CZ307102B6

CZ307102B6 - Způsob produkce spermií a transgenních ptáků

Info

Publication number: CZ307102B6
Application number: CZ2016-348A
Authority: CZ
Inventors: Pavel Trefil; Jitka Mucksová; Jiří Hejnar; Jiří Kalina; Barbora Benešová
Original assignee: Biopharm, Výzkumný Ústav Biofarmacie A Veterinárních Léčiv, A.S.
Priority date: 2016-06-10
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2018-01-10
Also published as: CZ2016348A3

Abstract

Řešení se týká způsobu produkce oplozeníschopných spermií a transgenních ptáků, které je charakterizováno tím, že oplozeníschopné spermie se připraví přenosem primordiálních zárodečných buněk ptáků z raného embryonálního stádia, ještě před založením gonád, do sterilních varlat kohoutů, umožňujících tvorbu transgenních jedinců.

Description

Řešení se týká způsobu produkce ptačích oplozeníschopných spermií vyvinutých ve varleti sterilizovaného kohouta příjemce, po transplantaci donorových primordiálních zárodečných buněk drůbeže, umožňující tvorbu transgenních jedinců.

Dosavadní stav techniky

Metoda přenosu spermatogoniálních buněk z varlat jednoho jedince - dárce - do varlat druhého jedince - příjemce - byla poprvé provedena u myší (Brinster and Zimmermann, 1994)'. Autoři odebrali testikulámí buňky dárců a přenesli je do varlat sterilních příjemců. Tyto dárcovské buňky osídlily semenotvomý epitel příjemce a obnovily spermatogenezi. Výsledkem tohoto experimentu byla produkce morfologicky normálních zralých spermií dárce u třetiny experimentálních zvířat. Od té doby se transplantace samčích zárodečných buněk používá experimentálně u řady savců, zejména hlodavců (Brinster and Avarbock, 1994; Clouthier et al., 1996; Kanatsu-Shinohara et al., 2003)^{2 4}, velkých hospodářských zvířat (Honaramooz et al., 2002; Izadyar et al., 2003; Herrid et al., 2009)^{5 7}, ale i u primátů a člověka (Schlatt et al., 1999; Nagano et al., 2001; Schlatt et al., 2ΟΟ2)^8-10. Jako největší přínos lze hodnotit, když se spermatogeneze u příjemce obnoví do té míry, že dojde k produkci plně funkčních spermií a následně jsou získáni potomci s fenotypem dárce (Brinster and Avarbock, 1994; Herrid et al., 2009; Majhi et al., 2009; Song and Silversides, 2007; Trefil et al., 2006; Trefil et al., 2010)²'⁷’^11-14.

Primordiální zárodečné buňky (PGC) jsou embryonální diploidní prekurzory pohlavních buněk, které vznikají vraném embryonálním vývoji, kdy po krátkém setrvání v zárodečném terčíku embrya se uvolňují do krevního oběhu a kolonizují genitální rýhu a dávají vznik gonádám a spermatogoniálním buňkám. Transplantace PGC mezi embryi se rutinně používá v několika laboratořích. Lze transplantovat PGC i mezi různými druhy ptáků, kdy vzniklý jedinec produkuje spermie/vajíčka transplantovaného genotypu (Kang et al., 2008)¹⁵. Recentně byla popsána dlouhodobá in vitro kultivace PGC (Whyte et al., 2015)¹⁶, která umožňuje i časově náročnou selekci geneticky manipulovaných PGC. Transplantace geneticky modifikovaných PGC pak vede k tvorbě transgenních jedinců a je v současnosti jedinou reproducibilní metodou tvorby transgenních ptáků (Nakamura et al., 2013)¹⁷. Základním úskalím metody je její nízká účinnost (0,1 až 4 %), technická náročnost (mikromanipulace s embryem), vznik chimérických jedinců, kteří mají pohlavní buňky dárce a příjemce současně, a z toho vyplývající dlouhá doba stabilizace transgenu (alespoň 3 generace pro získání homozygotní formy transgenu). Transplantace PGC do varlat dospělých kohoutů byla popsána jako nefunkční (Jung et al., 2010)¹⁸.

Pro úspěšnou transplantaci spermatogoniálních kmenových buněk jsou důležité dva faktory:

První z nich je skutečnost, že příjemce by ve varlatech měl mít obsažen co nejmenší počet vlastních spermatogonií. Před samotnou transplantací je nutné zastavit proces spermatogeneze, tedy sterilizovat příjemce, což se plně a funkčně povedlo u drůbeže (Trefil et al., 2003)¹⁹. Uvedenou metodou pro sterilizaci příjemců byla varlata příjemců vystavena y^:záření opakovaně v mírných dávkách (Trefil et al., 2006; 2010; 2003)¹³'¹⁴’¹⁹. Tato metoda bezpečně sterilizuje varle kohouta, přičemž dávka radiace nemá vliv na zdraví a chování kohoutů.

Druhým důležitým faktorem pro úspěšnou transplantaci je skutečný počet kmenových spermatogoniálních buněk v suspenzi donorových buněk (Izadyar et al., 2003)⁶. Pouze kmenové spermatogoniální buňky ze směsi testikulárních buněk jsou totiž schopné obnovit spermatogenezi. U myší byly identifikovány populace zárodečných buněk na základě povrchových markérů Stra8, Dazl, GFRal (Ouland-Abdelghani et al., 1996, Bastos et al., 2005, Barocca et al., 2ΟΟ9)²⁰'²². U drůbeže

- 1 CZ 307102 B6 byla identifikace kmenových spermatogoniálních buněk provedena poměrně nedávno (Bakst et al., 2007, Mucksová et al., 2009, Mucksová et al, 2013)²³’²⁵. Mucksová et al.²⁵ transplantovali vybranou populaci GFRal spermatogoniálních buněk. Tyto dárcovské zárodečné buňky osídlily semenotvomý epitel ve varleti kohouta příjemce, obnovily spermatogenezi a bylo získáno potomstvo s fenotypem dárce. Získání spermatogoniálních buněk s sebou nese nutnost usmrcení jedince s následovným odběrem buněk. Problémem se také ukazuje nemožnost dlouhodobé kultivace těchto buněk v in vitro kulturách, což brání genetickým modifikacím těchto buněk.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky týkající se spermatogoniálních buněk odstraňuje způsob produkce spermií a transgenních ptáků podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že oplozeníschopné spermie se připraví přenosem PGC buněk ptáků z raného embryonálního stádia, ještě před založením gonád, do sterilních varlat kohoutů, umožňujících tvorbu transgenních jedinců.

Způsob podle vynálezu je charakterizován tím, že do samčích primordiálních zárodečných buněk ve stáří 24 až 96 hodin vývoje embrya se vloží požadovaná genetická informace, odpovědná za tvorbu specifických rekombinantních proteinů ve vejcích a tkáních drůbeže, kdy z nich vyvinuté spermie umožní vznik transgenních jedinců.

Způsob podle vynálezu je dále charakterizován tím, že se do primordiálních zárodečných buněk vloží pomocí homologní nebo nehomologní rekombinace, nebo pomocí virové infekce nebo pomocí lipofekce nebo elektroporace nebo kalcium fosfátovou precipitací nebo pomocí nukleázových systémů nebo pomocí transpozonů požadovaná genetická informace markerového genu mCherry gen pro zelený nebo červený fluorescenční protein nebo geny odpovědné za tvorbu specifických rekombinantních proteinů ve vejcích a tkáních drůbeže, kdy z nich vyvinuté spermie umožní vznik transgenních jedinců.

Způsob podle vynálezu je také charakterizován tím, že pomocí injekce se zavedou primordiální zárodečné buňky (PGC) do sterilních varlat. PGC buňky jsou také podstatou vynálezu a jejich podstata spočívá v tom, že se jedná o samčí primordiální zárodečné buňky ve stáří 24 až 96 hodin vývoje embrya. Tyto PGC buňky se v množství nejméně 10 a nejvíce 10⁸ v objemu nejméně 1 až 1000 mikrolitrů aplikují přímo do předem ozářených sterilních varlat kohouta příjemce, kde se z transplantovaných buněk vytvoří oplozeníschopné spermie.

Způsob podle vynálezu se týká využití PGC buněk ptáků, kdy se do ozářených varlat kohouta příjemce, popsaným Trefil et al.²⁶ (číslo PV 1999-3186 č. 289464), se nově pomocí přesné injekce přes hrudní stěnu přímo do středu varlat dospělého kohouta příjemce přenesou izolované samčí PGC. Tyto PGC oproti spermatogoniálním buňkám mohou být dlouhodobě kultivované, aniž by se narušila jejich schopnost dalšího vývoje po transplantaci do sterilního varlete ve funkční oplozeníschopnou spermii. Při jejich kultivaci pak do nich může být vložena libovolná genetická informace, což se v současné době již rutinně provádí^17,27. Po transplantaci těchto samčích PGC buněk do varlete kohouta příjemce tyto transplantované samčí PGC buňky pak kolonizují semenotvorné kanálky ozářeného kohouta příjemce, kde začnou proliferovat a jsou schopny zde dosáhnout stádia základních spermatogoniálních buněk a později se zapojit do kaskády spermiogeneze ve varleti kohouta příjemce, která vyústí v plně hodnotné spermie schopné oplození vajíčka slepice. Navíc díky předchozí sterilizaci nedojde k souběžné produkci původních spermií kohouta příjemce a vzniklé spermie jsou tak výhradně dárcovského genotypu. Při očekávané hemizygotní integraci transgenu (transgen je v genomu PGC buněk integrován v jedné kopii na jednom z páru chromozomů) jsou pak transgenní jedinci tvořeni s 50% pravděpodobností (spermie jsou haploidní, tedy jedna polovina vzniklých spermií nese transgen a druhá nikoliv), tedy cca 12 až 500x účinněji než v současnosti používané metody.

-2CZ 307102 B6

Tedy ve varleti kohouta příjemce jsou přenesené PGC buňky schopny růst a dokončit zde svůj vývoj, podstoupit redukční dělení, a vyvinout se ve funkční oplozeníschopnou spermii. Zkráceně, PGC buňky je možné libovolně transformovat, např. pomocí CRISPR technologie, kultivovat je a po přenesení do varlete kohouta příjemce, jemuž byly pomocí γ-záření odstraněny jeho vlastní zárodečné buňky, se z nich vyvine funkční oplozeníschopná spermie.

Jako první na světě uvádíme, že je možné přeskočit celou kaskádu embryonálního vývoje těchto PGC buněk a že je možné tyto PGC buňky přímo využít k produkci spermií ve sterilním varleti kohouta příjemce. Toto zjištění je zásadní a pomůže akcelerovat teoretický, ale i praktický výzkum v oblasti genetiky, transgeneze, fyziologie a vývojové biologie. Celý způsob transgeneze u ptáků transplantací primordiálnich germinálních buněk do varlat podle vynálezu trvá jen kolem 4 měsíců, což přináší značnou úsporu času a energií.

Objasnění výkresů

Na přiloženém výkresu je na Obr. 1 schématicky znázorněn celý způsob podle vynálezu.

Na Obr. 2 je zobrazen kryořez varletem ozářeného kohouta příjemce týden po transplantaci transgenními embryonálními buňkami (PGCs) exprimující reporterový gen mCherry.

Na Obr. 3 jsou snímky A, B agarozových gelů DNA, přičemž na Obr. 3 A je snímek agarozových gelů DNA zopakované odebraných spermií operovaných kohoutů příjemců. Na Obr. 3B je snímek agarozového gelu DNA z izolované tkáně kuřete č. 003/700/701.

Na Obr. 4 je fotografie hejna mCherry pozitivních kuřat spolu s kontrolním kuřetem. mCherry protein byl vizualizován pomocí přístroje Dark Reader Transilluminator (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA) s excitační vlnovou délkou 400 až 500 nm. Na transgenních kuřatech jsou dobře vidět červená zabarvení peří a svítící nohy a zobáčky, kontrolní kuře je beze změny.

Způsob podle vynálezu byl původci úspěšně odzkoušen v laboratořích přihlašovatele, kterým je BIOPHARM, Výzkumný ústav biofarmacie a veterinárních léčiv, a.s., Pohoří-Chotouň 90, 25401 Jílové u Prahy.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, ale neomezují.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Do izolovaných embryonálních buněk byl vložen pomocí transfekce gen mCherry. Čtyřem předem sterilizovaným kohoutům byly tyto modifikované PGC buňky aplikovány přímo do sterilních varlat. Za tři týdny byla u jednoho z kohoutů, který byl za tímto účelem utracen, jasně prokázána proliferační aktivita vložených PGC buněk, které vykazovaly produkci mCherry proteinu, viz. Obr. 2. Za cca 3 měsíce se u ostatních 3 kohoutů objevila produkce spermií, pouze 2 kohouti byli mCherry pozitivní. Po inseminaci spermiemi od těchto dvou kohoutů bylo získáno celkem 49 kuřat, z toho 25 kuřat bylo mCherry pozitivních (transgenních) (Obr. 4). Toto odpovídá účinnosti tvorby transgeneze 51 %, což je plně v souladu s teoretickou účinností 50 %. Přítomnost mCherry genu byla jasně prokázána pomocí:

-3 CZ 307102 B6

1. fluorescence - viz Obr. 3

2. PCR

3. sekvenováni

Podmínky detekce 286 bp dlouhého úseku DNA specifického pro mCherry pomocí PCR:

Použité primery: mCherry-Fw ACGGCGAGTTCATCTACAAG mCherry-Rv ATGGTGTAGTCCTCGTTGTG

PCR bylo provedeno v celkovém objemu 25 μΐ při použití 5U Taq DNA polymerázy, 2,5 μΐ lOx reakčního pufru, 0,4 μΐ lOmM dNTP, (vše Top-Bio), 10 pmol každého primerů, 100 ngtemplátu DNA a ultračisté vody do finálního objemu. PCR program byl zahájen 5minutovou denaturaci při teplotě 95 °C, následně 30 cyklů 95 °C 30 s, 55 °C 30 s a 72 °C 40 s, a zakončen finální extensí 5 min při 72 °C. PCR produkt byl detekován pod UV světlem na 1,5% agarózovém gelu značeném Midori Green DNA Stain (5 μΐ/ΐ 00 ml).

Výsledek sekvenováni DNA z odebraných spermií kohouta č. 795 a tkáně kuřete č. 003/700/701:

GTCCCCGCGATGCATCTAGATTATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAA

CTTGATGTTGACGTTGTAGGCGCCGGGCAGCTGCACGGGCTTCTTGGCCTTGTAGGT

GGTCTTGACCTCAGCGTCGTAGTGGCCGCCGTCCTTCAGCTTCAGCCTCTGCTTGATC

TCGCCCTTCAGGGCGCCGTCCTCGGGGTACATCCGCTCGGAGGAGGCCTCCCAGCCC

ATGGTCTTCTTCTGCATTACGGGGCCGTCGGAGGGGAAGTTGGTGCCGCGCAGCTTC

ACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTGAATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGG

CCTGCATGCAAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCA

TAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCG

GAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTG

CGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATG

AATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTC

GCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTC

AAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT

GAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTT

TTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGG

TGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTC

GTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTT

CGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAAG

TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGATCCCCCCGTTCAACCCGACCGCTGCG

CCTTATCCAGTAACTATCGTCTTG

Kontrolní gen pro mCherry:

ATGGAGGGCT CCGTGAACGG CCACGAGTTC GAGATCGAGG GCGAGGGCGA 51 GGGCCGCCCC TACGAGGGCA CCCAGACCGC CAAGCTGAAG GTGACCAAGG 101 GTGGCCCCCT GCCCTTCGCC TGGGACATCC TGTCCCCTCA GTTCATGTAC 151 GGCTCCAAGG CCTACGTGAA GCACCCCGCC GACATCCCCG ACTACTTGAA 201 GCTGTCCTTC CCCGAGGGCT TCAAGTGGGA GCGCGTGATG AACTTCGAGG 251 ACGGCGGCGT GGTGACCGTG ACCCAGGACT CCTCCCTGCA GGACGGCGAG 301 TTCATCTACA AGGTGAAGCT GCGCGGCACC AACTTCCCCT CCGACGGCCC 351 CGTAATGCAG AAGAAGACTA TGGGCTGGGA GGCCTCCTCC GAGCGGATGT 401 ACCCCGAGGA CGGCGCCCTG AAGGGCGAGA TCAAGCAGAG GCTGAAGCTG 451 AAGGACGGCG GCCACTACGA CGCTGAGGTC AAGACCACCT ACAAGGCCAA

-4CZ 307102 B6

501 GAAGCCCGTG CAGCTGCCCG GCGCCTACAA CGTCAACATC AAGTTGGACA 551 TCACCTCCCA CAACGAGGAC TACACCATCG TGGAACAGTA CGAACGCGCC 601 GAGGGCCGCC ACTCCACCGG CGGCATGGAC GAGCTGTACA AG

Shoda blastované sekvence (querry) kohouta 795 se známou sekvencí mCherry (subject) z databáze jasně prokazuje mCherry gen ve spermiích kohouta 795 a tkáni kuřete č. 003/700/701:

Score Expect Identities Gaps Strand

531bits(287) 9e-155 289/290(99%) 0/290(0%) Plus/Minus

Query 23

ATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAACTTGATGTTGACGTTGTAGGCG CCG 82

Sbjct 578

ATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAACTTGATGTTGACGTTGTAGGCG CCG 519

Query 83

GGCAGCTGCACGGGCTTCTTGGCCTTGTAGGTGGTCTTGACCTCAGCGTCGTAGTGG CCG 142 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

Sbjct

518

GGCAGCTGCACGGGCTTCTTGGCCTTGTAGGTGGTCTTGACCTCAGCGTCGTAGTGG CCG 459

Query

143

CCGTCCTTCAGCTTCAGCCTCTGCTTGATCTCGCCCTTCAGGGCGCCGTCCTCGGGGT AC 202

Sbjct

458

CCGTCCTTCAGCTTCAGCCTCTGCTTGATCTCGCCCTTCAGGGCGCCGTCCTCGGGGT AC 399

Query

203

ATCCGCTCGGAGGAGGCCTCCCAGCCCATGGTCTTCTTCTGCATTACGGGGCCGTCG GAG 262

Sbjct

398

ATCCGCTCGGAGGAGGCCTCCCAGCCCATAGTCTTCTTCTGCATTACGGGGCCGTCG GAG 339

Query

263

GGGAAGTTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTG 312

Sbjct

338

GGGAAGTTGGTGCCGCGCAGCTTCACCTTGTAGATGAACTCGCCGTCCTG 289

-5CZ 307102 B6

Shrnutí:

Ze 3 kohoutů se způsobem podle vynálezu během sledovaného období vylíhlo 25 transgenních kuřet s vykazujícím mCherry genem.

Průmyslová využitelnost

Nový způsob produkce spermií a transgenních ptáků umožňuje během 3 až 4 měsíců z ptačích oplozeníschopných spermií vyvinutých ve varleti sterilního kohouta příjemce, po transplantaci donorových pohlavních embryonálních buněk drůbeže, vytvořit transgenní jedince s vysokou účinností ve srovnání s dosud popsanými metodami. Jedná se doslova o revoluční způsob.

Seznam literatury

1. Brinster, R.L. & Zimmermann, J.W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Developmental Biology 1994; 91:11298-11302.

2. Brinster, R.L. & Avarbock, M.R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Developmental Biology 1994; 91: 11303 - 1 1307.

3. Clouthier, D.E., Avarbock, M.R., Maika, S.D,. Hammer, R.E. & Brinster, R.L. Rat spermatogenesis in mouše testis. Nátuře 1996; 381: 418-421.

4. Kanatsu-Shinohara, M., Ogonuki, M., lnoue, K. et al. Allogeneic offspring produced by male germ line stem cell transplantation into infertile mouše testis. Biology of Reproduction 2003; 68():167-173.

5. Honaramooz, A., Megee, S.O. & Dobrinski, I. Germ cell transplantation in pigs. Biology of Reproduction 2002; 66: 21-28.

6. Izadyar, F., den Ouden, K., Stout, T.A.E. et al. Autologous and homologous transplantation of bovine spermatogonial stem cells. Reproduction 2003; 126: 765-774.

7. Herrid, M., Olejnik, J., Jackson, M. et al. Irradiation enhances the efficiency of testicular germ cell transplantation in sheep. Biology of Reproduction 2009; 81: 898-905.

8. Schlatt, S., Rosiepen, G., Weinbauer, G.F., Rolf, C., Brook, P.F., Nieschlag, E. Germ cell transfer into rat, bovine, monkey and human testes. Human Reproduction 1999.

9. Nagano, M., McCarrey, J.R., Brinster, R.L. Primáte spermatogonial stem cells colonize mouše testes. Biology of Reproduction 2001; 64: 1409-1416.

10. Schlatt, S., Foppiani, L., Rolf, C., Weinbauer, G.F., Nieschlag, E. Germ cell transplantation into X-irradiated monkey testes. Human Reproduction 2002; 17: 55-62.

11. Majhi, S.K., Hattori, R.S., Yokota, M., Watanabe, S., Strussmann, C.A. Germ cell transplantation using sexually competent fish:an aproach for rapid propagation of endangered and valuable germlines. PLoS One 2009; 4: 1-8.

12. Song, Y., Silversides, F.G. Heterotopic transplantation of testes in newly hatched chickens and subsequent production of offspring via intramagnal insemination. Biology of Reproduction

-6CZ 307102 B6

2007; 76:598-603.

13. Trefil, P., Micakova, A., Mucksova, J. et al. Restoration of spermatogenesis and male fertility by transplantation of dispersed testicular cells in the chicken. Biology of Reproduction 2006; 75: 575-581.

14. Trefil, P., Bakst, M.R., Yan, H., Hejnar, J., Kalina, J., Mucksova, J. Restoration of spermatogenesis after transplantation of c-Kit positive testicular cells in the fowl. Theriogenology 2010; 74: 1670-1676.

15. Kang, S.J., Choi, J.W., Kim, S.Y., Park, K.J., Kim, T.M., Lee, Y.M., Kim, H„ Lim, J.M., Han J.Y. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biology of Reproduction 2008; 79:931-937.

16. Whyte, J., Glover, J.D., Woodcock, M., Brzeszczynska, J., Taylor, L., Sherman, A., Kaiser, P., McGrew, M.J. Stem Cell Reports2015. 5: 1171-1182.

17. Nakamura, Y., Kagami, H., Tagami, T. Development, differentiation and manipulation of chicken germ cells. Development, Growth and Differentiation 2013. 55:20-40.

18. Jung, J.G., Lee, Y.M., Kim, J.N., Kim, T.M., Shin, J.H., Kim, T.H., Lim, J.M., Han, J.Y. 2009. The reversible developmental unipotency of germ cells in chicken. Reproduction 2010. 139:113-119.

19. Trefil, P., Polák, J., Poplstein, M., Mikus, T., Kotrbová, A., RozineK, J. Preparation of fowl testes as recipient organs to germ-line chimeras by means of gamma-radiation. British Poultry Science 2003; 44:643-650.

20. Ouland-Abdelghani, M., Bouillet, P.,Decimo, D. et al. Characterization of a premeiotic germ cell-specific cytoplasmic protein encode by Stra8, a novel retinoic acid-responsive gene. Journal of Cell Biology 1996; 135(2):469-477.

21. Bastos, H., Lasalle,B., Chicheportiche, A. et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouše spermatogenesis. Cytometry 2005(1):0-49.

22. Barocca, V., Lassale, B., Coureuil, M. et al. Mouše differentiating spermatogonia can generate germinal stem cells in vivo. Nátuře Cell Biology 2009. 11(2):190-196.

23. Bakst, M. R., Akuffo, V., Trefil, P., Brillard, J. P. Morfological and histochemical characterrization of the seminiferous epithelial and Leydig cells of the turkey. Animal Reproduction Science 2007; 97 (): 303-313.

24. Mucksova, J., Brillard, J. P., Hejnar, J. et al. Identification of various testicular cell populations in pubertal and adult cockerels. Animal Reproduction Science 2009; 114(4):415-422.

25. Mucksova, J., Kalina, J., Bakst, M. et al. Expression of the chicken GDNF family receptor a-1 as a markér of spermatogonial stem cells. Animal Reproduction Science 2013; 142: 75-83.

26. Trefil, P., Kotrbová, A. PV 1999-3186 č.289464

27. Schusser, B., Collarini, E.J., Yi, H., Izquierdo, S.M., Fesler, J., Pedersen, D., Klasing, K.C., Kaspers, B., Harriman, W.D., Lavoir, M.C., Etches, R.J., Leighton, P.A. Immunoglobulin knockout chickens via efficient homologous recombination in primordial germ cells. PNAS 2013.

Claims

1. Způsob produkce spermií a transgenních ptáků, vyznačující se tím, že oplozeníschopné spermie se připraví přenosem primordiálních zárodečných buněk ptáků z raného embryonálního stádia, ještě před založením gonád, do sterilních varlat kohoutů, umožňujících tvorbu transgenních jedinců.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že do samčích primordiálních zárodečných buněk ve stáří 24 až 96 hodin vývoje embrya se vloží požadovaná genetická informace, odpovědná za tvorbu specifických rekombinantních proteinů ve vejcích a tkáních drůbeže, kdy z nich vyvinuté spermie umožní vznik transgenních jedinců.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že do primordiálních zárodečných buněk se vloží pomocí homologní nebo nehomologní rekombinace nebo pomocí virové infekce nebo pomocí lipofekce nebo elektroporace nebo kalcium fosfátovou precipitací nebo pomocí nukleázových systémů nebo pomocí transpozonů požadovaná genetická informace markerového genu mCherry nebo gen pro zelený nebo červený fluorescenční protein nebo geny odpovědné za tvorbu specifických rekombinantních proteinů ve vejcích a tkáních drůbeže, kdy z nich vyvinuté spermie umožní vznik transgenních jedinců.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že pomocí injekce se zavedou přimordiální zárodečné buňky do sterilních varlat.

3 výkresy