JP6644276B2 - 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 - Google Patents
家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6644276B2 JP6644276B2 JP2016529678A JP2016529678A JP6644276B2 JP 6644276 B2 JP6644276 B2 JP 6644276B2 JP 2016529678 A JP2016529678 A JP 2016529678A JP 2016529678 A JP2016529678 A JP 2016529678A JP 6644276 B2 JP6644276 B2 JP 6644276B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primordial germ
- poultry
- gene
- female
- germ cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 title claims description 213
- 244000144977 poultry Species 0.000 title claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 199
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 97
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 71
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 62
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 55
- 108010064983 Ovomucin Proteins 0.000 claims description 50
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 31
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 30
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 23
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 23
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 22
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 21
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 20
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 19
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 19
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 19
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 17
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 16
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 16
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 10
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 10
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 10
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 8
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 claims description 7
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 7
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 5
- 108010043846 ovoinhibitor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 230000035938 sexual maturation Effects 0.000 claims description 3
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 69
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 57
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 48
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 26
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 21
- 210000000953 male primordial germ cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 17
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 16
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 15
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 12
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 12
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 11
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 11
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 11
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 11
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 11
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 9
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 9
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 9
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 7
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 6
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 101100479681 Arabidopsis thaliana OVA5 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 5
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 5
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 4
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 4
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 4
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 3
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000754798 Calophyllum brasiliense Species 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- QNQZPJLBGRQFDD-ZMSORURPSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N QNQZPJLBGRQFDD-ZMSORURPSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 241001136800 Anas acuta Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101001053670 Gallus gallus Ovomucoid Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000271567 Struthioniformes Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 1
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001887 anti-feedant effect Effects 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 101150069823 chd gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 235000015220 hamburgers Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- -1 ovoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
Description
項1. 家禽始原生殖細胞の遺伝子をゲノム編集により改変することを特徴とする、家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
項2. 前記家禽始原生殖細胞が雌始原生殖細胞である、項1に記載の遺伝子改変方法。
項3. 前記遺伝子が卵内タンパク質遺伝子である、項1又は2に記載の遺伝子改変方法。
項4. TALEN又はCRISPRを用いたゲノム編集により遺伝子が改変される、項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子改変方法。
項5. CRISPRを用いたゲノム編集により遺伝子が改変される、項4に記載の遺伝子改変方法。
項6. 遺伝子の改変が遺伝子のノックイン、ノックアウトまたは部分欠失である、項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子改変方法。
項7. 前記遺伝子をノックインにより改変し、前記家禽始原生殖細胞に薬剤耐性遺伝子を組み込み、前記薬剤耐性遺伝子に基づき遺伝子改変された始原生殖細胞を選別することを特徴とする、項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変方法。
項8. 前記遺伝子をノックアウト又は部分欠失により改変し、前記家禽始原生殖細胞に薬剤耐性遺伝子を導入し、前記薬剤耐性遺伝子に基づき遺伝子改変された始原生殖細胞を選別することを特徴とする、項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子改変方法。
項9. 薬剤耐性遺伝子がピューロマイシン耐性遺伝子(Puror)又はゼオシン耐性遺伝子(Zeor)である、項7又は8に記載の遺伝子改変方法。
項10. ゲノム編集をプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて行う、項1〜9のいずれか1項に記載の遺伝子改変方法。
項11. プラスミドベクター又はウイルスベクターを家禽初期胚に導入して内在性の始原生殖細胞のゲノム編集を行い内在性の家禽始原生殖細胞の遺伝子改変を行う、項10に記載の遺伝子改変方法。
項12. 項1〜10のいずれかに記載の遺伝子改変方法により得られた、ゲノム編集により遺伝子改変された家禽始原生殖細胞。
項13. 雌始原生殖細胞である、項12に記載の家禽始原生殖細胞。
項14. 項1〜10のいずれかの方法により得られた遺伝子改変された家禽始原生殖細胞を家禽初期胚の胚盤葉、血液中もしくは生殖巣領域に移植して遺伝子改変キメラ個体を得る工程、このキメラ個体を性成熟して野生型個体、遺伝子改変個体或いは遺伝子改変キメラ個体と交配する工程を含む、遺伝子改変家禽の生産方法。
項15. 項11に記載の方法により遺伝子改変された内在性の家禽始原生殖細胞を含むキメラ個体を性成熟して野生型個体、遺伝子改変個体或いは他の遺伝子改変キメラ個体と交配する工程を含む、遺伝子改変家禽の生産方法。
項16. 遺伝子改変された家禽のジェノタイプが変異型ホモ(-/-)である、項14又は15に記載の方法。
項17. 遺伝子改変がオボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビターからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内タンパク質遺伝子のノックアウトである、項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
項18. 遺伝子改変が卵内タンパク質遺伝子における外来遺伝子のヘテロ又はホモのノックインであり、雌の遺伝子改変家禽の卵が外来遺伝子の発現産物を含む項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
項19. 項17に記載の方法により生産された雌の遺伝子改変家禽から得られる、オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビター、オボグロブリン、リゾチームからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内アレルゲンタンパク質が低減又は消失されたノックアウト家禽卵。
項20. 項18に記載の方法により生産された雌の遺伝子改変家禽から得られる、外来遺伝子の発現産物を含むノックイン家禽卵。
項21. 外来遺伝子がヒト由来のタンパク質をコードする遺伝子である、項20に記載のノックイン家禽卵。
項22. 外来遺伝子が抗体又はその断片、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、コラーゲン、細胞外マトリクス分子、ワクチン、アゴニスト性タンパク質、アンタゴニスト性タンパク質からなる群から選ばれる、項20又は21に記載のノックイン家禽卵。
項23. 雌始原生殖細胞の継代培養方法であって、培地の交換を常圧下もしくは低重力加速度下に行うことを特徴とする、雌始原生殖細胞の継代培養方法。
このような長期間の培養が可能になったことから遺伝子改変始原生殖細胞を移植した雌の家禽成体(雌の遺伝子改変キメラ個体)の生産が可能になった。図11Bに示すように、雄始原生殖細胞は、培地の交換時に遠心操作を加えても増殖能力が高いが、雌始原生殖細胞は培地交換のたびに遠心操作を行うとほとんど増殖せず、キメラ個体を得ることは実質的に困難であるが、培地交換時の遠心操作を抑制することで増殖能力を維持でき、キメラ個体を得ることができる。
図2、図4A、図4B、図13において、OVMTg2のPAM配列は「agg」であるが、ニワトリのオボアルブミンのOVMTg2に対応する配列はNCBIのデータベースで2種類あり、OVMTg2の配列は、TTTCCCAACGCTACAGACA(t or a)ggと表記し得る。本発明は、このような多型を全て包含する。
(1)ニワトリ雄始原生殖細胞を用いたゲノム編集
(1−1)オボアルブミン(OVA)、オボムコイド(OVM)ノックアウトのための遺伝子構築
ニワトリ雄始原生殖細胞株を用い、オボアルブミンならびにオボムコイド遺伝子を標的としてCRISPR法により遺伝子破壊を行った。図1(オボアルブミン)、図2(オボムコイド)に示すようにそれぞれ2箇所(OVATg1、OVATg3)、4箇所(OVMTg2、OVMTg3、OVMTg5、OVMTg6)の標的部位の破壊を試みた。
(1−2−1)一過的薬剤選択による変異導入の効率化
横斑プリマスロック雄胚血液中より採取し、株化したニワトリ雄始原生殖細胞(非特許文献3)に上述の遺伝子(プラスミド)を一過的に導入した。1×105〜5×105個の雄始原生殖細胞株をPBSで洗浄し、OPTI-MEMに懸濁後、3μlのリポフェクタミン2000(Life Technologies, 米国)を用いて1.6μgのpx330-Puror-OVATg3を遺伝子導入した。具体的には、リポフェクタミン2000とプラスミドを80μl OPTI-MEM中で混合し、雄始原生殖細胞株と混合後室温で5分程度静置し、その後抗生物質を含まない培地を500μl添加し、37℃で1〜4時間程度静置した上でフィーダー細胞上に播種した。遺伝子導入後2〜4日の間、ピューロマイシン(InvivoGen,米国)を終濃度1μg/mlで添加し、これを洗浄除去した後に1〜2週間の培養を行った。培養後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出後、配列番号21,配列番号22で示されるオリゴDNAプライマーを用いたPCR法によりオボアルブミン遺伝子の一部領域を増幅し、TAベクター(pGEM-T Easy, Promega, 米国)にサブクローンし、配列番号5(OVATg3)を含む領域のゲノム塩基配列を解析した。解析した12クローン中12クローン全て(100%)においてオボアルブミン遺伝子の配列番号5(OVATg3)を含む領域で遺伝子の欠失が認められた。一方、対照群として薬剤選択を行わなかったものの遺伝子欠損は45クローン中3個のクローン(6.7%)にとどまった。これら変異の多くは翻訳時のフレームシフトを含んでいた。また、px330-Zeor-OVATg3を同様に遺伝子導入し、遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度50μg/mlのゼオシン(InvivoGen,米国)存在下で培養し、洗浄後、1〜2週間の培養を行った細胞を用いて同様の遺伝子解析を行った結果、解析した12クローン中11クローン(92%)において遺伝子の欠失が認められた。OVATg3を含む領域に認められた遺伝子変異の例を図3に示す。
オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点を含む領域を標的としたpx330-Neor-OVATg1を上述の方法によりニワトリ始原生殖細胞に遺伝子導入後、導入後2〜4日の間ネオマイシン(G418二硫酸塩、ナカライテスク、日本)終濃度0.5mg/mlで選択し、1−2−1と同様の手法で標的領域を含むゲノム塩基配列を解析した。図3に示すように開始コドンの欠失、置換を含む変異を確認した。
(1-2-1)に記載した要領で横斑プリマスロック種始原生殖細胞にpx330-Puror-OVMTg2を遺伝子導入し、薬剤選択した細胞を培養し、白色レグホン種2.5日胚(レシピエント胚)の血液中に顕微注射により移植を行った。移植に先立ち、レシピエント胚内在性の始原生殖細胞数を減少させる目的で孵卵操作前の受精卵に電離放射線を5Gyまたは6Gy照射した。電離放射線照射はガンマセル40(カナダ原子力公社)を用いたガンマ線照射により行った。
(1)オボアルブミン遺伝子座への遺伝子ノックイン
雄ニワトリ由来始原生殖細胞を用いてゲノム編集による遺伝子ノックインを行った。オボアルブミン遺伝子の翻訳開始点に外来遺伝子(EGFP)を挿入することを目的とし、配列番号25に示されるドナーコンストラクト(EGFPドナーコンストラクト)を作製した。このEGFPドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、EGFP遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)(Stratagene,米国 現Agilent technologies)に挿入しpBS-EGFPドナーとした。 実施例1と同様に1×105〜5×105個の始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS-EGFPドナーを0.8μg同時に遺伝子導入し、導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。適宜培地交換を行い、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で増殖する細胞を回収し、ゲノムDNAを調製した。
次に、薬剤選択された細胞群にどの程度の割合でドナーコンストラクトがオボアルブミン遺伝子座にノックインされた細胞が存在するか検定した。薬剤選択された細胞群と遺伝子導入を行なっていない始原生殖細胞(対照PGCs)よりゲノムDNAをそれぞれ調製した。これを鋳型として配列番号34と配列番号35で示されるプライマーによる定量PCR(OVA5’)、配列番号34と配列番号36で示されるプライマーによる定量PCR(OVA(ATG))、配列番号37と配列番号38で示されるプライマーによる定量PCR(GAPDH(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ))を行った。反応はTHUNDERBIRD qPCR Mix(東洋紡、日本)を使用し7300 Real Time PCR system (Applied Biosystems、米国)により解析した。図6に模式的に示すようにOVA5’のPCR産物はノックインされていないオボアルブミン遺伝子、ランダムに挿入されたドナーコンストラクト、ノックインされたドナーコンストラクトのいずれをも鋳型として増幅されうる。一方、OVA(ATG)のPCR産物はノックインされていないオボアルブミン遺伝子のみを鋳型とし、ランダムに挿入されたドナーコンストラクト、ノックインされたドナーコンストラクトを鋳型とした増幅は長い増幅領域のため、殆ど起こらない。GAPDHはゲノム量の内部標準として用いた。内部標準による補正を行った定量PCRの結果をグラフ化したものを図6に示す。OVA5’のPCR産物が薬剤選択された細胞群ゲノムと対照の始原生殖細胞ゲノムにおいて有意差が無いのに対し、OVA(ATG)のPCR産物は薬剤選択された細胞群ゲノムにおいて対照の十分の一以下となっている。OVA5’のPCR産物に有意差が無いことは、ドナーコンストラクトのノックイン以外のランダムな挿入が検出限界以下であることを示している。一方、OVA(ATG)のPCR産物が薬剤選択された細胞群ゲノムにおいて対照の十分の一以下となったことは、このゲノムのオボアルブミン遺伝子の9割以上でドナーコンストラクトがノックインされていることを示している。すなわち、薬剤選択された始原生殖細胞群において90%以上のオボアルブミン遺伝子がノックインコンストラクトによって置き換えられていると判断される。
ヒトインターフェロン遺伝子ノックイン
(1)始原生殖細胞樹立へのノックインとノックインキメラニワトリの樹立
上記実施例2のEGFPドナーコンストラクトのEGFPの代わりに配列番号39に示されるヒトインターフェロンβ遺伝子を導入したドナーコンストラクト(IFNβドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-IFNβドナーとした。 上記pBS-EGFPドナーと同様の手法により雄ニワトリ始原生殖細胞にノックイン後ピューロマイシンで選択し、選択された細胞のゲノムを鋳型としてPCRを行なった。5’側は配列番号27のプライマーと配列番号40に示されるインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーによるPCRの後、増幅産物に対して配列番号29のプライマーと配列番号41に示すインターフェロンβに対するアンチセンスプライマーを用いてPCRを行った(nested PCR)。3’側は上記EGFPドナーのノックイン時と同様に配列番号30と配列番号31に示すプライマーを用いたPCRの後、増幅産物に対して配列番号32と配列番号33に示すプライマーを用いてnested PCRを行った。図7Aに示すように、EGFPドナーと同様IFNβドナーを用いた場合でも始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子へのノックインが認められた。また、ノックイン効率の検定を実施例2−(2)と同様の定量PCRによって行った結果、85%以上のオボアルブミン遺伝子がIFNβドナーコンストラクトによって置き換えられていると判断される。
遺伝子ノックインの効率改善について検討を行った。まず、上述のインターフェロンβドナーコンストラクトの薬剤耐性ユニットをPGK-PurorからSV40Pe-Neor(配列番号125 )に置換したIFNβ-Neoドナーコンストラクトを作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kb、ヒトインターフェロンβ遺伝子、薬剤耐性遺伝子ユニット(SV40Pe-Neor)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成される。このドナーコンストラクトをプラスミドpBlue ScriptII(SK+)に挿入しpBS-IFNβ-Neoドナーとした。次に、px330-Neor-OVATg1のネオマイシン耐性ユニットを配列番号8のピューロマイシン耐性ユニットに置き換えたプラスミドpx330-Puror-OVATg1を構築した。また、図8Aに示すようにOVATg1と一部重なるオボアルブミンの標的配列OVATg2(配列番号126)を標的とし、CRISPR用プラスミドを構築した。配列番号127と配列番号128でそれぞれ示されるオリゴDNAを合成し、実施例1-1と同様にリン酸化後、アニールし、DNA断片をpx330のBbsI切断部位に挿入するとともに、NotI部位に配列番号8のピューロマイシン耐性ユニットを挿入したプラスミドpx330-Puror-OVATg2を構築した。約5×105個の始原生殖細胞株を調製し、3分割した後に、実施例2-(1)と同様にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβドナー(ピューロマイシン耐性遺伝子ユニットを持つ)を0.8μg(導入群1)もしくはpx330-Puror-OVATg1を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群2)もしくはpx330-Puror-OVATg2を0.8μg、pBS-IFNβ-Neoドナーを0.8μg(導入群3)それぞれ同時に遺伝子導入し、(導入群1)は実施例3-(1)同様導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。一方、(導入群2)と(導入群3)は実施例(1-2-1)と同様に遺伝子導入後2〜4日の間、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で培養し、洗浄後、終濃度0.5 mg/mlのネオマイシンを添加し培養を行った。導入後24日後に各導入群の細胞数をそれぞれ計測した所、導入群1の2×104に対し、導入群2と3では1×105の薬剤耐性細胞が認められた。また、それぞれの群より細胞を回収し、ゲノムDNAを調製後、実施例3-(1)と同様に配列番号30と配列番号31のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号27と配列番号40のプライマー(オボアルブミン遺伝子にノックインされたインターフェロンの3’側を増幅)、配列番号27と配列番号36のプライマー(ノックインされていないオボアルブミンを増幅)を用いてそれぞれPCRを行った(図8B)。導入群1と2との間でPCRシグナル強度比の大きな違いを認めないことから、導入群2のピューロマイシンで短期間選択後、ネオマイシン選択する方法のほうが迅速に目的細胞を調製可能と考えられる。また、導入群3は導入群2と比較してノックインされていないオボアルブミンが殆ど認められないことから、より効率の良いノックインが起こっていると考えられる。以上より、OVATg2配列を標的とし、CRISPRコンストラクトにピューロマイシン耐性遺伝子をドナーコンストラクトにネオマイシン耐性遺伝子をそれぞれ挿入し、始原生殖細胞に導入後一過的にピューロマイシンで選択し、その後ネオマイシンで選択を行うことで迅速かつ高効率に外来遺伝子のオボアルブミン遺伝子座へのノックインが可能になると考えられる。
ヒト抗体遺伝子ノックイン
上記実施例2のEGFPドナーコンストラクトのEGFPの代わりに配列番号42に示されるヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(免疫グロブリンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン重鎖、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることで免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなる抗体タンパク質を発現する。
ヒトコラーゲン遺伝子ノックイン
上記実施例2のEGFPドナーコンストラクトのEGFPの代わりに配列番号45に示されるヒトI型コラーゲン遺伝子を導入したドナーコンストラクト(コラーゲンドナーコンストラクト)を作製した。このドナーコンストラクトはオボアルブミン翻訳開始点の5’側約2.8kbの下流に卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトI型コラーゲンα1鎖(COLLAGEN1A1)、furinタンパク質切断標的配列、2A自己プロセッシング性ペプチド、卵白リゾチームシグナルペプチド、ヒトI型コラーゲンα2鎖(COLLAGEN1A2)遺伝子をそれぞれコードする遺伝子を連結して配置し、薬剤耐性遺伝子ユニット(PGK-Puror)、オボアルブミン翻訳開始点の3’側約3.0kbから構成されている。このドナーコンストラクトが転写、翻訳されることでヒトI型コラーゲンα1鎖とα2鎖からなるI型コラーゲンタンパク質を発現する。
雌始原生殖細胞の培養
ハイラインマリア種ニワトリ2〜3日胚血液中からの始原生殖細胞の単離と培養は非特許文献3に準拠して行った。性別の判定はCHD(chromo-helicase-DNA binding protein)遺伝子に対する配列番号46と配列番号47で示されるプライマーを用い、採血したニワトリ胚細胞由来ゲノムを鋳型としたPCRにより決定した。
培養した雌始原生殖細胞由来ニワトリ後代の樹立
実施例6に記載の方法により雌始原生殖細胞を172日培養した後に、2000個を実施例(1-3)と同様の方法で横斑プリマスロック種2.5日胚(レシピエント胚)の血液中に顕微注射により移植を行った。移植に先立ち、6Gyのガンマ線照射を行った。この個体(雌キメラヒヨコ)を孵化させ、性成熟後、横斑プリマスロック種野生型と交配した。移植細胞由来後代はハイラインマリア種の白色毛(優勢遺伝)により、黒色毛のレシピエント由来後代と区別がつくが、図12Aに示すようにドナー細胞由来の個体が得られ、上記培養法により雌始原生殖細胞の配偶子分化能を保持した長期培養が可能なことが示された。
雌始原生殖細胞の遺伝子操作
更に、本培養法で長期培養を可能にしたことで、雌始原生殖細胞に安定的な外来遺伝子導入ができるか否かを検証した。配列番号48で示されるEGFP、ネオマイシン耐性遺伝子ユニットから成る配列をトランスポゾン特異性末端逆位配列を有するベクターpB530A-2(System Bioscience, 米国)のEF1αプロモーター下流のEcoRI-EcoRV部位に挿入した(pB530-EGFP-Neor)。上述と同様、1×105〜5×105個の雌始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いて0.8μgのpB530-EGFP-NeorとPiggyBacポトランスポザーゼ発現ベクターであるpB200PA-1(System Bioscience, 米国) 0.8μgを同時に遺伝子導入した。遺伝子導入後3日以降、ネオマイシンを終濃度0.5mg/mlで添加し、培養を行った。ネオマイシン存在下で増殖する始原生殖細胞は図12Bに示すように緑色蛍光を発し、雌始原生殖細胞に安定的に外来遺伝子が導入され、発現することが示された。
雌始原生殖細胞のオボアルブミン、オボムコイドノックアウト
雌始原生殖細胞でゲノム編集操作によるノックアウトが可能となれば、ノックアウト雌始原生殖細胞を移植した雌キメラ個体(G0)を樹立可能となり、ノックアウト雄始原生殖細胞を移植した雄キメラ個体(G0)と交配することで後代(F1世代)にホモノックアウト個体を樹立可能になる。このことは従来の技術より1世代早くノックアウト個体が樹立可能なことを意味しており、研究にかかる期間や費用を大幅に低減できるなど利点が多い。そこで、雌始原生殖細胞を用いてアレルゲン遺伝子のノックアウトを試みた。
雌始原生殖細胞のオボアルブミン遺伝子座への遺伝子ノックイン
雌始原生殖細胞を用いて、雄始原生殖細胞のようなゲノム編集による遺伝子ノックインの可否を検討した。上述と同様に、1×105〜5×105個の雌始原生殖細胞株にリポフェクタミン2000を用いてpx330-Neor-OVATg1を0.8μg、pBS-EGFPドナーを0.8μg、同時に遺伝子導入し、導入後3日以降、ピューロマイシンを終濃度1μg/mlで添加した。適宜培地交換を行い、終濃度1μg/mlのピューロマイシン存在下で増殖する細胞を回収し、ゲノムDNAを調製後、Nested PCRを行い、EGFPドナーコンストラクトのオボアルブミン遺伝子座へのノックインを確認した(図14)。雌始原生殖細胞においてもゲノム編集による遺伝子ノックインは可能である。また、実施例2-(2)、3-(1)、4、5で行った雄始原生殖細胞のノックイン効率の検定と同様の定量PCRを行った結果、約80%以上のオボアルブミン遺伝子がEGFPドナーコンストラクトによって置き換えられていると判断された。
雌始原生殖細胞のヒトインターフェロン遺伝子ノックイン
雌始原生殖細胞を用いて、実施例3-(1)で行った雄始原生殖細胞と同様にゲノム編集によりIFNβドナーコンストラクトの遺伝子ノックインを行った。実施例3-(1)と同様の手法により雌ニワトリ始原生殖細胞に遺伝子ノックイン後ピューロマイシンで選択し、選択された細胞のゲノムを鋳型としてPCRをNested PCRを行い、IFNβドナーコンストラクトのオボアルブミン遺伝子座へのノックインを確認した(図15)。
Claims (21)
- 家禽の雌始原生殖細胞を培地の交換を常圧下もしくは300g未満の重力加速度を加えて行う継代培養により培養する工程、及び
培養した家禽の雌始原生殖細胞を遺伝子操作技術により改変する工程を含む、家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。 - 前記家禽の雌始原生殖細胞が、胚血液中より採取した家禽の雌始原生殖細胞である、請求項1に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記培養が、家禽の雌始原生殖細胞の配偶子分化能を保持した培養である、請求項1又は2に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記培養を、100日を超えて行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記遺伝子が卵内タンパク質遺伝子である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記遺伝子操作技術がゲノム編集である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- TALEN又はCRISPRを用いたゲノム編集により遺伝子が改変される、請求項6に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- CRISPRを用いたゲノム編集により遺伝子が改変される、請求項7に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 遺伝子の改変が遺伝子のノックイン、ノックアウトまたは部分欠失である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記遺伝子をノックインにより改変し、前記家禽始原生殖細胞に薬剤耐性遺伝子を組み込み、前記薬剤耐性遺伝子に基づき遺伝子改変された始原生殖細胞を選別することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 前記遺伝子をノックアウト又は部分欠失により改変し、前記家禽始原生殖細胞に薬剤耐性遺伝子を導入し、前記薬剤耐性遺伝子に基づき遺伝子改変された始原生殖細胞を選別することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 薬剤耐性遺伝子がピューロマイシン耐性遺伝子(Puror)又はゼオシン耐性遺伝子(Zeor)である、請求項10又は11に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- ゲノム編集をプラスミドベクター又はウイルスベクターを用いて行う、請求項1〜12のいずれか1項に記載の家禽の雌始原生殖細胞の遺伝子改変方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の遺伝子改変方法により得られた、遺伝子操作技術により遺伝子改変された家禽の雌始原生殖細胞であって、
前記遺伝子改変が
(i)オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビターからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内タンパク質遺伝子のノックアウト、又は
(ii)オボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビターからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内タンパク質遺伝子遺伝子における、抗体若しくはその断片、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、コラーゲン、細胞外マトリクス分子、ワクチン、アゴニスト性タンパク質、及びアンタゴニスト性タンパク質からなる群から選ばれる外来遺伝子のノックイン
である、家禽の雌始原生殖細胞。 - 請求項1〜13のいずれかの方法により得られた遺伝子改変された家禽の雌始原生殖細胞を家禽初期胚の胚盤葉、血液中もしくは生殖巣領域に移植して遺伝子改変キメラ個体を得る工程を含む、遺伝子改変家禽のキメラ雌個体の生産方法。
- 請求項1〜13のいずれかの方法により得られた遺伝子改変された家禽の雌始原生殖細胞を家禽初期胚の胚盤葉、血液中もしくは生殖巣領域に移植して遺伝子改変キメラ雌個体を得る工程、このキメラ雌個体を性成熟して野生型雄個体、遺伝子改変雄個体或いは遺伝子改変キメラ雄個体と交配する工程を含む、変異型ホモ又は変異型ヘテロの遺伝子改変家禽の生産方法。
- 遺伝子改変された家禽のジェノタイプが変異型ホモ(-/-)である、請求項16に記載の遺伝子改変家禽の生産方法。
- 遺伝子改変がオボアルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビターからなる群から選ばれる少なくとも1種の卵内タンパク質遺伝子のノックアウトである、請求項16又は17のいずれか1項に記載の遺伝子改変家禽の生産方法。
- 遺伝子改変が卵内タンパク質遺伝子における外来遺伝子のヘテロ又はホモのノックインであり、雌の遺伝子改変家禽の卵が外来遺伝子の発現産物を含む請求項16又は17のいずれか1項に記載の遺伝子改変家禽の生産方法。
- 外来遺伝子がヒト由来のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項19に記載の遺伝子改変家禽の生産方法。
- 外来遺伝子が抗体又はその断片、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターフェロン、コラーゲン、細胞外マトリクス分子、ワクチン、アゴニスト性タンパク質、アンタゴニスト性タンパク質からなる群から選ばれる、請求項19又は20に記載の遺伝子改変家禽の生産方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014132007 | 2014-06-27 | ||
JP2014132007 | 2014-06-27 | ||
PCT/JP2015/068523 WO2015199225A1 (ja) | 2014-06-27 | 2015-06-26 | 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015199225A1 JPWO2015199225A1 (ja) | 2017-04-27 |
JP6644276B2 true JP6644276B2 (ja) | 2020-02-12 |
Family
ID=54938302
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016529678A Active JP6644276B2 (ja) | 2014-06-27 | 2015-06-26 | 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6644276B2 (ja) |
WO (1) | WO2015199225A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020078346A (ja) * | 2015-12-25 | 2020-05-28 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 遺伝子改変家禽卵 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180242562A1 (en) * | 2015-08-27 | 2018-08-30 | Hiroshima University | Birds, method for producing birds, and bird eggs |
KR20200088805A (ko) * | 2017-09-19 | 2020-07-23 | 더 스테이트 오브 이스라엘, 미니스트리 오브 애그리컬처 & 루럴 디벨로프먼트, 애그리컬처럴 리서치 오거니제이션, (에이.알.오.), 볼카니 센터 | 게놈-편집 조류 |
EP3599465A1 (en) * | 2018-07-24 | 2020-01-29 | Tronico | Method for determining a specific characteristic of an embryo in an unhatched egg |
JP7325795B2 (ja) * | 2018-11-27 | 2023-08-15 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 遺伝子改変鳥類の作出方法および遺伝子改変鳥類 |
CN113913468B (zh) * | 2020-07-10 | 2023-09-29 | 北京大学 | 一种蜘蛛的基因编辑方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100502889B1 (ko) * | 2003-04-21 | 2005-07-20 | 한미약품(주) | 조류 원시생식세포의 생식선 전이 효율의 개선방법 |
-
2015
- 2015-06-26 JP JP2016529678A patent/JP6644276B2/ja active Active
- 2015-06-26 WO PCT/JP2015/068523 patent/WO2015199225A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020078346A (ja) * | 2015-12-25 | 2020-05-28 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 遺伝子改変家禽卵 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015199225A1 (ja) | 2015-12-30 |
JPWO2015199225A1 (ja) | 2017-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6644276B2 (ja) | 家禽始原生殖細胞の遺伝子改変方法、遺伝子改変された家禽始原生殖細胞、遺伝子改変家禽の生産方法及び家禽卵 | |
JP6004290B2 (ja) | 不活化された内因性遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリ | |
EP3331355A1 (en) | Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes | |
JP6923232B2 (ja) | 遺伝子改変家禽卵 | |
US20170223938A1 (en) | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus | |
AU2012258786B2 (en) | Transgenic chicken comprising an inactivated immunoglobulin gene | |
JP2019505175A (ja) | 鳥の未孵化卵内の胚の性別決定法及びその手段 | |
CN108697067A (zh) | 嵌合胚胎-辅助的器官制备的组合物和方法 | |
JP2021166551A (ja) | 鳥類および卵 | |
US20240052304A1 (en) | Sterile avian embryos, production and uses thereof | |
JP7426120B2 (ja) | ノックイン細胞の作製方法 | |
CN108882696A (zh) | 通过遗传互补对人源化肾脏的工程改造 | |
Doran et al. | Genome editing in poultry-opportunities and impacts | |
CN106978416A (zh) | 一种基因定位整合表达系统及其应用 | |
WO2024003907A1 (en) | Totally sterile population of avian embryos, production and uses thereof | |
Wells | Conference XI | |
CA3217797A1 (en) | Birds for producing female hatchling and methods of producing same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180405 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180424 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180625 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190417 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190611 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190815 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191203 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191217 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6644276 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |