JP2003517261A

JP2003517261A - Ｐｇｃの長期間培養によるトリの胚生殖（ｅｇ）細胞系の産生、クローン形成およびキメラ形成へのその利用

Info

Publication number: JP2003517261A
Application number: JP2000505276A
Authority: JP
Inventors: ドレオン、エフ、アベルポンス; ロブル、ジェームズ、エム; スタイス、スチーブン、エル; ジェリー、ディ、ジョセフ
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2003-05-27
Also published as: CA2300336A1; DE69832716D1; EP1019491B1; CN1273599A; ES2255174T3; AU8759498A; NZ502713A; ATE312167T1; DE69832716T2; BR9811832A; WO1999006534A1; IL134366A; EP1019491A4; EP1019491A1; EP1650294A1; AU738357B2

Abstract

(57)【要約】ＰＧＣを組織培養において長期間培養することによってＰＧＣまたはＥＧ細胞を産生する培養系を提供する。本培養系はＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、およびＳＣＦを使用する。得られたＥＧ細胞はトランスジェニックおよびキメラのトリ、特にニワトリおよび七面鳥を産生するために、ならびにクローン形成目的のために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）、特にニワトリＰＧＣを組織培養にお
いて長期間維持し、その結果胚生殖（ＥＧ）細胞を産生する新規方法を提供する
。これらのＥＧ細胞は望ましいＤＮＡ配列、例えばヒト遺伝子を挿入するために
用いることができる。これらのＥＧ細胞およびそれに由来するトランスジェニッ
クＥＧ細胞は、キメラのトリ、特にキメラのニワトリを作製するためおよびクロ
ーン形成のために用いてもよい。

【０００２】（発明の背景）近年、キメラ、クローンおよびトランスジェニック動物の作製に対して多くの
研究が行われている。

【０００３】特に、過去２０年間に、家畜動物種のゲノムの改変は積極的に追求されてきた
領域であるが、成功の程度は様々である。例えば、そのような研究は、トランス
ジェニックブタ、ウシ、およびニワトリの作製に集中している。今日まで、利用
可能なトランスジェニック動物の大多数は、単細胞胚に、関係する遺伝子を有す
るＤＮＡ構築物を直接微量注射することによって作製されている。しかし、微量
注射技法は成功するものの、そうした方法は費用が高く、しばしば効率が低いと
いう欠点を有する。

【０００４】最近、「ノックアウト」マウスの作製に関する胚幹（ＥＳ）細胞技術の成功に
よって、家畜動物種におけるＥＳ細胞および始原胚細胞（ＰＣＧ）の組織培養系
の開発に向けての研究が行われるようになった。ＥＳ未分化細胞を連続培養にお
いて維持することができれば、そのような細胞のインビトロ・トランスフェクシ
ョンが可能となり、理想的には、キメラ動物を作製するために発達中の胚の内部
細胞塊にそれらを移入する前に、望ましい遺伝子を含むトランスフェクトした細
胞を選択することが可能となる。理想的には、得られたキメラ動物の少なくとも
何例かは、生殖系列によってＤＮＡ構築物を分離することができ、したがってト
ランスジェニック後代を作製することができるであろう。しかし、今日まで、標
的化した（部位特異的）組み込みはマウスで成功しているに過ぎない。現在のと
ころ、他の動物種において標的化ＤＮＡ組み込みを行う能力は限られている。し
かし、これに向けての研究は現在進行中で、いずれ実現するはずである。

【０００５】特に、相当な経済的重要性のために、キジ類（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）および
ニワトリのゲノムの改善に向けてかなりの研究が行われている。トランスジェニ
ック・ニワトリの作製に関する研究の現状については、かなり完全なレビューが
３年前に発表された（サン（Ｓａｎｇ）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈ
．１２：４１５〜４２０（１９９４））。その中で考察されているように、基
本的に２つのトランスジェニック・ニワトリ作製経路が現在研究中である。これ
らの方法は、ゲノムの操作が行われる時期、すなわち、産卵前または産卵後に基
づいて区別することができる。後者の方法には、ドナーＥＳおよびＰＧＣのレシ
ピエント胚への移入が含まれる。そればかりか、いずれの経路においても、ほと
んどの研究が、関係する遺伝子を含むレトロウイルスベクターにドナー細胞を感
染させることによって行われている。

【０００６】産卵前にゲノムの操作を含む第一のアプローチは、多様なおよび／または無効
な結果を生じた。例えば、卵巣における卵母細胞の感染（シューマン＆ショフナ
ー（ＳｈｕｍａｎａｎｄＳｈｏｆｆｎｅｒ）、ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ．，
６５：１４３７〜１４９４（１９８６））および精子とプラスミドＤＮＡとの
プレインキュベーション（グルーエンバウム（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍ）ら、Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐ．，１５：１９４（１９９１））は
無効であり、繰り返されていない。同様に、リポフェクションによって精子細胞
にプラスミド構築物をトランスフェクションすることも示された（スクアイアー
ズ＆ドレーク（ＳｑｕｉｒｅｓａｎｄＤｒａｋｅ）、Ａｎｉｍ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ．，４：７１〜７８、１９９３）。しかし、生殖系列伝播は報告されて
いない。

【０００７】同様に、胚盤へのＤＮＡの直接微量注射を行った後に胚を培養すれば、生存ト
ランスジェニック・キメラのトリが０．１％得られ（サン（ＳａｎｇＷ．）、
ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈ．，１２：４１５〜４２（１９９４））
、トリ１例はトランスジーンをその子孫の３．４％に伝播した（ラブ（Ｌｏｖｅ
）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６０〜６３（１９９４））。こ
の同じアプローチは、ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）ら（Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅ
ｒｔｉｌ．，１０２：３２１〜３２５（１９９４））によって行われた。しか
し、この場合もトランスジーンの生殖系列伝播はその中で報告されなかった。

【０００８】産卵後にゲノムの操作を含む第二のアプローチは、よりよい成績を得た。産卵
した卵に複製コンピテント・レトロウイルス・ベクターを注射することによって
作製したキメラのトリは、生殖系列伝播をその子孫の１％および１１％に示した
（ソルター（Ｓａｌｔｅｒ）ら、「トリゲノムの操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏ
ｎｏｆｔｈｅＡｖｉａｎＧｅｎｏｍｅ）」、エッチズ（Ｅｔｃｈｅｓ，
ＲＪ）ら編：１３８〜１５０頁、ＣＲＣ出版（１９９３））。複製欠損レトロ
ウイルスベクターおよび産卵した卵へのインジェクションを用いたより有力な結
果では、２〜８％の発生率でその子孫にベクターを伝播するキメラの雄性トリ８
％が得られた（ボッセルマン（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４３：５３５〜５３５（１９８９））。

【０００９】しかし、トランスフェクションを促進することが知られている試薬の存在下で
産卵した卵にプラスミド構築物を注射しても、安定に組み込まれた構築物または
トランスジェニック・トリを得ることはできなかった（ローゼンブルム＆チェン
（ＲｏｓｅｎｂｌｕｍａｎｄＣｈｅｎｇ）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｓｕｐｐ．，１５Ｅ２０８（１９９１））。一般に、トランスジェ
ニックニワトリの作製のためにレトロウイルスベクターを用いることは、それに
関連する重要なな欠点のために広く行われていない。そのような欠点には、その
中に安定して導入することができるクローニングインサートの大きさに制限があ
ること、および内因性のウイルス座、または他のニワトリ白血病ウイルスとの組
換えイベントをおそらく誘発する可能性がある、というより重大な欠点が含まれ
る。

【００１０】これらの方法の全てに関する重要な問題は、ニワトリのＥＳおよびＰＧＣに関
する長期培養系を確立することが比較的難しいという事実である。試験者が知る
限り、キメラのトリの産生に成功したニワトリＰＧＣの培養は、最長でも５日未
満であると思われる。

【００１１】これまでのＰＧＣ培養法には増殖因子の使用が含まれ、特にＬＩＦまたはＩＧ
Ｆが含まれる。しかし、示されているように、そのような方法は長期の培養期間
を提供することができず、それがトランスジェニックＰＧＣの産生を促進するた
め特に懸念される。

【００１２】しかし、長期培養を行う問題にもかかわらず、ＥＳおよびＰＧＣ細胞のいずれ
も、そのような細胞を複製コンピテントおよびインコンピテントレトロウイルス
ベクターに感染させることによってキメラの作製に成功している。さらに、上記
のように、新しく得た胚盤葉細胞をレシピエント胚に注射したところ、キメラ性
腺を有するトリが得られた（カーサイエンス（Ｃａｒｓｃｉｅｎｃｅ）ら、Ｄｅ
ｖｅｌ．１１７：６６９〜６７５（１９９３））。胚盤葉細胞は、リポフェク
ションによって効率よくトランスフェクトすることができ、その後レシピエント
胚に移入することができる。しかし、トランスフェクトした細胞の生殖系列伝播
は報告されていない。

【００１３】同様に、ペイン（Ｐａｉｎ）ら、Ｄｅｖｅｌ．，１２２：２３２９〜２３９
８（１９９６）は最近、胚盤葉細胞から得たニワトリＥＳであると思われる細胞
の存在を示した。彼らはさらに、これらの細胞がＥＳ表現型を失うことなく（マ
ウスＥＳ細胞に対するモノクローナル抗体によって定義する）明らかに３５代ま
で培養によって維持されることを報告した。（Ｉｄ．）。これらの細胞は、トリ
胚に移入すると明らかにＰＧＣに発達して、そこでそれらは性腺に定着した。し
かし、彼らはこれらの細胞が実際にＥＳ細胞であることを明確に確立できなかっ
た。

【００１４】マウスＥＳモノクローナル抗体のニワトリＥＳ細胞との酵素反応性は、ＥＳ細
胞受容体が種を超えて保存されていることを支持する証拠となるかも知れない。
同様に、これらの研究者が７日齢の胚盤葉細胞培養の注入によって２例のキメラ
ニワトリを作製することもできたという事実から、その系にＥＳ細胞が存在する
ことが議論の余地はあるが示唆される。しかし、これらの研究者はＰＧＣがその
複雑な培養系に存在する可能性を除外しなかった。このように、この長期間のＥ
Ｓ培養系は多能性および生殖系列伝播に関してさらに試験すべきである。（Ｉｄ
．）

【００１５】ＥＳ細胞を産生するためのもう一つの経路にはＰＧＣが含まれる。ＰＧＣをド
ナーから単離してレシピエント胚に移入する技法が開発され、ドナー遺伝子型の
生殖系列伝播を伴うキメラ・ニワトリの作製に成功した（ビック（Ｖｉｃｋ）ら
、ＬｏｎｄｏｎＳｅｒ．Ｂ．，２５１：１７９〜１８２（１９９３）、タ
ジマ（Ｔａｊｉｍａ）ら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、４０：５０９〜５１
９（１９９３））。さらに、ＰＧＣは凍結保存して後に融解してもキメラのトリ
を生じる（ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）ら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．
，１０２：３２１〜３２５（１９９４））。しかし、この系は非常に骨の折れ
る作業で、しかも胚１個あたり平均でＰＧＣ５０〜８０個を産生するに過ぎない
。ＰＧＣをレトロウイルスベクターに感染させることも報告されている。しかし
、今日まで、トランスフェクトしたＰＧＣの選択を容易にするためにＰＧＣを長
期間培養してもそれらは増殖しなかった。

【００１６】このように、前述に基づいて、ＰＧＣを培養する改善された方法は、当技術分
野において重要な必要性を含むことは明白である。同様に、もう一つの重要な必
要性は、クローン・トリの産生への応用、ならびにキメラトリおよびそのトラン
スジェニック型を作製するために、トリ胚幹細胞（ＥＳ）または胚生殖細胞（Ｅ
Ｇ）を産生する新規方法を含む。

【００１７】（発明の目的）先行技術の問題を解決することが本発明の目的である。

【００１８】本発明のより特殊な目的は、トリ始原胚細胞（ＰＧＣ）を組織培養において長
期間培養し、その結果胚生殖（ＥＧ）細胞系を産生する新規方法を提供すること
である。

【００１９】本発明のさらにより特殊な目的は、キジ類（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）、特にニ
ワトリまたは七面鳥の始原胚細胞（ＰＧＣ）を組織培養において長期間培養して
胚生殖（ＥＧ）細胞系を産生する新規方法を提供することである。

【００２０】本発明のもう一つの目的は、キメラのトリ、好ましくは家禽、および最も好ま
しくはニワトリを作製するために、組織培養における長期間ＰＧＣの培養によっ
て得られるトリ胚生殖細胞を用いることである。

【００２１】本発明のもう一つの目的は、トリ始原胚細胞を組織培養において長期間培養す
ることによって得られたトリ胚生殖細胞に望ましい核酸配列を導入することであ
る。

【００２２】本発明のさらにもう一つの目的は、トランスジェニックなキメラのトリ、好ま
しくはトランスジェニック・キメラ・ニワトリを産生するために、始原胚細胞を
長期間培養することによって得られ、その中に望ましい核酸配列が導入されてい
るトリ生殖細胞を用いることである。

【００２３】本発明のさらにもう一つの目的は、得られたトランスジェニック・キメラ・ト
リ、好ましくはキジ類（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）および最も好ましくはニワトリ
または七面鳥を、好ましくはそのようなトランスジェニック・キメラ・トリ、特
にトランスジェニック・キメラ・ニワトリおよびその子孫の卵からそのようなタ
ンパク質を回収することによって、その中に導入された細胞に含まれる核酸によ
ってコードされる異種タンパク質を産生するために用いることである。または、
そのようなタンパク質はトランスジェニック・キメラ・トリから直接、例えば循
環系（血液もしくはリンパ）、または他の組織もしくは他の体液から回収するこ
とができる。

【００２４】本発明のもう一つの目的は、トリ胚生殖細胞、好ましくはトリ始原生殖細胞の
長期間培養によって得られたニワトリ胚生殖細胞を、トリのクローン、例えばク
ローン・ニワトリ（トランスジェニックであってもよい）に用いることである。

【００２５】（発明の簡単な説明）考察したように、本発明はトリ（ニワトリ）始原生殖細胞（ＰＧＣ）を組織培
養に置いて長期間、すなわち少なくとも１４日間、より好ましくは少なくとも２
５日間、および理想的には無限に維持する新規方法を提供する。われわれは現在
、４ヶ月間連続培養しており、およそ３２回の継代を行った。

【００２６】本発明より以前に、トリＰＧＣを組織培養において約５日間以上維持する（キ
メラ・トリの産生能によって示されるように）如何なる方法も報告されなかった
。本発明者らは、賢明な実験によって、少なくとも以下の増殖因子：白血病阻害
因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ
）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を含む培養培地を用いると、トリ始
原生殖細胞、特にニワトリ始原生殖細胞を長期間にわたって、すなわち少なくと
も１４日間、および実質的により長い期間、組織培養において維持し、増殖させ
ることができることを意外にも発見した。その上、これらのＰＧＣはキメラ・ニ
ワトリの作製に有用であることが示された。

【００２７】これらのＰＧＣは、トランスジェニック・キメラ・トリを作製するために用い
ることができるトランスジェニック・トリＰＧＣの作製に有用である。これらの
トランスジェニック・キメラ・トリは異種タンパク質を回収するために有用とな
ることが予想され、これは好ましくはそのようなキメラ・トランスジェニック・
トリの卵、または組織および他の体液から回収することができる。例えば、その
ようなトリは、治療的タンパク質および他のポリペプチドを産生および回収する
ために用いることができる。

【００２８】しかし、本発明の根拠となっているのは、これらのＰＧＣが長期間培養後、す
なわち約２５日後、脱分化して明らかに胚生殖（ＥＳ）細胞を産生するというさ
らなる知見である。

【００２９】詳しく述べると、２５日後、培養したＰＧＣ（細胞塊）は、平らな接着基底面
を有する迅速に広がる細胞単層を形成する。その表面には、より疎な「ＰＧＣ様
」細胞が存在する。その上、これらの細胞のいくつかはＰＡＳ染色陽性である。
同様に、これらの単層から得られたＤｉＩ染色細胞をレシピエント・トリ胚に移
入すると性腺に移動する。その上、これらの細胞単層は理論的に無限に継代する
ことができる。

【００３０】約３〜５回の継代後、いくつかの細胞はその増殖役割が遅くなり、外観が線維
芽細胞様を呈することも認められた。しかし、細胞系の中には多数回継代され、
連続組織培養の４ヶ月後であっても如何なる分化の徴候も示さずに生長するもの
もあった。同様に、そのような細胞コロニーにおける細胞数が増加するにつれて
、細胞単層はより「緻密に」になって、多層細胞コロニーの形状を呈することも
認められた。

【００３１】下記で述べるように、それらから２つの細胞系が得られ、その１つはアルカリ
・フォスファターゼ陽性であり、明らかに分化していない。同様に、それは多能
性および全能性細胞タイプの特徴である他のマーカーを発現している。このよう
に、この細胞系は胚生殖細胞株であると思われる。このように、本発明はＰＧＣ
が培養において脱分化してＥＧ細胞を産生することができるという発見に基づい
ている。

【００３２】下記で述べるように、そのような細胞はトリのクローン化、およびキメラ・ト
リを産生するために用いることができるため、これは非常に重要な発見である。
同様に、これらの胚生殖細胞はトリ胚細胞系のインビトロでの分化を研究するた
めに用いることができる。さらに、これらの細胞はトランスジェニック（望まし
い核酸配列を導入することによって）にすることができ、好ましくはキジ類（Ｇ
ａｌｌｉｎａｃｅａ）、および最も好ましくはニワトリまたは七面鳥のトランス
ジェニック・キメラまたはクローン・トリを作製するために用いることができる
。

【００３３】（発明の詳細な説明）このように、本発明は、これまでのトリＰＧＣ培養法に関連した問題、すなわ
ち組織培養においてそのようなＰＧＣを約５日間以上維持することができないと
いう問題を解決する。下記に詳細に述べるが、本発明者らは意外にも、トリＰＧ
Ｃ、好ましくはキジ類（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）のＰＧＣ、および最も好ましく
はニワトリＰＧＣを、少なくとも以下の４つの増殖因子：白血球阻害因子（ＬＩ
Ｆ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および塩基性線
維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培養培地を用いることによって、長期間、
少なくとも１４日間、より好ましくは少なくとも２５日間、および好ましくはそ
れより長く維持することができることを発見した。

【００３４】一般に、そのような培養法は下記の工程を含む：（ｉ）ＸＩＩ〜ＸＩＶ期のトリ胚ドナーからＰＧＣを単離する工程；および（ｉｉ）該単離されたトリＰＧＣを、ＥＧ細胞を産生するために、ＬＩＦ、ｂ
ＦＧＦ、ＳＣＦ、およびＩＧＦの増殖促進に有効な相対量を含む培養培地におい
て、長期間、すなわち典型的に少なくとも２８日後、組織培養において培養する
工程。その上、上記で述べたように、本発明は、そのようなＰＧＣがこの培地で
長期間、平均で約２５日培養した後、明らかに脱分化してトリ胚生殖細胞を産生
するという発見に基づいている。この点に関しては、ＬＩＦおよびｂＦＧＦの存
在下で、ＳＴＯフィーダー細胞単層上で維持したマウスＰＧＣが胚芽幹細胞に類
似の細胞を生じたことが、これより先に報告されている（レスニック（Ｒｅｓｎ
ｉｃｋ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５９：５５０〜５５１、１９９２；マツイ（Ｍａ
ｔｓｕｉ）ら、Ｃｅｌｌ，７０：８４１〜８４３、１９９２）。レスニック（
Ｒｅｓｎｉｃｋ）ら（Ｉｄ．）は、このタイプの細胞に関して、インビトロでＰ
ＧＣにそれらが由来することを意味する胚生殖（ＥＳ）細胞という名称を示唆し
たが、ＥＧ細胞が従来のＥＳ細胞とは有意に異なるか否かは現時点では明確でな
い。

【００３５】少なくともマウス胚細胞株に関しては、ＥＧ細胞は特定の遺伝子のメチル化状
態がＥＳ細胞とは異なることが示されている（ラボスキー（Ｌａｂｏｓｋｙ）ら
、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２０：３１９７〜３２０４、１９９４；ピードラ
・ヒタ（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ）ら、ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＲｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ５８：１３２１〜１３２９、１９９８）。しかし、ＥＳ細胞と同様
に、ＥＧ細胞は培養において広く分化し、宿主胚盤胞に注入するとキメラに関与
することが示されているため、その多能性および全能性特性が証明されている。
トリＥＧおよびＥＳ細胞も同様に遺伝子メチル化に差があるか否かを示す必要が
ある。この仮説に拘束されるつもりはないが、本発明の細胞はそれらがＰＧＣに
由来し、ＥＳ細胞のように胚盤葉に由来しないことからＥＧ細胞であると考えら
れる。

【００３６】これらの細胞が明らかに胚生殖細胞であるという事実は様々な試験によって支
持される。特に、組織細胞はアルカリフォスファターゼ陽性であり（ペイン（Ｐ
ａｉｎ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２２：２３３９〜２３４２、１９９６
）、マウス特異的抗原１および３陽性である（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３
に特異的なモノクローナル抗体との反応性に基づく）。これらは多能性および全
能性細胞のマーカーである。このように、トリ（ニワトリ）およびマウスの多能
性および全能性幹細胞は明らかに、その未分化状態の特徴である関連エピトープ
を共有している。このように、これらの抗体は、本培養系を用いてトリＰＧＣを
長期間培養した際に産生された細胞コロニーにおいて生じるトリ胚生殖細胞を選
択するために有用である。

【００３７】これらのＥＧ細胞の全能性および多能性は、Ｘ期ニワトリ胚への移入によって
確認することができる（エッチズ（Ｅｔｃｈｅｓ）ら、ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉ
ｅｎｃｅ，７２：８８２〜８８７、１９９３に記述のように）。これはこれら
のトリＥＧ細胞が、性腺に移動することと共に、異なる発達段階の特徴である（
多能性）異なる組織を生じることができるという証拠となり、生殖系列伝播を示
している。したがって、移入すると、これらのＥＧ細胞は体細胞および生殖系列
キメラのトリを生じるはずである。

【００３８】ドナー・トリ胚から始原生殖細胞を単離する方法は文献に報告されており、当
業者が行うことができる（例えば、その全てが参照として本明細書に全文が組み
入れられる、１９９３年９月７日に公表された日本特許第９２４９９７号、公開
番号第０５−２２７９４７号；チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、ＣｅｌｌＢｉｏｌ．
Ｉｎｔ．，１９（２）：１４３〜１４９（１９９２）；ナイトウ（Ｎａｉｔ
ｏ）ら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３９：１５３〜１６１（１
９９４）；ヤスダ（Ｙａｓｕｄａ）ら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．，
９６：５２１〜５２８（１９９２）；およびチャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，１６（９）：８５３〜８５７
（１９９２）を参照のこと）。

【００３９】本発明者らはトリＰＧＣを、約５３時間インキュベートしたニワトリの卵（胚
発達の１２〜１４期）から単離して、そこから胚を摘出し、その背側大動脈から
胚血液を採取して、適した細胞培養培地（Ｍ１９９培地）にそれを移した。次に
、これらのＰＧＣをフィコール密度遠心によって精製し、本発明の増殖因子を含
む培養培地１０μｌに再懸濁した。しかし、上記で述べたように、ＰＧＣを単離
する他の方法も既知であり、代わりに用いてもよい。

【００４０】次に、単離されたＰＧＣを計数して手動で（例えばピペットを用いて）分離す
る。その後、これらの異なるトリ胚から採取したＰＧＣをプールして（ＰＧＣ数
を増加させるため）、本増殖因子を含む培地においてインキュベートする。

【００４１】これ以降「完全な」培地と呼ぶこの培養培地は、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦお
よびＩＧＦと共に、典型的にＰＧＣおよび胚幹細胞培地に含まれる他の成分を含
む。より詳しく述べると、本「完全」培地は、好ましくは、上記の４つの増殖因
子を加えた周知の市販の細胞増殖培地であって、さらに、１０％仔ウシ胎児血清
、２ｍＭＬ−グルタミン、０．４８％抗生物質／分裂抑制物質、１３２μＭ
２−βメルカプトエタノール、１Ｕ／μｌＬＩＦ、０．４０ｐｇ／μｌｂＦ
ＧＦ、６０ｐｇ／μｌＩＧＦ−Ｉおよび８０ｐｇ／μｌＳＣＦを含むα−Ｍ
ＥＭを含む。

【００４２】今日まで行われた実験に基づいて、これらはこれらの増殖因子の最小濃度に対
応すると考えられる。しかし、下記に述べるように、これらの増殖因子の量は組
織培養での維持に成功したＰＧＣの場合の２倍であった。このように、これらの
増殖因子の個々の量は、増加しても有害作用がないことは知られている。その上
、例えば他のトリのＰＧＣを培養する場合には、これらの最小量でさえも変更し
てもよい。

【００４３】示したように、本発明者らは、周知の市販の組織培養培地であるα−ＭＥＭを
基礎培地として用いた。しかし、これらの４つの基本的な増殖因子が存在するの
であれば、他の培地をこれに置換してもよいと予想される。出願人は特に、その
定義されていない多様な組成のために、本「完全培地」から仔ウシ胎児血清を除
いた改変も本発明に含まれると考えている。

【００４４】本発明の特定の長所は、ＥＧ細胞はフィーダー層がなくとも維持される可能性
があるという事実であり、これによってキメラまたはクローン動物を作製する際
により純粋なコロニーおよびよりきれいな調製物が得られる。ＥＧ細胞調製物の
純度が増加すれば、今度はキメラおよびクローン動物作製の成功率が増加する。
しかし、本発明はまた、これらの細胞を開示の増殖因子をコードする遺伝子によ
ってトランスフェクトする場合には、フィーダー層を用いて行ってもよく、それ
によって培養の際にこれらの因子を外から加える必要性がなくなる。本質的に、
細胞はこれらの増殖因子の持続的な供給源となる。（このことは、これらの増殖
因子遺伝子を、構成的な強いプロモーターおよびその分泌を提供する配列の制御
下に置くことによって得られ、それによってこれらの増殖因子を培養ＰＧＣが利
用できるようにすることによって得られる。）

【００４５】示したように、これらの因子の量はトリＰＧＣ、好ましくはキジ類（Ｇａｌｌ
ｉｎａｃｅａ）ＰＧＣ、および最も好ましくはニワトリまたは七面鳥ＰＧＣの組
織培養における長期間培養を可能にするために有効な相対量を指す。本発明にお
いて、これはさらに培養ＰＧＣがＥＧ細胞へと分化する量を指す。

【００４６】好ましくはこれらの増殖因子の相対量は以下の範囲内であろう：

【００４７】ＬＩＦは１Ｕ／μｌ〜１００Ｕ／μｌ、より好ましくは１〜１０Ｕ／μｌ、お
よび最も好ましくは１〜５Ｕ／μｌ。

【００４８】ＩＧＦ−１は０．６０ｐｇ／μｌ〜６０．００ｐｇ／μｌであり、より好まし
くは重量で０．６０ｐｇ／μｌ〜６．０ｐｇ／μｌ、および最も好ましくは０．
６０ｐｇ／μｌ〜１．０ｐｇ／μｌである；

【００４９】ＳＣＦは重量で８０ｐｇ／μｌ〜８０００ｐｇ／μｌであり、より好ましくは
８０ｐｇ／μｌ〜８００ｐｇ／μｌ、および最も好ましくは重量で８０ｐｇ／μ
ｌ〜１６０ｐｇ／μｌである；

【００５０】ｂＦＧＦは０．４０ｐｇ／μｌ〜４０ｐｇ／μｌであり、より好ましくは重量
で０．４０ｐｇ／μｌ〜４．０ｐｇ／μｌ、および最も好ましくは０．４０ｐｇ
／μｌ〜０．８０ｐｇ／μｌである。

【００５１】上記の範囲において、上限は本発明にとって重要ではなく、主に費用の点から
記載している（増殖因子の製造元に関連した有意な出費）。

【００５２】しかし、これらの好ましい範囲は例えば、α−ＭＥＭが別の増殖培地によって
置換されている場合、およびトリＰＧＣの他のタイプを培養する場合に変化させ
てもよいと予想される。

【００５３】記述のように、これらのＰＧＣは長期間培養してキメラ・トリを首尾よく産生
することができる。今日まで細胞は組織培養において約４ヶ月まで維持されてお
り、明らかに有害な作用を認めていない。同様に２５日まで維持した細胞に関し
ては、トリ胚性腺に有効に定着して、キメラ・トリを作製するか否かを試験した
。しかし、これらの細胞は、キメラ・トリの産生能を保持したまま、無限に培養
することができると予想される。

【００５４】ＰＧＣを用いてキメラを産生する方法は、上記で述べた先行技術によって示さ
れるように当技術分野において既知である。好ましくは、以下の実施例に開示の
方法に従って、ＥＧ細胞をレシピエント・トリ胚に移入する。その後キメラ産生
の成否は、ＰＧＣの性腺への移動および定着、ＰＧＣ表現型の保持に基づいて評
価する、または孵化および生育後の性腺におけるドナーＰＧＣの有無を評価する
ことによって行う。

【００５５】本実施例において、本発明者は色から容易に追跡することができる遺伝子型を
選択した（ドナーのトリは白色ブロイラータイプであり、レシピエントのトリは
羽毛が黒いトリであり、それぞれ特定の潜在的遺伝子型を有する）。推定される
キメラは黒い羽毛で、これらを黒い羽毛のトリと交配させると黒／白の後代を生
じた。それによって、黒／白の羽毛を含むトリの産生に基づいてキメラの成功が
示された。

【００５６】第二の戦略において、縞模様の海鳥をレシピエントとして用いて白い羽毛のト
リをドナーとして用いた。考えられるキメラのトリは、部分的に縞の入った羽毛
を有する白い羽毛の子孫を産生することに基づいて示された。

【００５７】しかし、本発明は望ましい形質をキメラ化によって導入することに応用できる
はずである。これは当然のこととして、移入されるＰＧＣの遺伝子型特性に依存
するであろう。

【００５８】考察したように、長期間培養において維持することができる本ＰＧＣの重要な
応用は、キメラ・トリの作製である。これは、望ましいＤＮＡ配列を培養したＰ
ＧＣに導入することによって得られる。ＤＮＡをレシピエント細胞に導入する手
段は既知であり、これにはリポフェクション、トランスフェクション、微量注射
、形質転換、微量発射技法等が含まれる。特に、本発明者らはリポフェクション
によってリポーター遺伝子を含むベクターを導入することをまず選択した。しか
し、一過性にトランスフェクトしたＰＧＣは産生されたが、安定にトランスフェ
クトした細胞系はまだ単離されていない。しかし、これは本ＰＧＣを用いて既知
の技法によって得ることができると予想される。

【００５９】好ましくは、望ましい遺伝子、例えば治療ポリペプチド、増殖因子、酵素等を
コードするＤＮＡを、トリにおいて機能的である配列の調節的制御下で導入する
。好ましくはこれらの調節配列は真核生物由来であり、最も好ましくはトリ、例
えばニワトリ調節配列である。トリの細胞において機能的であるプロモーターは
例えば、トリ遺伝子または当技術分野において既知のウイルスに由来した。

【００６０】最初に、望ましいタンパク質を産生する安定な細胞株を単離してキメラの作製
に利用する。同様に、導入されたＤＮＡは、挿入されたＤＮＡを含む細胞をより
容易に同定するために、その発現が容易に検出されるマーカーＤＮＡを含む。そ
のような選択可能マーカーは周知であり、これらにはβ−ラクタマーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ等が含まれる。

【００６１】得られたトランスジェニックＰＧＣをトリ胚芽に注射すると、トランスジェニ
ック・キメラ・トリが得られる。好ましくは、望ましいタンパク質は、これらの
トランスジェニック・トリの卵体液等から回収され、それによってタンパク質の
持続的な供給が得られる。

【００６２】考察したように、本発明は上記のように培養したＰＧＣからのＥＧ細胞の産生
を含む。

【００６３】これらのＥＧ細胞は、特徴的な「ＥＳ」抗原またはマーカー、特にアルカリフ
ォスファターゼ、および発生期特異的胚抗原の発現に基づいて同定されるであろ
う。例えば、ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−３に特異的なモノクローナル抗体を
用いて長期間、典型的に少なくとも２５日間組織培養において培養したＰＧＣに
おいて多能性および全能性細胞を同定することができる。例えばＭＣ−４８０は
ＳＳＥＡ−１抗原に対して特異的なモノクローナル抗体である（ソルター＆ノウ
ルズ（ＳｏｌｔｅｒａｎｄＫｎｏｗｌｅｓ）（１９７８））。

【００６４】同様に、もう一つのモノクローナル抗体であるＥＭＡ−１は、マウスおよびニ
ワトリＰＧＣに特異的であり、それによって、ＰＧＣ特異的エピトープを保持す
るＰＧＣ培養が同定されるはずである。（この抗体はマウスおよびニワトリ始原
生殖細胞の双方に発現される特異的エピトープに結合する）。したがって、これ
らのエピトープは非常に異なる種（トリおよび哺乳類）において明らかに保存さ
れているため、ＥＭＡ−１はトリＥＧ細胞の遺伝的なさらなる特徴付けにとって
有用となるはずである。

【００６５】記述のように、これらのＥＧ細胞の全能性および多能性は、トリ胚への移入に
よって、例えばエッチズ（Ｅｔｃｈｅｓ）ら、ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ
，７２：８８２〜８８９、１９９３によって開示されているＸ期ニワトリ胚、
および上記のようなＸＩＩ〜ＸＩＶ期胚への移入によって調べることができる。
これはこれらのＥＧ細胞が発達段階の胚において認められる異なるタイプの組織
に分化する（多能性）こと、およびそれらが首尾よく遊走して性腺に定着する（
そのような細胞は生殖系列に伝播されることを示す）ことを示す実験からの証拠
となる。したがって、これらの細胞によって体細胞および生殖系列キメラのトリ
、例えばキメラ・ニワトリが得られる。

【００６６】トランスジェニック・ニワトリの作製：ＰＧＣの増殖を支え、ＥＧ細胞へと脱分化させる培養系を開発すれば、ニワト
リにおいて異物タンパク質を全身的に産生させるために、外因性遺伝子を有する
ＤＮＡベクター構築物に細胞をトランスフェクトさせ易くなる。同様に、本方法
によってトランスフェクション後のＥＧ細胞の選択および増殖が容易となるため
、「ノックアウト」および「ノックイン」トランスジェニック・ニワトリとして
も知られる部位指向（相同組換え）体を作製することが可能となるであろう。

【００６７】ニワトリのクローン化へのＥＧ細胞の利用哺乳類のクローン化は既に行われている。トリのクローン化はＰＧＣおよびＥ
Ｇ細胞、ならびにおそらく分化した胚細胞（ニワトリ胚線維芽細胞、ＣＥＦ）を
用いて行うことができる。これは以下のように行うことができる：

【００６８】１．ニワトリのキメラは、胚細胞を無防備とするように新しく産卵した卵をガ
ンマ線照射することによって産生される。この後、無防備状態の胚盤葉に含まれ
る細胞数とほぼ同数のクローニングしたＥＧ細胞を微量注射する。ガンマ線照射
の最適なレベルおよび注射した細胞数は当技術分野での教えに従って容易に決定
されるであろう（カーサイエンス（Ｃａｒｓｃｉｅｎｃｅ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ１１７：６５９〜６７５（１９９３）；エッチズ（Ｅｔｃｈｅｓ）ら
、ＰｏｕｌｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅ，７３：８８２〜８８９、１９９３）。

【００６９】２．ニワトリのクローンは新しく産卵された非受精卵から、非受精卵母細胞を
抽出してその後ガンマ線照射、卵母細胞の電気刺激、ＥＧ、ＰＧＣまたはＣＥＦ
の注射および融合を行うことによって作製する。融合後、胚培養培地を含むペト
リ皿に卵母細胞を移す（オノ（Ｏｎｏ）ら、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１６１
：１２６〜１３０、１９９４）、または非受精卵に戻す。

【００７０】（実施例）以下の実施例および方法を下記の実験において用いた。

【００７１】材料および方法モノクローナル抗体一次抗体ＥＭＡ−１およびＭＣ−４８０（抗ＳＳＥＡ−１抗体）を、アイオワ
大学発達研究ハイブリドーマバンク（ＤＳＨＢ）から得た。

【００７２】ＥＭＡ−１抗体：モノクローナル抗体ＥＭＡ−１は、ハーネル＆エディ（Ｈａｈｎｅｌａｎｄ
Ｅｄｄｙ）（１９８６）によって開発されたマウス始原生殖細胞（ＰＧＣ）に
特異的な細胞表面マーカーである。この試薬はＮｕｌｌｉＳＣＣＩマウス胚癌
（ＥＣ）細胞の細胞表面マーカーに対して作製された。抗体はＮＳ−１骨髄腫細
胞を、ＮｕｌｌｉＳＣＣＩＥＣ細胞で免疫したＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスの脾
細胞と融合させることによって調製した。ＥＭＡ−１モノクローナル抗体はＩｇ
Ｍアイソタイプ（付録＃１）である。抗体によって認識される抗原は細胞表面糖
タンパク質である。マウスＰＧＣ上でのＥＭＡ−１抗原の発現は、発達期のマウ
ス胚の８日〜１３日に限定される。ＥＭＡ−１は、初期胚におけるほとんどしか
し全てではない多能性細胞と反応する（ハーネル＆エディ（Ｈａｈｎｅｌａｎ
ｄＥｄｄｙ）、１９８７）。ハーネル＆エディ（ＨａｈｎｅｌａｎｄＥｄ
ｄｙ）（１９８６）によれば、ＰＧＣは９．５〜１１日目の胚の尾領域において
ＥＭＡ−１によって強く染色される唯一の細胞である。これは雄性マウスの尾領
域の半分、または１３日齢胚切片の尿生殖隆線においてＰＧＣとの反応性を示し
た。１４日齢のマウス胚切片ではＰＧＣとの反応性を示さなかった。ＥＭＡ−１
はＰＧＣの辺縁部およびＰＧＣに存在する細胞質顆粒に結合する。Ｎｕｌｌｉ細
胞上のＥＭＡ−１決定因子を有する抗原はＥＤＴＡおよびトリプシン処理に感受
性を示さない。

【００７３】ＭＣ−４８０（抗−ＳＳＥＡ−１）抗体：モノクローナル抗体ＭＣ−４８０は発達期特異的マウス胚抗原ＳＳＥＡ−１を
認識する。この抗体は、ソルター＆ノウルズ（ＳｏｌｔｅｒａｎｄＫｎｏｗ
ｌｅｓ、１９７８）によって記述されたアイソタイプＩｇＭである。この抗体に
よって同定される細胞表面抗原ＳＳＥＡ−１は糖脂質上に糖質エピトープおよび
フコシル化Ｚ型血液型を含む糖蛋白質を含む（付録＃２）。抗体はマウス骨髄腫
細胞を、Ｆ９奇形癌細胞で免疫した細胞から得た脾細胞と融合することによって
作製した。この抗体の特異性は、一連のマウスおよびヒト細胞株上でラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて調べた。この抗体は、マウス奇形癌細胞および２
種類のヒト奇形癌由来細胞株と反応した（ソルター＆ノウルズ（Ｓｏｌｔｅｒ
ａｎｄＫｎｏｗｌｅｓ）、（１９７８））。同じ腫瘍および奇形癌幹細胞株に
由来する分化した全ての細胞株は抗原に関して陰性であった。ハイブリドーマか
らの上清をさらに、マウス胚についても調べた。抗体は非受精卵、接合体、およ
び２〜４細胞期の胚とは反応性を示さなかった。抗体は後期８細胞期および桑実
胚に対して漸増的な効率で結合する。胚盤胞では結合量は減少した。補体依存的
溶解を用いた試験は類似の傾向を示した。８細胞期以前の胚の溶解を認めなかっ
た。８細胞期胚に中等度の溶解（１０〜２０％）を認めたが、桑実胚、胚盤胞、
および部内細胞塊は非常に高い効率で溶解した（ソルター＆ノウルズ（Ｓｏｌｔ
ｅｒａｎｄＫｎｏｗｌｅｓ）、１９７８）。間接的免疫蛍光アッセイによる
結果も非受精卵、接合体および２および４細胞期胚では陰性であった。インビト
ロで３日まで培養した内宇細胞塊（ＩＣＭ）の大部分は抗原に対して陽性であっ
た。ＩＣＭから内胚葉の外側の層を除去することによって暴露した外胚葉は、常
に完全に陽性であった。ソルター＆ノウルズ（ＳｏｌｔｅｒａｎｄＫｎｏｗ
ｌｅｓ、１９７８）は、おそらくいくつかの発達期特異的グリコシルトランスフ
ェラーゼが合成され、または活性化されて初期着床前および胚発達の際に細胞表
面に提示されることを示した。

【００７４】動物白色（Ｅ／ＥおよびＩ／Ｉ）ブロイラー型ニワトリを、長期ＰＧＣ培養系を発
達させるためのＰＧＣのドナーとして用いた。２つのタイプのトリ、すなわち優
性の黒い羽毛を有する（Ｅ／−およびｉ／ｉ）ニワトリ株と縞模様の海鳥（Ｅ／
Ｅおよびｉ／ｉ）株をレシピエント胚として用いた。白色ブロイラー（ＷＢ）タ
イプのＰＧＣを注射した優性の黒いトリをＥ／−（ＷＢ）と呼び、白色ブロイラ
ータイプのＰＧＣを注射した縞模様の海鳥をＢＲと呼んだ（ＷＢ）。

【００７５】ＰＧＣの抽出１２〜１４細胞期の胚をＰＧＣ抽出に選択した。ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）ら、
Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３７：１６７〜１７１（１９９４）が
記述したように、細いマイクロピペットを用いて背側大動脈からＰＧＣを採取し
た。胚２０個から得たＰＧＣを、１０％ウシ胎児血清を加えたハンクス溶液にプ
ールして、フィコール密度勾配遠心によって濃縮した（ナイトウ（Ｎａｉｔｏ）
ら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，３９：１５３〜１７１（１９９４
））。ＰＧＣを計数して、培養培地（ＤＭＥＭ、異なる量の増殖因子を含む）の
少量１０μｌに１滴あたりＰＧＣ約１００〜６００個となるように加えた。この
少量の培養培地に滅菌した軽油を重ねた。

【００７６】レシピエント胚へのＰＧＣの注射１３〜１４細胞期胚をレシピエント胚として用いた。卵を適当な表面に置いた
後、時間が経過すると、発育中の胚は静止状態の卵の上部に自ら収まる。細いピ
ンセットで、殻に小さい１０ｍｍ未満の開口部（「窓」）を作製した。４％抗生
物質を含む燐酸緩衝生理食塩液の混合液を加えることによって胚を表面に近いと
ころに持ってきた。胚をその心臓が見えるようにすると、背側動脈および／また
は辺縁の静脈を容易に特定することができる。０．０４％トリパン・ブルーを含
む培地２μｌ中にドナーＰＧＣ２００個をマイクロピペットに移した。ＰＧＣを
レシピエント胚の背側大動脈に注射した。不活性細胞色素であるトリパンブルー
によって、注入時にＰＧＣ懸濁液が肉眼で見える。注射の後、卵の殻の開口部を
手術用テープで閉じて、パラフィンで強化した。卵を監視下で湿潤ＣＯ₂インキ
ュベーター内で２４時間維持して、その後孵化するまで通常のインキュベーター
に移した。

【００７７】ＰＧＣの生存蛍光染色移入の成否および／またはＰＧＣの性腺への移動能を評価するために、ＰＧＣ
をＤｉＩ蛍光色素によって染色した。移入の２４時間後に胚を採取してペトリ皿
に置いて、上蛍光分析を備えた倒立顕微鏡下で観察した。

【００７８】ＰＧＣ培養条件ヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）
、ヒトインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）のいく
つかの濃度を試験した。同様に、マイトマイシン処置ニワトリ線維芽細胞および
マウスＳＴＯ細胞フィーダー層も試験した。

【００７９】ＰＧＣ長期培養培地完全な細胞培養培地はα−ＭＥＭ、１０％仔ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グル
タミン、０．５６％抗生物質／分裂阻止物質、３４．５６ｍＭ２−βメルカプ
トエタノール、０．００６２５Ｕ／μｌ白血病阻害因子（ＬＩＦ）、０．２５ｐ
ｇ／μｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、０．５６２５ｐｇ／μｌイ
ンスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および４．０ｐｇ／μｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）を
含む。培地交換は培地の５μｌを除去して２×新しい培地５μｌを加えることに
よって２日毎に実施した。後者は増殖因子が連続培養の一定期間後に不安定とな
ることを想定している。しかし、本当のところは増殖因子の濃度を倍加すること
である。したがって、最終培地は以下の濃度の増殖因子を有する：白血病阻害因
子（ＬＩＦ）０．０１２５Ｕ／μｌ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）０
．５ｐｇ／μｌ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）１．１２５ｐｇ／μｌおよび
幹細胞因子（ＳＣＦ）８．０ｐｇ／μｌ。本明細書に記述した増殖因子濃度の範
囲は、連続培養においてＰＧＣの維持および増殖を促進する。しかし、ＰＧＣは
記述の増殖因子濃度の最高濃度でよりよく生存し、増殖する。

【００８０】これらの培養条件を用いて、ＰＧＣは、採取後３〜４日以内に、大きい密度の
濃い、疎な接着細胞塊（細胞塊のいくつかはその中に数百個の細胞を有する）を
形成する。７日目の終わりに、細胞塊には大量の死細胞が現れ始め、細胞の屑が
それらの周りを取り囲んでいる。ＰＧＣ細胞塊は４週間まで生存して、その後そ
れらは細胞単層となった。１、２および３週間目に細胞塊を解離して、生存色素
ＤｉＩで染色して、レシピエント胚に移した。全ての３つの時点で、いくつかの
レシピエント胚の性腺に細胞を認めた。細胞数と、性腺において染色されたＰＧ
Ｃを示す胚の数はＰＧＣ培養の年齢と反比例した。

【００８１】（抗体試験の手順及び比較対照細胞系の成長）ガンマ線（８０００ラド）を照射したＳＴＯフィーダ層細胞（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社カタログ番号１５０３
−ＣＲＬ）を、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ社カタロ
グ番号Ｄ−５５２３）中、約７０−８０％の集合度で、４−ウェル室スライド上
に接種した。８−１０時間後、マウスのＥＳ細胞を正の試験比較対照として、Ｓ
ＴＯフィーダ細胞層に接種した。

【００８２】ＤＭＥＭ完全培地は、基礎培地に対して、最終濃度として４．５ｇ／ｌのグル
コース（ＳＩＧＭＡ社カタログ番号Ｇ−７０２１）、１．５ｇ／ｌの重炭酸ナト
リウム（ＳＩＧＭＡ社カタログ番号Ｓ−４０１９）、１ｍＭのピルビン酸ナトリ
ウム（ＧＩＢＣＯ社カタログ番号１１３６０−０７０）、０．１ｍＭの２β−メ
ルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ社カタログ番号２１９８５−０２３）、１０％
ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社カタログ番号ＳＨ３００７０−０３）及び％の
抗生物質／抗真菌物質（ＳＩＧＭＡ社カタログ番号Ａ−７２９２）を補うことに
より調製した。

【００８３】負の比較対照として、ＤＭＥＭ完全培地中のニワトリ線維芽細胞を、４−ウェ
ル室スライドに接種して使用した。３７℃、６％ＣＯ₂中で３日間インキュベー
トしたところ、マウスのＥＳ細胞は目に見えるコロニーを形成した。培地を傾し
ゃ法で除き、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で濯ぎ、冷たい４％パラホルムアル
デヒド（ＳＩＧＭＡ社カタログ番号Ｐ−６１４８）中、４℃で、１５分間かけて
細胞を固定した。

【００８４】生後９８日目のニワトリから採取したＰＧＣ生体外培養細胞クラスターを４−
ウェル室スライドに移し、冷たい４％パラホルムアルデヒド中で固定した。これ
に対して、ニワトリの新しいＰＧＣは、通常のガラス・スライド上で固定した。
ブロッキング剤（ＰＢＳ中に溶解した１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン；Ｆｉ
ｓｈｅｒ社カタログ番号ＢＰ１６０５−１００）を使用して、３０分間ブロッキ
ングした。

【００８５】抗体を５μｇ／ｍｌの速度でブロッキング剤で希釈し、２００μｌを個々のス
ライド上に塗布し、４℃で１８時間（一晩）インキュベートした。細胞は、冷た
いＰＢＳの中で一度濯いだ。ブロッキング剤中に溶かした２００マイクロリット
ルの二次抗体（フルオレセイン共役アフィニピュア・ヤギ・アンチマウスＩｇ
Ｍ；ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社カタログ番号９１１５−０
１５−０２０）を、ブロッキング剤中５μｇ／ｍｌの速度で、各スライド上に塗
布し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。スライドを、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０（Ｆｉｓｈｅｒ社カタログ番号ＢＰ３３７−１００）を含む４Ｘの
クエン酸ナトリウム食塩水（ＳＳＣ）中、３７℃で、５分間ずつ３回洗浄した。
４００ｎｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（ＳＩＧＭＡ社カタログ番号Ｄ−９５４２）を含む
２ＸＳＳＣ中で、常温で１０分間、細胞を染色し、０．０５％のＴｗｅｅｎ−
２０を含む２ＸＳＳＣ中で３分間濯ぎ、ＤＡＢＣＯ（ＳＩＧＭＡ社カタログ番
号Ｄ−２５２２）退色防止剤の中に固定した。

【００８６】スライドは、ＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅＥ８００光学顕微鏡の下で観察し
た。この顕微鏡には、標準励起障壁フィルターを有する１００ワット水銀灯の付
いたエピ蛍光照明による、明視野、ＤＩＣ、フェーズ及び蛍光光学機器を装備し
て使用した。細胞の観察には、ＦＩＴＣ信号及びＤＡＰＩ染色核の検出に適した
フィルター・セットを使用した。細胞のフェーズ・コントラスト画像も得た。Ｉ
ｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓバージョン３．０ソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙ
ｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社ＳｉｌｖｅｒＳｐｒｉｎｇｓＮＭ）を使用し、Ｉｏ
ｍｅｇａＺＩＰドライブ上に据えたＣｏｏｌＣａｍ液体冷却ＣＣＤカメラ（Ｃ
ｏｏｌＣａｍｅｒａ社；ＤｅｃａｔｕｒＧＡ）で、デジタル化画像を捕捉し
た。Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ４．０（Ａｄｏｂｅ社）ソフトウェアを使用し、Ｅｐ
ｓｏｎ社製Ｓｔｙｌｕｓ−８００プリンターで、高級光沢写真紙上にプリントし
て画像を処理した。

【００８７】（レシピエント胚へのＰＧＣ移入）ＰＧＣを移入するために、解剖鏡の下にレシピエント卵を水平に置いた。卵の
内圧を下げて漏れを防ぐために、卵の内部空気空間に向けて小さな孔を開けた。
卵の腹面上に１０ｍｍの窓を開け、卵の殻に開けた窓から流れ出る直前までこの
孔を通して４％の抗生物質／抗真菌物質を含有する１ｍｌのＰＢＳを注入し、胚
の位置を持ち上げた。ＰＧＣを注入するために、３０μｍピペットに傾角を付け
、次にミクロフォージでこれを引き上げ、端部が良く磨かれた微小な先端部を形
成させた。各胚の移入毎に、下記のようにして解離させた２００個のＰＧＣを、
ニードル・ピペットと吸引チューブを使用して手で拾い上げた。移入を行う前に
、ＰＧＣがまだピペットの中にある間に、これをトリパン・ブルー染料の０．０
４％溶液と混合した。各胚への総注入量は２μｌであった。最終段階として、辺
縁静脈の一部を露出させるような位置に、レシピエント胚を置いた。ＰＧＣの入
ったニードル・ピペットを挿入し、内容物を注意深く排出させた。このニードル
・ピペットを、数秒間そのままの位置に置いた後、これを抜き取った。手術用の
テープ２層を使用してレシピエント卵をシールし、全表面をパラフィン・ワック
スでコーティングした。次にレシピエント卵を回転インキュベータの中へ戻し、
孵化するまでインキュベートした。

【００８８】（ＰＧＣ表現形の評価）ニワトリのＰＧＣは、周期的な酸性シッフ染色（ＰＡＳ）に対して陽性であり
、アルカリ性ホスファターゼに対しても陽性であると主張されている。しかし、
ニワトリのＰＧＣが後者に対して陽性であるという明確な証拠は無い。これに代
わる、ニワトリのＰＧＣを特徴付けるような酵素又は分子標識法が無いために、
細胞をレシピエント胚に移入し、生殖腺の中で発育した胚を調べて、その表現形
を評価した。この方法では、１００μｇ／ｍｌＤｉＩ中のＰＧＣを、α−ＭＥ
Ｍ培地中で培養し、レシピエント胚へ移入する前にこれを濯ぐことが必要であっ
た。移入後２４時間目のレシピエント胚を除去し、これを倒立顕微鏡の下に置い
て観察した。生殖腺の中でＤｉＩ標識細胞が観察されたということは、ＰＧＣが
生殖腺へ移行することに成功し、このＰＧＣがＰＧＣの特性を保持していること
の確認となるものと解釈される。レシピエント胚を孵化させ、孵化後にその表現
形の中にドナーＰＧＣが存在するかどうかを調べることにより、ＰＧＣ表現形の
保持に関する第二の評価方法とならないかどうかを追求した。

【００８９】（ＰＧＣ評価を目的とする孵化戦略）２つの孵化戦略に関して検討した。第一の戦略では、ｉ／ｉ、Ｅ／Ｅ、ｓ／ｓ
、ｂ／ｂの遺伝子形を有する可能性のある黒色羽レシピエント鳥と、Ｉ／Ｉ、Ｅ
／Ｅ、Ｓ／Ｓ、Ｂ／Ｂの遺伝子形を有するブロイラー型白色羽のドナー鳥を使用
した。レシピエントがキメラであること、即ちそれ自身のＰＧＣ及びドナーＰＧ
Ｃをその生殖腺の中に有することを証明するために、これらを純粋な黒色羽鳥と
掛け合わせた。得られた後代が全て黒色羽鳥であれば、これらの動物はキメラで
はないことになる。しかし、後代の中に、黒斑のある白色羽のものがいれば、レ
シピエント動物はキメラである可能性が強い。第二の孵化戦略では、レシピエン
ト胚としてバーロック鳥を、またドナーとしては今回も引き続き白色羽のブロイ
ラー型鳥を使用した。この後者の場合において、想像上のキメラ鳥を純粋なバー
ロック鳥と掛け合わせて、同じ斑状白色羽の後代が出現すれば、キメラであるこ
とが確実視される。各推定キメラ鳥から５０羽の後代が得られたので、これらの
鳥が確実にキメラであることを結論した。

【００９０】（後代試験）Ｅ／−（ＷＢ）の推定キメラ鳥をＷＢ鳥と掛け合わせると、これらの親がドナ
ー（ＷＢ）ＰＧＣの場合には純粋な白色羽のニワトリが、また、これらの親が（
Ｅ／−）ＰＧＣの場合には黒斑のある白色羽のニワトリが生まれた。同様に、Ｂ
Ｒ（ＷＢ）をＷＢ鳥と掛け合わせると、親がドナー（ＷＢ）ＰＧＣの場合には純
白色羽のニワトリが生まれ、親が（ＢＲ）ＰＧＣの場合には、白斑のある黒色ニ
ワトリが生まれた。推定ＢＲキメラ鳥同士の掛け合わせも行った。後者の場合、
２羽の（ＷＢ）ＰＧＣの間で受精を行えば白色ニワトリが生まれ、２羽の（ＢＲ
）ＰＧＣの間で受精を行えば黒色ニワトリが生まれた。中間的な黒斑白色羽ニワ
トリは、（ＢＲ）ＰＧＣを（ＷＢ）ＰＧＣで受精した場合にのみ生まれた。

【００９１】（２５日を越える長期培養［ＥＧ細胞］）２５日間の連続培養を行った後、ＰＧＣの集団は速やかに広がって単細胞層を
形成する。これら単細胞層は、上面に平坦な付着性基礎面と、その上に付着した
これより緩いＰＧＣ状細胞鎖を有している。これら単細胞層の束は、ＰＡＳ陽性
の状態が保たれている。これら単細胞層から得られたＤｉＩ染色細胞を、レシピ
エント胚に移入した。胚の中には、生殖腺の中に殆ど細胞が存在しないものもあ
った。細胞は、単細胞層をうまく通過できた。これらの細胞は、その増殖速度が
落ち始め、老化し、線維芽細胞状に見えるようになるまでに、一般に単細胞層を
３−５回継代することが可能であった。この単細胞層を多数回継代し、連続培養
液中で何ら差異を生じることなく、約４カ月間もの間繁栄し続ける細胞株もいく
つかは存在する。

【００９２】単細胞層から得られた２つの細胞系、Ｐ１０２８９６及びＰ１１０５９６を凍
結させた。前者には分化の兆候は認められず、アルカリ・ホスファターゼに対し
て辛うじて陽性であった。これに対して、後者は神経細胞状形態を示し、アルカ
リ・ホスファターゼに対して強度の陽性を示した。上記に述べたように、ＰＧＣ
単細胞層（特に推定ＥＧ細胞）の特徴付けをさらに進めることにより、その全能
性及び多能性をさらに確認し得るものと考えられる。

【００９３】結果の要約キメラ・ニワトリは、新しいＰＧＣ及び凍結保存したＰＧＣから発生した。新
しいＰＧＳを移入して生産した３４羽の推定キメラ・ニワトリの中の２５羽（７
４％）が真のキメラ動物であることが、後代試験により証明された。凍結保存し
たＰＧＳからつくった３４羽の推定キメラ鳥の中３０羽（８８％）が、真のキメ
ラ・ニワトリであることが証明された。これら全ての場合において、１羽のキメ
ラ鳥あたり少なくとも４０羽の後代を生産したところ、受精したドナーＰＧＣの
数は１．４％から１００％まで変化し、その中大部分のものは３０％と６０％の
範囲内にあった。後者が注入後に生殖腺まで到達したＰＧＣの数を反映している
と仮定すると、注入１回あたりの成功範囲が変化したことになる。しかしレシピ
エントの生殖腺中で確立されるＰＧＣの数に影響を与えるような他の何らかのメ
カニズムが作用しているのであろう。このようなメカニズムに関しては、本試験
では評価しなかった。また全体的に、キメラ鳥の後代中に有意な性比率の変化も
観察されなかった。

【００９４】ＰＧＣの培養条件本試験で評価した細胞供給層の中には、ＰＧＣの長期培養条件を改善したもの
は無かった。試験した濃度の中には、成長因子だけで、ＰＧＣを生体外で分化さ
せずに保持し得たものも無かった。２つ及び３つの成長因子の組み合わせについ
ても試験したが、殆ど成功した例は無かった。我々の試験結果に基づけば、ＰＧ
Ｃの長期培養には、上記全ての因子（ＬＩＦ、ＢＦＧＦ、ＩＧＦ及びＳＣＦ）が
必要のように思われる。ＰＧＣのＤｉＩ染色の結果に基づけば、我々の培養条件
下においては、日齢１４日の連続培養で発生するＰＧＣは、注入後にレシピエン
ト胚の生殖腺まで移行することを、我々は観察したことになる。我々は、培養液
中で２５日間維持されたＰＧＣを、孵化まで持っていったレシピエント胚に移入
することも行った。後代試験の結果に基づき、これら胚の一つはキメラであるこ
とが見いだされた。

【００９５】長期培養条件下におけるＰＧＣの表現形採取後、そのサイズ及び脂質滴がその膜及び細胞質中に存在することにより、
ＰＧＣの認識を行った。採取約４８時間後に、ＰＧＣは一度塊になり、次に分割
を開始する。このことは、塊のサイズが増大し、次に塊がトリプシン解離して細
胞の数が増えることから証明される。塊を形成するＰＧＣだけが生き残り、他は
全て死滅する。一般に、１００個のＰＧＣで培養を開始すると、７日の中にこれ
が平均６００から８００個のＰＧＣに増える。ＰＧＣの中には、効率的な速度で
はないが分割するものがあるのも明らかである。しかし、これらのＰＧＣも、上
記のように生殖腺まで移行できる能力を維持している。

【００９６】２５日間を越える長期培養連続培養を開始してから２５日後、ＰＧＣの塊は急速に広がる単細胞層を形成
する。これらの単細胞層は、付着性を有する平坦な基礎部分と、これより緩い塊
及びその上部表面上にＰＧＣ状の細胞鎖を有している。これら単細胞層中のある
束は、ＰＡＳ陽性を保持した状態で残る。これら単細胞層から得られたＤｉＩ染
色細胞を、レシピエント胚に移入した。ある胚は、その生殖腺の中に、殆ど細胞
が集まらないことが分かった。単細胞層は、うまく透過させることができた。一
般に、これら細胞は、その増殖速度が低下し、老化し、線維芽細胞状の外観を呈
するようになる前に、３−５回の通過能力を有していた。この単細胞層をそれ以
上何回も通過し、それでもまだ、４カ月間の連続培養で、分化することなく繁栄
を続ける細胞系もいくつか存在する。

【００９７】多くの細胞系が類似の特徴を確立していたが、特に単細胞層から得られた２個
の細胞系を凍結し、これらをＰ１０２８９６及びＰ１１０５９６と呼称した。前
者は明確な分化を示さず、アルカリ・ホスフェートに対して辛うじて陽性であっ
たが、これに対して、後者は神経細胞の形態を示し、アルカリ・ホスフェートに
対して強度な陽性を示した。

【００９８】特に、上記４つの成長因子を少なくとも２５日間使用して培養したＰＧＣは、
生殖腺でうまくコロニーを形成し、キメラ・ニワトリをつくることができること
が分かった。また、我々はＰＧＣ細胞を培養液の中で４カ月まで維持した。これ
ら培養液は、本明細書記載の試験結果から、まだ所定のＰＧＣ表現形細胞を維持
しているように見える。これら細胞のキメラ鳥生成能力については試験しなかっ
たが、その外観から、キメラ鳥生成に役立つことが期待される。

【００９９】長期培養液中のニワトリＰＧＣ上におけるＥＭＡ−１及びＭＣ−４８０抗体の検出単一クローン抗体ＥＭＡ−１及びＭＣ−４８０を、マウスＥＳ細胞（正の比較
対照）、９８日間培養液中のニワトリＰＧＣ、新しく採取したニワトリＰＧＣ、
及びニワトリ線維芽細胞（負の比較対照）上で試験した。

【０１００】ＥＭＡ−１抗体は、マウスＥＳ細胞（図１）、日齢９８日のＰＧＣ培養液中の
細胞（図２）及び新しいニワトリＰＧＣ（図３）の多くに高親和力で結合した。
ＥＭＡ−１は、ニワトリの線維芽細胞には結合しなかった（図４）。これらの結
果は、この抗体が多くの多能性マウス胚細胞及びＰＧＣ上に存在する細胞表面の
標識を検出したことを報告した、Ｈａｈｎｅｌ及びＥｄｄｙ（１９８７）の結果
と一致する。彼らは又、ＥＭＡ−１が成体組織の尿性器管上皮及び初期胚に沿っ
て、反復陽性細胞を示したことも報告している。彼らは、このエピトープを他の
いかなる成体組織上でも検出したことは報告していない。生殖細胞の存在により
、成体の尿生殖隆腺上に、この抗体がエピトープを検出する可能性はある。Ｐａ
ｉｎら（１９９６）は、培養液中にニワトリのＥＳ細胞を検出するために、ＥＭ
Ａ−１を使用したことについて報告している。彼は、ＥＭＡ−１エピトープが
分化しない胚の幹細胞検出に、有用な標識として使用し得ることを示唆した。我
々の実験においては、マウスのＥＳ細胞と比較し得る日齢９８日のニワトリＰＧ
Ｃカルチャ上のＥＭＡ−１上及び新しいＰＧＣ上で、非常に強い陽性信号が得ら
れた。しかし、この抗体は、ＰＧＣとＥＳの表現形の間で分化しない。このこと
は、この抗体が多能性及び全能性を有する可能性を示していることは明らかであ
る。このことは、長期培養カルチャ中のＰＧＣが、そのままＰＧＣとして残るか
、又は多能性のＥＧ細胞に逆分化するかの、いずれかであることを示唆している
。

【０１０１】ＭＣ−４８０抗体は、マウスのＥＧ細胞表面の抗原（図５）及びカルチャ中の
日齢９８日のＰＧＣ（図６）と強く反応した。新しいＰＧＣで抗原に対して陽性
を示したものの数は非常に少なく（図７）、また、ニワトリの線維芽細胞は常に
陰性であった（図８）。これらの結果は、一度分化した長期生体外カルチャのＰ
ＧＣが多能性のＥＧ細胞に逆分化することを示唆している。新しいＰＧＣの中に
抗体に対して陽性信号を示すものがあるという事実は、新しいＰＧＣの中のある
ものが、胚生殖腺への移行期の間、まだいくらかのＥＳ抗原を維持していること
を示している。これらの抗原は、その後、失われるものと思われる。しかし、最
終的にその表面上にＥＧ抗原の存在を示すＰＧＣが、我々の長期培養において、
より良く生存し続けることも可能である。これら２つの結果を一緒にすると、我
々の長期カルチャ中のＰＧＣは、一度分化した多能性幹細胞へ逆分化することが
分かる。この発見は、マウスのＰＧＣがカルチャ中で逆分化し、ＥＧ細胞になる
という報告（Ｍａｔｓｕｉら，１９９２）と類似している。

【０１０２】これらの結果は、我々のニワトリＰＧＣ細胞培養培地が、ニワトリのＰＧＣの
ＥＧ細胞への逆分化に影響を与えていることを示している。これは、遺伝子導入
動物及びニワトリのクローンを効率良くつくる際に有用な、多能性ニワトリ細胞
の生産にとって重要な一歩となる。

【０１０３】ＰＧＣの移入緑色蛍光タンパク質リポータ遺伝子含有ベクターによる脂肪移入を利用して、
ＰＧＣの移入を行った。平均１／５０個のＰＧＣが一時的に移入された。しかし
、安定な移入細胞系はまだ開発されていない。

【０１０４】以上を要約すると、これらの結果は、ＰＧＣが長期間に亘って維持でき、これ
をキメラ鳥の生産に利用できることを示している。さらに成長因子の濃度を変化
させ、他の成長因子を使用することにより、さらに培養条件を最適化することが
できるものと考えられる。これをうまく利用できるようにするためには、ＰＧＣ
の生殖腺移行能力を維持しながら、ＰＧＣの培養系を移入し、ＰＧＣを選択でき
るようにすることが必要である。またこれらの結果は、マウスのＰＧＣ（Ｍａｔ
ｓｕｉら，Ｃｅｌｌ７０，８４１−８４７，１９９２）と同様に、鳥（
例えばニワトリ）のＰＧＣもＥＧ細胞の表現形に逆分化することを示している。
従って、分散ＥＧ細胞をレシピエントの胚盤葉の中へ注入することにより、キメ
ラ・ニワトリ及び遺伝子移入ニワトリを発生させることができるものと考えられ
る。また、これらの細胞は、遺伝子移入キメラ鳥及びクローン化鳥の生産に利用
できる、遺伝子移入ＥＧ細胞系の生産にも利用できるものと考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＥＳ細胞上のＥＭＡ−１抗体染色。パネルＡおよびＢは異なる２つの培
養を指す。Ａ１およびＢ１−マウスＥＳ細胞クラスタのＤＡＰＩ染色画像。Ａ２
およびＢ２−マウスＥＳ細胞クラスタの位相差画像。Ａ３およびＢ３−マウスＥ
Ｓ細胞上での陽性ＦＩＴＣシグナル。

【図２】９８日齢ＰＧＣ培養のＥＭＡ−１抗体染色。パネルＡおよびＢは異なる２つの
クラスタを示す。Ａ１およびＢ１−９８日齢ＰＧＣクラスタのＤＡＰＩ染色画像
。Ａ２およびＢ２−ＰＧＣクラスタの位相差画像。Ａ３およびＢ３−ＰＧＣ上の
陽性ＦＩＴＣシグナル。

【図３】新しく採取したニワトリＰＧＣのＥＭＡ−１抗体染色。パネルＡおよびＢは異
なる２つの処置を指す。Ａ１およびＢ１−新鮮なＰＧＣのＤＡＰＩ染色画像。Ａ
２およびＢ２−ＰＧＣ上の陽性ＦＩＴＣシグナル。Ａ２において陽性ＦＩＴＣシ
グナルを示すＰＧＣに対応するＤＡＰＩ染色したＰＧＣをＡ１において矢印の
先で示す。

【図４】ニワトリ初代培養線維芽細胞のＥＭＡ−１抗体染色。パネルＡおよびＢは、異
なる２つの培養を指す。Ａ１およびＢ１−ニワトリ線維芽細胞のＤＡＰＩ染色画
像。Ａ２およびＢ２−ニワトリ線維芽細胞の位相差画像。Ａ３およびＢ３−ニワ
トリ線維芽細胞のＦＩＴＣ画像（陰性）。

【図５】マウスＥＳ細胞上のＭＣ−４８０抗体染色。パネルＡおよびＢは異なる２つの
培養を指す。Ａ１およびＢ１−ＥＳ細胞クラスタのＤＡＰＩ染色画像。Ａ２およ
びＢ２−マウスＥＳ細胞の位相差画像。Ａ３およびＢ３−マウスＥＳ細胞上の陽
性ＦＩＴＣシグナル。

【図６】９８日齢ＰＧＣ培養の１つの処置におけるＭＣ−４８０抗体染色。Ａ１−９８
日齢ＰＧＣクラスタのＤＡＰＩ染色画像。Ａ２−ＰＧＣクラスタの位相差画像。
Ａ３−９８日齢ＰＧＣの陽性ＦＩＴＣシグナル。

【図７】新しく採取したニワトリＰＧＣのＭＣ−４８０抗体染色。パネルＡおよびＢは
異なる２つの処置を指す。Ａ１およびＢ１−ＤＡＰＩ染色した新鮮なＰＧＣ。Ａ
２およびＢ２−ＰＧＣ上の陽性ＦＩＴＣシグナル。Ａ２において陽性ＦＩＴＣシ
グナルに対応するＤＡＰＩ染色ＰＧＣはＡ１における矢印の先を参照のこと。

【図８】ニワトリ初代培養線維芽細胞上のＭＣ−４８０抗体染色。パネルＡおよびＢは
異なる２つの培養を指す。Ａ１およびＢ１−ニワトリ線維芽細胞のＤＡＰＩ染色
画像。Ａ２およびＢ２−ニワトリ線維芽細胞の位相差画像。Ａ３およびＢ３−ニ
ワトリ線維芽細胞のＦＩＴＣ画像（陰性）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ポンスドレオン、エフ、アベルアメリカ合衆国ミネソタ、セントポール、フォルウェルアベニュー 2180 (72)発明者ロブル、ジェームズ、エムアメリカ合衆国マサチューセッツ、ベンチャータウン、オールドエンフィールドロード 196 (72)発明者スタイス、スチーブン、エルアメリカ合衆国マサチューセッツ、ベンチャータウン、アマーストロード 468 (72)発明者ジェリー、ディ、ジョセフアメリカ合衆国マサチューセッツ、シャテスベリー、ダブリュ、ペルハムロードＦターム(参考） 4B024 AA10 AA20 BA80 CA02 DA02 GA11 GA18 GA30 4B065 AA90X AA99Y AB10 AC14 AC20 BA01 BA30 BB01 BC01 BD39 BD50 CA24 CA43 CA44 CA60 4H045 AA10 EA20 FA71 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の段階を含む、トリＰＧＣおよび生殖（ＥＳ）細胞の産
生を提供する培養法：（ｉ）望ましいトリから始原生殖細胞を単離する段階；および（ｉｉ）該始原生殖細胞を、組織培養において長期間該ＰＧＣを維持するために
十分量含まれる、少なくとも下記の増殖因子を含む培養培地において、緻密な多
層様外観を呈する培養が得られるように十分に長期間培養する段階：（１）白血病阻害因子（ＬＩＦ）、（２）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、（３）幹細胞因子（ＳＣＦ）、および（４）インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）；（ｉｉｉ）その中に含まれるＥＧ細胞を同定する段階。
【請求項２】増殖因子の最小量が下記である、請求項１記載の方法：（１）ＬＩＦ（０．００６２５Ｕ／μｌ）、（２）ｂＦＧＦ（０．２５ｐｇ／μｌ）、（３）ＩＧＦ（０．５６２５ｐｇ／μｌ）、および（４）ＳＣＦ（４．０ｐｇ／μｌ）。
【請求項３】増殖因子の最大量が該最小量の約２倍〜１００倍の範囲であ
る、請求項２記載の方法。
【請求項４】トリＰＧＣがキジ（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）類のトリから得
られる、請求項１記載の方法。
【請求項５】ＰＧＣがニワトリＰＧＣまたは七面鳥ＰＧＣである、請求項
４記載の方法。
【請求項６】ＰＧＣが培養において少なくとも２５日間維持される、請求
項１記載の方法。
【請求項７】ＰＧＣが培養において２５日以上維持される、請求項６記載
の方法。
【請求項８】ＰＧＣが培養において少なくとも４ヶ月間維持される、請求
項７記載の方法。
【請求項９】トリＥＧ細胞がマウスの細胞期特異抗原１の発現、および／
またはＥＭＡ−１もしくはＭＣ−４８０モノクローナル抗体との反応性に基づい
て同定される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】細胞のＥＧ表現型が、適したトリ胚へのそのような細胞の
移入によってさらに確認される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】胚がＸ期ニワトリ胚である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】以下をさらに含む、請求項１記載の方法：（ｉｖ）得られたＥＧ細胞を望ましい核酸配列によってトランスフェクトまたは
形質転換する段階。
【請求項１３】核酸配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項１２
記載の方法。
【請求項１４】下記段階を含む、キメラのトリを産生する改善された方法
：（ｉ）トリから始原生殖細胞を単離する段階；（ｉｉ）そのようなＰＧＣを少なくとも下記の増殖因子を含む組織培養培地にお
いて、胚生殖（ＥＧ）細胞を産生するために十分な時間維持する段階；（１）白血病阻害因子（ＬＩＦ）、（２）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、（３）幹細胞因子（ＳＣＦ）、および（４）インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）；（ｉｉｉ）該ＥＧ細胞をレシピエントのトリ胚に移入する段階；および（ｉｖ）望ましいＰＧＣ表現型を有するキメラのトリを選択する段階。
【請求項１５】ＰＧＣがキジ（Ｇａｌｌｉｎａｃｅａ）類のトリ胚に由来
する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】トリ胚が七面鳥またはニワトリの胚である、請求項１５記
載の方法。
【請求項１７】ＥＧ細胞がレシピエントのトリ胚に移入される前に望まし
い核酸配列によってトランスフェクトされる、または形質転換される、請求項１
４記載の方法。
【請求項１８】核酸配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項１７
記載の方法。
【請求項１９】段階（ｉｖ）に従って産生されたキメラトリの卵、または
全身循環系、体液もしくは組織から治療的ポリペプチドを精製することをさらに
含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】ＰＧＣがレシピエントのトリ胚の背側大動脈またはレシピ
エント胚盤葉に注射される、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】請求項１記載の培養法によって得られたトリＥＧ細胞系。
【請求項２２】ニワトリまたは七面鳥ＥＧ細胞系である、請求項２１記載
の細胞系。
【請求項２３】挿入された核酸配列を含む、請求項２１記載の細胞系。
【請求項２４】Ｐ１０２８９６である、請求項２２記載の細胞系。