EA013564B1 - Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция - Google Patents
Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция Download PDFInfo
- Publication number
- EA013564B1 EA013564B1 EA200601715A EA200601715A EA013564B1 EA 013564 B1 EA013564 B1 EA 013564B1 EA 200601715 A EA200601715 A EA 200601715A EA 200601715 A EA200601715 A EA 200601715A EA 013564 B1 EA013564 B1 EA 013564B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- gene
- human
- humanized
- segment
- rabbit
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 86
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 313
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 206
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 103
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 162
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 152
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 89
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 24
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 24
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 7
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 7
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 claims description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 abstract description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 88
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 68
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 52
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 49
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 34
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 29
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 28
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 28
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 101710196256 Collagen adhesin Proteins 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 14
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 14
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 14
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 12
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 8
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 7
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 6
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 6
- 101150044072 cn gene Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 5
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 5
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 101150076615 ck gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 3
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 101000777314 Homo sapiens Choline kinase alpha Proteins 0.000 description 3
- 101000777313 Homo sapiens Choline/ethanolamine kinase Proteins 0.000 description 3
- 101001138544 Homo sapiens UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 3
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241001236294 Hebe Species 0.000 description 2
- 101000994700 Homo sapiens Casein kinase I isoform alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- -1 for example Substances 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVGKRPYUFRZAQW-UHFFFAOYSA-N 3 prime Natural products CC(=O)NC1OC(CC(O)C1C(O)C(O)CO)(OC2C(O)C(CO)OC(OC3C(O)C(O)C(O)OC3CO)C2O)C(=O)O DVGKRPYUFRZAQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150070959 CK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100269157 Caenorhabditis elegans ads-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100264195 Caenorhabditis elegans app-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100167365 Caenorhabditis elegans cha-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100532679 Caenorhabditis elegans scc-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101000684297 Homo sapiens 26S proteasome complex subunit SEM1 Proteins 0.000 description 1
- 101100113588 Homo sapiens CS gene Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000873438 Homo sapiens Putative protein SEM1, isoform 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001181114 Neta Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010015724 Prephenate Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102100034920 Putative protein SEM1, isoform 2 Human genes 0.000 description 1
- PZYAYFPGUMSVJW-UHFFFAOYSA-N SSSSSSS Chemical compound SSSSSSS PZYAYFPGUMSVJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RRTCJVBFMMTZSS-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSS RRTCJVBFMMTZSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100380504 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) atf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101150087998 Su-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 101150100931 VI gene Proteins 0.000 description 1
- 101150051936 Y-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150108895 addB gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 108091011142 collagen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000021124 collagen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/107—Rabbit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к гуманизированным антителам и препаратам антитела, полученным из трансгенных животных, отличных от человека. Животных, отличных от человека, получают генно-инженерным способом, так, что они содержат один или более гуманизированных локусов иммуноглобулина, которые способны претерпевать реаранжировку генов и конверсию генов у трансгенных животных, отличных от человека, с получением разнообразных гуманизированных иммуноглобулинов. Гуманизированные антитела согласно изобретению обладают минимальной иммуногенностью для человека и пригодны для применения при терапевтическом лечении человека.
Description
Данное изобретение относится к гуманизированным антителам, получаемым из трансгенных животных, отличных от человека. С помощью генетической инженерии создают животных, отличных от человека, так что они содержат один или более гуманизированных локусов иммуноглобулинов, которые у трансгенных животных, отличных от человека, способны подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, давая разнообразные гуманизированные иммуноглобулины. Данное изобретение, кроме того, относится к новым последовательностям, рекомбинантным векторам и трансгенным векторам, применимым для создания таких трансгенных животных. Гуманизированные антитела согласно данному изобретению обладают минимальной иммуногенностью по отношению к человеку и подходят для применения при терапевтическом лечении людей.
Предпосылка изобретения
Лечение инфекционных заболеваний, вызванных бактериями, грибами, вирусами и паразитами в основном основано на химиотерапии. Однако появление организмов, устойчивых к лекарственным средствам, требует постоянной разработки новых антибиотиков. Лечение пациентов со злокачественными новообразованиями и раковыми опухолями также основано на химиотерапии. Однако многие из указанных способов лечения неэффективны, и высока смертность среди пациентов с такими заболеваниями. Как в случае инфекционных болезней, так и в случае рака необходимы усовершенствованные и новые способы лечения. Терапия резистентного к стероидам отторжения трансплантированных органов требует применения биологических реагентов (препаратов моноклональных или поликлональных антител), которые снимают протекающий аллоиммунный ответ у реципиента с трансплантатом. Основной проблемой в случае препаратов антител, полученных от животных, является присущая нечеловеческим иммуноглобулинам иммуногенность у пациентов людей. Чтобы уменьшить иммуногенность нечеловеческих антител, было предложено генетическое конструирование отдельных генов антител у животных. В частности было показано, что в результате слияния экзонов вариабельных (V) областей животных с экзонами константных (С) областей человека можно получить ген химерного антитела. Однако указанный подход может только устранять иммуногенность, вызванную Ес-областью нечеловеческого антитела, тогда как остальные нечеловеческие ЕаЬ-последовательности могут еще оставаться иммуногенными. При другом подходе гены иммуноглобулинов человека, как тяжелых, так и легких цепей иммуноглобулинов, вводили в геном мышей. Хотя указанный способ генетической инженерии в результате приводит к экспрессии полипептидов иммуноглобулинов человека в организме генетически сконструированных мышей, уровень экспрессии человеческих иммуноглобулинов достаточно низок. Это может быть следствием видоспецифических регуляторных элементов в локусах иммуноглобулинов, которые необходимы для эффективной экспрессии иммуноглобулинов. Как показано на трансфицированных линиях клеток, регуляторные элементы, имеющиеся в генах иммуноглобулинов человека, могут в организме животных, отличных от человека, функционировать неправильно.
Описано несколько регуляторных элементов в генах иммуноглобулинов. Особенно важное значение имеют энхансеры, расположенные ниже (3') константных областей тяжелой цепи, и интронные энхансеры в генах легких цепей. Кроме того, в генах иммуноглобулинов могут присутствовать другие регуляторные элементы, которые еще предстоит идентифицировать. Исследования на мышах показали, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы молекул иммуноглобулинов играют важную роль в регуляции уровней экспрессии химерных антител мышь-человека в сыворотке мышей, гомозиготных по гену Су1 человека. Поэтому для экспрессии гетерологичных генов иммуноглобулинов у животных желательно заменить последовательности, которые содержат энхансерные элементы и экзоны, кодирующие трансмембранный (экзон М1) и цитоплазматический концевой участок (экзон М2), последовательностями, которые в норме встречаются у животных в сходных положениях.
Введение генов иммуноглобулина человека в геном мышей приводило к экспрессии разнообразного спектра антител человека у мышей, полученных генно-инженерным путем. Как у мышей, так и у человека разнообразие антител создается в результате реаранжировки генов. Указанный процесс приводит к созданию множества различных рекомбинантных сегментов ν(Ό)1, кодирующих большое количество молекул антител с разными антигенсвязывающими участками. Однако у других животных, подобных кроликам, свиньям, коровам и птицам, разнообразие антител создается во многом отличающимся механизмом, называемым конверсией генов. Например, хорошо установлено, что у кролика и курицы νΌΙреаранжировка очень ограничена (почти 90% иммуноглобулинов формируются с З'-проксимальным элементом νΗ1), и разнообразие антител создается в результате конверсии генов и гипермутирования. Напротив, конверсия генов мыши и человека происходит очень редко, если вообще происходит. Поэтому предполагается, что у животных, у которых разнообразие антител образуется за счет конверсии генов, способ генетической инженерии, основанный на реаранжировке генов, приведет у животных к низкому титру антител и ограниченному разнообразию антител. Таким образом, генетическая инженерия на крупных животных с целью получения неиммуногенных препаратов антител для лечения человека требует альтернативной стратегии генетической инженерии.
- 1 013564
Литература, относящаяся к изобретению
Обзор применения препаратов поликлональных антител для лечения отторжения трансплантата недавно опубликован N. Воппе£оу-Вегагб е! а1.. 1. Неаг! Ьипд Тгапзр1ап! 1996; 15 (5): 435-442; С. Со1Ьу е! а1.. Апп. Рйагтасо!йег. 1996; 30 (10): 1164-1174; М.1. Иидап е! а1.. Апп. Нета!о1. 1997; 75 (1-2): 41-46. Применение терапии поликлональными антителами при аутоиммунных заболеваниях описано Сепбго\\'зкг Во11 Ιδ!. 81его!ег Мйап 1997; 58 (4): 339-343; Ь.К. Каб!гико££ е! а1.. Сап. 1. №иго1. δα. 1978; 5 (2): 175-178; 1.Е. \Уа1кег е! а1.. 1. №иго1. 8с1. 1976; 29 (2-4) : 303-309. Истощение жировых клеток с использованием препаратов антител описано Ь. Ие С1егсс.| е! а1.. 1. Атт. 8с1. 1997; 75 (7): 1791-1797; 1.Т. \Упдй1 е! а1.. ОЬез. Кез. 1995; 3 (3): 265-272.
Регуляторные элементы генов иммуноглобулинов описаны Вгаб1еу е! а1. (1999). ТгапзспрРопа1 епйапсегз апб !йе еуо1и!юп о£ !йе 1дН 1осиз; Ьаиз!ег. К. е! а1.. ЕтЬо 1. 12: 4615-23 (1993); Уо1щпа е! а1.. 1. 1ттипо1. 165: 6400 (2000); Но1е е! а1.. 1. 1ттипо1 146: 4377 (1991).
Увеличение разнообразия антител в результате конверсии генов у курицы и кролика описано ВиссЫш е! а1.. №!иге 32 6: 409-11 (1987); Кшдй! е! а1.. Абуапсез ш 1ттипо1оду 56: 179-218 (1994); Ьапдтап е! а1.. Кез. 1ттипо1. 144: 422-46 (1993). Создание мышей. экспрессирующих химерные антитела мышичеловека. описано Р1изсйке е! а1.. 1оигпа1 о£ 1ттипо1од1са1 Ме!йобз 215: 27-37 (1998). Создание мышей. экспрессирующих химерные антитела человека-мыши с мембранными и цитоплазматическими концевыми сегментами. полученными из антитела мыши. описано 2ои е! а1.. 8с1епсе 262: 1271-1274 (1993); 2ои е! а1. Сигг. Вю1. 4: 1099-1103. Создание мышей. экспрессирующих полипептиды иммуноглобулинов человека. описано Вгиддетапп е! а1. Сигг. Орт. Вю!есйпо1. 8 (4): 455-8 (1997); ЬопЬегд е! а1. 1п!. Кеу. 1ттипо1. 13 (1): 65-93 (1995); №иЬегдег е! а1.. №!иге 338: 350-2 (1989). Создание трансгенных мышей с использованием клона ВАС описано Уапд е! а1.. №!. Вю!есйпо1. 15: 859-65 (1997).
Создание трансгенных кроликов описано Рап. 1. е! а1.. Ра!йо1. 1п!. 49: 583-94 (1999); Вгет е! а1.. Мо1. Кергоб. Иеу. 44: 56-62 (1996). Клонирование кроликов на основе ядерного переноса описано 8йсе е! а1.. Вю1оду о£ Кергобисбоп 39: 657-664 (1988). Кролики с ослабленной экспрессией иммуноглобулинов описаны МсСайпеу-Ргапс1з е! а1.. Мо1. 1ттипо1. 24: 357-64 (1987); А11едгисс1. е! а1.. Еиг. 1. 1ттипо1. 21: 411-7 (1991).
Получение трансгенной курицы описано Е!сйез е! а1.. Ме!йобз т Мо1еси1аг Вю1оду 62: 433-450; Рат е! а1.. Се11з Т1ззиез Огдапз 1999; 165 (3-4): 212-9; 8апд. Н.. «Тгапздешс сй1скепз-те!йобз апб ро!епба1 аррбсабопз». Тгепбз Вю!есйпо1. 12: 415 (1994); и в \УО 200075300. «1п!гобистд а пис1ею ааб т!о ап ау1ап депоте. изе£и1 £ог бапз£есбпд ау1ап Ь1аз!обегта1 се11з £ог ргобистд !гапздешс ау1ап ашта1з \\йй 1Не безиеб депез. Ьу б1гес!1у т!гобистд !йе пис1ек ааб т!о !йе дегтта1 б1зс о£ !йе едд».
Курица с агаммаглобулинемией описана Рготте1 е! а1.. 1. 1ттипо1. 105 (1): 1-6 (1970); Вепебю! е! а1.. Абу. Ехр. Меб. Вю1. 1977; 88 (2): 197-205.
Клонирование животных из клеток описано Т. ^акауата е! а1.. №!иге 1998; 394: 369-374; 1. В. С1ЬеШ е! а1.. 8аепсе 280: 1256-1258 (1998); кВ. С1ЬеШ е! а1.. №!иге Вю!есйпо1оду 1998; 16: 642-646; А. Е. 8сйшеке е! а1.. 8аепсе 278: 2130-2133 (1997); К. Н. СатрЬе11 е! а1.. №!иге 380: 64-66 (1996).
Получение антител из трансгенных животных описано в патентах США №. 5814318. №. 5545807 и №. 5570429. Примеры гомологичной рекомбинации для получения химерных хозяев-млекопитающих приведены в патенте США №. 5416260. Способ введения ДНК в эмбрион описан в патенте США №. 5567607. Поддержание и размножение эмбриональных стволовых клеток описано в патенте США №. 5453357.
Обзор механизмов. вовлеченных в формирование разнообразия спектра антител у свиней. овец и коров. приведен в Ви!1ег. 1. Е. (1998). «1ттипод1оЬи1ш б1уегзйу. В-се11 апб апбЬобу герейоие беуе1ортеп! т 1агде £агт ашта1з». Кеу. δα. Тесй. 17: 43. Формирование разнообразия антител у овец описано в Кеупаиб. С. А.. С. Оагаа. ^. К. Нет. апб 1. С. \УеШ (1995). «Нурегти!а!юп депегабпд !йе зйеер 1ттипод1оЬи1т герейойе 1з ап апбдеп-тберепбеп! ргосезз». Се11 80: 115; и Ии£оиг. V.. δ. Мабпде. апб Р. №и. (1996). «Тйе зйеер 1д уапаЫе гедюп герейойе сопз1з!з о£ а зтд1е νΉ £атбу». 1. 1ттипо1. 156: 2163.
Сущность изобретения
Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным антителам (гуманизированным иммуноглобулинам). содержащим по меньшей мере часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека.
При этом антитело. которое обладает способностью связываться с антигеном. содержит по меньшей мере часть константной (С) области тяжелой цепи иммуноглобулина человека и аминокислотные последовательности варибельной области. кодируемые более чем одним вариабельным (V) сегментом гена иммуноглобулина. продуцируемая с использованием отличного от человека трансгенного животного. содержащая гуманизированный локус 1д. где указанный гуманизированный 1д-локус получен из 1длокуса отличного от человека трансгенного животного и содержит множество сегментов гена 1д. где по меньшей мере один из указанных сегментов гена является сегментом гена 1д человека. где указанные сегменты сближены друг с другом в нереаранжированной. частично реаранжированной или полностью реаранжированной конфигурации. и где указанный гуманизированный 1д-локус обладает способностью подвергаться конверсии генов и продуцировать репертуар гуманизированных иммуноглобулинов в орга
- 2 013564 низме отличного от человека трансгенного животного.
Гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных, отличных от человека, созданных генно-инженерным способом так, что они содержат один или более локусов гуманизированных 1д.
Предпочтительно гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных, отличных от человека, у которых разнообразие антител главным образом образуется в результате конверсии и гипермутирования генов, например, кролика, свиньи, курицы, овцы, коровы и лошади. Антитела можно получить посредством иммунизации трансгенных животных требуемым антигеном, таким как инфекционный агент (например, бактерии или вирусы) или их части или фрагменты.
Такие гуманизированные антитела обладают пониженной иммуногенностью у приматов, в частности у человека, по сравнению с негуманизированными антителами, полученными от животных, отличных от человека. Поэтому гуманизированные антитела согласно данному изобретению подходят для применения в терапевтическом лечении людей.
Другой вариант данного изобретения относится к препарату гуманизированных антител, которые могут быть моноклональными антителами или поликлональными антителами. Предпочтительные препараты антител согласно данному изобретению являются препаратами поликлональных антител, которые согласно данному изобретению обладают минимальной иммуногенностью по отношению к приматам, особенно человеку.
Предпочтительный препарат поликлональных антител состоит из гуманизированных молекул иммуноглобулина, имеющих, по меньшей мере, полипептидную последовательность константной области тяжелой цепи или легкой цепи, кодируемую сегментом гена константной области человека. Более предпочтительно вариабельные домены тяжелых цепей или легких цепей молекул иммуноглобулинов также кодируются сегментами генов человека.
В другом варианте данное изобретении относится к фармацевтическим композициям, которые включают препарат гуманизированных антител и фармацевтически приемлемый носитель.
Один гуманизированный локус 1д, представленный в изобретении, является гуманизированным локусом тяжелой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена Ό, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в гуманизированном локусе тяжелой цепи размещены по отношению друг к другу в нереаранжированной или частично или полностью реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гуманизированной тяжелой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно Са или Су. Более предпочтительный гуманизированный локус содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека наряду с участком константной области тяжелой цепи человека. Сегмент гена V человека помещен ниже нечеловеческих сегментов гена V.
Другой гуманизированный локус 1д представляет собой гуманизированный локус легкой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в локусе гуманизированной легкой цепи расположены по отношению к друг другу либо в нереаранжированной, либо в реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гуманизированной легкой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно СХ или Ск. Более предпочтительно, локус гуманизированной легкой цепи, кроме того, содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека. Сегмент гена V человека помещен ниже сегментов нечеловеческого гена V. Еще более предпочтительно, локус гуманизированной легкой цепи включает в себя реаранжированный сегмент VI человека, помещенный ниже ряда генных сегментов УЪ (например, 10-100) либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. З'-Фланкирующие последовательности Су коровы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СНЗ, и З'-праймер находится в М1. Последовательности клона 11, клона 3 и клона 5 указаны в 8ЕО ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 8Е0 ΙΌ N0: 5 соответственно.
Фиг. 2. З'-Фланкирующие последовательности Су овцы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН3, и 3'-праймер находится в М2. Последовательности клона 11 и клона 1 указаны в 8Е0 ΙΌ N0: 8 и 8Е0 ΙΌ N0: 9 соответственно.
Фиг. 3. Новая 3'-фланкирующая последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 10) гена С-гамма кролика.
Фиг. 4. Новая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 11) 3'-конца гена С-каппа-1 кролика.
Фиг. 5. Новые нуклеотидные последовательности (8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13) 5'-конца гена С-гамма кролика. Последовательности между ЗЕО ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13 (пробел длиной примерно 1000 нуклеотидов) еще предстоит определить.
Фиг. 6. Сравнение последовательностей человека, мыши, кролика, овцы, коровы и верблюда в М1и М2-участках 3'-конца гена С-гамма.
- 3 013564
Фиг. 7а. Конструкция ДНК для замены Ск кролика на Ск человека. Фрагмент длиной 0,5 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую Ск человека, фланкирован последовательностями гена Ск1 кролика. «Верхняя» последовательность (5'Ск) составляет 2,8 т.п.н., «нижняя» последовательность (3'Ск) составляет 2,6 т.п.н. Вектор также содержит кассету 1ох-пео для позитивной селекции и кассету Ηκν-Тк для негативной селекции.
Фиг. 7Ь. Конструкция ДНК для замены Су кролика на Су1 человека. Фрагмент длиной 1,8 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую Су1 человека, фланкирован последовательностями гена Су кролика. «Верхняя» последовательность (5'Су) составляет 1,9 т.п.н., «нижняя» последовательность (3'Су) составляет 3,1 т.п.н. Вектор также содержит кассету 1ох-пео для позитивной селекции и кассету Ηκν-Тк для негативной селекции. Масштаб фигуры не выдержан.
Фиг. 8. Фрагмент ДНК (8ЕО ΙΌ N0: 51), содержащий сегмент гена Су1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из фланкирующих участков гена Су кролика. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена Су кролика, подчеркнуты.
Фиг. 9. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 52), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична ν-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательность ν-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов νΗ1 и 1 кролика, подчеркнуты.
Фиг. 10. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 53), содержащий сегмент гена Ск тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из гена легкой цепи иммуноглобулина кролика каппа-1. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена Ск кролика, подчеркнуты.
Фиг. 11. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 54), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична ν-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательность ν-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и 1 кролика, подчеркнуты.
Фиг. 12. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 57), содержащий ген, кодирующий константную область легкой цепи иммуноглобулина человека С-лямбда-2, фланкированный 50 нуклеотидами (подчеркнуты), полученными из фланкирующих последовательностей гена С-лямбда курицы.
Фиг. 13. Модификация локуса легкой цепи курицы с использованием системы ЕТ. Геномный ВАСклон курицы с полноразмерным локусом легкой цепи модифицировали посредством гомологичной рекомбинации. На первой стадии Сл делетировали в результате инсерции кассеты для селекции, которую на второй стадии гомологичной рекомбинации заменяли на ген Сл человека.
Фиг. 14. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 58), содержащий сегмент гена VI, последовательность которого на 80% идентична сегментам гена V курицы, и кодирующий полипептид VI иммуноглобулина человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и 1 иммуноглобулина курицы, подчеркнуты.
Фиг. 15. Модифицированный локус легкой цепи курицы.
Подробное описание изобретения
Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным иммуноглобулинам (антителам).
Под «гуманизированным антителом» или «гуманизированным иммуноглобулином» подразумевается молекула иммуноглобулина, имеющая по меньшей мере часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека (или полипептидной последовательности, кодируемой сегментом гена Ιβ человека). Молекулы гуманизированных иммуноглобулинов согласно данному изобретению можно выделить из трансгенных животных, отличных от человека, полученных генно-инженерным способом, так, что они продуцируют молекулы гуманизированных иммуноглобулинов. Такие гуманизированные молекулы иммуноглобулинов менее иммуногены по отношению к приматам, в частности к человеку, по сравнению с негуманизированными молекулами иммуноглобулинов, выделенными от животного, или выделенными из клеток, полученных от животного.
Термин «животные, отличные от человека» в используемом в данном описании смысле включает в себя, но не ограничен указанным, кроликов, свиней, птиц (например, куриц, индеек, уток, гусей и тому подобных), овец, коз, коров и лошадей. Предпочтительными животными, отличными от человека, являются такие животные, у которых формирование разнообразия антител главным образом основано на конверсии генов и/или соматическом гипермутировании, например кролик, свиньи, птицы (например, курица, индейка, утка, гусь и тому подобные), овца, коза и корова. Особенно предпочтительными животными, отличными от человека, являются кролик и курица.
У таких животных, как человек и мышь, имеется множество копий сегментов гена V, Ό и 1 в локусе тяжелой цепи и множество копий сегментов гена V и 1 в локусе легкой цепи. Разнообразие антител у указанных животных главным образом формируется в результате реаранжировки генов, т.е. различных комбинаций сегментов гена с образованием реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи и
- 4 013564 вариабельной области легкой цепи. Однако у других животных (например, у кролика, курицы, овцы, козы и коровы) реаранжировка генов не играет значительной роли в создании разнообразия антител. Например, у кролика только очень ограниченное количество сегментов гена V, чаще всего сегменты гена V на З'-конце ν-области, используются в реаранжировке генов с образованием непрерывного участка νΟΙ У курицы только один сегмент гена V (участок, прилежащий к Ό-области или «3 '-проксимальный сегмент гена V»), один Ό-сегмент и один 1-сегмент используются при реаранжировке тяжелой цепи; и только один сегмент гена V (З'-проксимальный сегмент V) и один сегмент 1 используются при реаранжировке легкой цепи. Таким образом, у указанных животных существует небольшое разнообразие исходно реаранжированных последовательностей вариабельных областей, возникающих при формировании разнообразия воссоединением. Дальнейшее формирование разнообразия реаранжированных генов 1д достигается посредством конверсии генов, процесса, при котором короткие последовательности, полученные из расположенных выше сегментов гена V, заменяют короткие последовательности внутри сегмента гена V в реаранжированном гене 1д.
Термин «сегмент гена 1д» в используемом в данном описании смысле относится к участкам ДНК, кодирующим различные части молекулы 1д, которые присутствуют в зародышевой линии животных и человека, и которые сходятся вместе в В-клетках, образуя реаранжированные гены 1д. Таким образом, сегменты гена 1д в используемом в данном описании смысле включают в себя сегменты генов V, сегменты генов Ό, сегменты генов 1 и генные сегменты С-области.
Термин «сегмент гена 1д человека» в используемом в данном описании смысле включает в себя как последовательности сегмента гена 1д человека природного происхождения, так и вырожденные формы последовательностей сегмента гена 1д человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени идентичную полипептиду, кодируемому последовательностью сегмента гена 1д человека природного происхождения. «В значительной степени» означает, что степень идентичности аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере примерно 85-95%.
Предпочтительная молекула гуманизированного иммуноглобулина согласно данному изобретению содержит по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно молекула иммуноглобулина содержит по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека и по меньшей мере часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека.
В другом варианте данное изобретение относится к препарату гуманизированных антител.
Термин «препарат гуманизированных антител» означает продукт, представленный выделенным антителом, или продукт, представленный очищенным антителом, полученный из трансгенного животного, отличного от человека (например, из сыворотки, молока или яичного желтка животного) или из клеток, полученных из трансгенного животного, отличного от человека (например, В-клетки или клетки гибридомы).
Препарат гуманизированного антитела может быть препаратом поликлональных антител, который включает в себя спектр гуманизированных молекул иммуноглобулина. Препарат гуманизированных антител также может представлять собой препарат моноклонального антитела.
Хотя иммуногенность препарата гуманизированного моноклонального антитела по отношению к человеку также снижена по сравнению с препаратом негуманизированного моноклонального антитела, препараты гуманизированных поликлональных антител являются предпочтительными вариантами данного изобретения. Выяснено, что гуманизированные моноклональные антитела еще вызывают некоторую степень иммунного ответа (антиидиотипический ответ) у приматов (например, человека) при многократном введении в больших количествах вследствие уникального и нового идиотипа моноклонального антитела. Авторы данного изобретения однозначно показали, что общая иммуногенность поликлональных антител менее зависима от антиидиотипического ответа. Например, поликлональные антитела, полученные от животных, отличных от человека, в которых гуманизированы только элементы константной области (например, поликлональные антитела, имеющие константные области, кодируемые сегментами гена человека, и имеющие вариабельные домены, кодируемые эндогенными генами животного, отличного от человека), по существу, не иммуногены у приматов.
Без намерения связать с какой-либо теорией, авторы данного изобретения предположили, что сниженная иммуногенность такого препарата гуманизированных поликлональных антител является следствием того факта, что препарат содержит очень большое количество различных антител, с большим количеством разных идиотипов, которые в большой степени определяются новыми аминокислотными последовательностями в гипервариабельных областях (СЭК) тяжелой и легкой цепи. Поэтому при введении такого препарата примату, такому как человек, введенное количество каждой отдельной молекулы иммуноглобулина в препарате может быть слишком мало, чтобы вызвать иммунный ответ против каждой молекулы иммуноглобулина. Таким образом, препарат гуманизированных поликлональных антител, который имеет много разных идиотипов и вариабельных областей, обладает минимальной иммуногенностью по отношению к реципиенту, даже если все антитела в препарате поликлональных антител направлены к одному и тому же антигену. Чтобы далее снизить какую-либо потенциальную остаточную имму
- 5 013564 ногенность, можно получить препарат гуманизированных поликлональных антител, который состоит из молекул иммуноглобулина, имеющих как вариабельные домены, так и константные области, кодируемые сегментами гена 1д человека.
В предпочтительном варианте данное изобретение относится к препарату антитела, который включает в себя гуманизированные молекулы иммуноглобулинов, имеющие по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно, гуманизированные иммуноглобулины в препарате антител согласно данному изобретению дополнительно содержат по меньшей мере часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека в дополнение по меньшей мере к части полипептидной последовательности константной области человека.
Предпочтительные препараты гуманизированных антител согласно данному изобретению состоят из гуманизированных антител, полученных от трансгенных животных, отличных от человека, разнообразие антител которых главным образом формируется в результате конверсии генов, таких как кролик, птицы (например, курица, индейка, утка, гусь и тому подобные), овца, коза и корова; предпочтительно кролик и курица.
После получения трансгенного животного, отличного от человека, способного продуцировать разнообразные гуманизированные молекулы иммуноглобулинов (как, кроме того, указано далее) гуманизированные иммуноглобулины и препараты гуманизированных антител против антигена легко можно получить посредством иммунизации животного антигеном. Для иммунизации трансгенного животногохозяина можно использовать множество антигенов. Такие антигены включают микроорганизм, например, вирусы и одноклеточные организмы (такие как бактерии и грибы), живые, аттенуированные или мертвые, фрагменты микроорганизмов или антигенные молекулы, выделенные из микроорганизмов.
Предпочтительные бактериальные антигены для применения при иммунизации животного включают очищенные антигены §1арйу1ососси8 аигеик, такие как капсульные полисахариды типа 5 и 8, рекомбинантные версии факторов вирулентности, таких как альфа-токсин, белки, связывающие адгезии, белки, связывающие коллаген, и белки, связывающие фибронектин. Предпочтительные бактериальные антигены также включают аттенуированный вариант Б. аигеик, Ркеиботопак аетидшока, энтерококк, энтеробактерию и К1еЬ§1е11а рпеитотае, или надосадок культуры клеток указанных бактерий. Другие бактериальные антигены, которые можно использовать для иммунизации, включают очищенный липополисахарид (ЛПС), капсульные антигены, капсульные полисахариды и/или рекомбинантные варианты белков наружной мембраны, белки, связывающие фибронектин, эндотоксин и экзотоксин Ркеиботопак аетидшока, энтерококк, энтеробактерию и КЛеЬЧеИа рпеитотае.
Предпочтительные антигены для создания антител против грибов включают аттенуированные варианты грибов или белков их наружной мембраны, и указанные грибы включают, но не ограничены указанным, Сапб1ба а1Ысап8, Сапб1ба рагарЩокщ, Сапб1ба РоркаШ и Стур1ососси8 пеоГогтшъ.
Предпочтительные антигены для применения при иммунизации для того, чтобы получить антитела против вирусов, включают белки оболочки и аттенуированные варианты вирусов, которые включают, но не ограничены указанным, респираторно-синцитиальный вирус (РБУ) (в частности, Р-белок), вирус гепатита С (НСУ), вирус гепатита В (НВУ), цитомегаловирус (СМУ), ЕВУ и НБУ.
Терапевтические антитела для лечения рака можно получить иммунизацией трансгенных животных выделенными клетками опухоли или линиями опухолевых клеток; ассоциированными с опухолями антигенами, которые включают, но не ограничены указанным, антиген Нег-2-пеи (антитела против которого применимы для лечения рака молочной железы); антигены СЭ20, СЭ22 и СЭ53 (антитела против которых применимы для лечения В-клеточных лимфом), (3) специфичный для простаты мембранный антиген (РМБА) (антитела против которого применимы для лечения рака простаты) и молекула 17-1А (антитела против которой применимы для лечения рака толстой кишки).
Антигены можно вводить трансгенному животному-хозяину любым обычным способом с адъювантом или без него и можно вводить согласно назначаемой схеме.
После иммунизации сыворотку или молоко иммунизированных трансгенных животных можно фракционировать для очистки поликлональных антител, специфичных по отношению к антигену до фармацевтической степени очистки. В случае трансгенных птиц антитела также можно получить фракционированием яичных желтков. Концентрированную очищенную иммуноглобулиновую фракцию можно получить хроматографией (аффинной, ионообменной, гель-фильтрацией и т.д.), избирательным осаждением солями, такими как сульфат аммония, органическими растворителями, такими как этанол или полимерами, такими как полиэтиленгликоль.
Для получения моноклональных антител выделяют клетки селезенки от иммунизированного трансгенного животного и используют либо в слиянии клеток с трансформированными линиями клеток для получения гибридом, либо кДНК, кодирующую антитела, клонируют стандартными способами молекулярной биологии и экспрессируют в трансфецированных клетках. Методики получения моноклональных антител хорошо разработаны в данной области. См., например, Европейскую патентную заявку 0583980 А1 («МеШоб Рог СепетаИпд Мопос1опа1 АпДЬоФек Ргот КаЬЬйь»), патент США Ыо. 4977081 («Б1аЬ1е ВаЬЬй-Моике НуЬпботак Апб Бестебоп Ртобис18 ТйетеоГ»), \УО 97/16537 («Б1аЬ1е СЫскеп В-се11 Ыпе Апб
- 6 013564
Ме!йоб оГ Ике ТйегеоГ») и ЕР 0491057 В1 («НуЬпбота \νΐιίο1ι Ртобисек Лу1ап Зресгйс 1ттипод1оЬи1т С»), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки. Продукция моноклональных антител ίη уйто на основе клонированных молекул кДНК описана Лпбп5^|бйорГ е1 а1., «Ме1йоб8 Гог !йе депетайоп оГ сЫскеп топос1опа1 апбЬобу Гтадтепк Ьу рйаде бкр1ау», 1. 1ттипо1. Ме1йоб8 242: 159 (2000) и Вийоп, Ό. В., «Рйаде бкр1ау», 1ттипо1есйпо1оду 1: 87 (1995), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки.
В следующем варианте данного изобретения очищенные моноклональные или поликлональные антитела смешивают с соответствующим фармацевтическим носителем, пригодным для введения приматам, в частности человеку, чтобы получить фармацевтические композиции. Фармацевтически приемлемыми носителями, которые можно использовать в данных фармацевтических композициях, могут быть любые и все растворители, дисперсионные среды, изотоничные агенты и тому подобное. За исключением случаев, когда любые обычные среды, агент, разбавитель или носитель вредят реципиенту или терапевтической эффективности находящихся в них антител, их применение в фармацевтических композициях согласно данному изобретению приемлемо. Носителем могут быть жидкие, полутвердые, например, пасты, или твердые носители. Примеры носителей включают масла, воду, физиологические растворы, спирт, сахар, гель, липиды, липосомы, смолы, пористые основы, связывающие вещества, наполнители, покрытия, консерванты и тому подобное, или их комбинации.
Данное изобретение, кроме того, относится к новым нуклеотидным последовательностям и векторам, а также к применению последовательностей и векторов для получения трансгенного животного, отличного от человека, которое продуцирует гуманизированные иммуноглобулины.
В общем, генетическая инженерия животного, отличного от человека, заключается в интеграции одного или более сегментов гена 1д в геном животного, чтобы создать один или более гуманизированных локусов 1д. Следует заметить, что в зависимости от подхода, используемого в генетической модификации, сегмент гена 1д человека можно интегрировать в эндогенный локус 1д животного (например, в результате направленной инсерции) или в другой локус животного. Другими словами, гуманизированный локус 1д может находиться в положении хромосомы, в котором обычно находится эндогенный локус 1д животного, или в положении хромосомы, отличном от положения, в котором обычно находится эндогенный локус 1д животного. Независимо от хромосомного положения гуманизированный локус 1д согласно данному изобретению обладает способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов у животного, отличного от человека, тем самым, продуцируя разнообразный спектр гуманизированных молекул иммуноглобулинов. Локус 1д, обладающий способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, в данном описании также называется «функциональным» локусом 1д, и антитела в случае разнообразия, создаваемого функциональным локусом 1д, также называются в данном описании «функциональными» антителами или «функциональным» спектром антител.
В одном варианте данное изобретение относится к новым последовательностям, применимым для создания гуманизированного локуса 1д и получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные молекулы иммуноглобулинов. В частности, данное изобретение относится к последовательностям из 5'- и З'-фланкирующих участков сегментов гена 1д животного, отличного от человека, предпочтительно животного, создание разнообразия антител которого главным образом основано на конверсии генов (например, кролика, свиньи, овцы, козы, коровы, птиц, таких как курица, индейка, утка, гусь и тому подобные).
5'- и З'-фланкирующие участки генов, кодирующих константную область, являются особенно важными, так как указанные последовательности содержат нетранслируемые регуляторные элементы (например, энхансеры), необходимые для высокой экспрессии 1д в сыворотке. 3'-Фланкирующий участок генов, кодирующих константную область тяжелой цепи, также содержит экзоны, кодирующие мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы иммуноглобулина (Уо1дша е1 а1. 1. 1ттипо1. 165: 6400, 2000). Ранее было установлено, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы антител необходимы для достижения высокого уровня экспрессии антител в сыворотке мышей (2ои е1 а1., 8аепсе 262: 1271, 1993). Таким образом, идентификация фланкирующих последовательностей позволяет осуществлять замену экзонов и промежуточных интронов гена Су человеческим эквивалентом и сохранять эндогенные экзоны, кодирующие трансмембранную и цитоплазматическую концевую области, а также эндогенные некодирующие энхансерные последовательности.
В одном варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих Су кролика, Су1,2,3 коровы и Су 1,2 овцы. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают 8ЕО ГО N0: 10 (3' Су кролика), ШТ) ГО N0: 3-5 (3' Су1,2,3 коровы) и ШТ) ГО N0: 8-9 (3' Су 1,2 овцы).
В другом варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, данное изобретение относится к нуклеотидным последовательностям ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих Ск у кроликов. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают 8Е0 ГО N0: 11 (3' Ск кроли- 7 013564 ка).
В еще одном варианте данное изобретение относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности выше (5', 5-штрих) гена Су кролика. Особенно предпочтительные последовательности включают БЕО ΙΌ N0: 12 и БЕО ΙΌ N0: 13.
Другой вариант данного изобретения относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека.
Данное изобретение относится к частям указанных выше новых фланкирующих последовательностей. «Часть» означает фрагмент фланкирующей нуклеотидной последовательности, способный опосредовать гомологичную рекомбинацию между сегментом гена 1д человека и сегментом гена 1д животногомишени. В общем, часть составляет по меньшей мере примерно 200 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере примерно 400 пар оснований в случае рекомбинации в таких клетках животных, как клетки ЕБ или фибробласты, и по меньшей мере 40 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 50 пар оснований в случае рекомбинации в Е. сой. Примеры частей указанных выше новых фланкирующих последовательностей включают БЕО ГО N0: 5 9-60, 61-62, 63-64, 65-66, 67-68 и 69-70 (представленные подчеркнутыми последовательностями на фиг. 8-12 и 14, соответственно).
В следующем аспекте данное изобретение относится к векторам, пригодным для замены сегмента гена 1д животного, отличного от человека, соответствующим сегментом гена 1д человека. Указанные векторы, также называемые в данном описании «рекомбинантными векторами», включают сегмент гена 1д человека, который связан с фланкирующими последовательностями на 5'-конце и З'-конце, при этом степень гомологии фланкирующих последовательностей с фланкирующими последовательностями сегмента гена 1д животного-мишени достаточна для опосредования гомологичной рекомбинации между сегментами гена человека и гена животного. Как правило, по меньшей мере, примерно 200 оснований должны быть идентичными во фланкирующих областях в рекомбинантном векторе и фланкирующих областях гена-мишени для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в клетках животных, таких как клетки ЕБ и фибробласты; и по меньшей мере примерно 40 оснований должны быть идентичными для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в Е. сой.
Представлены рекомбинантные векторы, пригодные для замены генов константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина животного, которые содержат от 5'- к З'-концу нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени, ген константной области тяжелой цепи человека (например, Су1 человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную З'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени.
Представлены предпочтительные рекомбинантные векторы для замены генов константных областей тяжелой цепи кролика. Один такой вектор содержит в направлении 5' 3', нуклеотидную последовательность, указанную в БЕО ГО N0: 12 или БЕО ГО N0: 13, или их часть, сегмент гена константной области тяжелой цепи человека, нуклеотидную последовательность, указанную в БЕО ГО N0: 10, или часть БЕО ГО N0: 10. Другой такой вектор содержит БЕО ГО N0: 51 (фиг. 8), которая характеризуется тем, что содержит ген Су1 человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'фланкирующих участков гена константной области тяжелой цепи кролика.
Также представлены рекомбинантные векторы, которые применимы для замены генов константных областей легкой цепи иммуноглобулина животного. Такие векторы содержат в направлении 5' 3' нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени, ген константной области легкой цепи человека (например, Ск или Сл человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную 3'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени.
Предпочтительные векторы включают векторы для замены генов константных областей легкой цепи кролика. Предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в БЕО ГО N0: 53, и указанная последовательность характеризуется тем, что содержит ген Ск человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена Ск1 легкой цепи кролика.
Другие представленные рекомбинантные векторы включают векторы, применимые для замены элементов У-области 1д животного. Например, представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента У-области тяжелой цепи кролика, который содержит БЕО ГО N0: 52. Представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента У-области легкой цепи кролика, который содержит БЕР ГО N0: 54.
Рекомбинантные векторы согласно данному изобретению могут включать дополнительные последовательности, которые облегчают селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации. Например, маркерные гены, кодирующие устойчивость к неомицину, блеомицину, пуромицину и тому подобному, можно включить в рекомбинантные векторы, чтобы облегчить селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации.
- 8 013564
В следующем аспекте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям или векторам, несущим один или более гуманизированных локусов 1д.
В одном варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус тяжелой цепи 1д, который включает один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена Ό, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена представляет собой сегмент гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в таком гуманизированном локусе тяжелой цепи расположены по отношению друг к другу в нереаранжированной конфигурации (или «конфигурации гаметического типа») или в частично или полностью реаранжированной конфигурации. Гуманизированный локус тяжелой цепи обладает способностью подвергаться реаранжировке генов (если сегменты генов не полностью реаранжированы) и конверсии генов у животного, отличного от человека, продуцируя при этом разнообразный спектр тяжелых цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или «гуманизированных тяжелых цепей».
В предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи содержит, по меньшей мере, сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно Са или Су (включая любые подклассы Су 1, 2, 3 и 4).
В другом более предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи трансгена содержит гуманизированную ν-область и гуманизированную С-область, т.е., ν-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена νΗ человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, Са или Су человека).
Предпочтительно гуманизированная ν-область содержит по меньшей мере примерно 10-100 сегментов гена ν тяжелой цепи (или «νΗ»), по меньшей мере один из которых является сегментом гена νΗ человека. Согласно данному изобретению сегмент гена νΗ человека, включенный в трансген, обладает по меньшей мере примерно 75-85% гомологией с участками гена νΗ животного-хозяина, в частности, с участками гена νΗ животного, включенными в вышерасположенный участок трансгена. Как описано выше, участок νΗ человека охватывает последовательности сегмента гена νΗ человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена νΗ человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность в значительной степени (т.е. по меньшей мере примерно на 85-95%) идентичную полипептиду ν-домена тяжелой цепи человека.
Предпочтительно сегмент(ы) гена νΗ человека помещают ниже нечеловеческих сегментов νΗ в трансгенном локусе. Предпочтительно нечеловеческие сегменты гена νΗ в трансгене представляют собой сегменты гена νΗ из З'-УН-области в локусе 1д животного-хозяина, включая З'-проксимальный νΗ1.
В другом варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус легкой цепи, способный претерпевать реаранжировку генов и конверсию генов у животного-хозяина, продуцируя при этом разнообразный спектр легких цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или «гуманизированных легких цепей».
Гуманизированный локус легкой цепи включает один или более сегментов гена ν, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в гуманизированном локусе легкой цепи расположены друг относительно друга в нереаранжированной конфигурации (или «конфигурации гаметического типа») или в полностью реаранжированной конфигурации.
В предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи содержит, по меньшей мере, сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно СХ или Ск.
В другом предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи трансгена содержит гуманизированную ν-область и гуманизированную С-область, например ν-область, имеющую по меньшей мере один ген УЬ человека и/или по меньшей мере один реаранжированный сегмент VI человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, СХ или Ск).
Предпочтительно гуманизированная ν-область включает, по меньшей мере, примерно 10-100 сегментов гена ν легкой цепи (или «УЬ»), по меньшей мере один из которых является сегментом гена УЬ человека. Сегмент гена УЬ человека, включенный в трансген, проявляет по меньшей мере примерно 7585% гомологии с сегментами гена УЬ животного-хозяина, в частности сегментами гена УЬ животного, включенными в вышерасположенный участок трансгена. Соответственно сегмент УЬ человека охватывает последовательности сегмента гена УЬ человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена УЬ человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени (т.е. по меньшей мере примерно на 85-95%) идентичную полипептиду домена ν легкой цепи человека.
Предпочтительно сегмент(ы) гена УЬ человека помещают ниже нечеловеческих сегментов УЬ в трансгенном локусе. Нечеловеческие сегменты гена νΗ в трансгенной конструкции выбраны из сегментов гена νΗ в З'-УЬ-области локуса легкой цепи животного-хозяина, включая З'-проксимальный УЬ1.
- 9 013564
В еще одном предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи включает реаранжированный сегмент VI человека, помещенный ниже ряда (например, 10-100) сегментов гена УЬ либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения.
Другой аспект данного изобретения относится к способам получения трансгенного вектора, содержащего гуманизированный локус 1д. Такие способы заключаются в выделении локуса 1д или его части от животного, отличного от человека, и встраивании требуемого сегмента(ов) гена 1д человека в выделенный локус 1д животного или выделенную часть локуса 1д животного. Сегмент(ы) гена 1д человека встраивают в выделенный локус 1д животного или его часть посредством лигирования или гомологичной рекомбинации таким образом, при котором сохраняется способность локуса претерпевать эффективную реаранжировку генов и конверсию генов у животного, отличного от человека.
Предпочтительно фрагменты ДНК, содержащие локус 1д, которые необходимо гуманизировать, выделяют из животных, у которых разнообразие антител формируется в результате конверсии генов, например, кролика или курицы. Такие большие фрагменты ДНК можно выделить посредством скрининга библиотеки на основе плазмид, космид, УЛС или ВАС и тому подобных, полученных из геномной ДНК животного, отличного от человека. Полная С-область животного может находиться в одном плазмидном или космидном клоне, который затем подвергают гуманизации. Клоны УЛС могут нести фрагменты ДНК длиной до 2 миллионов оснований, таким образом, полный локус тяжелой цепи животного или его большую часть можно выделить в одном клоне УЛС или реконструировать так, чтобы он находился в одном клоне УЛС. Клоны ВАС способны нести фрагменты ДНК меньших размеров (примерно 150-250 т.п.н.). Однако множество клонов ВАС, содержащих перекрывающиеся фрагменты локуса 1д, можно гуманизировать отдельно и затем вместе инъецировать в клетку животного-реципиента, при этом перекрывающиеся фрагменты рекомбинируют в клетке животного-реципиента с образованием непрерывного локуса 1д
Сегменты гена 1д человека можно интегрировать в локус 1д в векторе (например, клоне ВАС) множеством способов, включая лигирование фрагментов ДНК или инсерцию фрагментов ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Интеграцию сегментов гена 1д человека осуществляют таким образом, чтобы сегмент гена 1д человека функционально связать с последовательностью животного-хозяина в трансгене, чтобы получить функциональный гуманизированный локус 1д, т.е. локус 1д, способный к реаранжировке генов и конверсии генов, которые приводят к продукции разнообразного спектра гуманизированных антител.
Предпочтительно сегменты гена 1д человека интегрируют в локус 1д гомологичной рекомбинацией. Гомологичную рекомбинацию можно выполнить в бактериях, дрожжевых и других клетках с высокой частотой событий гомологичной рекомбинации. Например, дрожжевую клетку трансформируют УЛС, содержащей локус 1д животного или его большую часть. Затем такую дрожжевую клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который описан выше, который несет сегмент гена 1д человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и З'-фланкирующей последовательностью. 5'и З'-фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента гена 1д животного в УЛС. В результате гомологичной рекомбинации сегмент гена 1д животного в УЛС заменяют сегментом гена 1д человека. Альтернативно, бактериальную клетку, такую, как Е. сой, трансформируют ВАС, содержащей локус 1д животного или его большую часть. Такую бактериальную клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который несет сегмент гена 1д человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и З'-фланкирующей последовательностью. 5'- и З'-фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе опосредуют гомологичную рекомбинацию и обмен между сегментом гена 1д человека в рекомбинантном векторе и сегментом гена 1д животного в ВАС. Гуманизированные УЛС и ВАС легко можно выделить из клеток и использовать для получения трансгенных животных.
В следующем аспекте данное изобретение относится к способам получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные иммуноглобулины.
Согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, получают введением в реципиентную клетку или клетки животного одного или более трансгенных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут гуманизированный локус 1д, и получением животного из генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток.
Предпочтительно реципиентные клетки являются клетками животных, отличных от человека, которые образуют разнообразие антител посредством конверсии генов и гипермутирования, например, птиц (таких как курица), кроликов, коров и тому подобных. У таких животных для продуцирования иммуноглобулинов предпочтительно используется З'-проксимальный сегмент гена V. Интеграция сегмента гена V человека в локус 1д в трансгенном векторе либо путем замены З'-проксимального сегмента гена V животного, либо путем помещения в непосредственной близости к З'-проксимальному сегменту гена V, приводит к экспрессии полипептидных последовательностей V-области человека в большинстве иммуноглобулинов. Альтернативно реаранжированный сегмент ΥΐΌ)] человека можно встроить в локус 1 иммуноглобулинового локуса в трансгенном векторе.
Трансгенные векторы, содержащие гуманизированный локус 1д, вводят в реципиентную клетку или
- 10 013564 клетки, и затем они интегрируют в геном реципиентной клетки или клеток в результате случайной интеграции или направленной интеграции.
В случае случайной интеграции трансгенный вектор, содержащий гуманизированный локус 1д, можно ввести в реципиентную клетку животного стандартным трансгенным способом. Например, трансгенный вектор можно непосредственно инъецировать в пронуклеус оплодотворенного ооцита. Трансгенный вектор также можно вводить совместной инкубацией спермы с трансгенным вектором до оплодотворения ооцита. Из оплодотворенных ооцитов могут развиваться трансгенные животные. Другой способ введения трансгенного вектора состоит в трансфекции эмбриональных стволовых клеток и затем инъецировании генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в развивающиеся эмбрионы. Альтернативно трансгенный вектор («голый» или в комбинации с облегчающими введение реагентами) можно непосредственно инъецировать в развивающийся эмбрион. В конечном счете, химерных трансгенных животных получают из эмбрионов, которые содержат трансген гуманизированного 1д, интегрированный в геном, по меньшей мере, нескольких соматических клеток трансгенного животного.
В предпочтительном варианте трансген, содержащий гуманизированный локус 1д, случайным образом интегрируют в геном реципиентных клеток (таких как оплодотворенный ооцит или развивающиеся эмбрионы), полученных из линий животных с нарушенной экспрессией эндогенных генов иммуноглобулина. Применение таких линий животных обеспечивает преимущественную экспрессию молекул иммуноглобулина из гуманизированного трансгенного локуса 1д. Примеры таких животных включают линии кроликов А11С1а и Вакйеа, а также линию куриц агаммаглобулинемией. Альтернативно трангенных животных с гуманизированными трансгенами или локусами иммуноглобулинов можно скрестить с линиями животных с нарушенной экспрессией эндогенных иммуноглобулинов. Можно получить потомство, гомозиготное по нарушенному эндогенному локусу 1д и гуманизированному трансгенному локусу 1д.
В случае направленной интеграции трансгенный вектор можно ввести в соответствующие реципиентные клетки животного, такие как эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Затем клетки, в которых трансген был интегрирован в геном животного и заменил соответствующий эндогенный локус 1д посредством гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Затем отобранные клетки можно слить с единичными клетками с удаленным ядром для ядерного переноса, например, ооцитами или эмбриональными стволовыми клетками, клетками, которые являются полипотентными и способны формировать функциональный организм новорожденного. Слияние выполняют согласно традиционным способам, которые хорошо разработаны. См., например, С1ЬеШ е1 а1., 8с1еисе (1998) 280: 1256. Удаление ядер ооцитов и ядерный перенос также можно выполнять посредством микрохирургии с использованием инъекционных пипеток. (См., например, \¥акауата е1 а1., №11иге (1998) 394: 369.). Затем полученные в результате яйцеклетки культивируют в соответствующей среде и переносят синхронизированным реципиентам для получения трансгенных животных. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, затем развивающиеся в химерных животных.
Кроме того, согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, также можно получить введением в реципиентную клетку или клетки одного или более рекомбинантных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут сегмент гена 1д человека, связанный с 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями, которые гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента эндогенного гена 1д, отбором клеток, в которых сегмент эндогенного гена 1д заменен сегментом гена 1д человека в результате гомологичной рекомбинации, и получением животного из отобранной генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток.
Подобно случаю с направленной инсерцией трансгенного вектора клетки, подходящие для применения реципиентных клеток в указанном способе, включают эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Рекомбинантный вектор, несущий сегмент гена 1д человека, можно вводить в такие реципиентные клетки любыми подходящими способами, например трансфекцией. Затем клетки, в которых сегмент гена 1д человека заменил соответствующий сегмент эндогенного гена 1д в результате гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Указанные генетически модифицированные клетки могут служить в качестве клеток-доноров ядер в процессе ядерного переноса при клонировании трансгенного животного. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные эмбриональные стволовые клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, которые затем могут развиться в химерных животных.
Трансгенные животные, получаемые любым из указанных выше способов, составляют другой вариант данного изобретения. Трансгенные животные имеют по меньшей мере один, т.е. один или более, гуманизированных локусов 1д в геноме, из которых продуцируется функциональный спектр гуманизированных антител.
В предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным кроликам, имеющим один или более гуманизированных локусов 1д в геноме. Трансгенные кролики согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов 1д и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител.
В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным курицам,
- 11 013564 имеющим один или более гуманизированных локусов 1д в геноме. Трансгенные курицы согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов 1д и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител.
Клетки, полученные из трансгенных животных согласно данному изобретению, такие как В-клетки или линии клеток, полученные из трансгенного животного, иммунизированного против антигена, также являются частью данного изобретения.
В следующем аспекте данное изобретение относится к способам лечения заболевания примата, в частности человека, посредством введения композиции очищенного гуманизированного антитела, предпочтительно композиции гуманизированных поликлональных антител, необходимой для лечения указанного заболевания.
Композиции гуманизированных поликлональных антител, используемые для введения, в общем, характеризуются тем, что они содержат популяцию поликлональных антител, имеющую концентрации иммуноглобулинов от 0,1 до 100 мг/мл, более обычно от 1 до 10 мг/мл. Композиция антител может содержать иммуноглобулины разных изотипов. Альтернативно композиция антител может содержать антитела только одного изотипа или ряда выбранных изотипов.
В большинстве случаев композиция антител состоит из немодифицированных иммуноглобулинов, т.е. гуманизированных антител, полученных от животного без дополнительной модификации, например, химическими веществами или ферментами. Альтернативно фракцию иммуноглобулинов можно подвергнуть такой обработке, как ферментативное расщепление (например, пепсином, папаином, плазмином, гликозидазами, нуклеазами, и.т.д.), нагревание, и т.д., и/или далее фракционировать.
Композиции антител, как правило, вводят в сосудистую систему, для удобства внутривенно путем инъекции или инфузии через катетер, имплантированный в соответствующую вену. Композицию антител вводят с соответствующей скоростью, как правило, в пределах примерно от 10 мин до 24 ч, более обычно примерно от 30 мин до 6 ч, в соответствии со скоростью, при которой пациент может воспринимать жидкость. Введение эффективной дозы можно осуществлять путем однократной инфузии или серии инфузий. Многократные инфузии можно вводить раз в день, раз в неделю, раз в месяц или раз каждые три месяца, в зависимости от периода полужизни препарата антител и клинических показаний. В случае применений на эпителиальных поверхностях композиции антител наносят на поверхность, которую необходимо обработать, в количестве, достаточном для обеспечения планируемого конечного результата, и при необходимости нанесение можно повторять.
Композиции антител можно использовать для связывания и нейтрализации антигенных единиц в тканях организма человека, которые вызывают заболевание или которые вызывают нежелательные или аномальные иммунные ответы. «Антигенная единица» в данном описании является определением, которое охватывает любые растворимые или связанные с клеточной поверхностью молекулы, включая белки, а также клетки или организмы, вызывающие инфекционные заболевания, или агенты, которые, по меньшей мере, способны связывать антитело и предпочтительно также способны стимулировать иммунный ответ.
Введение композиции антител против инфекционного агента в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией приводит к удалению инфекционных частиц. Однократное введение антител снижает количество инфекционных частиц, как правило, от 10 до 100 раз, более обычно более чем в 1000 раз. Подобным образом, терапия антителами у пациентов со злокачественным заболеванием, используемая в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией, снижает количество злокачественных клеток, как правило, от 10 до 100 раз или более, чем в 1000 раз. Терапию можно повторять в течение длительного периода времени, чтобы обеспечить полное удаление инфекционных частиц, злокачественных клеток и т.д. В некоторых случаях терапия препаратами антител будет продолжаться в течение длительных периодов времени в отсутствие регистрируемых количеств инфекционных частиц или нежелательных клеток. Подобным образом, применение терапии антителами для модулирования иммунных ответов может заключаться в однократном или многократном введениях терапевтических антител. Терапия может продолжаться в течение длительных периодов в отсутствие каких-либо симптомов заболевания.
Лечение субъекта можно применять вместе с химиотерапией в дозах, достаточных для ингибирования инфекционного заболевания или злокачественных новообразований. Для пациентов с аутоиммунным заболеванием или реципиентов трансплантатов терапию антителами можно применять вместе с иммуносупрессирующей терапией в дозах, достаточных для подавления иммунных реакций.
Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами, но не ограничено ими.
Пример 1. Новые последовательности З'-конца гена Су коров, овец и кроликов.
Геномную ДНК выделяли из крови симментальской коровы с использованием набора для выделения ДНК из крови ΟΙΛαιηρ (φΙΑΟΕΝ). Геномный З'-участок гена Су коровы (т.е., З'-фланкирующую последовательность гена Су коровы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры:
5'-праймер: 5'сдсаадсйССТАСАС6Т6Т6Т66Т6АТ63' (8Εφ ΙΌ ΝΟ: 1);
З'-праймер: 5'сдса;щсиААСАТСС\УСАТССТ8СТСС.А3' (8Εφ ΙΌ ΝΟ: 2) (универсальный вырож
- 12 013564 денный код: ^=(Л/Т), 8=(С/С)).
Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами взята из экзона 3 Су, и часть, указанная строчными буквами, представляет концевой сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ. Часть 3'-праймера, указанная заглавными буквами, представляла собой вырожденную последовательность, сконструированную в соответствии с опубликованными последовательностями экзона М1 человека и экзона М1 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ. ПЦР-фрагмент длиной 1,3 т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы ЕХРАНЭ (КосНе). Фрагмент очищали в геле, расщепляли ΗίηάΙΙΙ и клонировали в клонирующем векторе В1иекспр1. Полученные в результате клоны разделялись на три популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, получаемых с помощью ВатШ, ЕсоКI и ХНоС Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 1 (8ЕО ΙΌ N0: 3-5).
Геномную ДНК выделяли из крови мериносовых овец, используя набор для выделения ДНК из крови ΟΙΛαιηρ (ОМСЕХ). Геномный 3'-участок гена Су овцы (т.е., 3'-фланкирующую последовательность гена Су овцы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры:
5'-праймер: 5'сёсдёа1ссССТЛССССТСТСТССТСЛТС3' (8ЕС) ΙΌ N0: 6).
3'-праймер: 5'сдсдда1ссАСССАССАСААСАТСС-АСТТ3' (8ЕС) ΙΌ N0: 7).
Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами, взята из экзона 3 Су, и часть, указанная строчными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ВатШ. Часть 3'-праймера, указанную заглавными буквами, конструировали в соответствии с опубликованными последовательностями экзона М2 человека и экзона М2 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ВатШ. ПЦР-фрагмент длиной 2,9 т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы ЕХРАНЭ (КосНе). Фрагмент очищали в геле, расщепляли ВатШ и клонировали в клонирующем векторе В1иекспр1. Полученные в результате клоны разделялись на две популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, полученных с помощью ΗίηάΙΙΙ, ЕсоК! и Х1юЕ Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 2 (8Е0 ΙΌ N0: 8-9).
ЕсоК1-фрагмент длиной 10 т.п.н., содержащий ген Су и его фланкирующие последовательности кролика аллотипа А2, субклонировали из геномного космидного клона (сок 8.3 от ΚηίβΙιΙ е1 а1., ί. ТттипоЕ (1985) 1245-50, «Ο^дашζаΐ^оη αηά ро1утогрЫкт о£ гаЬЬй ^ттиηод1оЬи1^η Неату сНат девек»). Нуклеотидные 5'- и 3'-последовательности Су определяли, используя стандартные способы, последовательности указаны на фиг. 3 и 5, 8Е0 ΙΌ N0: 10, 12, 13 соответственно.
3'-Последовательности С-каппа 1 кролика определяли из ЕсоК Ι/ВатШ-субклона МТк2Ск в ρ8V2ηео. Нуклеотидная последовательность представлена на фиг. 4, 8Е0 ΙΌ N0: 11.
Аминокислотные последовательности, кодируемые экзонами М1 и М2 коровы, овцы и кролика рассчитывали на основе указанной выше 3'-фланкирующей последовательности. Указанные аминокислотные последовательности сопоставляли с опубликованными последовательностями М1 и М2 верблюда, человека и мыши, как показано на фиг. 6.
Пример 2. Вектор для замены участка эндогенного гена Су кролика сегментом Су1 человека.
Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по а2 кролика. Последовательность ДНК, расположенную выше Су кролика (т.е. 5'-фланкирующую последовательность Су кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры:
5' (ааЩЦдсддссдсСТТСАСССТСААССАСССССТС 3' (8 ЕС) ΙΌ N0: 39) с 5'-ЫоЙ-сайтом и 5' СТССАССССССТССАТССАСТСССАСАС 3' (8ЕС) ΙΌ N0: 40).
Последовательность ДНК, расположенную ниже Су кролика (т.е. 3'-фланкирующую последовательность Су кролика) амплифицируют со следующими праймерами:
5' дд!ассСТСТСССТСССССАССССССАСС 3' (8ЕС) ГО N0: 41) с 5'-ΚρηI-сайтом и
5' а1аШсадаАСТСССТСТСССТССТСТАСТАСАССС 3' (8ЕС) ГО N0: 42) с 5'-ХМ-сайтом.
Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий Су1 человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров:
5' СТССАСАСТССАСССТСААССТССССС 3' (8ЕС) ГО N0: 43) и
5' ССТАССССССССТТССССССССТСССАС 3' (8ЕС) ГО N0: 44).
Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе В1иекспр1. Затем кассету 1ох иео встраивают в сайт 8аИ, а кассету Ηκν-ΐΕ в сайт ХНоЕ Схематичный чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7а.
Пример 3. Вектор для замены сегмента эндогенного гена Ск кролика сегментом Ск человека.
Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по Ь5 кролика. Последовательность ДНК выше Ск1 (т.е. 5'-фланкирующую последовательность Ск1 кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры:
5' дсддссдсТССССАССАСАССААССТССАСАТСАААСС 3' (8ЕС) ГО N0: 45) с 5'-ЫоЙ-сайтом
5' СТССАСССАССССАААССТСТТССААТСССССАССС 3' (8ЕС) ГО N0: 46).
- 13 013564
Последовательность ДНК ниже Ск1 кролика (т.е., 5'-фланкирующую последовательность Ск1 кролика) амплифицируют со следующими праймерами:
5' а1аШдасс6С6А6АС6ССТ6ССА666САСС6СС 3' (БЕО ΙΌ N0: 47) с 5'-Крп1-сайтом
5' 66АТССС6А6СТТТАТ666СА666Т66660 3' (БЕО ΙΌ N0: 48).
Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий Ск человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров:
5' АТАТ0ТС6АССТ666АТАА6САТ6СТ6ТТТТСТ6ТСТ0ТССС 3' (БЕО ΙΌ N0: 49)
5' СТА06ТАССА6СА66Т66660САСТТСТССС 3' (БЕО ΙΌ N0: 50).
Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе В1ис5спр1. Затем кассету 1ох пео встраивают в сайт БаИ, а кассету Н5У-1к в сайт Х1юЕ Схематический чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7Ь
Пример 4. Замена сегментов эндогенных генов Су и Ск в фибробластах зародыша кролика соответствующими сегментами гена человека.
Клетки, фибробласты зародыша кролика, получают стандартными способами. После одного пассажа фибробласты трансфицируют 5 мкг линеаризованного с помощью вектора, направленного к мишени, как показано на фиг. 5а для Су или на фиг. 5Ь для Ск, и высевают в 96-луночные планшеты (2х103 клеток/лунку). После позитивной селекции с использованием 600 мкг/мл 0418 и негативной селекции с использованием 200 нМ МАИ, реплики устойчивых колоний переносят на два 96-луночных планшета для анализа ДНК и криоконсервирования соответственно. Проводят ПЦР и/или Саузерн-блот-анализ, чтобы идентифицировать клетки с сегментом гена Су1 человека, интегрированным в геном. Клетки, имеющие интегрированный ген Су1 человека, используют для клонирования кроликов, как описано в примере 5.
Пример 5. Клонирование кроликов.
Взрослых кроликов ЭШсН Ве11оп подвергают суперовуляции посредством подкожной инъекции фолликулостимулирующего гормона (РБН) каждые 12 ч (0,3 мгх2 и 0,4 мгх4). Овуляцию индуцируют внутривенным введением 0,5 мг лютеинизирующего гормона (ЬН) через 12 ч после последней инъекции РБН. Ооциты извлекают промывкой яйцеводов через 17 ч после инъекции ЬН. Из ооцитов механически удаляют ядра через 16-19 ч после созревания. Удаление хромосом оценивают с использованием красителя бисбензимида (Н0ЕСНБТ 33342, Б1дта, Бе Ьош8, МО) в ультрафиолетовом свете. Ооциты, из которых удалены ядра, сливают с активно делящимися фибробластами, используя один электрический импульс 180 В/см в течение 15 мкс (Е1ес1госе11 Машри1а1ог 200, Оепейошск, Бап И1едо, СА). Через 3-5 ч ооциты химически активируют кальциевым ионофором (6 мкМ) в течение 4 мин (№ 407 952, Са1Ьюсйет, Бап И1едо, СА) и 2 мМ 6-диметиламинопурином (ИМАР, Б1дта) в среде СР2 (специализированная среда, Ьауа1еП, N1) с 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (не содержащего жирных кислот, Б1дта) в течение 3 ч. После активации эмбрионы пять раз промывают в среде для культивирования эмбрионов хомячка (НЕСМ)-Нере§ и затем культивируют в среде СВ2, содержащей 3 мг/мл БСА, не содержащего жирных кислот, в течение 2-48 ч при 37,8°С и 5% СО2 в воздухе. Затем эмбрионы переносят синхронизированным реципиентам. Потомство анализируют с помощью ПЦР в отношении сегмента трансгена.
Примр 6. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи кролика с сегментом гена Су1 человека и сегментом гена УН, кодирующим полипептидную последовательность УНдомена человека.
Секвенировали верхние и нижние участки (т.е. 5'-фланкирующие и 3'-фланкирующие участки) гена Су тяжелой цепи кролика от кролика с аллотипом а2. Фрагмент ДНК (БЕО ΙΌ N0: 51) создают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5' 3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена Су кролика, ген
Су1 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена Су кролика (фиг. 8).
Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа а2, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к Су кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи кролика. Ген Су кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном Су1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой, используя фрагмент ДНК БЕО ΙΌ N0: 51 и систему рЕТ. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена Су кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена Су1 человека.
Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены тяжелой цепи кролика и встроенный ген Су1 человека далее модифицируют заменой 3'-проксимального сегмента УН1 синтетическим сегментом гена УН (фиг. 9). Указанный синтетический сегмент гена УН (БЕО ΙΌ N0: 52) получают, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды, и участок включает в себя 5'-фланкирующую последовательность, 3'фланкирующую последовательность и последовательность, кодирующую полипептид, почти идентичный полипептидной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Ниапд апб Б(о11аг (1. Iттипо1. 151: 5290-5300, 1993). Кодирующую последовательность синтетического сегмента гена УН конструируют на основе опубликованной последовательности гена
- 14 013564
УН1 кролика (а2, Κηφίιΐ аиб Вескег, Се11 60: 963-970, 1990), и последовательность идентична сегментам гена УН кролика более чем на 80%. 5'- и 3'-фланкирующие последовательности в синтетическом сегменте УН получают из выше- и нижерасположенных участков гена УН1 кролика аллотипа а2. Синтетический ген УН ЗЕЦ ΙΌ N0: 52 используют для замены гена УН1 кролика в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ или гебеву. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные методики.
Пример 7. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса легкой цепи кролика с сегментом гена Ск человека и сегментом гена УД кодирующим полипептидную последовательность домена УЬ человека.
Секвенировали выше- и нижерасположенные участки (т.е. 5'-фланкирующие и З'-фланкирующие участки) гена Ск1 легкой цепи кролика от кролика с аллотипом Ь5. Фрагмент ДНК (ЗЕЦ ΙΌ N0: 53) создают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5' 3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена Ск1 кролика, ген Ск1 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена Ск1 кролика (фиг. 10).
Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа Ь5, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к Ск1 кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена легкой цепи кролика. Ген Ск1 кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном Ск1 человека в фрагменте ДНК ЗЕЦ ΙΌ N0: 53 посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой с использованием системы рЕТ или гебеву-. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена Ск1 кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена Ск1 человека.
Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены легкой цепи кролика и встроенный ген Ск1 человека, далее модифицируют встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК У1 в 1-область локуса легкой цепи кролика. Реаранжированный фрагмент ДНК У1 кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный Ргйзсй е1 а1. (В1ооб 82 (10): 3103-3112, 1993) и ЬаиШег-Кгекке е1 а1. (Еиг. 1 1ттипо1. 22 (4), 1023-1029, 1992)) (фиг. 7). Нуклеотидную последовательность реаранжированного участка У1 конструируют, чтобы максимально увеличить гомологию последовательностей на уровне нуклеотидов с последовательностью У-каппа кролика, опубликованной ЫеЬегтаи е1 а1. (1. 1ттиио1. 133 (5), 2753-2756, 1984). Указанная реаранжированная последовательность ДНК У1 более чем на 80% идентична известным генам Ук кролика. Используя перекрывающиеся олигонуклеотиды в ПЦР, реаранжированный фрагмент ДНК У1 связывают с 5'- и 3'-фланкирующей последовательностью, получая фрагмент ДНК ЗЕЦ ΙΌ N0: 54 (фиг. 11). 5'-Фланкирующую последовательность получают из 5'-конца Ук кролика, 3'-фланкирующую последовательность получают из 3'-конца 12 кролика. Затем фрагмент ДНК ЗЕЦ ΙΌ N0: 54 встраивают в локус легкой цепи кролика посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой, используя систему рЕТ или гебеву. Встраивание осуществляют таким образом, что область легкой цепи кролика, содержащую сегмент гена Ук1 кролика, участки Л и 12 кролика и последовательности между ними заменяют реаранжированным фрагментом ДНК УД И в этом случае указанное встраивание осуществляют заменой участка У-1 кролика маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК УД Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные методики.
Пример 8. Трансгенные кролики, экспрессирующие трансген легкой и/или тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина.
Трансгенных кроликов получают, как описано Гаи е1 а1. (Ра11ю1. Ιηΐ. 49: 583-594, 1999). Коротко, самок кроликов подвергают суперовуляции, используя стандартные способы, и спаривают с самцами кроликов. Зиготы в стадии пронуклеуса собирают из яйцевода и помещают в соответствующую среду, такую как фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Экзогенную ДНК (например, гуманизированный ВАС-клон, описанный в примере 4 и/или 5, который был линеаризован перед инъекцией) микроинъецируют в мужской пронуклеус с помощью пары манипуляторов. Выжившие, судя по морфологическим признакам, зиготы переносят в яйцеводы псевдобеременных кроликов. Псевдобеременность индуцируют инъекцией хорионического гонадотропина человека (ЙСС). Примерно 0,1-1% инъецированных зигот развиваются в живых трансгенных кроликах. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом с использованием зонда, специфичного для трансгена.
кДНК получают с использованием РНК, выделенной из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенного кролика. Используют праймеры, специфичные по отношению к трансгену человека (участку гена СН человека или синтетическому участку гуманизированного гена УН) , для получения на основе кДНК амплифицированных продуктов. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том, что трансген реаранжируется в трансгенном животном, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорных последовательностей вышерасположенных генов У свидетельствует о том, что трансген, введен
- 15 013564 ный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов.
Наличие антител, содержащих 1§С человека и/или антигенные детерминанты легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных кроликов-родоначальников определяют с использованием анализа ЕЫ8А.
Пример 9. Получение гуманизированных антител из трансгенных кроликов, имеющих генетический фон линии кроликов А11С1а и/или ВаШеа.
У кроликов линии А11С1а отсутствует сегмент гена νΗ1, и поэтому у них нарушена экспрессия тяжелой цепи 1д. Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы тяжелой цепи на генетическом фоне линии кроликов А11С1а, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов А11С1а в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов А11С1а, которых скрещивали с самцами кроликов Айаа в приведенном выше примере 8. Также получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу 1д А11С1а, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену тяжелой цепи. Сыворотку проверяют в ЕЫ8А на наличие гуманизированной тяжелой цепи (например, константной области тяжелой цепи человека). Концентрация антител с гуманизированными тяжелыми цепями 1д у указанных гомозиготных животных А11С1а значительно выше, например, примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация, которая продуцируется с трансгена, интегрированного в геном кроликов дикого типа (не относящихся к А11С1а).
Линия ВаШеа не экспрессирует легкую цепь к1, а вместо этого экспрессирует исключительно легкие цепи к2 и λ. Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы легкой цепи на генетическом фоне линии кроликов ВаШеа, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов ВаШеа в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов ВаШеа, которых скрещивали с самцами кроликов ВаШеа в приведенном выше примере 8. Получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу легкой цепи ВаШеа, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену легкой цепи. Сыворотку проверяют в ЕЫ8А на наличие гуманизированной легкой цепи. Концентрация гуманизированной легкой цепи у гомозиготных животных ВаШеа значительно выше, примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация гуманизированной легкой цепи у трансгенного кролика с генетическим фоном дикого типа (не относящегося к ВаШеа). Трансгенных кроликов-родоначальников скрещивают друг с другом, чтобы получить трансгенных кроликов со следующими особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи, (3) гомозиготных по локусу тяжелой цепи Айаа и (4) гомозиготных по локусу легкой цепи ВаШеа.
Пример 10. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего модифицированный локус легкой цепи курицы, имеющий сегмент гена С-лямбда-2 человека и сегмент гена VI, кодирующий домен νΣ человека.
Проводили скрининг геномной ВАС-библиотеки, полученной от кустарниковой дикой курицы, с помощью радиоактивно меченых зондов, специфичных по отношению к С-лямбда легкой цепи курицы и νρ§ί25 курицы (сегмент гена V на самом 5'-конце локуса легкой цепи). Идентифицировали ВАС-клон, содержащий полный локус легкой цепи лямбда. Ген Ж курицы в данном ВАС-клоне заменяют геном ^2 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. со11, используя систему рЕТ (Ζ1ι;·ιη§ е1 а1., Ыа1. Вю1есЬпо1. 18 (12): 1314-7, 2000), следующим образом.
Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Тп5. 5'-Праймер (5' са!асасадсса1аса1асдсд1д1ддссдс1с1дсс1с1с1сйдсаддТАТ66АСА6САА6С6ААСС6 3', 8ЕЦ ΙΌ N0: 55) конструировали так, чтобы он включал в себя 50 п.н. на 5'-конце (строчные буквы), полученных из 5'фланкирующего участка гена Ж легкой цепи курицы. 3'-Праймер (5' а1саддд1дасссс1асдйасас1сс1д1сассааддаддддадддас ТС’АСААСААС’ТС’СТС’ААСААС 3', 8ЕЦ ΙΌ N0: 56) конструировали так, чтобы он включал примерно 50 п.н. на конце (строчные буквы), полученных из 3'-фланкирующего участка гена Ж легкой цепи курицы.
Второй фрагмент ДНК (8ЕЦ ΙΌ N0: 57) синтезировали с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5' 3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена С-лямбда легкой цепи курицы, гена С-лямбда-2 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена С-лямбда курицы (фиг. 12).
Клетки Е. со11 ВАС-клона легкой цепи курицы трансформировали рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции гесЕ и гесТ под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, трансформировали первым фрагментом ДНК, описанным выше, и затем проводили селекцию в среде, содержащей канамицин.
Идентифицировали клоны, устойчивые к канамицину, и замену участка Ж курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждали расщеплением ферментом рестрикции.
- 16 013564
На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, трансформировали вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводили скрининг трансформированных клеток по признаку отсутствия устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном С/.2 человека. Обмен подтверждали расщеплением ферментами рестрикции и/или секвенированием.
Методика ЕТ-клонирования суммирована на фиг. 13.
ВАС-клон, содержащий локус легкой цепи курицы и встроенный сегмент гена С-лямбда-2 человека дополнительно модифицировали встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК VI. Реаранжированный фрагмент ДНК VI кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный Кате1аш е! а1. (1. Вюсйет. 93 (2), 421-429, 1983) как N10-64 ν-Ι-области цепи лямбда 1д (Р01702) (фиг. 14). Нуклеотидная последовательность реаранжированного фрагмента VI конструировали так, чтобы достичь максимальной гомологии последовательностей на уровне нуклеотидсв с последовательностью ν-ламбда^ курицы, опубликованной МсСогтаск е! а1. (Се11 56, 785-791, 1989). Полученная реаранжированная последовательность ДНК VI более чем на 8 0% идентична известным генам V легкой цепи курицы. Реаранжированный фрагмент ДНК VI связывали с 5'-фланкирующей последовательностью и З'-фланкирующей последовательностью, получая в результате фрагмент ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 58 (фиг. 14). 5'-Фланкирующую последовательность получали из 5'-конца V-лямбда-1 курицы и 3'-фланкирующую последовательность получали из 3'-конца 1 курицы. Фрагмент ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 58 затем встраивали в локус легкой цепи курицы в Е. сой, используя систему рЕТ, как показано на фиг. 15. Встраивание осуществляли таким образом, чтобы участок локуса легкой цепи курицы от 5'-конца сегмента гена V-лямбда-1 курицы до 3'-конца области 1 курицы заменить реаранжированным синтетическим фрагментом ДНК VI. И в этом случае указанное встраивание осуществляли заменой V-^-области курицы маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК VI. Модифицированная область локуса легкой цепи курицы показана на фиг. 15. Модифицированный ВАС-клон амплифицировали и очищали, используя стандартные способы.
Пример 11. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи курицы с сегментом гена Су1 человека и сегментом гена ΥΗ, кодирующим полипептидную последовательность домена ΥΗ человека.
Геномную ВАС-библиотеку кустарниковой дикой курицы получали стандартными способами и подвергали скринингу с помощью зондов, специфичных по отношению к Су курицы. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи курицы. Секвенируют выше- и нижерасположенные участки (т.е. 5'-и 3'-фланкирующие участки) гена Су тяжелой цепи. Ген Су курицы в данном ВАСклоне заменяют геном Су1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой, используя систему рЕТ, следующим образом.
Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Тп5. 5'- и 3'-праймеры конструируют так, чтобы они включали около 50 п.н. на конце, полученных из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена Су тяжелой цепи курицы.
Второй фрагмент ДНК создают посредством ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды, при этом указанный второй фрагмент ДНК содержит в направлении 5' 3' последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из 5'-фланкирующего участка гена Су курицы, ген Су1 человека и последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из 3'-фланкирующего участка гена Су курицы.
Клетки Е.сой ВАС-клона СУ курицы трансформируют рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции гесЕ и гесТ под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, далее трансформируют первым фрагментом ДНК и проводят селекцию в среде, содержащей канамицин. Идентифицируют клоны, устойчивые к канамицину, и замену сегмента СУ курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждают расщеплением ферментом рестрикции.
На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, теперь трансформируют вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводят скрининг трансформированных клеток по признаку потери устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном Су1 человека. Обмен подтверждают расщеплением ферментом рестрикции и/или секвенированием.
ВАС-клон, содержащий встроенный ген Су1 человека, далее модифицируют заменой 3'проксимального сегмента ΥΗ1 (т.е. 3'-проксимального гена ΥΗ1 в V-области) синтетическим сегментом гена ΥΗ. Указанный синтетический сегмент гена ΥΗ конструируют на основе опубликованной последовательности гена ΥΗ1 курицы (Агака^а е! а1., ЕМВ0 1. 15 (10): 2540-2546, 1996). Синтетический сегмент гена более чем на 80% идентичен сегментам гена ΥΗ курицы и кодирует аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности полипептида вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Маййуззепв апб РаЬЬйзз (в 81етЬегд СМ апб Ье1коуЙ8 I, (ебз). Тйе 1ттипе 8уз1ет : 132-138, 8. Кагдег, ΝΥ 1981). Указанный синтетический сегмент
- 17 013564
ΥΗ, содержащий 5'- и 3'-фланкирующие последовательности, синтезируют ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды. 5'- и 3'-фланкирующие последовательности получают из выше- и нижерасположенных участков гена ΥΗ1 курицы. Полученный синтетический сегмент ΥΗ используют для замены гена \Ή1 курицы в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные способы.
Пример 12. Трансгенная курица, экспрессирующая трансгены гуманизированной легкой и/или тяжелой цепи иммуноглобулина.
Трансгенную курицу получают, используя способы, которые описаны ЕЮ11С5 е! а1., МеЛобк ίη Мо1еси1аг Вю1оду 62: 433-450; Рат е! а1., СеЛ Т155ие5 0гдап§ 1999; 165 (3-4): 212-9; 8апд, Ή., «Тгапкдешс с1нсксп5-тс11юб5 апб ро1епЬа1 аррИсайопк», Тгепбк Вю1есЬпо1. 12: 415 (1994); и в \У0 200075300, «Ιηίτοбисшд а пис1ею ас1б 1п1о ап ау1ап депоте, н5еГн1 Рог тиъГесЛщ ау1ап Ь1а51обегта1 сеЛ Рог ргобистд 1гап5дешс ау1ап аттак \νίΐ1ι Ле беыгеб депек, Ьу биесбу ЬИгобистд Ле пис1ею ас1б 1п1о Ле дегтта1 бкс оГ Ле едд».
Вкратце, модифицированные ВАС-клоны переводят в линейную форму и смешивают с реагентом для трансфекции, чтобы стимулировать захват ДНК клетками. Инъецируют композиции в эмбрион курицы в многоклеточной стадии в непосредственной близости к зародышевому диску. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. После вылупления химерных куриц идентифицируют с помощью ПЦР и Саузерн-блот-анализа с использованием специфичных для трансгена последовательностей. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом, используя специфичный для трансгена зонд. Животных, трансгенных по тяжелой и легкой цепям, скрещивают друг с другом, получая трансгенных куриц, экспрессирующих антитела, имеющие гуманизированные тяжелые и легкий цепи.
кДНК получают, используя РНК, выделенную из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенных куриц. Используют праймеры, специфичные для трансгена (например, для сегментов гена СН человека и/или синтетических участков гуманизированного гена \Ή), чтобы получить амплифицированные продукты кДНК. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том, что трансген реаранжирован у трансгенного животного, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорских последовательностей из вышерасположенных областей генов V свидетельствует о том, что трансген, введенный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов.
Наличие антител, содержащих антигенные детерминанты ЦС человека и/или легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных куриц определяют с использованием анализа ЕЫ8Л.
Пример 13. Получение функциональных гуманизированных антител у трансгенной курицы с агаммаглобулинемическим фенотипом.
Получают трансгенных куриц со следующими характерными особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи и (3) гомозиготных по фенотипу агаммаглобулинемии. Указанные животные продуцируют антитела в кровь и яйца, и антитела можно очистить из любого источника. Как правило, концентрации антител в яйцах составляют примерно от 5 до 50% от концентрации антител в крови. Животных, которые содержат высокие уровни гуманизированных антител в яйцах, можно отобрать и скрестить для получения потомства. Альтернативно можно получить трансгенных животных, которые специфично секретируют гуманизированные антитела в яйца.
Пример 14. Создание трансгенных куриц, экспрессирующих гуманизированный иммуноглобулин.
Эмбриональные стволовые клетки куриц выделяют и культивируют, как описано Раш е! а1. (Иеуе1ортеп! 122, 2339-2348; 1996). Эмбрионы куриц получают из яиц сразу же после их откладки. Полностью извлекают бластодерм с помощью осторожного отсасывания, эмбрионы подвергают медленной механической диссоциации и клетки высевают в полную среду Е8Л на инактивированные питающие клетки 8Т0. Среда Е8Л состоит из среды МЕМ, содержащей 10% РС8, 2% сыворотки курицы, 1% бычьего сывороточного альбумина, 10 нг/мл овальбумина, 1 мМ пируват натрия, 1% заменимых аминокислот, 1 мкМ каждого из нуклеотидов аденозина, гуанозина, цитидина, уридина, тимидина, 0,16 мМ βмеркаптоэтанола, полную среду Е8Л дополняют 10 нг/мл ЬРСР, 20 нг/мл Ь-ЮР-1, 1% об./об. 8СР птиц и 1% об./об. Ь-ЫР, 1% об./об. Ь-ГЬ-11. Культуры клеток инкубируют при 37°С в 7,5 СО2 и при 90% влажности. Через 48 ч к культуре добавляют свежие бластодермальные клетки в половине исходного объема полной среды Е8Л. После дополнительной инкубации в течение трех дней культуральную среду частично (50%) заменяют свежей полной средой Е8Л и после этого каждый день полностью. Для сбора клеток культуры промывают РВ8 и инкубируют в растворе проназы (0,025% мас./об.). Диссоциированные клетки трансфицируют различными линеаризованными трансгенными конструкциями, содержащими гуманизированный локус Ц. Трансфицированные клетки инкубируют с питающими клетками 8Т0 (как описано выше) в присутствии антибиотиков для селекции. Клетки переносят на свежие питающие клетки дважды в неделю. Выделяют устойчивые к антибиотикам клетки и с помощью ПЦР подтверждают интеграцию фрагментов гуманизированного гена Ц в случайный сайт или в соответствующие локусы генов иммуноглобулинов курицы.
Затем генетически модифицированные клетки инъецируют в реципиентные эмбрионы. В качестве
- 18 013564 реципиентных эмбрионов свежие отложенные яйца облучают (6 Гр - кобальтовый источник). От 100 до 200 генетически модифицированных клеток инъецируют в подзародышевую полость, используя микропипетку. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. Соматический химеризм вылупившихся куриц оценивают с помощью ПЦР. Химеризм зародышевой линии оценивают скрещиванием соматических химер.
Пример 15. Иммунизация трансгенных животных.
Полученных генно-инженерным способом куриц иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (НВкАд) (5 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0, 14 и 28 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЬ18А (ΝϋΝΕ, Эептагк) покрывают 1 мкг/мл НВкАд в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΡΜ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в РВ8/1% ΝΡΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают РВ8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с НВкАд. При разведении 1:250 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых НВкАд лунках, составляет ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с НВкАд. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1§С курицы-НКР. Это свидетельствует о том, что полученные генноинженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против НВкАд.
Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (НВкАд) (10 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 и 14 день. На 28 день у животных берут кровь из уха и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8А (ΝϋΝΕ, Эептагк) покрывают 1 мкг/мл НВкАд в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΡΜ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в РВ8/1% ΝΕΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают РВ 8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированных кроликов. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с НВкАд. При разведении 1:100 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых НВкАд лунках, составляет ниже 0,4. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит частично человеческие антитела, реагирующие с НВ 5 Ад. При разведении сыворотки 1:100 измеренная оптическая плотность составляет 2,8. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,2 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1дС кролика-НКР. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против НВкАд.
Пример 16. Опосредованная комплиментом цитотоксичность инфицированной вирусом линии клеток с использованием гуманизированных антител.
Линию клеток карциномы печени человека, экспрессирующую НВкАд, метят 0,1 мКи 51Сг в 100 мкл РВ8 в течение 1 ч при 37°С. Две тысячи клеток, меченых 51Сг, инкубируют с сывороткой полученных генно-инженерным способом кроликов или куриц, экспрессирующих гуманизированные иммуноглобулины против НЬкАд. Через два часа при 37° определяют высвобождение 51Сг в надосадок, измеряя радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика. Для определения максимального высвобождения добавляют 1% тритон Х100. Степень лизиса клеток рассчитывают следующим образом: % лизиса = имп/мин экспериментальное ± имп/мин спонтанное / имп/мин суммарное ± имп/мин спонтанное. Инкубация меченых клеток с сывороткой (разведенной 1:30) неиммунизированных кроликов не приводит к лизису клеток (< 10%). Однако инкубация клеток с сывороткой иммунизированных кроликов вызывает 80% лизис. Инактивация комплемента в сыворотке тепловой обработкой (56°С в течение 30 мин) делает сыворотку иммунизированных кроликов неактивной. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гуманизированные антитела, продуцируемые полученными генно-инженерным способом кроликами, связываются с НВкАд-позитивными клетками и вызывают зависимый от комплемента лизис.
Пример 17. Иммунизация трансгенных животных против 81арйу1ососсик аигеик.
Полученных генно-инженерным способом куриц иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина 81ар11у1ососси$ аигеик (100 мкг в неполном адъюванте Фрейн
- 19 013564 да) в 0, 14 и 28 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЬ18А (ХЬХС. Эсптагк) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΕΜ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в РВ8/1% ΝΡΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают РВ8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл.
Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора Ηί'Ί и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против ЦС курицы-ИКР. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина 81ар11. аигеик.
Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина 81арЕу1ососси5 аигеик (100 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 день и 14 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8А (ΝυΝΟ, Эептагк) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΡΜ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в РВ8/1% ΝΡΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 часа планшеты 3 раза промывают РВ8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид ортофенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора Ηί'Ί и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированного кролика. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1дС кролика-КИР. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина 81ар11. аигеик.
Пример 18. Защита от инфекции 81ар11у1ососси5 аигеик в мышиной модели.
Нативных мышей пассивно иммунизируют в/б в -1 день 16 мг иммуноглобулиновой фракции, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина 8. аигеик (из примера 17) или иммуноглобулиновой фракцией неиммунизированных животных. В 0 день мышам в/в вводят 4х107 КОЕ 8. аигеик на мышь и регистрируют смертность в течение следующих 7 дней. Коэффициент смертности в контрольных группах составляет 80% и 10% в группе, обработанной иммуноглобулиновой фракцией, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина 8. аигеик. Результаты свидетельствуют о том, что антитела против коллагенового адгезина могут защищать мышей от летального заражения 8. аигеик.
Пример 19. Антиген-специфичные гибридомы, полученные от трансгенных животных.
Трансгенных животных иммунизируют антигеном (например, ΚΕΗ, эритроцитами человека или эритроцитами овцы). Клетки селезенки извлекают в разных временных точках после иммунизации и сливают с линиями клеток миеломы, полученными от кролика и курицы, соответственно. После слияния клетки высевают в 96-луночные планшеты и надосадки тестируют по наличию гуманизированных антител. Чтобы показать, что антитела содержат последовательности иммуноглобулина человека, гибридомы красят флуоресцентно мечеными антителами, реагирующими с тяжелой и легкой цепью иммуноглобулинов человека. Проводят ограниченное разведение, чтобы очистить гибридомы до моноклональности.
Пример 20. Оценка иммуногенности.
Собирают образцы сыворотки от пяти макак-крабоедов в 0 день. Затем вводят очищенный препарат частично человеческих поликлональных антител (5 мг/кг) пяти макакам-крабоедам путем внутривенного введения. Введение повторяют шесть раз с двухнедельными интервалами. За обезьянами ведут тщательное наблюдение в отношении побочных эффектов (например, анафилактический шок, отражающийся повышением температуры тела). Через семь месяцев из образцов крови собирают сыворотку. Аффинные
- 20 013564 смолы, содержащие очищенный 1дС человека или частично очищенный 1дС человека, получают стандартным способом, используя СтВг-активированную сефарозу. Образцы сыворотки обезьян (3 мл) добавляют к ЦС-аффинной смоле (4 мл), содержащей 10 мг человеческого или частично человеческого 1дС. Затем колонки промывают РВ8. Связанный иммуноглобулин обезьян элюируют с колонки 0,1 М глицином/НС1, рН 2,5 и 2 раза диализуют против РВ8. Содержание белка в элюированных фракциях определяют с использованием анализа ВСА, используя в качестве стандарта 1дС человека. Суммарное количество белка в указанных фракциях свидетельствует о том, что терапия частично человеческим 1дС не приводит к значительному гуморальному ответу у обработанных животных.
Пример 21. Лечение животных с использованием гуманизированных антител.
Гуманизированные поликлональные иммуноглобулины очищают из сыворотки полученных генноинженерным способом кроликов или из яичного желтка полученных генно-инженерным способом куриц путем осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. Мышам 8СГО инъецируют один миллион клеток карциномы печени человека, экспрессирующих НВкАд. Затем внутрибрюшинно один раз в день инъецируют 25 мкг иммуноглобулина. Животные, обработанные антителами, выделенными из сыворотки неиммунизированного кролика, погибают примерно через 60 дней. Полученный результат сходен с результатом для необработанных реципиентов клеток карциномы печени. Напротив, мыши, обработанные антителами, выделенными из сыворотки иммунизированного кролика, живут более 150 дней. Это свидетельствует о том, что антитела человека, продуцируемые полученными генноинженерным способом кроликами, способны удалять клетки карциномы человека из организма мышей 8СГО.
Список последовательностей <110> ЗСНООТЕИ, Нтт-Уап; виЕЕОИ, Во1апд; ΡΙΑΤΖΕΗ, Эоае£;
ВЫЕЪОИ, Лепй-и1х1сН <120> ПОЛУЧЕНИЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ АНТИТЕЛ В [ОРГАНИЗМЕ] ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ <130> 3007-1127 <140> 2, 422,155 <141> 3 августа, 2001 <150 РСТ/и301/24348 <151> 3 августа, 2001 <150> 0Ξ60/222,872 <151> 3 августа, 2000 <150 0560/276,156 <151> 15 марта, 2001 <160> 58 <170> РаЛеггЫп Уег. 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:прг1Ймер <400> 1 сдсаадсЛЬс сбасасдЬдЬ. дЬддкдакд 29 <210 2 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 2
- 21 013564 сдсаадсЕба адаЕддида!: ддЪздЕсса <210> 3 <211> 1714 <212> ДНК <213> корова <400? 3
| ссЕасасдЪд | Ед£дд11да£д | сасдааасЦ | £асддаа£са | сЪасааадад | аадЕссассЕ | 60 |
| сдаддЕсИса | ддд1:ааа£да | дссЕсдсдсс | дсЪдаЪсЪад | ИддасдЪЪсс | сЪсаЪссасс | 120 |
| сассссЪссс | сссассссдд | дс1:ссадд1:с | садссадддс | дссскадссс | сЕсссЬдЕд^ | 180 |
| дсаЕЕссЕсс | 1здддссдССд | ЕдааЕааадс | асссаддссд | сесЕдддасс | сЕдсаасдс!: | 240 |
| д£дс±дд1:1:с | ЪЪЪссдаддс | ададссс^дд | Еддссдссад | дссЪдсдддд | дкдддскдад | 300 |
| ссдасНсЕдд | дссасЪкЪдЕ | ЕсадсаксЕд | кдддддадс^ | дассссаскс | сдддссадас | 360 |
| асасадкдад | кдддЕссадс | аддссассЕд | ддддсЕдссс | ааддссасад | аддддсЪЪдд | 420 |
| ссададдсас | адс^ссасдд | £сссс1:ссад | ссассассСд | сСдддссддс | сЕскддасад | 480 |
| даассдддда | адсссссдад | ассс^саддд | аГЛдаддссс | аа£дс!Лссс | досксЬдскс | 540 |
| садсссасдс | ЕдЬддддсад | ддссасаЕсс | ЪЕдкссссад | дсссс£д£сс | Екддд^дЕсс | 600 |
| адад£сс£1:д | Ьд^ссасЪсЕ | дддссЕдсс£ | ддадссасдс | а^ддссаддд | ддщддссс^д | 660 |
| сЬЕсасссЕс | аддсЕсссаа | ддЪеаддссЕ | сдсссЪсссЕ | сддссаддад | дсксЕдсссд | 720 |
| дс£с£ссс1:д | сссадддсса | ддсс1:д1:дсд | сссаЪдддда | дд£са£ ссс£ | дЕдсс^дааа | 780 |
| дддд^ссадд | ссдададссс | Ъдаа^дСсса | дддсадддас | с!:адсЬ дсПс | сокдЕддаса | 840 |
| сддадсссад | адссасадас | аасаадсссс | адссссдсас | дсасасдада | садсссдсас | 900 |
| ссадсскссЕ | ссасасдсас | ЬсаддЕдЪас | аЕдсдсасак | дадсасасЕЕ | сассссдСса | 960 |
| сасссасаса | сс£асасаса | с£садд!:с£с | дсас1:сдддд | ассса1дддд | £дассссасд | 1020 |
| ддсссадасс | ададск-дддЕ | скЕдЪдадсс | скссскдкдд | асассадскд | ддосссассс | 10Θ0 |
| Сссадсдссс | а£дддс1:дс1: | садсддссс1: | СЪсссасасЕ | дассасасЪд | ассаддСсад | 1140 |
| аса^ссдЪЕс | с^ИдссЕссс | сЕдддасасс | сасдссссИс | ссЕадсаддс | 1:дада1:сссс | 1200 |
| ссЕсадсссс | ^сдЕссЕддс | адссЕсассс | с1:сдддсаса | дсассссЕса | ддсссддИдс | 1260 |
| ЬдЕсадсосс | сескссссдд | дддсадддсс | саддаасдЬд | сдс-ЬсЬ дскд | асссксссад | 1320 |
| сЪссаддссХ | ддсссссадд | дсададдадд | ссаддаасЪд | адссЪсЪдЪс | сЬдИддддад | 1380 |
| дЕадддВсад | дд!сссадс£ | садддсасад | сЕсаддаИдд | дадсаддасс | ссасаддсса | 1440 |
| ддсссада£а | дсадссаддд | с£ддадддд£ | ТддддсГддд | дс«:дддсссс | ададас1:дас | 1500 |
| сЕсаддЕдас | сссЕдсс£дд | сссаЕдддда | да^сасдсса | ссЕЕсссесс | асссададдд | 1560 |
| адсссИдссс | НассссадЪд | ассс^дссса | дсссЪссдЪд | ддсадасаса | дсао^дасса | 1620 |
| сссскссскд | ЕдсадасИ^д | скдс1:ддадд | аддадакс^д | Ъдсддасдас | сЕддаЕдддд | 1680 |
| адскддасдд | дс^сЕддасс | ассаСсСсса | ΐοΐΐ | 1714 |
<210> 4 <211> 1704 <212> ДНК <213> корова
- 22 013564 <400> 4
| сскасасдкд | кдкддкдакд | сасдаддссс | ЪдсасааЪса | скасасдсад | аад^ссассЕ | 60 |
| скаадкскдс | дддкааакда | дсс1:сасдЪс | ссЕдсассад | саадссскса | сссадсссас | 120 |
| сскссссддд | скссаадксс | адссаддасд | ссс1:адсссс | кссскдкдкд | саб1:ссЕсс1: | 180 |
| дддссдссдк | даакааадса | сссаддссас | ссЪдддассс | Одсаасдскд | £ дсЕдд^ сЕ | 240 |
| ккссдаддса | дадссскддк | ддссдссадд | ссбдсадддд | кдддскдадс | сдас^сЪддд | 300 |
| ссаскккдкк | садсакскдк | дддддадскд | ассссдс1:сс | дддссадаса | сасад1:дад11 | 360 |
| дддкссадса | ддссасскдд | дддскдсссд | аддссасдда | ддддсккддс | сададдсд^а | 420 |
| сскссасддс | сссскссадс | сассасскдс | Сдддссддсс | кскддасадд | аассддддаа | 480 |
| дсссссдада | сссксаддда | ккдаддссса | а^дсЬ^сссд | сскскдсксс | адсссасдсЛ | 540 |
| дкддддсадд | дссасаксск | кдкссссадд | сссс^дкссс | кдддкдссса | дадЕсс11^дЕ | 600 |
| дкссаскскд | ддсскдсскд | дадссасдсд | Иддссддддд | акддссскдс | 1ссассс1:са | 660 |
| ддсксссаад | дксаддсскс | дссскссскс | адссаддадд | скскдсссдд | сЬсЕсссЪдс | 720 |
| ссадддссад | дсскдкдсдс | ссакддддад | дСсаЬсссЩд | кдсскдааад | ддс±ссаддс | 780 |
| сдддадссск | даакдкссад | ддсадддасс | Ъадс1:дс£сс | скдсадасас | ддадсссада | 840 |
| дссасадаса | асаадсссса | дссссдсасд | сасасаадас | адсссдсасс | садсс£сс£с | 900 |
| сасасдсаск | саддкдкдса | кссдсасакд | адсасас££с | ассссдксас | асссасасдс | 960 |
| скасасасас | ксаддксксд | сасксдддда | ссса^дддд·!: | дассссасад | дсссадассс | 1020 |
| ададскдддк | сккдкдадсс | скссскдкдд | асассадсЕд | дкссссассс | Ъссадсдссс | 1080 |
| акдддскдск | садкддссск | кксссасаск | дассасасбд | ассаддксад | аса£ссд£Сс | 114 0 |
| сккдсскссс | скддддсасс | сасдсссскс | сс^адсаддс | кдадаксссс | ссЪсадсссс | 1200 |
| ксдксскддс | асссксассс | сксаддсаса | дддасасадс | ссддсдскдк | сЪдсссХссс | 1260 |
| кссскддддд | садддсссад | дсксасакдс | Ес^дсЕдасс | сксссддскс | саддссбддс | 1320 |
| ссссадддса | даддаддсса | ддааскдадс | с1:с^дЕсс1:д | дддддаддЕд | ддд£садддс | 1380 |
| сссадсксад | ддсасадскс | аддакдддаа | саддасасса | саддссаддс | ссадасадТзд | 1440 |
| дссадддскд | даддддкддд | дкскддддск | ддддсссада | дасЕдассбс | адд£да£ссс | 1500 |
| кдсссадссс | акддддддак | сскдссасск | £ссссссасс | сададддадс | сс^дссссда | 1560 |
| ддссскдакд | акдссассса | дссссссдкд | ддсадасаса | дсасгдасса | ссссКссскд | 1620 |
| кдсадасскд | скдскддадд | аддадакскд | ^дсддасдсс | саддасдддд | адс1:ддасдд | 1680 |
| дскскддасд | ассаксасса | кскк | 1704 |
<210> 5 <211> 1704 <212> ДНК <213> корова
| <400> 5 | ||||||
| сскасасдкд | СдСдд(:да1д | сасдаддссс | кдсасаакса | сЕасасдсад | аадСссассЬ. | 60 |
| скаадкскдс | дддЪааа^да | дссбсасд'Сс | сскдсассад | саадсссбса | сссадсссас | 120 |
| сскссссддд | сЬссаддЕсс | адссаддасд | ссскадсссс | Ьссс£д1:дЪд | саб£сс11сс1: | 180 |
| дддссдссдк | даакааадса | сссаддссдс | сскдддассс | Щдсаасдсбд | ЕдсЕдд^ЕсЕ | 240 |
| ккссдаддса | дадсссЕдд! | ддссдссадд | сскдсддддд | бдддс1:дадс | сдасЪсЪддд | 300 |
| ссаскккдкк | садсаЕсСдЕ | дддддадскд | ассссасксс | дддссадаса | сасад^дадъ | 360 |
- 23 013564
| дддДссадса | ддссассДдд | дддсДдссса | аддссасада | ддддсДДддс | сададдсаса | 420 |
| дсДссасддД | ссссДссадс | сассассДдс | Ддддссддсс | ДсДддасадд | аассддддаа | 480 |
| дсссссдада | сссДсаддда | ЕДдаддссса | аДдсДДсссд | ссДсДдсДсс | адсссасдсД | 540 |
| дДддддсадд | дссасаДссД | ЕдДссссадд | ссссДдДссД | ДдддДдДсса | дадДссДДдД | 600 |
| дДссасбсДд | ддссДдссДд | дадссасдса | Дддссадддд | дДддсссДдс | ДДсасссДса | 660 |
| ддсДсссаад | дДсаддссДс | дсссДсссДс | ддссаддадд | сДсДдсссдд | сДсДсссДдс | 720 |
| ссадддссад | дссДдДдсдс | ссаДддддад | дДсаДсссДд | ДдссДдааад | дддДссаддс | 780 |
| сдададсссД | дааДдДссад | ддсадддасс | ДадсДдсДсс | седДддасас | ддадсссада | 840 |
| дссасадаса | асаадсссса | дссссдсасд | сасасдадас | адсссасасс | ссдссДссДс | 900 |
| сасасдсасД | саддДдДдса | ДссдсасаДд | адсасасДДс | ассссаДсас | асссасасдс | 960 |
| сДасасасас | ДсаддДсДсд | сасДсдддда | сссаДддддД | дассссасад | дсссадассс | 1020 |
| ададсДдддД | сДДдДдадсс | сДсссДдДдд | асассадсДд | дДссссассс | Дссадсдссс | 1080 |
| дДдддсДдсД | садсддДссД | ДДсссасасД | дассасасДд | ассаддДсад | асаДссдГДс | 1140 |
| сДДдссДссс | сДддддсасс | саДдссссДс | ссДадсаддс | ДдадаДсссс | ссДсадсссс | 1200 |
| ДсдДссДддс | асссДсассс | сДсаддсаса | дддасасадс | ссддДдсДдД | сДдсссДссс | 1260 |
| ДсссДддддд | садддсссад | дсДсасаДдс | ДсДдсДдасс | сДсссадсДс | саддссДддс | 1320 |
| ссссадддса | даддаддсса | ддаасДдадс | сДсДдДссДд | дддддаддДд | дддДсадддс | 1330 |
| сссадсДсад | ддсасадсДс | аддаДдддад | саддасасса | саддссаддс | ссадасадДд | 1440 |
| дссадддсДд | даддддДддд | дДсДддддсД | дддссссада | даакдасскс | аддДдаДссс | 1500 |
| Ддсссадссс | аДддддддаД | ссДдссассД | Дссссссасс | сададддадс | ссДдссссда | 1560 |
| ддсссДдаДд | аДдссассса | дссссссдДд | ддсадасаса | дсасъдасса | ссссДсссДд | 1620 |
| ДдсадассДд | сДдсДддадд | аддадаДсДд | Ддсддасдсс | саддасдддд | адсДддасдд | 1680 |
| дсДсДддасс | ассаДсасса | ДсДД | 1704 |
<210> 6 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 6 сдсддаДссс сДасдсдДдД дДддДдаДд 29 <210> 7 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер
- 24 013564 <400> Ί сдсддаЕсса ссдаддадаа даЕссасЕЕ 29 <210> а <211> 2842 <212> ДНК <213> овца <400> 8
| ссЕасдсдЕд | ЕдЕддЕдаЕд | сасдаддсЕс | Еасасаасса | сЕасасасад | аадЕсдаЕсЕ | 60 |
| сЕаадссЕсс | дддЕаааЕда | дссасаЕдсс | сссдсассад | саадсссЕса | сссадсссдс | 120 |
| ссЕссссддд | сЕссаддЕсс | адссаддасд | сссЕадсссс | ЕсссЕдЕдЕд | саЕдссЕссЕ | 180 |
| дддссдссаЕ | дааЕааадса | сссаддссдс | ссЕдддассс | ЕдсаасдсЕд | ЕдсЕЕдЕЕсЕ | 240 |
| ЕЕссдаддса | дадсссЕддЕ | дассдссадд | ссЕдсддддд | дЕдддсЕдад | сссасЕсЕдд | 300 |
| дссдсЕЕддЕ | ЕсадсаЕсЕд | ЕдддддсдсЕ | дассссЕсЕс | сдддссадас | асасадЕдад | 360 |
| ЕдддЕссддс | адддсассЕд | ддддсЕдссс | даддссЕсдд | аддддсЕЕдд | ссададдсдс | 420 |
| адсЕЕсасдд | сссссЕссад | ссассасаЕЕ | сЕдддссада | сЕсЕдддсад | даасддддда | 480 |
| адсссссдас | ассЕсаддда | ЕЕдаддссса | асдсЕЕсссд | ссЕсЕдсЕсс | адсссасдсЕ | 540 |
| даддддсадд | дссдсддссЕ | ЕдЕссссадд | ссссЕдЕЕсс | ЕдддЕдссса | дадЕссдЕдЕ | 600 |
| дЕссасЕсЕд | ддссЕдссЕд | дадссадасЕ | ддсссадддд | даддсссЕдс | ЕЕсасссЕса | 660 |
| ддсЕсссдад | дЕсаддсаЕс | аЕссЕсдЕсд | дссадЕадсЕ | сЕдссЕддсЕ | сЕсЕсЕдссс | 720 |
| ддддссаадс | сЕдЕдЕдссс | аЕддддаддЕ | сдЕсссЕдЕд | ссЕдаааадд | дсссаддсЕд | 730 |
| ддадсссЕда | асдЕссаддд | садддассЕа | дсЕдсЕсссЕ | ддддасасЕд | адсссададс | 840 |
| сссадасасс | аадссссадс | сссдсасдса | сасдадасад | сссасассса | дсдЕссЕсса | 900 |
| сасдсасЕса | ддсдЕссасс | сдсасасаад | саЕдсЕЕсас | ссссдЕсаса | сасссасаЕд | 960 |
| ссЕдсасаса | сЕсаддЕсЕс | асдсЕссддд | асссаЕддад | ЕдаЕсссасд | ддсссадасс | 1020 |
| сададсЕддд | ЕсЕсаЕдадс | ссЕсссЕдЕд | дасассадсЕ | ддЕссссаЕЕ | сЕссадсдсс | 1080 |
| сЕЕдддсЕдс | ЕсадЕддссс | ЕЕЕсссасас | ЕдассасасЕ | дассаддЕса | дасаЕссЕЕс | 1140 |
| сЕсдссЕссс | сЕддддсасс | сасдссссЕс | ссЕсдсаддс | Едадассссс | ссЕсадсссс | 1200 |
| ЕсдЕссЕддс | асссЕсассс | сЕсдддсаса | дддасасадс | ссддсасЕдЕ | сЕдсссЕссс | 1260 |
| ЕсЕсддддас | ададсссадд | сасдЕдЕдаЕ | сЕдсЕдадсс | ЕсссддсЕсс | аддссЕддсс | 1320 |
| сссадддсад | аддаддссад | дааЕЕдадсс | ЕеЕдЕссЕдС | ддддаддЕдд | ддЕсадддсс | 1380 |
| ссадсЕсадд | дсасадсЕса | ддаЕдддадс | аддассссас | аддссаддсс | садасадЕдд | 1440 |
| ссадддсЕдд | ддсЕддддсЕ | ддддсссада | дасЕдассЕс | аддЕдасссс | Едсссддссс | 1500 |
| аЕдддддаЕс | асассдссаЕ | сссссссдсс | дсададддад | сСОЕдссссд | аадссссдаЕ | 1560 |
| ддссссдссс | адссссссдЕ | дддсадасас | адсасЕдасс | ссссЕсссЕд | ЕдсадаЕсЕд | 1620 |
| сЕдсЕддадд | аддададсЕд | Едсддасдсс | саддасдддд | адсЕддасдд | дсЕсЕддасд | 1680 |
| асЕаЕсЕсса | ЕсЕЕсаЕсас | дсссЕЕссЕд | сЕсадсдЕсЕ | дсЕасадсдс | сассдЕдасс | 1740 |
| сЕсЕЕсаадд | ЕдддддЕсса | сссЕдсЕддд | сссЕсдддсс | сссЕсЕсЕдЕ | ссссадддЕс | 1800 |
| сссдсададЕ | сссЕсссЕдс | сссЕсасЕдЕ | сссЕсссЕдЕ | сссЕсЕсЕдЕ | сссЕсЕсЕдЕ | 1860 |
| сссЕсЕсЕдЕ | сссЕсЕсЕдЕ | ссдЕЕсаЕЕЕ | ЕсссЕЕсасс | дЕаадсЕЕда | дасадаЕЕдд | 1920 |
| ддЕсаЕЕЕса | дадддсдЕсЕ | даададЕсЕс | ЕдЕдссдсас | дссЕсссЕЕс | аЕдЕсадЕдд | 1980 |
| ддадааЕЕса | дсаадддЕдд | адЕдсЕдддЕ | дадаааЕдад | дсЕЕдсддсд | сЕсасдадса | 2040 |
- 25 013564
| дкдакддддс | аскдскдскс | сскдадасск | дсдсддасас | сдккккссак | сдсаддадаа | 2100 |
| дсдддсаадд | даааасдссс | ксккддкскс | ксккдадкаа | акдксдсдкк | ккддксакса | 2160 |
| дксссксссс | садкдаддск | ададдадккк | асккскссск | сксдакддкс | аддксаддас | 2220 |
| кдксакадас | кссддаксас | скксскдкаа | акдсккдскк | кккдкдкдса | дададсскдк | 2280 |
| кккадсксдд | дддкссксад | сксаскдадс | ксдсддддса | дддд^дддск | сдддскддсд | 2340 |
| ссдсскдккс | дддадсдсак | скссадсакд | скдксдсаса | дскксдккдс | каасаадасс | 2400 |
| дсккадкскс | дкддккадас | саасскдскк | ксксдадкаа | ккдккааккк | асаддадккк | 2460 |
| сскдкакккк | ксаасккака | аксссскадк | садакааскс | кккааксасс | каккскдссс | 2520 |
| скксаккккс | кссскаксда | ксксадсаас | ссаксаскдс | ссксаскдкс | сккаааскдк | 2580 |
| сссккааскд | ассадаскдк | сссксадкдк | ссссксадад | ксасскссск | аксассксас | 2640 |
| кдкссскскс | кдсссскскс | кдсссскскс | кдкссскссс | кдсссскссс | сдксссскск | 2700 |
| скдкссскск | скдсссскса | скдсксскск | скдсасскса | скдсксскса | скдссскддд | 2760 |
| ддаддсссдс | аксдаддкдк | скскдсксас | сссдкссссс | ассссдкасс | ссссдссадд | 2820 |
| кдаадкддак | сккскссксд | дк | 2842 |
| <210> | 9 |
| <211> | 2840 |
| <212> | ДНК |
| <213> | овца |
| <400> | 9 |
сскасдсдкд кдкддкдакд сасдаддскс кдсасаасса скасасасад аадксддкск скаадссксс дддкааакда дссасасдсс сссдсассад саадссскса сссадсссдс
120 сскссссддд скссаддксс адссаддасд ссскадсссс кссскдкдкд сакдссксск
180 дддссдссак даакааадса сссаддссдс сскдддассс кдсадсдскд кдскддккск
240 ккссдаддса дадссскддк даксдссадд сскдсддддд дсдддскдад сссаскскдд
300 дссдсккддк ксадсакскд кдддддсдск дасссскскс сдддссадас асасадкдад
360 кдддкссддс адддсасскд ддддскдссс даддссксдд аддддсккдд ссададдсдс
420 адскссасдд ссссскссад ссассасакк скдддссада скскдддсад даасддддда
480
540 ассксаддда ккдаддссса асдскксссд сскскдзксс адсссасдск адсссссдас
| даддддсадд | дссдсддсск | кдкссссадд | сссскдкксс | кдддкдссса | дадкссдкдк | 600 |
| дкссаскскд | ддсскдсскд | дадссадаск | ддсссадддд | даддссскдс | кксассскса | 660 |
| ддсксссдад | дксаддсакс | акссксдксд | дссадкадск | скдсскддск | скскскдссс | 720 |
| ддддссаадс | скдкдкдссс | акддддаддк | сдкссскдкд | сскдаааадд | дсссаддскд | 780 |
| ддадссскда | асдкссаддд | садддасска | дскдскссск | ддддасаскд | адсссададс | 840 |
| сссадасасс | аадссссадс | сссдсасдса | сасдадасад | сссасассса | дсдкссксса | 900 |
| сасссаскса | ддсдкссасс | сдсасасаад | сакдскксас | ссссдксаса | сасссасакд | 960 |
| сскдсасаса | сксаддкскс | асдскссддд | асссакддад | кдаксссасд | ддсссадасс | 1020 |
| сададскддд | ксксакдадс | сскссскдкд | дасассадск | ддкссссакс | скссадсдсс | 1080 |
| сккдддскдс | ксадкддссс | ккксссасас | кдассасаск | дассаддкса | дасакссккс | 1140 |
| сксдсскссс | скддддсасс | сасдсссскс | ссккдсаддс | кдадассссс | ссксадсссс | 1200 |
| ксдксскддс | асссксассс | сксдддсаса | дддасасадс | ссддсаскдк | скдссскссс | 1260 |
| ксксддддас | ададсссадд | сасдкдкдск | скдскдадсс | ксссддсксс | аддсскддсс | 1320 |
- 26 013564
| сссадддсад | аддаддссад | дааккдадсс | кскдксскдс | ддддаддкдд | ддксадддсс | 1380 |
| ссадсксадд | дсасадскса | ддакдддадс | аддассссас | аддссаддсс | садасадкдд | 1440 |
| ссадддскдд | ддскддддск | ддддсссада | даскдасскс | аддкдасссс | кдсссддссс | 1500 |
| акдддддакс | асассдссак | сссссссдсс | дсададддад | ссскдссссд | аадссссдак | 1560 |
| ддссссдссс | адссссссдк | дддсадасас | адсаскдасс | сссскссскд | кдсадакскд | 1620 |
| скдскддадд | аддададскд | кдсддасдсс | саддасдддд | адскддасдд | дскскддасд | 1680 |
| аскаксксса | кскксаксас | дскскксскд | сксадсдкск | дскасадкдс | сассдкдасс | 1740 |
| скскксаадд | кдддддссса | ссскдскддд | сссксдддсс | ссскскскдк | ссссадддкс | 1800 |
| сссдсададк | ссскссскдс | сссксаскдк | ссскссскдк | ссскскскдк | ссскскскдк | 1860 |
| ссскскскдк | ссскскскдк | ссдсксаккк | кссскксасс | дкаадсккда | дасадаккдд | 1920 |
| ддксакккса | дадддсдкск | даададкскс | кдкдссдсас | дссксссккс | акдксадкдд | 1980 |
| ддадааккса | дсаадддкдд | адкдскдддк | дадааакдад | дсккдсддсд | сксасдадса | 2040 |
| дкдакддддс | аскдскдскс | сскдадасск | дсдсддасас | сдккккссак | сдсаддадаа | 2100 |
| дсдддсаадд | даааасдссс | ксккддкскс | ксккдадкаа | акдксдсдкк | ккддксакса | 2160 |
| дксссксссс | садкдаддск | ададдадккк | асккскссск | сксдакддкс | аддксаддас | 2220 |
| кдксакадас | кссддаксас | скксскдкаа | акдсккдскк | кккдкд кдса | дадсскдккк | 2280 |
| кадсксдддд | дкссксадск | саскдадскс | дсддддсадд | ддкдддсксд | ддскддсдсс | 2340 |
| дсскдкксдд | дадсддсакс | кссадскдск | дксдсасадс | кксдккдска | асаадассдс | 2400 |
| ккадксксдк | ддккадасса | асскдскккс | ксдадкаакк | дккаак Ькас | аддадккксс | 2460 |
| кдкакккккс | аасккакаак | сссскадкса | дакааскскк | кааксасска | ккскдсссск | 2520 |
| ксаккккскс | сскаксдакс | ксадсаассс | аксаскдссс | ксаскд Ьсск | каааскдксс | 2580 |
| сккааскдас | садаскдксс | сксадкдксс | ссксададкс | асскссскак | сассксаскд | 2640 |
| кссскскскд | сссскскскд | сссскскскд | кссскскскд | кссскссссд | ксссскскск | 2700 |
| дкссскскск | дссссксаск | дсксскскск | дсассксаск | дскссксаск | дссскддддд | 2760 |
| аддсссдсак | сдаддкдкск | скдсксассс | сдксссссас | сссдкссссс | ссдссаддкд | 2820 |
| аадкддакск | кскссксддк | 2840 |
<210> 10 <211> 3120 <212> ДНК <213> кролик
| <400> 10 | ||||||
| скссссссса | сдссдсадск | дкдсассссд | сасасааака | аадсасссад | сбсбдсссбд | 60 |
| ададдскдкс | скдакксскк | ссааддсада | ддсккссаск | сдддссддас | адддббдддс | 120 |
| дддсдссдкд | ддскскдскд | кддссадсад | ссадаасддк | саасадкддд | асаддддсад | 180 |
| асссасадса | саддддсскд | ссаадааскд | ддсксадссд | дадкдскдкд | дсаддбсссс | 240 |
| ссккдсадск | адсасдкдкд | кдскдддсад | дсададдссс | ссаддддадд | адсасасадс | 300 |
| кассасскск | дсаададсск | ддсскддсдс | ссаддкссса | дкссасаддд | бдбдбадбас | 360 |
| асададсскс | аксккассас | адакдкаддд | асадасссас | сасдсссскд | сассссассс | 420 |
| адссксдссс | сккдкдддас | садддскасс | аскссасксс | сссдсссада | дсадсадаад | 480 |
| саддкддсак | ссксадсада | дддасадкск | сассссксса | сддсаскдад | сссбдасоса | 540 |
| ксааасаадс | сссксскдск | дсасадсасс | кдкдкдсаса | ксасасасас | асасасасас | 600 |
- 27 013564
| асасЪдаддс | сСдассссаГ | сааасаадсс | ссСсс£дс1д | сасадсасс! | д^дйдсасаС | 660 |
| сасасасаса | сасасасаса | сасСдаддсс | СдассссаЮ | сТдсссГсс!: | дсйдсаЬддс | 720 |
| ассСдЪдбдс | асаЬсасаса | сасабдсаса | сасасасСоа | сасасас^да | дсссСдассс | 780 |
| саСссСдссс | ЬссЪдсЬдса | Ьддсасс^дЬ | дЪдсасаСса | сасасасаса | сасасасаса | 840 |
| сасасасЬда | дссс^дассс | са^ссСдссс | £сс£дс£дса | Сддсасс£д£ | дсасасаЮа | 900 |
| сааасасдсс | ОдссбсаОас | ас£ддсас1:с | адааддддсс | сс£д1:асасд | са^асасабд | 960 |
| сасасассЬО | дасасабддд | сссссЬасас | асдсаСсаса | саеасЪсаСд | сасасЛсс1с | 1020 |
| асаса£ддсс | с£ссЬдсаса | ГасаЬГдсас | асасаЬдЬдс | асадасс£са | сааЬдддссс | 1080 |
| сЬдсасасас | а^дЬасаса | сдсайдЬдса | сасасйГсас | асаЕдддссс | ссЬдсасаСд | 1140 |
| саЫздсасас | асадасасас | асаЪдЬдсаЬ | ЬссЬсасаса | йбддддссЬО | дсаадддабд | 1200 |
| сссйдсасас | асаСТдсаса | СдсСсасаЬд | Сдсасасасс | ссасасКдда | дссЬЬдсаЬа | 1260 |
| дддсссссСд | Ьасасасасс | а^дсаГасас | асасассГса | сасааддддс | сссс£аса(:а | 1320 |
| сдсаааасас | асасасасас | а(:дсасасас | с1:са<:асасд | ддсссссСас | асасассаса | 1380 |
| сасасасаса | сасасасдЕа | ИдсаЬдссСс | асасасадас | с^Пдсааддд | дсссссСдса | 1440 |
| са1:дса1:саа | асаса£а5дс | асаГд^СТса | сасасасддГ | ссссЬасаса | сас£дсасас | 1500 |
| дсасаса£д1: | д£аса£дс(:1: | сасасас^дд | ддссС1:дса1: | ддддСссссО | дса£адса£а | 1560 |
| дсасссадад | ссасдссадд | СдссСдддса | са^ддасасС | дд^дсасаса | садсасссаа | 1620 |
| дсссадсйсЬ | саса^ссаад | дддсассадс | ассссссасЬ | сасдадсасс | сСдааНЬсс!: | 1680 |
| дсЪссссаса | адсдаасд(:д | сасссЪасс!; | сЦссадасдЪ | ссс4(Лсс1д | £ддссас1:сс | 1740 |
| саСадд(:а1:1: | ддсдадассс | (юссЬЬдасс | с^ГдддссСд | дСсасссадд | ддасаддада | 1800 |
| дддссаад£Ъ | дддссасад£ | ассасСдссс | адсаддддСд | аддсаадсад | адддСддд^с | 1860 |
| (зд^даддсдЪ | сСддссадсс | дТдЛддддс | ссадд1:дддд | адсадс^ддд | £ддс£даддс | 1920 |
| ддсСЪссГ^д | садд(:дд5 Ьд | дддддадсЬд | дссссасаад | ЪдссасЪдсс | садсасГдЮ | 1980 |
| сад£дс£Ьсс | сссСдаассС | сссддссасс | саСссссадс | Гдсадссдса | дадддад^дс | 2040 |
| сссбсддссС | ссСсддсаад | асдсасдсбд | асСдссссСс | сссаюсада | дсОдсадсСд | 2100 |
| дасдададс): | дЪдссдаддс | ссаддасддд | дадс£ддасд | ддсЬдСддас | сассаЬсасс | 2160 |
| а£с££са(:сЪ | сссЬс^сссй | дсЪсадсдГд | Сдсйасадсд | ссасадСсас | ссПс^Ссаад | 2220 |
| дЪдддТдсЪд | сасссддсас | дддйдддсГд | ддддссаддд | дсдддддссд | ддддссаддс | 2280 |
| сс£сс):сасс | ссдсдссдсс | дсСдс!:дсад | д£даад1:дда | ЬсЬЬс!сд!с | сд^ддЪддад | 2340 |
| сСдааасаса | ссаСсдсЬсс | сдасЪасадд | ааса^даСсд | ддсадддддс | сбаддсссСС | 2400 |
| сд£Ьс1:саса | дсс£дсс!:сс | с^ддссадса | ддадсссссд | ссЬссдссСс | ддассссайд | 2460 |
| дсСсГсЪдс!: | сГддссдсЮ | сддасссс1:с | сдссСсддда | даадсдсдса | дс^да^дсс!: | 2520 |
| дссддсссс,: | ссасдсадса | дСдсддасад | сасдсаСс^д | ЬсдЮсассс | ддсаддассс | 2580 |
| сасссадддс | садсссЪдас | сдссадссСс | оЬддас1сад | ддс£сс£сЪд | адааааддсс | 2640 |
| сасйЪдЬЪдд | 1;сссс1:садс | ссасасссад | дсадсс^ссд | дгдддСдсЬ!: | сссЬддассс | 2700 |
| садсс1;дадд | ссЬаЪдсЪСд | 1.5ст.сс1:д5.д | дс±с£1:ас1:с | ададдсссдб | дс!ддасЪсс | 2760 |
| сасссасадд | дасад^дссс | СдсЬссаасс | сЬсасЬдсас | ЕдддддЪса£ | ддддссассе | 2820 |
| СсОдСдсадд | ддбсЛддсЬ | ссааддадаа | сасЬсдаадд | дссСдсЪСдд | ссассЬддса | 2880 |
| ссасдддадс | сссдсСдддЬ | адс^Сддсад | ддассссСда | дСададдСдд | дСдсасссад | 2940 |
| ссадааадсс | СдЛддаЪдд | асаддадсск | ддсдСссддд | ссссаддсад | дсадасасдд | 3000 |
| с^^саЪддас | аддададдсс | ааддааса(:с | адсааадада | дасадсГддд | ссдддсд!1с | 3060 |
| садссадасс | са1:сс£дсад | сссадса1;сд | дссссд1;д£а | с£асадсадд | дасадссад!; | 3120 |
- 28 013564 <210> 11 <211> 2587 <212> ДНК <213> кролик <400> 11
| дсдадасдсс | 7дссадддса | ссдссад7да | сссОдаддсс | садсс7сдсс | дс7ссс7ссс | 60 |
| с7сад7ддас | осакцессас | сасад7сс7с | садссссСсс | ссГсссддсс | с7сассссс7 | 120 |
| сс71ддс777 | аассООдсда | а7д77дд7да | да7дда7даа | 7ааад7даа7 | с777дсас77 | 180 |
| д7дас77с7с | 7с7дс77с77 | са777аа7дд | 77а77ас7са | 7дд777ссса | д77дссс7аа | 240 |
| ад7сассдсс | а777са7сс7 | ссаОсссасс | с7дссс7дс7 | д7сс7сзддд | адасассас7 | 300 |
| сссЪдааасс | сасаддсссс | бдбсбксаса | ссдссдассс | сдассасасд | 7даддддс77 | 360 |
| дс77сдЬдГс | 7сас7сссс7 | сабсдадссс | садад7сс7с | С777ад7д77 | с7Сасад7са | 420 |
| са7асад77а | 7асад77 7да | д7саа7ссаа | сс7дссс7дс | саа777ссса | ааасааада7 | 480 |
| 777садааЪа | ааасадс7а7 | даадааадбе | а777а7ддаа | дса7даЬа7а | саасаасааа | 540 |
| асаа7дсааа | саасс7аас7 | даа7аадсад | адддааа7д+ | Тсадасасас | ЬаГддддсЫ: | 600 |
| дддс77са7д | дад7а77аса | сс77са77ас | а77777ааЭС | 77д7а77аад | дадс7сс7а7 | 660 |
| а77асаадда | 77а7ас7ада | дсас777сса | 7дасс7аа77 | аа77с7са77 | асас7д7дад | 720 |
| д77аааадса | 77ад77аааа | 7а77дддсад | дс7ссс7аСа | дссаасад77 | д77са7а77с | 780 |
| саЪаасссаа | сса7са777а | ддбдасОсад | ддбееб7д7с | сассаа даас | 777ддсаада | 840 |
| а7д77садад | саас77сс7Ъ | 7а7аааад7с | ааааа77дда | ад7аас 7саа | а7д7с7асса | 900 |
| асад7адаа7 | дддс7д77аа | 77ддса7а7д | 777аса7а77 | адаа7дс7д7 | 77аа7ааада | 960 |
| даа77аасаа | асбасаасба | 7ссс7аа7аа | са7адд7дас | 7са7аааса7 | да7д77аадс | 1020 |
| асаадаассс | ааасасаааа | дасасас7д7 | д7а7д7777с | а7сса7 адда | адГСсаааас | 1080 |
| 7ад77ааааа | 77даа77ада | аа77дада7д | аад771:ас7с | 77ддс7дддд | д7д7ддад7д | 1140 |
| аддсдд7дсс | ЪддЪддддда | садааад7дд | с7дс7дддд7 | с77дд7да7д | 77с7ад7сс7 | 1200 |
| сас7д7дд7д | 7д7дс7ас7с | 7даааа1д7а | 77дад7асас | аа77адд171 | 7д7дс777са | 1260 |
| 77а7ас7сса | аад7аад77с | 7са7аааса7 | 7дсс77асас | дддд7с 7аса | дабаададад | 1320 |
| асЪаададда | а7дад7ааса | да7сааддсс | асасадс7дд | 7аддса Ьддд | сс7ддда7са | 1380 |
| аассс7д7с7 | дсссаа77с7 | дс7с7с77да | дсссСасас! | а77с77 7сса | дсас1ддаа7 | 1440 |
| дссаГдсада | асадддад^а | ддаса+дсГа | сс7ссс7адд | д7с7сс 7сс7 | 77асссасс7 | 1500 |
| аассаддадс | ассса7аса7 | адааасадда | 7ддаааадас | са7садсаа7 | ддаасааддд | 1560 |
| адада77аас | с77д77сад7 | а77д7да7сс | са7д7аддаа | ада77д7ддд | аддадддс7д | 1620 |
| сасасададс | ассдбссссс | Ь'ЬсЬаТдПдс | ссассдс7с7 | д£дсссссЬЪ | а7с7дс7сас | 1680 |
| ссдсссадсд | 7дса77сас7 | садсасссОЪ | ίίсдссЪдсс | с7с7дааада | дд7дсадаад | 1740 |
| 7аас7ааасс | адс77ссс7с | с77сад7дас | 77ддаа7сса | д|.!. Пертес | 7с7а777ссс | 1800 |
| сс7сс7777с | ад7дсаддад | ссгддадааа | 7д7да777д7 | д77а77а7аа | а777сссаса | 1Θ60 |
| Ъса7777д7д | Оаадддаааа | 7аЬас7саас | ад7са7аас7 | дд7ааа асЪд | сбдбдаааас | 1920 |
| ЬаададаадГ | аа77са7дсд | аадд77дадс | ассадсс77д | 1:3791:371:33 | дада7ссада | 1980 |
| ад7д77ад7с | ассд77адаа | а7аадаадда | д7адс7саа7 | 77дас7 ад77 | сс7ддС7сас | 2040 |
| 7сс77дааса | 7д77с77сад | 77а7са7с77 | 7сад7сссаа | а7да77 даас | 77ддаа77аа | 2100 |
| сЬсасаГдда | 77с7адасс1: | д7дссдадаа | 7ддс7дссас | 7сд7дс7с7а | дадс7с7ддд | 2160 |
| да7даддс7д | 7ссс7ас7д7 | дд7д7дс7ас | адд7с7ааса | асасасзадд | 7777даадас | 2220 |
- 29 013564
| ЬЬадсасба)! | дааДакаЪаЬ | аЬаЬа!5а1:а | И.ссаабааа | Шаасасас | !Ъ5с1ас1!:1: | 2280 |
| саб-едсаЪдИ | 1дада!ад!:а | аШэс.Пд | ςβίβίζβΐίϊς | д!!ааассаа | ас!ас!с!са | 2340 |
| адасаааЬЪЬ | са^аддЪЪТа | Ьдд! | асаа^Маа·: | сааааЪа!аа | асаЬадбсса | 2400 |
| аасааЫаас | ссаТЪЪааад | Ьддадаабдд | сссаад1:д116 | СдддссссЬд | сЬасссаЬЪ! | 2460 |
| Ызаадассад | аЪдТ!дс1:с5 | ЬддсИс^дд | ο1ζ±.ΐ.1ζ дс5Тд | дс!садссс1: | ддссаидса | 2520 |
| дсса!с!дад | дадЪааасад | 1ддаЪддаад | аса!с!сссс | ссассс! дсс | саЪааадс!:с | 2580 |
| ддда!сс | 2587 |
<210> 12 <211> 1205 <212> ДНК <213> кролик <220>
<221> Неопределенно <222> (997) <223> нуклеозид в положении 997 является неопределенным <220>
<22
Неопределенно <222>
(1127) <223>
нуклеотидположении 1127 является неопределенным
<400>
аассасдссс
дас^даадас
ЪсТсасдсас
д!:дададса4:
ЫсСсаддаа
120 ссДсассбдд ааддЪдсасЪ асЬдсааддд
дс!ссдддад саЪддаааса саа
180
Ьдаддасдд!
300 дсд11ссадсс
ЪдасаЪддсс сссасадас!:
1дасдссада сдсссасадд
360
адЪсТсссГд
с!:даса1:сса
540 сссасддссЪ дсадсИсс!
дсЮсЬддс!
даас5ддссд ссссадссса
600
1с1сассссс ддссасдСдд
1:Т1:дс1:д!дс
660 ссасссадса
ддд1:дсадса
дсасд'ЬС^
720
780 аасссдсссс
с!дссссс1д
ГсссадсссЬ
ЪсасОсЬссд ссСГ
900
7.1. ос 1 дсс!. с са^сЪадс!
960
ЬдсссЬпЬс):
дсдссСЬдса
1020 а1с1дс1:д!!:
ддассаадас ассасссдса дсасадд!:дд с£д!дс!адд
1080 сссЬссссдс асадаааадд дсссЛаддс):
сЪддаддсОд с!дс1дпс0с
Оддддсиддс
аксдддсдса ссскдсассс кдсассскда ддааасксад дсскдсссдс кссаддсскд
1200 кссск
1205
| <210> | 13 |
| <211> | 668 |
| <212> | ДНК |
| <213> | кролик |
| <400> | 13 |
| даадскккас | ккдЬкддддд | сдддсаддкс каадддасск | дссаддкдкд | ддддскдддс | 60 | |
| РСдасксадс | аддадссккс | кадааддааа | дскскддада | аддкдддддс | ададддсддд | 120 |
| аааддсскдк | даддаддсдд | дкддкдддса | дддссаскдд | даадддаддд | скдддддкда | 180 |
| сасксаддМ: | ддсаскдддд | аддасскдад | даддсаддкд | ссаддсасад | адскдаасск | 240 |
| дддсадддса | ддддсаддка | асаадаадда | ккскссккдд | адсскддксс | адддкддксс | 300 |
| адддсддксс | адддсскддд | дкккдсаадс | кдддскдкда | садддсскск | скссссаддд | 360 |
| дсаадсадса | аадсскдддс | асададссса | аадсссссас | асададаадс | кссссадддс | 420 |
| адддссЬдса | дддсккдддд | дасскксккд | дадсаддсад | аддасададд | сакдадакса | 480 |
| дссксссада | ддсЪддааЪд | акаддкссад | саддаддддс | ссасакдддс | кскддккадс | 540 |
| аддадаааас | адсссссадд | кссссакддс | сассасдсас | сдаскс(скдд | кдаадскккд | 600 |
| ддкддсадас | дададссаса | кддсадскдс | ксскдксаск | скскдс[дадк | дсаксдаддд | 660 |
| дсдксдас | 668 |
<210> 14 <211> 45 <212> Белок <213> верблюд <400> 14
| 51 и 1 | Рго | Ьеи | Ьеи С1и 5 | С1и | С1и | Зег Суз А1а 10 | С1и | А1а | С1п | Зег | С1у 15 | С1и | |||
| Ьеи | Азр | 51у | Ьеи | Тгр | Ткг | Ткг | Не | Зег | 11е | Рке | Пе | Ткг | Ьеи | Рке | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ьеи | Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Ткг | Ча1 | Ткг | Ьеи | РЬе | Ьуз | |||
| 35 | 40 | 45 |
<210> 15 <211> 44 <212> Белок <213> Ното зартепз <400> 15
| 31и 1 | Ьеи | С1п | Ьеи | С1и С1и 5 | Зег Суз | А1а | С1и 10 | А1а С1п | Азр С1у | С1и 15 | Ьеи | ||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТНг | ТНг | Не | ТНг | Не | РНе | 11е | ТНг | Ьеи | РНе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТНг | Уа1 | ТНг | РЬе | РЬе | Ьуз |
40 <210> 16 <211> 44 <212> Белок <213> Ното зарЬепв
| <400> 16 | |||||||||||||||
| <31 и | Ьеи | С1п | Ьеи | С1и | (31и | Зег | Суз | А1а | С1и | А1а | С1п | Азр | Б1у | С1и | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТНг | ТНг | 11е | ТНг | 11е | Ьеи | 11е | ТНг | Ьеи | РНе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТНг | Уа1 | ТНг | РНе | РНе | Ьуз | ||||
| 35 | 40 |
| <210> | 17 | |
| <211> | 44 | |
| <212> | Белок | |
| <213> | Ното зариепз | |
| <400> | 17 | |
| С1и Ьеи С1п Ьеи 61и 51и Зег Суз А1а С1и А1а | С1п Азр С1у С1и Ьеи | |
| 1 | 5 10 | 15 |
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТНг | ТНг | 11е | ТНг | Не | РНе | 11е | ТНг Ьеи РНе Ьеи Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зет | А1а | ТНг | Уа1 | ТНг | РНе | РНе | Ьуз |
40
- 32 013564
| <210> | 13 |
| <211> | 44 |
| <212> | Белок |
| <213> | мышь |
| <400> | 13 |
| 61у 1 | Ьеи | С1п | Ьеи | Азр 5 | С1и | ТЬг | Суз | А1а | С1и 10 | А1а | С1п | Азр | С1у | С1и 15 | Ьеи |
| Αερ | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | А1а | Уа1 | ТЫ | Ьеи | РЬе | Ьуз | ||||
| 35 | 40 |
<210> 19 <211> 44 <212> Белок <213> мышь <4С0> 19
| С1у Ьеи Азр Ьеи Азр Азр Уа1 | Суз | А1а | С1и 10 | А1а С1п | Азр | С1у | С1и 15 | Ьеи | |||||||
| 1 | 5 | ||||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | 11е | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Зег | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
| 35 | |
| <210> | 20 |
| <211> | 45 |
| <212> | Белок |
| <213> | мышь |
| <400> | 20 |
| Рго С1у Ьеи С1п Ьеи Азр С1и | ТЬг Суз А1а С1и А1а С1п Азр С1у С1и | ||
| 1 | 5 | 10 | 15 |
| Ьеи Азр 61у Ьеи Тгр ТЬг ТЬг 11е ТЬг Не РЬе Не Зег Ьеи РЬе Ьеи | ||
| 20 | 25 | 30 |
- 33 013564
<210> 21 <211> 44 <212> Белок <213> мышь <400> 21
| С1и 1 | Ьеи | 61и | Ьеи | Азп 5 | 61и | ТЬг | Суз | А1а | С1и 10 | А1а | 51п | Азр С1у С1и 15 | Ьеи | ||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Зег | νβΐ | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз | ||||
| 35 | 40 |
<210> 22 хП-1 1 АЛ ц/ чч <212> Белок <213> мышь <400> 22
| С1и 1 | Ьеи | С1и | Ьеи Азп 5 | С1у ТЬг | Суз | А1а | С1и А1а С1п Азр 10 | С1у С1и Ьеи 15 | |||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | 11е | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Зег | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз | ||||
| 35 | 40 |
| <210> | 23 |
| <211> | 44 |
| <212> | Белок |
| <213> | овца |
<400> 23
Ьеи Ьеи Ьеи 31и С1и 61и Зег Суз А1а Азр А1а С1п Азр С1у 01и Ьеи
10 15
- 34 013564
Азр (31у Ьеи Тгр ТЬг ТЬг Не Зег 11е РЬе 11е ТЬг Рго РЬе Ьеи Ьеи
25 30
Зег Уа1 Суз Туг Зег А1а ТЬг Уа1 ТЬг Ьеи РЬе Ьуз
40 <210> 24 <211> 44 <212> Белок <213> овца <400> 24
| Ьеи | Ьеи | Ьеи | С1и | С1и | С1и | Зег | Суз | А1а | Азр | А1а | С1п | Азр | С1у | С1и | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | Зег | Т1е | РЬе | Не | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз | ||||
| 35 | 40 |
<210> 25 <211> 19 <212> Белок <213> корова <400> 25
Ьеи Ьеи Ьеи 61и С1и С1и 11е Суз А1а Азр Азр Ьеи Азр 31у С1и Ьеи
10 15
Азр С1у Ьеи
| <210> | 26 |
| <211> | 19 |
| <212> | Белок |
| <213> | корова |
| <4 00> | 26 |
- 35 013564
Ьеи Ьеи Ьеи С1и С1и 61и Не Суз А1а Азр А1а С1п Азр С1у С1и Ьеи
10 15
Азр С1у Ьеи
| <210> | 27 |
| <211> | 43 |
| <212> | Белок |
| <213> | кролик |
| <4С0> | 27 |
| Ьеи С1п 1 | Ьеи Азр | С1и Зег Суз 5 | А1а С1и А1а 61п 10 | Αερ | С1у | С1и | Ьеи 15 | Азр | |||||||
| С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи | Зег |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
40 <210> 28 <211> 27 <212> Белок <213> верблюд <400> 28
<210> 29 <211> 27 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 29
| Уа1 Ьуз Тгр 11е | РЬе Зег Зег Уа1 | Уа1 Азр Ьеи Ьуз СЬп ТЬг | Не Не |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
- 36 013564
С1п б1у А1а
Рго Азр Туг Агд Азп Мек Не С1у <210> 30 <211> 27 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 30
Уа1 Ьуз Тгр 11е Рке Бег Зег Уа1
5
Рго Азр Туг Агд Азп. Мек Не С1у <210> 31 <211> 27 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 31
Уа1 Ьуз Тгр 11е Рке Бег Зег Уа1
5
Рго Азр Туг Агд Азп Мек 11е С1у <210> 32 <211> 27 <212> Белок <213> мышь <400> 32
Уа1 Ьуз Тгр 11е Рке Зег Зег Уа1
5
Рго С1и Туг Ьуз Азп Мек Не <31у <210> 33
| Уа1 | Азр | Ьеи Ьуз С1п Ткг | 11е Не |
| 10 | 15 | ||
| С1п | С1у | А1а | |
| 25 |
Уа1 Азр Ьеи Ьуз С1п Ткг Не Не
| 10 | 15 |
| С1п С1у А1а 25 |
Уа1 01и Ьеи Ьуз 61п Ткг Ьеи Уа1
| 10 | 15 | |
| 61п | А1а Рго | |
| 25 |
- 37 013564
| <210> | 34 |
| <211> | 27 |
| <212> | Белок |
| <213> | мышь |
| <210> | 35 |
| <211> | 27 |
| <212> | Белок |
| <213> | мыть |
| <210> | 36 |
| <211> | 27 |
| <212> | Белок |
| <213> | мышь |
- 38 013564
| Рго Азр Туг Агд Азп Мер | 11е | С1у | ||||
| 20 | ||||||
| <210> | 37 | |||||
| <211> | 27 | |||||
| <212> | Белок | |||||
| <213> | кролик | |||||
| <400> | 37 | |||||
| Уа1 Ьуз Тгр | Не | РЬе | Зег | Зег | Уа1 | |
| 1 | 5 | |||||
| Рго Азр Туг | Агд | Азп | Мер | Мер | С1у | |
| 20 | ||||||
| <210> | 38 | |||||
| <211> | 8 | |||||
| <212> | Белок | |||||
| <213> | овца | |||||
| <400> | 38 | |||||
| 7а1 Ьуз Тгр | Не | РЬе | Зег | Зег | Уа1 | |
| 1 | 5 |
31п С1у А1а
Уа1 С1и Ьеи Ьуз Н13 ТЬг 11е А1а
15
С1п С1у А1а <210> 39 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 39 сдсаадсРРс сРасасдРд! дрддрдард 29 <210> 40 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер
- 39 013564 <400> 40 дЬсдасдссс сЪсдаЬдсас Ьсссадад 23 <210> 41 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 41 ддРасссЪс!; сссЮсссса сдссдсадс 2 9 <210> 42 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 42 а^аЬсЬсада асЬддЫдСс ссЬдсЬдЬад Ьасасдд 37 <210> 43 <2119 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 43 дЬсдасасЬд дасдсГдаас сЬсдсдд 27 <210> 44 <211> 23 <212> ДНК
- 40 013564 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 44 ддЬассдддд дсЪНдссддс сдЬсдсас 28 <210> 45 <211> 38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 45 дсддссдсЬд дсдаддадас саадсНддад а£сааасд 38 <210> 46 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 46 дСсдасдсад сссааадстд ььдсаасддд дсадсд 36 <210> 47 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер
- 41 013564 <400> 47 агаьддьасс дсдадасдсс Ьдссадддса ссдсс 35 <210> 48 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 48 ддабсссдад с5Ή-πίдддс аддд5ддддд 30 <210> 49 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 49 аОаЬдЬсдас сЬдддаХаад саОдсОдЬЫ: ЬсЪдЬс^дЬс сс 42 <210> 50 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 50 с^аддЬасса дсаддбдддд дсасС5с5сс с 31 <210> 51 <211> 1719 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 42 013564 <220>
<223> Описание искусственной последовательности:сегмент гена Ογΐ тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина, фланкированный нуклеотидами, полученными из тяжелой цепи кролика.
<400> 51
ЬдасскассР ассскдссаа ддксаддддб сскссааддс ааддда!сас абддсассас60 сксксЬРдса дсскссасса адддсссакс ддкскбсссс скддсассск сскссаадад120 сасскскддд ддсасадсдд ссскдддс1д ссоддксаад даскасЫсс ссдаассддк180 дасддрдксд кддаасбсад дсдсосбдас садсддсдкд сасассЬксс сддсбдкссб240 асадксскса ддасбскасС сссбсадсад сдкддкдасс дЬдсссЬсса дсадсЬДддд300 сасссадасс касакскдса асдкдаакса саадсссадс аасассаадд Ьддасаадаа360 адЬЬддкдад аддссадсас адддадддад ддкдкскдсЬ ддаадссадд сбсадсдсРс420 скдссЬддас дсаксссддс Ьакдсадссс садкссаддд садсааддса ддссссдкск480 дссксЫзсас ссддаддссГ скдсссдссс сасбсакдск садддададд д1.с;.ι с1:ддс540
ЪкккЬсссса ддсбскдддс аддсасаддс Ьаддкдсссс Оаасссаддс сскдсасаса600 ааддддсадд Рдскдддскс адасскдсса ададссакак ссдддаддас ссЬдссссЬд660 асскаадссс ассссааадд ссааасбсбс сасбсссбса дсбсддасас скЬсбскссб720 сссадакбсс адкааскссс аакскксРсЬ сСдсададсс сааабсккдЬ дасааааскс780 асасаЬдссс ассдОдссса ддкаадссад сссаддссбс дссскссадс Дсааддсддд840 асаддкдссс кададкадсс кдсакссадд дасаддсссс адссдддЬдс Ьдасасдбсс900 асскссаЬсР сГРссксадс ассбдаасбс скддддддас сдксадксЫ: ссксЬксссс960 ссаааассса аддасассск саЬдаксксс сддасссскд аддксасабд сдрддкддкд1020 дасдкдадсс асдаадассс ГдаддЬсаад бксааскддк асдкддасдд сдЬддаддбд1080 сакаакдсса адасааадсс дсдддаддад садкасааса дсасдкассд кдкддксадс1140 дкссксассд бссбдсасса ддасОддскд ааОддсаадд ад1асаадкд сааддксОсс1200 аасааадссс ксссадсссс саксдадааа ассаксбсса аадссааадд ЬдддасссдЬ1260 ддддбдсдад ддссасабдд асададдссд дсбсддссса сссЪскдссс кдададбдас1320 сдскдЬасса ассЬскдксс сЬасадддса дссссдадаа ссасаддкдк асассскдсс1380 сссаксссдд дакдадсбда ссаадаасса ддксадсскд ассбдсскдд СсаааддсЫ:1440 скаксссадс дасабсдссд Дддадкддда дадсаакддд садссддада асааскасаа1500 дассасдсск сссдкдскдд аскссдасдд сЕссСксккс срсрасадса адсбсассдк1560 ддасаададс аддкддсадс аддддаасдк скксксакдс ЬссдЪдабдс акдаддсксб1620 дсасаассас басасдсада ададссбсбс сскдксбссд ддкааакдад сдскдбдссд1680 дсдадскдсс ссксксссЬс ссссссасдс сдсадсбдк1719 <210> 52 <211> 390 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 43 013564 <220>
<223> Описание искусственной последовательности:сегмент гена ЧН, кодирующий полипептидную последовательность человеческого элемента ЧН, с фланкирующими последовательностями, полученжщли из последовательностей ДНК иммуноглобулина кролика.
<400> 52 кдадкдасад Сдксскдасс акдксдкскд кдкккдсадд Ьдкссадкдк даддкдсадс60 кдккддадкс сдддддаддк сксдкссадс саддддддас сскдадаскс асскдсдсад120 кскскддакк сасскксадк адскакдсаа кдадскдддк ссдссаддск ссадддаадд180 ддскддаакд ддксддадсс аккадкддка дкддкадсас акаскасдсд дасадсдкда240 ааддссдаСД сассаксксс ададасааск ссаадаасас дскдкакскд сааакдааса300 дкскдададс сдаддасасд дссдсскакк аскдкдсдаа адасасадкд аддддссскс360 аддскдадсс садасасааа сскссскдса390 <210> 53 <211> 445 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:сегмент гена Ск легкой цепи человеческого иммуноглобулина, фланкированного 50 нуклеотидами, полученными из гена каппа-1 легкой цепи иммуноглобулина кролика.
<400> 53
| сакссасакд | дсасссаддд | дадакдксса | скддкасска | адссксдсса | ксскдкккдс | 60 |
| кксккксскс | аддаас£д£д | дскдсассак | скдкскксак | сЫсссдсса | кскдакдадс | 120 |
| адккдааакс | 1ддаас£дсс | кскдккдкдк | дсскдскдаа | каасккскак | сссадададд | 180 |
| ссааадкаса | д^ддааддпд | дакаасдссс | кссааксддд | каасксссад | дададкдкса | 240 |
| сададсадда | садсааддас | адсасскаса | дссксадсад | сассскдасд | скдадсааад | 300 |
| садаскасда | дааасасааа | дкскасдсск | дсдаадксас | ссаксадддс | скдадсксдс | 360 |
| ссдксасааа | дадс^Ъсаас | аддддададк | дккададсда | дасдсскдсс | адддсассдс | 420 |
| садсдассск | даддсссадс | сксдс | 445 |
<210> 54 <211> 632 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 44 013564 <223> Описание искусственной последовательности:сегмент гена νκ, кодирующий полипептидную последовательность человеческого элемента νκ, фланкируемую последовательностями, полученными из ДНК иммуноглобулина кролика.
<400> 54 ддсаддсЪдс Ьсссасссса Ьдсаддаддс адЬассаддс аддасссадс аРддасаЬда60 дддЕсссЕдс ЕсадсЕссЕд ддас^ссРдс ГдсЪсЕддсР сссаддРаад дадддаааса120 асаааааЕЫ; ЪаЕЕсадсса дРдРадссас СааЕдссРдд сасЕРсадда ааРЬсЬЪсЪР180 адаасаЕРас ФааРсаРдРд даРаРдРдРР ГЪРаРдРЪсс РааРаРсада рассадаРдР240
РасаРссада РдасссадРс ЬссаЬссРсР сРдРсРдсаР сРдРдддада сададрсасс300 арсасррдсс дадссадРса дддсаРРадс ааРРасРРад ссРддРаРса дсадааасса360 дддааддРРс ссаадсРссР дарРРаРдсР дсаРссасЬс РдсааРсРдд ддРсссаРсд420 сддРРсадРд дсадРддаРс РдддасадаР РЬсасРсЫа ссаОсадсад ссРдсадссР480 даадардррд ссассСаРРа сРдРсаааад РасаасадРд ссссРссасР РРРсддсдда540 дддассаадд РддадаРсаа асдРаадРдс асРРРссРаа РдРРссРсас сдРРРсРдсс600 рдарррдррр дсРРРРРсса РРЪРРРсдсб аР632 <210> 55 <211> 70 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 55 саРасасадс саРасаРасд сдрдрддссд сРсРдссРсР сРсРРдсадд РаРддасадс 60 аадсдаассд 70 <210> 56 <211> 71 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности:праймер <400> 56 арсадддрда ссссРасдРР асасРссРдР сассааддад Рдддадддас Рсадаадаас 60
- 45 013564
ДсдДсаадаа д <210> 57 <211> 419 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223>
Описание искусственной последовательности: ген, кодирующий константную область Ολ2 легкой цепи человеческого иммуноглобулина, фланкированную нуклеотидами, полученными из гена легкой цепи цыпленка.
<400 саДасасадс саДасаДасд сдДдДддссд сДсДдссДсД сДсДДдсадд
Дсадсссаад дсДдсссссД ссдДсасДсД дДДсссдссс
ДссДсДдадд адсДДсаадс саасааддсс
120 асасДддДдД дДсДсаДаад
ДдасДДсДас ссдддадссд
ДдасадДддс
ДДддааадса
180 даДадсадсс ссдДсааддс дддадДддад ассассасас аадсаасаас
240 аадДасдсдд ссадсадсДа
ДсДдадссДд асдссДдадс адДддаадДс ссасадаадс
300
ДасадсДдсс аддДсасдса
Ддаадддадс ассдДддада адасадЬддс сссДасадаа
360
ДдДДсаДадД адДсссасДд дддаДдсааД дДдаддасад
ДддДДссДса сссДсссДд
419 <210> 58 <211> 416 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: сегмент гена νθ, кодирующий полипептид человеческого иммуноглобулина V,:, с фланкирующими последовательностями, полученными из ДНК иммуноглобулина цыпленка.
00>
ДДдссдДДДД
дссДсЬсссД
СДссссДсД
саДДддсдаД ааДДДсдДсД сДсадссдсс
сДаадсДДсД
120
сдаДДсбссд даДсДаДдаД аасаасаада
дсаДсасДдд дсДссааасс
300 дДДссаааДс
дддддсддда дссасаДдад сддсассД сДдасДаДД
дссДДДсДдД сдДссДаддД дадДсдсДда
ДдДДД
360 сасдсдДдас ссДсдДсДсд дДсДДДсДДс ссссаД
Claims (11)
1. Молекула гуманизированного иммуноглобулина, способная связываться с антигеном, содержащая по меньшей мере часть константной (С) области тяжелой цепи иммуноглобулина человека и аминокислотные последовательности вариабельной области, кодируемые более чем одним вариабельным (V) сегментом гена иммуноглобулина, продуцируемая с использованием отличного от человека трансгенного животного, содержащая гуманизированный локус 1д, где указанный гуманизированный 1д-локус получен из 1д-локуса отличного от человека трансгенного животного и содержит множество сегментов гена 1д, где по меньшей мере один из указанных сегментов гена является сегментом гена 1д человека, где указанные сегменты сближены друг с другом в нереаранжированной, частично реаранжированной или полностью реаранжированной конфигурации, и где указанный гуманизированный 1д-локус обладает способностью подвергаться конверсии генов и продуцировать репертуар гуманизированных иммуноглобулинов в организме отличного от человека трансгенного животного.
- 46 013564
2. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.1, где указанным трансгенным животным является кролик, курица, овца или корова.
3. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.1, где указанной последовательностью Собласти иммуноглобулина человека является последовательность Су, Ск или СХ.
4. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.1, где указанным антигеном является микроорганизм, выбранный из бактерии, гриба или вируса; антигенной части указанного организма; антигенной молекулы, полученной из указанного микроорганизма, или ассоциированный с опухолью антиген.
5. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.4, где указанная бактерия выбрана из 8. аигеик, Ркеиботопак аегидшока, энтерококка, энтеробактерии или К1еЬк1е11а рпеитошае.
6. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.4, где указанный гриб выбран из Сапб1ба а1Ь1сапк, Сапб1ба рагарк11ок1к, Сапб1ба коркаЬк или СгурЮсоссик пеоГогтапк.
7. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.4, где указанный вирус выбран из респираторно-синцитиального вируса (КБУ), вируса гепатита С (ΉΟΫ), вируса гепатита В (НВУ), цитомегаловируса (СМ¥), ЕВV и Ή8V.
8. Молекула гуманизированного иммуноглобулина по п.4, где указанный антиген выбран из антигена Нег-2-пеи, СИ20, СИ22, СИ53, специфичного в отношении простаты мембранного антигена (РМ8А) и молекулы 17-1А.
9. Препарат моноклонального антитела, содержащий молекулу гуманизированного иммуноглобулина по любому из пп.4-8.
10. Препарат моноклонального антитела по п.9, который, по существу, является неиммуногенным для человека.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и препарат моноклонального антитела по п.9.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22287200P | 2000-08-03 | 2000-08-03 | |
| US27615601P | 2001-03-15 | 2001-03-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200601715A1 EA200601715A1 (ru) | 2007-02-27 |
| EA013564B1 true EA013564B1 (ru) | 2010-06-30 |
Family
ID=26917236
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200601715A EA013564B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция |
| EA200300233A EA007958B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200300233A EA007958B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7129084B2 (ru) |
| EP (2) | EP2044839A3 (ru) |
| CN (1) | CN1468250A (ru) |
| AP (1) | AP2003002756A0 (ru) |
| AU (2) | AU2001284703B2 (ru) |
| CA (2) | CA2422155A1 (ru) |
| EA (2) | EA013564B1 (ru) |
| IL (2) | IL154751A0 (ru) |
| MX (1) | MXPA03001915A (ru) |
| NO (1) | NO20031054L (ru) |
| NZ (1) | NZ524523A (ru) |
| WO (1) | WO2002012437A2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671089C2 (ru) * | 2013-09-16 | 2018-10-29 | Хельмхольтц Центрум Мюнхен - Дойчес Форшунгсцентрум Фюр Гезундхайт Унд Умвельт (Гмбх) | Би- или полиспецифические полипептиды, связывающие поверхностные антигены иммунных эффекторных клеток и антигены hbv для лечения инфекций bv и ассоциированных с ними состояний |
| RU2703903C2 (ru) * | 2014-06-26 | 2019-10-22 | Хайдельберг Иммунотерапьютикс Гмбх | Местное применение антитела к hsv |
| RU2759950C2 (ru) * | 2015-02-17 | 2021-11-19 | Х4 Фармасьютикалз (Австрия) ГмбХ | Антитела, нацеленные на о-антиген на основе галактана из к.pneumoniae |
Families Citing this family (158)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
| GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
| US7323618B2 (en) | 2002-02-01 | 2008-01-29 | Origen Therapeutics, Inc. | Tissue specific expression of exogenous proteins in transgenic chickens |
| US20060191026A1 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Origen Therapeutics, Inc. | Tissue specific expression of antibodies in chickens |
| US7145057B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-12-05 | Origen Therapeutics, Inc. | Chimeric bird from embryonic stem cells |
| US20100311954A1 (en) * | 2002-03-01 | 2010-12-09 | Xencor, Inc. | Optimized Proteins that Target Ep-CAM |
| US20050246782A1 (en) * | 2002-03-22 | 2005-11-03 | Origen Therapeutics | Transgenic aves producing human polyclonal antibodies |
| US7357928B2 (en) | 2002-04-08 | 2008-04-15 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
| US7541150B2 (en) | 2002-04-08 | 2009-06-02 | University Of Louisville Research Foundation, Inc | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
| AU2003243651B2 (en) * | 2002-06-17 | 2008-10-16 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework |
| US20040172667A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-09-02 | Cooper Richard K. | Administration of transposon-based vectors to reproductive organs |
| US7527966B2 (en) * | 2002-06-26 | 2009-05-05 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
| MXPA05004022A (es) | 2002-10-17 | 2005-10-05 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos contra cd20. |
| AU2015205832A1 (en) * | 2002-10-17 | 2015-08-13 | Genmab A/S | Human Monoclonal Antibodies Against CD20 |
| AU2003290689A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof |
| DE10254601A1 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-03 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
| WO2004072115A2 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-26 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies |
| MXPA06000562A (es) | 2003-07-15 | 2006-03-30 | Therapeutic Human Polyclonals | Loci de inmunoglobulina humanizada. |
| WO2005019463A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Improved transgenesis with humanized immunoglobulin loci |
| EP1533617A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-05-25 | RMF Dictagene S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment and diagnosis of cancer |
| US7642341B2 (en) | 2003-12-18 | 2010-01-05 | Merck Serono S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer |
| US8071364B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-12-06 | Transgenrx, Inc. | Gene therapy using transposon-based vectors |
| US20060174364A1 (en) * | 2004-03-01 | 2006-08-03 | Avigenics, Inc. | Artificial chromosomes and transchromosomic avians |
| US20060123504A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-08 | Avigenics, Inc. | Methods of producing polyclonal antibodies |
| JP5128935B2 (ja) | 2004-03-31 | 2013-01-23 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体 |
| WO2005103081A2 (en) | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against cd20 |
| US7420099B2 (en) | 2004-04-22 | 2008-09-02 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Transgenic animals and uses thereof |
| DE102004024617A1 (de) | 2004-05-18 | 2005-12-29 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
| CA2570086A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Merial Limited | Medium and methods for culturing of avian primordial germ cells |
| JP2008512987A (ja) | 2004-07-22 | 2008-05-01 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | 結合分子 |
| CN101084317A (zh) * | 2004-10-22 | 2007-12-05 | 人类多克隆治疗公司 | 对内源免疫球蛋白表达的抑制 |
| JP2008538912A (ja) * | 2005-04-29 | 2008-11-13 | イナート・ファルマ | 遺伝子導入動物および組換え抗体の製造方法 |
| US7557190B2 (en) | 2005-07-08 | 2009-07-07 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target Ep-CAM |
| CN103710371B (zh) * | 2005-08-03 | 2017-03-01 | 人类多克隆治疗股份有限公司 | 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制 |
| EP1762575A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-14 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy |
| EP1790664A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-30 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
| KR101481843B1 (ko) * | 2006-01-25 | 2015-01-12 | 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 | 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성 |
| GB0618345D0 (en) * | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
| KR101443752B1 (ko) | 2006-03-10 | 2014-09-26 | 와이어쓰 엘엘씨 | 항-５ｔ４ 항체 및 이의 용도 |
| WO2007109747A2 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Wyeth | Methods and compositions for antagonism of rage |
| CN101484471B (zh) | 2006-06-30 | 2013-11-06 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 抗-nkg2a抗体及其用途 |
| WO2008003319A1 (en) | 2006-07-04 | 2008-01-10 | Genmab A/S | Cd20 binding molecules for the treatment of copd |
| SG173385A1 (en) | 2006-07-14 | 2011-08-29 | Ac Immune S A Ch | Humanized antibody against amyloid beta |
| JP5087625B2 (ja) | 2006-09-01 | 2012-12-05 | セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド | 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化 |
| US20090053210A1 (en) | 2006-09-01 | 2009-02-26 | Roland Buelow | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
| US8007797B2 (en) * | 2006-09-28 | 2011-08-30 | Merck Serono S.A. | Junctional adhesion molecule-C (JAM-C) binding compounds and methods of their use |
| HU0700534D0 (en) | 2006-11-24 | 2007-10-29 | Mezoegazdasagi Biotechnologiai | Transgenic animal with enhanced immune response and method for the preparation thereof |
| EP1970384A1 (en) | 2007-03-14 | 2008-09-17 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| EP1997832A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-03 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer |
| AU2008255350B2 (en) * | 2007-05-31 | 2014-07-10 | Genmab A/S | Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals |
| AU2008259939B2 (en) | 2007-06-01 | 2014-03-13 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
| EP2183381A1 (en) * | 2007-06-01 | 2010-05-12 | Buelow Research Enterprises Llc | Compositions and methods for producing antibodies having human idiotypes in transgenic birds |
| US8613923B2 (en) * | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| CL2008001742A1 (es) | 2007-06-12 | 2008-11-21 | Ac Immune Sa | Anticuerpo monoclonal que reconoce un epitope conformacional y se une a peptidos amiloides solubles polimericos y peptidos amiloides oligomericos; polinucleotido que lo codifica; composicion que lo comprende; y su uso para tratar enfermedades asociados a proteinas amiloides. |
| US20100138946A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-06-03 | Origen Therapeutics | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus |
| AU2008311367B2 (en) | 2007-10-05 | 2014-11-13 | Ac Immune S.A. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
| BRPI0908508A2 (pt) | 2008-01-24 | 2016-03-22 | Novo Nordisk As | anticorpo monoclonal nkg2a anti-humano humanizado |
| US8012714B2 (en) | 2008-04-14 | 2011-09-06 | Innovative Targeting Solutions, Inc. | Sequence diversity generation in immunoglobulins |
| KR20210097819A (ko) * | 2008-06-25 | 2021-08-09 | 노바르티스 아게 | 보편적 항체 프레임워크를 사용한 래빗 항체의 인간화 |
| EP2166021A1 (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-24 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| US9150880B2 (en) * | 2008-09-25 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of antibodies |
| WO2010036979A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of interferon |
| WO2010036978A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of growth hormone |
| LT2346994T (lt) | 2008-09-30 | 2022-03-10 | Ablexis, Llc | Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai |
| RU2011129459A (ru) * | 2008-12-18 | 2013-01-27 | Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам | Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение |
| US8685898B2 (en) | 2009-01-15 | 2014-04-01 | Imdaptive, Inc. | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| FI2398902T3 (fi) | 2009-02-20 | 2023-11-28 | Astellas Pharma Inc | Menetelmiä ja koostumuksia syövän diagnoosia ja hoitoa varten |
| GB0903325D0 (en) | 2009-02-26 | 2009-04-08 | Univ Aberdeen | Antibody molecules |
| WO2010118360A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Production of proteins using transposon-based vectors |
| EP2464220A4 (en) | 2009-08-13 | 2014-05-07 | Crystal Bioscience Inc | Transgenic animal for the production of antibodies with minimal complementarity-determining regions |
| EP2322555A1 (en) | 2009-11-11 | 2011-05-18 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6) |
| KR102126964B1 (ko) | 2009-11-11 | 2020-06-25 | 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 | 클라우딘 6 특이적 항체 |
| CN102770529B (zh) | 2009-11-17 | 2018-06-05 | Musc研究发展基金会 | 针对人核仁素的人单克隆抗体 |
| KR101553244B1 (ko) | 2009-12-10 | 2015-09-15 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 중쇄 항체를 만드는 마우스 |
| US8865462B2 (en) * | 2010-01-20 | 2014-10-21 | Crystal Bioscience Inc. | Sustained culture of avian gonocytes |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| RU2724663C2 (ru) | 2010-02-08 | 2020-06-25 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Мышь с общей легкой цепью |
| EP2371864A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-10-05 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| US9580491B2 (en) | 2010-03-31 | 2017-02-28 | Ablexis, Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
| EP2404936A1 (en) | 2010-07-06 | 2012-01-11 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo |
| US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| CA2806233C (en) | 2010-07-26 | 2021-12-07 | Trianni, Inc. | Transgenic animals and methods of use |
| US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| CN103179981B (zh) | 2010-07-30 | 2017-02-08 | Ac免疫有限公司 | 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体 |
| NZ606824A (en) | 2010-08-02 | 2015-05-29 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| GB201016864D0 (en) | 2010-10-06 | 2010-11-17 | Univ Aston | Therapeutic methods |
| US9528124B2 (en) | 2013-08-27 | 2016-12-27 | Recombinetics, Inc. | Efficient non-meiotic allele introgression |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| DK3026064T3 (en) | 2011-05-13 | 2019-01-14 | Ganymed Pharmaceuticals Gmbh | ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER EXPRESSING CLAUDIN 6 |
| ES2572915T3 (es) | 2011-06-02 | 2016-06-03 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Nanopartículas conjugadas a un agente antinucleolina |
| CA2835231A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Corimmun Gmbh | Binding compounds to human .beta.1-adrenoreceptor (.beta.1-ar) and their use in the measurement of auto-anti-.beta.1-ar antibodies |
| MY172718A (en) | 2011-08-05 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
| JP2014533930A (ja) * | 2011-09-19 | 2014-12-18 | カイマブ・リミテッド | 免疫グロブリン遺伝子多様性の操作およびマルチ抗体治療薬 |
| SG10202010120XA (en) | 2011-10-17 | 2020-11-27 | Regeneron Pharma | Restricted immunoglobulin heavy chain mice |
| WO2013104798A1 (en) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Cemm - Center For Molecular Medicine Of The Austrian Academy Of Sciences | Modulators of immune responses |
| PL2809150T3 (pl) * | 2012-02-01 | 2020-04-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanizowane myszy wykazujące ekspresję łańcuchów ciężkich zawierających domeny VL |
| CN104379601B (zh) | 2012-02-03 | 2021-04-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途 |
| WO2013134162A2 (en) | 2012-03-05 | 2013-09-12 | Sequenta, Inc. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| SG10201507700VA (en) * | 2012-05-08 | 2015-10-29 | Adaptive Biotechnologies Corp | Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed pcr reactions |
| WO2013167153A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Antibodies useful in cancer diagnosis |
| KR102436654B1 (ko) | 2012-06-12 | 2022-08-26 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물 |
| LT2840892T (lt) | 2013-02-20 | 2018-07-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis |
| US10993420B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-05-04 | Erasmus University Medical Center | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| WO2015014376A1 (en) | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Biontech Ag | Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells |
| WO2015025054A1 (en) | 2013-08-22 | 2015-02-26 | Medizinische Universität Wien | Dye-specific antibodies for prestained molecular weight markers and methods producing the same |
| EP3978526A1 (en) | 2013-09-05 | 2022-04-06 | AB2 Bio SA | Il-18 binding protein (il-18bp) in inflammatory diseases |
| AU2015231025A1 (en) | 2014-03-21 | 2016-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
| KR102601491B1 (ko) | 2014-03-21 | 2023-11-13 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물 |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| ES2777529T3 (es) | 2014-04-17 | 2020-08-05 | Adaptive Biotechnologies Corp | Cuantificación de genomas de células inmunitarias adaptativas en una mezcla compleja de células |
| HUE057708T2 (hu) * | 2014-05-02 | 2022-05-28 | Chiome Bioscience Inc | Sejtek humán antitestek elõállítására |
| EP3191136A1 (en) | 2014-09-08 | 2017-07-19 | Michaela Arndt | Construct for the delivery of a molecule into the cytoplasm of a cell |
| EP3715455A1 (en) | 2014-10-29 | 2020-09-30 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| US20170269092A1 (en) | 2014-12-02 | 2017-09-21 | Cemm - Forschungszentrum Fuer Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
| JP6959869B2 (ja) | 2015-02-23 | 2021-11-05 | シーガル セラピューティクス エスアーエス | 非天然セマフォリン３およびそれらの医学的使用 |
| EP3591074B1 (en) | 2015-02-24 | 2024-10-23 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods for diagnosing infectious disease and determining hla status using immune repertoire sequencing |
| US10882905B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-01-05 | Ab2 Bio Sa | IL-18 binding protein (IL-18BP) and antibodies in inflammatory diseases |
| CN107438622A (zh) | 2015-03-19 | 2017-12-05 | 瑞泽恩制药公司 | 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 |
| EP3277294B1 (en) | 2015-04-01 | 2024-05-15 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| US10857237B2 (en) | 2015-05-05 | 2020-12-08 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Anti-nucleolin agent-conjugated nanoparticles as radio-sensitizers and MRI and/or X-ray contrast agents |
| SG10202006332PA (en) * | 2015-10-29 | 2020-08-28 | Hoffmann La Roche | Transgenic rabbit with common light chain |
| US10813346B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-10-27 | Trianni, Inc. | Enhanced immunoglobulin diversity |
| DK3411476T3 (da) | 2016-02-04 | 2024-07-15 | Trianni Inc | Forøget produktion af immunoglobuliner |
| EP3216458A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-13 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modified vascular endothelial growth factor a (vegf-a) and its medical use |
| AU2017300040A1 (en) | 2016-07-22 | 2019-01-24 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | TREM2 cleavage modulators and uses thereof |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| CA3036983A1 (en) | 2016-11-21 | 2018-05-24 | Cureab Gmbh | Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates |
| WO2018136823A1 (en) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| JP7430636B2 (ja) * | 2017-12-05 | 2024-02-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 操作された免疫グロブリンラムダ軽鎖を有する非ヒト動物及びその使用 |
| EP3731865A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody |
| SG11202006348VA (en) | 2018-01-05 | 2020-07-29 | Ac Immune Sa | Misfolded tdp-43 binding molecules |
| CA3091646A1 (en) | 2018-02-14 | 2019-08-22 | Abba Therapeutics Ag | Anti-human pd-l2 antibodies |
| EP3768079A4 (en) * | 2018-03-21 | 2021-12-08 | Crystal Bioscience Inc. | TRANSGENIC CHICKEN WHICH PRODUCES HUMAN ANTIBODIES |
| CA3125380A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus |
| WO2020234473A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof |
| CN114531878A (zh) | 2019-06-27 | 2022-05-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子 |
| AR119382A1 (es) | 2019-07-12 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso |
| AR119393A1 (es) | 2019-07-15 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a nkg2d |
| US20230295281A1 (en) | 2020-04-10 | 2023-09-21 | Vanudis GmbH | Natural antibodies in prophylaxis and therapy |
| EP4158034A4 (en) | 2020-06-02 | 2024-07-03 | Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS HAVING A LIGHT-CHAIN IMMUNOGLOBULIN LOCUS |
| JP2023537761A (ja) | 2020-08-14 | 2023-09-05 | エイシー イミューン ソシエテ アノニム | ヒト化抗ｔｄｐ－４３結合分子およびその使用 |
| WO2022043517A2 (en) | 2020-08-27 | 2022-03-03 | Cureab Gmbh | Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation |
| CA3192306A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Burkhard Ludewig | Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof |
| CA3203328A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Dimitrios TSIANTOULAS | Anti-april antibodies and uses thereof |
| MX2024005876A (es) | 2021-11-16 | 2024-05-29 | Ac Immune Sa | Moleculas novedosas para terapias y diagnostico. |
| CR20240246A (es) | 2021-12-20 | 2024-07-19 | F Hoffmann La Roche Ag | Anticuerpos agonistas anti-ltbr y anticuerpos biespecificos que los comprenden |
| TW202342519A (zh) | 2022-02-16 | 2023-11-01 | 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 | 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途 |
| WO2023166081A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Heidelberg Immunotherapeutics Gmbh | Vaccine comprising an antibody or an fc-containing fusion protein comprising an fc part of an antibody |
| WO2023194565A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules |
| AU2023258146A1 (en) | 2022-04-20 | 2024-09-05 | Kantonsspital St. Gallen | Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof |
| WO2024184494A1 (en) | 2023-03-08 | 2024-09-12 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
Family Cites Families (87)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567607A (en) | 1981-10-28 | 1996-10-22 | Incell | Method of producing transgenic animals |
| US4994384A (en) * | 1986-12-31 | 1991-02-19 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Multiplying bovine embryos |
| US4977081A (en) | 1987-05-04 | 1990-12-11 | Adi Diagnostics, Inc. | Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof |
| GB8714426D0 (en) * | 1987-06-19 | 1987-07-22 | Agricultural & Food Res | Culture technique |
| US5204244A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| US5166065A (en) * | 1988-08-04 | 1992-11-24 | Amrad Corporation Limited | In vitro propagation of embryonic stem cells |
| US5162215A (en) * | 1988-09-22 | 1992-11-10 | Amgen Inc. | Method of gene transfer into chickens and other avian species |
| GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US5574205A (en) * | 1989-07-25 | 1996-11-12 | Cell Genesys | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
| EP0437576B1 (en) | 1989-07-25 | 2002-07-03 | Cell Genesys, Inc. | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
| EP0747485B1 (en) * | 1989-11-06 | 1998-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Production of proteins using homologous recombination |
| US5633076A (en) * | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
| JP3068180B2 (ja) * | 1990-01-12 | 2000-07-24 | アブジェニックス インコーポレイテッド | 異種抗体の生成 |
| DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1991-07-18 | Brem Gottfried Prof Dr Dr | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
| GB2245589A (en) | 1990-05-25 | 1992-01-08 | Medical Res Council | Culture medium for mammalian embryos |
| US5614396A (en) * | 1990-06-14 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination |
| EP0651787A1 (en) * | 1990-07-09 | 1995-05-10 | Amrad Corporation Limited | Enhanced implantation, development and maintenance of embryos using leukaemia inhibitory factor |
| AU8212291A (en) | 1990-07-10 | 1992-02-04 | Nkk Corporation | Hybridoma which produces avian specific immunoglobulin g |
| CA2043088A1 (en) | 1990-07-26 | 1992-01-27 | Michelle M. Sims | Method of cloning mammalian embryos |
| US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5877397A (en) * | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| US5661016A (en) * | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| ATE158021T1 (de) * | 1990-08-29 | 1997-09-15 | Genpharm Int | Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper |
| US5633425A (en) * | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5789650A (en) * | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| ATE352612T1 (de) * | 1990-08-29 | 2007-02-15 | Pharming Intellectual Pty Bv | Homologe rekombination in säugetier-zellen |
| US5545806A (en) * | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5625126A (en) * | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5258307A (en) * | 1990-09-17 | 1993-11-02 | Merck & Co., Inc. | Single stage avian embryo culture process |
| AU2515992A (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| JP2961986B2 (ja) | 1991-08-22 | 1999-10-12 | 東亞合成株式会社 | ポリクローナル抗体の分離精製方法 |
| WO1993016177A1 (en) * | 1992-02-11 | 1993-08-19 | Cell Genesys, Inc. | Homogenotization of gene-targeting events |
| US5340740A (en) * | 1992-05-15 | 1994-08-23 | North Carolina State University | Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process |
| EP0583980A1 (en) | 1992-08-20 | 1994-02-23 | Eli Lilly And Company | Method for generating monoclonal antibodies from rabbits |
| WO1994007997A1 (en) | 1992-10-06 | 1994-04-14 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Long-term proliferation of primordial germ cells |
| US5453357A (en) | 1992-10-08 | 1995-09-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
| WO1994014294A1 (en) | 1992-12-08 | 1994-06-23 | Linaeum Corporation | Audio transducer with flexible foam enclosure |
| US5480772A (en) * | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| US5496720A (en) * | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| AU5290793A (en) | 1993-09-22 | 1995-04-10 | Ohio University | Mammalian cloning by embryonic stem cell (esc) nuclear transplantation and esc |
| GB2282139A (en) | 1993-09-24 | 1995-03-29 | Univ Reading | Introducing DNA into the germ line of birds |
| WO1995010599A1 (en) | 1993-10-15 | 1995-04-20 | The University Of Melbourne | Embryonic stem cell-like cells |
| GB9324007D0 (en) | 1993-11-22 | 1994-01-12 | Pharmaceutical Proteins Ltd | Pre-implantation screening |
| DE69432901T2 (de) | 1993-12-23 | 2004-05-27 | Merck & Co., Inc. | Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen |
| GB9401380D0 (en) | 1994-01-25 | 1994-03-23 | Pharmaceutical Proteins Ltd | Embryonic cell isolation |
| JP4267689B2 (ja) | 1994-08-24 | 2009-05-27 | 明治乳業株式会社 | 鳥類由来の細胞の培養方法および該培養方法によって得られた細胞系 |
| GB9417831D0 (en) | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
| FR2726003B1 (fr) | 1994-10-21 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires |
| FR2728584A1 (fr) * | 1994-12-22 | 1996-06-28 | Centre Nat Rech Scient | Procede de transfert de gene dans des cellules activees a partir d'un etat de repos |
| US6130364A (en) | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
| WO1996033266A1 (en) * | 1995-04-21 | 1996-10-24 | Cell Genesys, Inc. | Generation of large genomic dna deletions |
| US5952222A (en) * | 1995-08-04 | 1999-09-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Functional enucleation of bovine oocytes |
| GB9517780D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB2331751B (en) | 1995-08-31 | 2000-01-19 | Roslin Inst | Quiescent cell populations for nuclear transfer |
| GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| AU7326796A (en) | 1995-10-30 | 1997-05-22 | Spectral Diagnostics Inc. | Stable chicken b-cell line and method of use thereof |
| US5721118A (en) * | 1995-10-31 | 1998-02-24 | The Regents Of The University Of California, San Diego | Mammalian artificial chromosomes and methods of using same |
| US5771429A (en) * | 1995-10-31 | 1998-06-23 | Ricoh Company, Ltd. | Developing device capable of automatic toner content control |
| JP3799426B2 (ja) | 1995-11-20 | 2006-07-19 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | トランスジェニック動物の作成方法 |
| US6737248B2 (en) * | 1996-01-05 | 2004-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences |
| US5994619A (en) * | 1996-04-01 | 1999-11-30 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells |
| US5905042A (en) | 1996-04-01 | 1999-05-18 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Cultured inner cell mass cell lines derived from bovine or porcine embryos |
| NZ334016A (en) | 1996-08-19 | 2000-08-25 | Univ Massachusetts | Embryonic stem cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| KR20080059467A (ko) * | 1996-12-03 | 2008-06-27 | 아브게닉스, 인크. | 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체 |
| WO1998029532A1 (en) | 1997-01-02 | 1998-07-09 | Monash University | A method of oocyte enucleation and production of reconstituted embryos |
| US6235969B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US5731367A (en) * | 1997-02-04 | 1998-03-24 | Bayer Corporation | Injection molded parts having improved surface gloss |
| GB9703550D0 (en) | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
| US6011197A (en) * | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| US5830698A (en) * | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
| US6080912A (en) | 1997-03-20 | 2000-06-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for creating transgenic animals |
| WO1998057538A1 (en) | 1997-06-18 | 1998-12-23 | The Curators Of The University Of Missouri | Complete activation of mammalian oocytes |
| CN101003800A (zh) | 1997-07-03 | 2007-07-25 | 马萨诸塞大学 | 使用来自无血清饥饿的分化细胞的供体细胞核进行克隆 |
| JP2003517261A (ja) | 1997-08-04 | 2003-05-27 | ユニバシティ オブ マサチューセッツ、ア パブリック インスチチユーション オブ ハイアー エデュケイション オブ ザ コモンウエルス オブ マサチューセッツ、アズ リプリゼンテッド バイ イッツ アマースト キャンパス | Ｐｇｃの長期間培養によるトリの胚生殖（ｅｇ）細胞系の産生、クローン形成およびキメラ形成へのその利用 |
| WO1999010505A2 (en) | 1997-08-22 | 1999-03-04 | University Of Guelph | Production of proteins in eggs |
| WO1999021415A1 (en) | 1997-10-28 | 1999-05-06 | Stem Cell Sciences Pty. Ltd. | Nuclear transfer for production of transgenic animal embryo |
| US6331659B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
| WO1999040213A1 (en) | 1998-02-09 | 1999-08-12 | Tranxenogen, Incorporated | Genetic manipulation of spermatogonia |
| DK1151010T3 (da) * | 1999-02-05 | 2006-01-09 | Therapeutic Human Polyclonals | Humane polyklonale antistoffer fra antigene ikke-humane dyr |
| WO2000075300A2 (en) | 1999-06-04 | 2000-12-14 | Tranxenogen, Inc. | Methods for manipulating the avian genome |
| AU7491800A (en) * | 1999-09-15 | 2001-04-17 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Immunotherapy with substantially human polyclonal antibody preparations purifiedfrom genetically engineered birds |
| US20020028488A1 (en) * | 2000-06-19 | 2002-03-07 | Sujay Singh | Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies |
-
2001
- 2001-08-03 AU AU2001284703A patent/AU2001284703B2/en not_active Ceased
- 2001-08-03 US US09/921,819 patent/US7129084B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-03 EP EP08016460A patent/EP2044839A3/en not_active Withdrawn
- 2001-08-03 CA CA002422155A patent/CA2422155A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-03 AU AU8470301A patent/AU8470301A/xx active Pending
- 2001-08-03 CN CNA018167233A patent/CN1468250A/zh active Pending
- 2001-08-03 EP EP01963780A patent/EP1311530A4/en not_active Withdrawn
- 2001-08-03 MX MXPA03001915A patent/MXPA03001915A/es active IP Right Grant
- 2001-08-03 EA EA200601715A patent/EA013564B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-03 IL IL15475101A patent/IL154751A0/xx unknown
- 2001-08-03 WO PCT/US2001/024348 patent/WO2002012437A2/en active IP Right Grant
- 2001-08-03 EA EA200300233A patent/EA007958B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-03 NZ NZ524523A patent/NZ524523A/en unknown
- 2001-08-03 CA CA002634294A patent/CA2634294A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-03-04 AP APAP/P/2003/002756A patent/AP2003002756A0/en unknown
- 2003-03-05 IL IL154751A patent/IL154751A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-03-07 NO NO20031054A patent/NO20031054L/no unknown
-
2006
- 2006-10-20 US US11/584,187 patent/US20070092505A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DUVOISIN et al. Characterization of four constant region genes of rabbit immunoglobulin-lambda chains. J. Immunol. June 1986. Vol. 136. No. 11. pages 4297-4302, see whole document. * |
| HAYZER et al. cDNA clones encoding immunoglobulin gamma chains from rabbit expressing the pheuotype c7. Eur. J. Immunol. 1990. Vol. 20. pages 2707-2712, see whole document * |
| HEIDMANN et al. Molecular cloning of rabbit gamma heavy chain mRNA. Nnc. Acids. Res. 1982. Vol. 10. No. 5. pages 1535-1545 * |
| MAGE et al. Evolutionary couservation of splice sites iu sterile C mu trasucripts and of immunoglobulin heavy chain (igh) enhaneer regions sequences. Mol. Immunol. 1989. Vol. 26. No. 10. pages 1007-1010, see whole document * |
| SEHGAL et al. Generation of the primary antibody repertoire in rabbits:expression of a diverse set of Igk-V genes may compensate for limited combinatorial diversity of the heavy chain locus. Immunogen. 1999. Vol. 50. pages 31-42, see whole document. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671089C2 (ru) * | 2013-09-16 | 2018-10-29 | Хельмхольтц Центрум Мюнхен - Дойчес Форшунгсцентрум Фюр Гезундхайт Унд Умвельт (Гмбх) | Би- или полиспецифические полипептиды, связывающие поверхностные антигены иммунных эффекторных клеток и антигены hbv для лечения инфекций bv и ассоциированных с ними состояний |
| RU2703903C2 (ru) * | 2014-06-26 | 2019-10-22 | Хайдельберг Иммунотерапьютикс Гмбх | Местное применение антитела к hsv |
| RU2759950C2 (ru) * | 2015-02-17 | 2021-11-19 | Х4 Фармасьютикалз (Австрия) ГмбХ | Антитела, нацеленные на о-антиген на основе галактана из к.pneumoniae |
| US11466074B2 (en) | 2015-02-17 | 2022-10-11 | X4 Pharmaceuticals (Austria) GmbH | Antibodies targeting a galactan-based O-antigen of K. pneumoniae |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL154751A (en) | 2009-11-18 |
| EP2044839A2 (en) | 2009-04-08 |
| EA007958B1 (ru) | 2007-02-27 |
| EP2044839A3 (en) | 2009-07-01 |
| NO20031054L (no) | 2003-04-02 |
| EP1311530A2 (en) | 2003-05-21 |
| EA200601715A1 (ru) | 2007-02-27 |
| MXPA03001915A (es) | 2004-09-10 |
| CN1468250A (zh) | 2004-01-14 |
| AP2003002756A0 (en) | 2003-02-03 |
| EA200300233A1 (ru) | 2004-02-26 |
| US20070092505A1 (en) | 2007-04-26 |
| CA2634294A1 (en) | 2002-02-14 |
| NO20031054D0 (no) | 2003-03-07 |
| NZ524523A (en) | 2006-02-24 |
| IL154751A0 (en) | 2003-10-31 |
| US7129084B2 (en) | 2006-10-31 |
| EP1311530A4 (en) | 2004-10-06 |
| WO2002012437A2 (en) | 2002-02-14 |
| AU2001284703B2 (en) | 2007-03-22 |
| WO2002012437A3 (en) | 2002-05-30 |
| AU8470301A (en) | 2002-02-18 |
| CA2422155A1 (en) | 2002-02-14 |
| US20030017534A1 (en) | 2003-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA013564B1 (ru) | Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция | |
| JP6705650B2 (ja) | ヒトイディオタイプを有するげっ歯類抗体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含む動物 | |
| US20190017021A1 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| ES2372718T3 (es) | Composiciones y métodos para inhibir genes endógenos de inmunoglobulinas y producir anticuerpos de idiotipos humanos transgénicos. | |
| AU2001284703A1 (en) | Production of humanized antibodies in transgenic animals | |
| JP6073550B2 (ja) | 遺伝子操作した動物から得られるヒトポリクローナル抗体 | |
| JPH07509137A (ja) | 異種抗体の生産 | |
| EP1690934A2 (en) | Generation of xenogeneic antibodies | |
| CN102443058A (zh) | 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制 | |
| CN110662421B (zh) | 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体 | |
| US20170218336A1 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| WO2001019394A2 (en) | Immunotherapy with substantially human polyclonal antibody preparations purified from genetically engineered birds | |
| US20040158880A1 (en) | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies | |
| ZA200301723B (en) | Production of humanized antibodies in transgenic animals. | |
| CN102850452B (zh) | 用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法 | |
| EP1604997A1 (en) | Human polyclonal antibodies from transgenic nonhuman animals | |
| NZ749259B2 (en) | Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |