cys115 120 125
Ser Met Arg vai Ala Ser Lys Ser Arg Ala Thr Ala Gln Lys Asp Glu130 135 140
Lys Cys Tyr Glu vai Phe ser Leu Ser Gln ser ser Gln Arg Pro Asn145 150 155 160
Cys Asp Cys Pro Pro Cys Val Phe ser Glu Glu Glu His Thr Gln Val165 170 175
Pro Cys His Gln Ala Gly Ala Gln Glu Ala Gln Pro Leu Gln Pro Ser180 185 190
His Phe Leu Asp Ile Ser Glu Asp Trp ser Leu His Thr Asp Asp Met195 200 205
Ile Gly ser Met210
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 3
aaatttggca gctgccttca c
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 4
cgatgccaca ttcagtaaca c 21
<210> 5
<211> 2582
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atccctgcag tggaagtgag gaggaagaaa ggtgaactcc ttttctcaag cacttctgct 60ctcctctacc agaatcactc agaatgcttc ccgggtgtat attcttgatg attttactca 120ttcctcaggt taaagaaaag ttcatccttg gagtagaggg tcaacaactg gttcgtccta 180aaaagcttcc tctgatacag aagcgagata ctggacacac ccatgatgat gacatactga 240aaacgtatga agaagaattg ttgtatgaaa taaaactaaa tagaaaaacc ttagtccttc 300atcttctaag atccagggag ttcctaggct caaattacag tgaaacattc tactccatga 360aaggagaagc gttcaccagg catcctcaga tcatggatca ttgtttttac caaggatcca 420tagtacacga atatgattca gctgccagta tcagtacgtg taatggtcta aggggattct 480tcagaataaa cgaccaaaga tacctcattg aaccagtgaa atactcagat gagggagaac 540atttggtgtt caaatataac ctgagggtgc cgtatggtgc caattattcc tgtacagagc 600ttaattttac cagaaaaact gttccagggg ataatgaatc tgaagaagac tccaaaataa 660aaggcatcca tgatgaaaag tatgttgaat tgttcattgt tgctgatgat actgtgtatc 720gcagaaatgg tcatcctcac aataaactaa ggaaccgaat ttggggaatg gtcaattttg 780tcaacatgat ttataaaacc ttaaacatcc atgtgacgtt ggttggcatt gaaatatgga 840cacatgaaga taaaatagaa ctatattcaa atatagaaac taccttattg cgtttttcat 900tttggcaaga aaagatcctt aaaacacgga aggattttga tcatgttgta ttactcagtg 960ggaagtggct ctactcacat gtgcaaggaa tttcttatcc agggggtatg tgcctgccct 1020attattccac cagtatcatt aaggatcttt tacctgacac aaacataatt gcaaacagaa 1080tggcacatca actggggcat aaccttggga tgcagcatga cgagttccca tgcacctgtc 1140cttcaggaaa atgcgtgatg gacagtgatg gaagcattcc tgcactgaaa ttcagtaaat 1200gcagccaaaa ccaataccac cagtacttga aggattataa gccaacatgc atgctcaaca 1260ttccatttcc ttacaatttt catgatttcc aattttgtgg aaacaagaag ttggatgagg 1320
gtgaagagtg tgactgtggc cctgctcagg agtgtactaa tccttgctgt gatgcacaca 1380catgtgtact gaagccagga tttacttgtg cagaaggaga atgctgtgaa tcttgtcaga 1440taaaaaaagc agggtccata tgcagaccgg cgaaagatga atgtgatttt cctgagatgt 1S00
gcactggcca ctcgcctgcc tgtcctaagg accagttcag ggtcaatgga tttccttgca 1560
agaactcaga aggctactgt ttcatgggga aatgtccaac tcgtgaggat cagtgctctg 1620
aactatttga tgatgatgca atagagagtc atgatatctg ctacaagatg aatacaaaag 1680
gaaataaatt tggatactgc aaaaacaagg aaaacagatt tcttccctgt gaggagaaag 1740
atgtcagatg tggaaagatc tactgcactg gaggggagct ttcctctctc cttggagaag 1800
acaagactta tcaccttaag gatccccaga agaatgctac tgtcaaatgc aaaactattt 1860
ttttatacca tgattctaca gacattggcc tggtggcgtc aggaacaaaa tgtggagagg 1920
gaatggtgtg caacaatggt gaatgtctaa acatggaaaa ggtctatatc tcaaccaatt 1980
gcccctctca gtgcaatgaa aatcctgtgg atggccacgg actccagtgc cactgtgagg 2040
aaggacaggc acctgtagcc tgtgaagaaa ccttacatgt taccaatatc accatcttgg 2100
ttgttgtgct tgtcctggtt attgtcggta tcggagttct tatactatta gttcgttacc 2160
gaaaatgtat caagttgaag caagttcaga gcccacctac agaaaccctg ggagtggaga 2220
acaaaggata ctttggtgat gagcagcaga taaggactga gccaatcctg ccagaaattc 2280
atttcctaaa taaacctgca agtaaagatt caagaggaat cgcagatccc aatcaaagtg 2340
ccaagtgagc ttgaagttgg atatccaaaa tggccgtgca agcttaggct ggggattctg 2400
gatgcaacgt ctttacaacc ttacctagat atctgctact cacatttttg gtagtgtttc 2460
aaacgttctt tatccagaca gacaatgttt aagagaaaca acttatttct gttaatattt 2520
accggtagaa ttcacaccct ctatcataaa catatgctgc agaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580
aa 2582
<210> 6
<211> 754
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Leu Pro Gly Cys Ile Phe Leu Met Ile Leu Leu Ile Pro Gln Val1 5 10 15
Lys Glu Lys Phe Ile Leu Gly Val Glu Gly Gln Gln Leu Val Arg Pro20 25 30
Lys Lys Leu Pro Leu Ile Gln Lys Arg Asp Thr Gly His Thr His Asp35 40 45
Asp Asp Ile Leu Lys Thr Tyr Glu Glu Glu Leu Leu Tyr Glu Ile Lys50 55 60
Leu Asn Arg Lys Thr Leu Val Leu His Leu Leu Arg Ser Arg Glu Phe65 70 75 80Leu Gly Ser Asn Tyr ser Glu Thr Phe Tyr Ser Met Lys Gly Glu Ala85 90 95
Phe Thr Arg His Pro Gln Ile Met Asp His Cys Phe Tyr Gln Gly ser100 105 110
Ile Val His Glu Tyr Asp Ser Ala Ala Ser Ile Ser Thr Cys Asn Gly115 120 125
Leu Arg Gly Phe Phe Arg Ile Asn Asp Gln Arg Tyr Leu Ile Glu Pro130 135 140
vai Lys Tyr Ser Asp Glu Gly Glu His Leu vai Phe Lys Tyr Asn Leu145 150 155 160
Arg vai Pro Tyr Gl^ Ala Asn Tyr ser Cys Thr Glu Leu Asn Phe Thr
170
175
Arg Lys Thr vai Pro Gly Asp Asn Glu Ser Glu Glu Asp Ser Lys Ile180 185 190
Lys Gly Ile His Asp Glu Lys Tyr vai Glu Leu Phe Ile Val Ala Asp195 200 205
Asp Thr vai Tyr Arg Arg Asn Gly His Pro His Asn Lys Leu Arg Asn210 215 220
Arg Ile Trp Gly Met vai Asn Phe vai Asn Met Ile Tyr Lys Thr Leu225 230 235 240
Asn Ile His vai Thr Leu vai Gly Ile Glu Ile Trp Thr His Glu Asp245 250 255
Lys Ile Glu Leu Tyr Ser Asn Ile Glu Thr Thr Leu Leu Arg Phe Ser260 265 270
Phe Trp Gln Glu Lys Ile Leu Lys Thr Arg Lys Asp Phe Asp His vai275 280 285
Val Leu Leu Ser Gly Lys Trp Leu Tyr Ser His vai Gln Gly Ile ser290 295 300
Tyr Pro Gly Gly Met Cys Leu Pro Tyr Tyr ser Thr ser Ile Ile Lys305 310 315 320
Asp Leu Leu Pro Asp Thr Asn Ile Ile Ala Asn Arg Met Ala His Gln325 330 335
Leu Gly His Asn Leu Gly Met Gln His Asp Glu Phe Pro Cys Thr Cys340 345 350ργο ser Gly Lys cys vai Met Asp ser Asp Gly ser Ile Pro Ala Leu355 360 365
Lys Phe ser Lys Cys ser Gln Asn Gln Tyr His Gln Tyr Leu Lys Asp370 375 380
Tvr Lys Pro Thr cys Met Leu Asn Ile Pro Phe Pro Tyr Asn Phe His385 390 395 400
Asp Phe Gln Phe Cys Gly Asn Lys Lys Leu Asp Glu Gly Glu Glu cys405 410 415
Asp Cys Gly Pro Ala Gln Glu cys Thr Asn Pro Cys Cys Asp Ala His420 425 430
Thr cys vai Leu Lys Pro Gly Phe Thr Cys Ala Glu Gly Glu Cys Cys435 440 445
Glu ser cys Gln Ile Lys Lys Ala Gly Ser Ile Cys Arg Pro Ala Lys450 455 460
asp Glu cys Asp Phe Pro Glu Met cys Thr Gly His ser Pro Ala Cys465 470 475 480
Pro LVS Asp Gln Phe Arg vai Asn Gly Phe pro cys Lys Asn ser Glu485 490 495
Glv Tyr cys Phe Met Gly Lys cys Pro Thr Arg Glu Asp Gln cys Ser500 505 510
Glu Leu Phe Asp Asp Asp Ala Ile Glu ser His Asp Ile cys Tyr Lys515 520 525
Met Asn Thr Lys Gly Asn Lys Phe Gly Tyr cys Lys Asn Lys Glu Asn530 535 540
Arg Phe Leu Pro cys Glu Glu Lys Asp vai Arg Cys Gly Lys Ile Tyr545 550 555 560
cys Thr Gly Gly Glu Leu ser ser Leu Leu Gly Glu Asp Lys Thr Tyr565 570 575
His Leu Lys Asp Pro Gln Lys Asn Ala Thr Val Lys cys Lys Thr Ile580 585 590
Phe Leu Tvr His Asp ser Thr Asp Ile Gly Leu vai Ala Ser Gly Thr595 600 605
Lvs Cvs Gly Glu Gly Met vai Cys Asn Asn Gly Glu Cys Leu Asn Met610 615 620Glu Lys vai Tyr Ile ser Thr Asn Cys Pro Ser Gln Cys Asn Glu Asn625 630 635 640
Pro Val Asp Gly His Gly Leu Gln Cys His Cys Glu Glu Gly Gln Ala645 650 655
Pro Val Ala Cys Glu Glu Thr Leu His vai Thr Asn Ile Thr Ile Leu660 665 670
Val vai va7 Leu vai Leu Val Jle Val Gly Ile Gly Val Leu lie Leu675 680 685
Leu vai Arg Tyr Arg Lys Cys Ile Lys Leu Lys Gln Val Gln Ser Pro690 695 700
Pro Thr Glu Thr Leu Gly Val Glu Asn Lys Gly Tyr Phe Gly Asp Glu705 710 715 720
Gln Gln Ile Arg Thr Glu Pro Ile Leu Pro Glu Ile His Phe Leu Asn725 730 735
Lys Pro Ala Ser Lys Asp Ser Arg Gly Ile Ala Asp Pro Asn Gln Ser740 745 750
Ala Lys
<210> 7<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 7
gtgcagaagg agaatgctgt g
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 8
tccacatctg acatctttct c
<210> 9
<211> 1731
<212> DNA
<213> Homo sãpiens
<400> 9
agaaggagga aggacagcac agctgacagc cgtgctcaga cagcttctgg atcccaggctcatctccaca gaggagaaca cacaggcagc agagaccatg gggcccctcc cagccccttc 120
ctgcacacag cgcatcacct ggaaggggct cctgctcaca gcatcacttt taaacttctg 180
gaacccgccc accactgccg aagtcacgat tgaagcccag ccacccaaag tttctgaggg 240
gaaggatgtt cttctacttg tccacaattt gccccagaat cttcctggct acttctggta 300
caaaggggaa atgacggacc tctaccatta cattatatcg tatatagttg atggtaaaat 360
aattatatat gggcctgcat acagtggaag agaaacagta tattccaacg catccctgct 420
gatccagaat gtcacccgga aggatgcagg aacctacacc ttacacatca taaagcgagg 480
tgatgagact agagaagaaa ttcgacattt caccttcacc ttatacttgg agactcccaa S40
gccctacatc tccagcagca acttaaaccc cagggaggcc atggaggctg tgcgcttaat 600
ctgtgatcct gagactctgg acgcaagcta cctatggtgg atgaatggtc agagcctccc 660
tgtgactcac aggttgcagc tgtccaaaac caacaggacc ctctatctat ttggtgtcac 720
aaagtatatt gcaggáccct atgaatgtga aatacggaac ccagtgagtg ccagtcgcag 780
tgacccagtc accctgaatc tcctcccgaa gctgcccatc ccctacatca ccatcaacaa 840
cttaaacccc agggagaata aggatgtctt agccttcacc tgtgaaccta agagtgagaa 900
ctacacctac atttggtggc taaacggtca gagcctcccc gtcagtcccg gggtaaagcg 960
acccattgaa aacaggatac tcattctacc cagtgtcacg agaaatgaaa caggacccta 1020
tcaatgtgaa atacaggacc gatatggtgg cctccgcagt aacccagtca tcctaaatgt 1080
cctctatggt ccagacctcc ccagaattta cccttcattc acctattacc gttcaggaga 1140
aaacctcgac ttgtcctgct tcacggaatc taacccaccg gcagagtatt tttggacaat 1200
taatgggaag tttcagcaat caggacaaaa gctctttatc ccccaaatta ctagaaatca 1260
tagcgggctc tatgcttgct ctgttcataa ctcagccact ggcaaggaaa tctccaaatc 1320
catgacagtc aaagtctctg gtccctgcca tggagacctg acagagtctc agtcatgact 1380
gcaacaactg agacactgag aaaaagaaca ggctgatacc ttcatgaaat tcaagacaaa 1440
gaagaaaaaa actcaatgtt attggactaa ataatcaaaa ggataatgtt ttcataattt 1500
tttattggaa aatgtgctga ttctttgaat gttttattct ccagatttat gaactttttt 1560
tcttcagcaa ttggtaaagt atacttttat aaacaaaaat tgaaatattt gcttttgctg 1620
tctatctgaa tgccccagaa ttgtgaaact attcatgagt attcataggt ttatggtaat 1680
aaagttattt gcacatgttc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1731
<210> 10
<211> 426
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Gly Pro Leu Pro Ala Pro Ser Cys Thr Gln Arg Ile Thr Trp LysGly Leu Leu Leu Thr Ala ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn pro Pro Thr20 25 30
Thr Ala Glu Val Thr Ile Glu Ala Gln pro Pro Lys Val ser Glu Glv35 40 45
Lys Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Pro Glv50 55 60
Tyr Phe Trp Tyr Lys Gly Glu Met Thr Asp Leu Tyr His Tyr lie Ile65 70 75 80
Ser Tyr lie Val Asp Gly Lys Ile Ile Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr ser85 90 95
Gly Arg Glu Thr Val Tyr Ser Asn Ala ser Leu Leu Ile Gln Asn vai100 105 HO
Thr Arg Lys Asp Ala Gly Thr Tyr Thr Leu His lie Ile Lys Arg Gly115 120 125
Asp Glu Thr Arg Glu Glu Ile Arg His Phe Thr Phe Thr Leu Tyr Leu130 135 140
Glu Thr Pro Lys Pro Tyr Ile Ser ser Ser Asn Leu Asn Pro Arg Glu145 150 155 160
Ala Met Glu Ala vai Arg Leu Ile Cys Asp Pro Glu Thr Leu Asp Ala165 170 175
Ser Tyr Leu Trp Trp Met Asn Gly Gln ser Leu Pro Val Thr His Arq180 185 190
Leu Gln Leu Ser Lys Thr Asn Arg Thr Leu Tvr Leu Phe Gly Val Thr195 200 205
Lys Tyr Ile Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Arg Asn Pro Val Ser210 215 220
Ala Ser Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Leu Leu Pro Lys Leu Pro225 230 235 240
Ile Pro Tyr Ile Thr Ile Asn Asn Leu Asn Pro Arg Glu Asn Lys Asp245 250
Val Leu Ala Phe Thr Cys Glu Pro Lys Ser Glu Asn Tyr Thr Tyr Ile260 265 270
Trp Trp Leu Asn Gly Gln ser Leu pro Val Ser Pro Gly Val Lys Arg275 280 285Pro Ile Glu Asn Arg Ile Leu Ile Leu Pro Ser Val Thr Arg Asn Glu290 295 300
Thr Gly Pro Tyr Gln Cys Glu Ile Gln Asp Arg Tyr Gly Gly Leu Arq305 310 315 320
Ser Asn Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro Ara325 330 335
Ile Tyr Pro ser Phe Thr Tyr Tyr Arg ser Gly Glu Asn Leu Asp Leu340 345 350
Ser Cys Phe Thr Glu ser Asn Pro Pro Ala Glu Tyr Phe Trp Thr Ile355 360 365
Asn Gly Lys Phe Gln Gln Ser Gly Gln Lys Leu Phe Ile Pro Gln Ile370 375 380
Thr Arg Asn His Ser Gly Leu Tyr Ala Cys ser Val His Asn Ser Ala385 390 395 400
Thr Gly Lys Glu Ile Ser Lys Ser Met Thr Val Lys Val Ser Gly Pro405 410 415
Cys His Gly Asp Leu Thr Glu Ser Gln Ser420 425
<210> 11<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 11
ctcctcyatg gtccagacct c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 12
gttgcagtca tgactgagac tc 22
<210> 13
<211> 1634
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
atgacagtga ctccacagta tctaccagaa tacaagggca agcatccaaa atgtgactca 60ctggtggtgt tccgcaatgt gtgcgtctgt gtgtccaccg cgacaggcat cagtacattg 120
gatcagagtg tcgctttcag ttgtaacgga cttcatcaca tcacaaattg tactcgttct 180
catcctttta agaaagttca gacccaggaa aatttccata gtaccttaat gaaaaagata 240
gaaatcagtg ggacgtgtct ttcctttcat ctccttttcg gcttggaaat cagaatgaga 300
aggattgttt ttgctggtgt tatcttattc cgcctcttag gtgttatctt attccgcctc 360
ttaggtgtta tcttattcgg ccgcttaggt gacctgggaa cctgccagac aaaacctggt 420
cagtactgga aagaagaggt ccacattcaa gatgttggag gtttgatttg cagagcatgc 480
aatctttcac tgcccttcca tggatgtctt ttagacctgg gaacctgcca ggcagaacct 540
ggtcagtact gtaaagaaga ggtccacatt caaggtggca ttcaatggta ttcagtcaaa 600
ggctgcacaa agaacacatc agagtgcttc aagagtactc tcgtcaagag aattctgcaa 660
ctgcatgaac ttgtaactac tcactgctgc aatcattctt tgtgcaattt ctgagtcagt 720
ggcccatatc taaaatgctt ggcagatcaa tcagtctcga agcctgacct ggctatcaca 780
aaatgatggc tattgtcaat tagcccactt cagaaacctc agacccttgt aggtagaagg 840
aattttgatc tgaaattgac tttggttttc aatattccca atatctcccc caccacctcc 900
aactcatctg agaaatagcc ctttcaacac catttctctc ctctcctcct tctgcttaat 960
ttaccttcct accacaaggc tacaaagaag gaaaaatgtt agtgattctc caagtcaaac 1020
taggcatgtc acctctaact actttcattt ccctcaataa ttccatactc caaaatatgg 1080
ttacaaatgt ttcacaagac agcaagtgac ctgagaatat tcatttggtt tccaaagcaa 1140
actgccttgc tcctttgggg tgatttatgg tatagaagaa actgacttaa catatactat 1200
agggaaaaaa taagccatga atcagcaagc caggcctgcg ggaaaagtat gaacccaaac 1260
aggaaagggc tgaggcaggt ggtagggctg gcacttattt cttccatctg cctcagagtt 1320
tatccaaatt ttgaattttc cgtaccttaa ccatgcctaa atgctttggc ttgttcaatt 1380
ttggcagatt aagcagttca aggtaagcag agaagtaagt tcccaaccac aaggaattta 1440
aaaggagtag gaaçgtactt tgaactacat ttcccatttt gcgatcatta cgtcttctat 1500
tacaatgccc tactttggca gcatgaagag tactgcatta atttaattta atttaaaatt 1560
taatttaaaa ctgtctttct ctgtattttc aggagtttga aaattcaaaa aataaataat 1620
aaatgtcaat aaaa 1634
<210> 14
<211> 237
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Thr Val Thr Pro Gln Tyr Leu Pro Glu Tyr Lys Gly Lys His Pro
Lys Cys Asp ser Leu vai Val Phe Arg Asn vai Cys Val Cys Val Ser20 25 30Thr Ala Thr Gly Ile ser Thr Leu Asp Gln Ser vai Ala Phe ser Cys35 40 45
Asn Gly Leu His His Ile Thr Asn Cys Thr Arg Ser His Pro Phe Lys50 55 60
Lys vai Gln Thr Gln Glu Asn Phe His Ser Thr Leu Met Lys Lys Ile65 70 75 80
Glu Ile Ser Gly Thr Cys Leu Ser Phe His Leu Leu Phe Gly Leu Glu85 90 95
Ile Arg Met Arg Arg Ile Val Phe Ala Gly Val Ile Leu Phe Arg Leu100 105 110
Leu Gly Val lie Leu Phe Arg Leu Leu Gly Val Ile Leu Phe Gly Arg115 120 125
Leu Gly Asp Leu Gly Thr Cys Gln Thr Lys Pro Gly Gln Tyr Trp Lys130 135 140
Glu Glu vai His Ile Gln Asp Val Gly Gly Leu Ile Cys Arg Ala Cys145 150 155 160
Asn Leu ser Leu Pro Phe His Gly Cys Leu Leu Asp Leu Gly Thr Cys165 170 175
Gln Ala Glu Pro Gly Gln Tyr Cys Lys Glu Glu vai His Ile Gln Gly180 185 190
Gly Ile Gln Trp Tyr Ser vai Lys Gly Cys Thr Lys Asn Thr ser Glu195 200 205
Cys Phe Lys Ser Thr Leu vai Lys Arg Ile Leu Gln Leu His Glu Leu210 215 220
vai Thr Thr His Cy ~ Asn His Ser Leu Cys Asn Phe
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 15
gacaaaacct ggtcagtact g
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
225
235<400> 16
cccattgaat gccaccttga atg 23
<210> 17
<211> 744
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
atcaggttca acgcagtgac tgctcagtag aagccatggc tcgcagacac tgcttctcct 60actggttact ggtatgctgg ttggtggtaa ctgtggcaga aggacaagaa gaggtattta 120cgcttcctgg agattcacaa aataatgcgg acgctaccga ctgccagatc tttacactca 180cccctccacc tgccccgagg agtccggtca caagggccca gcccatcaca aagacàccca 240ggtgtccctt ccattttttt ccacgaaggc ccagaatcca ttttaggttt ccaaacagac 300ctttcgtccc ttcaaggtgt aaccaccgtt ttccattcca gccattttat tggccacacc 360gttaccttac ttataggtat ttccccagaa gaagactcca gagaggaagc tcatctgagg 420aaagctgaga gggaagagaa acccaaacat actgaagcaa aaaaaagcct atccttcaga 480aaaaagcaac aaaaagattt ctgttttatc tttcgaaact aaaactattg gatttgaaga 540ttaagtatcc taaacatcac tgactagaaa ctgttctctt tgtcagcagt gáagatattg 600gatcataggt tattgatggt tgcaaaattg gacaataacc acgttatttt tatcctcaac 660ctcttatggt cacaggatat ttatgcaaat aaaatcttta aatgggaaaa aaaaaaaaaa 720aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 744
<210> 18
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18 .
Met Ala Arg Arg His Cys Phe Ser Tyr Trp Leu Leu Val cys Trp Leu1 5 10 15
Val Val Thr Val Ala Glu Gly Gln Glu Glu Val Phe Thr Leu Pro Gly20 25 30
Asp Ser Gln Asn Asn Ala Asp Ala Thr Asp Cys Gln Ile Phe Thr Leu35 40 45
Thr pro Pro Pro Ala Pro Arg Ser Pro vai Thr Arg Ala Gln Pro Ile50 55 60
Thr Lys Thr Pro Arg Cys Pro Phe His Phe Phe Pro Arg Arg Pro Arg65 70 75 80Ile His Phe Arg Phe Pro Asn Arg Pro Phe vai Pro Ser Arg Cys Asn85 90 95
His Arg Phe Pro Phe Gln Pro Phe Tyr Trp Pro His Arg Tyr Leu Thr100 105 110
Tyr Arg Tyr Phe Pro Arg Arg Arq Leu Gln Arg Gly Ser Ser ser Glu115 120 125
Glu Ser130
<210> 19<211> 21<212> DNA<213> Seqüência artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 19taactgtggc agaaggacaa g 21<210> 20<211> 21<212> DNA<213> Seqüência artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 20agatgagctt cctctctgga g 21<210> 21<211> 1955<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 21
acagaagcgc gcagagtccc atcctgccac gccacgagga gagaagaagg aaagatacag 60
tgttaggaaa gagacctccc tcgcccctac gccccgcgcc cctgcgcctc gçttcagcct 120
caggacagtc ctgccgggac ggtgagcgca ttcagcaccc tggacagcac cgcggttgcg 180
ctgcctccag ggcggccccg ggctgctcct gctccgcaga gctacgccct ccccccgggt 240
gccccggacc ctgcacttgc cgccgctttc ctcgcgctgc tctggacctt gctagccggc 300
tctgcacctc ccagaagccg tgggcgcgcc gctcagctgc tccatcgcct cactttccca 360
ggctcgcgcc cgaagcagag ccatgagaac cccagggtgc ctggcgagcc gctagcgcca 420
tgggccccgg cgaggcgctg ctggcgggtc tcctggtgat ggtactggcc gtggcgctgc 480
tatccaacgc actggtgctg ctttgttgcg cctacagcgc tgagctccgc actcgagcct 540
caggcgtcct cctggtgaat ctgtctctgg gccacctgct gctggcggcg ctggacatgc 600ccttcacgct gctcggtgtg atgcgcgggc ggacaçcgtc ggcgcccggc gcatgccaag 660
tcattggctt cctggacacc ttcctggcgt ccaacgcggc gctgagcgtg gcggcgctga 720
gcgcagacca gtggctggca gtgggcttcc cactgcgcta cgccggacgc ctgcgaccgc 780
gctatgccgg cctgctgctg ggctgtgcct ggggacagtc gctggccttc tcaggcgctg 840
cacttggctg ctcgtggctt ggctacagca gcgccttcgc gtcctgttcg ctgcgcctgc 900
cgcccgagcc tgagcgtccg cgcttcgcag ccttcaccgc cacgctccat gccgtgggct 960
tcgtgctgcc gctggcggtg ctctgcctca cctcgctcca ggtgcaccgg gtggcacgca 1020
gacactgcca gcgcatggac accgtcacca tgaaggcgct cgcgctgctc gccgacctgc 1080
accccagtgt gcggcagcgc tgcctcatcc agcagaagcg gcgccgccac cgcgccacca 1140
ggaagattgg cattgctatt gcgaccttcc tcatctgctt tgccccgtat gtcatgacca 1200
ggctggcgga gctcgtgccc ttcgtcaccg tgaacgccca gtggggcatc ctcagcaagt 1260
gcctgaccta cagcaaggcg gtggccgacc cgttcacgta ctctctgctc cgccggccgt 1320
tccgccaagt cctggccggc atggtgcacc ggctgctgaa gagaaccccg cgcccagcat 1380
ccacccatga cagctctctg gatgtggccg gcatggtgca ccagctgctg aagagaaccc 1440
cgcgcccagc gtccacccac aacggctctg tggacacaga gaatgattcc tgcctgcagc 1500
agacacactg agggcctggc agggctcatc gcccccacct tctaagaagc cctgtggaaa 1560
gggcactggc cctgccacag agatgccact ggggaccccc agacaccagt ggcttgactt 1620
tgagctaagg ctgaagtaca ggaggaggag gaggagaggg ccggatgtgg gtgtggacag 1680
cagtagtggc ggaggagagc tcggggctgg gctgcctggc tgctgggtgg ccccgggaca 174Ó
gtggcttttc ctctctgaac cttagcttcc tcacccttgt tctggggtca tggcgatgct 1800
tcgagacagt gggtagggaa gtgccctgtg tggcatatgg tactcgtggg cgtgctataa 1860
gtgactgctg ttcatgtggg tgaggtggtc actcttgctc agggtctgtt gtgcagccca 1920
gatggacacc tgtttctcca aaaaaaaaaa aaaaa 1955
<210> 22
<211> 363
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Gly Pro Gly Glu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu vai Met vai Leu1 5 10 15
Ala vai Ala Leu Leu ser Asn Ala Leu Val Leu Leu Cys Cys Ala Tyr20 25 30
Ser Ala Glu Leu Arg Thr Arg Ala ser Gly vai Leu Leu Val Asn Leu
35
40
45
Ser Leu Gly His Leu Leu Leu Ala Ala Leu Asp50 55
55
Met Pro Phe Thr Leu60Leu Gly Val Met Arg Gly Arg Thr Pro Ser Ala Pro Gly Ala Cys Gln
65 70 75 80
vai Ile Gly Phe Leu Asp Thr Phe Leu Ala ser Asn Ala Ala Leu ser85 90 95
vai Ala Ala Leu ser Ala Asp Gln Trp Leu Ala Val Gly Phe Pro Leu100 105 no
Arg Tyr Ala Gly Arg Leu Arg Pro Arg Tyr Ala Gly Leu Leu Leu Gly115 120 125
Cys Ala Trp Gly Gln Ser Leu Ala Phe Ser Gly Ala Ala Leu Gly Cvs130 135 140
Ser Trp Leu Gly Tyr Ser Ser Ala Phe Ala Ser Cys Ser Leu Arg Leu145 150 155 160
Pro Pro Glu Pro Glu Arg Pro Arg Phe Ala Ala Phe Thr Ala Thr Leu165 170 175
His Ala vai Gly Phe vai Leu Pro Leu Ala vai Leu Cys Leu Thr Ser180 185 190
Leu Gln Val His Arg vai Ala Arg Arg His Cys Gln Arg Met Asp Thr195 200 205
Val Thr Met Lys Ala Leu Ala Leu Leu Ala Asp Leu His Pro ser vai210 215 220
Arg Gln Arg cys Leu Ile Gln Gln Lys Arg Arg Arg His Arg Ala Thr225 230 235 240
Arg Lys Ile Gly Ile Ala Ile Ala Thr Phe Leu lie Cys Phe Ala Pro245 250 255
Tyr vai Met Thr Arg Leu Ala Glu Leu vai Pro Phe Val Thr Val Asn260 265 270
Ala Gln Trp Gly Ile Leu ser Lys Cys Leu Thr Tyr ser Lys Ala Val275 280 285
Ala Asp Pro Phe Thr Tyr ser Leu Leu Arg Arg Pro Phe Arg Gln vai290 295 300
Leu Ala Gly Met vai His Arg Leu Leu Lys Arg Thr Pro Arg Pro Ala305 310 315 320
Ser Thr His Asp Ser Ser Leu Asp vai Ala Gly Met Val His Gln Leu325 330 335
Leu Lys Arg Thr Pro Arg Pro Ala ser Thr His Asn Gly Ser Val Asp340 345 350
Thr Glu Asn Asp ser Cys Leu Gln Gln Thr His355 360<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 23
ccgtatgtca tgaccaggct g 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 24
aagtcaagcc actggtgtct g 21
<210> 25 <211> 2059 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 agcacagaag gaggaaggac agcacagctg acagccgtac tcaggaagct tctggatcct 60aggcttatct ccacagagga gaacacacaa gcagcagaga ccatggggcc cctctcagcc 120cctccctgca cacagcgcat cacctggaag ggggtcctgc tcacagcatc acttttaaac 180ttctggaatc cgcccacaac tgcccaagtc acgattgaag cccagccacc caaagtttct 240gaggggaagg atgttcttct acttgtccac aatttgcccc agaatcttgc tggctacatt 300tggtacaaag ggcaaatgac atacctctac cattacatta catcatatgt agtagacggt 360caaagaatta tatatgggcc tgcatacagt ggaagagaaa gagtatattc caatgcatcc 420ctgctgatcc agaatgtcac gcaggaggat gcaggatcct acaccttaca catcataaag 480cgacgcgatg ggactggagg agtaactgga catttcacct tcaccttaca cctggagact 540cccaagccct ccatctccag cagcaactta aatcccaggg aggccatgga ggctgtgatc 600ttaacctgtg atcctgcgac tccagccgca agctaccagt ggtggatgaa tggtcagagc 660ctccctatga ctcacaggtt gcagctgtcc aaaaccaaca ggaccctctt tatatttggt 720gtcacaaagt atattgcagg accctatgaa tgtgaaatac ggaacccagt gagtgccagc 780cgcagtgacc cagtcaccct gaatctcctc ccaaagctgt ccaagcccta catcacaatc 840aacaacttaa accccagaga gaataaggat gtcttaacct tcacctgtga acctaagagt 900aagaactaca cctacatttg gtggctaaat ggtcagagcc tccctgtcag tcccagggta 960aagcgaccca ttgaaaacag gatcctcatt ctacccaatg tcacgagaaa tgaaacagga 1020ccttatcaat gtgaaatacg ggaccgatat ggtggcatcc gcagtgaccc agtcaccctg 1080aatgtcctct atggtccaga cctccccagc atttaccctt cattcaccta ttaccgttca 1140ggagaaaacc tctacttgtc ctgcttcgcc gagtctaacc cacgggcaca atattcttgg 1200acaattaatg ggaagtttca gctatcagga caaaagctct ctatccccca aataactaca 1260aagcatagtg ggctctatgc ttgctctgtt cgtaactcag ccactggcaa ggaaagctcc 1320aaatccatca cagtcaaagt ctctgactgg atattaccct gaattctact agttcctcca 1380attccatttt ctcccatgga atcacgaaga gcaagaccca ctctgttcca gaagccctat 1440aagctggagg tggacaactc gatgtaaatt tcatgggaaa acccttgtac ctgacatgtg 1500agccactcag aactcaccaa aatgttcgac accataacaa cagctactca aactgtaaac 1560caggataaca agttgatgac ttcacactgt ggacagtttt tccaaagatg tcagaacaag 1620actccccatc atgataaggc tcccacccct cttaaccgtc cttgctcatg cctgcctctt 1680tcacttggca ggataatgca gtcattagaa tttcacatgt agtagcttct gagggtaaca 1740acagagtgtc agatatgtca tctcaacctc aaacttttac gtaacatctc aggggaaatg 1800tggctctctc catcttgcat acagggctcc caatagaaat gaacacagag atattgcctg 1860tgtgtttgca gagaagatgg tttctataaa gagtaggaaa gctgaaatta tagtagagtc 1920tcctttaaat gcacattgtg tggatggctc tcaccatttc ctaagagata cagtgtaaaa 1980cgtgacagta atactgattc tagcagaata aaacatgtac cacatttgct aaaaaaaaaa 2040aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2059
<210> 26
<211> 419
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met 61y Pro Leu Ser Ala Pro Pro Cys Thr Gln Arg Ile Thr Trp Lys1 5 10 * 15
Gly Val Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30
Thr Ala Gln Val Thr Ile Glu Ala Gln Pro Pro Lys vai Ser Glu Gly35 40 45
Lys Asp vai Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Ala Gly50 55 60
Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Gln Met Thr Tyr Leu Tyr His Tyr Ile Thr65 70 75 80Ser Tyr vai vai Asp Gly Gln Arg lie Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95
Gly Arg Glu Arg Val Tyr Ser Asn Ala ser Leu Leu Ile Gln Asn Val100 105 110
Thr Gln Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Leu His Ile Ile Lys Arg Arg115 120 125
Asp Gly Thr Gly Gly Val Thr Gly His Phe Thr Phe Thr Leu His Leu130 135 140
Glu Thr Pro Lys Pro ser Ile ser ser ser Asn Leu Asn Pro Arg Glu145 150 155 160
Ala Met Glu Ala vai Ile Leu Thr Cys Asp Pro Ala Thr Pro Ala Ala165 170 175
Ser Tyr Gln Trp Trp Met Asn Gly Gln ser Leu Pro Met Thr His Arg180 185 190
Leu Gln Leu ser Lys Thr Asn Arg Thr Leu Phe Ile Phe Gly vai Thr195 200 205
Lys Tyr lie Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu lie Arg Asn Pro vai Ser
210
215
Ala Ser Arg ser Asp Pro vai Thr Leu Asn Leu Leu Pro Lys Leu ser225 230 235 240
Lys Pro Tyr lie Thr lie Asn Asn Leu Asn Pro Arg Glu Asn Lys Asp245 250 255
vai Leu Thr Phe Thr Cys Glu Pro Lys Ser Lys Asn Tyr Thr Tyr Ile260 265 270
Trp Trp Leu Asn Gly Gln Ser Leu Pro vai Ser Pro Arg Val Lys Arg275 280 285
Pro Ile Glu Asn Arg Ile Leu Ile Leu Pro Asn Val Thr Arg Asn Glu290 295 300
Thr Gly Pro Tyr Gln cys Glu Ile Arg Asp Arq Tyr Gly Gly lie Arg305 310 315 320
Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro ser325 330 335
Ile Tyr Pro Ser Phe Thr Tyr Tyr Arg ser Gly Glu Asn Leu Tyr Leu340 345 350Ser Cys Phe Ala Glu Ser Asn Pro Arg Ala Gln Tyr ser Trp Thr Ile355 360 365
Asn Gly Lys Phe Gln Leu Ser Gly Gln Lys Leu Ser Ile Pro Gln Ile370 375 380
Thr Thr Lys His ser Gly Leu Tyr Ala Cys ser vai Arg Asn ser Ala385 390 395 400
Thr Gly Lys Glu Ser ser Lys ser Ile Thr vai Lys Val ser Asp Trp405 410 415
Ile Leu Pro
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 27
gttgttaccc tcagaagcta c 21
<210> 28
<211> 1780
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
agcacagaag gaggaaggac agcacagctg acagccgtac tcaggaagct tctggatcct 60
aggcttatct ccacagagga gaacacacaa gcagcagaga ccatggggcc cctctcagcc 120
cctccctgca cacagcgcat cacctggaag ggggtcctgc tcacagcatc acttttaaac 180
ttctggaatc cgcccacaac tgcccaagtc acgattgaag cccagccacc caaagtttct 240
gaggggaagg atgttcttct acttgtccac aatttgcccc agaatcttgc tggctacatt 300
tggtacaaag ggcaaatgac atacctctac cattacatta catcatatgt agtagacggt 360
caaagaatta tatatgggcc tgcatacagt ggaagagaaa gagtatattc caatgcatcc 420
ctgctgatcc agaatgtcac gcaggaggat gcaggatcct acaccttaca catcataaag 480
cgacgcgatg ggactggagg agtaactgga catttcacct tcaccttaca cctggagact 540
cccaagccct ccatctccag cagcaactta aatcccaggg aggccatgga ggctgtgatc 600
ttaacctgtg atcctgcgac tccagccgca agctaccagt ggtggatgaa tggtcagagc 660
ctccctatga ctcacaggtt gcagctgtcc aaaaccaaca ggaccctctt tatatttggt 720
gtcacaaagt atattgcagg accctatgaa tgtgaaatac ggaacccagt gagtgccagc 780
cgcagtgacc cagtcaccct gaatctcctc catggtccag acctccccag catttaccct 840tcattcacct attaccgttc aggagaaaac ctctacttgt cctgcttcgc cgagtctaac 900ccacgggcac aatattcttg gacaattaat gggaagtttc agctatcagg acaaaagctc 960tctatccccc aaataactac aaagcatagt gggctctatg cttgctctgt tcgtaactca 1020gccactggca aggaaagctc caaatccatc acagtcaaag tctctgactg gatattaccc 1080tgaattctac tagttcctcc aattccattt tctcccatgg aatcacgaag agcaagaccc 1140actctgttcc agaagcccta taagctggag gtggacaact cgatgtaaat ttcatgggaa 1200aacccttgta cctgacatgt gagccactca gaactcacca aaatgttcga caccataaca 1260acagctactc aaactgtaaa ccaggataac aagttgatga cttcacactg tggacagttt 1320ttccaaagat gtcagaacaa gactccccat catgataagg ctcccacccc tcttaaccgt 1380ccttgctcat gcctgcctct ttcacttggc aggataatgc agtcattaga atttcacatg 1440tagtagcttc tgagggtaac aacagagtgt cagatatgtc atctcaacct caaactttta 1500cgtaacatct caggggaaat gtggctctct ccatcttgca tacagggctc ccaatagaaa 1560tgaacacaga gatattgcct gtgtgtttgc agagaagatg gtttctataa agagtaggaa 1620agctgaaatt atagtagagt ctcctttaaa tgcacattgt gtggatggct ctcaccattt 1680cctaagagat acagtgtaaa acgtgacagt aatactgatt ctagcagaat aaaacatgta 1740ccacatttgc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1780
29326PRT
Homo sapiens<400> 29
Met Gly Pro Leu Ser Ala Pro Pro Cys Thr Gln Arg Ile Thr Trp Lys1 5 10 15
Gly Val Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30
Thr Ala Gln vai Thr Ile Glu Ala Gln Pro Pro Lys vai ser Glu Gly35 40 45
Lys Asp vai Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Ala Gly50 55 60
Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Gln Met Thr Tyr Leu Tyr His Tyr Ile Thr65 70 75 80
Ser Tyr vai Val Asp Gly Gln Arg He Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 9Ϊ
<210><211><212><213>
Gly Arg Glu Arg Val Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn vai100 105 110Thr Gln Glu Asp Ala Gly ser Tyr Thr Leu His Ile Ile Lys Arg Arg115 120 125
Asp Gly Thr Gly Gly vai Thr Gly His Phe Thr Phe Thr Leu His Leu130 135 140
Glu Thr Pro Lys Pro ser Ile Ser ser Ser Asn Leu Asn Pro Arg Glu145 150 155 160
Ala Met Glu Ala vai Ile Leu Thr Cys Asp Pro Ala Thr Pro Ala Ala165 170 175
Ser Tyr Gln Trp Trp Met Asn Gly Gln ser Leu Pro Met Thr His Arg180 185 190
Leu Gln Leu Ser Lys Thr Asn Arg Thr Leu Phe Ile Phe Gly vai Thr195 200 205
Lys Tyr Ile Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Arg Asn Pro Val ser210 215 220
Ala Ser Arg ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Leu Leu His Gly Pro Asp225 230 235 240
Leu Pro Ser lie Tyr Pro Ser Phe Thr Tyr Tyr Arg Ser Gly Glu Asn245 250 255
Leu Tyr Leu ser Cys Phe Ala Glu Ser Asn Pro Arg Ala Gln Tyr ser260 265 270
Trp Thr Ile Asn Gly Lys Phe Gln Leu ser Gly Gln Lys Leu Ser lie275 280 285
Pro Gln Ile Thr Thr Lys His ser Gly Leu Tyr Ala Cys Ser Val Arg290 295 300
Asn Ser Ala Thr Gly Lys Glu ser Ser Lys Ser Ile Thr Val Lys vai305 310 315 320
Ser Asp Trp Ile Leu Pro325
<210> 30
<211> 1989
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
attcgggcct aggctcatct ccacagagga gaacacgcag ggagcagaga ccatggggcc 60
cctctcagcc cctccctgca cacagcatat aacctggaaa gggctcctgc tcacagcatc 120
acttttaaac ttctggaacc cgcccaccac agcccaagtc acgattgaag cccagccacc 180aaaagtttct gaggggaagg atgttcttct acttgtccac aatttgcccc agaatcttac 240
tggctacatc tggtacaaag gacaaatcag ggacctctac cattatgtta catcatatgt 300
agtagacggt caaataatta aatatgggcc tgcatacagt ggacgagaaa cagtatattc 360
caatgcatcc ctgctgatcc agaatgtcac ccaggaagac acaggatcct acactttaca 420
catcataaag cgaggtgatg ggactggagg agtaactgga cgtttcacct tcaccttata 480cctggagact cccaaaccct ccatctccag cagcaatttc aaccccaggg aggccacgga 540ggctgtgatc ttaacctgtg atcctgagac tccagatgca agctacctgt ggtggatgaa 600
tggtcagagc ctccctatga ctcacagctt gcagctgtct gaaaccaaca ggaccctcta 660
cctatttggt gtcacaaact atactgcagg accctatgaa tgtgaaatac ggaacccagt 720
gagtgccagc cgcagtgacc cagtcaccct gaatctcctc ccgaagctgc ccaagcccta 780
catcaccatc aataacttaa accccaggga gaataaggat gtctcaacct tcacctgtga 840acctaagagt gagaactaca cctacatttg gtggctaaat ggtcagagcc tcccggtcag 900
tcccagggta aagcgacgca ttgaaaacag gatcctcatt ctacccagtg tcacgagaaa 960
tgaaacagga ccctatcaat gtgaaatacg ggaccgatat ggtggcatcc gcagtgaccc 1020
agtcaccctg aatgtcctct atggtccaga cctccccaga atttaccctt cgttcaccta 1080
ttaccattca ggacaaaacc tctacttgtc ctgctttgcg gactctaacc caccggcaca 1140
gtattcttgg acaattaatg ggaagtttca gctatcagga caaaagcttt ctatccccca 1200
gattactaca aagcatagcg ggctctatgc ttgctctgtt cgtaactcag ccactggcaa 1260
ggaâagctcc aaatccgtga cagtcagagt ctctgactgg acattaccct gaattctact 1320
agttcctcca attccatctt ctcccatgga acctcaaaga gcaagaccca ctctgttcca 1380
gaagccctat aagtcagagt tggacaactc aatgtaaatt tcatgggaaa atccttgtac 1440
ctgatgtctg agccactcag aactcaccaa aatgttcaac accataacaa cagctgctca 1500aactgtaaac aaggaaaaca agttgatgac ttcacactgt ggacagtttt tcccaagatg 1560
tcagaataag actccccatc atgatgaggc tctcacccct cttagctgtc cttgcttgtg 1620
cctgcctctt tcacttggca ggataatgca gtcattagaa tttcacatgt agtataggag 1680
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atctcaggag gaaatgtggc tctctccatc ttgcatacag ggctcccaat agaaatgaac 1800
acagagatat tgcctgtgtg tttgcagaga agatggtttc tataaagagt aggaaagctg 1860aaattatagt agagtcccct ttaaatgcac attgtgtgga tggctctcac catttcctaa 1920
gagatacatt gtaaaacgtg acagtaagac tgattctagc agaataaaac atgtactaca 1980
tttgctaaa iggg
<210> 31
<211> 419
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31Met Gly Pro Leu ser Ala Pro Pro Cys Thr Gln His Ile Thr Trp Lys
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Thr Ala ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn Pro Pro Thr20 25 30
Thr Ala Gln Val Thr Ile Glu Ala Gln Pro Pro Lys Val Ser Glu Gly35 40 45
Lys Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Thr Gly50 55 60
Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Gln Ile Arg Asp Leu Tyr His Tyr vai Thr65 70 75 80
Ser Tyr Val Val Asp Gly Gln Ile Ile Lys Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser85 90 95
Gly Arg Glu Thr Val Tyr ser Asn Ala ser Leu Leu Ile Gln Asn vai100 105 110
Thr Gln Glu Asp Thr Gly Ser Tyr Thr Leu His Ile Ile Lys Arg Gly115 120 125
Asp Gly Thr Gly Gly vai Thr Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Tyr Leu130 135 140
Glu Thr Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser ser Asn Phe Asn Pro Arg Glu145 150 155 160
Ala Thr Glu Ala Val Ile Leu Thr Cys Asp Pro Glu Thr Pro Asp Ala165 170 175
ser Tyr Leu Trp Trp Met Asn Gly Gln Ser Leu Pro Met Thr His Ser180 185 190
Leu Gln Leu Ser Glu Thr Asn Arg Thr Leu Tyr Leu Phe Gly Val Thr195 200 205
Asn Tyr Thr Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Arg Asn Pro Val Ser210 215 220
Ala ser Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Leu Leu Pro Lys Leu Pro225 230 235 240
Lys Pro Tyr Ile Thr Ile Asn Asn Leu Asn Pro Arg Glu Asn Lys Asp245 250 255
vai ser Thr Phe Thr Cys Glu Pro Lys ser Glu Asn Tyr Thr Tyr Ile260 265 270Trp Trp Leu Asn Gly Gln Ser Leu Pro vai Ser Pro Arg Val Lys Ara275 280 285
Arg ílS Glu Asn Ar9 11e Leu 11e Leu Pfo Ser vai Thr Arg Asn Glu290 295 300
Thr Gly Pro Tyr Gln Cys Glu Ile Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Ile Arg305 310 315 320
ser Asp Pro Val Thr Leu Asn vai Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro Arq325 330 335
He Tyr Pro ser Phe Thr Tyr Tyr His ser Gly Gln Asn Leu Tyr Leu340 345 350
Ser Cys Phe Ala Asp ser Asn Pro Pro Ala Gln Tvr Ser Trp Thr Ile355 360 365
Asn Gly Lys Phe Gln Leu ser Gly Gln Lys Leu Ser Ile Pro Gln Ile370 375 380
Thr Thr Lys His ser Gly Leu Tyr Ala Cys Ser Val Arg Asn Ser Ala385 390 395 400
Thr Gly Lys Glu ser Ser Lys ser vai Thr vai Arg vai ser Asp Trp405 410 415
Thr Leu Pro
<210> 32<211> 21<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 32
taccctcaga agctcctata c
<210> 33<211> 20<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 33
cgtgagcgct tcgagatgttcc g
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 34
cctaaccagc tgcccaactg tag 23
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<400> 35
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tggtggtggt ggcaattgtg ggcctctacc gcacaggcaa atcctacctg atgaacaagc 240
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tctggatgtg gtgtgtgccc caccccaaga agccaggcca catcctagtt ctgctggaca 360
ccgagggtct gggagatgta gagaagggtg acaaccagaa tgactcctgg atcttcgccc 420
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agaagctaca agacctgaag aaaaagtact atgaggaacc gaggaagggg atacaggctg 1440
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ctgcacaggc ttcagcaaaa atgttgcagg aaatgcaaag aaagaatgag cagatgatgg 1620aacagaagga gaggagttat caggaacact tgaaacaact gactgagaag atggagaacg 1680acagggtcca gttgctgaaa gagcaagaga ggaccctcgc tcttaaactt caggaacagg 1740agcaactact aaaagaggga tttcaaaaag aaagcagaat aatgaaaaat gagatacagg 1800atctccagac gaaaatgaga cgacgaaagg catgtaccat aagctaaaga ccagagcctt 1860cctgtcaccc ctaaccaagg cataattçaa acaattttag aatttggaac aagcgtcact 1920acatttgata ataattagat cttgcatcat aacaccaaaa gtttataaag gcatgtggta 1980caatgatcaa aatcatgttt tttcttaaaa aaaaaaaaaa gactgtaaat tgtgcaacaa 2040agatgcattt acctctgtat caactcagga aatctcataa gctggtacca ctcaggagaa 2100gtttattctt ccagatgacc agcagtagac aaatggatac tgagcagagt cttaggtaaa 2160agtcttggga aatatttggg cattggtctg gccaagtcta caatgtccca atatcaagga 2220caaccaccct agcttcttag tgaagacaat gtacagttat ccattagatc aagactacac 2280ggtctatgag caataatgtg atttctggac attgcccatg tataatcctc actgatgatt 2340tcaagctaaa gcaaaccacc ttatacagag atctagaatc tctttatgtt ctccagagga 2400aggtggaaga aaccatgggc aggagtagga attgagtgat aaacaattgg gctaatgaag 2460aaaacttctc ttattgttca gttcatccag attataactt caatgggaca ctttagacca 2520ttagacaatt gacactggat taaacaaatt cacataatgc caaatacaca atgtatttat 2580agcaacgtat aatttgcaaa gatggacttt aaaagatgct gtgtaactaa actgaaátaa 2640ttcaattact tattatttag aatgttaaag cttatgatag tcttttctaa ttcttaacac 2700tcatacttga aatctttccg agtttcccca gaagagaata tgggattttt tttgacattt 2760ttgacccatt taataatgct cttgtgttta cctagtatat gtagactttg tcttatgtgt 2820caaaagtcct aggaaagtgg ttgatgtttc ttatagcaat taaaaattat ttttgaactg 2880a 2881
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Asn ser Ile Gly Thr Ile Asn Gln Gln Ala Met Asp Gln Leu Tyr Tyr130 135 140
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150
160
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Asp Phe vai Trp Thr Leu Arg Asp Phe ser Leu Asp Leu Glu Ala Asp180 185 190
Gly Gln Pro Leu Thr Pro Asp Glu Tyr Leu Thr Tyr Ser Leu Lys Leu195 200 205
Lys Lys Gly Thr ser Gln Lys Asp Glu Thr Phe Asn Leu Pro Arg Leu210 215 220
Cys Ile Arg Lys Phe Phe Pro Lys Lys Lys Cys Phe vai Phe Asp Arg225 230 235 240
Pro vai His Arg Arg Lys Leu Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gln Asp Glu245 250 255
Glu Leu Asp Pro Glu Phe Val Gln Gln Val Ala Asp Phe Cys ser Tyr260 265 270
lie Phe Ser Asn Ser Lys Thr Lys Thr Leu ser Gly Gly Ile Gln Val275 280 285
Asn Gly Pro Arg Leu Glu ser Leu Val Leu Thr Tyr vai Asn Ala Ile290 295 300
ser ser Gly Asp Leu Pro Cys Met Glu Asn Ala Val Leu Ala Leu Ala305 310 315 320
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Leu Leu Asp Leu Nis Arg Asp ser Glu Arg Glu Ala Ile Glu Val Phe355 360 365
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<400> 39
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<210> 40
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<212> PRT
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<400> 40
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<210> 41
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<210> 44<211> 17<212> DNA<213> Seqüência artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 44
ttcatccaac acgcagg 17
<210> 45<211> 875<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 45
ggttgctaag gagtgggtgc ctcagaatca ggctgcaatg ggcattgtct gtgcacaatg 60ttcctttatt ctgctgctgt ccataataag ggctcgtcca cctcccttcc tcttctgccc 120attgagcagt caaagaactg aaagtcctta taagcctgtg cacctgggcc tgggccctac 180agataaggta gctgctattg ctatggcccg catcattgac ctggtgccct gggacgatgg 240ctccacacat gtgtatgcct ccccggccat cctgcttccc atggagcggc agcgcaacca 300gctggcgggc gtgaagcagc agctctacca cccagccctg cccaccctgc gccacatgga 360cagggacacc gtcaaggcct gccttcctga tgagcactgc cagtccacca cctactgccg 420caaagatgaa tttgacaacg cccattttac actccttggg gtccccaaca aacccctgca 480gtgtttggac atcaccgcca caggccagaa gcttcgcaac aggtaccacg agggaaagct 540ggcgcccatc gcgccaggca tcaaccgagt ggactggccc tgcttcacgc gcgccatcga 600ggactggtcc cacttcgtgt cctcggccgg ggagttcaag ctgccttgcc tgaggaagcg 660agcggagggt ctcagcggct acgcggtgcg gtacttgaag cccgacgtga cccagacctg 720gcggtactgc ctcaaccaga accccagcct ggaccgctac ggacagaagc ccctgccttt 780cgactccctg aacactttcc gaagcttcgg ctccagctac agtcgtgtca actacctgac 840cccctggcat taatctctgg aaaggaggct gactc 875
<210> 46
<211> 271
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
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Asp Lys vai Ala Ala Ile Ala Met Ala Arg Ile Ile Asp Leu Val Pro50 55 60
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Lys Ala Cys Leu Pro Asp Glu His Cys Gln Ser Thr Thr Tyr Cys Arg115 120 125Lys Asp Glu Phe Asp Asn Ala His Phe Thr Leu Leu Gly Val Pro Asn130 135 140
Lys Pro Leu Gln Cys' Leu Asp Ile Thr Ala Thr Gly Gln Lys Leu Arg145 150 155 160
Asn Arg Tyr His Glu Gly Lys Leu Ala Pro Ile Ala Pro Gly Ile Asn165 170 175
Arg vai Asp Trp Pro Cys Phe Thr Arg Ala Ile Glu Asp Trp ser His180 185 190
Phe vai Ser Ser Ala Gly Glu Phe Lys Leu Pro Cys Leu Arg Lys Arg195 200 205
Ala Glu Gly Leu Ser Gly Tyr Ala Val Arg Tyr Leu Lys Pro Asp vai210 215 220
Thr Gln Thr Trp Arg Tyr Cys Leu Asn Gln Asn Pro Ser Leu Asp Arg225 230 235 240
Tyr Gly Gln Lys Pro Leu Pro Phe Asp Ser Leu Asn Thr Phe Arg Ser245 250 255
Phe Gly Ser ser Tyr ser Arg vai Asn Tyr Leu Thr Pro Trp His260 265 270
<210> 47<211> 22<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo<400> 47
tccaccacct actgccgcaa ag
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Seqüência artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: oligonucleotideo
<400> 48
accctccgct cgcttcctca
<210> 49
<211> 956
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
ggttgctaag gagtgggtgc ctcagaatca ggctgcaatg ggcattgtct gtgcacaatgttcctttatt ctgctgctgt ccataataag ggctcgtcca cctcccttcc tcttctgccc 120attgagcagt caaagaactg aaagtcctta taagcctgtg cacctgggcc tgggccctac 180agataaggta gctgctattg ctatggcccg catcattgac ctggtgccct gggacgatgg 240ctccacacat gtgtatgcct ccccggccat cctgcttccc atggagcggc agcgcaacca 300gctggcgggc gtgaagcagc agctctacca cccagccctg cccaccctgc gccacatgga 360cagggacacc gtcaaggcct gcçttcctga tgagcactgc cagtccacca cctactgccg 420caaagatgaa tttgacaacg cccattttac actccttggg gtccccaaca aacccctgca 480gtgtttggac atcaccgcca caggccagaa gcttcgcaac aggtaccacg agggaaagct 540ggcgcccatc gcgccaggca tcaaccgagt ggactggccc tgcttcacgc gcgccatcga 600ggactggtcc cacttcgtgt cctcggccgg ggagttcaag ctgccttgcc tgaggaagcg 660agcggagggt ctcagcggct acgcggtgcg gtacttgaag cccgacgtga cccagacctg 720gcggcaggaa gccctgtgtg gggcgtgggc agggcgtccg tgctcccccg actcaccgcg 780cccctatccc tgctgcccgc ctcagtactg cctcaaccag aaccccagcc tggaccgcta 840cggacagaag cccctgcctt tcgactccct gaacactttc cgaagcttcg gctccagcta 900cagtcgtgtc aactacctga ccccctggca ttaatctctg gaaaggaggc tgactc 956
<210> 50<211> 298<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 50
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Lys Asp Glu Phe asd Asn Ala His Phe Thr Leu Leu Gly Val Pro Asn130 135 140
Lys Pro Leu Gln Cys Leu Asp Ile Thr Ala Thr Gly Gln Lys Leu Arg145 150 155 160
Asn Arg Tyr His Glu Gly Lys Leu Ala Pro Ile Ala Pro Gly Ile Asn165 170 175
Arg vai Asp Trp Pro Cys Phe Thr Arg Ala Ile Glu Asp Trp Ser His180 185 190
Phe vai Ser ser Ala Gly Glu Phe Lys Leu Pro Cys Leu Arg Lys Arg195 200 205
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Thr Gln Thr Trp Arg Gln Glu Ala Leu Cys Gly Ala Trp Ala Gly Arg225 230 235 240
Pro Cys ser Pro Asp Ser Pro Arg Pro Tyr Pro Cys Cys Pro Pro Gln245 250 255
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Lys Lys Leu Pro Leu lie Gln Lys Arg Asp Thr Gly His Thr His Asp35 40 45
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115 120 125
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vai Lys Tyr ser Asp Glu Gly Glu His Leu vai Phe Lys Tyr Asn Leu145 150 155 160
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Arg lie Trp Gly Met vai Asn Phe Val Asn Met Ile Tyr Lys Thr Leu225 230 235 240
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
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<212> PRT
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<400> 59
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6012PRT
Homo sapiens
<210><211><212><213>
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<210> 61
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<212> DNA
<213> Homo sapiens<400> 61
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aaacctccta caaaagagag 500
<210> 62
<211> 2256
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 62
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ggctgtgggg gcgctggtcc catcacggcc tttttcataa agcacatggt gccaactgtt 240
agtggatcta ccatcctgga ggatgatagc cctcttctaa cagctccact aggcagtgcc 300
ccagtaggga ctctgtgtag gcgccctcac cccacatttc ccttccacac tgccctagca 360
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<210> 63
<211> 751
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
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Ala Ala Leu Val Leu Ile Arg Arg Ser Pro Arg Ser Arg Gln Ser Arg20 25 30Asp Pro Ala Cys Ala Thr Gln Leu Arg Gly Leu Gln Gly Ala Leu Leu35 40 45
Leu Leu Ser Leu Ser Leu Gly Pro Ser Leu Gln Cys Gly Cys Gly Gly50 55 60
Ala Gly Pro Ile Thr Ala Phe Phe Ile Lys His Met Val Pro Thr vai65 70 75 80
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145
150
160
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vai Ala Leu Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro225 230 235 240
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Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Phe ser Pro Asp Gly Ser340 345 350
Arg Leu Tyr Thr His Gln Val Ala Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu355 360 365
Leu Leu Tyr Gly Ala Arg Gln Tyr Asp Gln Gly vai Asp Leu Trp ser370 375 380
vai Gly Cys Ile Met Gly Glu Leu Leu Asn Gly ser Pro Leu Phe Pro385 390 395 400
Gly Lys Asn Asp Ile Glu Gln Leu Cys Tyr vai Leu Arg Ile Leu Gly405 410 415
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Asn Lys Ile Ser Phe Lys Glu Gln Val Pro Met Pro Leu Glu Glu Val435 440 445
Leu Pro Asp vai ser Pro Gln Ala Leu Asp Leu Leu Gly Gln Phe Leu450 455 460
Leu Tyr Pro Pro His Gln Arg Ile Ala Ala ser Lys Leu Trp Glu Pro465 470 475 480
Gln Glu Arg Gly Lys Ala Asp Phe Gly Val Lys Gln Ser Phe Leu vai485 490 495
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Arg Leu Gly Gly Pro Ala Pro Lys Ala His Pro Gly Pro Pro His Ile530 535 540
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Glu Leu Ile Arg Pro Phe Ile Leu Glu Gly Pro Cys Glu Glv Trp Ser565 570 575Arg Gly Arg Gly His Val Pro Ser Gln Glu Tyr Glu Asn lie Gln ser580 585 590
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<210> 64
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
tcagaccgac agtcaggcag aagcagggcc cccggtctgt ctaggcttca ggatgcctaa 60gaagctctcg gtgggcagcc agtgctccag aaccaggggg ttgttgtggg caggtctctg 120gggaggcctg aggggccaca cggtgtcctg ggtgtggggt ctgcatctac atacgactca 180taggcacctg ccattggggc gatttgtgat ggtttaggga aacagggtct gcccttggat 240gggctggcct acagtcaggg gccttccttg tctgtcttac tttccccgct ctgccagagt 300gaacccaagg atgccgccag cctcacccca gtgggtggca gttacgccgg catggaactc 360agactcaccg gcacgcatga cttccaaccg tccacacatc tttgcaccca cagtatctgc 420ttcagagaat gtattctaaa taataaaaat cataa 455
<210> 65
<211> 746
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 65cccactttgc tggatgaagc tctgtgaact cttcctggtt cttagtactg cctaattcat 60gaatccttct ttgctcaaat gaactcaaag ttaatttaaa gtttttattc taacatgaga 120CtCtttCtCC catgagactt tgcatgaggg agaacagtcg ctaattaaca gccagttctt 180gaaatcacgc agtcctgaaa tccagctgat gctgctcagc agagaagcag atgtttggag 240gttaaaacaa agtcacaagt ctgacccaca ctcaaaggga gaagattatg caagagcaaa 300agcacgagat ggaaaccatg gggccatctt atagtctgtc tgccggagaa agatgaacac 360aaatcctcgt gcagaaaagt gtgacactaa aagaaccaac ctgatactac tatccttaga 420aaagcctgca tacaaggttg gctgtcatct gggaatgtag gtgatcaaga gttctctcca 480ctgacataaa ctttgtttaa ataataagga tgactcattg tgactagact atgcaaataa 540tgggatgtgt gttaaacatc tcctttcctt ctgggagtct ggaattttgg tgtatgctaa 600acagtgggtg cctgcaagac cagcctcaaa taaaaaccct gggcactgag tctctaaaaa 660gactcccagt aggcaatatt tcacacgtgt tctcacaaac ttactgctgg aggaattatg 720cacgccttgc atgactctat tggaaa 746
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
gcacgagaga tgttataata attttcaaaa gaaggtaaaa tcatgactca tatggatata 60aaaatgaaca ccttgttatg gattgaactg tgtgccccta aaagatatgt tgaagcctga 120actcccagta cctgagaatg tgaccatgtt tggaaatagt gtctttgcag gtttaatcaa 180gttaagatga ggtcattaga tgggacctaa tttaatatgg ctgatgccct tataagaaga 240gggaattttg gacacagaca tacaaggagg acgccatgtg aagacacagt tggaaaagca 300gggaagagat ggccttgtgt ataaggaggc agagactgga gttatgctgc cacaagccaa 360ggaacaactg gggctacctg agctggaaga ggcgaggaag gattctcccc tagagggttc 420tgagggagcg tggacctgcc aacaacttgg tttcagattt ctagtctcca gaactatgca 480gtaataaatt tctgttgttt taagccaccc agtttgtggc actttgttac gtcagccctg 540tgaaacaaac aaacaaacaa acaaaaaaca agttaaatat tttatttaac tcataatatg 600gaaataggtg aggtgttaca accaattcaa aaaagaagtg aaaaataagc ccaaatgtat 660atagagtaaa ggaatgttga aatgaatgtg caaatggaag caaaactaga ttctcctaca 720atgggacaga aaagtcaatt gaacctctac tggacagaac ataatttgca tgtgtataga 780aa 782
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 67gcaccaggtt tctggtaagg ggcaattttg tgtttgcctg ttctttggga atatcaectg 60
gagatagatg gattcccaga cccaccaaat ctaggtttta gaccaaaaaa gaatgtttta 120
ttattagaat tgagtatatc tcaggtcctc tttcattact acaacacaaa ataaatctgg 180
gggccaggaa cggtggctca cacctgtaat cccagagtgc taggattaca agcaacaagc 240
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gggtttgtgc tcgtggccct aaaaatgaac atgagaaagg cagggagtac ctgcttagtt 360
gcaataggcc ttgtttaggc taaaaátaag ctcgatacct gtattttata tactgtaaag 420
agcattaacc ataacctgcc tgcaacagcc tctgtaggta gaaacaatta tggaggtgtc 480
aagtaagaat aaagagctga taacatcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 525
<210> 68<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 68
Ala Pro Gln Lys Ser Pro Trp Leu Thr Lys Pro1 5 10
<210> 69<211> 13<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 69
Pro Leu Gln Pro Ser His Phe Leu Asp Ile Ser Glu Asp1 5 10
<210> 70<211> 21<212> PRT<213> Homo sapiens<220> siRNA filamento de sentido<220. <221> misc_feature<222> (1) .. (19)<223> base de ribonucleotideo<400> 70
ccaugagagu agccagcaat t 21
<210> 71<211> 21<212> DNA<213> seqüência artificial<220><223> siRNA filamento de sentido<220<221> misc_feature<222> (1) .. (19)<223> base de ribonucleotideo<400> 71
uugcuggcua cucucaugga g
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> siRNA filamento de sentido<220
<221> misc_feature
<222> (1) .. (19)
<223> base de ribonucleotideo
<400> 72
gguucaggac aaaguccaat τ
<210> 73<211> 21<212> DNA<213> seqüência artificiai<220> <223> siRNA filamento de sentido<220. <221> misc_feature<222> (1) .. (19)<223> base de ribonucleotideo<400> 73
uuggacuuug uccugaaccg g

Claims (49)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um agente o qual (I) inibe a expressão ou atividade de um antí-geno associado ao tumor e/ou (II) tem atividade de inibição de tumor e é se-letivo para células expressando ou expressando anormalmente um antígenoassociado ao tumor e/ou (III) quando administrado, aumenta seletivamente aquantidade de complexos entre uma molécula do MHC e um antígeno asso-ciado ao tumor ou uma parte do mesmo, o referido antígeno associado aotumor tendo uma seqüência codificada por um ácido nucleíco o qual é sele-cionado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,- 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado do mesmo,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b) e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente sob (II) causa indução de morte ce-lular, redução no crescimento celular, dano à membrana celular ou secreçãode citocinas.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente sob (I) ou (II) é o ácido nucleíco anti-sentido o qual se hibridiza seletivamente com o ácido nucleíco que codifica oantígeno associado ao tumor.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente sob (I) ou (II) é um anticorpo o qualse liga seletivamente ao antígeno associado ao tumor.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente compreende um ou mais componen-tes selecionados do grupo consistindo em: (i) o antígeno associado ao tumorou uma parte do mesmo, (ii) um ácido nucleíco o qual codifica o antígenoassociado ao tumor ou uma parte do mesmo, (iii) um anticorpo o qual se ligaao antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, (iv) um ácido nu-cleíco anti-sentido o qual se hibridiza especificamente a um ácido nucleícoque codifica o antígeno associado ao tumor, (v) um siRNA dirigido contra umácido nucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor, (vi) uma célulahospedeira a qual expressa o antígeno associado ao tumor ou uma parte domesmo e (viii) complexos isolados entre o antígeno associado ao tumor ouuma parte do mesmo e uma molécula do MHC.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o agente compreende dois ou mais agentesos quais, em cada caso, inibem seletivamente a expressão ou atividade dediferentes antígenos associados ao tumor, os quais são, em cada caso, sele-tivos para células expressando ou expressando anormalmente diferentesantígenos associados ao tumor ou os quais liberam a quantidade de com-plexos entre moléculas do MHC e diferentes antígenos associados ao tumorou partes dos mesmos, com pelo menos um dos referidos antígenos associ-ados ao tumor tendo uma seqüência codificada por um ácido nucleíco o qualé selecionado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,-13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um ou mais componentes selecionados do grupo consistindoem: (i) um antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, (ii) um áci-do nucleíco o qual codifica um antígeno associado ao tumor ou uma parte domesmo, (iii) um anticorpo o qual se liga a um antígeno associado ao tumorou uma parte do mesmo, (iv) um ácido nucleíco anti-sentido o qual se hibri-diza especificamente com um ácido nucleíco que codifica um antígeno asso-ciado ao tumor, (v) um siRNA dirigido contra um ácido nucleíco que codificaum antígeno associado ao tumor, (vi) uma célula hospedeira a qual expressaum antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo e (vi) complexosisolados entre um antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo euma molécula do MHC, o referido antígeno associado ao tumor tendo umaseqüência codificada por um ácido nucleíco o qual é selecionado do grupoconsistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,- 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleíco de (ii) está presente emum vetor de expressão.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira secreta o antígeno as-sociado ao tumor ou a parte do mesmo.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5ou 7, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira expressa, adicio-nalmente, uma molécula do MHC a qual se liga ao antígeno associado aotumor ou à parte do mesmo.
11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira expressa a molécula doMHC e/ou o antígeno associado ao tumor ou a parte do mesmo de uma ma-neira recombinante.
12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10,caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira expressa a molécula doMHC endogenamente.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5,-7, 10 ou 12, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célulaapresentando antígeno.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,-5 ou 7, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclo-nal, quimérico ou humanizado ou é um fragmento de um anticorpo.
15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4,-5, 7 ou 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é acoplado a um agen-te terapêutico ou diagnóstico.
16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de que pode ser usada para otratamento ou prevenção de câncer.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o câncer é um tumor de pulmão, um tumor demama, um tumor de próstata, um melanoma, um tumor de cólon, um tumorgástrico, um tumor pancreático, um tumor de ENT, um carcinoma de célularenal ou um carcinoma cervical, um carcinoma de cólon ou um carcinomamamário.
18. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 -17, caracterizada pelo fato de que o antígeno associado aotumor compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46,-50-60, 63, 68 e 69, uma parte ou derivado das mesmas.
19. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 5-13 e 16-18, caracterizada pelo fato de que está naforma de uma vacina.
20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19,caracterizada pelo fato de que é para uso terapêutico e/ou profilático.
21. Método de diagnóstico ou monitoramento de uma doençadefinida por expressão ou expressão anormal de um antígeno associado aotumor, sendo o referido método caracterizado pelo fato de que compreendedetecção ou determinação da quantidade (i) de um ácido nucleíco o qualcodifica o antígeno associado ao tumor ou de uma parte do mesmo e/ou (ii)do antígeno associado ao tumor ou de uma parte do mesmo e/ou (iii) de umanticorpo ao antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo e/ou (iv)de linfócitos T os quais são específicos ao antígeno associado ao tumor ou auma parte do mesmo em uma amostra biológica isolada de um paciente,com o referido antígeno associado ao tumor tendo uma seqüência codificadapor um ácido nucleíco o qual é selecionado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com rélação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pe-lo fato de que a detecção ou determinação da quantidade compreende (i)contato da amostra biológica com um agente o qual se liga especificamenteao ácido nucleíco que codifica o antígeno associado ao tumor ou à parte domesmo, ao antígeno associado ao tumor ou à parte do mesmo, ao anticorpoou a linfócitos T e (ii) detecção da formação de ou determinação da quanti-dade de um complexo entre o agente e o ácido nucleíco ou a parte do mes-mo, o antígeno associado ao tumor ou à parte do mesmo, o anticorpo ou oslinfócitos T.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o agente o qual se liga especificamente ao ácido nucleíco quecodifica o antígeno associado ao tumor ou à parte do mesmo é um oligonu-cleotídeo ou polinucleotídeo o qual se hibridiza especificamente ao referidoácido nucleíco ou à referida parte do mesmo.
24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o agente o qual se liga especificamente ao antígeno associadoao tumor ou à parte do mesmo é um anticorpo que se liga especificamenteao referido antígeno associado ao tumor ou à referida parte do mesmo.
25. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o agente o qual se liga especificamente ao anticorpo é umaproteína ou peptídeo que se liga especificamente ao referido anticorpo.
26. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o agente o qual se liga especificamente aos linfócitos T é umacélula apresentando o complexo entre o antígeno associado ao tumor ou àparte do mesmo e uma molécula do MHC.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a 26, caracterizado pelo fato de que o referido monitoramento da referidadoença compreende determinação de regressão, curso ou início da referidadoença em uma amostra de um paciente que tem a referida doença ou ésuspeito de ficar enfermo com a referida doença.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pe-lo fato de que compreende detecção ou determinação da quantidade emuma primeira amostra em um primeiro ponto de tempo e em uma outra a-mostra em um segundo ponto de tempo e comparação das duas amostras.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-28, caracterizado pelo fato de que o agente é rotulado de uma maneira de-tectável.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-29, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende fluido corporale/ou tecido corporal.
31. Uso de um agente como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para a preparação deuma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma do-ença definida por expressão ou expressão anormal de um antígeno associa-do ao tumor, o referido antígeno associado ao tumor tendo uma seqüênciacodificada por um ácido nucleíco o qual é selecionado do grupo consistindoem:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,-13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
32. Uso de um anticorpo que se liga ao antígeno associado aotumor ou a uma parte do mesmo e acoplado a um agente terapêutico ou di-agnóstico, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma com-posição farmacêutica para o tratamento, prevenção, diagnóstico ou monito-ramento de uma doença definida por expressão ou expressão anormal doreferido antígeno associado ao tumor, o referido antígeno associado ao tu-mor tendo uma seqüência codificada por um ácido nucleíco o qual é selecio-nado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,-13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
33. Método de acordo com a reivindicação 24 ou uso de acordocom a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um an-ticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado ou é um fragmento de um an-ticorpo.
34. Uso de células T citolíticas ou que liberam citocina, caracte-rizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêuti-ca para o tratamento de um paciente tendo uma doença definida por expres-são ou expressão anormal de um antígeno associado ao tumor, em que asreferidas células T citolíticas ou que liberam citocina são produzidas atravésdo contato de uma amostra contendo células imunorreativas com uma célulahospedeira expressando o referido antígeno associado ao tumor ou umaparte do mesmo, sob condições as quais favorecem a produção de células Tcitolíticas ou que liberam citocina contra o referido antígeno associado aotumor ou à referida parte do mesmo e, em que a referida composição farma-cêutica é para introdução das células T citolíticas ou que liberam citocina nopaciente em uma quantidade adequada para Iise de células expressando oantígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmo, o referido antígenoassociado ao tumor tendo uma seqüência codificada por um ácido nucleíco oqual é selecionado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,-13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
35. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelofato de que a célula hospedeira expressa recombinantemente uma moléculado MHC que se liga ao antígeno associado ao tumor ou a uma parte domesmo.
36. Uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelofato de que a célula hospedeira expressa endogenamente uma molécula doMHC que se liga ao antígeno associado ao tumor ou a uma parte do mesmo.
37. Uso de um agente como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é para a preparação deuma composição para a inibição do desenvolvimento de câncer em um paci-ente.
38. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 21-37, caracterizado pelo fato de que o antígeno associado ao tumorcompreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistin-do em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60,- 63, 68 e 69, uma parte ou derivado das mesmas.
39. Agente, caracterizado pelo fato de que se liga especifica-mente a uma proteína ou polipeptídeo ou a uma parte dos mesmos, a referi-da parte dos mesmos sendo codificada por um ácido nucleíco selecionadodo grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,- 13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
40. Agente de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelofato de que a proteína ou polipeptídeo compreende uma seqüência de ami-noácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18,-22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 e 69, uma parte ou derivado dasmesmas.
41. Agente de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracteriza-do pelo fato de que é um anticorpo.
42. Agente de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humaniza-do ou é um fragmento de um anticorpo.
43. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que se liga seletiva-mente a um complexo de:(i) uma proteína ou polipeptídeo ou uma parte do mesmo e(ii) uma molécula do MHC à qual a referida proteína ou poli-peptídeo ou referida parte dos mesmos se liga, com o referido anticorpo nãose ligando a (i) ou (ii) apenas e a referida proteína ou polipeptídeo sendocodificado por um ácido nucleíco selecionado do grupo consistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
44. Anticorpo de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a proteína ou polipeptídeo compreende uma seqüência deaminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14,18, 22, 26, 29, 31, 36, 40, 42, 46, 50-60, 63, 68 e 69, uma parte ou derivadodas mesmas.
45. Anticorpo de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracteri-zado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizadoou é um fragmento de um anticorpo.
46. Conjugado, caracterizado pelo fato de que é entre um agentecomo definido em qualquer uma das reivindicações 39-42, ou um anticorpocomo definido em qualquer uma das reivindicações 43-45 e um agente tera-pêutico ou diagnóstico.
47. Conjugado de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que o agente diagnóstico ou terapêutico é uma toxina.
48.
Kit para detecção da expressão ou expressão anormal deum antígeno associado ao tumor, caracterizado pelo fato de que compreen-de agentes para detecção ou determinação da quantidade (i) de um ácidonucleíco o qual codifica o antígeno associado ao tumor ou de uma parte domesmo e/ou (ii) do antígeno associado ao tumor ou de uma parte do mesmoe/ou (iii) de anticorpos os quais se ligam ao antígeno associado ao tumor oua uma parte do mesmo e/ou (iv) de células T as quais são específicas paraum complexo entre o antígeno associado ao tumor ou uma parte do mesmose uma molécula do MHC1 o referido antígeno associado ao tumor tendo umaseqüência codificada por um ácido nucleíco o qual é selecionado do grupoconsistindo em:(a) um ácido nucleíco o qual compreende uma seqüência deácido nucleíco selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 5, 9,-13, 17, 21, 25, 28, 30, 35, 39, 41, 45, 49, 61, 62 e 64-67, uma parte ou deri-vado das mesmas,(b) um ácido nucleíco o qual se hibridiza com o ácido nucleícode (a) sob condições estringentes,(c) um ácido nucleíco o qual é degenerado com relação aoácido nucleíco de (a) ou (b), e(d) um ácido nucleíco o qual é complementar ao ácido nucleí-co de (a), (b) ou (c).
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