CN1046550C - 肽的制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种制造含肽的物质的方法，该方法包括将编码所述肽的DNA序列掺入编码乳清蛋白的哺乳动物(例如羊)基因中，使得该DNA序列在成年雌性哺乳动物乳腺中表达。所述物质可以是一种(任意修饰的)蛋白，例如血液凝固因子。DNA序列优选地插入编码乳清蛋白(例如β-乳球蛋白)的基因的第一外显子中。所述物质一般地从雌性哺乳动物的乳液中回收，但也可以在原位使用(例如如果它是一种酶)。

Description

肽的制造方法
本发明是关于制造一种含多肽物质的方法，特别是关于制造蛋白质的方法，以及用酶类蛋白质催化制备生物物质的方法。
在过去的十年里，重组DNA技术越来越多地用于制造工业上重要的生物物质。为此，已对编码多种医学上重要的人体蛋白质的DNA序列进行了克隆，它包括胰岛素、血纤维蛋白溶酶原活化剂、α1-抗胰蛋白酶、以及凝固因子Ⅷ和Ⅸ。目前，虽然出现了重组DNA技术，然而这些蛋白质通常从血液和细胞组织中提纯，该方法成本昂贵且费时，并且可能会引起传染介质的传播，这些传染介质会引起艾滋病和肝炎。
尽管在细菌中表达DNA序列，对于产生所需的医学上重要的蛋白质来说是一个吸引人的计划，然而事实上细菌作为宿主通常是不能令人满意的，因为在细菌细胞中，外来蛋白质不稳定而且没有合格处理过。
认识到这个问题，人们对在哺乳动物细胞组织培养物中的克隆基因的表达方式作了尝试，而且在某种情况下已经证明这是一个可行的策略，然而动物细胞的间歇发酵培养是昂贵的、但却是技术上需要的过程。
因此，需要一种产率高、成本低的制造生物物质的方法，例如恰当修饰真核生物多肽的方法，这种方法的一个优点是对人体没有传染介质。
根据本发明的第一方面，提供一种制造含多肽物质的方法，该方法包括将编码多肽的DNA序列插入编码哺乳动物乳清蛋白的基因中，用这种办法在成年雌性哺乳动物的乳腺中表达DNA序列。通常在转译后修饰之前或者最好是在之后从成年雌性哺乳动物的乳液中回收该物质。
在本说明书中使用的术语“多肽”是指包含氨基酸链的分子，无论链的长度对于划为蛋白质是否合适，多肽最好具有足够长的分子而成为蛋白质。“含多肽物质”可以是多肽本身，或者可以是一种经修饰的(例如糖基化的)多肽，此外，或者也可以是在多肽经转译后修饰而交叉连接的物质。
本发明可用于生产肽激素、血液凝固因子(特别是Ⅷ和Ⅸ因子)或它们(特别是Ⅷ和Ⅸ因子)的亚基、血液蛋白质(例如β-珠蛋白)和血清蛋白(例如α1-抗胰蛋白酶)、粮食蛋白、包括天然或改进的宿主哺乳动物的乳蛋白、或酶。
本发明产生的酶能在原位作用于在乳腺中的底物，因此，可以看出本发明包括一种生产酶反应产物的方法，该方法通过将编码酶的DNA序列插入编码哺乳动物乳清蛋白的基因中，以实现该序列在成年雌性哺乳动物乳腺中的表达，然后用该酶作用于酶的一种或多种底物的来催化反应产物的制备，该反应产物一般从成年的雌性哺乳动物的该乳液中回收。
最好在试管中，将编码肽的DNA序列，(所需的DNA序列)插入到乳清蛋白质基因中形成融合基因，这种乳清蛋白基因可以在成年的雌性哺乳动物中表达。通过向受精的哺乳动物的卵子注射融合基因，从而将融合基因插入种系中，此后，经注射的受精卵发育为成年的雌性哺乳动物。人们预计并非所有注射过的卵都能发育成表达所需的DNA序列的成年雌性哺乳物。此外，将近一半的动物是雄性，在下一代生育雌性动物。
将外源DNA序列插入到哺乳动物种系中的有关技术已用于小鼠。目前，最有效的途径需要将几百个直链DNA分子直接显微注射到一个受精卵细胞的原胞核中，这是本发明的优选方法。然后将显微注射过的卵转移到假孕养母的输卵管中，进行培养。Brinster et al在Proc Natl Acad Sci 82(1985)4438-4442中报道培养的小鼠大约有25％遗传了一个或多个显微注射的DNA拷贝。从商业观点出发，显然在本发明中，最好将具有高产乳率的哺乳动物作为宿主哺乳动物。因此，优选选用家畜，例如绵羊、猪和牛，下面将进一步详细讨论。
研究大量家畜需要相当大的投资，尤其是在所需动物的数目及其成本方面。每个超数排卵的小鼠产生30个卵是正常的，而母羊排卵数只有3至5个。所遇到的另一个问题是农场动物的卵还不透明，这是由于它存在大量的囊，这就使得鉴别以及向其原胞核进行成功注射更为困难。然而，向兔子、绵羊和猪的卵中注射DNA已由Hammer et al在Nature 315(1985)680-683中作了报道，他将金属硫因-生长激素融合基因插入这三种动物的种系中。对2035个猪卵进行注射和转移，有192只小猪出生，其中20只带有融合基因。对于绵羊，结果却并不如此令人鼓舞，对1032个羊卵进行注射和转移，只有73只羊出生，其中只有一只羊含有外源DNA序列。
一旦将外源DNA导入种系，外源DNA就可以在高选择性的细胞组织内表达，生成一种功能蛋白质，这种蛋白质可以很容易地从动物中获取。要实现这个过程，一般将编码所需肽的DNA序列融合到一种DNA序列中或者融合到在适当组织调节其表达的序列中。尽管对小鼠的一些初步实验表明插入DNA的细胞组织的特异性表达略有不同(例如，Lacey et al,Cell 34(1983)343-356)，但是，一致的是大多数转染基因都获得了正确的组织特异性表达。参阅Brinster et al Cell 27(1981)223-231；Swift et al Cell38(1984)639-646；Shani Nature 314(1985)283-286；和Magram etal Nature 315(1985)338-340。标准的细胞组织特异性对于去除所有原核生物的载体序列显然是重要的，这些序列在显微注射前被用于所需的DNA序列的克隆(Krumlauf et al Mol.Cell Biol5(1985)1639-1648)。
这些出版物指出的是将某些不同的细胞组织在转移基因动物的构建中当作目标，而没有提出任何可用于商业的生产多肽物质的特定理想细胞组织，也没有提出在给定的细胞组织中表达的，并用作插入DNA表达的任何特殊基因。
关于含肽物质和其表达所靶向的组织，必须考虑到许多因素。为了显示充分的生物活性，许多蛋白质需要转译后修饰。例如Ⅸ因子需要将谷氨酸残基的特定子集合进行ν-羧基化，以使之具有生物活性(De Seipio and Davie、Biochemistry 18 899-904(1979))。肝是天然合成Ⅸ因子的部位，它能专门进行这种修饰。尽管效率较低，成纤维细胞能够进行Ⅸ因子的γ-羧基化：de laSalle et al Nature 316 268-270(1985)。然而，一些蛋白质只有当在特定的组织中合成时才可被恰当地修饰，有时必须使表达的位点适合生产蛋白质的需要。可以认为使用乳腺作为表达的细胞组织，不论满意程度如何，这是一个潜在的困难因素。
与固体细胞组织相反，从体液中获得蛋白质是理想的，因为该途径一般说来是可以重复的，并且大部分生物医学上重要的蛋白质本身是分泌到体液中的。从肝或β-淋巴细胞分泌到血流中是一个可行的途径，但是血液的凝固生物活性肽和抗原分子的存在是进行后续过程的障碍。
根据本发明，可以通过使用乳腺作为表达的细胞组织来克服以上困难，很容易大量收集乳液，并且乳液有较好的生物化学特性，此外，主要的乳蛋白以高浓度(大约1-15g/l)存在于乳液中。
世界上许多国家的农场动物一般有四种；猪、山羊、绵羊和牛，也就是说Suidae科、Capra属、ovis属和Bos属，家畜一般是Taurus种。
当本发明从广义上不限制任何特殊哺乳动物种属、科时，猪、山羊、绵羊和牛为优选，在本发明的范围内它们各有优缺点。这些顾虑起源于实际情况，根据本发明的优选方面，用编码多肽的DNA序列于试管内掺入可用成年雌性哺乳动物乳腺表达的乳清蛋白基因中，形成融合基因，将这种基因注射到哺乳动物的受精卵中，从而使注射过的受精卵发育为成年雌性哺乳动物。
尽管从牛中获得高产乳率是建议优先选用牛的因素，但是，控制牛的胚胎比控制例如羊胚胎有更多的技术困难。然后关于牛的全部实验成本意味着其他三种优选的家畜是待选的。
下面表1给出了用于本发明的猪、羊和牛的相互比较。
               表1
不同家畜进行胚胎控制和产乳量的比较
猪 羊 牛
控制卵泡成熟时间的可能性每个非超数排卵动物的卵母细胞数目每个超数排卵动物的卵母细胞数目原核的可见性季节性繁殖每个胚胎转移的相对成本包括动物的标定成本高峰时产乳率升/天(升/天) 有1015-20(有)否1.0n.a. (有)1-34-10(有)是1.81-3* (无)1大约6(无)否1105-30*
*取决于繁殖情况 n.a.=得不到的数据
原核可见性的意义在于它是本发明将含有编码肽的DNA序列的融合基因注射到受精卵的原核中的一个优选特征。
猪的产乳率数据不易得到，但是羊的产乳率为每天1-3升，这取决于羊的品种。羊的挤奶专用设备可以从供应厂商处买到，该设备对牛也适用。因此羊成为选择的动物，特别是诸如EastFrieslands奶羊。高产乳量的羊种与黑脸羊的杂交种是可行的选择。
分泌乳汁的乳腺是一个非常特殊的器官，它包括排出分泌细胞复合体小叶中乳液的导管系统。乳腺细胞适合以多种方式高速分泌，例如，它们有特殊的运输机制以确保有效地吸收血液中的前体，还具有一个广泛的细胞内膜系统(粗面内质网、高尔基氏体等)，能高速合成蛋白质、进行转译后修饰和从细胞中输出。
乳腺的发育及其功能的各个方面取决于激素，关于乳腺的综述包括Topper and Freeman,Physiol Rev 60 1049-1106(1980)和Forsyth in“The Biochemistry of Lactation”Mepham(Ed)，Elsevier(1982)309-349。影响乳腺的激素介导了怀孕和哺乳期间乳腺所发生的显著变化。例如对于羊，这将导致细胞总数增加一倍，以及改变了各种细胞类型之间的比例和分泌细胞的最终分化。
乳腺将许多不同的蛋白质分泌到乳液中，不同种的乳液组合物存在着质和量的差别，尽管在酪蛋白和可溶(乳清)蛋白之间可以找到一般的差别(参见Jenness in“Developments in DairyChemistry,Ⅰ”Fox(Ed)Elsevier(1982)87-109)。在乳腺中合成的反刍乳清蛋白质主要是α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。
有三种主要的酪蛋白，它们是α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，表现出许多种的特征，在乳液中将它们以微胞形式聚集来隔离钙。反刍动物中主要的乳清蛋白质，β-乳球蛋白的作用是未知的，尽管它似乎能与κ-酪蛋白相互作用(Brunner.J.DairySci.64 1038-1054(1981))。α-乳清蛋白在葡萄糖和半乳糖转化为乳糖的过程中是一种基本辅助因子(Brew,Nature 223 671-672(1969))。表2列出了各种乳蛋白组合物。
                       表2各种乳蛋白组合物
克/升     牛     羊     鼠   人
酪蛋白αS1αS2βκ 103.4103.9 123.8103.9     7 0.431
主要的乳清蛋白质α-乳清蛋白β-乳球蛋白乳清酸性蛋白质 13无 0.82.8无 痕量无2 1.6无无
其他乳清蛋白质血清清蛋白溶菌酶乳汁肝褐质(Lactoferrin)免疫球蛋白 0.4痕量0.10.7 ．．．． ．．．． 0.40.41.41.4
(以各种来源收集的数据)
通常人们认为不同的乳蛋白是由一种复制基因编码的(Mercier and Gaye in“The Biochemistry of Lactation”Mepham(Ed)Elsevier(1983)177-225)。酪蛋白基因在小鼠中似乎是连锁基因(Rosen et al Biochem Soc Trans,9,112(1982))，在奶牛中也是如此(Grossclaude Proc、16th Inti,Conf Animal BloodGroups、Biochem、Polvmorphy,1 54-59(1979))。因为酪蛋白基因与乳清蛋白基因相比似乎表达水平更高，所以很自然地认为作为表达插入的外源DNA的基因应选择酪蛋白基因。然而，出乎意料的是，本发明提供了用编码乳清蛋白的基因表达插入的编码所需肽的DNA序列的方法。
大鼠的α-乳清蛋白基因包含四个外显子，并且包含2.5kb。染色体DNA(Qasba和Safaya Nature 311 377-380(1984))，牛的α-乳清蛋白基因似乎是类似的结构。现已发现绵羊的β-乳球蛋白最可能是单拷贝基因，它在4.9kb的转录单位中包含7个外显子，这种基因是本发明中使用的优选基因。
在大鼠(Nakhasi和Qasba.J.Biol Chem 254 6016-6025(1979))、兔(Shuster et al Eur.J.Biochem.71 193-199(1976))和小鼠(Pauley et al Nature 275 455-457(1978))的乳房发育期间，利用在试管内转译和互补DNA杂交来评估在乳蛋白信使RNAs水平的变化，该乳腺收集了80,000-100,000个由协调机制产生的乳蛋白特异信使RNA，这种协调机制包括高速合成乳蛋白信使RNA和有效地稳定这些分子(Mercier和Gaye,op.Cit和Guyette et alCell 17 1013-1073(19 79))，然而也有例外。对于母羊，β-酪蛋白占乳蛋白总量的45％，但是仅17％的与这一基因的互补的DNA克隆能从互补DNA基因库中分离出来(Mercier et al Biochimie 67959-971(1985))。对于兔子，在微粒体囊中隔离起来的α-乳清蛋白的量大大低于没有微囊时的蛋白质合成所得到的蛋白量，这样就可以假定，信号肽没有最佳构型(Gaye et al Biochimie)64173-184(1982))。许多乳蛋白基因的最初转译产物被进一步修饰，例如α-乳清蛋白是N-糖基化的，κ-酪蛋白是O-糖基化的、以及α-和β-酪蛋白是O-糖基化的。除了它在转译后修饰中的作用之外，高尔基复合体也参与将酪蛋白凝聚并包裹在微团中的过程，酪蛋白和乳清蛋白有可能通过不同的途径从细胞中排出。关于这一点，人们有趣地注意到，在种内和种间比较中，酪蛋白信号肽(与大量的其它分子比较)被很好地保存，预计它为新生肽定位正确的分泌途径起作用(Mepham et al op Cit)。如上所述，乳蛋白基因在分泌乳汁的乳腺中大量地表达，例如，对于母羊，在多聚腺核苷酸+RNA(Mercier et al(1985)op Cit)中，αS1-酪蛋白占30％左右，β-乳球蛋白占5％左右。给定这些来源于单拷贝基因的转录本，于是，这些含量显示了转译的高速率和有效的信使RNA的稳定化(Teyssot和Houdebine.,EurJ.Biochem 110 263-272(1980))。通过存在于成熟的信使RNA中的序列可调节特异信使RNA的稳定化，在本发明的优选方案中，可获得插入羊种系中的DNA序列的相似水平的表达。将它连接到与乳液中乳清蛋白质基因有关的DNA序列中来完成该过程，从而维持高水平的组织特异性表达及信使RNA稳定化：β-乳球蛋白是优选的基因。
将新基因转入小鼠中是现在惯用的方法，在转基因的小鼠中显示了外源基因的高水平的组织特异性表达，外源的DNA不仅包括结构基因，而且还包括5′和3′侧翼序列。尽管有大量的证据提出许多重要的调控元件位于信使RNA加帽位点的5′端(例如参见Mcknight和Kingsbury、Science 217 316-324(1982)；Payvar etal Cell 35 381-392(1983)；Renkawitz et al Cell 37 503-510(1984)；Karin et al Nature 308 513-518(1984))，另外，很明显，重要的调节序列，特别是介导组织特异表达的调节序列可以保留在结构基因中，或者在结构基因的3′端(Charnay et al Cit38 251-263(1984)；Gillies et al Cell 33 717-728(1983))。然而外来序列(即存在于成熟的信使RNA序列中)可含能有影响信使RNA稳定性的序列。表3详细说明了小鼠中外来基因的组织特异表达。表3
作者      构成物   重新移植的卵数   注射的DNA拷贝数  转基因子代     种系遗传 表达方式 表达部位
Gordon et alPNAS 77 7380-7384(1980)E.Wagner et alPNAS 78 5016-5020(1981)Brinster et alCell 27 223-231(1981)T.Viagner et alPNAS 78 6376-6380(1981)Costantini &Lacy Nature  29492-94(1981)Gordon & RuddleScience 412 1244-1246(1981) PR-SV40+havTKCir,VechBG,hav TKPR-mYT+havTKCir,Vec,U1700raDG1.Cir,Vec2.Lin,NovraBGLin,Vec,U14000+hIFN (alpha)(cDNA)Cir,Vec ′sev100s ＇ns240211nsns   500-12,0002,50020020,000100-100010,000  2/1735/337/417/469/241/10     ndndnd+4/4+     nd+4/7+ndnd 肝，肾
续表3
 Palmiter et alCell 26 701-71-(1952) PR-mift+hsvTKcir/Lin,Vec/Nov(U1700)     ns     200-600     10/69     +     7/10 主要是肝
Palniter et alHeture300611-515(1982)  ER-mMT+rGH     170     600     7/21     nd     + 主要是肝禹可变表达
Mcknight et alCell37 335-341(1983)  cTransferrin1．Cir,Vec2．Lin,VecU2000     ns  1.5002.140     3/19     +     6，7 肝，肾(尾，睾丸弱表达)
Lacy et aLCell 34 341-3S6(1983)  raBGLin,VecU14000+ ns 100-1.000 9/24 8/9 2/9 肌肉或睾丸
Palmiter et alScience 222809-814(1983) FR-MT+hGHLin(Vec)U230     1000     1.000     33/101     nd     + 主要是肝
Brinster eta alNature 306 332-336(1983)，Storh et alNature 310 238-241 mIgK(lit)     192     400     6/11     4/4     + (1×肾)
Hamnet et al.Nature 311 65-67(1984) PR-mMT+rGHOr hGHLin NovU18S     494     300-600     32/ns7/41     111     + nd
续表3
 Brinster et alCell 37 367-379(1934)  PR-SV40+svTLin.Vec     925     240-B30  25/95     + 脑瘤
Swift et alCell 3B 639-646(1954) rELastase tvpe ILin，(Vec)07000     320     200     7/37     7/7     5/S 只有胰
Grosschedl et alCell 38 647-658(1984) mIgM bew(功能性重排Lin ,Vec,0200     284     50  5/13-23     3/4     4/5 主要(单独)B和T淋巴
Stewart et alCell 38 627-637(1984) PR-mMTV+nMTYCLin．Vec, 02000     ns     500     13     nd     11/12 主要是唾液腺(乳瘤)
Ornitz et alNature 313600-602(1985) PR-rElastasetype I+hGHLin，Vec,0200     ns     nd  22/131     nd     13/18 只有胰腺
Sbani Nature314 283-206(1985) rHyosin lit-2Linr Vec，U1200     ns     500     4/26     3/4(1 mosaic)     2/4 只有骨胳肌
Rusconi & KohlerNature 314 330-334 (1985) rIgH hev & lit(k)功能性重排)Cir Vec,U3000-U5000     ns     20-100     5/13     4/5(1 mosaic)     5/5  B淋巴结核
Chada et alNature 314 377-380(1985) PR-mBG+hBGCirJ Vec orLin，Nov 01200     ns     400-800     10     nd     4/10 主要是红细胞低表达
续表3
Hanahan Nature315 115-121(1985) PR-rInsulinⅡ+svTLin,Vec(Lin,Nov,)    ns     20-150    5     5/5     + 只有胰腺(B细胞瘤)
Cir=用环DNA注射；Lin=转移前DNA的线性化；NoV=转移前移去的载体；
Vec=转移期间存在的载体；U=上游序列；U1000=1000bp的U序列；
C=鸡；h=人；hsv=疱疹单纯病毒；m=鼠；r=鼠；ra=免；sv=猴病毒40
BG=bea球蛋白；GH=生长激素；IFN=干扰素；Ig=免疫球蛋白；
PR=启动子；T=T抗源；
TK=胸苷激酶；hev=重链；Iit=轻链；nd=未测定的；ns=非专一性的。
鉴于以上理由，指导编码所需肽的DNA序列表达的上述优选融合基因包括一个或多个：启动子；转录起始位点；一个或多个(假定的)乳蛋白质基因的远5′末端调节序列；乳蛋白结构基因序列，侧翼连结，乳蛋白基因的3′端序列。最优选的融合基因包括所有这些类型的序列。
选择的融合基因包括插入乳清蛋白质基因的第一外显子中的编码所需肽的互补DNA序列，优先的是这种融合蛋白包含蛋白基因的5′端侧翼序列的数个kb片段。在这些结构中，最好通过自身的信号肽调节所需肽的分泌，因而对所需的肽，融合基因最好含有一个信号肽。然而，组织特异性信号肽对于新生的肽进入正确分泌路径的定位是重要的(如上讨论)。因此，特别优选的是将编码乳清蛋白基因信号肽的DNA序列准确地融合到编码成熟蛋白质的N端氨基酸的插入子DNA序列中。插入子的3′端最好在其终止密码子之后，但在信息切断和聚腺苷位点之前终止。在插入点下游一般保留其余的结构基因，以及一些3′端侧翼序列。
在转基因的动物中，这种构成最有可能获得高水平的乳腺特异性表达，最初的转录应进行适当的多腺苷酸化，并在保留在乳清蛋白质基因处联接。成熟的信使应含有用于有效稳定信使RNA的序列，在使用乳蛋白基因信号肽的构建中，转译成熟的信使RNA得到一个融合的前肽，其中从乳蛋白质基因中得到的信号肽有效地指导用插入的互补DNA编码的成熟肽的分泌。
如上讨论，羊的β-乳球蛋白是选择乳清蛋白质基因，用它去“导致”编码所需肽的互补DNA。对于羊来说，β-乳球蛋白是乳腺中表达最丰富的乳清蛋白，其信使RNA包括大约8％的总多聚腺核苷酸+RNA。准确定性基因并用以构建含有编码人体Ⅸ因子和人体α1抗胰蛋白酶互补DNA序列的融合构建体。
根据本发明的第二个方面，提供了一种含有编码肽的DNA序列的基因构建体，将该DNA序列重组列编码乳清蛋白的哺乳动物基因中，可以获得在成年雌性哺乳动物乳腺中的表达。
根据本发明的第三个方面，提供一种含有上述基因构建体的动物细胞，该动物细胞可以是胚胎细胞。
根据本发明的第四个方向，提供一种含有上述基因构建体的质粒。
第二、三和四方面的优选特征，如上文第一方面所述，mutatismutandis。
为了更好地理解本发明，将给出一些实施例，在实施例中将对附图作介绍，其中：
图1-4指出了按照本发明的方法，加工β-乳球蛋白融合基因的基本步骤。
图5表示羊DNA的Southern blot分析。
图5a表示羊的DNA Southern blot分析以及通过实际传代说明β-乳球蛋白融合基因的遗传。
图6表示小白鼠和羊的乳清蛋白的SDS-PAGE分析。
图7表示羊和小鼠蛋白质的Western blot分析。
图8表示从载有如上所述的β-乳球蛋白融合基因的转基因母羊中得到的乳蛋白RNA。
实施例1
A．重组DNA步骤
由于重组DNA步骤在Maniatis et al(“Molecular Cloning”Cold Spring Harbor(1982))和“Methods in Enzymology”Vols68,100和101(Wr.Grossman and Moldave,Eds)、Academic press中已说明，所以在这里没有详细说明。除非有特别需要说明，所有的化学品可从BDH Chemicals Ltd.Poole、Dorset、England或the Sigma Chemical Company、Poole、Dorset、Eng；and买到。
羊的β-乳球蛋白融合基因的构建
羊脾DNA的制备
从刚屠宰的Black face/Suffolk小羊中取出羊脾组织，基本上按照Rurch和Weintraub Cell 33 65(1983)介绍的方法分离细胞核。将核溶解在0.3M NaCl、10mM Tris HCl、10mM EDTA、1％SDSpH7.4和400mcg/ml蛋白酶K(Sigma Co.Fancy Road,Poole,Dorset BH17 7NH)中，在37℃下保温2小时。用苯酚/氯仿反复萃取，直到完全脱去蛋白质，用乙醇沉淀DNA链，使用玻璃棒将其取出，用70％乙醇/30％TE(TE=10mM Tris HCl、1mM EDTA,pH值为8.0)洗涤，在空气中干燥，并重新悬浮在TE中，使其浓度为1mg/ml。
羊脾DNAλ融合基因的构建
用λ噬菌体EMBL 3(Frischauf et al J.Mol.Biol 170 827(1983))构建基因库，在生产厂家建议的条件下，用5倍量的限制性内切酶Eco RⅠ和Bam HⅠ(由Amersham Intgernational Plc,Lincoln place,Green End.Aylesbury、Bucking ham shire、England提供)消化30mcg的噬菌体DNA。消化后，加入氯化精胺盐达到5mM浓度以沉淀出λDNA，在冰上保温1小时后，在台式微型离心机中，在10000g下离心15分钟，将DNA沉淀，在70％乙醇、300mM乙酸钠、100mM MgCl2中洗涤，再次离心，最后重新悬浮在1mg/ml浓度的TE中。
用限制性内切酶San 3A(Amersham)部分消化羊DNA，在37℃下20分钟内，用变量的Sau 3A[从5至40单位]消化100mcg羊DNA。加入15mM EDTA终止该反应，通过0.6％琼脂糖凝胶电泳分析消化程度，将适当消化的样品汇集起来，加到38.0ml 10-40％的pH为8.0的蔗糖浓度梯度溶液中，该溶液由1M NaCl、20mM、Tris HCl和5mM的EDTA组成，这些梯度溶液在Backmann SW 28回旋器中以26,000rpm离心分离24小时，从顶部取出不同蔗糖梯度液分，每液分收集1ml。每个液分的DNA分子的大小由琼脂糖凝胶电泳确定，依大小收集14-21kb长度的DNA分子液分。在TE溶液中稀释2倍后，加入2体积的乙醇，在-20℃沉淀DNA一夜，然后将DNA重新悬浮在TE中，浓度为300mcg/ml。
将7.5mcg由Bam HⅠ/Eco RⅠ切割的EMBL3和2.5mcg用Sau 3A部分消化的羊脾DNA，在50mcl含有60mM Tris HCl、6mM MgCl2、10mM DTT、0.01％明胶、0.25mM rATP和25单位的T4DNA连接酶的溶液中混合(Boehringer Company、Boehringer MannheimHouse、Bell Lane、lewes、East Sussex)的溶液中混合，在14℃下保温一夜。
连接后，使用从Amersham买到的试剂盒，根据生产厂商建议的步骤，在体外将1mcg DNA包装起来。包装库用E.coli菌株ED 8654滴定，预计该库的大小为5.7×106个空斑形成单位(pfu’s)，滴定完成后，立即将未扩增库的部分铺放在10×22cm2的Petri平皿上(大平板)，该平皿含有大约为50,000 pfu’s/板密度的E.coli菌株ED8654。
筛选λ基因库
根据Benton和Davis(Science 196 180(1977))的方法，挑取大平板中的噬菌体，放到20cm2的硝基纤维膜上(schieicher和Schull、Postfach 4,D-3354,west Germany)。通过Rigby etal(J.Mol.Biol.113,237(1977))介绍的方法，将β-乳球蛋白互补DNA克隆(p931-gift of J.C,Mercier,INRA,Jouey-en-Josas,Paris)通过32p dCTP缺口转译达到比活性＞108apm/mcg,β-乳球蛋白互补DNA按照Mercier et al在Biochimie 67 959-971(1985)的描述进行克隆，p931克隆序列由Gaye et al在Biochimie68,1097-1107(1986)中给出。
根据Maniatis et al在Cell 15 687(1978)中的方法，将滤膜预杂交、杂交和冲洗，最后的洗涤是在1×SET中于68℃下进行的(SET是pH为8.0的0.15M NaCl,2mM EDTA、0.03M Tris HCl)。对滤膜吸滤干燥，在X-射线底片曝光之前点32p对它们进行标记定位。用消毒巴氏吸管的钝端挑取32p标记点，以此为对照来定位大平皿上的阳性杂交空斑。用E.coli ED 8654对取出的最初空斑进行滴度测定，并铺在15cm直径的培氏平皿上使空斑密度将近为500/板，通过如2介绍的方法将这些板重新进行筛选，使用牙签将单个的阳性杂交空斑挑出，加入1.0ml的噬菌体缓冲液中(噬菌体缓冲液是pH为7.4的10mM Tris HCl、10mM MgCl2、0.01％白明胶)。
克隆的β-乳球蛋白DNA的制备
将0.4ml再悬浮的噬菌体溶液加入到E.coli ED 8654(Borg etal Mol.Gen.Genetics 146 199-207(1976))中，铺放到9cm直径的培氏平皿上，得到细菌菌苔的汇合解裂。从得到汇合的平板上，将上层琼脂刮到10ml的噬菌体缓冲液中，并加入几滴氯仿保温过夜，在5000rpm下离心分离5分钟，将细菌碎片沉淀下来，在4℃下保存噬菌体液，并用E.coli ED 8654进行滴定，测出pfu/ml。
在37℃10ml的10mM MgSO4中将8×107pfu’s吸附到7×109E.coli细胞上，15分钟后，将2.5ml各等分试样加入到装有100mlL肉汤/10mM MgSO4的1升烧瓶中，使劲震动细菌悬浮液几小时，每小时测一次OD540。几小时后OD540降低，产生了溶菌，完成后，向每100ml培养物中加入0.2ml氯仿，该培养物在4℃下放置一夜。
在10,000rpm下离心分离15分钟除去细菌碎屑，将10mcg/mlRNA酶A和10mcg/ml RNA酶Ⅰ加入到上清液中，然后在37℃保温1小时。保温后加入NaCl使浓度达到40g/l，并加入聚乙二醇(PEG)至10％，将该制备物冷却到4℃，放置至少2小时沉淀噬菌体。在10,000rpm下离心15分钟使噬菌体沉淀，并重新悬浮在16.0ml的噬菌体缓冲剂中。在14.0ml的超级离心管内，装有1.5ml 56％CsCl、1.5ml 45％CsCl和2.5ml 31％CsCl(溶于噬菌体缓冲液)的8.0ml的该悬浮液在上述CsCl梯度溶液中分层。在20℃35,000rpm下在振动回旋器中梯度离心1.5小时。使用一根带针头的注射器吸去噬菌体带层，提纯噬菌体颗粒，进行第二梯度离心分离。
将提纯的噬菌体颗粒透析到pH为8的0.1mM NaCl、10mM TrisHCl、1mM的EDTA中，然后使用苯酚和氯仿连续萃取脱去蛋白质，加入NaCl到最终浓度0.3M，然后添加2体积的乙醇沉淀噬菌体DNA，在10,000rpm下离心20分钟，将DNA沉淀成片，用70％乙醇、30％TE洗涤、干燥、然后重新悬浮在TE中，最终浓度200-400mcg/ml。
重组β-乳球蛋白克隆的鉴定
用多种限制性内切酶限制上述的DNA制备物的0.5mcg等分试样，单消化产物和双消化产物在0.6％和1％琼脂糖胶上进行电泳分析，通过Southern(J.Mol.Biol.98 503(1975))的方法，将这些凝胶上的DNA转移到Hybond膜(Amersham International、Littlechalfont、Bucks)上的硝基纤维素滤纸上，杂交到用32P标记的P931。使用的方法基本如上所述，杂交过的滤纸通过放射自显影进行分析，用多种限制性内切酶和P931的5′端和3′端的特异探针，制成一个限制性酶切图谱，从而测定出β-乳球蛋白基因的大小和方向(参见图1)。
β-乳球蛋白克隆的识别和基因5′端与3′端的准确位置可直接通过DNA序列确认。通过合适地限制酶切位置，基因片段被克隆到质粒载体及M13载体上，使用Sanger et al(PNAS 745463(1977))的双脱氧方法进行测序。
β-乳球蛋白融合基因的加工
加工含有β-乳球蛋白以及在乳腺中表达的所需基因的融合基因的方法如图1-4所示，该方法使用从λ克隆得到序列，它的分离和鉴定如上所述。该方法包括将所需的DNA序列插入对应于β-乳球蛋白信使RNA的5′端非转译区域的DNA区域。从这个基因的信使RNA转录而来的转译的蛋白质含有目的蛋白的分泌肽。
按照图1所示，将1.4kbλ噬菌体SS-1的sphⅠ-Eco RⅠ片段连接到载体质粒pPoly上，构成亚克隆pSS-1tg SE，其中载体质粒pPoly被SphⅠ+Eco RⅠ切割，转化菌株-E,coli菌株DH1，按照Hanahan和Meselson的方法(Gene10 63(1980))进行适当的制备。将对氨苄青霉素有抵抗力的克隆分离。再用Birnboim和Doty的方法(Nuc.Acid Res.7.1513(1979))制备DNA。
在图1中，顶端箭头代表存在于λSS1内的β-乳球蛋白转录单位的方向和大小(大约4.9kb)；比例始终相同。一般说来，在图1至图4中，应当注明只示出有关限制酶切位点。大的开口方框代表λEMBL3臂；窄的开口方框代表pPoly；窄的阴影方框代表要表达的目标序列；线代表对应于β-乳球蛋白基因克隆羊的序列以及它的邻接序列。
通过用限制性核酸内切酶pvuⅡ(图2)的消化作用使pSSItg SE线性化，限制性核酸内切酶pvuⅡ切割对应于β-乳球蛋白信使RNA5′端未转译的序列的DNA区域内的质粒中唯一的酶切位点。将5mcg完全消化后的质粒溶解在pH为9.0的0.5M Tris HCl、10mMMgCl2、1mM MnCl2、10mM精胺中，用0.01-0.04单位的牛肠磷酸酶(Boehringer)在56℃下处理30分钟，牛肠磷酸酶在0.5％r SDS中失活，用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀的方法回收DNA。
根据Dr.G.Brownlee Sir William Dunu School of Pathology、University of oxford、oxford的方法制造Ⅸ因子DNA克隆P5′G3’CVI，这个克隆含有从pAT158中获得的质粒中的1579bp插入物(Twig et al Nature 283,216-218(1980))，它从离开假定的信使RNA初始点-7的TagⅠ位点到+1572并含有编码人体Ⅸ因子的完整序列(Arson et al Embo J.3,1053-1060(1984))。
将含Ⅸ因子序列的1553bp长度的NheⅠ-HindⅢ片段切断，并用如下描述的方法从载体序列中提纯。根据Maniatis et al描述的技术(“Molecular Cloning”Cold Spring Harbor(1982))，使用Klenow多聚酶使它的HindⅢ端和NheⅠ端钝化并将该片段连接到pvuⅡ限制的、磷酸酶处理的pSSItgSE(如上描述)，在将其E.coli DH-1转化成对氨苄青霉素抗性后以形成pSSItgSE-Ⅸ因子。
Ⅸ因子互补DNA序列以下表示为TARG，见图2。
按照如上所述制备质粒DNA，并通过用合适的限制性内切酶消化检验，用SphⅠ+Eco RⅠ消化质粒DNA，在含有0.5mcg/ml溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(sigma)的1％琼脂糖胶上电泳，用UV灯(Ultra-Violet Products、Inc,San Gabriel,California,USA)照射测出有关的SphⅠ-Eco RⅠ片段的位点。在区域前部插入一块渗析膜，DNA电泳至膜上，将DNA从渗析膜上洗脱出来，用“Elu-tip”[Schleicher and Schll,Postfach 4,D-3354,Dassel,W.Germany]，根据生产厂家建议的方法分离DNA。
将λSS-1的XbaⅠ-SalⅠ片段连接到XbaⅠ-SalⅠ消化的pPoly上构建成质粒pSSⅠtgXS(图3)，分离克隆，按前文所述制备质粒DNA，从这个质粒或由其获得的小亚克隆各自分离出两个DNA片段：10.5kb SphⅠ(部分)Hind Ⅲ碎片和1.2kb Eco RⅠ-HindⅢ碎片(图4)。通过如上所述的凝胶电泳方法分离这些碎片。
Sph-Ⅰ-Eco RⅠ、SphⅠ-HindⅢ和Eco RⅠ-HindⅢ碎片以大致相同的比例连接在一起，使用该DNA转化DH-1，按照如上介绍的方法制备质粒DNA(pSSItg XS-TARG)用XbaⅠ和SalⅠ消化，从载体中切去β-乳球蛋白融合基因。用凝胶电泳方法，然后用“Elu-tip”提纯这种片段，将用乙醇沉淀出的DNA形成小丸，重新悬浮在TE中，进行苯酚/氯仿萃取、重新沉淀，DNA最终再悬浮于TE中直接用于显微注射。
B．转基因动物的构成
收集受精卵
方法类似于Gordon和Ruddle在“Methods in Enzymology”(1983)Vol 101(W.Grossman和Moldave,Eds)Academic Press pp411至pp432中描述的用于小鼠的方法。
收集在发情期经诱导超数排卵的母羊胚胎。其中发情期靠孕激素类控制，已受精的成熟母羊用由60mg medrog proxyesteroneacetate浸润的子鞘内海绵处理12-16天(Veromix,Upjohn Ltd,Crawley)。在孕激素类处理结束前28小时及在取出海绵时，肌肉注射2次马的促卵泡激素[3.5-4.3mg水溶液/羊]，取出海绵后20-72小时，使发情期的羊进行多次交配，每天在8.00、12.00、16.00和20.00小时开始观察母羊的发热情况，在发情期开始36-72小时后，由外科手术收集在1-4细胞发育阶段的胚胎。
通过静脉注射5-乙基-5-(1-甲基丁基)-2-巴比土酸钠[Intraval,May and Baker]和保持在半封闭的循环系统中的氧和氧化二氮混合物中进行麻醉，胚胎的收集依照Hunter etal(J.Agric.Sci.46 143-149(1955))的方法进行。将生殖系统通过中心切口露出来，将尼龙导管通过伞毛插入到输卵管中，介质通过钝园的18号针，强制通过子宫输卵管接合处，并延着输卵管引入子宫腔内。在含有能源和蛋白质的磷酸-缓冲盐水中收集胚胎[0vum Culture Medium,Flow Labs,Irvine,Scotland]。在卵的贮存和微量注射期间，这种介质补充20％的牛胎血清。
注射DNA
将DNA(1-2mcg/ml)注射到单外卵细胞的原核中，或注射到2个和4个卵细胞的一个或多个核中。在充有卵培养介质的室中操纵卵，该室包括具有玻璃支架的硅化显微镜玻片(25mm×2mm×3mm)，它与镜玻片的长边相平行，盖玻片置于支架顶部，连接部分用硅酮脂密封，室的开端充满Dow-Corning 200流体(50cs)(BDHChemicals)。
待注射的卵用粗头吸管吸住，用Nikon Diaphet翻转显微镜(Nikon(uk)Ltd.Haybrooke,Halesfield 9,Telford,Shropshire)可以看见原核或核，使用从在显微电极拉出器(CampdenInstruments,186 Campden Hill Road,London)上的毛细管(硼硅酸盐玻璃-1mm外径，带有丝的薄壁-Clark ElectromedicalInstruments,POBOX 8,Pangbourne,Reading.RG8 7HU)中伸出的微量移管，将DNA注射到原核或核中，用显微控制器(LeitzMechanical Micro-manipulators.E.Leitz(Instruments)Ltd,48Park street,Luton,England)控制两种显微仪器的位置。含有待注射的DNA的微量移管通过空气密封管连接到100ml玻璃注射器，通过注射器的压力可以进行注射，由原核或核的可见膨胀显示注射成功，注射后的卵在室温下保温30分钟以上，使损坏的卵进行可见的退变。
将判定为注射存在的胚胎转移到未交配的受体母羊中，[Veromix,Upjohn Lta]其发情期周期与用孕激素处理过的卵供体同步，使用细口移管将胚胎转移到输卵管中，向每只母羊转移4个胚胎，这些胚胎分布在输卵管之间。
母羊的身体是用可溶的肌原纤维细丝[Desscon,Dayis andGreck]和带有Michel clips的皮肤包转起来，每只羊在手术时注射抗菌素[Duphapen L.A.,Duphar,Amersham]，手术后10-20天除去Michel clips。
发育和成长
母羊从麻醉中恢复过来后，返回小牧场，在那里它们度过整个怀孕期。根据需要补充秣、芜菁和浓缩食物，受孕第3个期间，通过超声波扫描测出胎的数目(White et al Vet.Rec.115,140-143(1986))。然后就要注意怀孕母羊中胎数目的变化，当接近预产期时，将羊放到室内以使监督，以及在生产时给予协助。
转基因羊的分析
生产小羊后至少2周，用皮下注射器通过静脉穿刺移取10ml血样，并收集在加了肝素的管中。从血样中制备DNA如下：向10ml血样中加入30ml(155mM NH4Cl、10mM KHCO3、1mM EDTA)，该混合物冰浴15分钟，在1500g作用下，40℃分离10分钟，分离出白血细胞，并重新悬浮在10ml SE(75mM NaCl、2mM EDTA)中，然后在SE中洗涤一次。加入蛋白酶K达到100mcg/ml，再加入1ml 20％SDS，该制备物保温四小时，用苯酚/氯仿进行反复萃取，直到全部脱去蛋白质。将1/30th Vol的0.3M NaAc-1 Vol异丙醇加到水相中，沉淀DNA，将沉淀取出，在70％乙醇中清洗，并重新悬浮在TE中。
10mcg整份DNA制备物用合适的限制性内切酶(例如Eco RⅠ)消化，在0.8％的凝胶上电泳。通过Southern标记分析这些胶，基本上按照描述的方法进行杂交。
阳性杂交动物，即那些含有融合基因的动物(假定的染色体位置积分)长大成熟，雌性动物交配、一旦分泌乳汁，一经分析乳汁中含有所需的物质(参见实施例7)。使阳性的雄性动物交配后，筛选出含有外源DNA序列的雌性子代。随后，分析其乳汁以找出所需的物质。
实施例2
除了编码所需多肽，所编码的α1-抗胰蛋白酶的DNA序列是根据R.Cortese.EMBL.Meyerhofstrasse 1,D-6900 Heidelberh,WestGermany而获得之外，实施例2重复了实施例1的方法。切除含有1294 bp插入物(参见Ciliberto et al Cell 41 531-540(1985))的Tag 1-Bst NⅠ片段，从此克隆中纯化并通过实施例1中描述的方法将其克隆到pSSⅠtgSE的PvuⅡ位点。
实施例3
重复实施例1的方法，只是用质粒pUC 18(Pharmacia Ltd,Pharmacia House,Midsummer Boulevard,Milton Keynes”,England)取代质粒pPoly。
实施例4
重复实施例1的方法，只是用质粒pUC 19(Pharmacia Ltd,Pharmacia House,Midsummer Boulevard,Milton Keynes”,England)取代质粒pPoly。
实施例5
转基因羊的传代
从质粒pSSItgXS-FIX(也称为pSSItgXS-TARG，参见实施例1)切下的SalⅠ-XbaⅠ片段，注射到羊卵中，每个受精卵注射将近200个拷贝，252个卵细胞中，有一个卵细胞被注射，并再移植到受体母羊中，52只小羊出生。分析由血样制备的DNA，表明其中四只载有外源β-乳球蛋白Ⅸ因子序列(表4)。
表4转基因羊的概况
小羊编号     性别      构成物      拷贝数(大约)
6LL225        M        BLG-FIX         40
6LL231        F        BLG-FIX         10
6LL239        M        BLG-FIX         1
6LL240        F        BLG-FIX         10
所有的卵在原核阶段注射，不进行离心分离，
拷贝数通过定量扫描光密度分析法测定。
图5是羊DNA的Southern标记分析，羊的DNA按照介绍制备，用给出的限制性内切酶消化，在0.8％的琼脂胶上电泳，并转移到HY-bond膜上(Amersham International,Little Chalfont,Bucks,UK)。先用32p标记的质粒pSSⅠtgXS-FIX(泳道1-7)，然后(脱去膜后)用质粒P931(泳道1′-7′)探测滤膜，pSSⅠtgXS-FIX复制对照包含在指示的胶上。泳道1，对照(非基因转移的)羊DNA，泳道2和3对照DNA以及P5′G3′CVI1和5复制当量；泳道4-7，转基因羊6LL225、6LL231、6LL239和6LL240、中的DNA，每个转基因羊产生的Ⅸ因子杂交带的5.95kb(EcoRⅠ)和6.05kb(BamHⅠ)与从pSSItgXS-FIX中获得的因子大小一致，这表明转移基因的5′端是完整的。观察不到与羊的Ⅸ因子的明显杂交，与P931杂交显示了预测的4.4kb Eco RⅠ和2.1kb Bam HⅠ片段。尽管内源的羊β-乳球蛋白基因对在这些区域内杂交有作用，但在6LL225、6LL231和6LL240样品中的密度表明这些区域主要来自注射了β-乳球蛋白Ⅸ因子融合基因，证实了其结构的3′端是完整的。用HindⅢ切除的DNA：泳道1，从pSSItgXS-FIX中切除的12.1kb提纯的SalⅠ-XbaⅠ片段；泳道2-5，来自6LL225、6LL231、6LL239和6LL240的DNA。探针是P5′G3′CVI。杂交12.1kb HindⅢ片段(6LL225、6LL231和6LL240)与注射的片段大小一致，它显示了从头到尾的排列，同样的羊共有的15.6kb片段显示也存在从头到头的重复。这些数据表明在羊6LL225、6LL231和6LL240中整合了pSS1tgXS-FIX中(β-乳球蛋白Ⅸ因子融合基因)获得的SalⅠ-XbaⅠ片段，其结合没有明显的前后顺序排列，对于羊6LL239，其数据与这个片段的单个未重排排列复制的整合作用一致。实施例6因子Ⅸ序列遗传到下一代
实施例5得到的雄性转基因羊6LL225(载有将近40个从pSSItgXS-FIX制备的SalⅠ-XbaⅠ片段拷贝数)与许多Finn-Dorset和Friesland母羊连续地交配。使用所述的人体Ⅸ因子质粒探针P5′G3’CVI，对由血样制备的DNA进行Southern标记分析来分析其后代，对它的一些后代进行的Southern blot分析列于图5a中。泳道数为1、3、4、5、6、7、9、11、43、45、48和49是来自6LL225后代的DNA(称为7R1、7R3等至RR49)；泳道C211，来自对照(非转因基的)羊6LL211的DNA泳道5-211或1-211，来自羊6LL211的DNA以及5或1复制当量的pSSItgXS-FIX。这些数据表明转基因羊6LL225已将Ⅸ因子序列转移到它的12个子孙中的6个中，从而这些序列已被插入到种系中。
实施例7
编码羊的β-乳球蛋白基因在转基因小鼠中的表达
转基因小鼠一般是通过Gordon和Ruddle在Methods inEnzymology Vol 101(1983),(Eds,Wu,Crossman和Moldave)Academic Press pp 411-432描述的技术方法生成的，形成了几个含有克隆λSS-1的SalⅠ片段的转基因小鼠(图3)，其中之一，B-Lac7带有15-20个拷贝数的SalⅠ片段。通过多次交配繁殖出许多遗传有SS-1序列的后代。
生产一窝小鼠后3-12天，获取小鼠的乳液，该过程是这样进行的。先进行腹膜注射0.3IU催产素(Sigma)和7mcl/g动物的Hypnorm/Hypnovel(Fleckneil,Vet,Rec 1983年12月10日，p574)，在每四个小时周期中，先移走动物幼子后，等待20分钟，然后用手按摩各个乳腺，将乳液收集到50ml的毛细管中。
小鼠乳液用蒸馏水以1∶5稀释，在间歇式离心分离机中粗略离心脱脂，添加1N HCl使得pH值为4.6，以沉淀酪蛋白，离心分离后，移去乳清蛋白，用5％的三氯乙酸沉淀，根据Laemmli(Nature 277、680-684(1970))的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(图6表示鼠和羊的乳清蛋白质的SDS PAGE分析，泳道1，标准蛋白质；2，标准的小鼠乳清；3，羊的乳清；4，标准的小鼠乳清；5,B-Lac7乳清；6,B-Lac7乳清(25×5)，相应于在标示踪迹的和羊乳清中的β-乳球蛋白的电泳带标有箭头)。使用兔子中抗羊β-乳球蛋白的抗血清，通过用凝胶电泳解析的样品进行Westernblotting(burnett,Anal、Bioches,112,195-203(1981))检测羊的β-乳球蛋白。图7表示Western blot分析。Western blot与兔的抗-β-乳球蛋白血清和抗兔Ig过氧化物酶血清反应。(泳道1，标准蛋白质；2，羊的乳清；3,B-Lac7乳清；4，标准的小鼠乳清；5，提纯的β-乳清蛋白；6，考马斯亮兰染色的羊乳清平行的跑带)。
分析表明，大量的乳球蛋白分泌到小鼠乳液中，表明在B-Lac7中高水平地表达了SS-1。这个克隆可能含有所有必要的序列，以确保在转基因小鼠的乳腺中高水平的表达，从而预测，即使不完全是如此，在同源种类中，即在转基因羊中也能有效地起作用。因此，可以预计由这个克隆得到的融合基因也能在羊的乳腺中表达(有效)。
实施例8
人体Ⅸ因子在转基因母羊乳液中的表达
两只雌性羊，6LL231和6LL240(各载有将近10个拷贝数的从pSSItgXS-FIX制备的SalⅠ-XbaⅠ片段)与Fast Friesland公羊进行连续交配。分娩后，使小羊自然哺乳2周，以刺激分泌乳汁，用手工将乳液(每个动物约25ml)收集到无菌的塑料容器中，同样收集对照(非转基因的)分泌乳汁羊的乳液，在-20℃冷冻这些样品，运送到位于爱丁堡皇家医院的苏格兰国家输血机构，在那里对人体Ⅸ因子进行放射免疫测定。
转基因乳液和对照乳液在4℃渗析一夜除去水份，然后冷冻干燥。冷冻干燥后的样品再悬浮于蒸馏水中，而后离心分离出乳脂，用RIA检验人体Ⅸ因子的存在，方法如下：
用在RIA缓冲剂(50mM Tris/HCl,0.25％凝胶，1％吐温-20,10mMHCl,pH值7.2)稀释标准人体血浆，取1/10-1/1280的稀释液，建立标准曲线(参见图8)。为了消除分析过程中对乳剂的任何干扰，将标准血浆同样稀释于对照乳剂中，作出标准曲线，分析来自6LL231和6LL240冷冻干燥乳剂样品的稀释液，RIA中的每个试管包括：50mcl RIA缓冲液，50mcl样品稀释液，稀释度为1/30000的50mcl兔多克隆抗Ⅸ因子抗体(Dako-patts)，以及50mcl 1125标记的Ⅸ因子。建立了包含100mcl RIA缓冲液，50mcl抗体和50mcl的1125Ⅸ因子的用于最大结合的对照，还建立了包含150mcl RIA缓冲液，50mcl 1125标记的用于非特异结合的对照。
保温一夜后，将50mcl与驴子抗-兔IgG结合的琼脂糖-S1000在试管中混合，并通过蔗糖分离回收的小珠。RIA测定对0.125国际单位(iu)/dl敏感，含有高于该含量的Ⅸ因子的任何样品将抑制在RIA中的最大结合。
对下列样品是用RIA中的结合百分数与稀释系数的倒数作图。
1．标准血浆。
2．标准血浆加乳剂。
3．来自6LL231(T1)的冷冻干燥的乳剂样品。
4．来自6LL240(T2)的冷冻干燥的乳样样品。
这些结果显示于图8。
来自6LL231(T1)和6LL240(T2)的乳剂，分别在2.5iu/dl和8.0iu/dl时显示出可探测出Ⅸ因子的含量水平。在测定的灵敏度范围内，对照乳剂未测出活性，这些数据表明载有β-乳球蛋白-Ⅸ因子融合基因[特别是从pSSItgXS-FIX(通常也称为pSSItgXS-TAEG)中得到的SalⅠ-XbaⅠ碎片]的转基因母羊表达这个基因，并将人体蛋白质分泌到乳液中，这就为以这种方式生产人体蛋白质建立了基础。

Claims (24)

1．一种在乳液中生产含有来源于动物的多肽的物质的方法，该方法包括：
(a)在体外在一种遗传构建体中掺入：
(ⅰ)编码所述多肽的DNA序列；和
(ⅱ)在成年的雌性胎盘哺乳动物的乳腺中指导编码所述多肽的DNA序列表达的，来自β-乳球蛋白基因的DNA序列；
(b)将该遗传构建体掺入非人类胎盘哺乳动物的种系中；
(c)任意选择地繁殖一种雌性哺乳动物，该哺乳动物的种系含有从步骤(b)中产生的哺乳动物的遗传构建体；
(d)在由步骤(b)或(c)中产生的成年雌性胎盘哺乳动物的乳腺中生产乳液；以及
(e)收集在步骤(d)中产生的乳液。
2．根据权利要求1所述的方法，其中含多肽的物质是随后从成年雌性哺乳动物的乳液中回收的。
3．根据权利要求2所述的方法，其中含多肽的物质是在转录后修饰之后从乳液中回收的。
4．根据权利要求1的所述的方法，其中含多肽的物质是人体血液蛋白质。
5．根据权利要求1所述的方法，其中含多肽的物质是肽激素。
6．根据权利要求1所述的方法，其中含多肽的物质是血液凝固因子或血液凝固因子的亚基。
7．根据权利要求1所述的方法，其中含多肽的物质是一种酶。
8．根据权利要求1所述的方法，其中成年雌性非人类哺乳动物是用一种方法产生的，该方法包括：
(a)在体外在一种遗传构建体中掺入：
(ⅰ)编码所述多肽的DNA序列；和
(ⅱ)在成年的雌性哺乳动物的乳腺中指导编码所述多肽的DNA序列表达的，来自β-乳球蛋白基因的DNA序列；
(b)通过注射入哺乳动物的胚胎细胞或受精卵中而将遗传构建体掺入哺乳动物的种系中；以及
(c)使已受注射的受精卵或胚胎发育成成年的哺乳动物；以及
(d)任意选择地繁殖一种雌性哺乳动物，其种系含有从步骤(c)中产生的哺乳动物的遗传构建体。
9．根据权利要求8所述的方法，其中向两细胞胚胎的核进行注射。
10．根据权利要求8所述的方法，其中将直链DNA分子注射到卵的原核或核中。
11．根据权利要求1所述的方法，其中哺乳动物是家畜哺乳动物。
12．根据权利要求11所述的方法，其中哺乳动物选自Suidae科，Ovis属，Capra属，以及Bos属。
13．根据权利要求11所述的方法，其中哺乳动物是奶羊。
14．根据权利要求1所述的方法，其中β-乳球蛋白是羊的β-乳球蛋白。
15．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含一种启动子。
16．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含一个转录起始位点。
17．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含一个或多个β-乳球蛋白的远侧的5＇调节序列。
18．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含结构性β-乳球蛋白质基因序列，该序列可任意选择地包含内部调节序列。
19．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含β-乳球蛋白3′侧翼序列。
20．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含插至编码β-乳球蛋白基因的第一个外显子中的，编码所述来源于动物的多肽或酶的cDNA序列。
21．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体包含一些编码β-乳球蛋白基因的5′侧翼序列。
22．根据权利要求1所述的方法，其中遗传构建体含有所述来源于动物的多肽或酶的信号肽。
23．根据权利要求22所述的方法，其中将编码β-乳球蛋白的信号肽的序列准确地与编码所生产的物质中成熟多肽的N-末端氨基酸的DNA序列融合。
24．根据权利要求1所述的方法，其中DNA序列的3′端在它的终止密码子之后，但是在它自己的多聚腺苷酸添加位点之前终止。
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