JP7325795B2 - 遺伝子改変鳥類の作出方法および遺伝子改変鳥類 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子が改変された鳥類の作出方法および当該方法により作出された遺伝子が改変された鳥類に関する。

これまでに、抗体を含む医療用タンパク質や酵素等の多くの種類の有用タンパク質が遺伝子改変された細菌や遺伝子改変された哺乳類細胞で生産される例が知られている。また、ニワトリ等の遺伝子改変動物個体における有用タンパク質生産の例も多く報告されている（特許文献１，２等）。

特許文献１には、内因性オバルブミン遺伝子にヒトインターフェロンβ構造遺伝子がノックインされたニワトリ始原生殖細胞（Primordial germ cells、以下「ＰＧＣ」という。）を作出し、ついで、当該ＰＧＣをレシピエント胚に移植することにより、当該ＰＧＣ由来の遺伝子改変ニワトリを作出したことが開示されている。また、特許文献２には、この遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する卵の卵白中にヒトインターフェロンβが高濃度（約５ｍｇ／ｍｌ）で含まれることが開示されている。当該遺伝子改変ニワトリの卵白における外因性タンパク質の量は、従来の諸研究において作出された遺伝子改変鳥類の卵白における外来タンパク質の量と比較して高いものであり、ニワトリを含む鳥類が、有用タンパク質の効率的な生産系として広く実用化される可能性を示すものである。

国際公開第２０１５／１９９２２５号 国際公開第２０１７／１１１１４４号

しかし、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子がヘテロにノックインされた遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵からは産子が通常の孵卵条件下で孵化しなかった。

そこで、本発明は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることを可能とする遺伝子改変鳥類の作出方法および当該方法により作出された遺伝子改変鳥類を提供することを目的とする。

本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を、発生初期は、他の卵由来の第１の代理卵殻内において卵殻と接触させた状態で人工培養する工程と、発生後期は、前記第１の代理卵殻内で前記卵白組成物の一部を取り除いて又は前記第１の代理卵殻の内容物を第２の代理卵殻に移して、前記胚が空気と接触するようにして前記胚由来の産子が孵化するまで保温する工程とを有し、前記第１の代理卵殻内で人工培養する工程では、前記受精卵の胚及び卵黄のみを前記第１の代理卵殻に移すと共に、前記第１の代理卵殻内を他の卵から採取された卵白を用いて調製された前記卵黄よりも比重が大きい卵白組成物で満たして密封し、前記胚が前記卵殻に接触するようにして保温する。
前記卵白組成物には、例えば、野生型鳥類の未受精卵若しくは受精卵から採取された水様性卵白、又は、該野生型鳥類由来の水様性卵白と前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵した未受精卵若しくは受精卵から採取された濃厚卵白及び水様性卵白を超音波処理して得た組成物との混合物を用いることができる。
本発明に係る遺伝子改変鳥類の他の作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を、発生初期は、他の卵由来の第１の代理卵殻内において卵殻と接触させた状態で人工培養する工程を有し、該第１の代理卵殻内で人工培養する工程では、前記受精卵の胚及び卵黄のみを前記第１の代理卵殻に移すと共に、前記第１の代理卵殻内を他の卵から採取された卵白を用いて調製された前記卵黄よりも比重が大きい卵白組成物で満たして密封し、前記胚が前記卵殻に接触するようにして保温すると共に、前記卵白組成物として、野生型鳥類の未受精卵若しくは受精卵から採取された水様性卵白、又は、該野生型鳥類由来の水様性卵白と前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵した未受精卵若しくは受精卵から採取された濃厚卵白及び水様性卵白を超音波処理して得た組成物との混合物を用いる。
本発明の遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への第１の外因性構造遺伝子のヘテロ又はホモのノックインである場合に適用することができる。その場合、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のホモのノックインであってもよい。
又は、本発明の遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロ又はホモのノックアウトである場合に適用することができる。その場合、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロのノックアウトであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のホモのノックアウトであってもよい。
又は、本発明の遺伝子改変鳥類の作出方法は、例えば、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入である場合に適用することができる。その場合、前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入であり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入であってもよい。
前記第１～３の内因性卵白タンパク質遺伝子は、例えば、それぞれ、オバルブミン遺伝子、オボムコイド遺伝子、オボムチン遺伝子、オボトランスフェリン遺伝子、オボインヒビター遺伝子又はリゾチーム遺伝子のいずれかであり、又は、前記第１～３の内因性卵白タンパク質遺伝子は、例えば、オバルブミン遺伝子である。
また、前記遺伝子改変鳥類は、例えばニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウである。

本発明の遺伝子改変鳥類の作出方法は、遺伝子改変がヘテロになされている遺伝子改変鳥類の受精卵から、遺伝子改変がホモの遺伝子改変鳥類を作出することができる。

（定義）
本発明において、「遺伝子改変鳥類」とは、遺伝子改変前の鳥類（たとえば、野生型鳥類）が有するゲノムの塩基配列に対して意図的に変異が導入された塩基配列を有するゲノムを持つ細胞から構成される鳥類を意味する。

また、「鳥類胚の人工培養」とは、受精卵中の鳥類胚を、通常の孵卵条件下で培養するのではなく、受精卵およびその胚に対して何らかの人工的な変更を加えた条件で培養することを意味する。人工培養には、後に詳しく述べるように、胚を含む卵黄を本来の卵殻から取り出して別の卵殻や人工培養容器内で培養することが含まれる。

本発明によれば、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることが可能となる。

本発明の第１の実施形態に係る作出方法を示すフローチャートである。 図１に示す工程Ａにおける人工培養方法を模式的に示す図である。 図１に示す工程Ｂにおける人工培養方法を模式的に示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る作出方法を示すフローチャートである。 図４に示す工程Ｄにおける人工培養方法を模式的に示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る作出方法を示すフローチャートである。 図６に示す工程Ｆにおける人工培養方法を模式的に示す図である。

以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。

本発明者は、前述の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、以下の知見を得た。特許文献１および２に記載されているヒトインターフェロンβ構造遺伝子がヘテロにノックインされた遺伝子改変ニワトリの場合、メスが産卵する卵から産子が孵化しない理由としては、当該受精卵中の卵白の組成が野生型ニワトリのメスが産卵する受精卵中の卵白の組成と異なっていることが考えられる。

一般に、遺伝子改変鳥類の卵白中に外因性構造遺伝子の遺伝子産物を効率よく生産した場合には、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵白の組成は大きく変化する。当該受精卵中の卵白の組成は、当該遺伝子改変鳥類のメスの遺伝子型によって決まるからである。その結果、受精卵中の胚の発生が阻害され胚由来の産子が孵化しない場合が多くあることが推測される。外因性構造遺伝子が内因性タンパク質遺伝子にノックインされた遺伝子改変鳥類の場合だけでなく、ゲノムに非特異的に挿入された外因性構造遺伝子がコードするタンパク質が卵管特異的に発現するような遺伝子改変鳥類の場合も同様の問題がある。

また、鳥類の内因性卵白タンパク質の産生を抑えることによって卵白中に生産される外因性タンパク質の純度を上げるためや、アレルゲンでもある内因性卵白タンパク質を有さない点でより安全な卵を得ることを目指して、内因性卵白タンパク質遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変鳥類の作出が複数行われている。このような卵白タンパク質遺伝子ノックアウト鳥類の場合にも、当該遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵白の組成は野生型鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵白の組成と大きく異なることから、それが原因となって、当該受精卵中の胚に由来する個体が孵化しない場合があることが予測される。

外因性構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変鳥類の場合、外因性構造遺伝子がコードするタンパク質の効率的生産の観点から、外因性構造遺伝子がホモにノックインされた遺伝子改変鳥類が得られることが望ましい。遺伝子改変が、内因性卵白タンパク質遺伝子のノックアウトである場合、また、外因性構造遺伝子の非特異的な挿入である場合にも、それぞれの遺伝子改変によって意図された形質を有する鳥類又は鳥類の卵をより効率的に得るためには、当該遺伝子改変がホモになされている鳥類を作出することが望ましい。

遺伝子改変がホモになされている遺伝子改変鳥類を得るためには、遺伝子改変がヘテロになされている遺伝子改変鳥類のオスとメスとを交配してその産子を得ることが必要である。また、そのためには、遺伝子改変がヘテロになされている遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵からの産子が得られることが必要である。したがって、遺伝子改変の結果、受精卵中の卵白の組成が野生型鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵白の組成と異なっており、その結果、通常の孵卵条件下では当該受精卵中の胚由来の産子が得られないような遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得る方法が求められている。

のちに詳述するように、本発明の発明者は、内因性オバルブミン遺伝子にヒトインターフェロンβ構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変ニワトリに加えて、ヒト抗体構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変ニワトリをも作出し、この遺伝子改変ニワトリのメスが産卵した卵からも通常の孵卵条件下では産子が孵化しないことを見出した。さらに、インターフェロンβ構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変ニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子がノックインされたニワトリのメスが産卵する受精卵中の卵白の比重を調べたところ、それらの卵白の比重は、野生型ニワトリのメスが産卵する受精卵中の卵白の比重と比べて小さく、さらに、卵黄の比重よりも小さいことを見出した。

（第１の実施形態）
本発明の第１の実施形態に係る遺伝子改変鳥類の作出方法（以下、単に「作出方法」という。）は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第１の代理卵殻内で培養する工程（以下「工程Ａ」という。）、および、その発生後期において、第１の卵殻とは異なる第２の代理卵殻内で培養する工程（以下「工程Ｂ」という。）を行う。なお、「第１の代理卵殻」および「第２の代理卵殻」については後に説明する。

本実施形態の作出方法のフローチャートを図１に示す。図１に示すように、工程Ａでは、例えば、受精卵を割卵し受精卵の内容物を容器に移す工程（Ｓ１）と、受精卵の内容物中の胚と卵黄のみを第１の代理卵殻に移す工程（Ｓ２）と、第１の代理卵殻を卵白組成物で満たし密封する工程（Ｓ３）と、胚を第１の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ４）を行う。また、工程Ｂでは、例えば、第１の代理卵殻の内容物を第２の代理卵殻に移す工程（Ｓ５）と、胚を第２の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ６）を行う。

本明細書において、別段の記載がない場合には、鳥類の胚の発生初期とは、受精卵の産卵直後から、胚がハンバーガー・ハミルトンの発生ステージ（以下「ＨＨステージ」という。）（V. Hamburger, H. Hamilton, “A series of normal stages in the development of the chick embryo”, Journal of Morphology, Vol.88, p.42, (1951）でステージ９～２０又はそれに相当するステージにまで達する期間をいう。

ＨＨステージは、当初、ニワトリ胚の発生段階を胚の形態的特徴に基づき分類したものである。しかし、ニワトリ以外の鳥類胚の発生および形態形成は、ニワトリ胚の発生および形態形成と相似的に進行することが知られており、ニワトリ以外の鳥類の胚の発生に関しても、それぞれの時期における胚の形態（体節数、頭部、四肢原器の形態等）に基づき各ＨＨステージに相当する各発生ステージが規定されている。したがって、遺伝子改変鳥類がニワトリ以外の鳥類である場合にも、発生段階が産卵直後の胚盤葉期からＨＨステージ９～２０に相当するステージに達するまでの期間における胚を発生初期の胚とすることができる。

鳥類の産卵直後の受精卵中の胚は、卵黄の動物極側の表面上にある直径５ｍｍほどの扁平な細胞層として存在する。卵黄の動物極側の比重はその植物側の比重に比べて小さいため、重力下で卵黄を卵白等の水溶液中に静置した場合には、動物極側にある胚が卵黄最上部に位置する。また、野生型鳥類の受精卵中の卵黄の比重は、卵白の比重より小さい。したがって、重力下で受精卵を静置した場合、卵黄は卵中で浮上して上側の卵殻に接触した状態となる。その結果、卵黄の最上部にある胚も上側の卵殻に接触した状態となる。卵殻の内側には外卵殻膜が密着し、さらにその内側に内卵殻膜が密着している。したがって、上記の「胚が卵殻に接触した状態」とは、より具体的には、胚が卵殻の最内側にある内卵殻膜に接触した状態にあるという意味である。

理論に拘束されるものではないが、通常の孵卵条件下で野生型鳥類の受精卵中の胚が卵殻に接触した状態であることは、特に発生初期の胚の発生にとって重要であると考えられる。上述したように、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変ニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子がノックインされた遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵中の卵白の比重は、それらの受精卵中の卵黄の比重に比べて小さい。したがって、これらの遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵を通常の孵卵条件で孵卵した場合には、受精卵中で卵黄が沈んでしまい、卵黄上の胚が卵殻とは接触できていないと考えられる。

上記遺伝子改変ニワトリを含む遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から通常の孵卵条件下で産子が得られないことの主な理由は、これら遺伝子改変鳥類の受精卵中では卵黄が沈んでしまい、その結果、卵黄上の胚が発生初期において卵殻と接触できないことにあると考えられる。本発明の第１の実施形態に係る作出方法は、発生初期の胚を卵殻と接触させた状態で人工培養する工程を含む方法であり、これにより、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることができる。

本実施形態の作出方法において、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を卵殻に接触させた状態で人工培養する工程（工程Ａ）は、前記受精卵中の産卵直後における卵黄の比重よりも大きい比重を有する卵白組成物とともに卵殻内で培養する工程である。卵黄の比重よりも大きい比重を有する卵白組成物を用いることにより、卵黄が卵殻内で浮上する結果、卵黄上の胚を卵殻に接触させた状態で人工培養することができる。

本明細書において、産卵直後における卵白又は卵黄は、それぞれ、産卵直後の受精卵に含まれる卵白又は卵黄を意味する。また、産卵直後の受精卵とは、遺伝子改変鳥類のメスが受精卵を産卵した時点の受精卵ばかりでなく、産卵直後から低温条件（４℃～２５℃）下で１か月以内、より好ましくは１週間以内保存され、その後高温条件下（３６℃～４０℃）に移された直後の受精卵をも意味する。この場合、「高温条件下に移された直後」とは、高温条件下に移されてから１２時間以内であること、６時間以内であること、又は、３時間以内であることを意味する。

本実施形態の作出方法に用いる材料および装置について、詳細に説明する。

〔遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵〕
本実施形態の作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵であって、当該受精卵中の産卵直後における卵白の比重が産卵直後の卵黄の比重と比べて同じか又はより小さい受精卵を出発材料とすることが好ましい。

卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さい場合には、当該受精卵を通常の孵卵条件下で孵卵しても受精卵中の胚は発生初期において卵殻に接触した状態でないことから、当該胚は正常に発生できない。これに対し、卵黄の比重に比べてより大きい比重を有する卵白組成物を用いて卵殻内で人工培養することによって、卵黄を卵殻内で浮上させ、その結果胚を卵殻に接触させた状態で培養することができる。

遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵において、当該受精卵中の産卵直後における卵白の比重が産卵直後の卵黄の比重と比べて同じかより小さいものであるか否かは、産卵直後の受精卵を割卵し、その内容物をガラス製のビーカー等の透明な容器に入れて静置することにより、卵黄が卵白中で浮いているか沈んでいるかを調べることができる。

卵黄が浮いている場合には、卵白の比重が卵黄の比重に比べて大きいことを意味し、卵黄が沈んでいる、又は、上昇も下降もせずに中間部で停止している場合には、卵白の比重が卵黄の比重と同じか、又は、卵黄の比重に比べて小さいことを意味する。この場合、受精卵中の濃厚卵白、内水様性卵白、外水様性卵白をともに超音波処理したものの中に卵黄を加えることが好ましい。濃厚卵白の粘度が高いために卵黄の卵白中での移動が妨げられる場合があるからである。この試験の結果、卵黄が卵白中で沈んでいる、又は、上昇も下降もせずに中間で停止している場合は、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さいと判断できる。

本実施形態の作出方法は、第１の内因性卵白タンパク質遺伝子へ第１の外因性構造遺伝子がヘテロ又はホモにノックインされた遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵を出発材料とすることが好ましい。第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への第１の外因性構造遺伝子のヘテロ又はホモのノックインを有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、外因性構造遺伝子の遺伝子産物が卵白中に高濃度に存在することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子へ前記第１の外因性構造遺伝子がヘテロ又はホモにノックインされた遺伝子改変鳥類には、ノックインの結果前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子がノックアウトされた遺伝子改変鳥類も含まれる。

本明細書において、内因性卵白タンパク質遺伝子とは、野生型鳥類のゲノム内に本来的に存在する遺伝子（以下「内因性遺伝子」という。）であって、野生型鳥類のメスの卵管で生産され当該鳥類のメスが産卵する卵の卵白中に集積される卵白タンパク質をコードする内因性遺伝子を意味する。本明細書において、外因性構造遺伝子とは、遺伝子改変される前の鳥類が本来的には生産しないタンパク質（本明細書において「外因性タンパク質」という。）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを意味する。

さらに、本実施形態の作出方法は、受精卵を産卵する遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインであり、当該遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のホモのノックインである場合に適用されることがより好ましい。

前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインを有する遺伝子改変鳥類のオスとメスとを交配させたのち当該メスが産卵する受精卵中の胚の一部は、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子へ前記第１の外因性構造遺伝子がホモにノックインされた胚である。ホモノックインを有する胚の割合は、メンデル則によれば１／４である。遺伝子改変鳥類のオスとメスとを交配させることには、オスとメスとを交尾させることやオスから採取された精液でメスを人工授精することが含まれる。

また、本実施形態の作出方法は、第２の内因性卵白タンパク質遺伝子がヘテロ又はホモにノックアウトされた遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵を出発材料とすることが好ましい。前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子がヘテロ又はホモにノックアウトされた遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、ノックアウトされた内因性卵白タンパク質遺伝子の遺伝子産物が発現しないことから卵白の組成が大きく変化することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

さらに、本実施形態の作出方法は、受精卵を産卵する遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロのノックアウトであり、当該遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のホモのノックアウトである場合に適用されることがより好ましい。前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子がヘテロにノックアウトされた遺伝子改変鳥類のオスとメスとを交配させたのち当該メスが産卵する受精卵中の胚の一部は、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子がホモにノックアウトされた胚である。ホモノックアウトを有する胚の割合は、メンデル則によれば１／４である。

また、本実施形態の作出方法は、第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入を有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵を出発材料とすることが好ましい。前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入を有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、外因性構造遺伝子の遺伝子産物が卵白中に高濃度に存在することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

本明細書において、内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列とは、内因性卵白タンパク質遺伝子に含まれる塩基配列であって、当該遺伝子の鳥類体内での発現の時期的、部位的又は量的特性を調節している塩基配列である。発現調節配列には、内因性卵白タンパク質遺伝子に含まれるプロモーター配列、エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、転写終結シグナル配列等またはそれらの組み合わせが含まれる。

さらに、本実施形態の作出方法は、受精卵を産卵する遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入であり、当該遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入である場合に適用されることがより好ましい。

前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入を有する遺伝子改変鳥類のオスとメスとを交配させたのち当該メスが産卵する受精卵中の胚の一部は、前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入を有する胚である。ホモの非特異的挿入を有する胚の割合は、メンデル則によれば１／４である。

本実施形態の作出方法は、前記第１～３の内因性卵白タンパク質遺伝子が、それぞれ、オバルブミン遺伝子、オボムコイド遺伝子、オボムチン遺伝子、オボトランスフェリン遺伝子、オボインヒビター遺伝子およびリゾチーム遺伝子のいずれかの遺伝子である遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵を出発材料とすることが好ましい。また、本実施形態の作出方法は、前記第１～３の内因性卵白タンパク質遺伝子がオバルブミン遺伝子である遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵に対して適用されることがより好ましい。

オバルブミン、オボムコイド、オボムチン、オボトランスフェリン、オボインヒビターおよびリゾチームは鳥類の卵白タンパク質の中でも卵白における相対量が多く、なかでも、オバルブミンの相対量が最も多い。したがって、これらの遺伝子のいずれかに外因性構造遺伝子をノックインされている遺伝子改変鳥類、これらの遺伝子のいずれかがノックアウトされている遺伝子改変鳥類、および、これらの遺伝子のいずれか由来の発現調節配列に機能的に接続した外因性構造遺伝子を有する遺伝子改変鳥類が産卵する受精卵においては、卵白の組成が野生型鳥類の受精卵中の卵白の組成と大きく異なり、その結果卵白の比重が卵黄の比重に比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

本実施形態の作出方法が適用される鳥類種としては、野生型鳥類の未受精卵等の入手が比較的容易である点で、ニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウであることが好ましく、ニワトリおよびウズラであることがより好ましく、ニワトリであることがさらに好ましい。

本実施形態の作出方法が適用される遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵に導入されている前記第１および第２の外因性構造遺伝子は、医療又は物質生産において有用であり鳥類体内で生産することが可能なタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。外因性構造遺伝子がコードするタンパク質には、免疫系サイトカイン、細胞外マトリクスタンパク質、抗体、酵素またはその他の有用タンパク質が含まれる。なお、第１の外因性構造遺伝子と第２の外因性構造遺伝子は、互いに同一であっても異なるものであってもよい。

また、前記第１および第２の外因性遺伝子がコードするタンパク質は、好ましくは哺乳類由来、さらに好ましくはヒト由来のタンパク質である。哺乳類由来又はヒト由来のタンパク質には、これらタンパク質の機能が保持されている限りでそれらタンパク質の改変体やバリアントが含まれる。さらに好ましくは、前記第１および第２の外因性構造遺伝子がコードするタンパク質は、哺乳類由来の、より好ましくはヒト由来の免疫系サイトカインおよび抗体である。

免疫系サイトカインは主に免疫系で機能するサイトカインである。免疫系サイトカインには、インターフェロンα、インターフェロンβ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、インターロイキン１やインターロイキン２等の各種インターロイキン、マクロファージ成長因子、顆粒球成長因子、顆粒球マクロファージ成長因子、幹細胞成長因子（stem cell factor）が含まれるがこれらに限定されない。また、抗体には、すべてのクラス、サブクラス、アロタイプの抗体が含まれる。また、抗体には、マウス由来又はヒト由来のモノクローナル抗体やヒト化抗体等のキメラ抗体が含まれ、さらに、Ｆａｂフラグメントや１本鎖抗体等の抗体として活性を保持しつつ人工的に改変されたタンパク質も含まれる。

〔代理卵殻〕
本実施形態の作出方法の工程ＡおよびＢにおいて、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を培養するための容器として、当該受精卵以外の受精卵または未受精卵の卵殻を材料として作製される第１の代理卵殻および第２の代理卵殻が用いられる。代理卵殻の材料として用いる受精卵の内容積は、本実施形態の作出方法に供される受精卵の内容積と同程度であるか又はそれよりも大きいことが好ましい。

代理卵殻は、本実施形態の作出方法に供される受精卵と同種の鳥由来の卵殻であってもよく、また、異種の鳥類由来の卵殻であってもよい。たとえば、野生型ニワトリの受精卵中の胚をニワトリ未受精卵又は受精卵由来の代理卵殻内で培養して産子を得ることができるばかりでなく、シチメンチョウ、アヒルまたはアイガモの未受精卵又は受精卵由来の代理卵殻内で培養して産子を得ることもできる。また、野生型ウズラの受精卵中の胚をニワトリ未受精卵又は受精卵由来の代理卵殻内で培養して産子を得ることもできる。

第１および第２の代理卵殻には受精卵の内容物を収納するための開口部が設けられる。開口部の周縁が形成する平面は、卵の長軸に対して垂直であることが培養操作上好ましい。第１の代理卵殻の場合は、開口部は卵の鋭端側に設けられることが好ましい。一方、第２の代理卵殻の場合は、開口部は卵の鈍端側に設けられることが好ましい。開口部の広さは、卵黄に傷がつかない状態で遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵の内容物（卵黄、卵白等）を代理卵殻内に移すことができる広さである。

第１の代理卵殻における開口部の直径は、ニワトリ由来の卵殻を用いる場合は、３０ｍｍ～４０ｍｍとすることが好ましい。また、第２の代理卵殻における開口部の直径は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル又はアイガモ由来の卵殻を用いる場合は、３５ｍｍ～４５ｍｍとすることが好ましい。代理卵殻の開口部は、受精卵の卵殻を内卵殻膜および外卵殻膜とともに開口部の周縁に沿って切断することによって設けられる。卵殻の切断は、たとえば、電動ミニドリルを用いて行うことができる。開口部が設けられた受精卵から卵内容物を除去した後、工程Ａおよび工程Ｂにおいて用いることができる。

〔卵白組成物〕
本明細書において、卵白組成物とは、鳥類の卵白からなる組成物を意味する。卵白は、受精卵又は未受精卵の内水様性卵白、濃厚卵白および外水様性卵白の何れかであってもよく、これらを混合した組成物であってもよい。本実施形態の作出方法の工程Ａに用いる卵白組成物は、その比重が遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵黄の比重よりも大きいものである。

これにより、工程Ａにおいて、卵黄上の胚を卵殻に接触させた状態で人工培養することができる。卵白組成物が、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の卵黄の比重よりも大きい比重を有するか否かは、たとえば、容器内にある卵白組成物中に当該卵黄を入れて静置し、卵黄が浮かぶかあるいは沈むかを調べることによってわかる。卵黄が浮かんで卵白組成物の表面に来れば、卵白組成物の比重が卵黄の比重に比べて大きいことがわかる。

工程Ａにおいて使用する卵白組成物としては、例えば、野生型鳥類の未受精卵もしくは受精卵から採取された水様性卵白（内水様性卵白および／または外水様性卵白）が挙げられる。また、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した未受精卵もしくは受精卵から採取された濃厚卵白および水様性卵白（内水様性卵白および外水様性卵白）を共に超音波処理して得られる組成物と野生型鳥類の未受精卵もしくは受精卵から採取された水様性卵白との混合物が挙げられる。

〔孵卵器〕
本実施形態の作出方法における胚１を代理卵殻内で保温する工程（Ｓ４およびＳ６）においては胚を保温するために自動転卵装置付きの孵卵器を用いることができる。孵卵器としては、特に限定されるものではなく、たとえば、昭和フランキ社製のＴｙｐｅ Ｐ－００８等のように一般に使用されているものを用いることができる。

〔工程Ａ〕
まず、工程Ａについて説明する。図２は、工程Ａの人工培養法を模式的に示す図である。図１に示すように、工程Ａでは、受精卵を割卵し受精卵の内容物を容器に移す工程（Ｓ１）と、受精卵の内容物中の胚と卵黄のみを第１の代理卵殻に移す工程（Ｓ２）と、第１の代理卵殻を卵白組成物で満たし密封する工程（Ｓ３）と、胚を第１の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ４）を行う。

〔Ｓ１〕
Ｓ１は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵した産卵直後の受精卵を割卵し、卵の内容物を容器に移す工程である。容器としては、たとえば、直径５０ｍｍ～１５０ｍｍのセラミックス製、ガラス製又は金属製の蒸発皿等の開口部が大きな容器を用いることが好ましい。

〔Ｓ２〕
Ｓ２は、容器内に移された受精卵内容物から胚１および卵黄２のみを第１の代理卵殻４内に卵黄２に傷がつかないように移す工程である。Ｓ２において、第１の代理卵殻４に卵黄２とそれに付着する胚１のみを移すために、まず、上記容器内にある受精卵内容物から、吸引ピペット等を用いて卵白等の胚１および卵黄２以外の卵内容物を吸引する。ついで、容器から胚１および卵黄２のみを代理卵殻４内に移す。

野生型鳥類のメスが産卵する受精卵の場合は、吸引ピペット等を用いて卵白等の卵黄および胚以外の内容物を吸引することによって卵黄と卵白等とを分離することができる。しかし、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の濃厚卵白の組成によっては、卵黄に対して濃厚卵白が比較的強く付着している場合がある。この場合には、卵黄に付着する濃厚卵白を滅菌したスパーテル等を用いて掻きとることによって除去することができる。また、胚が付着した卵黄を紙や布等の吸湿性素材の上で回転させることで、卵黄の付着した濃厚卵白を吸湿性素材に吸着させて除去することができる。

その際、容器内にある卵黄２から、卵黄２に付着する濃厚卵白を除去することが好ましい。特に、胚を覆っている濃厚卵白は残さないようにすることが好ましい。これにより、胚１と第１の代理卵殻４とをより確実に接触させることができる。その後、胚１および卵黄２のみが第１の代理卵殻４内に移す。

〔Ｓ３〕
Ｓ３では、胚１および卵黄２が入れられた第１の代理卵殻４の開口部から卵白組成物３を注入して第１の代理卵殻内を開口部の淵まで卵白組成物３で満たしたのち、第１の代理卵殻４の開口部を密封する。この際、代理卵殻４の内容物内に気泡が入らないように密封する。また、あらかじめ卵白組成物３の一部を第１の代理卵殻４に入れておき、胚１および卵黄２を第１の代理卵殻４に移してから、卵白組成物３で第１の代理卵殻４を満たしてもよい。

第１の代理卵殻４の開口部は、たとえば、開口部をプラスチックフィルム５で覆ってプラスチックフィルム５の周辺部を代理卵殻に接着させることによって密封する。プラスチックフィルム５としては、たとえば、ポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエステルフィルムなどを使用することができる。開口部を覆うプラスチックフィルム５は、たとえば、合成接着剤や水様性卵白を用いて卵殻に接着させてもよい。水様性卵白を用いる場合には、プラスチックフィルム５の周辺部の内側に水様性卵白を塗ったあと、プラスチック製等の保定用プラスチックリング６および輪ゴム７を用いて、図２に示すようにプラスチックフィルム５を第１の卵殻４に固定することができる。

〔Ｓ４〕
Ｓ４では、胚１が入れられた第１の代理卵殻４を、第１の代理卵殻４の長軸が水平になるように自動転卵機能が付いた孵卵器内に置き、たとえば、温度３７℃～４０℃、湿度５０％～８０％で保温する。保温は、第１の代理卵殻４内の胚１の発生段階がＨＨステージ９～２０又はそれに相当するステージに達するまで行う。第１の代理卵殻４は保温時に転卵されることが好ましい。転卵の角度は４０°～１２０°であることが好ましく、転卵の頻度は１５分に１回～1時間に１回であることが好ましい。

受精卵中の胚１の高い孵化率を得るためには、胚１を工程Ａにより産卵直後からＨＨステージ９～２０又はそれに相当するステージまで培養し、その後、胚由来の個体が孵化するまでの間、つぎに述べる工程Ｂにより培養することが好ましい。鳥類胚を工程Ａにより培養した後に工程Ｂによる培養を開始する時期は、鳥類胚の発生ステージがＨＨステージ９～２０まで又はそれに相当するステージである時期であり、ＨＨステージ１１～１８まで又はそれに相当する発生ステージである時期がより好ましく、ＨＨステージ１４～１６まで又はそれに相当するステージである時期であることがさらに好ましい。この時期に工程Ａから工程Ｂへ切り替えることによって、培養された胚由来の個体の孵化率が高くなる。

〔工程Ｂ〕
次に、工程Ｂについて説明する。図３は、工程Ｂの人工培養法を模式的に示す図である。図１に示すように、工程Ｂでは、第１の代理卵殻の内容物を第２の代理卵殻に移す工程（Ｓ５）と、胚を第２の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ６）を行う。

〔Ｓ５〕
Ｓ５では、まず、第１の代理卵殻４内の胚１、卵黄２および卵白８を、第２の代理卵殻９内に移す。第１の代理卵殻４内の内容物を第２の代理卵殻９に移した後、開口部を上側にして第２の代理卵殻９を直立させた場合、内容物の表面と第２の代理卵殻９の開口部が形成する平面との間に空気層１０があることが好ましい。空気層の幅は、第２の代理卵殻を転卵した際に卵内容物が第２の代理卵殻の開口部の淵まで到達しない程度の幅とする。

胚１が移されたのちに第２代理卵殻９の開口部を密封する。開口部は、たとえば、プラスチックフィルム５を開口部にかぶせる前に、プラスチックフィルム５の周辺部を開口部の周縁部の卵殻にプラスチックモデル用セメントや水様性卵白を塗布して接着させることによって密封できる。プラスチックフィルム５としては、たとえば、ポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエステルフィルムなどを使用することができる。

〔Ｓ６〕
Ｓ６では、胚１が入れられた第２の代理卵殻９を、開口部を上側にして第２の代理卵殻９の長軸が垂直になるように、自動転卵機能が付いた孵卵器内に置き、温度３７℃～４０℃、湿度５０％～８０％で保温する。保温は、第２の代理卵殻９内の胚１由来の産子が孵化するまで行う。第２の代理卵殻９は、胚１由来の産子の孵化予定日の５日前まで転卵されることが好ましい。

転卵の角度は４０°～８０°であることが好ましく、転卵の頻度は１５分に１回～１時間に１回であることが好ましい。胚１由来の産子の孵化予定日の５日前以降は、転卵を停止することが好ましい。また、孵化予定日の１日前には、第２の代理卵殻９の開口部を密封しているフィルムに穴をあけ、または、フィルムを外して開口部にプラスチック製の蓋を置いて、産子が肺呼吸に移行することを助けることが好ましい。

また、本実施形態の作出方法の変法として、工程Ａにより発生初期の鳥類胚を第１の代理卵殻内で培養し、ついで、Ｓ５において、第１の代理卵殻から適当量の卵白を除去した後に第１の代理卵殻を密封し、第１の代理卵殻を第２の代理卵殻として用いてＳ６の保温工程を行うことができる。ここで「適当量の卵白を除去」するとは、Ｓ６において第２の代理卵殻として用いられる第１の代理卵殻を転卵したときに卵内容物が第１の代理卵殻の開口部周縁まで達しない程度にまで卵白の量を減らすという意味である。この方法も本実施形態の作出方法に含まれる。

本実施形態の作出方法によれば、第１の卵殻内での培養において、胚を卵殻に接触させた状態で培養しているため、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることができる。また、遺伝子改変がホモになされた新規の遺伝子改変鳥類を得ることができる。

（第２の実施形態）
本発明の第２の実施形態に係る作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第１の代理卵殻内で培養する工程（以下「工程Ｃ」という。）、および、その発生後期において、プラスチックフィルム成形体内で培養する工程（以下「工程Ｄ」という。）を含む方法である。なお、プラスチックフィルム成形体およびそれを備える人工培養容器については、後に説明する。

図４は本実施形態の作出方法を示すフローチャートであり、図５は、図４に示す工程Ｄにおける人工培養法を示す図である。

図４に示すように、工程Ｃでは、例えば、受精卵を割卵し受精卵の内容物を容器に移す工程（Ｓ１１）と、受精卵の内容物中の胚と卵黄のみを第１の代理卵殻に移す工程（Ｓ１２）と、第１の代理卵殻を卵白組成物で満たし密封する工程（Ｓ１３）と、胚を第１の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ１４）を行う。工程Ｄでは、例えば、第１の代理卵殻の内容物をプラスチックフィルム成形体内に移す工程（Ｓ１５）と、胚をプラスチックフィルム成形体内で保温する工程（Ｓ１６）を行う。

本実施形態の作出方法の材料、装置および操作は、発生後期において胚１が第２の代理卵殻内ではなくプラスチックフィルム成形体内で培養される点を除き、第１の実施形態の作出方法の材料、装置および操作と同じである。したがって、本実施形態の作出方法のうち、発生後期において胚１がプラスチック成形体内で培養される工程（工程Ｄ）についてのみ説明する。

工程Ｄにおいて、胚1は、プラスチックフィルム成形体を備える人工培養容器内で培養される。当該人工培養容器は、外側容器１２、および、外側容器１２内に懸架されたプラスチックフィルム成形体１１とからなる。外側容器１２は、上部が開口したカップ状の容器である。外側容器１２の底面の形状は、平面状であっても半球状等であってもよい。外側容器１２の材質は特に限定されないが、透明な熱可塑性プラスチック製のものが好ましい。

外側容器１２は透明な蓋１４がついたものであることが好ましい。外側容器１２の大きさは、遺伝子改変鳥類メスが産卵する受精卵の内容積に応じて決めることができる。遺伝子改変鳥類がニワトリの場合には、上部開口部の内径が８０ｍｍ程度であり、高さが１２０ｍｍ程度とすることができる。また、遺伝子改変鳥類がウズラの場合には、上部開口部の内径が３０ｍｍ程度であり、高さが４５ｍｍ程度とすることができる。外側容器１２には、胚１への十分な酸素供給の観点から、少なくとも一つの空気孔１３をあけておくことが好ましい。また、空気孔１３には綿栓を詰めておくことが好ましい。さらに、外側容器１２の底部には、雑菌の購入防止と水分の補給のために塩化ベンザルコニウム等の殺菌剤が入った蒸留水１５を入れておくことが好ましい。

プラスチックフィルム成形体１１とは、透明なプラスチックフィルムを凹状に延伸成形して形成されたものであり、その凹状部の内部に、胚および卵内容物が収納される。プラスチックフィルムとしては、特に限定されないが、通気性の観点から、ポリメチルペンテンフィルムが好ましい。プラスチックフィルム成形体１１は、プラスチックフィルムを凸状の押し型に押し当てて局所的にプラスチックフィルムを延伸して凹状に塑性変形させることにより作製できる。

プラスチックフィルム成形体１１の凹状部の大きさは、遺伝子改変鳥類メスが産卵する受精卵の内容積に応じて決めることができる。遺伝子改変鳥類がニワトリの場合には、上部開口部の内径が８０ｍｍ程度であり上部開口部から凹状部最下部までの距離が８０ｍｍ程度とすることができる。また、遺伝子改変鳥類がウズラの場合には、上部開口部の内径が３０ｍｍ程度であり、上部開口部から凹状部最下部までの距離が３０ｍｍ程度とすることができる。これにより、凹状部に胚１を含む卵内容物を収納した際に、卵内容物と上部開口部との間に十分な幅の空気層を設けることができる。

プラスチックフィルム成形体１１は、外側容器１２の開口部に懸架する。プラスチックフィルム成形体１１の周縁部を外側容器の蓋１４と外側容器１２の開口部の周縁との間に挟み込むことで、プラスチックフィルム成形体１１を外側容器１２内に懸架してもよい。また、プラスチックフィルム成形体１１を、外側容器１２内に懸架される、逆円錐台上のかご状の台座内に配置してもよい。

つぎに、工程Ｄについて説明する。
〔Ｓ１５〕
Ｓ１５では、人工培養容器に備えられたプラスチックフィルム成形体１１の凹状部に乳酸カルシウム粉末および蒸留水を入れる。遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵内の胚１を培養する場合には、乳酸カルシウム粉末の質量を、０．２５ｇ～０．３ｇとし、蒸留水の体積を、２．５ｍｌ～３．０ｍｌとすることができる。また、遺伝子改変ウズラのメスが産卵する受精卵内の胚１を培養する場合には、乳酸カルシウム粉末の質量を、０．０２５ｇ～０．１ｇとし、蒸留水の体積を、０．２５ｍｌ～１．０ｍｌとすることができる。

つぎに、ＨＨステージ９～２０又はそれに相当するステージまで発生した胚１を第１の代理卵殻４内の卵黄２および卵白８とともにプラスチックフィルム成形体１１の凹状部内に移す。ついで、プラスチックフィルム成形体１１の凹状部の卵内容物と接しない部分に、少なくとも１個、好ましくは６個～１２個の空気孔１３を、半田ごて等を用いて開ける。その後、外側容器１２の上面を、たとえば、透明な蓋１４により密封する。

〔Ｓ１６〕
Ｓ１６では、胚１が入れられた人工培養容器を孵卵器内で、たとえば、温度３７℃～４０℃、湿度５０％～８０％で保温する。胚１が入れられた人工培養容器は保温中に転動されることが好ましい。人工培養容器の転動は、たとえば、人工培養容器の長軸を地表面に垂直な軸に対して８°程度傾けておき、人工培養容器の長軸を、地表面に垂直な軸の周りで１２０°づつ歳差運動させることによって行うことが好ましい。転動の間隔は、１日に１回～２回である。孵卵条件をこのようにすることで産子のより高い孵化率が得られる。

胚１が入れられた人工培養容器に、工程Ｄによる培養開始から胚由来の産子の孵化までの期間の最後の１０％の期間、さらに好ましくは、最後の２０％の期間に加湿酸素を供給する。加湿酸素の供給は、外側容器に開けられた空気孔１３を介して行う。加湿酸素の供給量は、特に限定されないが、通常、３００ｍｌ／ｈｒ～１０００ｍｌ／ｈｒ程度、好ましくは、４００ｍｌ／ｈｒ～６００ｍｌ／ｈｒ程度である。このような条件で加湿酸素の供給を行うことにより産子のより高い孵化率が得られる。

本実施形態の作出方法によれば、第１の卵殻内での培養において、胚を卵殻に接触させた状態で培養しているため、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることができる。また、遺伝子改変がホモになされた新規の遺伝子改変鳥類を得ることができる。

（第３の実施形態）
本発明の第３の実施形態に係る作出方法は、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚を、その発生初期において、胚を卵殻に接触させた状態で第１の代理卵殻内で培養する工程（以下「工程Ｅ」という。）、および、その発生後期において、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜成形体内で培養する工程（以下「工程Ｆ」という。）を含む方法である。なお、ＰＴＦＥ膜成形体およびそれを備える人工培養容器については、後に説明する。

図６は本実施形態の作出方法のフローチャートであり、図７は、図６に示す工程Ｆにおける人工培養法を示す模式図である。

図６に示すように、工程Ｅでは、受精卵を割卵し受精卵の内容物を容器に移す工程（Ｓ２１）と、受精卵の内容物中の胚と卵黄のみを第１の代理卵殻に移す工程（Ｓ２２）と、第１の代理卵殻を卵白組成物で満たし密封する工程（Ｓ２３）と、胚を第１の代理卵殻内で保温する工程（Ｓ２４）を行う。また、工程Ｆでは、第１の代理卵殻の内容物をＰＴＦＥ膜成形体内に移す工程（Ｓ２５）と、胚をＰＴＦＥ膜成形体内で保温する工程（Ｓ２６）を行う。

本実施形態の作出方法の材料、装置および操作は、発生後期において胚１が第２の代理卵殻内ではなくＰＴＦＥ膜成形体内で培養される点を除き、第１の実施形態の作出方法の材料、装置および操作と同じである。したがって、本実施形態の作出方法のうち、発生後期において胚１がＰＴＦＥ膜成形体内で培養される工程（工程Ｆ）についてのみ説明する。

工程Ｆにおいて、胚1は、ＰＴＦＥ膜成形体を備える人工培養容器内で培養される。当該人工培養容器は、外側容器１２、外側容器１２内に懸架され、凹状部を有するメッシュ状部材１７、および、メッシュ状部材１７の凹状部内に保持されるＰＴＦＥ膜成形体１６とから構成される。外側容器１２は、上部が開口したカップ状の容器である。外部容器１２の底面の形状は、平面状であっても半球状等であってもよい。外側容器１２の材質は特に限定されないが、透明なガラス製又はプラスチック製であることが好ましい。

外側容器１２の大きさは、遺伝子改変鳥類メスが産卵する受精卵の内容積に応じて決めることができる。遺伝子改変鳥類がニワトリの場合には、上部開口部の内径が８０ｍｍ程度であり、高さが１２０ｍｍ程度とすることができる。また、遺伝子改変鳥類がウズラの場合には、上部開口部の内径が３０ｍｍ程度であり、高さが４５ｍｍ程度とすることができる。外側容器１２には、十分な酸素供給の観点から、少なくとも一つの空気孔１３をあけておくことが好ましい。外側容器の底部には、雑菌の購入防止と水分の補給のために塩化ベンザルコニウム等の殺菌剤を含む蒸留水１５を入れておくことが好ましい。

ＰＴＦＥ膜成形体１６とは、ガス透過性の多孔質ＰＴＦＥ膜を凹状に延伸成形して形成されたものであり、その凹状部の内部に胚を含む卵内容物が収納される。ＰＴＦＥ膜成形体１６は、ＰＴＦＥ膜を凸状の押し型に押し当ててＰＴＦＥ膜を凹状に塑性変形させることにより作製できる。ＰＴＦＥ膜成形体１６の凹状部の大きさは、第２の実施形態の作出方法におけるプラスチックフィルム成形体の凹状部の大きさと同様である。

メッシュ状部材１７は、ＰＴＦＥ膜成形体の外側に配置されてＰＴＦＥ膜の凹状部の形態を保持するための部材である。メッシュ状部材１７の材質は、特に限定されるものではなく、ＰＴＦＥ膜成形体の凹状部の形状を保持できる程度の剛性を有したものであればよい。

次に、工程Ｆについて説明する。
〔Ｓ２５〕
Ｓ２５では、ＨＨステージ９～２０又はそれに相当ステージまで発生した胚１を第１の代理卵殻４内の卵黄２および卵白８とともに人工培養容器に備えられたＰＴＦＥ膜成形体１６の凹状部内に移す。

ついで、ＰＴＦＥ膜成形体１６の凹状部内の卵内容物に、カルシウムの有機酸塩を加える。カルシウムの有機酸塩としては、乳酸カルシウムが好ましい。凹状部内の卵内容物に加えられる乳酸カルシウムの量は、遺伝子改変ウズラのメスが産卵する受精卵中の胚を培養する場合には、２５ｍｇ～４５ｍｇであることが好ましい。また、遺伝子改変ニワトリのメスが産卵する受精卵中の胚を培養する場合には、１２５ｍｇ～２２５ｍｇであることが好ましい。これにより、発生過程の胚に対して適度な量のカルシウムを供給することができる。

ついで、外側容器１２の上面を密封する。密封は、たとえば、プラスチックフィルム５で外側容器１２の上面を覆い、ついで、水様性卵白を接着剤として使用してプラスチックフィルム５の周縁部を外側容器１２の外側上縁部に接着させることによって行うことができる。

〔Ｓ２６〕
Ｓ２６において、胚１が入れられた人工培養容器を孵卵器内で、鳥類胚で適した温度および湿度条件下、たとえば、温度３７℃～４０℃、湿度５０％～８０％で保温する。胚１が入れられた人工培養容器は保温中に転動されることが好ましい。転動は、人工培養容器を所定の角度傾けることによって行う。転動の角度は、３０°が好ましく、転動の間隔は、１日に１回～２回である。これによって、より高い産子の孵化率が得られる。

胚１が入れられた人工培養容器には、工程Ｆによる培養開始から胚由来の産子の孵化までの期間、酸素を供給する。酸素の供給は、酸素を孵卵器内に供給することによって行う。酸素の供給量は、特に限定されないが、培養開始から孵化予定日の５日前までは０．２５Ｌ／分、孵化予定日の５日前から２日前までは０．５Ｌ／分、孵化予定日の２日前から前日までは０．７５Ｌ／分であることが好ましい。これにより、胚1に適度な量の酸素を供給できる。また、産子の肺呼吸への移行を助けるために、孵化予定日の前日には転動を止め培養容器上面のプラスチックフィルムに穴をあけることが好ましい。

本実施形態の作出方法によれば、第１の卵殻内での培養において胚1を卵殻に接触させた状態で培養するので、遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵から産子を得ることができる。また、遺伝子改変がホモになされた新規の遺伝子改変鳥類を得ることができる。

（第４の実施形態）
本発明の第４の実施形態に係る遺伝子改変鳥類は、上記第１～３の実施形態に係る作出方法によって作出された遺伝子改変鳥類である。

本発明の第４の実施形態に係る遺伝子改変鳥類は、第１の内因性卵白タンパク質遺伝子に第１の外因性構造遺伝子がホモにノックインされている遺伝子改変鳥類であることが好ましい。当該ノックインを有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、外因性構造遺伝子の遺伝子産物が卵白中に高濃度に存在することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

この遺伝子改変鳥類のメスは、前記第１の外因性構造遺伝子がヘテロにノックインされたメスが産卵する卵（受精卵又は未受精卵）よりも外因性構造遺伝子の遺伝子産物をより多く含む卵を産卵することが期待される。また、この遺伝子改変鳥類のオスを野生型鳥類のメスと交配することにより、野生型鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚に由来するメスの産子のすべてが、前記第１の外因性構造遺伝子をヘテロに有する遺伝子改変鳥類となり、当該外因性構造遺伝子の遺伝子産物を卵白中に含む卵を産卵する。これにより、外因性構造遺伝子の遺伝子産物を卵白中に含む卵の生産をより効率的に行うことができる。

本発明の第４の実施形態に係る遺伝子改変鳥類は、第２の内因性卵白タンパク質遺伝子がホモでノックアウトされている遺伝子改変鳥類であることが好ましい。当該ノックアウトを有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、ノックアウトされた内因性卵白タンパク質遺伝子の遺伝子産物が発現しないことから卵白の組成が大きく変化することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

オバルブミンやオボトランスフェリン等の卵白タンパク質は、卵アレルギーのアレルゲンとして知られている。本発明に係る遺伝子改変鳥類の作出方法を用いることにより、オバルブミン遺伝子やオボトランスフェリン遺伝子等の内因性卵白タンパク質遺伝子がホモにノックアウトされた遺伝子改変鳥類のメスが得られれば、アレルゲンである卵白タンパク質を含まない点で安全な卵を提供することができる。

本発明の第４の実施形態に係る遺伝子改変鳥類は、第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第２の外因性構造遺伝子がゲノムにホモで非特異的挿入されている遺伝子改変鳥類であることが好ましい。当該非特異的挿入を有する遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵においては、外因性構造遺伝子の遺伝子産物が卵白中に高濃度に存在することにより、卵白の比重が卵黄の比重と比べて同じか又はより小さくなる可能性がより高いからである。

この遺伝子改変鳥類のメスは、前記第２の外因性構造遺伝子がゲノムに対しヘテロに非特異的挿入がされたメスが産卵する卵（受精卵又は未受精卵）よりも前記第２の外因性構造遺伝子の遺伝子産物をより多く含む卵を産卵することが期待される。また、この遺伝子改変鳥類のオスを野生型鳥類のメスと交配することにより、野生型鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚に由来するメスの産子のすべてが、前記第２の外因性構造遺伝子をヘテロに有する遺伝子改変鳥類となり、当該外因性構造遺伝子の遺伝子産物を卵白中に含む卵を産卵する。これにより、外因性構造遺伝子の遺伝子産物を卵白中に含む卵の生産をより効率的に行うことができる。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。

１．ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ノックインニワトリ
（１－１）インターフェロンβ構造遺伝子ノックインのためのドナープラスミドの構築
配列番号１に示される塩基配列を有するドナーＤＮＡを調製した。このドナーＤＮＡの塩基配列は、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク翻訳開始コドンの直上流から５‘側約２．８キロベースまでの塩基配列、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子の塩基配列、ピュロマイシン耐性遺伝子ユニットの塩基配列、および、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク質翻訳開始コドンの直上流から３’側約３．０キロベースまでの塩基配列から構成される。このドナーＤＮＡをプラスミドpBlueScriptII (SK+)（Stratagene社（現Agilent Technologies社））に挿入してドナープラスミドpBS-IFNbetaを調製した。

（１－２）ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ノックインニワトリの作出
横斑プリマスロック由来の株化されたニワトリＰＧＣに、pBS-IFNbetaおよびpx330-Neo^r-OVATg1をトランスフェクトし、その後細胞をピュロマイシンで選択することにより、ドナーＤＮＡがノックインされている遺伝子改変ＰＧＣを含むＰＧＣ集団を得た。px330-Neo^r-OVATg1は、内因性オバルブミン遺伝子内の翻訳開始コドン直上流にある塩基配列を標的配列とするガイドＲＮＡおよびＤＮＡ分解酵素Ｃａｓ９を発現するプラスミドである。こうして得られたＰＧＣ集団の一部を、レシピエント胚（白色レグホン）に移植して生殖細胞キメラニワトリ（以下「Ｇ０ニワトリ」という。）を作出した。

Ｇ０ニワトリのオスが性成熟した後、それらから精子を採取し、それにドナーＤＮＡがノックインされた遺伝子改変精子が含まれているか否かを、採取された精子から調製したＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー（以下「プライマー」という。）Ｐ１、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーＰ２からなるプライマー対、配列番号４の塩基配列を有するプライマーＰ３および配列番号５の塩基配列を有するプライマーＰ４からなるプライマー対、並びに、プライマーＰ１および配列番号６の塩基配列を有するプライマーＰ５からなるプライマー対をそれぞれ用いたＰＣＲを行って調べた。

遺伝子改変精子を有するオスのＧ０ニワトリを野生型ニワトリ（白色レグホンまたは横斑プリマスロック）のメスと交配し、当該メスニワトリが産卵した受精卵を通常の孵卵条件下で孵卵して産子を得ることにより、Ｇ０ニワトリの複数の後代を得た。後代が、ドナーＤＮＡがノックインされた遺伝子改変ニワトリであるか否かを、後代の羽軸から調製したＤＮＡを鋳型として、上述のＰＣＲ法により調べた。その結果、ドナーＤＮＡがノックインされた遺伝子改変ニワトリ（以下「Ｇ１ニワトリ」という。）のオスおよびメスが得られた。

さらに、性成熟したＧ１ニワトリのオスを野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスと交配することにより、後代を得た。当該後代のうち、ドナーＤＮＡがノックインされた個体（以下「Ｇ２ニワトリ」という。）を上述のＰＣＲ法を用いて選抜した。

（１－３）後代ニワトリのメスが産卵した卵
Ｇ１ニワトリのメスは、性成熟後に未受精卵を産卵した。産卵直後における未受精卵においては、卵黄の周囲の白濁した卵白、および、粘性の低い比較的少量の水様性卵白があることが確認された。白濁した卵白中のヒトインターフェロンβの量を、抗ヒトインターフェロンβ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（VeriKine Human Interferon Beta ELISA kit, PBL Assay Science社）で検査した。卵白には、１．８～３．５ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトインターフェロンβが含まれていた。

また、Ｇ２ニワトリのメスは、性成熟後に未受精卵を産卵した。Ｇ２ニワトリのメスが産卵した未受精卵中の白濁した卵白におけるヒトインターフェロンβの濃度は、Ｇ１ニワトリのメスが産卵した未受精卵中の白濁した卵白におけるヒトインターフェロンβの濃度と同程度だった。

Ｇ１ニワトリおよびＧ１ニワトリのメスが産卵した受精卵の通常の孵卵条件下における孵化率を以下のように調べた。Ｇ１ニワトリ又はＧ２ニワトリのメスをＧ１ニワトリのオスの精液で人工授精した後に当該メスが産卵した受精卵を計１６個採取した。また、野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスを野生型ニワトリ（白色レグホン）の精液で人工授精した後に当該メスが産卵した受精卵を計１８個採取した。産卵直後の受精卵を、自動転卵装置付き孵卵器（Ｔｙｐｅ Ｐ－００８、昭和フランキ社製）内で、温度３８．５℃、湿度６０％、転卵角度９０°、転卵間隔３０分の条件で保温した。

その結果、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵の孵化率は０％（０／１６）であり、野生型ニワトリのメスが産卵した受精卵の孵化率は１００％（１８／１８）であった。

２．ヒト抗体構造遺伝子ノックインニワトリ
（２－１）ヒト抗体構造遺伝子ノックインのためのドナープラスミドの構築
配列番号７に示される塩基配列を有するドナーＤＮＡを調製した。このドナーＤＮＡの塩基配列は、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク翻訳開始コドンの直上流から５‘側約２．８キロベースまでの塩基配列、卵白リゾチーム由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１）重鎖構造遺伝子の塩基配列、ｆｕｒｉｎタンパク質切断標的配列をコードするＤＮＡの塩基配列、２Ａ自己プロセッシング性ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、卵白リゾチーム由来のシグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１）軽鎖構造遺伝子の塩基配列、ピュロマイシン耐性遺伝子ユニットの塩基配列、および、ニワトリオバルブミン遺伝子におけるタンパク質翻訳開始コドンの直上流から３’側約３．０キロベースまでの塩基配列から構成されている。

このドナーＤＮＡ中のタンパク質コード領域が転写、翻訳されることにより生産されたポリぺプチドがその後プロセッシングされることによって、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖からなるヒト抗体が発現する。このドナーＤＮＡをプラスミドpBlueScriptII (SK+)（Stratagene社（現Agilent Technologies社））に挿入してドナープラスミドpBS-Ig(H+L)を調製した。

（２－２）ヒト抗体構造遺伝子ノックインニワトリの作出
横斑プリマスロック由来の株化されたニワトリＰＧＣに、pBS-Ig(H+L)およびpx330-Neo^r-OVATg1をトランスフェクトし、その後細胞をピュロマイシンで選択することにより、ドナーＤＮＡがノックインされている遺伝子改変ＰＧＣを含むＰＧＣ集団を得た。ＰＧＣ集団に遺伝子改変ＰＧＣが含まれていることをＰＣＲ法により確認した。すなわち、ＰＧＣから調製したＤＮＡを鋳型として、第１に、プライマーＰ１および配列番号８の塩基配列を有するプライマーＰ６を用いてＰＣＲを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、配列番号９の塩基配列を有するプライマーＰ７および配列番号１０の塩基配列を有するプライマーＰ８を用いてＰＣＲを行った。

第２に、プライマーＰ３およびプライマーＰ４を用いたＰＣＲを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、配列番号１１の塩基配列を有するプライマーＰ９および配列番号１２の塩基配列を有するプライマーＰ１０を用いたＰＣＲを行った。こうして得られたＰＧＣ集団の一部を、レシピエント胚（白色レグホン）に移植した結果、交配可能なオスのＧ０ニワトリが１羽得られた。当該Ｇ０ニワトリを野生型ニワトリ（白色レグホン）と交配し、Ｇ０ニワトリの複数の後代を得た。

後代が、ドナーＤＮＡがノックインされた遺伝子改変ニワトリであるか否かを調べた。すなわち、後代ニワトリの羽軸から調製したＤＮＡを鋳型として、プライマーＰ１およびプライマーＰ６を用いてＰＣＲを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、プライマーＰ７およびプライマーＰ８を用いてＰＣＲを行った。

その結果、ドナーＤＮＡがノックインされた遺伝子改変ニワトリ（以下「Ｇ１ニワトリ」という。）のオスおよびメスが得られた。性成熟したＧ１ニワトリのオスを野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスと交配することにより、後代を得た。当該後代のうち、ドナーＤＮＡがノックインされた個体（以下「Ｇ２ニワトリ」という。）を上述のＰＣＲ法を用いて選抜した。

（２－３）後代ニワトリのメスが産卵した卵
Ｇ２ニワトリのメスは、性成熟後に未受精卵を産卵した。産卵直後における未受精卵の水様性卵白および濃厚卵白をともに超音波処理し、得られた標品の一部を、７％ポリアクリルアミドゲルを用いた非還元条件でのＳＤＳゲル電気泳動法（レムリー法）により分析した。ポリアクリルアミドゲルには標準品として精製ヒトＩｇＧ１（アブカム社）もロードした。

電気泳動後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を１次抗体としたウエスタンブロット解析を行った。その結果、卵白中に分子量約２００万のヒト抗体の存在が確認された。また、ブロット上のヒト抗体および標準ヒトＩｇＧ１のバンドの染色強度の比較から、卵白中におけるヒト抗体の濃度は約０．１３ｍｇ／ｍｌであることがわかった。

Ｇ１ニワトリのメスをＧ１ニワトリのオスの精液で人工授精した後に当該メスが産卵した受精卵を１９個採取した。産卵直後の受精卵を、自動転卵装置付き孵卵器（Ｔｙｐｅ Ｐ－００８，昭和フランキ社製）内で、温度３８．５℃、湿度６０％、転卵角度９０°、転卵間隔３０分の条件で保温した。その結果、ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１ニワトリ）のメスが産卵した受精卵の孵化率は０％（０／１９）であった。

３．ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の卵白の比重
インターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ２又はＧ３ニワトリ）のメスをインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のオスの精液で人工受精した後に当該ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のメスをヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のオスの精液で人工受精した後に当該ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスを野生型ニワトリ（白色レグホン）のオスの精液で人工授精した後に当該野生型ニワトリのメスが産卵した受精卵を採取した。

各ニワトリ系統の産卵直後の受精卵から、卵白（濃厚卵白、外水様性卵白および内水様性卵白）を採取し、それぞれを超音波処理して非粘性化した。超音波処理は、超音波強度を８～１０に設定した超音波発生機（ＵＲ－２０Ｐ、トミー精工社製）のプローブを卵白に差し込み、３分間超音波処理することにより行った。非粘性化された卵白を、それぞれ、１００ｍｌのビーカーに入れ、それに野生型ニワトリの受精卵から採取した胚および卵黄を加えて静置した。

その結果、インターフェロンβ構造遺伝子ノックインニワトリ由来の卵白またはヒト抗体構造遺伝子ノックインニワトリ由来の卵白に加えられた卵黄はビーカーの底に沈み、一方、野生型ニワトリ由来の卵白に加えられた卵黄は、浮上して卵白表面に位置していた。これにより、インターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ由来の卵白およびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ由来の卵白の比重は、卵黄の比重と比べてより小さいことが示された。一方、野生型ニワトリ由来の卵白の比重は、卵黄の比重と比べてより大きいことが示された。

４．ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚の人工培養
ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚を、第１の代理卵殻および第２の代理卵殻を用いた人工培養法により培養して産子の孵化率を調べた。

ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ２ニワトリ）のメスをヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のオスの精液で人工授精した後、当該メスニワトリが産卵した受精卵３２個を採取した。ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のメスをヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のオスの精液で人工授精した後、当該メスニワトリが産卵した受精卵８１個を採取した。これらの産卵直後の受精卵を人工培養の出発材料とした。

ダイヤモンドカッターを取り付けたミニター（ミニター株式会社製）を用いて、野生型ニワトリ（白色レグホン）の未受精卵（卵重５５ｇ～６０ｇ）の鋭端側に、周縁が形成する平面が卵の長軸に対して垂直であり周縁部の直径が約３５ｍｍである円形の開口部を設けた。開口部から未受精卵の内容物を取り出したのち、卵殻を第１の代理卵殻として用いた。同様に、野生型ニワトリの未受精卵（卵中７０ｇ以上）の鈍端側に直径約４０ｍｍの円形の開口部を設けた。開口部から未受精卵の内容物を取り出したのち、卵殻を第２の代理卵殻として用いた。

第１の卵殻内での培養において、野生型ニワトリ（白色レグホン）の未受精卵から採取した水様性卵白を卵白組成物として用いた。
受精卵を割卵し卵内容物をガラス製蒸発皿に移した。注射筒（テルモシリンジ（登録商標）、テルモ社製）を用いて濃厚卵白、水様性卵白およびカラザを吸引除去して胚および卵黄のみを残した。ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵については、さらに、スパーテルを用いて卵黄に付着する濃厚卵白を注意深く掻きとることにより卵黄から濃厚卵白を除去した。

あらかじめ約２０ｍｌの卵白組成物を入れた第１の代理卵殻に胚および卵黄を移した。次いで、第１の代理卵殻を卵白組成物で満たした。４．５ｃｍ四方に切ったプラスチックフィルム（ワンラップ（登録商標）、日本製紙社製）で開口部を覆い、２個の保定用プラスチックリング（外形５．５ｃｍ、内径３．５ｃｍ、厚さ５ｍｍ、４か所にネジ径２ｍｍ、長さ１ｍｍのネジが取り付けられている）と輪ゴムを用いてプラスチックフィルムと卵殻を固定した。ついで、胚が入れられた第１の代理卵殻を、自動転卵装置付き孵卵器（Ｔｙｐｅ Ｐ－００８、昭和フランキ社製）内に置き、温度３８，５℃、湿度６０％、転卵角度９０°、転卵間隔３０分の条件で約２日半保温した。

第１の代理卵殻内でＨＨステージ１３～１８まで発生した胚を、第１の卵殻の内容物すべてとともに第２の代理卵殻に移した。水様性卵白を第２の代理卵殻の開口部周縁部に塗ったのちに、４．５ｃｍ四方に切ったワンラップ（登録商標）を周縁部に張り付けることで開口部を密封した。

胚が入れられた第２の代理卵殻を、自動転卵装置付き孵卵器（Ｔｙｐｅ Ｐ－００８、昭和フランキ社製）内に置き、温度３８，５℃、湿度６０％、転卵角度６０°、転卵間隔３０分の条件で人工培養開始後１９日目まで保温した。人工培養開始後１９日目に、胚の肺呼吸を助けるためプラスチックフィルムに穴をあけた。人工培養開始後２１日目には、プスチックフィルムを取り除き、第２の代理卵殻の開口部に直径６０ｍｍのプラスチックシャーレをかぶせた状態で保温した。

その結果、人工培養された胚からは、人工培養開始後２１日目から２２日目にかけて産子が孵化した。ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子が３羽孵化した（孵化率：９．４％）。ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子が１４羽孵化した（孵化率：１７．３％）。

この結果から、人工培養により、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵からの産子が得られることが示された。

５．ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚に由来する産子の遺伝子型
実施例４で得られたヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子の遺伝子型を、産子の羽軸から調製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行って調べた。すなわち、プライマーＰ１およびＰ２を用いてＰＣＲを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、Ｐ７および配列番号１３の塩基配列を有するプライマーＰ１１を用いてＰＣＲを行った。また、プライマーＰ１およびプライマーＰ５を用いてＰＣＲを行った。

ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子の遺伝子型を、産子の羽軸から調製したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行って調べた。すなわち、プライマーＰ１およびＰ６を用いてＰＣＲを行い、それにより得られた増幅産物を鋳型として、プライマーＰ７およびプライマーＰ８を用いてＰＣＲを行った。また、プライマーＰ１およびプライマーＰ５を用いてＰＣＲを行った。

その結果、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子（３羽）のうち、２羽がヘテロノックインニワトリであり、１羽が野生型ニワトリであることがわかった。また、ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚由来の産子１４羽のうち、２羽がホモノックインニワトリであり、９羽がヘテロノックインニワトリであり、３羽が野生型ニワトリであることがわかった。この結果から、人工培養により、外因性構造遺伝子がホモにノックインされた形質転換ニワトリが得られることが示された。

６．ノックインニワトリのメスが産卵した受精卵の卵白を用いた人工培養
ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリおよびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した卵の卵白が胚の発生に及ぼす影響を調べるため、これら遺伝子改変ニワトリのメスが産卵した受精卵の卵白を含む卵白組成物を用いて野生型ニワトリ由来の胚の人工培養を行った。

野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスを野生型ニワトリ（白色レグホン）のオスの精液で人工授精した後、当該メスが産卵した受精卵を試験材料とした。ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ２又はＧ３ニワトリ）およびヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ（Ｇ１又はＧ２ニワトリ）のメスが産卵した受精卵または未受精卵から卵白（濃厚卵白、内水様性卵白および外水様性卵白）を採取した。採取された卵白を超音波処理して非粘性化した。また、野生型ニワトリ（白色レグホン）のメスが産卵した未受精卵から外水様性卵白を採取した。上記遺伝子改変ニワトリ由来の非粘性化された卵白を、野生型ニワトリ由来の水様性卵白と下記表１に示す混合比で混合して卵白組成物を調製し第１の卵殻内での培養において用いた。

野生型ニワトリのメスが産卵した受精卵中の胚を試験に供したこと、および、第1の卵殻内の培養において上記の卵白組成物を用いたことを除き、（４－２）と同様の操作を行った。その結果得られた胚由来の産子の孵化率を下記表１に示す。

上記表１に示すように、卵白組成物として、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリまたはヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した未受精卵又は受精卵由来の非粘性化された卵白のみからなる卵白組成物を第１の卵殻内での培養に用いた場合（表１中の「混合比」が１００％）には、培養された胚由来の産子は得られなかった。

一方、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した未受精卵由来の非粘性化された卵白と野生型ニワトリの未受精卵由来の水様性卵白とを５０％：５０％、または、２０％：８０％の体積比で混合して得られた卵白組成物を用いた場合（表１中の「混合比」が５０％または２０％）には、培養された胚由来の産子が得られた。

また、ヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリのメスが産卵した未受精卵由来の非粘性化された卵白と野生型ニワトリの未受精卵由来の水様性卵白とを５０％：５０％の体積比で混合して得られた卵白組成物を用いた場合（表１中の「混合比」が５０％）にも、培養された胚由来の産子が得られた。

実施例３と同様の方法により、本実施例で用いた卵白組成物の比重を調べたところ、ヒトインターフェロンβ構造遺伝子ヘテロノックインニワトリまたはヒト抗体構造遺伝子ヘテロノックインニワトリ由来の非粘性化された卵白と野生型ニワトリ由来の水様性卵白とを５０％：５０％の体積比で混合して得られた卵白組成物の比重は、ともに、卵黄の比重と比べて大きかった。

以上のことから、人工培養によって胚由来の産子が得られるか否かは、主に、人工培養に用いる卵白組成物の比重によって決まることが示された。

１ 胚、２ 卵黄、３卵白組成物、４ 第１の代理卵殻、５ プラスチックフィルム、６ 保定用プラスチックリング、７ 輪ゴム、８ 卵白、９ 第２の代理卵殻、１０ 空気層、１１ プラスチックフィルム成形体、１２ 外側容器、１３ 空気孔、１４ 蓋、１５ 蒸留水、１６ ＰＴＦＥ膜成形体、１７ メッシュ状部材

Claims (11)

1. 遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を、発生初期は、他の卵由来の第１の代理卵殻内において卵殻と接触させた状態で人工培養する工程と、
   発生後期は、前記第１の代理卵殻内で前記卵白組成物の一部を取り除いて又は前記第１の代理卵殻の内容物を第２の代理卵殻に移して、前記胚が空気と接触するようにして前記胚由来の産子が孵化するまで保温する工程と
   を有し、
   前記第１の代理卵殻内で人工培養する工程では、前記受精卵の胚及び卵黄のみを前記第１の代理卵殻に移すと共に、前記第１の代理卵殻内を他の卵から採取された卵白を用いて調製された前記卵黄よりも比重が大きい卵白組成物で満たして密封し、前記胚が前記卵殻に接触するようにして保温する遺伝子改変鳥類の作出方法。
2. 前記卵白組成物は、野生型鳥類の未受精卵若しくは受精卵から採取された水様性卵白、又は、該野生型鳥類由来の水様性卵白と前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵した未受精卵若しくは受精卵から採取された濃厚卵白及び水様性卵白を超音波処理して得た組成物との混合物である請求項１に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
3. 遺伝子改変鳥類のメスが産卵した受精卵中の胚を、発生初期は、他の卵由来の第１の代理卵殻内において卵殻と接触させた状態で人工培養する工程を有し、
   前記第１の代理卵殻内で人工培養する工程では、前記受精卵の胚及び卵黄のみを前記第１の代理卵殻に移すと共に、前記第１の代理卵殻内を他の卵から採取された卵白を用いて調製された前記卵黄よりも比重が大きい卵白組成物で満たして密封し、前記胚が前記卵殻に接触するようにして保温すると共に、
   前記卵白組成物として、野生型鳥類の未受精卵若しくは受精卵から採取された水様性卵白、又は、該野生型鳥類由来の水様性卵白と前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵した未受精卵若しくは受精卵から採取された濃厚卵白及び水様性卵白を超音波処理して得た組成物との混合物を用いる遺伝子改変鳥類の作出方法。
4. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への第１の外因性構造遺伝子のヘテロ又はホモのノックインである請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
5. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のヘテロのノックインであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第１の内因性卵白タンパク質遺伝子への前記第１の外因性構造遺伝子のホモのノックインである請求項４に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
6. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロ又はホモのノックアウトである請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
7. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のヘテロのノックアウトであり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第２の内因性卵白タンパク質遺伝子のホモのノックアウトである請求項６に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
8. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロ又はホモの非特異的挿入である請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
9. 前記遺伝子改変鳥類のメスにおける遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのヘテロの非特異的挿入であり、前記遺伝子改変鳥類のメスが産卵する受精卵中の胚における遺伝子改変が、前記第３の内因性卵白タンパク質遺伝子由来の発現調節配列に機能的に接続した前記第２の外因性構造遺伝子のゲノムへのホモの非特異的挿入である請求項８に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
10. 前記第１～第３の内因性卵白タンパク質遺伝子は、それぞれ、オバルブミン遺伝子、オボムコイド遺伝子、オボムチン遺伝子、オボトランスフェリン遺伝子、オボインヒビター遺伝子およびリゾチーム遺伝子のいずれか１の遺伝子である、請求項４～９のいずれか１項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。
11. 前記遺伝子改変鳥類が、ニワトリ、ウズラ、アヒル又はシチメンチョウである請求項１～１０のいずれか１項に記載の遺伝子改変鳥類の作出方法。

Images