ES2434945T3 - Identificación de antígenos asociados a tumores para el diagnóstico y la terapia - Google Patents

Identificación de antígenos asociados a tumores para el diagnóstico y la terapia

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Abstract

Composición farmacéutica, que comprende uno o más componentes que se seleccionan de entre el grupo queconsiste en: (i) un anticuerpo que se une a la parte extracelular de un antígeno asociado a un tumor, (ii) un ácido nucleico antisentido que hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica un antígenoasociado a un tumor, y (iii) un ARNpi dirigido contra un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor,presentando dicho antígeno asociado a un tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que seselecciona de entre el grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1, (b) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas, (c) un ácido nucleico degenerado con respecto al ácido nucleico de (a) o (b), y (d) un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c)para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizadoporque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor.

Description

Identificación de antígenos asociados a tumores para el diagnóstico y la terapia.
A pesar de los enfoques interdisciplinarios y el uso exhaustivo de procedimientos terapéuticos clásicos, el cáncer todavía se encuentra entre las principales causas de muerte. Los conceptos terapéuticos más recientes están dirigidos a incorporar el sistema inmunitario del paciente en el concepto terapéutico global utilizando vacunas tumorales recombinantes y otras medidas específicas como la terapia con anticuerpos. Un requisito previo para el éxito de este tipo de estrategias es el reconocimiento de antígenos específicos de tumores o antígenos asociados a tumores o epítopos por parte del sistema inmunitario del paciente cuyas funciones del efector se mejoran mediante una intervención. Las células tumorales se diferencian sustancialmente de sus células de origen no malignas. Estas diferencias se deben a alteraciones genéticas adquiridas durante el desarrollo del tumor y dan como resultado también, entre otras, la formación de estructuras moleculares cualitativa o cuantitativamente alteradas en las células cancerosas. Las estructuras de este tipo asociadas a tumores que son reconocidas por el sistema inmunitario específico del huésped que aloja el tumor se denominan antígenos asociados a tumores. El reconocimiento específico de antígenos asociados a tumores implica mecanismos celulares y humorales que son dos unidades funcionalmente interconectadas: los linfocitos T CD4+ y CD8+ reconocen los antígenos procesados presentados en las moléculas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad) de las clases II y I, respectivamente mientras que los linfocitos B producen moléculas de anticuerpos circulantes que se unen directamente a los antígenos sin procesar. La importancia clínicoterapéutica potencial de los antígenos asociados a tumores reside en el hecho de que el reconocimiento de antígenos en células neoplásicas por parte del sistema inmunitario conduce al inicio de los mecanismos efectores citotóxicos y, en presencia de linfocitos T cooperadores, puede producir la eliminación de las células cancerosas (Pardoll, Nat. Med. 4: 525-31, 1998). Consecuentemente, un objetivo principal de la inmunología de los tumores es definir estas estructuras molecularmente. La naturaleza molecular de estos antígenos ha sido un enigma durante mucho tiempo. Sólo tras el desarrollo de técnicas de clonación adecuadas ha sido posible cribar las librerías de expresión del ADNc de tumores de forma sistemática para encontrar antígenos asociados a tumores mediante el análisis de las estructuras diana de los linfocitos T citotóxicos (LTC) (van der Bruggen et al., Science
254: 1643-7, 1991) o utilizando anticuerpos circulantes (Sahin et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997) como sondas. Con este propósito, se prepararon librerías de expresión de ADNc a partir de tejido tumoral fresco y se expresaron de forma recombinante como proteínas en sistemas adecuados. Se utilizaron inmunoefectores aislados de pacientes, principalmente clones de LTC con patrones de lisis específicos de tumor, o anticuerpos circulantes para clonar los antígenos respectivos.
Durante los últimos años se han definido muchos antígenos en varias neoplasias mediante estos enfoques.
Sin embargo, las sondas utilizadas para la identificación de antígenos en los procedimientos clásicos son inmunoefectores (anticuerpos circulantes o clones de LTC) habitualmente de pacientes que ya presentan un cáncer avanzado. Algunos datos indican que los tumores pueden conducir a, por ejemplo, la tolerancia y la anergia de los linfocitos T, y que, durante el trascurso de la enfermedad, especialmente estas especificidades que podrían provocar un reconocimiento inmunitario eficaz se pierden del repertorio inmunoefector. Los estudios actuales con pacientes todavía no han proporcionado una evidencia sólida de una acción real de los antígenos asociados a tumores encontrados previamente y que se han utilizado. Por consiguiente, no se puede descartar que las proteínas que provocan respuestas inmunitarias espontáneas sean las estructuras diana incorrectas.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar estructuras diana para un diagnóstico y una terapia para el cáncer.
Este objetivo se consigue mediante el contenido que se proporciona en las reivindicaciones.
Según la invención, se identifican los genes que se expresan de forma selectiva o aberrante en las células tumorales y, por consiguiente, proporcionan antígenos asociados a tumores. Estos genes y/o sus productos genéticos resultan útiles como estructuras diana para los enfoques terapéutico y de diagnóstico.
En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende uno o más componentes seleccionados de entre el grupo que consiste en:
(i)
un anticuerpo que se une a una poción extracelular de un antígeno asociado a un tumor,
(ii)
un ácido nucleico antisentido que hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor, y
(iii) un ARNpi dirigido contra un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor,
presentando dicho antígeno asociado a un tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
(a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 1,
(b)
un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo unas condiciones estrictas,
(c)
un ácido nucleico que se degenera en relación al ácido nucleico de (a) ó (b), y
(d)
un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) ó (c)
para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención del cáncer que se caracteriza por la expresión del antígeno asociado a un tumor.
En una forma de realización, el cáncer es un tumor de pulmón, un tumor de mama, un tumor de próstata, un melanoma, un tumor de colon, un tumor gástrico, un tumor de páncreas, un tumor de ENT (oído, nariz y garganta), un carcinoma de las células renales o un carcinoma cervical, un carcinoma de colon o un carcinoma de mama.
En una forma de realización, el antígeno asociado a un tumor comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº: 2, y 7-11.
En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otras formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado, un fragmento de un anticuerpo natural o un anticuerpo sintético. El anticuerpo puede estar acoplado a un agente terapéuticamente útil o útil para el diagnóstico también de nominado agente terapéutico o de diagnóstico en la presente memoria.
En una forma de realización, el ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de 6-50, especialmente de 1030, de 15-30 y de 20-30, de nucleótidos adyacentes al ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor.
En unas formas de realización especiales del ARNpi que tiene como diana el ácido nucleico según la SEC ID nº: 1, la hebra de ARN sentido presenta la secuencia la hebra sentido presenta la secuencia de SEC ID nº: 12 y la hebra de ARN antisentido presenta la secuencia de SEC ID nº: 13, o la hebra de ARN sentido presenta la secuencia de SEC ID nº: 14 y la hebra de ARN antisentido presenta la secuencia de SEC ID nº: 15.
La composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante.
La invención también se refiere a un procedimiento de diagnóstico in vitro y de supervisión de un cáncer que se caracteriza por la expresión de un antígeno asociado a un tumor, cuyo procedimiento comprende la detección o determinación de la cantidad
(i)
de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor, y/o
(ii)
de un antígeno asociado a un tumor, en una muestra biológica aislada de un paciente, y que dicho antígeno asociado a un tumor presenta una secuencia codificada por un ácido nucleico que se
selecciona de entre el grupo que consiste en:
(a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 1,
(b)
un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo unas condiciones estrictas,
(c)
un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) ó (b), y
(d)
un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) ó (c).
La muestra biológica preferentemente se aísla de un paciente que presenta dicho cáncer, que se sospecha que padece dicho cáncer o que ha caído enfermo a causa de dicho cáncer o que presenta probabilidades de desarrollar dicho cáncer. Los mecanismos para conseguir dicha detección y/o determinación se describen en la presente memoria y resultarán evidentes para el experto en la materia.
Preferentemente, la presencia de dicho ácido nucleico y/o dicho antígeno asociado a un tumor y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, y/o dicho antígeno asociado a un tumor que ha aumentado en comparación con un paciente sin dicho cáncer es indicativo de la presencia de dicho cáncer o de la posibilidad de desarrollar dicho cáncer.
Los procedimientos de diagnóstico y/o de seguimiento de la invención también incluyen formas de realización en las que mediante la detección o determinación de la cantidad de dicho ácido nucleico, y/o dicho antígeno asociado a un tumor es posible evaluar o hacer un pronóstico del comportamiento metastásico de dicho cáncer, en el que,
preferentemente, la presencia de dicho ácido nucleico, y/o dicho antígeno asociado a un tumor, y/o una cantidad de dicho ácido nucleico, y/o dicho antígeno asociado a un tumor que aumenta en comparación con un paciente sin dicho cáncer o sin metástasis de dicho es indicativa de un comportamiento metastásico de dicho cáncer o de la posibilidad de desarrollar un comportamiento metastásico de dicho cáncer.
En unas formas de realización particulares, dicha detección o determinación de la cantidad comprende (i) el contacto de una muestra biológica con un agente que se une específicamente a dicho ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor o a dicho antígeno asociado a un tumor y (ii) la detección de la formación de, o la determinación de la cantidad de un complejo entre el agente y el ácido nucleico o del antígeno asociado a un tumor.
En otra forma de realización, la muestra biológica aislada del paciente se compara con una muestra biológica normal comparable.
Los procedimientos de supervisión según la invención comprenden preferentemente una detección y/o una determinación de la cantidad en una primera muestra en un primer periodo de tiempo y en otra muestra en un segundo periodo de tiempo, en la que la se determina el curso de la enfermedad comparando las dos muestras.
Según la invención, la detección de un ácido nucleico o la determinación de la cantidad de un ácido nucleico se puede realizar utilizando una sonda de oligo- o polinucleótidos que hibrida específicamente a dicho ácido nucleico o se puede realizar mediante una amplificación selectiva de dicho ácido nucleico, por ejemplo, mediante mecanismos de amplificación por PCR. En una forma de realización, la sonda de oligo- o polinucleótidos comprende una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, de 15-30 y de 20-30, de nucleótidos adyacentes de dicho ácido nucleico.
En formas de realización específicas, el antígeno asociado a un tumor que se debe detectar o cuya cantidad se debe determinar en los procedimientos de la presente invención está presente intracelularmente, en la superficie celular o en un complejo con la molécula del CMH. Según la invención, la detección de un antígeno asociado a un tumor o la determinación de la cantidad de antígeno asociado a un tumor se puede llevar a cabo utilizando un anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno asociado a un tumor.
Un agente que se utiliza para la detección o la determinación de la cantidad en los procedimientos de la invención, como una sonda de oligo o polinucleótidos o un anticuerpo, está etiquetado preferentemente de forma detectable, especialmente por un marcador detectable como un marcador radioactivo o un marcador enzimático.
La invención también se refiere a un anticuerpo para su uso en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o la supervisión del estado, es decir, para determinar la regresión, progresión, curso y/o aparición de un cáncer que se caracteriza por la expresión de un antígeno asociado a un tumor, y que dicho antígeno asociado a un tumor presenta una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
(a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 1,
(b)
un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
(c)
un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) ó (b), y
(d)
un ácido nucleico que es por lo menso un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) ó (c)
en la que el anticuerpo se une a la parte extracelular de dicho antígeno asociado a un tumor y se acopla a un agente terapéutico o de diagnóstico.
En una forma de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una toxina.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En otras formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado o un fragmento de un anticuerpo natural.
En algunas formas de realización, los procedimientos para el diagnóstico o la supervisión de un cáncer se realizan con una muestra biológica que contiene o que se sospecha que contiene células tumorales diseminadas o células tumorales metastásicas. Estas muestras biológicas incluyen, por ejemplo, sangre, suero, médula ósea, esputo, aspirado bronquial y/o lavado bronquial.
Según la invención, el término “unión” se refiere preferentemente a una unión específica. “Unión específica” significa que un agente como un anticuerpo se une con más fuerza a una diana como un epítopo para el que es específico en comparación a la unión a otra diana. Un agente se une con más fuerza a una primera diana comparado con una segunda diana si se une a la primera diana con una constante de disociación (KD) que es inferior a la constante de disociación para la segundo diana. Preferentemente, la constante de disociación (KD) para la diana a la que se une el agente específicamente es más de 10 veces, preferentemente más de 20 veces, más preferentemente más de 50
veces, e incluso más preferentemente más de 100 veces, 200 veces, 500 veces o 1000 veces inferior que la constante de disociación (KD) para la diana a la que el agente no se une específicamente.
Estos anticuerpos específicos se pueden obtener, por ejemplo, mediante inmunización utilizando los péptidos que se han indicado anteriormente.
La invención también se refiere a un conjugado entre un anticuerpo y un agente terapéutico o de diagnóstico, en el que el anticuerpo se une específicamente a la parte extracelular de una proteína o de un polipéptido, y que dicha proteína o polipéptido está codificada/o por un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste en:
(a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 1,
(b)
un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
(c)
un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y
(d)
un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c)
para su uso en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de un cáncer que se caracteriza por la expresión de la proteína o del polipéptido.
En una forma de realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una toxina.
La invención también se refiere al uso de un kit para el diagnóstico in vitro de un cáncer que se caracteriza por la expresión de un antígeno asociado a un tumor, y que dicho kit comprende agentes para la detección o la determinación de la cantidad
(i)
de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor, y/o
(ii)
de un antígeno asociado a un tumor,
dicho antígeno asociado a un tumor que presenta una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
(a)
un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 1,
(b)
un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
(c)
un ácido nucleico que se ha degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y
(d)
un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c).
En una forma de realización, los agentes para la detección del ácido nucleico son moléculas de ácido nucleico para la amplificación selectiva de dicho ácido nucleico, que comprende, en particular, una secuencia de 6-50, en especial de 10-30, de 15-30 y de 20-30, nucleótidos contiguos a dicho ácido nucleico.
Descripción detallada de la invención
Según la invención, se puede utilizar una “referencia”, como una muestra de referencia o un organismo de referencia, para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los procedimientos descritos en la presente memoria a partir de una muestra de prueba o de un organismo de prueba, es decir, un paciente. Normalmente, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece cáncer.
Un “valor de referencia” se puede determinar empíricamente a partir de una referencia midiendo un número suficientemente elevado de referencias. Preferentemente, el valor de referencia se determina midiendo por lo menos 2, preferentemente por los menos 3, preferentemente por lo menos 5, preferentemente por lo menos 8, preferentemente por lo menos 12, preferentemente por lo menos 20, preferentemente por lo menos 30, preferentemente por lo menos 50 o preferentemente por lo menos 100 referencias.
El término “derivado” de un ácido nucleico significa según la invención que una o múltiples como por lo menos 2, a por lo menos 4, o por lo menos 6 y preferentemente hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 10, hasta 15, o hasta 20 sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos están presentes en dicho ácido nucleico. Además, el término “derivado” comprende también una derivación química de un ácido nucleico o una base nucleótida, en el azúcar o en el fosfato. El término “derivado” también comprende ácidos nucleicos que contienen nucleótidos y análogos de nucleótidos que no se dan de forma natural.
Según la invención, un ácido nucleico es preferentemente un ácido desoxirribonucleico (ADN) o ribonucleico (ARN). Según la invención, los ácidos nucleicos comprenden moléculas de ADN genómico, ADNc, ARNm producidas de forma recombinante y sintetizadas químicamente. Según la invención, un ácido nucleico puede estar presente como hebra sencilla o como doble hebra y lineal o con moléculas circulares cerradas covalentemente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “ARN” significa una molécula que comprende por lo menos un residuo ribonucleótido. Por “Ribonucleótido” se hace referencia un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2’ del grupo beta-D-ribo-furanosa. El término incluye ARN de doble hebra, ARN de hebra sencilla, ARN aislado, como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que difiere del ARN que se da de forma natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleótido, como en el extremo de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándares, como nucleótidos que no se dan de forma natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Nos podemos referir a estos ARN alterados como análogos o análogos de ARN que se dan de forma natural.
Preferentemente, los ácidos nucleicos descritos según la invención se han aislado. El término “ácido nucleico aislado” significa según la invención que el ácido nucleico (i) se ha amplificado in vitro, por ejemplo mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se ha producido de forma recombinante mediante clonación, (iii) se ha purificado, por ejemplo mediante división y fraccionamiento en gel electroforético, o (iv) se ha sintetizado, por ejemplo mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para su manipulación mediante técnicas de recombinación del ADN.
Un ácido nucleico es “complementario” de otro ácido nucleico si las dos secuencias son capaces de hibridar y de formar un dúplex estable uno con otro, y en la que la hibridación se realiza preferentemente bajo unas condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones estrictas). Las condiciones estrictas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editores, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 o Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Editores, John Wiley & Sons, Inc., New York y se refieren, por ejemplo, a una hibridación a 65ºC en un tampón de hibridación (3,5 x SSC, Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, albúmina bovina sérica al 0,02%, 2,5 mM, NaH2PO4 (pH 7), SDS al 0,5%, EDTA 2 mM). SSC es cloruro sódico 0,15 mM / de citrato sódico 0,15 M, pH 7. Después de la hibridación, se lava la membrana a la que se ha transferido el ADN, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y después en 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68ºC.
Según la invención, los ácidos nucleicos complementarios presentan por lo menos un 40%, especialmente por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90% y preferentemente por lo menos un 95%, por lo menos un 98% o por lo menos un 99% de nucleótidos idénticos.
Con el término “porcentaje de identidad” se trata de indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias que se han de comparar, obtenidos después del mejor alineamiento, este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen aleatoriamente y en toda su longitud. Las comparaciones de las secuencias entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se realizan convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de forma óptima, y esta comparación se realiza por segmento o por “ventana de comparación” para identificar y comparar las regiones locales con similitud de la secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparar se puede producir, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads. App. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas de ordenador que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
El porcentaje de identidad se calcula determinando la cantidad de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando por 100 el resultado obtenido de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.
Según la invención, los ácidos nucleicos que codifican para los antígenos asociados a tumores pueden estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, en particular con ácidos nucleicos heterólogos. En las formas de realización preferidas, un ácido nucleico se une funcionalmente a secuencias de control de la expresión o a secuencias reguladoras que pueden ser homólogas o heterólogas en relación a dicho ácido nucleico. Una secuencia que codifica y una secuencia reguladora están “funcionalmente” unidas entre sí están unidas covalentemente entre sí de tal forma que la expresión o transcripción de dicha secuencia que codifica está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia reguladora. Si la secuencia que codifica se debe traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia reguladora unida funcionalmente a dicha secuencia que codifica, la inducción de dicha secuencia reguladora da lugar a la transcripción de dicha secuencia que codifica, sin provocar un cambio de marco en la secuencia que codifica o sin que dicha secuencia que codifica se pueda traducir a la proteína
o péptido deseado.
El término “secuencia de control de la expresión” o “secuencia reguladora” comprende según la invención promotores, potenciadores y otros elementos de control que regulan la expresión de un gen. En las formas de realización particulares de la invención, las secuencias de control de la expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias reguladoras puede variar en función de la especie o del tipo de célula, pero normalmente comprende secuencias 5’ no transcritas y 5’ no traducidas que están implicadas en el inicio de transcripción y traducción, respectivamente, como la caja TATA, la secuencia tapón, la secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias reguladoras 5’ no transcritas comprenden una secuencia promotora para el control de la trascripción del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras hacia 5’.
Según la invención, otro ácido nucleico puede estar presente en combinación con otro ácido nucleico que codifica un péptido que controla la secreción de la proteína o el péptido que codifica para dicho ácido nucleico de una célula huésped. Según la invención, también puede estar presente un ácido nucleico en combinación con otro ácido nucleico que codifica un péptido que provoca que la proteína o el péptido codificado se ancle a la membrana celular de la célula huésped o compartimentada en orgánulos especiales de dicha célula. De forma similar, es posible una combinación con un ácido nucleico que representa un gen reportero o una de las “etiquetas”.
En una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico recombinante es, según la invención, un vector, adecuado para un promotor, que controla la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor identificado según la invención. El término “vector” se utiliza en la presente memoria en su significado más general y comprende un vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite que dicho ácido nucleico, por ejemplo se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando proceda, se integre en el genoma. Preferentemente, los vectores de este tipo se replican y/o se expresan en la célula. Se puede adaptar un vehículo intermediario, por ejemplo para su utilización en la electroporación, en el bombardeo con microproyectiles, en la administración liposomal, en la transferencia con la ayuda de agrobacterias o en la inserción a través de virus ADN o ARN. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas víricos.
Los ácidos nucleicos que codifican un antígeno asociado a un tumor descrito en la presente memoria se pueden utilizar para la transfección de células huésped. Los ácidos nucleicos significan tanto ADN como ARN recombinante. El ARN recombinante se puede preparar mediante una transcripción in vitro de un patrón de ADN. Además, se puede modificar mediante secuencias de estabilización, tapón y poliadenilación antes de su aplicación.
Según la invención, el término “célula huésped” se refiere a una de las células que se puede transformar o transfectar con un ácido nucleico exógeno. Según la invención, el término “células huésped” comprende células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, linfocitos B, células CHO, células COS, células K562, células de la levadura y células de insectos). Resultan particularmente preferidas las células de mamíferos tales como las células de humanos, ratones, hámster, cerdos, cabras, primates. Las células pueden derivar de una pluralidad de tipos de tejidos y comprenden células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos comprenden queratinocitos, células de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En otras formas de realización, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. En la célula huésped puede estar presente un ácido nucleico en la forma de un sola copia o dos o más copias y, en una forma de realización, se expresa en la célula huésped.
Según la invención, el término “expresión” se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteínas. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión se puede llevar a cabo de forma transitoria o estable. Los sistemas de expresión preferidos en células de mamíferos comprenden pcADN3.1 y pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contiene un marcador seleccionable, como un gen que proporciona resistencia a G418 (y, de esta forma, permite que se seleccionen las líneas celulares transfectadas establemente) y las secuencias potenciador-promotor de citomegalovirus (CMV).
En aquellos casos en los que una molécula del CMH presenta un antígeno asociado a un tumor o una de sus partes, un vector de expresión también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula del CMH. La secuencia del ácido nucleico que codifica para la molécula del CMH puede estar presente en el mismo vector de expresión que el ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor o a una de sus partes, o ambos ácidos nucleicos pueden estar presentes en vectores de expresión diferentes. En este último caso, los dos vectores de expresión se pueden cotransfectar a una célula. Si una célula huésped no expresa el antígeno asociado a un tumor o una de sus partes ni la molécula del CMH, ambos ácidos nucleicos que codifican para ello se pueden transfectar tanto en el mismo vector de expresión como en vectores de expresión diferentes. Si la célula ya expresa la molécula del CMH, sólo se puede transfectar en la célula la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor o la parte del mismo se puede transfectar en la célula.
Los kits para la amplificación de un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor comprenden, por ejemplo, un par de cebadores de amplificación que hibridan con el ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor. Los cebadores comprenden preferentemente una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, de 15-30 y
de 20-30 nucleótidos adyacentes al ácido nucleico y que no se solapan, para evitar la formación de los dímeros del cebador. Uno de los cebadores hibridará con una hebra del ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor, y el otro cebador hibridará con la hebra complementaria en una disposición que permite la amplificación del ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor.
Las “moléculas antisentido” o los “ácidos nucleicos antisentido” se pueden utilizar para regular, en particular reducir, la expresión de un ácido nucleico. El término “moléculas antisentido” o “ácidos nucleicos antisentido” se refiere, según la invención, a un oligonucleótido que es un oligorribonucleótido, un oligodesoxirribonucleótido un oligorribonucleótido modificado o un oligodesoxirribonucleótido modificado y que hibrida bajo condiciones fisiológicas al ADN que comprende un gen en especial o al ARNm de dicho gen, inhibiendo así la transcripción de dicho gen y/o la traducción de dicho ARNm. Según la invención, una “molécula antisentido” también comprende un constructo que contiene un ácido nucleico o una de sus partes en sentido inverso en relación a su promotor natural. Una transcrito antisentido de un ácido nucleico o de una de sus partes puede formar un dúplex con el ARNm que se da de forma natural especificando la enzima y, de esta forma, evitar su acumulación o su traducción del ARNm en la enzima activa. Otra posibilidad para inactivar un ácido nucleico es la utilización de ribozimas. Los oligonucleótidos antisentido preferidos según la invención presentan una secuencia de 6-50, en particular de 10-30, de 15-30 y de 2030, de nucleótidos adyacentes al ácido nucleico diana y preferentemente son totalmente complementarios al ácido nucleico diana o a una de sus partes.
En unas formas de realización preferidas, el oligonucleótido antisentido hibrida con un terminal N o hacia el extremo 5’ como un sitio de inicio de traducción, un sitio de inicio de transcripción, o un sitio de inicio del promotor. En otras formas de realización, el oligonucleótido antisentido hibrida con una región 3’ no traducida o en el sitio de empalme (splicing) del ARNm.
En una forma de realización, un oligonucleótido consta de ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o una de sus combinaciones, con el extremo 5’ de un nucleótido y el extremo 3’ de otro nucleótido unidos a otro mediante un enlace fosfodiéster. Estos oligonucleótidos se pueden sintetizar de forma convencional o se pueden producir de forma recombinante.
En las formas de realización preferidas, un oligonucleótido es un oligonucleótido “modificado”. Así, el oligonucleótido se puede modificar de muchas formas distintas, sin afectar a sus capacidades de unión a su diana, para aumentar, por ejemplo, su estabilidad o su eficacia terapéutica. Según la invención, el término “oligonucleótido modificado” significa un oligonucleótido en el que (i) por lo menos dos de sus nucleótidos están unidos uno al otro mediante un enlace internucleósido sintético (es decir, un enlace internucleósido que no es un enlace fosfodiéster) y/o (ii) un grupo químico que normalmente no se encuentra en ácidos nucleicos se une covalentemente al oligonucleótido. Los enlaces internucleósidos preferidos son fosforotioatos, fosfonatos de alquilo, fosforoditioatos, ésteres de fosfato, fosfonotioatos de alquilo, fosforamidatos, carbamatos, carbonatos, triésteres de fosfato, acetamidatos, ésteres de carboximetilo y péptidos.
El término “oligonucleótido modificado” también comprende oligonucleótidos que presentan una base o un azúcar modificados covalentemente. Los “oligonucleótidos modificados” comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos con residuos de azúcar que están covalentemente unidos a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes de un grupo hidroxilo en la posición 3’ y a un grupo fosfato en la posición 5’. Los oligonucleótidos modificados pueden comprender, por ejemplo, un residuo de ribosa 2’-O-alquilado u otro azúcar en lugar de la ribosa, como la arabinosa.
Debe apreciarse que todas las formas de realización descritas anteriormente en relación a los oligonucleótidos también se aplican a los polinucleótidos.
Por “ARN pequeño interferente” o “ARNpi”, tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende una molécula aislada de ARN, preferentemente mayor de 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente mayor a 15 nucleótidos de longitud, y más preferentemente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud que se utiliza para identificar un gen diana o ARNm que se debe degradar. Un intervalo de 19-25 nucleótidos es el tamaño preferido para los ARNpi.
Según la invención, los ARNpi pueden comprender ARN parcialmente purificado, ARN sustancialmente puro, ARN sintético o ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que se diferencia del ARN que se da de forma natural por la adición, delección, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleótido, como al extremo/extremos del ARNpi o a uno o más nucleótidos internos del ARNpi; modificaciones que hacen al ARNpi resistente a la digestión por la nucleasa (por ejemplo, la utilización de ribonucleótidos sustituidos en 2’ o modificaciones del esqueleto del azúcar-fosfato); o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNpi con desoxirribonucleótidos. Además, el ARNpi se puede modificar para aumentar su estabilidad como se ha descrito anteriormente mediante oligonucleótidos modificados, en particular mediante la introducción de una o más uniones fosforotioato.
Una o ambas hebras del ARNpi pueden comprender también un extremo 3’ saliente. Tal como se utiliza en la presente memoria, un “extremo 3’ saliente” se refiere a por lo menos un nucleótido no emparejado que se extiende
desde el extremo de 3’ de una hebra de ADN. Por consiguiente, en una forma de realización, el ARNpi comprende por lo menos un extremo 3’ saliente de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos de longitud (que incluye ribonucleótidos
o desoxirribonucleótidos), preferentemente de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud y especialmente preferentemente de 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En la forma de realización en la que ambas hebras de la molécula comprenden un extremo 3‘ saliente, la longitud de los salientes puede ser igual o diferente para cada hebra. En una forma de realización más preferida, el extremo 3’ saliente está presente en ambas hebras del ARNpi, y presenta 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra del ARNpi de la invención puede comprender extremos 3’ salientes de ácido didesoxitimidílico (“TT”) o ácido diuridílico (“uu”).
Para aumentar la estabilidad del ARNpi, los extremos 3’ salientes también se pueden estabilizar frente a la degradación. En una forma de realización, los salientes se estabilizan incluyendo nucleótidos purina, como nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, se tolera la sustitución de nucleótidos de pirimidina con análogos modificados, por ejemplo, la sustitución de los nucleótidos de uridina en los extremos 3’ salientes con 2’desoxitimidina y no afecta a la eficacia de la degradación del ARNi. En particular, la ausencia de 2’-hidroxilo en la 2’desoxitimidina aumenta significativamente la resistencia a la nucleasa del extremo 3’ salientes en medios de cultivo tisulares.
Las hebras sentido y antisentido del ARNpi pueden comprender dos moléculas de ARN de hebra única complementarias o pueden comprender una sola molécula en la que dos porciones complementarias están emparejadas por las bases y están unidas covalentemente por un área “horquilla” de hebra simple. Es decir, la región sentido y la región antisentido pueden estar conectadas covalentemente a través de una molécula de enlace. La molécula de enlace puede ser una molécula de enlace polinucleótido o no nucleótido. Sin vincularse a una teoría en concreto, se cree que el área horquilla del último tipo de la molécula de ARNpi está adherida intracelularmente por la proteína “Dicer” (o su equivalente) para formar un ARNpi de dos moléculas de ARN individuales emparejadas por las bases.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el “ARNm diana” se refiere a una molécula de ARN que es la diana para la disminución de la regulación.
El ARNpi se puede expresar a partir de los vectores de expresión pol III sin un cambio en el sitio diana, ya que se cree que la expresión del ARNs a partir de los promotores pol III sólo es eficaz cuando el primer nucleótido transcrito es una purina.
Según la invención, se puede hacer diana en el ARNpi en cualquier tramo de los aproximadamente 19-25 nucleótidos adyacentes de las secuencias diana del ARNm (la “secuencia diana”). Las técnicas para la selección de las secuencias diana para el ARNpi se proporcionan, por ejemplo, en Tuschl T. et al., “The siRNA User Guide”, revisado el 11 de octubre de 2002, cuya descripción completa se incorpora en la presente memoria como referencia. “The siRNA User Guide” está disponible en Internet en una página gestionada por el Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USA, y se puede encontrar accediendo a la página de la Rockefeller University y buscando la palabra clave “siRNA”. Por consiguiente, la hebra sentido del presente ARNpi comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a uno de los tramos adyacentes de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm diana.
Generalmente, una secuencia diana en el ARNm diana se puede seleccionar a partir de una secuencia dada de ADNc que corresponde al ARNm diana, preferentemente comenzando de 50 a 100 nt hacia 3’ (es decir, en la dirección del extremo 3’) desde el codón de inicio. Sin embargo, la secuencia diana puede estar situada en las regiones 5’ o 3’ no traducidas, o en la región próxima al codón de inicio.
El ARNpi se puede obtener utilizando varias técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el ARNpi se puede sintetizar químicamente o producir de forma recombinante utilizando unos procedimientos conocidos en la técnica, como el sistema in vitro con Drosophila descrito en la solicitud publicada en US 2002/0086356 de Tuschl et al., cuya descripción se incorpora a la presente memoria como referencia en su totalidad.
Preferentemente, el ARNpi se sintetiza químicamente utilizando ribonucleósido-fosforamiditas protegidas adecuadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. El ARNpi se puede sintetizar como dos moléculas separadas de ARN complementarias, o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.
Alternativamente, el ARNpi también se puede expresar a partir de plásmidos de ADN lineales o circulares recombinantes utilizando un promotor adecuado. Estas formas de realización se incluyen según la presente invención cuando se hace referencia en la presente memoria a la administración de ARNpi o a la incorporación de ARNpi en composiciones farmacéuticas. Los promotores adecuados para expresar el ARNpi de la invención a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias del promotor U6 ó H1 ARN pol III y el promotor citomegalovirus.
La selección de otros promotores adecuados forma parte de las habilidades del experto en la materia. Los plásmidos recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNpi en un tejido particular o en un entorno intracelular particular.
El ARNpi expresado a partir de plásmidos recombinantes se puede aislar a partir de sistemas de expresión de células cultivadas mediante técnicas habituales, o se puede expresar intracelularmente. La utilización de plásmidos recombinantes para distribuir el ARNpi a células in vivo se expone a continuación. El ARNpi se puede expresar a partir de un plásmido recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.
La selección de plásmidos adecuados para la expresión del ARNpi, los procedimientos para la inserción de las secuencias de ácido nucleico para la expresión del ARNpi en el plásmido, y los procedimientos para distribuir el plásmido recombinantes en las células de interés forman parte de las habilidades del experto en la materia.
El ARNpi también se puede expresar a partir de vectores virales recombinantes intracelularmente in vivo. Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican para el ARNpi y un promotor adecuado para la expresión de las secuencias de ARNpi. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNpi en un tejido en particular o en un entorno intracelular en particular. El ARNpi se puede expresar a partir de un vector viral recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.
El término “péptido” comprende óligo- y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 o más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 ó 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante uniones a péptidos. El término “proteína” se refiere a unos péptidos grandes, preferentemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos “péptidos” y “proteínas” son sinónimos y se utilizan en la presente memoria de forma intercambiable.
Preferentemente, las proteínas y los péptidos descritos según la invención se han aislado. Los términos “proteína aislada” o “péptido aislado” significan que la proteína o el péptido se han separado de su entorno natural. Una proteína o un péptido aislado puede estar en un estado esencialmente purificado. El término “esencialmente purificado” significa que la proteína o el péptido están presentes esencialmente libres de otras sustancias con las que están asociados de forma natural o in vivo.
Estas proteínas y péptidos se pueden utilizar, por ejemplo, en la producción de anticuerpos y en un ensayo inmunológico o de diagnóstico o como agentes terapéuticos. Las proteínas y los péptidos descritos según la invención se pueden aislar a partir de muestras biológicas como homogeneados de tejidos o de células y también se puede expresar de forma recombinante en múltiples sistemas de expresión procariotas o eucariotas.
En el contexto de la presente invención, los “derivados” de una proteína o péptido o de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.
Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden fusiones de amino- y/o carboxilo terminales y también inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos determinada. En el caso de las variantes de secuencia de aminoácidos que presentan una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio determinado de una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado adecuado del producto resultante. Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracteriza por la eliminación de por lo menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Resultan preferidas las modificaciones en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o para reemplazar aminoácidos por otros que presentan unas propiedades similares como hidrofobicidad, hidrofilia, electronegatividad, volumen de la cadena lateral y similares (sustitución conservativa). Las sustituciones conservativas, por ejemplo, se refieren al intercambio de un aminoácido por otro aminoácido detallado a continuación en el mismo grupo que el aminoácido que se debe sustituir:
1.
residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2.
residuos cargados negativamente y sus amidas: Asn, Asp, Glu, Gln
3.
residuos cargados positivamente: His, Arg, Lys
4.
residuos alifáticos no polares grandes: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5.
residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.
Debido a su parte particular en la arquitectura de la proteína, tres residuos se muestran entre paréntesis. Gly es el único residuo sin una cadena lateral y, por consiguiente, proporciona flexibilidad a la cadena. Pro presenta una geometría inusual que restringe la cadena enormemente. Cys puede formar un puente disulfuro.
Las variantes de aminoácido descritas anteriormente se pueden preparar fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis de péptidos conocidas como, por ejemplo, mediante síntesis de fase sólida (Merrifield, 1964) y procedimientos similares o mediante manipulación del ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para la preparación de proteínas y péptidos que presentan sustituciones, inserciones o deleciones se describe en detalle, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989).
Según la invención, los “derivados” de proteínas y péptidos también comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones simples o múltiples de las moléculas asociadas a la proteína o péptido, como hidratos de carbono, lípidos y/o proteínas o péptidos.
El término “derivado” se extiende también a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos.
Según la invención, una parte o fragmento de un antígeno asociado a un tumor presenta preferentemente una propiedad funcional de la proteína o péptido del que se ha derivado. Estas propiedades funcionales comprenden la interacción la interacción con anticuerpos, la interacción con otros péptidos o proteínas, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. Una propiedad especial es la capacidad de formar un complejo con moléculas del CMH y, cuando proceda, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente mediante la estimulación de linfocitos T cooperadores o citotóxicos. Una parte o fragmento de un antígeno asociado a un tumor comprende preferentemente una secuencia de por lo menos 6, en particular por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 30 o por lo menos 50, aminoácidos consecutivos del antígeno asociado a un tumor. Una parte o fragmento de un antígeno asociado a un tumor comprende preferentemente una secuencia de hasta 8, en particular de hasta 10, de hasta 12, de hasta 15, de hasta 20, de hasta 30 o de hasta 55 aminoácidos consecutivos del antígeno asociado a un tumor. Una parte o un fragmento de un antígeno asociado a un tumor es preferentemente una parte del antígeno asociado a un tumor que corresponde a la parte no transmembranaria, en particular la parte extracelular del antígeno, o está comprendida en ella.
Según la invención, las partes o fragmentos preferidos de un antígeno asociado a un tumor son particularmente adecuados para la estimulación in vivo de los linfocitos T citotóxicos pero también para la producción de linfocitos T amplificados y estimulados para la transferencia adoptiva terapéutica ex vivo.
Según la invención, una parte o un fragmento de un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor se refiere a la parte del ácido nucleico, que codifica por lo menos el antígeno asociado a un tumor y/o para una parte o fragmento de dicho antígeno asociado a un tumor, tal como se ha descrito anteriormente. Una parte o fragmento de un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor es preferentemente la parte del ácido nucleico que se corresponde con el marco abierto de lectura.
Los antisueros que contienen anticuerpos específicos que se unen específicamente a la proteína diana se pueden preparar mediante varios procedimientos estándares; ver, por ejemplo, “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” de Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 22-9; “Antibodies: A Laboratory Manual” de Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 y “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” de Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. De esta forma, también es posible generar anticuerpos afines y específicos que reconocen proteínas de membrana complejas en su forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Esto es especialmente relevante para la preparación de anticuerpos que se deben utilizar terapéuticamente, pero también para muchas aplicaciones de diagnóstico. En este caso, es posible inmunizar con toda la proteína, con secuencias extracelulares parciales así como con células que expresan la molécula diana en la forma plegada fisiológicamente.
Los anticuerpos monoclonales se prepararan tradicionalmente utilizando la tecnología del hibridoma. (Para detalles técnicos ver: “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” por Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19963722-9; “Antibodies: A Laboratory Manual” por Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Es conocido que sólo una pequeña parte de una molécula del anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epítopo (cf. Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7ª Edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc son, por ejemplo, efectores de la cascada de complemento pero no están implicados en la unión del antígeno. Un anticuerpo al que se le ha extraído enzimáticamente la región pFc’ o que se ha producido sin la región pFc’, denominado fragmento F(ab’)2, es portador de ambos sitios de unión del antígeno de un anticuerpo completo. De modo similar, un anticuerpo al que se ha extraído enzimáticamente la región Fc o que se ha producido
sin la región Fc, denominado fragmento Fab, es portador de un sitio de unión del antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Además, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de un anticuerpo unida covalentemente y parte de la cadena pesada de dicho anticuerpo, denominada Fd. Los fragmentos Fd son los determinantes principales de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes, sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd, cuando se aíslan, mantienen la capacidad de unión a un epítopo.
Situadas en la parte de unión del antígeno de un anticuerpo están las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que interactúan directamente con el epítopo del antígeno y las regiones marco (FR) que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto el fragmento Fd de la cadena pesada como el de la cadena ligera de la inmunoglobulina IgG contienen cuatro regiones marco (FR1 a F4) que están separadas en cada caso por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3). Las regiones CDR, y en especial, las regiones CDR3 y, más especialmente, las regiones CDR3 de la cadena pesada son responsables en gran medida de la especificidad del anticuerpo.
Es sabido que las regiones no CDR de un anticuerpo de un mamífero se pueden reemplazar por regiones similares de anticuerpos con la misma o diferente especificidad, conservando la especificidad para el epítopo del anticuerpo original. Esto hace posible el desarrollo de anticuerpos “humanizados” en los que CDR no humanos se unen covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc’ para producir un anticuerpo funcional.
Otro ejemplo, el documento WO 92/04381 describe la producción y el uso de anticuerpos RSV murinos humanizados en los que por lo menos parte de las regiones FR murinas se han reemplazado por regiones FR de origen humano. Los anticuerpos de este tipo, que incluyen fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de unión al antígeno, son denominados a menudo anticuerpos “quiméricos”.
Según la invención, el término “anticuerpo” también incluye fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos quiméricos con fragmentos F(ab’)2 en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han remplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos quiméricos con fragmentos Fab en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas, y anticuerpos quiméricos con fragmento Fd en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han reemplazado por secuencias homólogas humanas o no humanas. El término “anticuerpo” también comprende anticuerpos de “cadena sencilla”.
Las proteínas y péptidos que se unen específicamente a antígenos asociados a tumores se pueden proporcionar, por ejemplo, mediante librerías de péptidos degenerados que se pueden preparar simplemente en una solución en una forma inmovilizada o mediante bibliotecas de expresión en fagos. También es posible preparar librerías combinatorias de péptidos con uno o más aminoácidos. También se pueden preparar bibliotecas de peptoides y de residuos sintéticos no péptídicos.
Los anticuerpos también se pueden acoplar a sustancias de diagnóstico específicas para que muestren las células y los tejidos que expresan los antígenos asociados al tumor. También se pueden acoplar a sustancias terapéuticas útiles.
Las sustancias de diagnóstico incluyen uno de los marcadores que se utilizan para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primer o el segundo marcador, por ejemplo, FRET (Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia); (iii) afectar a la movilidad, por ejemplo, la movilidad electroforética, mediante carga, hidrofobicidad, forma, u otros parámetros físicos; o (iv) proporcionar un grupo de captura, por ejemplo, afinidad, anticuerpo/antígeno, o formación de complejos iónicos. Las estructuras adecuadas como marcadores son marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, preferentemente marcadores isotópicos estables, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, especialmente marcadores de partículas de metal, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, moléculas orgánicas pequeñas como la biotina, ligandos de receptores o moléculas de unión como proteínas de adhesión celular o lecitinas, secuencias de marcadores que comprenden ácidos nucleicos y/o residuos de aminoácidos que se pueden detectar utilizando agentes de unión, etc. Las sustancias de diagnóstico comprenden, de forma no limitante, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanóico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y de radiodiagnóstico, que incluyen los emisores de positrones como la flúor-18 y el carbono-11, emisores gamma como el yodo-123, el tecnetio-99m, el yodo-131 y el indio-111, núclidos para la resonancia magnética nuclear, como la flúor y el gadolinio.
Según la invención, el término “sustancia terapéuticamente útil” significa una de las moléculas que pueda ejercer un efecto terapéutico. Según la invención, una sustancia terapéuticamente útil se guía preferentemente de forma selectiva a una célula que expresa uno o más antígenos asociados al tumor e incluye agentes anticancerígenos, compuestos marcados con yodo radioactivo, toxinas, fármacos citostáticos o citoliticos, etc. Los agentes
anticancerígenos comprenden, por ejemplo, aminoglutetimida, azatioprina, sulfato de bleomicina, busulfano, carmustina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, ciclosporina, citarabidina, dacarbacina, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, taxol, etopósido, fluorouracilo, interferona-a, lomustina, mercaptopurina, metotrexato, mitotano, procarbacina HCl, tioguanina, sulfato de vinblastina y sulfato de vincristina. Otros agentes anticancerígenos se describen, por ejemplo, en Goodman y Gilman, “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8ª edición, 1990, McGraw-Hill, Inc., especialmente el Capítulo 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi y Bruce A. Chabner). Las toxinas pueden ser proteínas como la proteína antiviral del ombú, la toxina del cólera, la toxina pertussis, la ricina, la gelonina, la abrina, la exotoxina de la difteria o la exotoxina Pseudomonas. Los residuos de toxinas también pueden ser radionúclidos emisores de gran energía como el cobalto-60.
El término “complejo mayor de histocompatibilidad” o “CMH” se refiere a un complejo de genes presentes en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del CMH están implicadas en la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígeno en las reacciones inmunitarias normales mediante la unión de péptidos y presentandolas para el reconocimiento por parte de los receptores de los linfocitos T (TCR). Las moléculas del CMH unen péptidos en un compartimento de procesamiento intracelular y entregan estos péptidos en la superficie de las células que presentan un antígeno para el reconocimiento por parte de los linfocitos T. La región del CMH humano también denominada HLA está situada en el cromosoma 6 e incluye la región de clase I y de clase II. En una forma de realización preferida, una molécula del CMH es una molécula de HLA.
“Reducir” o “inhibir” tal como se utiliza en la presente memoria significa la capacidad de provocar una disminución global en el nivel, preferentemente de 20% o superior, más preferentemente de 50% o superior, y aún más preferentemente de 75% o superior, por ejemplo, en el nivel de proteínas o ARNm en comparación con una muestra de referencia (por ejemplo, una muestra no tratada con ARNpi). Esta reducción o inhibición de la expresión del ARN
o la proteína puede ocurrir a través de la división o degradación del ARNm diana. Los ensayos para la expresión de las proteínas o del ácido nucleico son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los ensayos ELISA, análisis de transferencia western para la expresión de proteínas, o de transferencia northern o ensayos de protección frente a ARNasa para el ARN.
Según la invención, el término “paciente” significa un ser humano, un primate no humano u otro animal, en particular un mamífero como una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor como un ratón o una rata. En una forma de realización especialmente preferida, el paciente es un ser humano.
Según la invención, “expresión anormal” significa que la expresión está alterada, preferentemente aumentada, en comparación con el estado en un individuo sano.
Según la invención, el término “aumento” o “cantidad aumentada” se refiere preferentemente a un aumento de por lo menos 10%, en particular por lo menos 20%, por lo menos 50% o por lo menos 100%. La cantidad de una sustancia también aumenta en una muestra de prueba, como en una muestra biológica, en comparación con una muestra de referencia si es detectable en la muestra de prueba pero está ausente o no detectable en la muestra de referencia.
Según la invención, el término “enfermedad” se refiere a uno de los estados patológicos en los que los antígenos asociados a un tumor se expresan o se expresan anómalamente. Según la invención, “expresión anómala” significa que la expresión está alterada, preferentemente aumentada, en comparación con el estado en un individuo sano. Un aumento de la expresión se refiere a un aumento de por lo menos 10%, en particular por lo menos 20%, por lo menos 50% o por lo menos 100%. En una forma de realización, el antígeno asociado a un tumor se expresa sólo en el tejido de un individuo enfermo, mientras que la expresión en un individuo sano está reprimida. Un ejemplo de esta enfermedad es el cáncer, en el que el término “cáncer”, según la invención, comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer del endometrio, cáncer de riñón, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer de células sanguíneas, cáncer de piel, cáncer cerebral, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestinos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de nódulos linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y sus metástasis. Sus ejemplos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. Según la invención, el termino cáncer también comprende metástasis del cáncer.
Por “tumor” se entiende un grupo anómalo de cellas o tejidos que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que los estímulos que iniciaron el crecimiento hayan cesado. Los tumores presentan una falta parcial o completa de organización estructural y de coordinación funcional con el tejido normal, y normalmente forman una masa de tejido distinta, que puede ser tanto benigna como maligna.
Por “metástasis” se entiende la propagación de las células cancerosas desde su lugar original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, invasión de la matriz extracelular, penetración de las membranas basales del endotelio para penetrar en la cavidad y en los vasos, y después, tras haber sido transportada por la sangre, infiltrarse en los
órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor en el lugar diana depende de la angiogénesis. Frecuentemente, la metástasis del tumor ocurre incluso después de la extracción del tumor primario ya que las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. Según la invención, en una forma de realización el término “metástasis” se refiere a “metástasis distante” que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de nódulos linfáticos de la zona.
Según la invención, una muestra biológica puede ser una muestra de tejido, que incluye fluidos corporales, y/o una muestra celular y se puede obtener de forma convencional como mediante una biopsia del tejido, que incluye una biopsia por punción, y mediante la extracción de sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. Según la invención, el término “muestra biológica” también incluyes fracciones de muestras biológicas.
Según la invención, el término “célula inmunorreactiva” significa una célula que puede madurar hasta célula inmunitaria (como linfocitos B, linfocitos T cooperadores, o linfocito T citolítico) con una estimulación adecuada. Las células inmunoreactivas comprenden células madre hematopoyéticas CD34+, linfocitos T inmaduros y maduros y linfocitos B inmaduros y maduros. Si se desea una producción de células citolíticas o de linfocitos T cooperadores que reconozcan un antígeno asociado a un tumor, la célula inmunoreactiva se pone en contacto con una célula que expresa un antígeno asociado a un tumor bajo unas condiciones que favorezcan la producción, diferenciación y/o selección de linfocitos T citolíticos y de linfocitos T de ayuda. La diferenciación de los precursores de linfocitos T en linfocitos T citolítitcos, cuando se exponen a un antígeno, es similar a la selección por clonación del sistema inmunitario.
Los términos “células T” y “linfocitos T” se utilizan de forma intercambiable en la presente memoria e incluyen linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos que comprenden linfocitos T citolíticos.
Algunos procedimientos terapéuticos están basados en una reacción del sistema inmunitario del paciente, que tiene como resultado una lisis de las células presentadoras de antígenos, como las células cancerosas que presentan uno
o más antígenos asociados al tumor. En esta conexión, por ejemplo, los linfocitos T citotóxicos autólogos específicos para un complejo de antígeno asociado a un tumor y una molécula del CMH, se administran a un paciente que presenta una anomalía celular. La producción in vitro de estos linfocitos T citotóxicos es conocida. Un ejemplo de un procedimiento para diferenciar linfocitos T se puede encontrar en el documento WO-A-9633265. Normalmente, se toma una muestra que contiene células, como células sanguíneas, del paciente y las células se ponen en contacto con una célula que presenta el complejo y que puede provocar la propagación de los linfocitos T citotóxicos (por ejemplo, células dendríticas). La célula diana puede ser una célula transfectada, como una célula COS. Estas células transfectadas presentan el complejo deseado en su superficie y, cuando contactan con los linfocitos T citotóxicos, estimulan su propagación. Después, los linfocitos T citotóxicos autólogos se administran al paciente.
En otro procedimiento para la selección de linfocitos T citotóxicos específicos para el antígeno, se utilizan tetrámeros fluorogénicos de complejos molécula/péptido de clase I del CMH para obtener clones específicos de linfocitos T citotóxicos (Altman et al., Science 274: 94-96, 1996; Dunbar et al., Curr. Biol. 8: 413-416, 1998).
En procedimientos terapéuticos denominados de transferencia adoptiva (Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917, 1986; Riddel et al., Science 257: 238, 1992; Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59: 603614, 1989), las células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) se combinan con los linfocitos T citotóxicos del paciente que se debe tratar, dando como resultado una propagación de linfocitos T citotóxicos específicos. Después, los linfocitos T citotóxicos propagados se administran a un paciente que presenta una anomalía celular que se caracteriza por determinadas células anómalas presentadoras del complejo específico. Después, los linfocitos T citotóxicos lisan las células anómalas, consiguiendo de esta forma un efecto terapéutico deseado.
Además, las células que presentan el complejo deseado (por ejemplo, células dendríticas) se pueden combinar con linfocitos T citotóxicos de individuos sanos o de otras especies (por ejemplo, ratones) que puede dar como resultado la propagación de linfocitos T citotóxicos específicos con una afinidad elevada. La elevada afinidad del receptor de linfocitos T de estos linfocitos T específicos propagados se puede clonar y opcionalmente humanizar a un alcance diferente, y después los receptores de linfocitos T obtenidos de esta forma transducidos a través de un gen de transferencia, por ejemplo utilizando vectores retrovirales, en los linfocitos T de los pacientes. Después, se puede realizar la transferencia adoptiva utilizando estos linfocitos T genéticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2: 962-70, 2001 Kessels et al., Nat Immunol. 2: 957-61, 2001).
Los linfocitos T citotóxicos también se pueden generar in vivo de la manera conocida per se. Un procedimiento utiliza células no proliferativas que expresan el complejo. Las células que se utilizan en este caso serán las células que normalmente expresan el complejo, tales como células de tumor irradiadas o células transfectadas con uno o más genes necesarios para la presentación del complejo (es decir, el péptido antigénico y la molécula presentadora del CMH). Otra forma preferida es la introducción del antígeno asociado a un tumor en la forma de ARN recombinante que se puede introducir en las células, por ejemplo, mediante transferencia liposomal o mediante electroporación. Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos autólogos que después se propagan.
Se puede conseguir un efecto similar combinando el antígeno asociado a un tumor o un fragmento suyo con un adyuvante para hacer que sea posible la incorporación in vivo en las células presentadoras de antígeno. El antígeno asociado a un tumor o un fragmento suyo puede estar representado como una proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno asociado a un tumor se procesa para producir un complementario del péptido para la molécula del CMH, mientras que su fragmento puede ser presentado sin la necesidad de un procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si éstos se pueden unir a las moléculas del CMH. Resultan preferidas las formas de administración en las que el antígeno completo se procesa in vivo por una célula dendrítica, ya que esto también producirá respuestas de los linfocitos T cooperadores que son necesarios para una respuesta inmunitaria eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998). En general, es posible administrar una cantidad eficaz de antígeno asociado a un tumor a un paciente, por ejemplo, mediante una inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también se puede realizar intranodalmente en un nódulo linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303, 2001).
Según la invención, los términos “inmunización” o “vacunación” se refieren preferentemente a un aumento o activación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno. Es posible utilizar modelos animales para probar un efecto inmunizante en el cáncer utilizando un antígeno asociado a un tumor o un ácido nucleico que codifica el mismo. Por ejemplo, se pueden introducir las células cancerosas humanas en un ratón para generar un tumor, y se pueden administrar uno o más ácidos nucleicos que codifican un antígeno asociado a un tumor. Se puede medir el efecto en las células cancerosas (por ejemplo, reducción del tamaño del tumor) como el cálculo de la eficacia de una inmunización por parte del ácido nucleico.
Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferentemente se administran uno o más antígenos asociados al tumor o fragmentos suyos estimulados conjuntamente con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que se incorpora al antígeno o que se administra conjuntamente con este último y que aumenta la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden aumentar la respuesta inmunitaria proporcionando un depósito de antígenos (extracelularmente o en macrófagos), activando macrófagos y/o estimulando determinados linfocitos. Los adyuvantes son conocidos y comprenden, de manera no limitativa, monofosforil lípido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas como la QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), la QS7, la QS17, la QS18 y la QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7: 178-186, 1997), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (cf. Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995) y varias emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biológicamente degradables como el escualeno y/o tocoferol. Preferentemente, los péptidos se administran en una mezcla con DQS21/MPL. La proporción de DQL21 en relación al MPL es habitualmente de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1 y en particular de aproximadamente 1:1. Para la administración en humanos, una formulación de vacuna contiene habitualmente DQS21 y MPL en un intervalo de entre aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 100 µg.
También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible por ejemplo, utilizar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Estas citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12) que ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (cf. Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF y IL-18.
Existen varios componentes que aumentan la respuesta inmunitaria y que, por consiguiente, se pueden utilizar en una vacunación. Estos compuestos comprenden moléculas coestimuladoras proporcionadas en la forma de proteínas o ácidos nucleicos como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).
Las proteínas y los péptidos se pueden administrar de una forma conocida per se. En una forma de realización, los ácidos nucleicos se administran mediante procedimientos ex vivo, es decir, extrayendo las células del paciente, modificando genéticamente dichas células para incorporar un antígeno asociado a un tumor y reintroducción en el paciente de las células alteradas. Esto generalmente comprende la introducción in vitro de una copia funcional de un gen en las células de un paciente y la reintroducción de las células genéticamente alteradas en el paciente. La copia funcional del gen está bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten que el gen se exprese en las células alteradas genéticamente. Los procedimientos de transfección y transducción son conocidos por el experto en la materia. Los ácidos nucleicos se pueden administrar in vivo utilizando vectores, tales como virus y liposomas con control de diana. Si se hace referencia según la invención a la administración o incorporación en composiciones farmacéuticas de ácidos nucleicos esto incluye formas de realización en las que el ácido nucleico está presente en estos vectores.
En una forma de realización preferida, se selecciona un virus o un vector viral para la administración de un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor de entre el grupo que consiste en adenovirus, virus asociados a adenovirus, pox virus, que incluyen la vacuna del virus y atenuados de pox virus, virus Semliki Forest, retrovirus, virus Sindbis y partículas similares a los virus Ty. En especial, resultan preferidos los adenovirus y los retrovirus. Los retrovirus son normalmente deficientes para la replicación (es decir, son incapaces de generar partículas infecciosas).
Los procedimientos para la introducción in vitro o in vivo de ácidos nucleicos en las células comprende la transfección de ácidos nucleicos precipitados por fosfato cálcico, la transfección de ácidos nucleicos asociados a DEAE, transfección o infección con los virus indicados anteriormente que portan los ácidos nucleicos de interés, la transfección mediada por liposomas, y similares. En formas de realización determinadas, resulta preferido dirigir el ácido nucleico a determinadas células. En estas formas de realización, el vehículo utilizado para la administración de un ácido nucleico en una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede presentar una molécula diana control unida. Por ejemplo, se puede incorporar una molécula, como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie en la célula diana o un ligando para un receptor de la célula diana en el interior o unido al vehículo de ácido nucleico. Los anticuerpos preferidos comprenden anticuerpos que se unen selectivamente a un antígeno asociado a un tumor. Si se desea una administración de un ácido nucleico a través de liposomas, se pueden incorporar proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie asociada con la endocitosis en la formulación del liposoma para hacer posible el control de la diana y/o la absorción. Estas proteínas comprenden proteínas de cápsida o sus fragmentos que son específicos para un tipo de células determinado, anticuerpos para proteínas que se internalizan, proteínas que se dirigen a un sitio intracelular, y similares.
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar en preparaciones farmacéuticamente compatibles. Estas preparaciones contienen habitualmente concentraciones farmacéuticamente compatibles de sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos, sustancias que aumentan la inmunidad suplementaria como los adyuvantes, por ejemplo, oligonucleótidos CpG, citocinas, quimiocinas, saponinas, GM-CSF y/o ARN y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos.
Los compuestos terapéuticamente activos se pueden administrar mediante una de las vías convencionales, incluyendo la inyección o la infusión. La administración se puede realizar, por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente o trasdérmicamente. Preferentemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente mediante un aerosol pulmonar. Los ácidos nucleicos antisentido se administran preferentemente mediante una administración intravenosa lenta.
Las composiciones descritas en la presente memoria se administran en cantidades eficaces. Una “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad que consigue una reacción deseada o un efecto deseado por sí sola o con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad determinada o de una patología determinada que se caracteriza por la expresión de uno o más antígenos asociados a un tumor, la reacción deseada se refiere preferentemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, especialmente, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad o de una patología también puede ser un retraso en la aparición o la prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha patología. Según la invención, un diagnóstico o tratamiento de un cáncer también puede incluir el diagnóstico
o el tratamiento de la metástasis del cáncer que ya se ha formado o que se vaya a formar. Según la invención, el término “tratamiento” comprende tratamiento terapéutico y profiláctico, es decir, prevención.
La cantidad efectiva de una composición dependerá de la patología que se debe tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, el estado fisiológico, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de la terapia de acompañamiento (si está presente), la vía específica de administración y factores similares.
Las composiciones farmacéuticas son preferentemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.
Las dosis administradas de las composiciones dependerán de varios parámetros como el tipo de administración, el estado del paciente, el periodo de administración deseado, etc. En el caso de que una administración en el paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden utilizar dosis más elevadas (o dosis más elevadas eficaces que se consiguen mediante una vía de administración diferente, más localizada).
Las composiciones farmacéuticas se administran habitualmente en cantidades farmacéuticamente compatibles y en composiciones farmacéuticamente compatibles. El término “farmacéuticamente compatible” se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo, pueden contener habitualmente sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se utilizan en medicina, las sales deberían ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, las sales que no son farmacéuticamente compatibles se pueden utilizar para preparar sales farmacéuticamente compatibles y se incluyen en la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden, de manera no limitativa, las preparadas a partir de los ácidos siguientes: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente compatibles también se pueden preparar como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinos térreos, como las sales de sodio, las sales de potasio
o las sales de calcio.
Una composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente compatible. Según la invención,
el término “vehículo farmacéuticamente compatible” se refiere a uno o más agentes de relleno sólidos o líquidos, diluyentes o sustancias de encapsulación compatibles, que son adecuados para su administración en humanos. El término “vehículo” se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar la aplicación. Los componentes de la composición farmacéutica son de una forma que no tiene lugar una interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéuticamente deseada.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener sustancias tampón adecuadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, cuando sea apropiado, conservantes adecuados como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y tiomersal.
Las composiciones farmacéuticas se proporcionan habitualmente en una forma de dosificación uniforme y se pueden preparar de una forma conocida per se. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, tabletas, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o, por ejemplo, en la forma de una emulsión.
Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden habitualmente una preparación estéril acuosa o no acuosa del componente activo, que es preferentemente isotónico para la sangre del receptor. Los ejemplos de vehículos y solventes compatibles son la solución Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Adicionalmente, se utilizan aceites fijados, habitualmente estériles, como solución o medio de suspensión.
La presente invención se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos siguientes, proporcionados a título ilustrativo y no limitativo. Debido a la descripción de los ejemplos, las formas de realización adicionales que también están incluidas en la invención resultarán evidentes para el experto en la materia.
Figuras:
Figura 1. Expresión del ARNm de ISC-468
A. Investigaciones por RT-PCR con los cebadores específicos de ISC-468 no mostraron una expresión significativa en todos los tejidos normales sometidos a ensayo a excepción de la placenta.
B. Expresión del ARNm del ISC-468 en los carcinomas de cabeza y el cuello, hígado, riñón y colon.
C. Expresión del ARNm del ISC-468 en los carcinomas de mama, ovario y estómago.
Figura 2. Análisis cuantitativo por PCR de la expresión del ARNm de ISC-468 en tejidos normales control y en cánceres de mama
La investigación por PCR en tiempo real con cebadores específicos de ISC-468 mostró una expresión selectiva del ARNm en testículos, placenta, estómago y PBMC normales, y en todas las biopsias del carcinoma de mama.
Figura 3. Expresión del ARNm de ISC-468
La investigación por (A) RT-PCR y (B) PCR en tiempo real con los cebadores específicos de ISC-468 mostró una expresión selectiva del ARNm en testículos y placenta normales y en el 80% de las biopsias del carcinoma de mama.
Figura 4. Análisis de inmunofluorescencia de la expresión del ISC-468
(A) Se confirmó la especificidad de los anticuerpos anti-ISC-468 mediante la tinción de las células transfectadas del ISC-468-eGFP. (B) La tinción de las células fijadas en MeOH tanto transfectadas con dúplex de ARNi específicos de ISC-468, o con dúplex control no silenciadoras. (C) Tinción de las células no fijadas tanto transfectadas con dúplex específicos de ARNi de ISC-468, o dúplex de control no silenciadas.
Figura 5. Análisis inmunohistoquímico de la expresión de ISC-468
No se detectó ninguna expresión en tejido mamario normal (A) 100x, (B) 200x. Por el contrario, se observó una tinción grande y homogénea de la membrana en los especímenes de carcinoma de mama (C) 100x, (D) 200x.
Figura 6. Inhibición inducida por ARNi de la expresión de ISC-468
La transfección de células con los dúplex de ARNpi específicas para ISC-468 dio como resultado una inhibición perceptible de la expresión del ARNm de ISC-468 en comparación con las células de control.
Figura 7. Análisis de la proliferación celular
La transfección de células con dúplex de ARNpi específicos para ISC-468 dio como resultado una alteración perceptible de la proliferación celular en comparación con las células de control.
Figura 8. Análisis del ciclo celular
La transfección de células con dúplex de ARNpi específicos para ISC-468 dio como resultado la parada en G1/S de las células (A) MCF-7 y (B) BT-549 de carcinoma de mama en comparación con las células de control.
Figura 9. Fosforilación de AKT
La transfección de células con dúplex de ARNpi específicos para ISC-468 dio como resultado una alteración perceptible de la fosforilación de AKT en comparación con las células de control.
Figura 10. Inhibición de la proliferación mediada por anticuerpo
La incubación de células MCF-7 de carcinoma de mama con anticuerpos específicos para ISC-468 dio como resultado una proliferación reducida en comparación con las células incubadas con un anticuerpo control irrelevante.
Figura 11. Análisis de la proliferación celular
La transfección de células con dúplex de ARNpi específicos para ISC-468 dio como resultado una alteración perceptible de (A) quimiotaxis, (B) quimiocinesis, y (C) invasión en comparación con las células de control.
Figura 12. Correlación con receptor de estrógenos
Los niveles de expresión del ARNm de ISC-468 en las muestras de carcinoma de mama se corresponden con el estado del receptor del estrógeno. Se muestran las medias, 10º, y 90º percentiles con barras de errores.
Figura 13. Tratamiento con 17j-estradiol
Se indujo la expresión de ARNm de ISC-468 mediante el tratamiento del receptor del estrógeno en líneas celulares positivas de cáncer de mama MCF-7 con 17�-estradiol 100 nM. No se observó ninguna inducción del receptor de estrógenos en la línea celular negativa MDA-MB-231.
Figura 14. Secuencias
Se muestran las secuencias a las que se hace referencia en la presente memoria.
Ejemplos: Material y procedimientos
Las técnicas y procedimientos indicados en la presente memoria se han llevado a cabo de la forma conocida per se y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Todos los procedimientos, incluyendo la utilización de kits y reactivos, se han llevado a cabo según las indicaciones de los fabricantes.
Extracción de ARN, preparación de ADNc cebado con poli-d(T) y análisis convencional por RT-PCR
Se extrajo todo el ARN del material tisular nativo utilizando isotiocianato de guanidio como agente caotrópico (Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-9, 1987). Después de la extracción con fenol ácido y la precipitación con isopropanol, dicho ARN se disolvió en agua tratada con DEPC.
Se realizó la síntesis de la primera hebra de ADNc a partir de 4 µg de ARN total en una mezcla de reacción de 20 µl mediante Superscript II (Invitrogen), según las indicaciones del fabricante. El cebador utilizado fue el oligonucleótido dT(18). Se revisaron la integridad y calidad del ADNc mediante amplificación de p53 en una PCR de 30 ciclos ((SEC ID NO: 5, 6), temperatura de hibridación 67ºC).
Se preparó un archivo de la primera hebra de ADNc a partir de una cantidad de tejidos normales y de entidades tumorales. Para los estudios de expresión, se amplificaron 0,5 µgl de estos ADNc en una mezcla de reacción de 30 µl, utilizando cebadores específicos para GOI (ver a continuación) y 1 U de ADN polimerasa HotStartTaq (Qiagen). Cada muestra de reacción contenía dNTP 150 µM, 0,3 µM de cada cebador y 3 µl de 10 x tampón de reacción. Los cebadores se seleccionaron de forma que se situasen en dos exones diferentes, y se confirmó la eliminación de la
interferencia por ADN genómico contaminado como la razón para los resultados falso-positivo probando el ADN transcrito no reversible como patrón. Después de 15 minutos a 95ºC para activar la ADN polimerasa de HotStartTaq se realizaron 35 ciclos de PCR (0,5 minutos a 94ºC, 0,5 minutos a la temperatura de hibridación determinada, 0,5 minutos a 72ºC y una elongación final a 72ºC durante 6 minutos). Se fraccionaron 20 µl de esta reacción y se analizaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.
Preparación de ADNc cebado con hexámero aleatorio y PCR cuantitativo en tiempo real
Se cuantificó la expresión de varios genes mediante PCR en tiempo real. Los productos de la PCR se detectaron utilizando SYBR Green como colorante marcador intercalado. La fluorescencia del marcador de SYBR Green se suprime en la solución y el colorante es activo sólo después de la unión a los fragmentos de ADN de doble hebra. El aumento de la fluorescencia del SYBR Green como resultado de la amplificación específica que utiliza cebadores específicos para GOI después de cada ciclo se utiliza para la cuantificación. La expresión del gen diana se cuantifica como absoluta o relativa a la expresión de un gen de control con una expresión constante en los tejidos que se denen investigar. La expresión se midió después de la estandarización de las muestras frente a ARN 18s denominado gen de mantenimiento que utiliza el procedimiento MM -Ct (PE Biosystems, USA). Las reacciones se llevaron a cabo por duplicado y se determinaron por triplicado. Se utilizó el kit QauntiTec SYBR Green PCR (Qiagen, Hilden) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó con cebadores aleatorios (Invitrogen) utilizando el protocolo descrito anteriormente. Para la PCR, se utilizó cada porción de 5 µl del ADNc diluido en un volumen total de 30 µl: cebador sentido 300 nM, cebador antisentido 300 nM; desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 minutos; 95ºC durante 30 segundos; anillado durante 30 segundos; 72ºC durante 30 segundos; 40 ciclos. Las secuencias de los cebadores utilizados se indican en los ejemplos respectivos.
Análisis de clonación y secuencia
La clonación de los genes completos y de los fragmentos de genes tuvo lugar mediante procedimientos convencionales. Para determinar la secuencia, se amplificaron los antígenos correspondientes utilizando la polimerasa pfu de comprobación (Stratagene). Después de completar la PCR, se ligó la adenosina mediante la ADN polimerasa de HotStartTaq a los extremos del amplicón para clonar los fragmentos en el vector TOPO-TA según las instrucciones del fabricante. La secuenciación la realizó una empresa externa. Las secuencias se analizaron utilizando programas y algoritmos de predicción convencionales.
Análisis de la proliferación celular
Después de 24 horas tras la transfección con los dúplex de ARNpi, se cultivaron 1x104 células en un medio con suplemento con varias concentraciones de FCS durante 48 horas. Se analizó la proliferación midiendo la incorporación de BrdU en las hebras de ADN acabadas de sintetizar utilizando el kit de proliferación celular DELFIA (Perkin Elmer) según las instrucciones del fabricante en un contador multietiquetas Wallac Victor2 (Perkin Elmer).
Análisis del ciclo celular y apoptosis
Las células se cultivaron en un medio con suplemento de FCS con varias concentraciones, se recogieron después de 48 horas y se tiñeron con propidio yodado antes del análisis por citometría de flujo del contenido de ADN. Las células apoptóticas y las células en fases S/G2/M del ciclo celular se cuantificaron utilizando CellQuest-Software (Becton Dickinson).
Migración celular
Los ensayos de migración celular se realizaron en cámaras transpocillo con membranas porosas de 8,0 µm (BD Biosciences) con células cultivadas en un medio sin suero durante 12 horas antes del experimento. Para los experimentos con ARNpi, las células se transfectaron a condiciones sin suero 24 horas después de la transfección con los dúplex de ARNpi descritos anteriormente. Se añadieron 4x104 células en un medio de cultivo sin suero de 400 µl en la cámara superior. Las cámaras inferiores contenían 800 µl de medio de cultivo con un suplemento de FCS, PDGF-BB (Sigma-Aldrich) o SDF-1a /CXCL12 (R&D Systems) como quimioatrayentes. Transcurridas 24 horas, las células que habían migrado a la parte inferior de la membrana se fijaron en metanol helado; las membranas se escindieron, se colocaron en portaobjetos de microscopio y se montaron con Hoechst (Dako) para microscopía de fluorescencia. Se contaron las células por cada membrana en cinco campos visuales aleatorios (amplificación 100x). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Se analizaron los efectos de la quimiocinesis de las células utilizando la misma configuración experimental (i) sin quimioatrayente añadido tanto a la cámara superior como a la inferior y (ii) con quimioatrayente añadido tanto a la cámara superior como a la inferior.
Ensayo de invasión in vitro
Los ensayos de invasión in vivo se realizaron en cámaras transpocillos con membranas porosas de 8,0 µm (BD Biosciences) con células cultivadas en un medio sin suero durante 12 horas antes del experimento. Las cámaras superiores se prepararon con 100 µl de Matrigel (BD Biosciences) diluido a 1 mg/ml en un medio sin suero. Las
cámaras se incubaron a 37ºC durante 5 horas para la gelificación. Para los experimentos de ARNpi, las células se transfirieron a condiciones sin suero 24 horas después de la trasnfección con duplas de ARNpi tal como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 1x105 células en un medio de cultivo de 400 µl a la cámara superior. Las cámaras inferiores contenidas en un medio de cultivo de 800 µl se suplementaron con FCS como quimioatrayente. Transcurridas 24 horas, las células invadidas en la parte inferior de la membrana se fijaron en metanol helado; las membranas se escindieron se colocaron en portaobjetos de microscopio y se montaron con Hoechst (Dako) para microscopía de fluorescencia. Se contaron las células por cada membrana en cinco campos visuales aleatorios (amplificación 100x). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Ejemplo 1: identificación de ISC-468 como diana terapéutica y de diagnóstico del cáncer
ISC-468 (SEC ID NO: 1) codifica para una proteína de 212 aminoácidos (SEC ID NO: 2) y con un peso molecular de 23,6 kDa.
Se ha descrito previamente como una proteína específica de la placenta que se expresa durante el embarazo (Fant et al., Mol Reprod Dev. 63: 430-6, 2002).
Se ha pronosticado que la proteína presenta un péptido señal de división desde aa 1-23, seguido de un domino transmembrana putativo corto (aa 25-47) como se ha analizado con herramientas de bioinformática (TMpred, SOUSI). Se ha pronosticado que el resto de la proteína es extracelular y, por consiguiente, se puede utilizar, según la invención, como estructura diana para los anticuerpos monoclonales.
Según la invención, se utilizó una pareja de cebadores específicos para gen (SEC ID NO: 3, 4) para ISC-468 en análisis por RT-PCR para amplificar el ADNc derivado de un amplio panel de tejidos normales y tumorales. Tal como se esperaba, se confirmó que la placenta es el único tejido sano que expresa este gen (figura 1). No se detectó ninguna expresión en absoluto en ningún otro tejido normal de un órgano. Más sorprendentemente, cuando se investigaron muestas de cáncer, encontramos niveles de expresión elevados y significativos en diferentes tipos de tumores, incluyendo en carcinomas de colon, páncreas, esófago, estómago, pulmón, mama, ovario, cabeza y cuello, riñón, próstata e hígado (figuras 1 y 2 así como en la Tabla 1). El análisis cuantitativo por RT-PCR en tiempo real de la expresión de ISC-468 en 60 muestras de carcinoma de mama reveló que el 80% de las muestras expresó niveles significativos de ISC-468 (figura 3ª, B).
Tabla 1: expresión de ISC-468 en tejidos normales y tumorales
Tejidos normales
Expresión Tipo de tumor Expresión
Cerebro
- Carcinoma de colon +
Miocardio
- Carcinoma de páncreas +
Músculo esquelético
- Carcinoma de esófago +
Miocardio
- Carcinoma de estómago +
Estómago
- Carcinoma de pulmón +
Colon
- Carcinoma de mama +
Páncreas
- Carcinoma de ovario +++
Riñón
- Carcinoma de cabeza y cuello +
Hígado
- Carcinoma de riñón +
Testículos
- Carcinoma de próstata +
Timo
- Carcinoma de hígado ++
Mama
-
Ovario
-
Útero
-
Piel
-
Pulmón
-
Placenta
+++
Nódulos linfáticos
-
Bazo
-
PBMC
-
Próstata
-
La expresión selectiva y elevada de los transcritos de ISC468 en los tumores no se conocía anteriormente y se puede utilizar, según la invención, para procedimientos de diagnóstico molecular como RT-PCR para detectar células tumorales diseminadas en el suero y en la médula ósea y para detectar metástasis en otros tejidos. Esta molécula se puede utilizar además como diana específica para estrategias terapéuticas.
Según la invención, los péptidos siguientes, entre otros, se seleccionaron para la producción de anticuerpos específicos para ISC-468: SEC ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 2). La especificidad de los anticuerpos se confirmó mediante análisis por inmunoflorescencia de las células transfectadas ISC-468-eGFP (figura 4A).
Se analizó la localización subcelular de ISC-468 en las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT-549 para la expresión de forma endógena mediante análisis por inmunofluorescencia. La tinción tanto de las células fijadas con MeOH (figura 4B) como de las no fijadas (figura 4C) reveló que el ISC-468 se encuentra en las membranas plasmáticas de las células que lo expresan. La especificidad de la tinción se confirmó mediante el silenciamiento de la expresión del ISC-468 inducido por ARNi, dando como resultado la pérdida de tinción en la membrana plasmática.
Además, se utilizaron los anticuerpos específicos para ISC-468 para el análisis inmunohistoquímico de la expresión del ISC-468 en muestras clínicas de mama normales y carcinomas de mama. La expresión del ISC-468 no se detectó en las muestras de mamas normales (figura 5A, B). Por el contrario, las muestras de carcinoma de mama mostraron una expresión fuerte y homogénea del ISC-468 (figura 5C, D). Las señales se acentuaron en la membrana plasmática de las células que expresaban las células cancerosas, confirmando que el ISC-468 es una proteína de la membrana que se expresa selectivamente en las células cancerosas.
Según la invención, los dominios extracelulares del ISC-468 se pueden utilizar como estructura diana para el inmunodiagnóstico y la terapia mediante anticuerpos monoclonales. Además, el ISC-468 se puede utilizar como vacuna (ARN, ADN, proteína, péptido) para inducir respuestas inmunitarias específicas para el tumor (respuestas inmunitarias mediadas por los linfocitos T y B).
El silenciamiento de la expresión del ISC-468 inducido por ARNi se consiguió mediante la transfección de células con dúplex de ARNpi que hacen diana específicamente en el ARNm del ISC-468 (SEC ID NO: 12-15). La transfección de las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT-549 que expresan de forma endógena dio como resultado una reducción estable y específica de la expresión del ARNm del ISC-468 (figura 6).
Para obtener más conocimiento sobre el papel fisiológico de la expresión del ISC-468 se realizaron varios ensayos celulares in vitro basados en el ARNi. La transfección de las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT549 con dúplex de ARNpi dio como resultado una reducción evidente de la proliferación celular en comparación con los controles respectivos, tal como se analizó en un ensayo de proliferación basado en BrdU (figura 7). El análisis del ciclo celular basado en FACS mostró que la derogación de la proliferación celular dio como resultado una detención del G1/S (figura 8A, B). Adicionalmente, se podría mostrar que el silenciamiento del ISC-468 inducido por ARNi afecta notablemente la vía de señalización AKT en las células cancerosas que expresan endógenamente mediante la inhibición de la fosforilación de AKT (figura 9). Además, la proliferación de las células MCF-7 se atenuó cuando las células se incubaron con anticuerpos específicos para el ISC-468 generados contra péptidos específicos de ISC-468 (SEC ID NO: 10, 11) en comparación con un anticuerpo de control irrelevante (figura 10). Estos resultados indican que el ISC-468 es un factor fundamental para la proliferación de las células cancerosas presumiblemente mediante la mediación en la activación inducida por el factor de crecimiento de la vía de señalización AKT y otros. El ISC-468 mismo puede representar un receptor, correceptor o chaperona unida a la membrana para los factores de crecimiento, quimiocinas u otras sustancias.
Además, se analizó el impacto de la expresión del ISC-468 en la capacidad de migración de las células cancerosas. El silenciamiento de la expresión de ISC-468 inducido por ARNi en las líneas celulares de carcinoma de mama MCF7 y BT-549 dio como resultado una deficiencia evidente de la quimiotaxis, quimiocinesis y la invasión de las células, tal como se evaluó en los ensayos de migración transpocillo (figura 11A, B, C). La quimiotaxis, la quimiocinesis y la invasión son actores fundamentales para la metástasis de las células cancerosas a otros órganos. Por consiguiente, la expresión del ISC-468 en las células cancerosas puede ser un factor positivo para la metástasis de las células cancerosas.
En los carcinomas de mama, se podría mostrar que la expresión del ISC-468 corresponde al estado del receptor de estrógeno del tumor. El análisis cuantitativo por RT-PCR en tiempo real de la expresión de ISC-468 en 60 muestras de carcinoma de mama reveló que los carcinomas de mama positivos para el receptor del estrógeno mostraron niveles significativamente más elevados de expresión del ISC-468 que los tumores negativos para el receptor (figura 12).
Por consiguiente, la expresión del ISC-468 se podría inducir en líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 positivas para el receptor del estrógeno mediante el tratamiento con 17 -estradiol (figura 13).
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. 5 <120> Identificación de antígenos asociados a un tumor para el diagnóstico y la terapia
<130> 342-28PCT
<140> 10 <141> 2006-09-06
<150> EPO5019786.2
<151> 2005-09-12 15 <160> 15
<170> Patentin version 3.3
<210> 1 20 <211> 1126
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<210> 2
<211> 212
<212> PRT 30 <213> Homo sapiens
<400> 2 <210> 3
<211> 21 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido 10
<400> 3 aaatttggca gctgccttca c 21
<210> 4 15 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
20 <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 4 tgatgccaca ttcagtaaca c 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
5 <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
25 <210> 5
<400> 5 cgtgagcgct tcgagatgttcc g 21
<210> 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido
<400> 6 cctaaccagc tgcccaactg tag 23
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens 25
<400> 7
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
45 <210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 11
<211> 13 55 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 12
<211> 21
<212> ADN <213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Hebra sentido ARNpi
10
<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases de ribonucleótidos
<400> 12 ccaugagagu agccagcaat t
21
15
<210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial
20
<220> <223> Hebra sentido ARNpi
25
<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases de ribonucleótidos
30 35
<400> 13 uugcuggcua cucucaugga g <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Hebra sentido ARNpi 21
40
<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases de ribonucleótidos
45
<400> 14 gguucaggac aaaguccaat t 21
50
<210> 15 <211> 21 <211> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Hebra sentido ARNpi
55
<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> bases de ribonucleótidos
60
<400> 15 uuggacuuug uccugaaccg g 21

Claims (23)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Composición farmacéutica, que comprende uno o más componentes que se seleccionan de entre el grupo que
    consiste en: 5
    (i)
    un anticuerpo que se une a la parte extracelular de un antígeno asociado a un tumor,
    (ii)
    un ácido nucleico antisentido que hibrida específicamente con un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor, y
    (iii) un ARNpi dirigido contra un ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a un tumor,
    presentando dicho antígeno asociado a un tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1,
    (b)
    un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
    (c)
    un ácido nucleico degenerado con respecto al ácido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un ácido nucleico que es por lo menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c)
    para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado 25 porque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor.
  2. 2.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado porque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo.
  3. 3.
    Composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado porque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 1, en la que el anticuerpo se acopla a un agente terapéutico o de diagnóstico.
  4. 4.
    Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado porque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 1, en la que el cáncer es un tumor de pulmón, un tumor de mama, un tumor de próstata, un melanoma, un tumor de colon, un tumor gástrico, un tumor pancreático, un tumor ENT, un carcinoma de las células renales o un carcinoma cervical, un carcinoma de colon o un carcinoma de mama.
  5. 5.
    Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado porque presenta la expresión del antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 1, en la que el antígeno asociado a un tumor comprende una
    45 secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en SEC ID nos: 2, y 7-11.
  6. 6. Procedimiento in vitro para el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor, comprendiendo dicho procedimiento detectar o determinar la cantidad
    (i)
    de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor, y/o
    (ii)
    del antígeno asociado a un tumor,
    55 en una muestra biológica aislada del paciente,
    con dicho antígeno asociado a un tumor presentando una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1,
    (b)
    un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones restrictivas,
    (c) un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y 65
    (d) un ácido nucleico que es por lo menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c).
  7. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la detección o determinación de la cantidad comprende las etapas siguientes:
    (i)
    poner en contacto la muestra biológica con un agente que se une específicamente al ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor o al antígeno asociado a un tumor, y
    (ii)
    detectar la formación de o determinar la cantidad de un complejo entre el agente y el ácido nucleico o el antígeno asociado a un tumor.
  8. 8.
    Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el agente que se une específicamente al ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor es un oligonucleótido o polinucleótido, que hibrida específicamente con dicho ácido nucleico.
  9. 9.
    Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el agente que se une específicamente al antígeno asociado a un tumor es un anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno asociado a un tumor.
  10. 10.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho seguimiento de dicha enfermedad cancerosa comprende determinar la regresión, el curso o la aparición de dicha enfermedad en una muestra de un paciente que presenta dicha enfermedad o que se cree que puede contraer dicha enfermedad.
  11. 11.
    Procedimiento según la reivindicación 10, que comprende la detección o determinación de la cantidad en una primera muestra en un primer punto temporal y en otra muestra en un segundo punto temporal y una comparación de las dos muestras.
  12. 12.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 -11, en el que el agente se marca de una manera detectable.
  13. 13.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12, en el que la muestra comprende fluido corporal y/o tejido corporal.
  14. 14.
    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 - 13, en el que el antígeno asociado a un tumor comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en SEC ID nos: 2, y 7
  15. 11.
  16. 15. Anticuerpo para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor,
    presentando dicho antígeno asociado a un tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID NO: 1,
    (b)
    un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
    (c)
    un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un ácido nucleico que es por lo menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c),
    en el que el anticuerpo se une a la parte extracelular de dicho antígeno asociado a un tumor y se acopla a un agente terapéutico o de diagnóstico.
  17. 16.
    Anticuerpo según la reivindicación 15, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 15, que es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo.
  18. 17.
    Anticuerpo según la reivindicación 15 o 16, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 15, en el que el antígeno asociado a un tumor comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nos: 2 y 7-11).
  19. 18.
    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15, 16 o 17, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor según la reivindicación 15, en el que el agente terapéutico
    o de diagnóstico es una toxina.
  20. 19. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento o la prevención del cáncer caracterizado porque presenta la expresión de un antígeno asociado a
    5 un tumor según la reivindicación 1, para inhibir el desarrollo del cáncer en un paciente, en el que la composición farmacéutica debe administrarse en una cantidad eficaz.
  21. 20. Conjugado entre un anticuerpo y un agente terapéutico o de diagnóstico, en el que el anticuerpo se une
    específicamente a la parte extracelular de una proteína o polipéptido, siendo dicha proteína o polipéptido codificada 10 por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1,
    (b) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas, 15
    (c)
    un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un ácido nucleico que es por lo menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c)
    20 para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención, el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de la proteína o el polipéptido.
  22. 21. Conjugado según la reivindicación 20, para su utilización en un procedimiento para el tratamiento, la prevención,
    el diagnóstico o el seguimiento de una enfermedad caracterizada porque presenta la expresión de la proteína o el 25 polipéptido según la reivindicación 20, en el que el agente terapéutico o de diagnóstico es una toxina.
  23. 22. Utilización de un kit para el diagnóstico in vitro de una enfermedad cancerosa caracterizada porque presenta la expresión de un antígeno asociado a un tumor, comprendiendo dicho kit unos agentes para la detección o la determinación de la cantidad
    (i)
    de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a un tumor, y/o
    (ii)
    del antígeno asociado a un tumor,
    35 presentando dicho antígeno asociado a un tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:
    (a)
    un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1, 40 (b) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) bajo condiciones estrictas,
    (c) un ácido nucleico degenerado en relación al ácido nucleico de (a) o (b), y
    (d)
    un ácido nucleico que es por lo menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a), (b) o (c). 45
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