KR100267633B1 - 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생식선으로부터 윈시생식세포를 분리하여 배양하고, 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라조류를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 5.5일령(발생단계 27) 오골계 배자의 생식선으로부터 원시생식세포를 분리하여 배양기에서 5일간 배양한 다음, 2.5일령(발생단계 17) 화이트레그혼 배자에 주입시키고, 발생할 때까지 배양하였다. 성성숙에 이른 개체를 오골계와 인공수정으로 교배하여 후대검정을 실시한 결과, 성성숙에 도달한 닭 60마리 중 6마리가 생식선 키메라임이 확인되었다. 한편, 원시생식세포의 생식선 전이효율은 성에 상관없이 후대검정기간 5 내지 10주간에 1.3 내지 3.1%로 확인되었다. 본 발명자들은 배양된 원시생식세포가 자연적인 이동단계를 벗어났음에도 불구하고, 수용체 배자에서 수정능력을 가지고 있으며, 성세포로 분화할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명에 의하면, 조류의 원시생식세포를 배양액 중에서 배양함으로써 배양시기 동안 비교적 다량의 원시생식세포를 수집할 수 있으며, 더 나아가 배양 중에 원시생식세포의 왜래 유전자를 전이시키는 것이 가능해지므로, 배양된 조류의 원시생식세포를 이용하여 형질전환 생식선 키메라 조류를 보다 쉽게 생산할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류(germline chimeric birds)의 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생식선으로부터 원시생식세포를 분리하여 배양하고, 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류를 생산하는 방법에 관한 것이다.
원시생식세포(primordial germ cell : PGC)는 개개 종들의 모든 유전학적 정보를 포함하고 있으며, 이들 유전학적 정보는 개개 종들의 고유한 세포 및 분자적 메카니즘에 의하여 다음 세대로 전달된다. 조류의 원시생식세포는 외배엽에서 생성되어(참조 : Eyal-Giladi et al., J. Embryol. Exp. Morph., 65 ; 139-147, 1981). 생식반월(germinal crescent)의 내배엽층으로 이동한다. 정상적인 닭의 배자(embryo)에서 원시생식세포의 대부분은 혈관계를 통하여 배선세포 말단(germinal ridge)에 도달하고(참조 : Urven et al., Development, 103; 299-304, 1983), 궁극적으로 원시생식선(gonadal primordium)으로 이동하게 된다(참조 : Meyer, D. B. et al., Develop. Biol., 10; 154-190, 1964). 이동이 끝난 원시생식세포들은 수컷의 정원세포(spermatogonia) 또는 암컷의 난원세포(oogonia)로 신속히 분화한다(참조 : Nakamura et al., Anat. Rec., 222; 90-94, 1988).
한편, 원시생식세포를 수용체 배자에 전이시켜 생식선 키메라를 생산하려는 여러가지 시도가 있어왔다. 예를 들면, 배자의 혈액에서 분리한 원시생식세포를 이용한 생식선 키메라 생산에 관한 보고가 있었지만(참조 : Tajima et al., Theriogenology, 40; 509-519, 1993; Naito et al., Mol. Reprod. and Dev., 39; 153-161, 1994), 혈액으로부터는 적은 수의 원시생식세포만을 분리할 수 있으므로(참조 : Chang et al., Cell Biol. Int. Rep., 16; 853-857, 1992), 혈액 유래 원시생식세포를 배양하거나 또는 이를 이용하여 생식선 키메라를 생산한다는 것은 기술적으로 어렵다. 반면에, 배발달 중인 원시생식선으로부터는 혈액으로부터 분리할 수 있는 원시생식세포보다 많은 수의 원시생식세포를 얻을 수 있다. 또한, 생식선 유래 원시생식세포(gonadal PGC; gPGC)는 배양액 상태에서 5일 이상 성공적으로 배양이 가능하고, 손쉽게 배선세포 말단의 기저세포(germinal ridge stroma cell ; GRSC)로부터 분리할 수 있으며, 배양된 생식선 유래 원시생식세포를 2.5일령된 수용체 배자에 전이시켰을 때, 이동과 분화가 일어난다는 것이 밝혀졌다(참조 : Chang et al., Cell Biol. Int., 19; 143-149, 1995a; Chang et al., Cell Biol. Int., 19; 567-576, 1995b). 그러므로, 배양된 생식선 유래 원시생식세포를 수용체 배자에 전이시키고, 이 배자가 발생하여 성성숙에 도달하면 생식선 키메라 자손을 생산할 수 있으리라고 예상할 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 원시생식세포를 배양하고, 배양된 원시생식세포가 배발달단계에서 성세포로서 작용할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 오골계 배자로부터 원시생식세포를 분리하여 배양하는데 성공하고, 배양된 오골계 원시생식세포가 주입된 화이트레그혼 배자(WL(KNOC))를 배양하여, 성성숙에 이른 개체를 오골계와 인공수정으로 교배하여 후대검정을 실시한 결과, 성성숙에 도달한 닭의 일부가 생식선 키메라임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 5.5일령(발생단계 27) 오골계 배자의 생식선으로부터 원시생식세포를 분리하여 배양기에서 5일간 배양한 다음, 2.5일령(발생단계 17) 화이트레그혼 배자에 주입시키고, 발생할 때까지 배양하였다. 성성숙에 이른 개체를 오골계와 인공수정으로 교배하여 후대검정을 실시한 결과, 성성숙에 도달한 닭 60마리중 6마리가 생식선 키메라임이 확인되었다. 한편, 원시생식세포의 생식선 전이효율은 성에 상관없이 후대검정기간 5 내지 10주간에 1.3 내지 3.1%로 확인되었다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류를 생산하는데 있어, 화이트레그혼의 체모색 저해 유전자가 우성이며, 오골계의 체모색 저해 유전자는 열성이라는 사실에 기초하여, 원시생식세포 공여체로서 오골계 배자를, 수용체로서 화이트레그혼 배자를 각각 선택함으로써, 원시생식선 세포로 전이된 생식선 키메라를 용이하게 후대검정하고자 하였다. 오골계는 깃털, 부리, 볏, 정강이, 뼈 및 피부를 포함한 신체 대부분이 검정색인 한국 재래계로서 오골계의 표현형과 유전적 연관은 화이트레그혼과 상당히 먼 것으로 알려져 있고, 오골계와 화이트레그혼을 교배하면 자손의 깃털은 흰색을 띠게 된다. 따라서, 오골계 원시생식세포가 주입된 화이트레그혼(WL(KNOC))과 오골계를 교배시키면, 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라를 용이하게 판정할 수 있다.
본 발명자들은 5.5일령(발생단계 27상태) 오골계 배자의 생식선으로부터 원시생식세포를 분리하여, 배양기 내에서 5일간 배양하였다. 200개 정도의 배양된 원시생식세포를 2.5일령 화이트레그혼 배자의 혈관내로 주입한 다음, 발생할 때까지 배양하였으며, 발생율은 58.8%였다. 또한, 오골계와의 후대검정교배 결과, 발생 이후 성성숙에 도달한 닭 60마리 중 6마리가 생식선 키메라로 밝혀졌으며, 생식선 전이 효율은 성에 상관없이 후대검정기간 5 내지 10주간에 1.3 내지 3.1%였다.
전이된 원시생식세포의 생식선 전이효율을 개선하기 위하여 수용체 배자의 원시생식세포를 제거하거나 감소시키기 위한 여러 방법들이 개발되어 왔으며, 오노(참조 : Ono et al., Exp. Anim., 45; 347-352, 1996) 등은 배발달 단계에 영향을 끼치지 않고, 원시생식세포를 주입하기 전에 수용체 배자의 혈액을 제거함으로써 공여체 원시생식세포 유래의 자손 발생효율을 증가시킨 바 있다. 그러나, 본 발명에서는 배양된 원시생식세포를 사용하였을 때의 전이효율을 확인하는 것이 목적이므로, 전이효율에 영향을 미칠 가능성이 있는 다른 요인을 배제하기 위하여 수용체 배자의 혈액을 제거하지 않았다.
또한, 본 발명에서는 5 내지 10주간에 걸쳐 후대검정을 실시하였지만, 생식세포의 성숙기간은 개체에 따라 편차가 있으므로, 후대검정 기간을 연장함으로써 원시생식세포의 생식선 전이효율을 보다 향상시킬 수도 있다.
한편, 본 발명의 생식선 키메라 조류의 생산방법은 조류로서 하기 실시예에 예시한 오골계 등의 닭 이외에도 메추리 등 여러가지 조류에서도 적용될 수 있으며, 원시생식세포는 생식선 유래 원시생식세포 이외에도 혈액 또는 생식반월 등으로부터 분리된 원시생식세포를 이용하더라도 실행이 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 수정란 준비 및 배양
공여체 배자와 수용체 배자를 위한 수정란은 서울대학교 실험목장에서 사육된오골계(Korean native ogol chicken; KNOC)와 화이트레그혼(white leghorn; WL)으로부터 각각 확보하였다. 공여체의 수정란은 온도가 37.5℃이고 상대습도가 60-70%인 부화기에서 5.5일 동안(즉, 배발달 단계 27상태에 이를 때까지) 배양하여 사용하였다. 수용체의 수정란은 공여체 수정란과 동일한 조건에서 2.5일 동안(즉, 배발달 단계 17상태에 이를 때까지) 배양하여 사용하였다.
[실시예 2] 생식선 유래 원시생식세포의 준비 및 배양
5.5일간 배양한 수정란으로부터 난황을 제거한 배자를 추출한 다음, 마그네슘을 제외시킨 PBS(phosphate buffered saline) 완충액이 담겨진 100mm 페트리 디쉬로 옮기고, 세척하여 난황 및 혈액을 제거하였다. 전기 배자를 검은 왁스로 코팅된 60mm 페트리 디쉬에 옮겨 담고, 실체 현미경 하에서 배자의 배 부위를 제거한 다음, 신장 근처에 붙어있는 원시생식기를 떼어내었다. 떼어낸 원시생식기는 기계적으로 파쇄하거나, 트립신(0.05%(w/w))-EDTA(0.02%(w/w)를 이용하여 잘게 분순다음, 10%(w/w) FBS, 10ng/ml IGF-1(insulin-like growth factor-1), 10ng/ml bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 10unit/ml의 mLIF(murine leukemia inhibitor factor)를 첨가한 M199 배양액(Gibco BRL, MD, Gaithersberg, U.S.A.)이 담긴 96 웰 도는 24 웰 플레이트에 옮겨담고, 37℃의 5% CO2배양기에서 5일 동안 배양하였다. 그런 다음, 배선세포 말단 기저세포(GRSC)층 위에서 부유하여 자라는 특성을 지닌 원시생식세포만을 가벼운 파이펫팅으로 현탁하고, 이를 수집하여 헤마토사이토메타를 이용하여 마이크로리터 당 약 100개 정도로 농축시켰다.
[실시예 3] 배양된 원시생식세포의 수용체 배자내로의 주입
실시예 2에서 수득한 원시생식세포가 포함된 현택액을 다음과 같은 방법으로 수용체 배자의 혈관내로 주입하였다: 수용체 배자인 화이트레그혼의 수정란을 70% 알코올로 닦은 다음, 첨단부에 미세 핀셋을 이용하여 직경 20mm정도의 구멍을 배자가 상처입지 않도록 조심하여 만들었다. 이어서, 구멍을 통하여 실체현미경의 초점을 배자와 맞추고, 말단부위의 각도가 25°이며 내경이 25㎛인 미세바늘을 이용하여, 혈관내로 약 200개 정도의 원시생식세포를 주입한 다음, 수정란의 구멍을 파라핀 필름으로 2번 반복하여 밀봉하였다. 전기 수정란을 부화기로 옮기고, 첨단부가 아래로 가도록 하여 부화될 때까지 배양하였다. 이하에서는, 오골계의 원시생식세포가 주입된 화이트레그혼 배자를 편의상 'WL(KNOC)'라고 표기하기로 한다. 배양 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, 전기 원시생식세포가 주입된 수용체 배자는 원시생식세포를 주입하지 않고 동일 조건에서 배양한 대조군 배자에 비하여 부화기간 중 생존율이 급격하게 감소하지는 않았으나, 실험군의 생존율(58.8%)이 대조군의 생존율(76.3%)에 비하여 약간 낮았다(참조 : 표 1).
[표 1] 배양된 원시생식세포가 주입된 수용체 배자의 생존율 및 발생율
a) 오골계 원시생식세포가 주입된 화이트레그혼 배자(실험군)
b) 원시생식세포를 주입하지 않은 화이트레그혼 배자(대조군)
[실시예 4] 생식선 키메라 확인을 위한 후대검정
전기 WL(KNOC)중 성성숙(sexual maturity) 일령까지 생존한 개체를 오골계와 인공수정에 의해 교배하는 방법을 사용하여 후대검정하였다. 즉, 실시예 3에서 부화된 병아리(즉, WL(KNOC)) 중 수컷 34마리, 암컷 49마리가 성성숙에 도달하였는데, 그 중 암컷 36마리와 수컷 24마리(총 60마리)를 인공수정에 의해 오골계와 교배하여, 이로부터 얻은 1128마리의 자손을 약 5 내지 10주에 걸쳐 검정하였다. 이때, 검정방법은 화이트레그혼의 흰색 깃털색이 오골계의 검은 깃털색에 대하여 우성으로 작용하는 유전적 특성을 이용하여, 교배 결과 나타난 병아리들의 깃털색과 성을 기준으로 판정하였다. 즉, 검정 깃털의 자손은 그 원시생식세포가 오골계로부터 온 개체인 것으로 판정하였고, 흰 깃털의 자손은 원시생식세포가 화이트레그혼으로부터 온 개체인 것으로 판정하였으며, 부화하지 못하고 사멸한 개체도 모두 체크하여 가능하면 결과에 포함시켰다. 그 결과, 하기 표 2에서 볼 수 있듯이, 후대검정에 사용된 60마리중 6마리가 검은 깃털의 자손을 생산할 수 있는 생식선 키메라로 밝혀졌으며(참조 : 표 2), 이들 생식선 키메라로 판정된 개체는 모두 건강하였고, 성성숙도 정상이었다.
[표 2] 배양된 오골계 원시생식세포 전이에 의해 생산된 생식선 키메라
a): 오골계의 원시생식세포가 주입된 화이트레그혼 배자를 부화할 때까지 배양하여 성성숙 일령에 도달한 개체
b): 키메라 후보계(WL(KNOC))를 오골계와 교배하여 생산된 모든 자손(병아리)의 수
c): 검정 병아리는 오골계 원시생식세포로부터 유래된 키메라 자손을 의미함.
한편, 하기 표 3에서 볼 수 있듯이, 원시생식선 유래 원시생식세포의 후대전이효율은 성에 상관없이 1.3 내지 3.1% 였다(참조 : 표 3)
[표 3] 생식선 키메라 자손 발생율
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류 생산방법을 제공한다. 본 발명자들은 배양된 원시생식세포가 자연적인 이동단계를 벗어났음에도 불구하고, 수용체 배자에서 수정능력을 가지고 있으며, 성세포로 분화할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명에 의하면, 조류의 원시생식세포를 배양액 중에서 배양함으로써 배양시기 동안 비교적 다량의 원시생식세포를 수집할 수 있으며, 더 나아가 배양 중에 원시생식세포에 외래 유전자를 전이시키는 것이 가능해지므로, 배양된 조류의 원시생식세포를 이용하여 형질전환 생식선 키메라 조류를 보다 쉽게 생산할 수 있을 것이다.
Claims (3)
- (i) 조류 배자의 생식선으로부터 원시생식세포를 분리하는 단계 ;(ii) 분리한 원시생식세포를 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하는 단계 ;(iii) 배양된 원시생식세포를 수용체 배자에 주입하는 단계 ; 및(iv) 주입된 배자를 함유하는 수정란을 부화시키는 단계를 포함하는 생식선 키메라 조류를 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서,원시생식세포는 오골계(Korean Native Ogol Chicken : KNOC)로 부터 유래되고, 수용체 배자는 화이트레그혼(White Leghorn : WL)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 생식선 키메라 조류를 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서,원시생식세포는 생식선, 혈액 또는 생식반월로부터 분리된 것을 특징으로 하는 생식선 키메라 조류를 생산하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1019980006623A KR100267633B1 (ko) | 1998-02-28 | 1998-02-28 | 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류의 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1019980006623A KR100267633B1 (ko) | 1998-02-28 | 1998-02-28 | 배양된 원시생식세포로 전이된 생식선 키메라 조류의 생산방법 |
Publications (2)
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| KR19990071270A KR19990071270A (ko) | 1999-09-15 |
| KR100267633B1 true KR100267633B1 (ko) | 2000-10-16 |
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| KR (1) | KR100267633B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104770337A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-07-15 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种麻羽绿壳蛋鸡的生产方法 |
-
1998
- 1998-02-28 KR KR1019980006623A patent/KR100267633B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104770337A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-07-15 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种麻羽绿壳蛋鸡的生产方法 |
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| KR19990071270A (ko) | 1999-09-15 |
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