JP2863789B2 - 効率的な分泌のための乳腺に出される蛋白におけるｄｎａ配列 - Google Patents

効率的な分泌のための乳腺に出される蛋白におけるｄｎａ配列

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はその乳に外来の化合物を分泌する遺伝子導入
（transgenic）された哺乳動物と、薬学、医学、食料、
農産物、ガン研究などの分野に有用な化合物を含む改良
された乳を分泌する遺伝子導入された哺乳動物を作る方
法に関する。
発明の背景 カゼインは主要な乳蛋白であり、通常乳分泌期の間に
合成され、乳腺にのみ分泌される。カゼインの遺伝子の
最初の詳細な性格付けは本発明者の研究室でなされた
〔ユー・リー（Yu−Lee）等、Nuc.Acids Res.,第14巻、
1833〜1902頁（1986年）〕。
その紹介以来、DNAを受精した一個の細胞である胚（e
mbryo）の前核に微小注入することが多くの遺伝子をマ
ウスの染色体に転入するのに使われてきた〔ゴードン
（Gordon）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第77巻、7380
〜7384頁（1980年）；パルミターとブリンスター（Palm
iter and Brinster）、Cell第41巻、343〜345頁（1985
年）；パルミターとブリンスター（Palmiter and Brins
ter）、Ann.Rev・Genet.，約20巻、465〜499頁（1986
年）〕。この技術は遺伝子の発現と制御に関する特定の
ヌクレオチド配列の研究や家畜類の改良のための実用に
有用である。遺伝子導入されたヒツジやブタがいま作ら
れている〔ハマー（Hammer）等、Nature（London）第31
5巻、343〜345頁（1985年）〕。家畜での研究が進んで
いる〔クレーマー（Kraemer）等、「ウシとヒツジにお
ける遺伝子移入」バンバリ報告、No.20、221〜227頁（1
985年）〕。
農業における実用的な遺伝子導入動物を作るためには
外来の遺伝子を宿主動物の染色体に組みこみその子孫に
移していかねばならない。適当な組織で発現しなければ
ならない。またその発現が高率で、また正常なあるいは
人為的な制御機構を受ける。導入される遺伝子の発現の
組織特異性はラットのエステラーゼＩ遺伝子、IgL鎖及
びＨ鎖の遺伝子、ラットのミオシンＬ鎖遺伝子及びマウ
ス／ヒトβ−グロビン遺伝子などのいくつかの遺伝子に
ついて報告されている〔スウィフト（Swift）等、Cel
l，第38巻、639〜646頁（1984年），ストーブ（Storb）
等、Nature（London）、第310巻き、238〜241頁（1984
年）；グロスシェルドル（Grosscheldl）等、Cell，第4
1巻、885〜897頁（1984年）；シャニー（Shani）Nature
（London）第314巻、283〜286頁（1985年）；チャダ（C
hada）等、Nature（London）第314巻、377〜380頁（198
5年）〕。組織特異的な発現を司どる要素は完全には解
明されていない。MMTVプロモーターとマウスのメタロチ
オネイン・プロモーターでの研究による証拠が５′−fl
ankingDNAにおけるDNA配列が重要であることを示唆して
いる〔スチュアート（Stewart）等、Nuc.Acids Res.，
第12巻、3895〜3906頁（1984年）及びパルミターとブリ
ンスター（Palmiter and Brinster）、Cell，第41巻、3
43〜345頁（1985年）〕。
この問題に対する鍵は遺伝子導入動物と細胞培養系の
相方の研究から生じはじめている。５′−側のDNAによ
る特定のエンハンサー配列−時には翻訳開始点よりはる
か上流に位置している−とプロモーター自身の中あるい
はそれに近いところの配列が組織特異的な遺伝子発現に
関与していることは明らかである。遺伝子導入されたマ
ウスの遺伝子発現はβ−グロビン、エステラーゼ、α−
フェトプロテイン、α−Ａ−クリスタリンやインスリン
などの場合では相同遺伝子からの５′−側DNAまたは
３′−側DNAを含めることによって適当な組織に向けら
れてきた〔マグラム（Magram等）、Nature（London）、
第315巻、338〜340頁（1985年）；オーニッツ（Ornit
z）等、Nature（London）、第313巻、600〜602頁（1985
年）；クラムラウフ（Krumlauf）等、Mol.Cell.Biol.，
第５巻、1639〜1648頁（1985年）；オーバービーク（Ov
erbeek）等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、第82巻、7815
〜7819頁（1985年）；ハナハン（Hanahan）、Nature（L
ondon）、第315巻、115〜121頁（1985年）〕。
インスリンの遺伝子は最も精力的に解析されている。
ラットのインスリンＩ遺伝子はハムスターのインスリノ
ーマ（HIT）細胞において標識遺伝子の発現をBHK細胞と
比べると−103から−133の間のエンハンサー領域とプロ
モータ領域自体の両方を必要としている〔エドランド
（Edlund）等、Science、第230巻、912〜916頁（1985
年）〕。さらにラットのインスリンII遺伝子は遺伝子導
入マウスの膵臓のβ−細胞にSV40のオンコジーンを発現
させるのに530bpの５′−側配列を必要としている〔ハ
ナハン（Hanahan）、Nature（London）、第315巻;115〜
121頁（1985年）〕。
最近のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）遺伝子の発現にはネズミのα−Ａ−クリス
タリンの−364から＋45までのDNA断片にCAT遺伝子をコ
ードしている配列を結合することによって眼のレンズに
向けられてきた〔オーバービーク（Overbeek）等、Pro
c.Natl.Acad.Sci.,USA、第82巻、7815〜7819頁（1985
年）〕。
特定の遺伝子を乳腺に向けさせる能力が効果的な蛋白
合成と分泌をもたらし窮極にはバイオテクノロジーや薬
学、医薬、食品科学やガン研究の分野に影響を与えるこ
とになろう。例えば、多くの発現ベクターがバクテリア
や酵母で効果的に蛋白を合成するために開発されている
ものの、これら蛋白を正しく加工できないために多くの
場合、これらの蛋白の生物活性は損われている。哺乳動
物細胞培養系の開発がもう一つの戦略を提供するがこの
ような細胞培養の費用のために実現しにくい。乳腺は１
日当り何グラムの蛋白を合成、分泌するための非常に効
率のよい生体のモデルを提供している。哺乳動物の一生
の中の授乳期の間分泌を続ける。加えて、乳腺は蛋白の
分割燐酸化、糖鎖修飾などに必要な翻訳後の修飾系をも
っている。それ故、このやり方を使うと、生物的に重要
な分子を効率的に合成し分泌することが可能となろう。
例えば、蛋白、ホルモン、成長因子、薬剤、脂質、炭水
化物などが合成され分泌され、医薬品の新しい道具を提
供する。この方法論はまた乳腺液（＝ミルク）の蛋白、
糖質、脂質の組成を変え、また静菌剤を含ませることに
よってその組成を操作する方法を提供している。この変
換は農業や食糧工学の科学に重大な変化を示すだろう。
さらに、オンコジーン（oncogene）（発がん遺伝子のこ
と）を乳腺に集める能力はそれが乳腺上皮細胞の形質転
換の基本的メカニズムを解析するためのモデルを提供す
るために基礎的な乳癌研究を可能にするだろう。生物体
外（in vitro）での細胞培養系を用いたのではこの方法
論は利用できない。
本発明は乳腺に遺伝子の発現をおこさせるばかりでな
く授乳期にこれら蛋白を効率的に分泌するのに使われて
いる方法を提供している。
発現の要約 本発明の対象は生物学的に活性のある作用物、すなわ
ち蛋白を乳の中に合成させる組換えDNA遺伝子複合体で
ある。
本発明のもう一つの対象はその乳腺に生物的に活性の
ある作用物を分泌する遺伝子導入哺乳動物を開発するこ
とである。
本発明のさらにもう一つの対象は医薬品、ガン研究、
農業、食料生産に使われる改良された乳を分泌する遺伝
子導入動物を開発することである。
本発明の別の対象はそれ自身で繁殖する遺伝子導入動
物を開発することである。
かくして、本発明は下記の組換えDNA遺伝子複合体で
ある。
乳腺に対して蛋白の発現を標的するための組換えDNA
遺伝子複合体において、該遺伝子複合体が、 （ａ）乳腺特異的な遺伝子からのカゼインプロモーター
配列、 （ｂ）乳腺特異的な遺伝子からのカゼインエンハンサー
配列、 （ｃ）乳房分泌細胞において機能するシグナルペプチド
配列、 （ｄ）蛋白質をコードする遺伝子に由来するコード配列
（該コード配列は天然にはプローモーターに結合されて
いない）、 （ｅ）カゼイン遺伝子または該蛋白質をコードする遺伝
子からのイントロン配列を含み、ここで上記のプロモー
ター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチド配列及
びイントロン配列は乳腺における上記コード配列の発現
を促進するところの組換えDNA遺伝子複合体。
本発明のもう一つの一面は、コード配列の５′及び
３′未満の夫々に結合された５′非翻訳mRNA配列及び
３′非翻訳mRNA配列をさらに含む、上記の組換えDNA遺
伝子複合体を開発することである。この５′及び３′隣
接配列は組換えDNA遺伝子複合体によって合成されたメ
ッセンジャーRNAの安定性を増加する。
本発明のもう一つの局面は組換えDNA遺伝子複合物を
含む生殖細胞系（germ line）をもった、乳腺でペプチ
ドを合成するための遺伝子導入哺乳動物を本件の内容と
して開発することである。この生殖細胞系はその次の世
代に移行しうるものである。遺伝子導入哺乳動物のもう
一つの面はどんな哺乳動物でもよいということである。
望ましい例はヒト以外の哺乳動物である。
本発明のもう一つの面は、組換えDNA遺伝子複合物を
哺乳動物の生殖細胞系に挿入する段階を含む少くとも一
つの特定の遺伝子のペプチドの合成を乳腺に向けさせる
方法である。その他の実施態様は分化成長して個体とす
る環境下で胚を成長させる方法を含んでいる。さらに実
施態様は生殖細胞系統の中に遺伝子の複合物を安定にと
り込ませる段階を含んでいる。また別の実施態様は、コ
ードしている配列の発現を哺乳動物からとった乳腺組織
や乳で検査するステップを含んでいる。さらにまた遺伝
子複合体に適当な機能をもたせることを確立するステッ
プを含んでいる。
本発明の付加的な意図は乳腺特異的遺伝子から選ばれ
たプロモータ配列、エンハンサー配列、シグナルペプチ
ド配列及び生物学的に活性の作用物をコードしている遺
伝子からのコード配列を結合するステップを含む乳腺特
異的遺伝子複合物を構成する方法である。実施例ではさ
らに５′−の非翻訳mRNAと３′−の非翻訳mRNA配列を結
合するステップも含んでいる。
もう一つの本発明の意図によれば、組換えDNA複合物
を構築し哺乳動物の胚の生殖細胞系にこの遺伝子複合物
を挿入し、その胚を成熟するまで成育させ、その生物学
的に活性のある作用物のための遺伝子複合物をもつ哺乳
動物によって作られる乳を検定するステップを含む乳腺
に生物活性物を合成する方法を提供している。
本発明のもう一つの意図は静菌的なコード配列を含む
組換えDNA遺伝子複合体を哺乳動物の胚の生殖細胞系に
挿入するステップを含む乳の細胞汚染を防ぐ方法である 本発明の別の意図はオンコジーンを含む組換えDNA遺
伝子複合体を哺乳動物の胚の生殖細胞系統に挿入するス
テップを含む哺乳動物のガンの機構を検討し、その結果
として生ずるガン性の組織の発生を解析する方法であ
る。
この発現の別の意図するところは市乳を分泌する遺伝
子導入した哺乳動物の系統株を開発することである。市
乳は自然にある化合物の濃度を変えたり、外来の化合物
を含ませることができる。外来の化合物は薬剤、ホルモ
ン、ペプチド、蛋白、脂質、炭水化物、抗菌剤などであ
りうる。これら外来の化合物は細菌、動物あるいはヒト
の染色体から由来する遺伝子から合成される。
本発明のもう一つの意図は市乳を乳製品の製造に用い
るステップを含む乳製品の生産を可能にする過程であ
る。
本発明のもう一つの別の意図は遺伝子導入された哺乳
動物から作られる市乳を含む食料品である。
その他の目的、特徴及び利点はこの発明の実施例につ
いて以下に記載しているものから明らかであろう。
実施例の詳細な記述 本件の構成として本発明の一例はプロモータ、エンハ
ンサー、シグナルペプチド及びコードしている配列を含
む組換えDNA遺伝子複合物である。この組み合わせにお
いてプロモータ、エンハンサー、シグナルペプチド配列
は乳腺に特異的な遺伝子から由来し、コード配列は生物
的に活性な作用物に対するコードをもっている。乳腺に
特異的な組換えDNA遺伝子複合物を構成させる通常の方
法はプロモータ、エンハンサー、シグナルペプチド及び
コード配列を一緒に結合させることを含んでいる。第１
図Ａは本発明の一例を示しており、エンハンサー配列
（Ｅ）と遺伝子プロモータ配列（Ｐ）をフランキング配
列により結合していることが示されている。これらの配
列は通常乳組織にのみ特異的に発現される遺伝子から由
来される。例えば、これらの配列はα−カゼイン、β−
カゼイン、γ−カゼイン、χ−カゼイン、α−ラクトア
ルブミン、β−ラクトグロブリン、ホエーの酸性蛋白な
どをコードしている遺伝子から得ることができる。
それから、プロモータ−エンハンサ−複合物はシグナ
ルペプチドのエクソン配列に結合されている。乳腺に特
異的ないろいろなシグナルペプチドエクソンが利用でき
る。シグナルペプチドのエクソンは効率のよい転位、認
識、除去、乳への蛋白の分泌などに役立っている。蛋
白、炭水化物、ペプチド、脂質などが一たび乳に分泌さ
れると標準的な分離法がその成分を精製するために使わ
れる。シグナルペプチドは翻訳後の修飾を可能にするけ
れども、いくつかの合成される分子のもっている特徴が
乳への分泌を妨げることもあろう。従って、乳組織を集
めて、関心のある分子を組織から精製しなければならな
い。乳組織を集めることは問題の化合物を継続して生産
することを妨げるし、組織から成分を分離することは乳
から分離するよりも困難な方法であるので上記のアプロ
ーチに満足できるものでない。特定の実施例でα−、β
−、及びγ−カゼイン遺伝子のエクソンIIとホエーの酸
性蛋白遺伝子のエクソンＩが使われている。
問題としている遺伝子のコード領域が（cDNA）がイン
トロン配列によってプロモータ−エンハンサー−シグナ
ルペプチド複合物に接続されている。コード領域はどん
な遺伝子でもあるいは一つの分子をコードしている遺伝
子の一部でもよい。それには遺伝子のイントロン領域及
びエクソン領域を含んでいてもよい。例えば、蛋白、乳
蛋白、脂質、炭水化物、ホルモン、バクテリアの生産物
（薬剤や抗生物質）、抗体、抗原、酵素などをコードし
ている遺伝子がプロモータ−エンハンサー−シグナル複
合物に結合される。
望ましい実施例では、コード配列はα−カゼイン、β
−カゼイン、γ−カゼイン、χ−カゼイン、α−ラクト
アルブミン、β−ラクトグロブリン、ホエーの酸性蛋
白、ホルモン、薬剤、蛋白、脂質、炭水化物、成長ホル
モン、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラ
ーゼ、抗菌物質などから成る群から選ばれた生物的に活
性のある作用物をコードしている遺伝子から選ばれてい
る。実施例では乳腺特異的な遺伝子はα−カゼイン、β
−カゼイン、γ−カゼイン、χ−カゼイン、α−ラクト
アルブミン、β−ラクトグロブリン、ホエー酸性蛋白の
群から選択されている。
その他の例ではプロモータ配列、エンハンサー配列、
シグナルペプチド配列を生み出すのに同じ遺伝子が使わ
れている。別の特定の具体例ではβ−カゼイン遺伝子の
プロモータ、エンハンサー、シグナルペプチド配列とβ
−カゼイン遺伝子またはクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ遺伝子のコード配列とが使われてい
る。
本件を構成するものとしてのもう一つの具体例では第
１図Ｂに示された組換えDNA遺伝子である。この例はプ
ロモータ−エンハンサー−シグナル複合体に結合した遺
伝子のコード領域に連結したメッセンジャーRNA（mRN
A）の５′−非翻訳配列（untranslated sequence）
（５′−UT）と３′−非翻訳配列（３′−UT）を含んで
いる。非翻訳mRNA配列はイントロンによって連結される
ことができる。これらの翻訳がされないmRNA配列は転写
されmRNAに結合される。これらの非翻訳領域はコード領
域のmRNAを迅速な分解から保護するのに役立っている。
そのmRNAの寿命が短いところの自然にある遺伝子はこれ
らの非翻訳領域のよい候補者となる。これらを構築する
のに使われる非翻訳領域の例はβ−カゼイン、β−グロ
ビン、ビテロゲニンのmRNAの非翻訳mRNA配列が含まれ
る。β−カゼイン遺伝子配列が好ましい例を提供してい
る。
エンハンサー−プロモータ−シグナルペプチド配列
と、エンハンサー−プロモータ−５′−非翻訳mRNA配列
−シグナルペプチド−３′−非翻訳mRNA配列の構成がベ
クターにくみこまれる。そこで必要なときにいろいろな
cDNAがくみこまれることができる。cDNAは、乳中に化合
物を特異的に分泌するように設計されたDNA配列に挿入
されるカセットのようなものである。かくして多種のく
み換えDNA遺伝子複合体が容易に形成される。
一たびくみ換えDNA遺伝子複合体（外来遺伝子複合
体）が作られると、非翻訳配列があってもなくても、そ
れは宿主哺乳動物の染色体（生殖細胞系）の中にくみ込
まれる。生殖細胞系の中に外来の遺伝子複合体をくみ込
むことは本件の構成として遺伝子導入動物を創造する。
さらに生殖細胞系へのくみこみは子孫へ外来の遺伝子複
合体を移送させる。かくして、外来遺伝子をもった哺乳
動物の系統が維持される。外来の遺伝子複合体はどの哺
乳動物の染色体にも含ませられる。一例ではヒト以外の
哺乳動物が使われている。
哺乳動物の胚の卵子系統に組換えDNA遺伝子複合物を
挿入することによって生物性のある作用物の合成も乳腺
で行わせることができる。もう一つの具体例には哺乳動
物に、胚を分化成長させる適当な環境の中で胚を挿入す
るステップが含まれている。哺乳動物が生後、外来遺伝
子複合体の宿主染色体への安定な組み込みができるよう
にするために染色体をスクリーニングする付加的なステ
ップが行われる。哺乳動物が成人に達した後、乳分泌腺
について外来遺伝子複合体のmRNAまたは分子合成が乳腺
で起っているかどうかを確める検査がされる。このステ
ップは組換え遺伝子複合体が正しく機能するかどうかを
確めるために使われる。組みこまれる外来遺伝子の特性
に応じていろいろなスクリーニング法が使用される。ス
クリーニング法にはプローグ解析、mRNA解析、酵素分
析、細菌検査、抗体スクリーニング、蛋白、炭水化物、
脂質分析などが含まれる。
具体的な一例では外来の遺伝子複合体が、単一細胞の
時期に哺乳動物の卵子系統に挿入される。もしこの組み
込みが単一細胞時期に行われれば外来遺伝子複合体に対
するプローグがどの細胞を調べるために利用できようが
もし組み込みが発生のより遅い時期に起これば検査すべ
き組織は組み込みが行われた細胞系統から発達してきた
ものに限られる。注入された卵母細胞（oocyte）はそれ
から同じ卵子系統をもった宿主動物の卵管の中に挿入さ
れる。
外来遺伝子複合体の実施例 7.2kbのラットβ−カゼイン遺伝子を含むゲノムDNAの
34.4kbの領域が特徴づけられた。ジョーンズ（Jones）
等、J.Biol.Chem.，第260巻、7042−7050頁（1985年）
の記載を参考に取上げる。遺伝子全体と５′−側面の
（フランキング）のDNAの1,3または2.3kbのいずれかを
単一のファージクローンからKpn I−BamH IまたはBamH
I−BamH I分解のいずれかによって分離しサブクローン
化した〔ジョーンズ（Jones）等、J.Biol.Chem.，第260
巻、7042−7050頁（1985年）〕。この構成物はさらにλ
DNAの1kb（Kpn I−BamH Iの場合）または5kb（BamH I−
BamH Iの場合）を含んでいる。第２図は1kbの５′側面D
NAと1kbのλDNAを伴うβ−カゼイン遺伝子を含むKpn I
−BamH I消化断片を示している。一方、ファージB12か
らのBamH I−Sal I断片をファージB99からのSal I−Bam
H I断片に連結することによって原核性のDNAのない14.6
kbのBamH I−BamH I断片が分離される。この構成は7kb
の５′−側面DNA、全遺伝子及び400bpの３′−側面配列
を含んでいる。
組換えDNA遺伝子複合体の例はマウスの乳腺腫瘍ウィ
ルスの長い末端のくり返し構造からのグルココルチコイ
ド応答因子（GRE）を含んでいる。これは乳腺特異的な
エンハンサー配列へ５′挿入されている。この付加は適
当な制限酵素リンカーをつけ加えることによって可能に
なる。GREは隣り合った遺伝子にグルココルチコイド誘
導能を授けることのできる340bp断片を生むために、Xho
IIで消化することによってプラスミドpTK2A1から作ら
れる〔ゴドウスキー等（Godowski et al.）Nature、第3
25巻、365−368頁（1987年）〕。GREは授乳の期間存在
するグルココルチコイドの量が増加することによって隣
りの遺伝子をさらに10〜20倍誘導させる。
遺伝子導入したマウスで効率的な組織特異的な発現を
引き出すために使われる組換えDNA遺伝子複合体の一例
は7kbの５′−側面のDNAを含み原核性のベクター配列を
欠いているラットのβ−カゼイン遺伝子の全体である。
カゼイン遺伝子の大きなそして複雑な性質は複数の部位
で遺伝子を分解することなしにλDNA配列に作用しうる
制限酵素分解部位を少ししか残していない。かくして、
Kpn I−BamH I断片からλ配列の除去にはBal31による消
化とそれに続くサブクローニングとDNAの配列決定が必
要である。マニアティス等（Maniatis et al）、Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual、コールドスプリン
グハーバー出版207−209頁（1982年）の記載を参考に取
り上げる。さらに、全遺伝子とその大きな側面に位置す
る配列が組織特異的な制御にとって重要である。
β−カゼイン−CAT融合遺伝子を使ってもう一つの組
換えDNA遺伝子複合体が作られた。ビスビー、ローゼン
（Bisbee and Rosen）分子及び細胞生物学に関するUCLA
シンポジウム「転写制御（Transcriptional Contro
l）」（1986年）この記述を参考とする。この構成物は
2.3kbまでの５′−側面DNAを含んでいる。これは独特な
Nde IとBamH I部位を使ってベクターDNAから都合よく作
り出される。そのベクターDNAを含まない直鎖状の断片
が使われている。β−カゼイン−CAT複合体の別の構成
はカゼイン−CAT融合遺伝子の構成に使われるXba Iリン
カーへさらに５′−側面配列は結合されている。7kbの
５′−側面DNAにほんのわずかしかXba I部位が存在しな
いのでBamH I−Xba I（部分分解）断片は失われる上流
の配列を含んで生成されている。遺伝子の中に組織特異
的なエンハンサー配列が存在するときの組換えDNA遺伝
子複合体を作るもう一つの方法は遺伝子から切り出され
る制限酵素断片を分析し、適当なリンカーでベクターの
中へクローニングすることによってエンハンサー配列を
検索することである。CATの場合にはベクターはSV1CAT
ベクターである。ゴーマン等（Gorman et al）Mol.Cel
l.Biol.，第２巻、1044−1051（1982年）この記述を参
考に供する。このベクターはSV40からの構成的プロモー
ターを含んでいるがSV40のエンハンサー配列を欠いてい
る。それ故これはいろいろなDNA断片のプロモーターに
依存しないエンハンサー活性を検索するのに有用であ
る。さらに511bpの５′−側面DNAしか含まないβ−カゼ
イン−CAT構造が利用しうる。遺伝子導入マウスにおい
て転移された遺伝子（ラットのβ−カゼインとCAT）の
再配列されていないコピーが発現について解析される。
発現を乳腺に向けこれらの蛋白を授乳の間に効率的に
分泌されるために、シグナルペプチドを複合体に結合し
なければならない。一例はCATのところに63bpのカゼイ
ンシグナルペプチドのエクソン配列を結合させるもので
ある。そのカゼインのためのシグナルペプチドは哺乳動
物の発生の間十分に保たれていることが示されている。
ユーリー等（Yu−Lee et al.）Nuc.Acids.Res.，第14
巻、1833−1902頁（1986年）にありその記載は参考に提
供される上で論議した他のシグナルペプチドが使用でき
るけれど、乳腺に効率的に分泌させるために高度に保た
れる配列を使うことが有利である。外来の分泌性蛋白を
コードしているDNAを制御を受けた分泌細胞の中に移入
されるのは分泌小胞に入る蛋白の種類に特異性があるこ
とが示されている。〔ケリー（Kelly）、Science、第23
0巻、25−32頁（1985年）〕この記載は参考にされる。
例えば、β−カゼイン遺伝子の第２エクソン（エクソン
II）を含むHind III断片が分離される。Hind III部位は
成熟したカゼインの＋２アミノ酸に対する14bpの３′と
エクソンIIの開始点に対する548bpの５′である〔ジョ
ーンズ等（Jones et al）J.Biol.Chem.，第260巻、7042
−7050頁（1985年）〕。＋２アミノ酸に対するAGT3′の
ところで終止コドンを脱落させるためBal31消化を行いH
ind IIIリンカーを挿入している。この断片はSV2CATベ
クターのHind III部位に挿入される。ゴーマン等（Gorm
an et al）、Mol.Cell.Biol.，第２巻、1044−1051頁
（1982年）とローゼン等（Rosen et al）「膜の受容体
と細胞制御（Membrane Receptors and Cellular Regula
tion）」、アラン・R.リス編（Alan.R.Liss）ニューヨ
ーク、385−396頁（1985年）の記載があり、参考に供さ
れる。
もう一つのアプローチは独特な制御酵素リンカーを含
む45bpのオリゴヌクレオチドを直接合成することであ
る。これはβ−カゼイン−CATベクターのHind III部位
に直接結合される。よりよい効率と正確性のために分解
するところの配列をコントロールできるのでオリゴヌク
レオチドによるアプローチは望ましい。
構成されるあるいは合成されるベクターがCOMMA−ID
細胞の中に移入され、そしてCATが効率的に発現され
る。ビスビー、ローゼン（Bisbee and Rosen）：分子及
び細胞生物学に関するUCLAシンポジウム「Transcriptio
nal Control」（1986年）。この構造はCATのアミノ末端
に融合された付加的な14個のアミノ酸を含むCAT融合蛋
白となりあとでシグナルペプチドの分解が起こる。
もう一つの具体例ではカゼインのシグナルペプチド−
CAT構造に組織特異的な発現を引き出すために必要な予
め決められたシス作動性の制御配列が上記の例示した構
成に結合される。これはAcc IとSph Iを使って上の構成
からSV40 72bpのエンハンサーを削除（これは本質的にS
V1CATベクターを生ずる）し、乳腺特異的なエンハンサ
ー断片を挿入することによるかまたは、カゼイン特異的
プロモーター、エクソンＩ、イントロンＡ及びエクソン
IIを含む断片を産生するために−330bpのところの上流
のHind III部位での部分的なHind III消化を使うことに
よって完成される。どちらの場合も原核性のベクター配
列を欠いた直鎖状のDNA断片が遺伝子導入マウスを産む
のに使われている。
CAT活性は培地（＝乳）、細胞質や組織の抽出物での
酵素的分析を含むいろいろな方法や、ドットブロット法
を使った免疫学的方法によって定量される。
カゼインのシグナルペプチド配列は特に分泌が例えば
内在的な疎水性のような多くの要因に左右されるので、
すべての蛋白の分泌を標的するには十分でないだろう。
かくして、他のシグナルペプチドやまたは側につく領域
について変更することが分泌のために必要であろう。成
長ホルモンや組織プラスミノーゲン活性化因子のような
通常は分泌される蛋白のもっているシグナルペプチドが
カゼインのシグナルペプチドの代りに含められうる。あ
るいは、膜に蛋白をつなぎとめるのに関わるカルボキシ
末端のアミノ酸は離脱させねばならないだろう。
例示の構造が信頼に足ることは制限酵素によるマッピ
ングとDNA配列決定によって確められる。
遺伝子導入された哺乳動物の産生 遺伝子導入した哺乳動物は宿主の染色体に外来のDNA
配列をとり込ませる過程によって作り出される。この方
法は胚を集めること、DNAをその胚に注入すること、そ
の生き残った胚を代理の母親に移し、その子孫を外来の
遺伝子がくみこまれ発現しているかどうかを検索するこ
とから成り立っている。遺伝子導入された哺乳動物は薬
物を生産するために哺乳動物に挿入されたバクテリアの
遺伝子、乳に生物学的化合物をｇ単位の量で生産するた
めに非ヒト哺乳動物に挿入されたヒトの遺伝子、酪農の
動物にとり込まれたヒトの成長因子、マウスにとり込ま
れたラットのDNA、酪農用動物にとり込まれたラットま
たはウシのDNA、及びウシに挿入されたヤギ、ヒツジま
たはブタの乳蛋白をコードしているDNAなどを含ませる
ことができる。
特定の具体例では、哺乳動物の胚の卵子系統にくみ換
えDNA遺伝子複合体を挿入することによって、乳中の有
害汚染菌を防ぐ方法を含んでいる。別の具体例ではオン
コジーンを含むくみ換えDNA遺伝子複合体を哺乳動物の
胚の卵子系統の中に挿入することを含んでいる。こので
きた遺伝子導入された哺乳動物を検定し、ガン組織の発
生の機構を解析できる。この方法も、家畜からとった乳
を生産にとり入れることによって酪農産物を作ることを
可能にしている。この市販乳は生物活性のある作用物を
含めることができ、食料、薬品、化粧品、ホルモン、炭
水化物、脂肪、アミノ酸、蛋白などの多種の生産物を生
み出すのに使うことができる。
ラットのβ−カゼインのマウスへの取り込みの特定例 1. 胚の採集 １個の細胞である胚はゴナドトロピン投与で過度排卵
にされた雌のマウスの卵管を水で洗い出すことによって
採取される。ゴナドトロピン管理は系統によってかわる
が本質的には妊娠しているウマの血清（PMS）のゴナド
トロピンの腹腔内（i.p）投与した後、ヒトの絨毛膜ゴ
ナドトロピン（hCG）をip投与することによっている。
最後のゴナドトロピン投与後、雌マウスは雄と交尾され
る。雌マウスはhCG投与後、約18〜20時間で屠殺され、
卵管を洗滌され１細胞の胚が注入のために準備される。
特別の具体例では、約14〜18gのICR系雌マウスが約5I
U（国際単位）のPMS、次いで約48時間後に約5IUのhCG投
与される。若い未成熟のマウスの方が年老いた動物より
も過度排卵によく応答する。しかしながらどれを使って
もよい。雌のB6マウスが交尾に使われる。
2. 胚の注入 胚を一滴の培養液の中におく〔クイン（Quinn），J.R
eprod.Fert.,第66巻、161−168頁（1982年）を参考とし
て取上げる〕。そして５μg/mlのサイトカラシンＢを加
えておく、培地はパラフィン油で覆われ、その胚はホフ
マン光学系を使った倒立型顕微鏡で観察される。ラット
のβ−カゼイン遺伝子複合体の注入は支持用マイクロピ
ペットで一細胞胚を固定してβ−カゼイン遺伝子複合体
を細くひっぱった注入用マイクロピペットによって雄性
前核に注入することによって達せられる。マイクロピペ
ットを通しての液の流れのコントロールは、テフロン管
でマイクロピペットにストールティングマイクロメータ
ー・シリンジにつなぐことで行われる。全体をパラフィ
ン油で満たし、注入のための陽圧をかけまた胚を微妙な
コントロールの下で注入できるよう固定するための陰圧
にできるようにしている。
注入されるラットのβ−カゼイン遺伝子複合体は10mM
のトリス（pH7.5）と0.25mMのEDTAの溶液中に約2ng/μ
の濃度に溶解される。ブリンスター等〔（Brinster e
t al）、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、第82巻、4438−444
2頁（1985年）〕の記載を参考とする。約１〜2plのβ−
カゼイン遺伝子複合体溶液を前核に注入する。注入後の
胚の生存は正常な形態上の外観をしているかどうかで判
定される。
3. 胚の転移 マイクロインジエクションに生き残った胚をHT6培地
におき、６〜８週齢の雌マウスの卵管に移す準備をす
る。受容側のマウスはPMSをip投与された後hCGを与えら
れ、精管切断された雌マウスとともに置かれる。マイク
ロインジェクトされる胚を受入れるたすけとするために
ゴナドトロピン投与と交尾は投与側のマウスのスケジュ
ールに一致される。
一例では約20〜22gのICR系雌マウスに約2IUのPMS、次
いで48時間後に2IUのhCGのip投与を行った。精管切断さ
れた雄と一緒にされた後、腔栓をもった雌を受容動物と
して用いた。受容雌マウスは麻酔され、卵管を背側切開
で露出し、細くひいたパスツールピペットを使って卵管
の釆を通して胚を置く。卵管を腹腔に戻して傷口を閉じ
る。
胚転移の成功は転移後約19〜21日でマウスが誕生する
ことで判定される。マイクロインジェクションの成功は
マウスの尾の生検試料から採取されたDNAをサザンハイ
ブリダイゼーション解析によって評価される。
細菌のCATのマウスへの組み込みの特定例 1. 胚の採取−ラットのβ−カゼインの例と同じ方法に
よる。
2. 胚の注入 バクテリアのCAT遺伝子複合体が単一細胞胚の雄前核
に注入される以外はラットのβ−カゼインの例と同じ方
法がとられる。注入されるバクテリアのCAT遺伝子複合
体は10mMのトリス（pH7.5）と0.25mM EDTAの溶液に約2n
g/μの濃度で溶解される。バクテリアのCAT遺伝子複
合体液の約１〜2plが前核に注入される。注入後の胚の
生存は正常な形態上の外観で判定される。
3. 胚の転移 β−カゼイン遺伝子複合体の場合と同じ方法が用いら
れる。胚の転移の成功は転移後約19〜21日でマウスが生
まれるかどうかで判定される。バクテリアのCATのマイ
クロインジェクションの成功はマウスの尾の生検試料か
らとったDNAのサザンハイブリダイゼーション解析によ
って評価される。
組換えDNA遺伝子複合体のウシ、ヒツジ、ブタの胚への
くみこみの特定例 胚の採取と注入方法は既述のとおりである。ハマー等
（Hammer et al）Nature（London）、第315巻343−345
頁（1985年）、クレーマー等（Kraemer et al）、「ウ
シ、ヒツジにおける遺伝子転移」バンベリーレポート、
11月20日、221−227頁（1985年）の記載を参考にする。
マウスとウシ、ヒツジ、ブタとの大きな違いは、前核の
観察の際にウシ、ヒツジ、ブタでは卵子がはっきりしな
いことである。みえるようにするには約３分間約15,000
gで遠心分離することで可能となる。この遠沈法は細胞
質を層状にし、原核と核を位相差顕微鏡でみえるように
する。
転移された遺伝子の構造と発現の解析 1. DNAの分離 小さな組織検体をSET緩衝液（150mM NaCl、20mMトリ
ス、1mM Na2EDTA、ph7.8）中で37℃、１晩ブリンクマン
・ポリトロンによってホモゲナイズし、フェノール、フ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール及びク
ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。DNAは
エタノール沈殿或いは糸状にまきつけること（spoolin
g）で回収される。DNA濃度は特殊な蛍光法で定量され
る。ラバルカとペイゲン（Labarca and Paigen）Anal.B
iochem.第102巻、344−352頁（1980年）の記載を参考と
する。マウスでは尾の１〜2cmを切りとって分析され
る。
2. サザン法とDNAドットブロット分析 はじめにそう思われる遺伝子導入動物がサザンブロッ
ト法（Southern blotting）によって転移された遺伝子
の存在が検索される。外来のDNAを供給する対照生物、
対照の宿主及び転移された宿主からの染色体DNA10μｇ
が制限エンドヌクレアーゼで消化され、アガロースゲル
電気泳動で分離され、ニトロセルロースに転写され、そ
して特有の遺伝子プローブとハイブリダイズされる。
例えば、ラットのβ−カゼイン遺伝子がマウスにとり
込まれる場合には1.9KbのEcoR I遺伝子プローブが使わ
れる。β−カゼインくみこみの状況は例えばKph IとBam
H Iのような他の制限エンドヌクレアーゼでDNAを消化
し、1.9Kb断片で2.8Kbの５′−EcoR I断片と同様検定さ
れる。転移した遺伝子のコピー数はラットの染色体DNA
標準物を使ったDNAドットブロット法によって定量され
る（第３図）。カファトス等（Kafatos et al）Nucl.Ac
id Res.,第７巻、1541−1553頁（1979年）の記載を参考
とする。
3. 乳腺の生検、RNA分離とノーザンブロット（Norther
n Blot） 授乳期の哺乳動物を麻酔し、乳腺組織の生検試料を採
り、グアニジンチオシアネート−CsCl法でRNA抽出にか
ける。チャーグウィン等（Chirgwin et al）Biochemist
ry、第18巻、5294−5299頁（1979年）の記載を参考とす
る。生検試料と対照組織からの乳腺のRNAをグリオキサ
ール−アガロースゲル電気泳動で分離しニトロセルロー
スまたはナイロンの膜に転写し、cRNAのリボプローブと
ハイブリダイズする。ジン等（Zinn et al.），Cell.,
第34巻、865−879頁（1983年）の記載を参考とする。
例えば、遺伝子導入マウスを麻酔し、第４乳腺をとり
出し、RNA抽出にかける。ラットのβ−カゼイン遺伝子
のmRNAをラットの３′−cRNAリボプローブとハイブリダ
イズすることによってニトロセルロース上で、検出され
た（第７図）。
4. RNアーゼとS1ヌクレアーゼによるマッピング 導入された外来の遺伝子複合体が正しく開始停止され
るかどうかはRNアーゼとS1ヌクレアーゼでのマッピング
によって決められる。
例えば、ラットのβ−カゼイン遺伝子のRNアーゼマッ
ピングでは、５′側面、第１エクソン及びイントロンＡ
の部分をカバーする800bpのリボプローブかジン等（Zin
n et al.,Cell，第34巻、865−879頁1983年）の方法に
従ってRNA試料とハイブリダイズされ、RNアーゼＡとRN
アーゼT1による消化が行われる。残った断片を８％ポリ
アクリルアミド／尿素の系のシーフェンシングゲル上で
解析される。
例えば、ラットのβ−カゼイン遺伝子のS1ヌクレアー
ゼマッピングにおいては２つの異なるプローブが使われ
る（第５図）。第１のプローブはポリヌクレオチドキナ
ーゼによって３′末端に標識したPvu II−Nco I断片で
ある。第２のプローブはDNAポリメラーゼＩのクレノー
断片によって３′末端に標識されたエクソンIXの３′末
端をカバーしているNco I−EcoR I染色体断片である。R
NAはこれらのプローブとハイブリダイズされ、S1ヌクレ
アーゼで消化され５％ポリアクリルアミド／尿素ゲルで
分析される〔マニアティス等（Maniatis et al）Molecu
lar Cloning：A Laboratory Manual,207−209頁（1982
年）〕。組みこまれた外来の遺伝子には夫々特殊なプロ
ーブが必要であろう。
5. CATの酵素分析及び免疫的分析 CAT酵素活性は14C−クロラムフェニコールをそのアセ
チル誘導体に変換することによって測定される〔ゴーマ
ン等（Gorman et al）Mol.Cell.Biol.，第２巻、1044−
1051頁（1982年）〕。その結果は試験された組織または
細胞のDNAまたは蛋白含量の函数として表わされる。ま
たある場合にはDNAドットブロット法で定量されたくみ
こまれたCAT遺伝子のコピー数当りで表わされる。乳中
のCAT活性は蛋白mg当りで表わされる。またはポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を使ったりウェスタン
ドットブロット法を使ってCAT蛋白を測定できる。この
技術に通じた者はこの蛋白またはその活性を検出するそ
の他の方法が利用できることを認識しよう。細胞培養で
のCAT分泌の測定はインスリン（約５μg/ml）、ハイド
ロコーチゾン（約１μg/ml）、プロラクチン（約１μg/
ml）を含む５％ウシ胎児血清中に浮かせたＩ型コラーゲ
ンゲル上に72時間生育させた若い継代のCOMMA−ID細胞
をゲルからはがして用いられる。この条件下では、β−
カゼインのmRNAは授乳期の組織にみられるレベルの５〜
10％である。ローゼン等〔（Rosen et al）Annals N.Y.
Acad.Sci.，第478巻、63−76頁（1986年）〕の記載を参
考とする。比較しうる条件下でカゼインは浮遊させたコ
ラーゲンゲル上に生育させたマウス乳腺細胞の初代培養
細胞から効率よく分泌される。リー等〔（Lee et al）P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、第82巻、1419−1423頁（1985
年）〕の記載を参考とする。
ラットβ−カゼインのマウスへのとり込みの分析 β−カゼイン構成の解析での大きな困難はホルモンで
制御されるカゼイン遺伝子の発現を示す細胞系統がクロ
ーン化されていないことである。初代培養細胞でのカゼ
イン遺伝子の発現は細胞同志及び細胞−基質間の相互作
用によっている〔レビンとストックデール（Levine and
Stockdale）J.Cell.Biol.，第100巻、1415頁（1985
年）、リー等（Lee et al）Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、
第82巻、1419−1423頁（1985年）〕。カゼインもホエー
の酸性蛋白（wap）もその遺伝子発現は移植培養系での
無血清培地ではホルモンによって制御されるがWAP遺伝
子の発現については用いられる培養条件によらず初代培
養あるいは細胞系統においてはみられない〔ホッブス等
（Hobbs et al）J.Biol.Chem.，第257巻、3598−3605
頁〕。かくして遺伝子導入マウスは乳腺においてシス作
動性DNA配列の機能的役割を解析するための別のin vivo
の系を提供している。
Kpn I−BamH I断片を使っていくつかの遺伝子導入マ
ウスが生産された（第２図、第３図）。ラットのβ−カ
ゼイン遺伝子の移入と発現は染色体DNAをブロッティン
グした上で1.9kbのEcoR Iプローブを用いて分析され
た。このプローブの特異性はラットのプローブと10Kbの
マウスDNAのEcoR I断片との間でごく弱い交差ハイブリ
ダイゼーションしかみられないことによって示される。
３段階の濃度のラットの染色体DNA、マウスのDNA、異な
るFoマウスから分離した４種のDNAが第３図に示されて
いる。マウス11.2は期待される1.9Kbの断片を含んでい
た。さらに詳細に分析すると、ほゞ４コピーの再配列さ
れていない全体のKpn I−BamH I断片が11.2マウスに存
在していることが示された。くみこまれたラットβ−カ
ゼイン遺伝子の移入は第４図に総括されているように一
連のF1、F2マウスでの尻尾でブロット法を行って分析さ
れた。F1世代では22の中11が一つの部位でのくみこみを
示唆する変化をうけていないコピー数の遺伝子を受けつ
いでいた。陽性のF1マウスの中２匹はホモ接合体を確立
するために交配された。F2世代のうちで９匹の中８匹は
陽性で、データはこれらマウスのいくつかはホモ接合体
であることが示唆している。
授乳中のマウスから乳腺の生検を行った。マウス11.2
−2.4を屠殺し、その他の組織もカゼイン遺伝子発現に
ついて分析した。はじめにラットのβ−カゼインmRNAの
３′−非コード領域から合成したSP6リボプローブを使
ってRNAブロッティングが行われた。正しい大きさのmRN
A（1.1Kb）の発現が11.2−2.0及び−2.4マウスからとっ
た授乳性のRNAにRNAブロットが観察された。肝や脳から
とったRNAでは発現はみられず、腎からのRNAでも殆んど
検出できる兆候はみられなかった。ラットとマウスのβ
−カゼインmRNAの大きさは同一であるのでラットβ−カ
ゼインmRNAの３′−非コード領域を使った特異的なS1ヌ
クレアーゼ分解性実験を開発した。このプローブは検出
されたβ−カゼインのmRNAの発現が転移されたラットの
遺伝子によるもので、内在性のマウスの遺伝子によるも
のでないことを確めるために使われた。
予め特有のNco I部位で標識された一本鎖の448NIプロ
ーブを調製した。成熟したmRNAからの保護で280NTの断
片が生産される。もし前駆mRNAが作られなければ144NT
断片ができる。第５図に示されるように、授乳している
ラットの乳腺からとったRNA1μｇは280NTの主要バンド
と144NTの弱いバンドを示す。遺伝子導入マウス11.2−
2.0と−2.4の２匹に280NTが分泌されている兆候がみら
れるが144NTにはもっと濃いバンドがみられる。RNAは夫
々50μｇ分析にかけられた。対照及び陰性の遺伝子導入
マウスのいずれもそれから分離したあるいはｔ−RNAを
使っても授乳期RNAの存在はみられなかった。
腎から抽出されたRNAではもっと長時間おくことで280
NTのうすい存在の兆候がみられたが肝からはみられなか
った。これらの結果は移入されたラットのβ−カゼイン
遺伝子は授乳中の乳腺に選択的に発現されるが内在性の
マウスの遺伝子よりもずっと低いレベルであることを示
している。RN.アーゼとS1保護実験はラットβ−カゼイ
ン遺伝子転写産物が正しく開始され加工されるかどうか
を調べるのに使われる。
組織特異的な導入遺伝子の発現の程度について原核生
物性のベクター配列が阻害的な効果があると報告されて
おりまた、その遺伝子に対してさらに５′或いは３′に
位置しているエンハンサー配列がある可能性があるため
に、3.5Kbの５′側に隣り合うDNAと3.0Kbの３′側にあ
るDNAを伴うラットのβ−カゼインの全遺伝子を含みベ
クター配列のない染色体のクローンを単離し、遺伝子導
入マウスの造成に使った。第６図に示されているよう
に、期待される1.9KbのEcoR I DNA断片は５匹のマウス
に示されている（他の３匹の陽性のマウスは示されてい
ない）。３匹の雌のFoマウスの授乳時の乳腺の生検試料
からRNAを抽出し、特異的なRN.アーゼの分解性試験を使
って第７図に示されるようにカゼイン遺伝子の発現を解
析した。３匹のマウスの中１匹はラットのβ−カゼイン
導入遺伝子を発現した（第７図、第Ｆ列）。このマウス
はコントロールラットの授乳期のRNA試料にもみられる
予期どおりの450NTの分解されない断片を示した（第７
図、第Ｂ列）。F1世代の試験では８匹のFo遺伝子導入さ
れた雌の中７匹はその子孫に外来の遺伝子複合体を伝播
していた。
これらの結果は遺伝子導入されたマウスでラットのβ
−カゼイン遺伝子が移入され発現することを示してい
る。効果的な組織特異的な遺伝子発現をひき出すために
５′−または３′側の配列を付加することによって発現
の程度を増やしうる。５′フランキング配列の保存がCA
P部位の最初の２〜３百bp上流にみられたけれど、この
ことが、この領域をはずれる他の配列が組織特異的な発
現と制御に重要な役割をもつということを妨げるもので
ない。このことは大多数の遺伝子でそうではないのに、
一方、マウスのα−フェトプロティン遺伝子の５〜7Kb
上流の遺伝子導入マウスにおいて効率的な組織特異的な
発現に必要であることが観察されている〔ハマー等（Ha
mmer et al.）Science,235巻、53−58頁（1987年）〕。
CATくみ込みの分析 pSVoCAT発現ベクターはバクテリアの酵素クロラムフ
ェニコール・アセチルトランスフエラーゼをコードする
遺伝子を含んでいる。特定の遺伝子配列による遺伝子の
発現の促進と昂揚は真核細胞には全くバックグラウンド
のない非常に鋭敏な酵素的試験であるCAT活性を測定す
ることによって容易に調べることができる。一連のβ−
及びγ−カゼイン−CAT融合遺伝子が構築されている
（第８図）。これらはホルモン的に制御されたプロモー
タ活性についていろいろな乳腺細胞系統や初代培養細胞
で調べられている〔ビスビーとローゼン（Bisbee and R
osen）「分子及び細胞生物学に関するUCLAシンポジウム
−転写の制御」（1986年）〕。遺伝子導入された動物で
カゼイン−CAT融合遺伝子を使うことは組織特異性のプ
ロモータとエンハンサーの機能についての迅速で敏感な
測定法を提供している。
この技術に精通する者は乳腺と乳の中に蛋白を分泌す
るためにこの他の外来遺伝子複合体系を使えることを認
識するだろう。ここには公表のために本発明の具体的な
実施例が与えられているが、この分野の技術に通じるも
のにとって本発明の精神の中に包含され付記する特許請
求の範囲で示されている中での変化やそれ以外の利用が
できるであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図Ａは組換DNA遺伝子複合物を示す。Ｅはエンハン
サー配列、Ｐはプロモータ配列を表わしている。シグナ
ルペプチドは組織に特異的な配列を表わす。cDNAは合成
された特定の遺伝子を表わしている。細い線（−）は側
面につながる配列を表わし、太線 はイントロン配列を表わしている。 第１図Ｂはもう一つの別の組換えDNA遺伝子複合物を示
す。記号は同じであるが５′UTは５′の非翻訳mRNA、
３′UTが３′の非翻訳mRNAを表わしていることが追加さ
れている。 第２図は移入されたラットのβ−カゼイン遺伝子の構造
を示す。このものはB14プラスミドでATCC寄託番号40420
号として寄託されている。図は約1.3kbの５′側面につ
ながるDNAと1kbのλDNAを伴う全遺伝子を含んでいる。
この構造は単一のファージクローンからKpn I−BAM H I
による消化によって分離されサブクローン化された。染
色体DNAを解析するために使われる1.9kbのEcoR Iプロー
ブも示されている。 第３図は生物の形態を表わす写真であり、ラットのβ−
カゼインの遺伝子導入マウスへの移入に関するものであ
り、マウスの胚に挿入した後1.9kbのKpn I−Ban H I断
片の解析を示す。ラットやマウスのDNAが対照として使
われている。 第４図は遺伝子導入マウス11.2におけるラットのβ−カ
ゼイン遺伝子の限定された系図である。○は雌を□は雄
を表わす。黒くぬりつぶした記号はラットのβ−カゼイ
ン遺伝子を含むマウスを示す。尻尾の試料のDNAブロッ
ト（転写）をF1及びF2世代のマウスについて行った。 第５図は生物の形態を表わす写真であり、遺伝子導入し
たマウスにおけるβ−カゼイン遺伝子の発現に関するも
のであり、肝、脳、腎からとったRNA分離物についてRNA
転写の結果を示している。ラットのβ−カゼインのmRNA
の３′−非コード領域を使った特異的なS1ヌクレアーゼ
防護測定法がラットとマウスのmRNAを区別するのに使わ
れた。 第６図は生物の形態を表わす写真であり、ラットのβ−
カゼイン遺伝子の遺伝子導入マウスへの移入に関するも
のである。ラットのβ−カゼイン遺伝子全体と3.5kbの
５′側に連なるDNAと3.0kbの３′側のDNAを含む染色体
クローンをマウスの胚に挿入した。５匹のマウスがいく
つかの数のコピー数をもった転移遺伝子（transgene）
のあることを示している。 第７図は生物の形態を表わす写真であり、遺伝子導入し
たマウスからとった乳腺RNAのリボヌクレアーゼによる
分解性試験に関するものである。３匹の雌のF0マウスか
ら生検試料として得た授乳期の乳組織からRNAを抽出し
た。ラットのβ−カゼインの転移遺伝子が発現している
ことはリボヌクレアーゼによる分解性試験を使ってRNA
において検出された。文字は次のようなことを表わして
いる；すなわち、Ａ列（プローブだけ）、Ｂ列（ラット
の授乳期中のRNA0.5μｇ）、Ｃ列（注入されていない対
照からとった授乳期のRNA50μｇ）、Ｄ、Ｅ、Ｆ列（陽
性の遺伝子導入マウスからとったRNA50μｇ）、Ｇ列（t
RNAの50μｇ）。 第８図はカゼイン−CAT融合遺伝子の構成。pSV0CATの発
現ベクターの構造を示す。2.3kbの５′側面DNAとある場
合には５′−非翻訳エクソンＩとこれらの遺伝子のイン
トロンＡの一部を含んでいる４つのβ−カゼイン−CAT
融合遺伝子と１つのγ−カゼイン−CAT融合遺伝子が示
されている。図中CATプラスミドβ−511/＋535は、ATCC
寄託番号40421号として、又、β−2300/＋535は、ATCC
寄託番号40419号として、それぞれ寄託されている。数
字の相対的でカゼインのmRNAのCAP部位を＋１としてい
る。構成遺伝子配列はエクソンを黒色でイントロンを白
色で示されている。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−291（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−500162（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．103，Ｎｏ．５, Ｐａｒｔ２（1986）ｐ．313ａ ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｔｒｏ ｌ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｖｏｌ．52 （1987）ｐ．313−323 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１ （1987．Ｊａｎ）ｐ．20−24 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】乳腺に対して蛋白の発現を標的するための
    組換えDNA遺伝子複合体において、該遺伝子複合体が、 （ａ）乳腺特異的な遺伝子からのカゼインプロモーター
    配列、 （ｂ）乳腺特異的な遺伝子からのカゼインエンハンサー
    配列、 （ｃ）乳房分泌細胞において機能するシグナルペプチド
    配列、 （ｄ）蛋白質をコードする遺伝子に由来するコード配列
    （該コード配列は天然にはプロモーターに結合されてい
    ない）、 （ｅ）カゼイン遺伝子または該蛋白質をコードする遺伝
    子からのイントロン配列を含み、ここで上記のプロモー
    ター配列、エンハンサー配列、シグナルペプチド配列及
    びイントロン配列は乳腺における上記コード配列の発現
    を促進するところの組換えDNA遺伝子複合体。
  2. 【請求項２】請求項１の組換えDNA遺伝子複合体を含有
    する生殖細胞系を有し、乳腺において蛋白を合成するト
    ランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該生殖細胞
    系は次世代へと受継がれるものであるところのトランス
    ジェニック非ヒト哺乳動物。
  3. 【請求項３】乳腺からの乳中に蛋白を合成する方法であ
    って、 請求項１の組換えDNA遺伝子複合体を非ヒト哺乳動物の
    胚の生殖細胞系中に挿入すること、 該胚を成長させて、上記遺伝子複合体を含む生殖細胞系
    を有する哺乳動物を作ること、及び 上記蛋白を含有する、上記哺乳動物により作られた乳を
    集めること の工程を含むところの方法。
  4. 【請求項４】上記蛋白が静菌剤である請求項３の方法。
  5. 【請求項５】乳から蛋白を精製する工程を更に含む請求
    項３又は４の方法。
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