TW202100550A - 識別ｔａｕ之抗體 - Google Patents

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菲利浦 多蘭
躍 劉
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Abstract

本發明提供特異性結合tau之抗體。該等抗體抑制或延遲與tau相關聯的病理和相關聯的症狀惡化。

Description

識別ＴＡＵ之抗體
相關申請案之交互參照
本申請案主張2019年3月3日申請之美國臨時申請案第62/813,126號、2019年3月3日申請之美國臨時申請案第62/813,137號及2019年4月24日申請之美國臨時申請案第62/838,159號之優先權，各申請案出於所有目的皆以全文引用之方式併入。對序列表之引用
本申請案包括電子序列表，其檔案名稱為536323WO_ST25.TXT，建立於2020年2月24日且含有168,875個位元組，該序列表據此出於所有目的皆以全文引用之方式併入。 本發明係關於特異性結合tau之抗體、以及該等抗體抑制或延遲與tau相關聯的病理和相關聯的症狀惡化。
tau為可以磷酸化形式存在的眾所周知的人類蛋白(參見例如，Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051-4055(1988)；Goedert, EMBO J. 8:393-399(1989)；Lee, Neuron 2:1615-1624(1989)；Goedert, Neuron 3:519-526(1989)；Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633 (1992))。據報導，tau在穩定微管方面發揮作用，特別是在中樞神經系統中。總tau (t-tau，即磷酸化及非磷酸化形式)及磷酸-tau (p-tau，即磷酸化tau)由腦部回應於神經元損傷及神經退化而釋放，且據報導，相對於普通群體，在阿茲海默氏病患者之CSF中以增加之水準存在(Jack等人, Lancet Neurol 9: 119-28 (2010))。
tau為神經纖維纏結之主要成分，其與斑一起為阿茲海默氏病之標誌性特徵。纏結構成直徑測量為10 nm的異常原纖維，其成對出現，以螺旋方式纏繞，具有80 nm的規則週期性。神經纖維纏結內之tau經異常磷酸化(過度磷酸化)，其中磷酸酯基團連接於分子上之特定位點。在阿茲海默氏病中，在內嗅皮質之II層神經元、海馬迴之CA1及下腳區、扁桃體以及新皮質之深層(III層、V層及表層VI)中觀察到神經纖維纏結之嚴重受累。亦報導，經過度磷酸化之tau干擾微管組裝，這可能促進神經元網路的破壞。
tau內含物為若干神經退化性疾病之定義神經病理學之一部分，該等神經退化性疾病包括阿茲海默氏病、額顳葉退化、進行性核上神經麻痺症及匹克病(Pick's disease)。
在一個態樣中，本發明提供一種特異性結合人類tau之經單離抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區包含有分別包含SEQ ID NO:8之CDR-H1，包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:149之CDR-H2及包含SEQ ID NO:10之CDR-H3，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO:18具有至少90%一致性；該成熟輕鏈可變區包含有包含SEQ ID NO:12之CDR L1，包含SEQ ID NO:150、151、153、156、158、159、160、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173或174之CDR L2及包含SEQ ID NO:14之CDR L3，其中該輕鏈可變區與SEQ ID NO:122具有至少90%一致性。
在一些抗體中，位置H12、H13、H17、H24、H40、H43、H48、H66、H67、H76、H80、H81及H91中之至少一者可分別由V、K、T、A、R、Q、I、R、A、D、L、Q及F佔據，且位置L2、L12、L15、L37、L39、L45、L60及L100中之至少一者可分別由V、P、L、Q、R、R、D及Q佔據。
在一些抗體中，CDR L2包含SEQ ID NO:150、151、163、167、168或169。在一些抗體中，重鏈可變區包含SEQ ID NO:18，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO:110、121、122或123。
在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:110。在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:121。在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:123。
在一些抗體中，重鏈可變區包含SEQ ID NO:146，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO:94或122。在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:94。在一些抗體中，輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。
在一些抗體中，重鏈可變區包含SEQ ID NO:18或146，且輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。
在另一態樣中，本發明提供一種特異性結合人類tau之抗體，其包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區包含有分別包含SEQ ID NO:8、9及10之CDR H1、CDR H2及CDR H3，除了位置H28可由N或T佔據，H54可由N或D佔據，H56可由D或E佔據，位置H58由V或I佔據，且位置H60可由D或E佔據；該成熟輕鏈可變區包含有分別包含SEQ ID NO:12、13及14之CDR L1、CDR L2及CDR L3，除了位置L24可由K或R佔據，位置L50可由L、E、D、G或V佔據，位置L52可由S或G佔據，且位置L54可由L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，其中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由Q佔據，H5由Q佔據，H11由L佔據，H20由L佔據，H23由T佔據，H38由K佔據，H75由S佔據，H56由E佔據，H58由I佔據，H60由E佔據，H82c由V佔據，L10由T佔據，L17由E佔據，L24由R佔據，L37由Q佔據，L47由G、N、D、E、P、T、S或A佔據，L48由G或D佔據，L49由E佔據，L50由E、D、G或V佔據，L52由G佔據，L54由D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，L83由L佔據，L86由H佔據，L100由Q佔據，L106由L佔據。
在另一態樣中，本發明提供一種結合人類tau之經單離單株抗體，其包含單株抗體3D6之三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR，其中3D6為特徵在於重鏈可變區具有包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列且輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的小鼠抗體，除了位置H27可由F或Y佔據，位置H28可由N或T佔據，位置H29可由I或F佔據，位置H30可由K或T佔據，位置H51可由I或V佔據，位置H54可由N或D佔據，位置H60可由D、A或E佔據，位置H61可由P或E佔據，位置H102可由F或Y佔據，位置L50可由L、E、D、G或V佔據，位置L52可由S或G佔據，且位置L54可由L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，其中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L37由Q佔據，L47由G、N、D、E、P、T、S或A佔據，L48由G或D佔據，L49由E佔據，L50由E、D、G或V佔據，L52由G佔據，L54由D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，L100由Q佔據，H60由E佔據，H82c由V佔據。
在一些抗體中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:149之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-L2具有包含SEQ ID NO:150-175中任一者之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-L1具有包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且CDR-H2具有包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且CDR-H2具有包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且CDR-H2具有包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H1具有包含SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H2具有包含SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:149之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-H3具有包含SEQ ID NO:65之胺基酸序列。在一些抗體中，CDR-L2具有包含SEQ ID NO:150-175中任一者之胺基酸序列。
一些抗體為人源化抗體、鑲飾(veneered)抗體或嵌合抗體。
一些抗體包含人源化成熟重鏈可變區及人源化成熟輕鏈可變區，該人源化成熟重鏈可變區具有與SEQ ID NO:76-80及SEQ ID NO:90-91中任一者具有至少95%一致性的胺基酸序列，且該人源化成熟輕鏈可變區具有與SEQ ID NO:83-85中任一者具有至少90%一致性的胺基酸序列。
一些抗體包含人源化成熟重鏈可變區及人源化成熟輕鏈可變區，該人源化成熟重鏈可變區具有與SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:146-148中任一者具有至少95%一致性的胺基酸序列，且該人源化成熟輕鏈可變區具有與SEQ ID NO:93-145中任一者具有至少90%一致性的胺基酸序列。
在一些抗體中，VH區中之以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H93由S佔據，且H94由T佔據。在一些抗體中，位置H93及H94分別由S及T佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H91由F佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由E佔據，H5由V佔據，H11由V佔據，H20由I佔據，H23由K佔據，H38由R佔據，H42由G佔據，H43由K佔據，H66由R佔據，H75由T佔據，H76由D佔據，H81由E佔據，H108由L佔據，H109由V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H20、H23、H38、H42、H43、H66、H75、H76、H81、H108及H109分別由E、V、V、I、K、R、G、K、R、T、D、E、L及V佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H17由T佔據，H80由M佔據，H83由R佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H17、H80及H83分別由T、M及R佔據。
在一些抗體中，VH區中之位置H58由I佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H28由T佔據，H67由V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H28及H67分別由T及V佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H54由D佔據，H56由E佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H54及H56分別由D及E佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由Q或E佔據，H5由Q或V佔據，H11由L或V佔據，H17由S或T佔據，H20由L或I佔據，H23由T或K佔據，H28由N或T佔據，H38由K或R佔據，H42由E或G佔據，H43由Q或K佔據，H54由N或D佔據，H56由D或E佔據，H58由V或I佔據，H60由D或E佔據，H66由K或R佔據，H67由A或V佔據，H75由S或T佔據，H76由N或D佔據，H80由L或M佔據，H81由Q或E佔據，H82c由L或V佔據，H83由T或R佔據，H91由F或Y佔據，H93由S佔據，H94由T佔據，H108由T或L佔據，H109由L或V佔據。
在一些抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H10由E或D佔據，H12由K或V佔據，H13由K或R佔據，H17由T、L或S佔據，H24由V或A佔據，H27由F或Y佔據，H28由N或T佔據，H29由I或F佔據，H30由K或T佔據，H38由Q或R佔據，H40由A或R佔據，H42由G或E佔據，H43由K或Q佔據，H48由M或I佔據，H51由V或I佔據，H54由N或D佔據，H60由D、A或E佔據，H61由P或E佔據，H66由R或K佔據，H67由V或A佔據，H76由D或N佔據，H80由M或L佔據，H81由E或Q佔據，H82a由S或G佔據，H82c由L或V佔據，H83由T或R佔據，H91由Y或F佔據，H93由A或S佔據，H102由F或Y佔據，H108由T或L佔據，H109由L或V佔據。
在一些抗體中，VH區中之位置H91、H93及H94分別由F、S及T佔據。
在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H20、H23、H38、H42、H43、H66、H75、H76、H81、H91、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、I、K、R、G、K、R、T、D、E、F、S、T、L及V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H38、H42、H43、H58、H66、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、R、G、K、I、R、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H58、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、I、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H58、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、I、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據。
在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H91、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、R、V、T、D、M、E、R、F、S、T、L及V佔據。在一些抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據。
在一些抗體中，位置H60由E佔據。在一些抗體中，位置H82C由V佔據。在一些抗體中，位置H60、H80、H81、H82c及H83分別由E、M、E、V及R佔據。
在一些抗體中，VL區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L7由S佔據，L10由S佔據，L15由L佔據，L83由V佔據，L86由Y佔據，且L106由I佔據。在一些抗體中，位置L7、L10、L15、L83、L86及L106分別由S、S、L、V、Y及Y佔據。
在一些抗體中，VL區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L7為T或S，L10為T或S，L15為I或L，L17為Q或E，L24為K或R，L37為L或Q，L45為K或R，L47為L、G、N、D、E、P、T、S或A，L48為I、G或D，L49為Y或E，L50為L、E、D、G或V，L52為S或G，L54為L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S，L83為L或V，L86為H或Y，L100為A或Q，L106為L或I。
在一些抗體中，VL區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L2為V或I，L7為S或T，L12為P或S，L15為L或I，L36為L，L37為L或Q，L45為R或K，L47為L、G、N、D、E、P、T、S或A，L48為I、G或D，L49為Y或E，L50為L、E、D、G或V，L52為S或G，L54為L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V，L60為D或S，L100為G或Q。
在一些抗體中，VL區中之位置L7、L10、L15、L83、L86及L106分別由S、S、L、V、Y及I佔據。在一些抗體中，VL區中之位置L7、L10、L15、L17、L24、L37、L45、L83、L86、L100及L106分別由S、S、L、E、R、Q、R、V、Y、Q及I佔據。
在一些抗體中，位置L54由D佔據。在一些抗體中，位置L54由G佔據。在一些抗體中，位置L54由N佔據。在一些抗體中，位置L54由E佔據。在一些抗體中，位置L50由E佔據。在一些抗體中，位置L54由Q佔據。在一些抗體中，位置L50由D佔據。在一些抗體中，位置L54由K佔據。在一些抗體中，位置L54由R佔據。在一些抗體中，位置L54由T佔據。在一些抗體中，位置L50由G佔據。在一些抗體中，位置L48由G佔據。在一些抗體中，位置L48由D佔據。在一些抗體中，位置L47由G佔據。在一些抗體中，位置L49由E佔據。在一些抗體中，位置L54由V佔據。在一些抗體中，位置L54由S佔據。
在一些抗體中，位置L52由G佔據。在一些抗體中，位置L47由N佔據。在一些抗體中，位置L47由D佔據。在一些抗體中，位置L47由E佔據。在一些抗體中，位置L47由P佔據。在一些抗體中，位置L47由T佔據。在一些抗體中，位置L47由S佔據。在一些抗體中，位置L47由A佔據。在一些抗體中，位置L50由V佔據。
在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、G及R佔據。在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、G及G佔據。在一些抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及G佔據。在一些抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及R佔據。在一些抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及T佔據。在一些抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及D佔據。在一些抗體中，L37及L54分別由Q及R佔據。
在一些抗體中，位置L37及L54分別由Q及G佔據。在一些抗體中，位置L37及L54分別由Q及D佔據。在一些抗體中，位置L37及L50分別由Q及G佔據。在一些抗體中，位置L37及L50分別由Q及D佔據。在一些抗體中，位置L37及L54分別由Q及T佔據。在一些抗體中，位置L37及L52分別由Q及G佔據。在一些抗體中，位置L37及L54分別由Q及E佔據。在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、D及G佔據。在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、D及R佔據。
在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、E及G佔據。在一些抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、E及R佔據。在一些抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、G、R及Q佔據。在一些抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、G、G及Q佔據。在一些抗體中，位置L37、L52、L54及L100分別由Q、G、R及Q佔據。在一些抗體中，位置L37、L52、L54及L100分別由Q、G、D及Q佔據。在一些抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、D、G及Q佔據。在一些抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、D、R及Q佔據。
在一些抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、V、D及Q佔據。在一些抗體中，位置L37由Q佔據。在一些抗體中，位置L100由Q佔據。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:76-80及SEQ ID NO:90-91中任一者，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83-85中任一者。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18及SEQ ID NO:146-148中任一者，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:93-145中任一者。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:76，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:76，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:76，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:77，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:77，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:77，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:78，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:78，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:78，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:79，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:79，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:79，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:80，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:80，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:80，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:90，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:90，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:90，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:91，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:83。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:91，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:84。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:91，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:85。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:122。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:123。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:146，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:122。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:121。在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:110。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:146，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:94。
在一些抗體中，成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:18，且成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:103。
例如，抗體可為嵌合抗體、鑲飾抗體或人源化抗體。
抗體可為完整的嵌合、鑲飾或人源化抗體或結合片段、單鏈抗體Fab片段、Fab'2片段或單鏈Fv。一些抗體具有人類IgG1同型，而其他抗體可具有人IgG2或IgG4同型。一些抗體具有與輕鏈恆定區融合之成熟輕鏈可變區及與重鏈恆定區融合之成熟重鏈可變區。一些抗體之重鏈恆定區為天然人類重鏈恆定區之突變體形式，其相對於天然人類重鏈恆定區與Fcγ受體之結合減少。
在一些抗體中，重鏈恆定區具有胺基酸序列SEQ ID NO:176。在一些抗體中，與重鏈恆定區融合之成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:178。一些抗體進一步包含與成熟重鏈及/或輕鏈可變區融合之訊息肽。在一些抗體中，重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:180。在一些抗體中，輕鏈恆定區具有胺基酸序列SEQ ID NO:177。在一些抗體中，與輕鏈恆定區融合之成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:179。在一些抗體中，輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:181。在一些抗體中，重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:178，且輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:179。在一些抗體中，重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:180，且輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:181。
一些抗體可在恆定區中具有至少一個突變，諸如減少藉由恆定區之補體固定或活化的突變，例如，在藉由EU編號的位置241、264、265、270、296、297、318、320、322、329及331中之一或多者處的突變。一些抗體在位置318、320及322處具有丙胺酸。一些抗體可為至少95% w/w純。抗體可綴合於治療劑、細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、神經營養劑或神經保護劑。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本文所揭示之任一抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種編碼本文所揭示之任一抗體之重鏈及/或輕鏈的核酸、一種包含該核酸之重組表現載體以及一種用該重組表現載體轉型之宿主細胞。
在一些核酸中，重鏈由包含SEQ ID NO:182之序列編碼，且輕鏈由包含SEQ ID NO:183之序列編碼。
亦提供產生抗體之方法，該等抗體諸如人源化抗體、嵌合抗體或鑲飾抗體，例如3D6之人源化形式、嵌合形式或鑲飾形式。在此類方法中，培養了用編碼抗體之重鏈及輕鏈的核酸轉型之細胞，使得該等細胞分泌該抗體。然後可自細胞培養基中純化出抗體。
產生本文所揭示之任一抗體的細胞株可藉由以下方式產生：將編碼抗體之重鏈及輕鏈以及可選擇標誌物的載體引入細胞中；在選擇載體之複本數增加之細胞的條件下使細胞繁殖；自所選擇之細胞單離出單細胞；且將由基於抗體之產率選擇之單細胞選殖之細胞存入庫。
在另一態樣中，本發明包含一種載體，其包含編碼成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之核酸，該核酸可操作地連接至一或多個影響本文所揭示之任一抗體在哺乳動物細胞中之表現的調控序列。在一些載體中，經表現之抗體為scFv或Fab片段。在一些載體中，該一或多個調控序列包括啟動子、強化子、核糖體結合位點及轉錄終止訊息中之一或多者。在一些載體中，核酸進一步編碼與成熟重鏈及輕鏈可變區融合之訊息肽。在一些載體中，核酸經密碼子最佳化以供在宿主細胞中表現。在一些載體中，該一或多個調控序列包括真核啟動子。在一些載體中，核酸進一步編碼可選擇基因。
在另一態樣中，本發明提供在哺乳動物細胞中表現抗體的方法，其包含將本文所揭示之核酸併入基因轉殖動物之基因體中，由此表現抗體。
在另一態樣中，本發明提供第一及第二載體，其分別包含編碼成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區之核酸，各核酸可操作地連接至一或多個影響本文所揭示之任一抗體之表現的調控序列；以及一種包含該等核酸之宿主細胞。在一些第一及第二載體中，核酸分別進一步編碼與成熟重鏈可變區融合之重鏈恆定區及與成熟輕鏈可變區融合之輕鏈恆定區。在一些第一及第二載體中，重鏈恆定區具有帶有或不帶有C端離胺酸之序列SEQ ID NO:176，且輕鏈恆定區具有序列SEQ ID NO:177。
在另一態樣中，本發明提供在哺乳動物細胞中表現抗體的方法，其包含將本文所揭示之任一核酸併入基因轉殖動物之基因體中，由此表現抗體。
亦提供產生抗體之方法，該等抗體諸如人源化抗體、嵌合抗體或鑲飾抗體。在此類方法中，培養了用編碼本文所揭示之任一抗體之重鏈及輕鏈的核酸轉型之細胞，使得該等細胞分泌該抗體。然後可自細胞培養基中純化出抗體。
產生本文所揭示之任一抗體的細胞株可藉由以下方式產生：將編碼請求項1之抗體之重鏈及輕鏈以及可選擇標誌物的載體引入細胞中；在選擇載體之複本數增加之細胞的條件下使細胞繁殖；自所選擇之細胞單離出單細胞；且將由基於抗體之產率選擇之單細胞選殖之細胞存入庫。
可在選擇性條件下使一些細胞繁殖並篩選出天然表現且分泌至少100 mg/L/106 個細胞/24小時的細胞株。可自所選擇之細胞中單離出單細胞。然後可將由單細胞選殖之細胞存入庫。可基於期望特性來選擇單細胞，諸如抗體之產率。示範性細胞株為表現3D6或3D6之人源化型式之細胞株。
本發明亦提供抑制或減少患有tau介導之類澱粉變性或處於發展tau介導之類澱粉變性之風險的個體中之tau聚集的方法，其包含向該個體投與本文所揭示之抗體之有效方案，從而抑制或減少該個體中之tau聚集。示範性抗體包括3D6之人源化型式。
亦提供治療個體中之tau相關疾病或實現tau相關疾病之預防的方法，其包含投與本文所揭示之抗體之有效方案，且由此治療疾病或實現疾病之預防。此一疾病之實例為阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變(tauopathy)、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病(type C Niemann-Pick disease)、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症(amyotrophic lateral sclerosis/parkinsonism dementia complex of Guam)、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(Lewy body variant of Alzheimer disease；LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。在一些方法中，tau相關疾病為阿茲海默氏病。在一些方法中，患者為ApoE4攜帶者。
亦提供減少tau之異常傳播的方法，其包含投與本文所揭示之抗體之有效方案且從而減少tau之傳播。
亦提供誘導tau之吞噬的方法，其包含投與本文所揭示之抗體之有效方案且從而誘導tau之吞噬。
亦提供抑制tau聚集或沉著的方法，其包含投與本文所揭示之抗體之有效方案，從而抑制tau聚集或沉著。
亦提供抑制tau纏結形成的方法，其包含投與本文所揭示之抗體之有效方案。
本發明亦提供一種偵測患有與tau聚集或沉著相關聯之疾病或處於該疾病之風險的個體中之tau蛋白沉著物的方法，其包含向個體投與本文所揭示之抗體，及偵測該個體中之結合tau之抗體。此一疾病之實例為阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。在一些實施例中，抗體係藉由靜脈內注射至個體體內來投與。在一些實施例中，抗體係藉由顱內注射或藉由鑽取穿透個體之顱骨的孔來直接向個體之腦部投與。在一些實施例中，抗體係經標記。在一些實施例中，抗體用螢光標記、順磁性標記或放射性標記進行標記。在一些實施例中，使用正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)偵測放射性標記。
本發明亦提供一種量測正治療與tau聚集或沉著相關聯之疾病的個體中之治療功效的方法，其包含在藉由向個體投與本文所揭示之抗體進行治療之前量測個體中之tau蛋白沉著物之第一水準，且偵測個體中之結合tau之抗體之第一量；向個體投與治療；在藉由向個體投與抗體進行治療之後量測個體中之tau蛋白沉著物之第二水準，且偵測個體中之結合tau之抗體；其中tau蛋白沉著物水準之降低指示對治療的陽性反應。
本發明亦提供一種量測正治療與tau聚集或沉著相關聯之疾病的個體中之治療功效的方法，其包含在藉由向個體投與本文所揭示之抗體進行治療之前量測個體中之tau蛋白沉著物之第一水準，且偵測個體中之結合tau之抗體之第一量；向個體投與治療；在藉由向個體投與抗體進行治療之後量測個體中之tau蛋白沉著物之第二水準，且偵測個體中之結合tau之抗體之第二量；其中tau蛋白沉著物之水準沒有變化或tau蛋白沉著物之少量增加指示對治療的陽性反應。
在另一態樣中，本發明提供產生在式KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)或KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194)之模體內的抗原決定位處特異性結合人類tau之抗體的方法，其包含用人類tau或其片段使動物免疫以產生抗體且篩選出所產生之抗體中在模體內特異性結合的抗體。在另一態樣中，本發明提供產生特異性結合由殘基KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)或KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194)組成之肽的抗體的方法，其包含用人類tau或其片段使動物免疫以產生抗體且篩選出所產生之抗體中特異性結合該肽的抗體。在另一態樣中，本發明提供產生特異性結合包含KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)之抗原決定位之抗體的方法，其包含用tau或其片段使動物免疫且篩選出特異性結合該抗原決定位之抗體。
在一些方法中，用383個胺基酸的人類tau (4R0N)使動物免疫。在一些方法中，人類tau含有P301S突變。在一些方法中，人類tau為重組的帶有N末端His標籤的。
在一些方法中，篩選確定抗體與一或多種至多15個胺基酸的肽之間的特異性結合，該一或多種肽包含分別KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)、KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)、KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)或由KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)表示之任何其他共通模體。在一些方法中，該一或多種肽包含分別KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)或KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)或KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)。在一些方法中，用連接至載劑的至多15個胺基酸的tau片段使動物免疫，該tau片段包含KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)。在一些方法中，肽為KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)或KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)或KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)。
序列簡單說明
SEQ ID NO:1示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-8)。
SEQ ID NO:2示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-7)。
SEQ ID NO:3示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-6)(4R0N人類tau)。
SEQ ID NO:4示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-5)。
SEQ ID NO:5示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-4)。
SEQ ID NO:6示出人類tau之同功型之胺基酸序列(Swiss-Prot P10636-2)。
SEQ ID NO:7示出小鼠3D6抗體之重鏈可變區之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8示出小鼠3D6抗體之Kabat/Chothia複合物CDR-H1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9示出小鼠3D6抗體之Kabat CDR-H2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10示出小鼠3D6抗體之Kabat CDR-H3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11示出小鼠3D6抗體及小鼠6A10抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列。
SEQ ID NO:12示出小鼠3D6抗體及小鼠6A10抗體之Kabat CDR-L1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:13示出小鼠3D6抗體及小鼠6A10抗體之Kabat CDR-L2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:14示出小鼠3D6抗體及小鼠6A10抗體之Kabat CDR-L3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:15示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:16示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:17示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1b之胺基酸序列。
SEQ ID NO:18示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1bA11之胺基酸序列。
SEQ ID NO:19示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv5之胺基酸序列。
SEQ ID NO:20示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLv1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:21示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLv2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:22示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLv3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:23示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLv4之胺基酸序列。
SEQ ID NO:24示出重鏈可變受體Acc.# BAC01986.1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:25示出重鏈可變受體Acc.# IMGT# IGHV1-69-2*01之胺基酸序列。
SEQ ID NO:26示出重鏈可變受體Acc.# IMGT# IGKJ1*01之胺基酸序列。
SEQ ID NO:27示出輕鏈可變受體Acc.# IMGT# IGKV2-30*02之胺基酸序列。
SEQ ID NO:28示出輕鏈可變受體Acc.# IMGT# IGKJ2*01之胺基酸序列。
SEQ ID NO:29示出輕鏈可變受體Acc.# AAZ09048.1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:30示出編碼小鼠3D6抗體之重鏈可變區的核酸序列。
SEQ ID NO:31示出編碼小鼠3D6抗體之輕鏈可變區的核酸序列。
SEQ ID NO:32示出小鼠3D6抗體之Kabat CDR-H1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:33示出小鼠3D6抗體之Chothia CDR-H1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:34示出小鼠3D6抗體之Chothia CDR-H2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:35示出小鼠3D6抗體之AbM CDR-H2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:36示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-L1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:37示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-L2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:38示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-L3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:39示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-H1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:40示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-H2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:41示出小鼠3D6抗體之Contact CDR-H3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:42示出人源化3D6抗體之替代Kabat-Chothia複合物CDR-H1 (如hu3D6VHv5、hu3D6VHv1bA11B6G2、hu3D6VHv1bA11B6H3、hu3D6VHv1e及hu3D6VHv1f中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:43示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHv5及hu3D6VHv1bA11B6H3中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:44示出小鼠3D6及所選擇之人源化3D6抗體之重鏈可變區(VHv1、VHv2、VHv1b、VHv1bA11及VHv5)中之共通胺基酸序列(在PCT/IB2017/ 052544之圖2中標記為「Majority」)。
SEQ ID NO:45示出小鼠3D6及所選擇之人源化3D6抗體之輕鏈可變區之間的共通胺基酸序列(在PCT/IB2017/052544之圖3中標記為「Majority」)。
SEQ ID NO:46示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1bA11B6G2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:47示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1bA11B6H3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:48示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1c之胺基酸序列。
SEQ ID NO:49示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1d之胺基酸序列。
SEQ ID NO:50示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1e之胺基酸序列。
SEQ ID NO:51示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv1f之胺基酸序列。
SEQ ID NO:52示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:53示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv3b之胺基酸序列。
SEQ ID NO:54示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv3c之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv4之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv4b之胺基酸序列。
SEQ ID NO:57示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHv4c之胺基酸序列。
SEQ ID NO:58示出人源化3D6抗體之替代Kabat-Chothia複合物CDR-H1 (如hu3D6VH1c中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:59示出人源化3D6抗體之替代Kabat-Chothia複合物CDR-H1 (如hu3D6VHv1d、hu3D6VHv3c及hu3D6VHv4c中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:60示出人源化3D6抗體之替代Kabat-Chothia複合物CDR-H1 (如hu3D6VHv3b及hu3D6VHv4b中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:61示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHv1bA11B6G2中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:62示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHv1c、hu3D6VHv3b及hu3D6VHv4b中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:63示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHv1d、hu3D6VHv1f、hu3D6VHv3c及hu3D6VHv4c中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:64示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHv1e中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:65示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H3 (如hu3D6VHv1f中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:66示出小鼠6A10抗體之重鏈可變區之胺基酸序列。
SEQ ID NO:67示出小鼠6A10抗體之Kabat/Chothia複合物CDR-H1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:68示出小鼠6A10抗體之Kabat CDR-H2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:69示出小鼠6A10抗體之Kabat CDR-H3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:70示出用作重鏈人源化之結構模板的小鼠抗體之VH區(pdb代碼1CR9)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:71示出所選擇之人源化3D6抗體之重鏈可變區(VHv1、VHv1b、VHv1bA11、VHv1bA11B6G2、VHv1bA11B6H3、VHv1c、VHv1d、VHv1e、VHv1f、VHv2、VHv3、VHv3b、VHv3c、VHv4、VHv4b、VHv4c及VHv5)中之共通胺基酸序列(在PCT/IB2017/052544之圖4A及圖4B中標記為「Majority」)。
SEQ ID NO:72示出嵌合3D6抗體之重鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO:73示出嵌合3D6抗體之輕鏈之胺基酸序列。
SEQ ID NO:74示出重鏈可變結構模型Acc.# 5MYX-VH_mSt之胺基酸序列。
SEQ ID NO:75示出重鏈可變受體Acc.# 2RCS-VH_huFrwk之胺基酸序列。
SEQ ID NO:76示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:77示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:78示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:79示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb4之胺基酸序列。
SEQ ID NO:80示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb5之胺基酸序列。
SEQ ID NO:81示出輕鏈可變結構模型Acc.# 5MYX-VL_mSt之胺基酸序列。
SEQ ID NO:82示出輕鏈可變受體Acc.# ARX71335-VL_huFrwk之胺基酸序列。
SEQ ID NO:83示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLvb1之胺基酸序列。
SEQ ID NO:84示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLvb2之胺基酸序列。
SEQ ID NO:85示出人源化3D6抗體之輕鏈可變區hu3D6VLvb3之胺基酸序列。
SEQ ID NO:86示出人源化3D6抗體之替代Kabat-Chothia複合物CDR-H1 (如hu3D6VHvb4及hu3D6VHvb5中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:87示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHvb3及hu3D6VHvb4中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:88示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHvb5中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:89示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L1 (如hu3D6VLvb3中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:90示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb6之胺基酸序列。
SEQ ID NO:91示出人源化3D6抗體之重鏈可變區hu3D6VHvb7之胺基酸序列。
SEQ ID NO:92示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如hu3D6VHvb6及hu3D6VHvb7中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:93示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:94示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:95示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L45N之胺基酸序列。
SEQ ID NO:96示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54E之胺基酸序列。
SEQ ID NO:97示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L50E之胺基酸序列。
SEQ ID NO:98示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:99示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L50D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:100示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54K之胺基酸序列。
SEQ ID NO:101示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:102示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54T之胺基酸序列。
SEQ ID NO:103示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L50G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:104示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體I48G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:105示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體I48D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:106示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:107示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體Y49E之胺基酸序列。
SEQ ID NO:108示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54V之胺基酸序列。
SEQ ID NO:109示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L54S之胺基酸序列。
SEQ ID NO:110示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體S52G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:111示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47N之胺基酸序列。
SEQ ID NO:112示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:113示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47E之胺基酸序列。
SEQ ID NO:114示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47P之胺基酸序列。
SEQ ID NO:115示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47T之胺基酸序列。
SEQ ID NO:116示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47S之胺基酸序列。
SEQ ID NO:117示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L47A之胺基酸序列。
SEQ ID NO:118示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L50V之胺基酸序列。
SEQ ID NO:119示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:120示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:121示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:122示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:123示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54T之胺基酸序列。
SEQ ID NO:124示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:125示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:126示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:127示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L54D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:128示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:129示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D之胺基酸序列。
SEQ ID NO:130示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L54T之胺基酸序列。
SEQ ID NO:131示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:132示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:133示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:134示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50E_L54G之胺基酸序列。
SEQ ID NO:135示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50E_L54R之胺基酸序列。
SEQ ID NO:136示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54R_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:137示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54G_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:138示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:139示出輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54D_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:140示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54G_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:141示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54R_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:142示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體L37Q_L50V_L54D_G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:143示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體L37Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:144示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體G100Q之胺基酸序列。
SEQ ID NO:145示出輕鏈可變區Hu3D6VLv2變異體L37Q_L54E之胺基酸序列。
SEQ ID NO:146示出重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體D60E (亦稱為h3D6VHvb8)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:147示出重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體L82cV之胺基酸序列。
SEQ ID NO:148示出重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (亦稱為h3D6VHvb9)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:149示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如h3D6VHvb8及h3D6VHvb9中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:150示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54D及hu3D6VLv2 L37Q_L54D中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:151示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54G及hu3D6VLv2 L37Q_L54G中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:152示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54N中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:153示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54E及hu3D6VLv2 L37Q_L54E中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:154示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L50E中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:155示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:156示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L50D及hu3D6VLv2 L37Q_L50D中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:157示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54K中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:158示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54R及hu3D6VLv2 L37Q_L54R中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:159示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54T及hu3D6VLv2 L37Q_L54T中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:160示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L50G及hu3D6VLv2 L37Q_L50G中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:161示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54V中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:162示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54S中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:163示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 S52G及hu3D6VLv2 L37Q_S52G中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:164示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L50V中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:165示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R及hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:166示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G及hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:167示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:168示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R及hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:169示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:170示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D及hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:171示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G及hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:172示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R及hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:173示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:174示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:175示出人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q中)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:176示出重鏈恆定區(IgG1：同種異型G1m17,1)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:177示出輕鏈恆定區(κ)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:178示出3D6人源化變異體之成熟重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:179示出3D6人源化變異體之成熟輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:180示出在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:181示出在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:182示出編碼在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之核苷酸序列。
SEQ ID NO:183示出編碼在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之核苷酸序列。
SEQ ID NO:184示出tau微管結合重複序列1之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基255-271)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:185示出tau微管結合重複序列2之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基286-302)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:186示出tau微管結合重複序列3之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基317-333)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:187示出tau微管結合重複序列4之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基349-365)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:188示出3D6所結合之MBTR 1中tau之核心模體之胺基酸序列。
SEQ ID NO:189示出tau序列之在3D6所結合之MBTR 1中tau之核心模體之N末端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:190示出tau序列之在3D6所結合之MBTR 1中tau之核心模體之C末端的胺基酸序列。
SEQ ID NO:191示出3D6之抗原決定位之胺基酸序列。
SEQ ID NO:192示出3D6所結合之MBTR 2中tau之核心模體之胺基酸序列。
SEQ ID NO:193示出3D6所結合之MBTR 3中tau之核心模體之胺基酸序列。
SEQ ID NO:194示出3D6所結合之MBTR 4中tau之核心模體之胺基酸序列。定義
單株抗體或其他生物學實體通常以經單離形式提供。此意謂抗體或其他生物學實體通常為干擾蛋白及由其產生或純化所產生之其他污染物之至少50% w/w純，但不排除單株抗體與過量的一種或多種醫藥學上可接受之載劑或旨在有助於其使用的其他媒劑組合的可能性。有時單株抗體為干擾蛋白及來自產生或純化之污染物之至少60%、70%、80%、90%、95%或99% w/w純。經單離之單株抗體或其他生物學實體常常為在其純化之後剩餘的主要巨分子物質。
抗體與其靶抗原之特異性結合意謂親和力及/或親合力為至少106 、107 、108 、109 、1010 、1011 或1012 M-1 。特異性結合之量級可偵測為較高的且其可與對至少一種不相關靶標發生的非特異性結合區分。特異性結合可為在具體官能基或具體空間配合(例如，鎖-匙型)之間鍵的形成之結果，然而非特異性結合通常為凡得瓦力之結果。然而特異性結合不一定暗示抗體結合一個且僅一個靶標。
基本抗體結構單元為次單元之四聚物。各四聚物包括兩對相同的多肽鏈，各對均具有一個「輕」鏈(約25 kDa)及一個「重」鏈(約50-70 kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別的約100至110或更多個胺基酸的可變區。此可變區最初經表現為連接至可切割的訊息肽。不具有訊息肽之可變區有時被稱為成熟可變區。因此，例如，輕鏈成熟可變區意謂不具有輕鏈訊息肽之輕鏈可變區。各鏈之羧基末端部分限定主要負責效應子功能的恆定區。
輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區與恆定區由約12或更多個胺基酸的「J」區接合，其中重鏈亦包括約10或更多個胺基酸的「D」區。一般而言參見，Fundamental Immunology , Paul, W編, 第2版, Raven Press, N.Y., 1989, 第7章(其出於所有目的以全文引用之方式併入)。
免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變區(本文亦分別稱為「輕鏈可變域」(「VL域」)或「重鏈可變域」(「VH域」))由藉由三個「互補決定區」或「CDR」間隔開的「架構」區組成。架構區用以比對用於特異性結合抗原之抗原決定位的CDR。CDR包括抗體之主要負責抗原結合的胺基酸殘基。自胺基末端至羧基末端，VL域及VH域均包含以下架構(FR)及CDR區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。VL域之CDR1、CDR2及CDR3在本文亦分別稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3；VH域之CDR1、CDR2及CDR3在本文亦分別稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。當本申請案揭示具有作為C末端殘基之R的VL序列時，R可替代地視為輕鏈恆定區之N末端殘基。因此，本申請案亦應理解為揭示不具有C末端R的VL序列。
各VL域及VH域之胺基酸之分配係根據CDR之任何習知定義。習知定義包括：Kabat定義(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest (美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1987及1991)；Chothia定義(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol . 196:901-917, 1987；Chothia等人,Nature 342:878-883, 1989)；Chothia Kabat CDR的複合定義，其中CDR-H1為Chothia CDR及Kabat CDR之複合物；AbM定義，其由Oxford Molecular之抗體建模軟體使用；以及Martin等人之contact定義(bioinfo.org.uk/abs)(參見表1)。Kabat提供廣泛使用的編號慣例(Kabat編號)，在該編號慣例中將不同重鏈之間或不同輕鏈之間的對應殘基分配相同的編號。當藉由CDR之某一定義(例如，Kabat)將抗體表述為包含CDR時，該定義指定抗體中存在之CDR殘基(即，Kabat CDR)之最小數目。不排除亦存在屬於另一習知CDR定義但不屬於該指定定義的其他殘基。例如，包含由Kabat定義之CDR的抗體在其他可能性中包括CDR含有Kabat CDR殘基且無其他CDR殘基的抗體，以及CDR H1為複合Chothia-Kabat CDR H1且其他CDR含有Kabat CDR殘基且無基於其他定義的另外CDR殘基的抗體。
Figure 02_image001
*藉由Chothia之CDR-H1可結束於H32、H33或H34 (視環之長度而定)。此係因為Kabat編號方案於35A及35B處放置額外殘基之插入，然而Chothia編號將其放置於31A及31B處。若H35A或H35B (Kabat編號)均不存在，則Chothia CDR-H1環結束於H32處。若僅H35A存在，則其結束於H33處。若H35A及H35B均存在，則其結束於H34處。
術語「抗體」包括完整抗體及其結合片段。通常，片段與其來源的完整抗體競爭特異性結合包括單獨重鏈、輕鏈Fab、Fab'、F(ab')2 、F(ab)c、Dab、奈米抗體及Fv之靶標。片段可藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白之酶或化學分離來產生。術語「抗體」亦包括雙特異性抗體及/或人源化抗體。雙特異性或雙功能性抗體為具有兩個不同的重鏈/輕鏈對及兩個不同的結合位點之人工雜交抗體(參見例如，Songsivilai及Lachmann,Clin. Exp. Immunol ., 79:315-321 (1990)；Kostelny等人,J. Immunol ., 148:1547-53 (1992))。在一些雙特異性抗體中，兩個不同的重鏈/輕鏈對包括人源化3D6重鏈/輕鏈對及特異於tau上不同於3D6所結合的抗原決定位的重鏈/輕鏈對。
在一些雙特異性抗體中，一個重鏈/輕鏈對為如以下所進一步揭露之人源化3D6抗體，且另一重鏈/輕鏈對來自於結合血腦障壁上所表現之受體的抗體，該受體諸如胰島素受體、類胰島素生長因子(IGF)受體、瘦素受體或脂蛋白受體或運鐵蛋白受體(Friden等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4771-4775, 1991；Friden等人,Science 259:373-377, 1993)。此一雙特異性抗體可藉由受體介導之胞吞轉送來轉移跨過血腦障壁。雙特異性抗體之腦攝取可進一步藉由將雙特異性抗體工程改造以減小其對血腦障壁受體之親和力來增強。受體之親和力減小導致腦部中之分佈更寬(參見例如，Atwal等人,Sci. Trans. Med . 3, 84ra43, 2011；Yu等人,Sci. Trans. Med . 3, 84ra44, 2011)。
示範性雙特異性抗體亦可為：(1)雙重可變域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈及重鏈含有透過短肽鍵聯串連的兩個可變域(Wu等人, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；(2) Tandab，其為兩個單鏈雙功能抗體之融合，得到具有針對靶標抗原中每一者的兩個結合位點的四價雙特異性抗體；(3)柔性體(flexibody)，其為scFv與雙功能抗體之組合，得到多價分子；(4)所謂的「對接及鎖定(dock and lock)」分子，基於蛋白激酶A中之「二聚合及對接域」，當施加至Fab時，其可得到由連接至不同Fab片段之兩個相同的Fab片段組成的三價雙特異性結合蛋白；或(5)所謂的蠍(Scorpion)分子，其包含例如與人類Fc區之兩個末端融合之兩個scFv。可用於製備雙特異性抗體之平台之實例包括BiTE (Micromet)、DART (MacroGenics)、Fcab及Mab2 (F-star), Fc工程改造之IgGl (Xencor)或DuoBody (基於Fab臂交換，Genmab)。
術語「抗原決定位」係指抗原上與抗體結合的位點。抗原決定位可由連續胺基酸或藉由一或多種蛋白之三級折疊並列的非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定位(亦稱為線性抗原決定位)通常在暴露於變性溶劑時保留，然而由三級折疊形成之抗原決定位(亦稱為構形抗原決定位)通常在用變性溶劑處理時喪失。抗原決定位通常包括呈獨特空間構形之至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。確定抗原決定位之空間構形的方法包括例如X射線結晶學及二維核磁共振。參見例如，Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biology, 第66卷, Glenn E. Morris編(1996)。
識別相同或重疊抗原決定位的抗體可以簡單的免疫檢定鑑別，該免疫檢定顯示一種抗體與另一抗體競爭結合靶抗原的能力。抗體之抗原決定位亦可藉由結合其抗原的抗體之X射線結晶學來定義以鑑別接觸殘基。替代地，若抗原中減少或消除一種抗體之結合的所有胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩種抗體具有相同的抗原決定位。若減少或消除一種抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩種抗體具有重疊的抗原決定位。
抗體之間的競爭藉由受測試抗體抑制參考抗體對共同抗原的特異性結合之檢定來確定(參見例如，Junghans等人,Cancer Res . 50:1495, 1990)。若如競爭性結合檢定中所量測，過量的測試抗體(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制參考抗體之結合至少50%，則測試抗體與參考抗體競爭。一些測試抗體抑制參考抗體之結合至少75%、90%或99%。藉由競爭分析(競爭抗體)所鑑別之抗體包括結合與參考抗體相同抗原決定位之抗體以及結合與參考抗體結合的抗原決定位充分接近以產生位阻的相鄰抗原決定位的抗體。
術語「醫藥學上可接受」意謂載劑、稀釋劑、賦形劑或輔助劑可與調配物之其他成分相容且對其接受者實質上無害。
術語「患者」包括接受預防或治療性治療之人及其他哺乳動物個體。
若個體具有至少一種已知的風險因素(例如，遺傳、生物化學、家族病史及情境暴露)，從而與不具有該風險因素之個體相比，將具有該風險因素之個體置於統計學上顯著更大的發展疾病之風險，則個體處於增加的疾病風險。
術語「生物樣本」係指在例如人類或哺乳動物個體之生物來源內或可自其獲得的生物材料之樣本。此類樣本可為器官、胞器、組織、組織切片、體液、周邊血液、血漿、血清、細胞、諸如蛋白及肽之分子及自其來源的任何部分或組合。術語生物樣本亦可涵蓋藉由處理該樣本所來源的任何材料。所來源之材料可包括細胞或其子代。生物樣本之處理可涉及過濾、蒸餾、萃取、濃縮、固定、干擾組分之去活化及其類似操作中之一或多者。
術語「對照樣本」係指未已知或懷疑包括tau相關疾病影響區域的生物樣本，或至少未已知或懷疑包括給定類型的患病區域的生物樣本。對照樣本可自未患有tau相關疾病的個體獲得。替代地，對照樣本可自患有tau相關疾病的患者獲得。此類樣本可與認為包含tau相關疾病之生物樣本同時或在不同時刻獲得。生物樣本及對照樣本均可自同一組織獲得。較佳的是，對照樣本基本上或完全由正常的健康區域組成，且可用於與認為包含tau相關疾病影響之區域的生物樣本的比較。較佳的是，對照樣本中之組織與生物樣本中之組織為相同類型。較佳的是，認為在生物樣本中的tau相關疾病影響之細胞來自與對照樣本中的細胞型相同的細胞型(例如，神經元或神經膠)。
術語「疾病」係指損害生理功能之任何異常病狀。該術語廣泛用於涵蓋生理功能受損的任何病症、病痛、異常、病理、不適、病狀或症候群，不論病因的性質如何。
術語「症狀」係指如個體所感知的疾病之主觀證據，諸如步態改變。「徵象」係指如醫師所觀察之疾病之客觀證據。
術語「對治療的陽性反應」係指相對於未接受治療的對照群體中的平均反應，個體患者中的更有利的反應或患者群體中的平均反應。
出於將胺基酸取代分類為保守或非保守之目的，將胺基酸如下分組：第I組(疏水性側鏈)：met、ala、val、leu、ile；第II組(中性親水性側鏈)：cys、ser、thr；第III組(酸性側鏈)：asp、glu；第IV組(鹼性側鏈)：asn、gln、his、lys、arg；第V組(影響鏈取向之殘基)：gly、pro；以及第VI組(芳族側鏈)：trp、tyr、phe。保守取代涉及相同類的胺基酸之間的取代。非保守取代包括將該些類別中一者之成員交換為另一類別之成員。
用藉由Kabat編號慣例最大程度比對之抗體序列確定序列一致性百分比。在比對之後，若將個體抗體區(例如，重鏈或輕鏈之整個成熟可變區)與參考抗體之相同區進行比較，則在個體抗體區與參考抗體區之間的序列百分比一致性為個體及參考抗體區兩者中相同胺基酸所佔據之位置數目除以兩個區之比對位置之總數目(不計入空位)乘以100以轉換成百分比。
「包含」或「包括」一或多種所述要素之組成物或方法可包括未特定描述的其他要素。例如，「包含」或「包括」抗體之組成物可含有單獨的或與其他成分組合的抗體。當本揭露係關於包含指定要素之特徵時，本揭露應替代理解為係指基本上由指定元素組成或由指定元素組成的特徵。
值之範圍的指定包括該範圍內或定義該範圍的所有整數，及由該範圍內的整數所定義的所有子範圍。
除非從上下文中另外顯而易見，否則術語「約」涵蓋非實質性變型，諸如所述值之量測誤差之標準限度內(例如，SEM)之值。
統計顯著性意謂p≤0.05。
除非上下文另外清楚指定，否則冠詞「一個」、「一種」及「該」之單數形式包括複數個參考。例如，術語「化合物」或「至少一種化合物」可包括複數種化合物，包括其混合物。I. 概要
本發明提供結合tau之抗體。一些抗體特異性結合人類tau之微管結合區(MTBR)區域內由SEQ ID NO:1之約殘基244至372定義的一個或多個抗原決定位。因為MTBR區域含有序列重複，所以單一抗體可在此區域內的多個重複位點結合。一些抗體特異性結合KXXSXXNX (K/H)H (SEQ ID NO:191)之抗原決定位。一些抗體在SEQ ID NO:3之殘基199-213及/或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271或320-334)內結合。一些抗體在SEQ ID NO:1之殘基259-268及/或290-299及/或321-330及/或353-362內結合。在一些抗體中，在殘基353-362處與MTBR 4區之結合弱於與MTBR 1、MTBR 2及MTBR 3之結合。一些抗體結合tau，不管是否為磷酸化狀態。本發明之一些抗體用於抑制或延遲與tau相關聯的病理及相關聯的症狀惡化。儘管本發明之實踐不要求理解機制，但是可由於以下而發生毒性降低：抗體誘導tau之吞噬；抑制tau的分子間或分子內聚集或與其他分子的結合；藉由穩定非毒性構形；藉由抑制致病性tau形式之細胞間或細胞內傳播；藉由阻斷tau磷酸化；藉由防止tau與細胞結合；或藉由誘導tau之蛋白酶切割等機制。本發明之抗體或誘導此類抗體的劑可用於治療阿茲海默氏病及與tau相關聯的其他疾病或實現該等疾病之預防的方法。II. 靶分子
除非從上下文中另外顯而易見，否則對tau的提及意謂tau之天然人類形式，包括所有同功型，不管是否存在轉譯後修飾(例如，磷酸化、附醣化或乙醯化)。在人類腦部中存在六種主要的tau同功型(剪接變異體)。這些變異體中最長的具有441個胺基酸，其起始met殘基經切割。殘基係根據441同功型進行編號。因此，例如，對位置404處的磷酸化的提及意謂441同功型之位置404或者當與441同功型最大程度比對時任何其他同功型之對應位置。以下指示同功型之胺基酸序列及Swiss-Prot編號。
Figure 02_image003
Figure 02_image005
對tau的提及包括已知的自然型式(其中約30種列出於Swiss-Prot資料庫及其排列中)以及與tau病理相關聯的突變，該等病理諸如失智、匹克病、核上神經麻痺症等(參見例如，Swiss-Prot database及Poorkaj等人, Ann Neurol. 43:815-825 (1998))。藉由441同功型編號之tau突變的一些實例為：在胺基酸殘基257處的離胺酸至蘇胺酸突變(K257T)；在胺基酸位置260處的異白胺酸至纈胺酸突變(I260V)；在胺基酸位置272處的甘胺酸至纈胺酸突變(G272V)；在胺基酸位置279處的天冬醯胺至離胺酸突變(N279K)；在胺基酸位置296處的天冬醯胺至組胺酸突變(N296H)；在胺基酸位置301處的脯胺酸至絲胺酸突變(P301S)；在胺基酸301處的脯胺酸至白胺酸突變(P301L)；在胺基酸位置303處的甘胺酸至纈胺酸突變(G303V)；在位置305處的絲胺酸至天冬醯胺突變(S305N)；在胺基酸位置335處的甘胺酸至絲胺酸突變(G335S)；在位置337處的纈胺酸至甲硫胺酸突變(V337M)；在位置342處的麩胺酸至纈胺酸突變(E342V)；在胺基酸位置369處的離胺酸至異白胺酸突變(K3691)；在胺基酸位置389處的甘胺酸至精胺酸突變(G389R)；以及在胺基酸位置406處的精胺酸至色胺酸突變(R406W)。
tau可以在一或多個胺基酸殘基處經磷酸化，該等胺基酸殘基包括：在胺基酸位置18、29、97、310及394處的酪胺酸；在胺基酸位置184、185、198、199、202、208、214、235、237、238、262、293、324、356、396、400、404、409、412、413及422處的絲胺酸；以及在胺基酸位置175、181、205、212、217、231及403處的蘇胺酸。除非從上下文另外顯而易見，否則對tau或其片段的提及包括天然人類胺基酸序列，包括其同功型、突變體及對偶基因變異體。III. 抗體 A. 結合特異性及功能特性
本發明提供結合tau之抗體。一些抗體特異性結合KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)內之抗原決定位。一些抗體結合包含441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之胺基酸殘基259-268、基本上由其組成或由其組成之肽。一些抗體結合包含441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之胺基酸殘基290-299、基本上由其組成或由其組成之肽。一些抗體結合包含441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之胺基酸殘基321-330、基本上由其組成或由其組成之肽。一些抗體結合包含441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之胺基酸殘基353-362、基本上由其組成或由其組成之肽。一些抗體結合兩種、三種或全部四種這些肽。一些抗體特異性結合383個胺基酸的4R0N人類tau蛋白(SEQ ID NO:3)之殘基199-213 (對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271)內的抗原決定位。一些抗體特異性結合383個胺基酸的4RON人類tau蛋白(SEQ ID NO:3)之殘基262-276 (對應於SEQ ID NO:1之殘基320-334)內的抗原決定位。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之殘基257-271組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:1)之殘基320-334組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白SEQ ID NO:1之殘基259-268 (即，KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188))組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白SEQ ID NO:1之殘基290-299 (即，KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192))組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白(SEQ ID NO:193)之殘基321-330 (即，KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193))組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由441個胺基酸的tau蛋白SEQ ID NO:1之殘基353-362 (即，KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194))組成之肽。本發明之一些抗體特異性結合由共通模體KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)組成之肽。一些抗體結合包含441個胺基酸的tau蛋白SEQ ID NO:1之殘基259、262、265、267、268；殘基290、293、296、298、299；殘基321、324、327、329、330；或殘基353、356、359、362之抗原決定位。一些抗體結合tau，不管是否為磷酸化狀態。一些抗體結合不包括經受磷酸化的殘基的抗原決定位。這些抗體可藉由用自天然來源純化或重組表現之tau多肽進行免疫來獲得。可針對結合以非磷酸化形式以及一或多個易於磷酸化之殘基經磷酸化之形式的tau對抗體進行篩選。與非磷酸化之tau相比，此類抗體較佳以不可區分的親和力或至少在1.5倍、2倍或3倍的係數內結合磷酸化tau (即，具有「泛特異性」)。3D6為泛特異性單株抗體之實例。本發明亦提供結合與前述抗體中任一者相同的抗原決定位(例如，3D6之抗原決定位)的抗體。亦包括與前述抗體中任一者競爭結合tau (例如，與3D6競爭)的抗體。
上文提及之抗體可藉由用包括SEQ ID NO:3之殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271或320-334)、基本上由其組成或由其組成的肽進行免疫，或藉由用包括SEQ ID NO:1之殘基259-268、290-299、321-330或353-362、基本上由其組成或由其組成的肽進行免疫，或藉由用全長tau多肽或其包含此類殘基之片段進行免疫，並針對特異性結合包括此類殘基的肽進行篩選來重新生成。此類肽較佳連接至有助於引發對肽的抗體反應的異源綴合物分子。瞭解可為直接的或經由間隔肽或胺基酸進行。使用半胱胺酸作為間隔胺基酸，因為其游離SH基團有助於載劑分子之連接。亦可使用在甘胺酸與肽之間具有或不具有半胱胺酸殘基的聚甘胺酸連接子(例如，2-6個甘胺酸)。載體分子用於提供T細胞抗原決定位，其有助於引發針對肽的抗體反應。通常使用若干載劑，特別是鎖眼帽血藍蛋白(KLH)、卵白蛋白及牛血清白蛋白(BSA)。肽間隔物可作為固相肽合成之一部分添加至肽免疫原中。載劑通常藉由化學交聯來添加。可使用之化學交聯劑之一些實例包括交聯-N-馬來醯亞胺基-6-胺基己醯基酯或間馬來醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)(參見例如，Harlow, E等人, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988；Sinigaglia等人, Nature, 336:778-780 (1988)；Chicz等人, J. Exp. Med., 178:27-47 (1993)；Hammer等人, Cell 74:197-203 (1993)；Falk K.等人, Immunogenetics, 39:230-242 (1994)；WO 98/23635；以及Southwood等人, J. Immunology, 160:3363-3373 (1998))。若存在，則載劑及間隔物可連接至免疫原之任一端。
具有視情況選用之間隔物及載劑之肽可用於使實驗室動物或B細胞免疫，如下文所更詳細描述。可針對結合一或多種肽及/或tau之磷酸化及非磷酸化形式(諸如像，具有以磷酸化形式之位置404的tau之全長同功型)之能力對融合瘤上清液進行測試，該一或多種肽包括SEQ ID NO:3之殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271或320-334)、基本上由其組成或由其組成或者包括SEQ ID NO:1之殘基259-268、290-299、321-330或353-362、基本上由其組成或由其組成。可將肽連接至載劑或其他標籤以有助於篩選檢定。在此情況下，載劑或標籤優先不同於用於免疫的間隔物及載劑分子之組合，以消除對間隔物或載劑而不是tau肽具有特異性的抗體。可使用任何tau同功型。
本發明提供結合tau內之抗原決定位的單株抗體。指定為3D6的抗體為一種此類示範性小鼠抗體。除非從上下文中另外顯而易見，否則對3D6的提及應理解為指代此抗體之小鼠形式、嵌合形式、鑲飾形式及人源化形式中任一者。抗體已以[寄存號]經寄存。此抗體特異性結合KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)之抗原決定位。此抗體在383個胺基酸的4R0N人類tau蛋白(SEQ ID NO:3)之胺基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271及/或320-334)內特異性結合。此抗體在SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362及其任何兩者、三者或全部四者之組合內特異性結合。此抗體之特徵進一步在於其結合磷酸化及非磷酸化tau、tau之非病理及病理形式及構形以及tau之錯誤折疊/聚集形式的能力。指定為6A10的抗體為一種此類示範性小鼠抗體。除非從上下文中另外顯而易見，否則對6A10的提及應理解為指代此抗體之小鼠形式、嵌合形式、鑲飾形式及人源化形式中任一者。6A10之重鏈之Kabat/Chothia複合物CDR分別指定為SEQ ID NO:67、68及69，且6A10之輕鏈之Kabat CDR分別指定為SEQ ID NO:12、13及14。小鼠6A10分別與小鼠3D6之VH鏈及VL鏈有82.1%的VH序列一致性及100%的VL序列一致性。
本發明之一些抗體結合與指定3D6的抗體相同或重疊的抗原決定位。此抗體之重鏈及輕鏈成熟可變區之序列分別指定為SEQ ID NO:7及11。具有這種結合特異性的其他抗體可藉由以下方式產生：用tau或其包括所要抗原決定位、基本上由其組成或由其組成的部分(例如SEQ ID NO:3之199-213及/或262-276，分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271及/或320-334；或例如，SEQ ID NO:1之259-268或290-299或321-330或353-362，其兩者、三者或全部四者之任何組合)對小鼠進行免疫且針對視情況與具有小鼠3D6 (IgG1 κ)之可變區的抗體競爭結合tau來對所得抗體進行篩選。tau之包括所要抗原決定位之片段可連接至有助於引發對該片段的抗體反應的載劑及/或可與有助於引發此類反應的佐劑組合。可針對與指定殘基之突變體相比對tau或其片段的不同結合篩選此類抗體。針對此類突變體的篩選更精確地定義結合特異性，以允許鑑別結合受具體殘基的誘變的抑制並且可能共享其他所例示之抗體之功能特性的抗體。突變可為在整個靶標或已知抗原決定位駐留在其中的整個區段中用丙胺酸(或絲胺酸，若丙胺酸已經存在)進行系統性置換取代，一次一個殘基，或間隔更寬的間隔。若同一組突變顯著降低兩種抗體之結合，則這兩種抗體結合相同抗原決定位。
具有所選擇之鼠抗體(例如，3D6)之結合特異性的抗體亦可使用噬菌體顯示方法之變異體產生。參見Winter, WO 92/20791。此方法特別適用於產生人類抗體。在此方法中，使用所選擇之鼠抗體之重鏈或輕鏈可變區作為起始材料。若例如選擇輕鏈可變區作為起始材料，則構築噬菌體文庫，在該噬菌體文庫中成員顯示相同的輕鏈可變區(即，鼠起始材料)及不同的重鏈可變區。重鏈可變區可以例如由經重排之人類重鏈可變區的文庫獲得。選擇對於tau或其片段顯示出強特異性結合(例如，至少108 且較佳至少109 M-1 )的噬菌體。然後來自此噬菌體的重鏈可變區用作用於構築另一噬菌體文庫的起始材料。在此文庫中，各噬菌體顯示相同的重鏈可變區(即，自第一顯示文庫鑑別之區域)己不同的輕鏈可變區。輕鏈可變區可例如自經重排之人類可變輕鏈區的文庫獲得。再一次，選擇對於tau或其片段顯示出強特異性結合的噬菌體。所得抗體通常具有與鼠起始材料相同或相似的抗原決定位特異性。
3D6之重鏈之Kabat/Chothia複合物CDR分別指定為SEQ ID NO:8、9及10，且3D6之輕鏈之Kabat CDR分別指定為SEQ ID NO:12、13及14。
表2指示如藉由Kabat、Chothia、Chothia及Kabat之複合物(在本文亦稱為「Kabat/Chothia複合物」)、AbM及Contact所定義之3D6 CDR。
Figure 02_image007
其他抗體可藉由編碼示範性抗體(諸如，3D6)之重鏈及輕鏈之cDNA之誘變獲得。本發明亦包括與成熟重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列中之3D6具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性且維持其功能特性，及/或與各別抗體不同之處在於少量功能上不重要的胺基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的單株抗體。亦包括具有如藉由任何習知定義所定義之至少一個或全部六個CDR，但較佳為Kabat之單株抗體，其與3D6之對應CDR具有90%、95%、99%或100%一致性。
本發明亦提供具有完全或實質上來自3D6的一些或全部(例如，3、4、5及6個) CDR之抗體。此類抗體可包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區具有完全或實質上來自3D6之重鏈可變區的至少兩個且通常全部三個CDR，該輕鏈可變區具有完全或實質上來自3D6之輕鏈可變區的至少兩個且通常全部三個CDR。抗體可包括重鏈及輕鏈兩者。當含有不多於4、3、2或1個取代、插入或缺失時，CDR實質上來自對應的3D6 CDR，除了CDR-H2 (當藉由Kabat定義時)可具有不多於6、5、4、3、2或1個取代、插入或缺失。此類抗體可與成熟重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列中之3D6具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性且維持其功能特性，及/或與3D6不同之處在於少量功能上不重要的胺基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入。
藉由此類檢定鑑別之一些抗體可結合tau之單體、錯誤折疊、聚集、磷酸化或非磷酸化形式或其他形式。同樣，一些抗體對tau之非病理及病理形式及構形具有免疫反應性。 B. 非人類抗體
針對tau或其片段(例如，SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213或262-276，分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334；或SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362)的其他非人類抗體(例如，鼠、豚鼠、靈長類動物、兔或大鼠)之產生可藉由例如用tau或其片段對動物進行免疫來實現。參見Harlow及Lane,Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (出於所有目的以引用之方式併入)。這種免疫原可來自天然來源、藉由肽合成或藉由重組表現獲得。視情況，免疫原可與載劑蛋白融合或以其他方式複合來投與。視情況，免疫原可與佐劑一起投與。可如以下所述使用若干類型佐劑。對於實驗室動物之免疫，較佳為完全弗氏佐劑，繼之以不完全佐劑。兔或豚鼠通常用於製備多株抗體。小鼠通常用於製備單株抗體。針對與tau或tau內之抗原決定位(例如，包含SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334)中一或多者之抗原決定位；或包含SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362中一或多者之抗原決定位)之特異性結合對抗體進行篩選。此類篩選可藉由以下方式實現：確定抗體與tau變異體之集合的結合，諸如含有SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之基酸殘基257-271或320-334)之tau變異體或含有SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362之tau變異體或者這些殘基內的突變；且確定哪些tau變異體結合該抗體。可例如藉由西方墨點法、FACS或ELISA來評估結合。 C. 人源化抗體
人源化抗體為將非人類「供體」抗體之CDR植入至人類「受體」抗體序列中的基因工程改造抗體(參見例如，Queen, US 5,530,101及5,585,089；Winter, US 5,225,539；Carter, US 6,407,213；Adair, US 5,859,205；及Foote, US 6,881,557)。受體抗體序列可為例如成熟人類抗體序列、此類序列之複合物、人類抗體序列之共通序列或生殖細胞系區序列。因此，人源化抗體為具有全部或實質上來自供體抗體之至少三種、四種、五種或全部CDR以及全部或實質上來自人類抗體序列之可變區架構序列及恆定區(若存在)的抗體。類似地，人源化重鏈具有全部或實質上來自供體抗體重鏈的至少一種、兩種及通常全部三種CDR以及實質上來自人類重鏈可變區架構及恆定區序列的重鏈可變區架構序列及重鏈恆定區(若存在)。類似地，人源化輕鏈具有全部或實質上來自供體抗體輕鏈的至少一種、兩種及通常全部三種CDR以及實質上來自人類輕鏈可變區架構及恆定區序列的輕鏈可變區架構序列及輕鏈恆定區(若存在)。不同於奈米抗體及dAb，人源化抗體包含人源化重鏈及人源化輕鏈。當對應CDR之間至少85%、90%、95%或100%的對應殘基(如藉由任何習知定義所定義，但較佳藉由Kabat定義)相同時，人源化抗體中之CDR實質上來自非人抗體中的對應CDR。當至少85%、90%、95%或100%的藉由Kabat定義之對應殘基相同時，抗體鏈之可變區架構序列或抗體鏈之恆定區分別實質上來自人類可變區架構序列或人類恆定區。為了根據2014年世界衛生組織(WHO)國際非專利名稱(INN)對人源化抗體的定義經歸類為人源化的，抗體必須與人類生殖系抗體序列(即，在體體細胞超突變之前)具有至少85%一致性。混合抗體為一條抗體鏈(例如，重鏈)滿足臨限但另一條鏈(例如，輕鏈)不滿足臨限的抗體。若任一條鏈均不滿足臨限，則將抗體歸類為嵌合抗體，即使兩條鏈之可變架構區實質上為人類，具有一些鼠回復突變。參見Jones等人(2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs 8:1, 1-9, DOI:10.1080/19420862.2015.1114320。亦參見「WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (綜述)」 (網際網路) 2014。可從http://www. who.int/medicines/services/ inn/BioRev2014.pdf)獲得，其以引用之方式併入本文。為避免疑義，如本文所用之術語「人源化」不旨在限制人源化抗體之2014 WHO INN定義。本文所提供之一些人源化抗體與人類生殖系序列具有至少85%序列一致性，且本文所提供之一些人源化抗體與人類生殖系序列具有小於85%序列一致性。本文所提供之人源化抗體之一些重鏈與人類生殖系序列具有約60%至100%序列一致性，例如像，在約60%至69%、70%至79%、80%至84%或85%至89%的範圍內。一些重鏈不滿足2014 WHO INN定義且與人類生殖系序列具有例如約64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%或82%、83%或84%序列一致性，而其他重鏈滿足2014 WHO INN定義且與人類生殖系序列具有約85%、86%、87%、88%、89%或更高序列一致性。本文所提供之人源化抗體之一些輕鏈與人類生殖系序列具有約60%至100%序列一致性，例如像，在約80%至84%或85%至89%的範圍內。一些輕鏈不滿足2014 WHO INN定義且與人類生殖系序列具有例如約81%、82%、83%或84%序列一致性，而其他輕鏈滿足2014 WHO INN定義且與人類生殖系序列具有約85%、86%、87%、88%、89%或更高序列一致性。根據2014 WHO INN定義為「嵌合」的本文所提供之一些人源化抗體具有與人類生殖系序列具有小於85%一致性的重鏈，該等重鏈和與人類生殖系序列具有小於85%一致性的輕鏈配對。根據2014 WHO INN定義為「混合」的本文所提供之一些人源化抗體，例如具有與人類生殖系序列具有至少85%序列一致性的重鏈，該重鏈和與人類生殖系序列具有小於85%序列一致性的輕鏈配對，或反之亦然。本文所提供之一些人源化抗體滿足「人源化」之2014 WHO INN定義且具有與人類生殖系序列具有至少85%序列一致性的重鏈，該重鏈和與人類生殖系序列具有至少85%序列一致性的輕鏈配對。本發明之另外人源化抗體滿足「混合」之2014 WHO INN定義。
儘管人源化抗體經常併入來自小鼠抗體之全部六個CDR (由任何習知定義所定義，但較佳如藉由Kabat所定義)，但它們亦可用少於來自小鼠抗體之所有CDR (例如，至少3個、4個或5個CDR)製備(例如，Pascalis等人,J. Immunol . 169:3076, 2002；Vajdos等人,J. of Mol. Biol ., 320: 415-428, 2002；Iwahashi等人,Mol. Immunol . 36:1079-1091, 1999；Tamura等人,J. Immunol ., 164:1432-1441, 2000)。
在一些抗體中，僅部分CDR，即結合所需的CDR殘基之子集，稱為SDR，需要保留在人源化抗體中之結合。可基於先前的研究(例如，通常不需要CDR H2中之殘基H60-H65)從位於Chothia高變環外的Kabat CDR之區(Chothia,J. Mol. Biol . 196:901, 1987)，藉由分子建模及/或憑經驗，或Gonzales等人,Mol. Immunol . 41: 863, 2004中所述鑑別不接觸抗原且不在SDR中的CDR殘基。在不存在一或多個供體CDR殘基或省略全部供體CDR的位置處的此類人源化抗體中，佔據該位置的胺基酸可為佔據受體抗體序列中對應位置(藉由Kabat編號)的胺基酸。CDR中將包括的受體對供體胺基酸的此類取代的數量反映了競爭考慮的平衡。此類取代可能有利於減少人源化抗體中小鼠胺基酸之數量，並且因此降低潛在的免疫原性及/或滿足「人源化」之WHO INN定義。然而，取代亦可引起親和力改變，且較佳避免親和力之顯減小。亦可憑經驗選擇待取代的CDR及胺基酸內取代的位置。
人類受體抗體序列可視情況選自許多已知人類抗體序列以提供在人類受體序列可變區架構與供體抗體鏈之對應可變區架構之間的高序列一致性(例如，65-85%一致性)。
一些人源化抗體及嵌合抗體具有相同的(在實驗誤差範圍內)或改善的功能特性，例如，對人類tau之結合親和力、tau內化至神經元中之抑制，如在實例中呈它們所來源的鼠抗體所述。例如，一些人源化抗體及嵌合抗體之結合親和力在它們所來源的鼠抗體之3、2或1倍內或者親和力在實驗誤差範圍內不可區分。一些人源化抗體及嵌合抗體如實例中所述抑制tau內化至神經元中在它們所來源的鼠抗體之3、2或1倍內或者在實驗誤差範圍內抑制與它們所來源的小鼠抗體相同。相對於先前所述之3D6抗體之人源化型式(參見WO 2017/191560)，一些人源化抗體表現出免疫原性降低、親和力增加、熱穩定性增加及/或表現改善。hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4顯示出優於親代hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2的親和力改善，如藉由締合速率、解離速率及Kd數所證明。hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4顯示出優於親代hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2的較高熱穩定性及效價。
重鏈之受體序列之實例為具有PDB登錄代碼2RCS-VH_huFrwk (SEQ ID NO:75)的人源化48G7 Fab之人類成熟重鏈可變區。3D6及48G7 Fab之可變域之CDR-H1、H2環亦共有相同的長度。重鏈之受體序列之實例為具有IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)的人類成熟重鏈可變區。IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)共享小鼠3D6重鏈CDR-H1及H2之正則形式。IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)屬於人類重鏈第1亞組。輕鏈之受體序列之實例為具有PDB登錄代碼人類抗體ARX71335 VL (SEQ ID NO:82)的人類成熟輕鏈可變區。3D6及ARX71335抗體之可變輕域之CDR-L1、L2及L3環亦共有相同的長度。輕鏈之受體序列之實例為具有IMGT#IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)的人類成熟輕鏈可變區。IMGT# IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3具有與小鼠3D6相同的正則類別。IMGT#IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)屬於人類κ第2亞組。
若選擇多於一個人類受體抗體序列，則可使用那些受體之複合物或雜交物，且在人源化輕鏈及重鏈可變區中不同位置所使用之胺基酸可取自所使用之任何人類受體抗體序列。例如，將具有IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)及PDB登錄代碼# 2RCS-VH_huFrwk (SEQ ID NO:75)之人類成熟重鏈可變區用作3D6成熟重鏈可變區之人源化的受體序列。該兩種受體不同的位置之實例為位置H17 (T或S)。3D6重鏈可變區之人源化型式可包括在此位置處的任一胺基酸。例如，將人類成熟輕鏈可變區IMGT# IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)及PDB代碼# ARX71335-VL_huFrwk (SEQ ID NO:82)用作3D6成熟輕鏈可變區之人源化的受體序列。該兩種受體不同的位置之實例為位置L100 (Q或A)。3D6輕鏈可變區之人源化型式可包括在此位置處的任一胺基酸。
可以基於它們對CDR構形及/或與抗原之結合的可能影響來選擇來自人類可變區架構殘基的某些胺基酸以供取代。對此類可能影響的研究係藉由建模、檢查具體位置處的胺基酸之特徵或憑經驗觀察具體胺基酸之取代或誘變的作用來實現。
例如，當鼠可變區架構殘基與所選擇之人類可變區架構殘基之間的胺基酸不同時，當合理地預期胺基酸有以下特徵時人類架構胺基酸可由來自小鼠抗體之等效架構胺基酸取代： (1)  直接非共價地結合抗原； (2)  與CDR區相鄰或在由Chothia但不為Kabat所定義之CDR內； (3)  以其他方式與CDR區相互作用(例如，在約6 Å CDR區內)，(例如，藉由在同源的已知免疫球蛋白鏈之解析結構上建模輕鏈或重鏈來鑑別)；或 (4)  為參與VL-VH界面之殘基。
在一個實施例中，使用兩階段PCR方案生成人源化序列，該方案允許使用QuikChange定點誘變引入多個突變、缺失及插入[Wang, W.和Malcolm, B.A.(1999) BioTechniques 26:680-682)]。
來自如Queen, US 5,530,101所定義之類別(1)至(3)之架構殘基有時可替代地稱為正則及遊標(vernier)殘基。有助於定義CDR環之構形的架構殘基有時被稱為正則殘基(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)；Thornton及Martin,J. Mol. Biol . 263:800-815 (1996))。支持抗原結合環構形並在微調抗體與抗原的配合中發揮作用的架構殘基有時被稱為遊標殘基(Foote及Winter,J. Mol. Biol 224:487-499 (1992))。
作為取代候選的其他架構殘基為產生潛在醣化位點的殘基。其他取代候選為在該位置對於人類免疫球蛋白而言不常見的受體人類架構胺基酸。此等胺基酸可經來自小鼠供體抗體之等效位置或更典型人類免疫球蛋白之等效位置之胺基酸取代。
作為取代候選的其他架構殘基為N末端麩醯胺殘基(Q)，其可置換為麩胺酸(E)以最小化焦麩胺酸轉化的可能性[Y. Diana Liu等人, 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217]。麩胺酸(E)向焦麩胺酸(pE)的轉化比從麩醯胺(Q)發生更慢。因為麩醯胺向pE轉化中一級胺的損失，抗體變得具有更大酸性。不完全轉化產生抗體之異質性，這可使用基於電荷的分析方法呈多個峰觀察到。異質性差異可指示缺乏過程控制。
示範性人源化抗體為小鼠3D6之人源化形式，指定為Hu3D6。
小鼠抗體3D6包含成熟重鏈及輕鏈可變區，其分別具有包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11之胺基酸序列。本發明提供鼠3D6抗體之人源化型式，其包括10個例示之人源化重鏈成熟可變區(hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76)、hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77)、hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78)、hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79)、hu3D6VHvb5 (SEQ ID NO:80)、hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHv1bA11 D60E (h3D6VHvb8, SEQ ID NO:146)、hu3D6VHv1bA11 L82cV (SEQ ID NO:147)及hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9, SEQ ID NO:148))以及56個例示之人源化輕鏈成熟可變區(hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83)、hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84)、hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2 L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2 L54N (SEQ ID NO:95)、hu3D6VLv2 L54E (SEQ ID NO:96)、hu3D6VLv2 L50E (SEQ ID NO:97)、hu3D6VLv2 L54Q (SEQ ID NO:98)、hu3D6VLv2  L50D (SEQ ID NO:99)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、hu3D6VLv2 I48G (SEQ ID NO:104)、hu3D6VLv2 I48D (SEQ ID NO:105)、hu3D6VLv2 L47G (SEQ ID NO:106)、hu3D6VLv2 Y49E (SEQ ID NO:107)、hu3D6VLv2 L54V (SEQ ID NO:108)、hu3D6VLv2 L54S (SEQ ID NO:109)、hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L47N (SEQ ID NO:111)、hu3D6VLv2 L47D (SEQ ID NO:112)、hu3D6VLv2 L47E (SEQ ID NO:113)、hu3D6VLv2 L47P (SEQ ID NO:114)、hu3D6VLv2 L47T (SEQ ID NO:115)、hu3D6VLv2 L47S (SEQ ID NO:116)、hu3D6VLv2 L47A (SEQ ID NO:117)、hu3D6VLv2 L50V (SEQ ID NO:118)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G (SEQ ID NO:134)、hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R (SEQ ID NO:135)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)及hu3D6VLv2 G100Q (SEQ ID NO:144))。
圖2及圖3分別顯示鼠3D6及各種人源化抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的比對。圖9A及圖9B顯示鼠3D6之重鏈可變區與各種人源化抗體之重鏈可變區的比對。圖10A、圖10B、圖10C及圖10D顯示輕鏈可變區hu3D6VLv2與各種人源化抗體之輕鏈可變區的比對。
出於諸多原因，諸如對CDR構形及/或結合抗原的影響、介導重鏈與輕鏈之間的相互作用、與恆定區相互作用、作為轉譯後修飾所要或非所要的位點、作為人類可變區序列中其位置之不常見殘基且因此潛在地具有免疫原性、產生聚集潛能及其他原因，以下35個可變區構架位置考慮為56個例示之人類成熟輕鏈可變區及10個例示之人類成熟重鏈可變區之候選，如實例中進一步指定：L7 (T7S)、L10 (T10S)、L15 (I15L)、L17 (Q17E)、L37 (L37Q)、L45 (K45R)、L47 (L47G、L47N、L47D、L47E、L47P、L47T、L47S或L47A)、L48 (I48G或I48D)、L49 (Y49E)、L83 (L83V)、L86 (H86Y)、L100 (A100Q)、L106 (L106I)、H1 (Q1E)、H5 (Q5V)、H11 (L11V)、H17 (S17T)、H20 (L20I)、H23 (T23K)、H38 (K38R)、H42 (E42G)、H43 (Q43K)、H66 (K66R)、H67 (A67V)、H75 (S75T)、H76 (N76D)、H80 (L80M)、H81 (Q81E)、H82c (L82cV)、H83 (T83R)、H91 (Y91F)、H93 (A93S)、H94 (S94T)、H108 (T108L)及H109 (L109V)。以下9個可變區CDR位置考慮為56個例示之人類成熟輕鏈可變區及10個例示之人類成熟重鏈可變區之取代候選，如實例中進一步指定：L24 (K24R)、L50 (L50E、L50D、L50G或L50V)、L52 (S52G)、L54 (L54D、L54G、L54N、L54E、L54Q、L54K、L54R、L54T、L54V或L54S)、H28 (N28T)、H54 (N54D)、H56 (D56E)、H58 (V58I)及H60 (D60E)。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:149之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat-Chothia複合物CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat-Chothia複合物CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat-Chothia複合物CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列，且Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-L1具有包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-L2包含選自由SEQ ID NO:150-175組成之群的胺基酸序列。
此處，與其他地方一樣，首先提及之殘基為藉由將Kabat CDR或複合物Chothia-Kabat CDR (在CDR-H1之情況下)接枝至人類受體架構中所形成之人源化抗體之殘基，且其次提及之殘基為考慮置換這一殘基的殘基。因此，在可變區架構內，首先提及之殘基為人類，且在CDR內，首先提及之殘基為小鼠。
例示之抗體包括例示之以下成熟重鏈及輕鏈可變區之任何排列或組合：VHvb1/VLvb1、VHvb1/VLvb2、VHvb1/VLvb3、VHvb2/VLvb1、VHvb2/VLvb2、VHvb2/VLvb3、VHvb3/VLvb1、VHvb3/VLvb2、VHvb3/VLvb3、VHvb4/VLvb1、VHvb4/VLvb2、VHvb4/VLvb3、VHvb5/VLvb1、VHvb5/VLvb2、VHvb5/VLvb3、VHvb6/VLvb1、VHvb6/VLvb2、VHvb6/VLvb3、VHvb7/VLvb1、VHvb7/VLvb2、VHvb7/VLvb3。例示之抗體包括例示之成熟重鏈可變區hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76)、hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77)、hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78)、hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79)、hu3D6Hvb5 (SEQ ID NO:80)、hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHv1bA11 D60E (h3D6VHvb8、SEQ ID NO:146)、hu3D6VHv1bA11 L82cV (SEQ ID NO:147)及hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9、SEQ ID NO:148)與人源化3D6VL輕鏈可變區hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83)、hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84)、hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2  L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2  L54N (SEQ ID NO:95)、hu3D6VLv2 L54E (SEQ ID NO:96)、hu3D6VLv2 L50E (SEQ ID NO:97)、hu3D6VLv2  L54Q (SEQ ID NO:98)、hu3D6VLv2  L50D (SEQ ID NO:99)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、hu3D6VLv2 I48G (SEQ ID NO:104)、hu3D6VLv2 I48D (SEQ ID NO:105)、hu3D6VLv2 L47G (SEQ ID NO:106)、hu3D6VLv2 Y49E (SEQ ID NO:107)、hu3D6VLv2 L54V (SEQ ID NO:108)、hu3D6VLv2 L54S (SEQ ID NO:109)、hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L47N (SEQ ID NO:111)、hu3D6VLv2  L47D (SEQ ID NO:112)、hu3D6VLv2 L47E (SEQ ID NO:113)、hu3D6VLv2 L47P (SEQ ID NO:114)、hu3D6VLv2 L47T (SEQ ID NO:115)、hu3D6VLv2 L47S (SEQ ID NO:116)、hu3D6VLv2 L47A (SEQ ID NO:117)、hu3D6VLv2 L50V (SEQ ID NO:118)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2  L37Q_L50E_L54G (SEQ ID NO:134)、hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R (SEQ ID NO:135)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)及hu3D6VLv2 G100Q (SEQ ID NO:144)中任一者之任何排列或組合。
例示之抗體包括例示之成熟重鏈可變區hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76)、hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77)、hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78)、hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79)、hu3D6Hvb5 (SEQ ID NO:80)、hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHv1bA11 D60E (h3D6VHvb8、SEQ ID NO:146)、hu3D6VHv1bA11 L82cV (SEQ ID NO:147)及hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9、SEQ ID NO:148)與人源化3D6VL輕鏈可變區hu3D6VLv1 (SEQ ID NO:20)、hu3D6VLv2 (SEQ ID NO:21)、hu3D6VLv3 (SEQ ID NO:22)及hu3D6VLv4 (SEQ ID NO:22)中任一者之任何排列或組合。例示之抗體包括例示之成熟輕鏈可變區hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83)、hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84)、hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2  L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2  L54N (SEQ ID NO:95)、hu3D6VLv2 L54E (SEQ ID NO:96)、hu3D6VLv2 L50E (SEQ ID NO:97)、hu3D6VLv2  L54Q (SEQ ID NO:98)、hu3D6VLv2  L50D (SEQ ID NO:99)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、hu3D6VLv2 I48G (SEQ ID NO:104)、hu3D6VLv2 I48D (SEQ ID NO:105)、hu3D6VLv2 L47G (SEQ ID NO:106)、hu3D6VLv2 Y49E (SEQ ID NO:107)、hu3D6VLv2 L54V (SEQ ID NO:108)、hu3D6VLv2 L54S (SEQ ID NO:109)、hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L47N (SEQ ID NO:111)、hu3D6VLv2  L47D (SEQ ID NO:112)、hu3D6VLv2 L47E (SEQ ID NO:113)、hu3D6VLv2 L47P (SEQ ID NO:114)、hu3D6VLv2 L47T (SEQ ID NO:115)、hu3D6VLv2 L47S (SEQ ID NO:116)、hu3D6VLv2 L47A (SEQ ID NO:117)、hu3D6VLv2 L50V (SEQ ID NO:118)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2  L37Q_L50E_L54G (SEQ ID NO:134)、hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R (SEQ ID NO:135)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)及hu3D6VLv2 G100Q (SEQ ID NO:144)與人源化3D6重鏈可變區hu3D6VHv1 (SEQ ID NO:15)、hu3D6VHv2 (SEQ ID NO:16)、hu3D6VHv1b (SEQ ID NO:17)、hu3D6VHv1bA11 (SEQ ID NO:18)、hu3D6VHv5 (SEQ ID NO:19)、hu3D6VHv1bA11B6G2 (SEQ ID NO:46)、hu3D6VHv1bA11B6H3 (SEQ ID NO:47)、 hu3D6VHv1c (SEQ ID NO:48)、hu3D6VHv1d (SEQ ID NO:49)、hu3D6VHv1e (SEQ ID NO:50)、hu3D6VHv1f (SEQ ID NO:51)、hu3D6VHv3 (SEQ ID NO:52)、hu3D6VHv3b (SEQ ID NO:53)、hu3D6VHv3c (SEQ ID NO:54)、hu3D6VHv4 (SEQ ID NO:55)、hu3D6VHv4b (SEQ ID NO:56)及hu3D6VHv4c (SEQ ID NO:57)中任一者之任何排列或組合。
本發明提供人源化重鏈可變區hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5，SEQ ID NO:18)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (L2-DIM4，SEQ ID NO:122)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5，SEQ ID NO:18)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (L2-DIM5，SEQ ID NO:123)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區h3D6VHvb8 (SEQ ID NO:146)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (L2-DIM4，SEQ ID NO:122)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5，SEQ ID NO:18)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (L2-DIM3，SEQ ID NO:121)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5，SEQ ID NO:18)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 S52G (L2-DIM9，SEQ ID NO:110)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區h3D6VHvb8 (SEQ ID NO:146)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L54G (L2-DIM7，SEQ ID NO:94)組合的抗體。本發明提供人源化重鏈可變區hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5，SEQ ID NO:18)與人源化輕鏈可變區hu3D6VLv2 L50G (L2-DIM22，SEQ ID NO:103)組合的抗體。
本發明提供例示之人源化重鏈可變區中任一者與人類重鏈恆定區組合的抗體。示範性人類重鏈恆定區提供為SEQ ID NO:176 (IgG1：同種異型G1m17,1)。例如，SEQ ID NO:178示出3D6人源化變異體之成熟重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之胺基酸序列。例如，SEQ ID NO:180示出在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之胺基酸序列。本發明提供例示之人源化輕鏈可變區中任一者與輕鏈恆定區組合的抗體。示範性輕鏈恆定區提供為SEQ ID NO:177 (κ)。例如，SEQ ID NO:179示出3D6人源化變異體之成熟輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之胺基酸序列。例如，SEQ ID NO:181示出在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之胺基酸序列。
本發明提供3D6人源化抗體之變異體，在該等變異體中人源化成熟重鏈可變區顯示與hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76)、hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77)、hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78)、hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79)、hu3D6Hvb5 (SEQ ID NO:80)、hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90)、 hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91)、hu3D6VHv1bA11 D60E (h3D6VHvb8，SEQ ID NO:146)、hu3D6VHv1bA11 L82cV (SEQ ID NO:147)或hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9，SEQ ID NO:148)具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，且人源化成熟輕鏈可變區顯示與hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83)、hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84)、hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2  L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2 L54N (SEQ ID NO:95)、hu3D6VLv2 L54E (SEQ ID NO:96)、hu3D6VLv2 L50E (SEQ ID NO:97)、hu3D6VLv2 L54Q (SEQ ID NO:98)、hu3D6VLv2 L50D (SEQ ID NO:99)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、hu3D6VLv2 I48G (SEQ ID NO:104)、hu3D6VLv2 I48D (SEQ ID NO:105)、hu3D6VLv2 L47G (SEQ ID NO:106)、hu3D6VLv2 Y49E (SEQ ID NO:107)、hu3D6VLv2 L54V (SEQ ID NO:108)、hu3D6VLv2 L54S (SEQ ID NO:109)、hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L47N (SEQ ID NO:111)、hu3D6VLv2  L47D (SEQ ID NO:112)、hu3D6VLv2 L47E (SEQ ID NO:113)、hu3D6VLv2 L47P (SEQ ID NO:114)、hu3D6VLv2 L47T (SEQ ID NO:115)、hu3D6VLv2 L47S (SEQ ID NO:116)、hu3D6VLv2 L47A (SEQ ID NO:117)、hu3D6VLv2 L50V (SEQ ID NO:118)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2  L37Q_L50E_L54G (SEQ ID NO:134)、hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R (SEQ ID NO:135)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)或hu3D6VLv2 G100Q (SEQ ID NO:144)具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一些此類抗體中，保留了SEQ ID NO:76-80、SEQ ID NO:90-91、SEQ ID NO:146-148、SEQ ID NO:83-85及SEQ ID NO:93-145中之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或全部44個回復突變或其他突變。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H93由S佔據，且H94由T佔據。在一些人源化3D6抗體中，位置H93及H94分別由S及T佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H91由F佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由E佔據，H5由V佔據，H11由V佔據，H20由I佔據，H23由K佔據，H38由R佔據，H42由G佔據，H43由K佔據，H66由R佔據，H75由T佔據，H76由D佔據，H81由E佔據，H108由L佔據，H109由V佔據。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H20、H23、H38、H42、H43、H66、H75、H76、H81、H108及H109分別由E、V、V、I、K、R、G、K、R、T、D、E、L及V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H17由T佔據，H80由M佔據，H83由R佔據。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H17、H80及H83分別由T、M及R佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H58由I佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H28由T佔據，H67由V佔據。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H28及H67分別由T及V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H54由D佔據，H56由E佔據。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H54及H56分別由D及E佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由Q或E佔據，H5由Q或V佔據，H11由L或V佔據，H17由S或T佔據，H20由L或I佔據，H23由T或K佔據，H28由N或T佔據，H38由K或R佔據，H42由E或G佔據，H43由Q或K佔據，H54由N或D佔據，H56由D或E佔據，H58由V或I佔據，H66由K或R佔據，H67由A或V佔據，H75由S或T佔據，H76由N或D佔據，H80由L或M佔據，H81由Q或E佔據，H83由T或R佔據，H91由F或Y佔據，H93由S佔據，H94由T佔據，H108由T或L佔據，H109由L或V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H91、H93及H94分別由F、S及T佔據，如在huVHvb1中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H20、H23、H38、H42、H43、H66、H75、H76、H81、H91、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、I、K、R、G、K、R、T、D、E、F、S、T、L及V佔據，如在huVHvb2中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H38、H42、H43、H58、H66、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T,I、K、R、G、K、I、R、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據，如在huVHvb3中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H58、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、I、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據，如在huVHvb4中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H58、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、I、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據，如在huVHvb5中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H91、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、R、V、T、D、M、E、R、F、S、T、L及V佔據，如在huVHvb6中。在一些人源化3D6抗體中，VH區中之位置H1、H5、H11、H17、H20、H23、H28、H38、H42、H43、H54、H56、H66、H67、H75、H76、H80、H81、H83、H93、H94、H108及H109分別由E、V、V、T、I、K、T、R、G、K、D、E、R、V、T、D、M、E、R、S、T、L及V佔據，如在huVHvb7中。
在一些人源化3D6抗體中，位置H60由E佔據，如在hu3D6VHv1bA11 D60E (h3D6VHvb8)中。在一些人源化3D6抗體中，位置H82C由V佔據，如在hu3D6VHv1bA11 L82cV中。在一些人源化3D6抗體中，位置H60、H80、H81、H82c及H83由E、M、E、V及R佔據，如在hu3D6VHv1bA11 D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R (h3D6VHvb9)中。
上文所提及之抗體中任一者之重鏈可變區可經修飾以進一步降低免疫原性。例如，在一些人源化抗體中，位置H80由M佔據及/或位置H82c由V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VL區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L7由S佔據，L10由S佔據，L15由L佔據，L83由V佔據，L86由Y佔據，且L106由I佔據。在一些人源化3D6抗體中，位置L7、L10、L15、L83、L86及L106分別由S、S、L、V、Y及Y佔據。
在一些人源化3D6抗體中，VL區中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L7為T或S，L10為T或S，L15為I或L，L17為Q或E，L24為K或R，L37為L或Q，L45為K或R，L83為L或V，L86為H或Y，L100為A或Q，L106為L或I，
在一些人源化3D6抗體中，VL區中之位置L7、L10、L15、L83、L86及L106分別由S、S、L、V、Y及I佔據，如在huVLvb2中。在一些人源化3D6抗體中，VL區中之位置L7、L10、L15、L17、L24、L37、L45、L83、L86、L100及L106分別由S、S、L、E、R、Q、R、V、Y、Q及I佔據，如在huVLvb3中。
上文所提及之抗體中任一者之輕鏈可變區可經修飾以進一步降低免疫原性。例如，在一些人源化抗體中，位置L47由G、N、D、E、P、T、S或A佔據；位置L48由G或D佔據；位置L49由E佔據；位置L50由E、D、G或V佔據；位置L52由G佔據；及/或位置L54由D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據。上文所提及之抗體中任一者之重鏈可變區可經修飾以進一步降低免疫原性。例如，在一些人源化抗體中，位置H80由M佔據及/或位置H82c由V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，位置L54由D佔據，如在hu3D6VLv2 L54D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由G佔據，如在hu3D6VLv2 L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由N佔據，如在hu3D6VLv2 L54N中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由E佔據，如在hu3D6VLv2 L54E中。在一些人源化3D6抗體中，位置L50由E佔據，如在hu3D6VLv2 L50E中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由Q佔據，如在hu3D6VLv2 L54Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L50由D佔據，如在hu3D6VLv2 L50D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由K佔據，如在hu3D6VLv2 L54K中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由R佔據，如在hu3D6VLv2 L54R中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由T佔據，如在hu3D6VLv2 L54T中。在一些人源化3D6抗體中，位置L50由G佔據，如在hu3D6VLv2 L50G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L48由G佔據，如在hu3D6VLv2 I48G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L48由D佔據，如在hu3D6VLv2 I48D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由G佔據，如在hu3D6VLv2 L47G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L49由E佔據，如在hu3D6VLv2 Y49E中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由V佔據，如在hu3D6VLv2 L54V中。在一些人源化3D6抗體中，位置L54由S佔據，如在hu3D6VLv2 L54S中。在一些人源化3D6抗體中，位置L52由G佔據，如在hu3D6VLv2 S52G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由N佔據，如在hu3D6VLv2 L47N中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由D佔據，如在hu3D6VLv2 L47D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由E佔據，如在hu3D6VLv2 L47E中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由P佔據，如在hu3D6VLv2 L47P中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由T佔據，如在hu3D6VLv2 L47T中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由S佔據，如在hu3D6VLv2 L47S中。在一些人源化3D6抗體中，位置L47由A佔據，如在hu3D6VLv2 L47A中。在一些人源化3D6抗體中，位置L50由V佔據，如在hu3D6VLv2 L50V中。
在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、G及R佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、G及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及R佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及T佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52及L54分別由Q、G及D佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D中。
在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L54分別由Q及R佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L54R中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L54分別由Q及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L54分別由Q及D佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L54D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L50分別由Q及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L50分別由Q及D佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50D中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L54分別由Q及T佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L54T中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L52分別由Q及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37及L54分別由Q及E佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L54E中。
在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、D及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、D及R佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、E及G佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50及L54分別由Q、E及R佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R中。
在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、G、R及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、G、G及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52、L54及L100分別由Q、G、R及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L52、L54及L100分別由Q、G、D及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、D、G及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、D、R及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L37、L50、L54及L100分別由Q、V、D及Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q中。
在一些人源化3D6抗體中，位置L37由Q佔據，如在hu3D6VLv2 L37Q中。在一些人源化3D6抗體中，位置L100由Q佔據，如在hu3D6VLv2 G100Q中。
一些人源化3D6抗體包含成熟重鏈可變區及成熟輕鏈可變區，該成熟重鏈可變區包含有分別包含SEQ ID NO:8、9及10之CDR H1、CDR H2及CDR H3，除了位置H28可由N或T佔據，H54可由N或D佔據，H56可由D或E佔據，位置H58由V或I佔據，且位置H60可由D或E佔據；該成熟輕鏈可變區包含有分別包含SEQ ID NO:12、13及14之CDR L1、CDR L2及CDR L3，除了位置L24可由K或R佔據，位置L50可由L、E、D、G或V佔據，位置L52可由S或G佔據，且位置L54可由L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，其中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：H1由Q佔據，H5由Q佔據，H11由L佔據，H20由L佔據，H23由T佔據，H38由K佔據，H75由S佔據，H56由E佔據，H58由I佔據，H60由E佔據，H82c由V佔據，L10由T佔據，L17由E佔據，L24由R佔據，L37由Q佔據，L47由G、N、D、E、P、T、S或A佔據，L48由G或D佔據，L49由E佔據，L50由E、D、G或V佔據，L52由G佔據，L54由D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，L83由L佔據，L86由H佔據，L100由Q佔據，L106由L佔據。
一些人源化3D6抗體包含單株抗體3D6之三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR，其中3D6為特徵在於重鏈可變區具有包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列且輕鏈可變區具有包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的小鼠抗體，除了位置H27可由F或Y佔據，位置H28可由N或T佔據，位置H29可由I或F佔據，位置H30可由K或T佔據，位置H51可由I或V佔據，位置H54可由N或D佔據，位置H60可由D、A或E佔據，位置H61可由P或E佔據，位置H102可由F或Y佔據，位置L50可由L、E、D、G或V佔據，位置L52可由S或G佔據，且位置L54可由L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，其中以下位置中之至少一者由如所指定之胺基酸佔據：L37由Q佔據，L47由G、N、D、E、P、T、S或A佔據，L48由G或D佔據，L49由E佔據，L50由E、D、G或V佔據，L52由G佔據，L54由D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據，L100由Q佔據，H60由E佔據，H82c由V佔據。
在一些人源化3D6抗體中，可變重鏈與人類序列具有≥85%一致性。在一些人源化3D6抗體中，可變輕鏈與人類序列具有≥85%一致性。在一些人源化3D6抗體中，可變重鏈及可變輕鏈中之各者均與人類生殖系序列具有≥85%一致性。在一些人源化3D6抗體中，三個重鏈CDR係如藉由Kabat/Chothia複合物所定義(SEQ ID NO:8、9及10)，且三個輕鏈CDR係如藉由Kabat/Chothia複合物所定義(SEQ ID NO:12、13及14)；條件為位置H28由N或T佔據，位置H54由N或D佔據，位置H56由D或E佔據，位置H58由V或I佔據，位置H60由D或E佔據，位置L24由K或R佔據，位置L50由L、E、D、G或V佔據，位置L52由S或G佔據且位置L54由L、D、G、N、E、Q、K、R、T、V或S佔據。在一些人源化3D6抗體中，Kabat/Chothia複合物CDR-H1具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-H2具有包含SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:149之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-L1具有包含SEQ ID NO:89之胺基酸序列。在一些人源化3D6抗體中，Kabat CDR-L2包含選自由SEQ ID NO:150-175組成之群的胺基酸序列。
此類人源化抗體之CDR區可以與3D6之CDR區相同或實質上相同，CDR區可以由任何習知定義(例如，Chothia或Chothia及Kabat之複合物)來定義，但較佳如由Kabat所定義。
除非另外說明，否則可變區架構位置係根據Kabat編號。其他此類變異體通常與例示之Hu3D6重鏈及輕鏈之序列相差少量(例如，通常不多於1、2、3、5、10或15個)置換、缺失或插入。此類差異通常在架構中，但可發生於CDR中。
人源化3D6變異體中另外變異之可能性為可變區架構中另外的回復突變。人源化mAb中不與CDR接觸的許多架構殘基可適應來自供體小鼠mAb或其他小鼠或人類抗體之對應位置的胺基酸的取代，且甚至許多潛在的CDR接觸殘基亦適合於取代。甚至CDR內之胺基酸可例如經用於提供可變區架構的人類受體序列之對應位置處所見的殘基改變。此外，可將替代人類受體序列用於例如重鏈及/或輕鏈。若使用不同的受體序列，則可不進行上文推薦之一或多種回復突變，因為在沒有回復突變之情況下對應供體及受體殘基已經相同。
較佳的是，人源化3D6變異體中之置換或回復突變(無論是否為保守的)對人源化mAb之結合親和力或效力(即，其結合tau的能力)沒有實質影響。
人源化3D6抗體之特徵進一步在於它們結合磷酸化及非磷酸化tau以及tau之錯誤折疊/聚集形式的能力。 D. 嵌合及鑲飾抗體
本發明進一步提供非人類抗體、特別是實例之3D6抗體之嵌合及鑲飾形式。
嵌合抗體為非人類抗體(例如，小鼠)之輕鏈及重鏈之成熟可變區與人類輕鏈及重鏈恆定區組合的抗體。此類抗體實質上或全部保留小鼠抗體之結合特異性，且為約2/3人類序列。在一個實施例中，嵌合3D6抗體具有重鏈胺基酸序列SEQ ID NO:72及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO:73。
鑲飾抗體為人源化抗體之一種類型，其保留一些且通常所有CDR及非人類抗體之一些非人類可變區架構殘基，但用來自人類抗體序列之對應位置之殘基置換可造成B細胞或T細胞抗原決定位的其他可變區架構殘基，例如暴露殘基(Padlan,Mol. Immunol . 28:489, 1991)。結果為CDR完全或實質上來自非人類抗體且非人類抗體之可變區架構藉由取代而變得更像人類的抗體。本發明中包括3D6抗體之鑲飾形式。 E. 人類抗體
針對tau或其片段(例如，SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213及/或262-276，分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334；或SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362；或其2者、3者或4者之任何組合)的人類抗體藉由下文所述之多種技術提供。藉由競爭性結合實驗，藉由Winter之噬菌體顯示方法(上文)或以其他方式選擇一些人抗體，以具有與具體小鼠抗體(諸如實例中所述之小鼠單株抗體之一)相同的抗原決定位特異性。亦可藉由僅使用tau之片段諸如僅含有SEQ ID NO:3的氨基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334)或僅含有SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362之tau片段作為靶抗原，及/或藉由針對tau變異體之集合諸如在SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334)內或在SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362內含有各種突變之tau變異體篩選抗體來針對具體抗原決定位特異性對人類抗體進行篩選。
用於產生人類抗體之方法包括Oestberg等人,Hybridoma 2:361-367 (1983)；Oestberg, 美國專利第4,634,664號；及Engleman等人, 美國專利4,634,666之三源雜交瘤(trioma)方法；使用包括人類免疫球蛋白基因的基因轉殖小鼠(參見，例如，Lonberg等人, WO93/12227 (1993)；US 5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US 5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；Neuberger,Nat.Biotechnol. 14:826 (1996)；以及Kucherlapati, WO 91/10741 (1991))；噬菌體顯示方法(參見，例如Dower等人, WO 91/17271；McCafferty等人, WO 92/01047；US 5,877,218；US 5,871,907；US 5,858,657；US 5,837,242；US 5,733,743；以及US 5,565,332)；以及WO 2008/081008中描所述之方法(例如，將自人類單離之記憶B細胞永生化，例如用EBV，針對所要特性進行篩選，且選殖及表現重組形式)。 F. 恆定區之選擇
嵌合抗體、鑲飾抗體或人源化抗體之重鏈及輕鏈可變區可連接至人類恆定區之至少一部分。恆定區之選擇部分取決於是否需要抗體依賴性細胞介導之細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬及/或補體依賴性細胞毒性。例如，人類同型IgG1及IgG3具有補體依賴性細胞毒性且人類同型IgG2及IgG4不具有補體依賴性細胞毒性。人類IgG1及IgG3亦誘導強於人類IgG2及IgG4的細胞介導之效應子功能。輕鏈恆定區可為λ或κ。恆定區之編號慣例包括EU編號(Edelman, G.M.等人, Proc.Natl.Acad.USA, 63, 78-85 (1969))、Kabat編號(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)、IMGT唯一編號(Lefranc M.-P.等人, IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev.Comp.Immunol., 29, 185-203 (2005))以及IMGT外顯子編號(Lefranc, 出處同上)。
輕鏈及/或重鏈之胺基末端或羧基末端處之一個或若干胺基酸，諸如重鏈之C末端離胺酸，可在一部分或全部分子中缺少或經衍生。可在恆定區中進行取代以減少或增加效應子功能，諸如補體介導之細胞毒性或ADCC (參見例如，Winter等人, 美國專利第5,624,821號；Tso等人, 美國專利第5,834,597號；以及Lazar等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005, 2006)，或延長在人類中的半衰期(參見，例如，Hinton等人, J. Biol.Chem. 279:6213, 2004)。示範性取代包括在位置250處的Gln及/或在位置428處的Leu (EU編號在此段中用於恆定區)以供增加抗體之半衰期。位置234、235、236及/或237中任一者或全部處的取代降低了對Fcγ受體、特別是FcγRI受體的親和力(參見例如，US 6,624,821)。在人類IgG1之位置234、235及237處的丙胺酸取代可用於減小效應子功能。一些抗體具有在人類IgG1之位置234、235及237處的丙胺酸取代以供減小效應子功能。視情況，人類IgG2中之位置234、236及/237經丙胺酸取代，且位置235經麩醯胺取代(參見例如，US 5,624,821)。在一些抗體中，使用人類IgG1之位置241、264、265、270、296、297、322、329及331 (藉由EU編號)中之一或多者處的突變。在一些抗體中，使用人類IgG1之位置318、320及322 (藉由EU編號)中之一或多者處的突變。在一些抗體中，位置234及/或235經丙胺酸取代，及/或位置329經甘胺酸取代。在一些抗體中，位置234及235經丙胺酸取代。在一些抗體中，同型為人類IgG2或IgG4。
抗體可表現為含有兩個輕鏈及兩個重鏈的四聚物，單獨的重鏈、輕鏈，Fab、Fab'、F(ab')2及Fv，或重鏈及輕鏈成熟可變域經由間隔物連接的單鏈抗體。
人類恆定區顯示出不同個體之間的同種異型變異及同族同種異型(isoallotypic)變異，即在不同個體中恆定區可在一或多個多型位置處有所不同。同族同種異型與同種異型的區別在於，識別同族同種異型的血清結合一或多種其他同型之非多型區。因此例如，另一重鏈恆定區屬於具有或不具有C末端離胺酸的IgG1 G1m3。對人恆定區的提及包括具有任何天然同種異型或佔據天然同種異型中的位置的殘基的任何排列的恆定區。示範性重鏈恆定區為具有或不有C末端離胺酸之SEQ ID NO:176，且示範性輕鏈恆定區為SEQ ID NO:177。 G. 重組抗體之表現
已知許多用於使用抗體表現細胞株(例如，融合瘤)產生嵌合抗體及人源化抗體的方法。例如，可以使用熟知的方法對抗體之免疫球蛋白可變區進行選殖及定序。在一種方法中，使用由融合瘤細胞製備之mRNA藉由RT-PCR對重鏈可變VH區進行選殖。將共通引子作為5'引子及g2b恆定區特異性3'引子用於涵蓋轉譯起始密碼子的VH區前導肽。示範性引子描述於Schenk等人的美國專利公開案US 2005/0009150中(下文稱為「Schenk」)。可以比較來自多個獨立來源之殖株之序列，以確保在擴增期間不引入任何變化。亦可藉由對藉由5' RACE RT-PCR方法及3' g2b特異性引子獲得之VH片段進行定序來確定或確認VH區之序列。
可以同功方式選殖輕鏈可變VL區。在一種方法中，使用經設計成與涵蓋轉譯起始密碼子之VL區雜交的5'引子及對V-J接合區下游的Ck區具有特異性的3'引子來設計用於VL區之擴增的共通引子組。在第二種方法中，採用5'RACE RT-PCR方法選殖VL編碼cDNA。示範性引子描述於Schenk, 出處同上。然後將選殖之序列與編碼人類(或其他非人類物種)恆定區之序列組合。
在一種方法中，重鏈及輕鏈可變區經再工程改造以編碼相應VDJ或VJ接合處下游的剪接供體序列，且經選殖至哺乳動物表現載體中，諸如用於重鏈的pCMV-hγ1及用於輕鏈的pCMV-Mcl。這些載體將人類γ1及Ck恆定區編碼為插入可變區匣下游的外顯子片段。在序列驗證後，可將重鏈及輕鏈表現載體共轉染至CHO細胞中以產生嵌合抗體。轉染後48小時收集條件培養基，且藉由西方墨點法分析評估抗體產量或藉由ELISA評估抗原結合。如上所述將嵌合抗體人源化。
嵌合抗體、鑲飾抗體、人源化抗體及人類抗體通常藉由重組表現產生。重組多核苷酸構築體通常包括可操作地連接於抗體鏈之編碼序列的表現控制序列，包括天然相關聯的或異源的表現控制元件，諸如啟動子。表現控制序列可為能夠轉型或轉染真核或原核宿主細胞的載體中的啟動子系統。一旦載體併入至適當寄主中，就將寄主維持在適於核苷酸序列之高水準表現及交叉反應性抗體之收集及純化的條件下。
這些表現載體通常可作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之整體部分在宿主生物體中複製。通常，表現載體含有選擇標誌物，例如氨苄青黴素抗性或潮黴素抗性，以允許偵測用所要DNA序列轉型之那些細胞。
大腸桿菌為可用於表現抗體、特別是抗體片段的一種原核宿主。諸如酵母之微生物亦可用於表現。酵母屬(Saccharomyces )為帶有如所要的具有表現控制序列、複製起點、終止序列及其類似者的合適載體的酵母宿主。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶及其他醣解酶。誘導型酵母啟動子尤其包括來自醇去氫酶、異細胞色素C及負責麥芽糖與半乳糖利用的酶的啟動子。
哺乳動物細胞可用於表現編碼免疫球蛋白或其片段的核苷酸區段。參見Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987)。已經開發出許多能夠分泌完整異源蛋白質合適宿主細胞株，且包括CHO細胞株、各種COS細胞株、HeLa細胞、HEK293細胞、L細胞以及包括Sp2/0和NS0的非抗體產生骨髓瘤。細胞可為非人類。這些細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子、強化子(Queen等人,Immunol.Rev. 89:49 (1986))及必要的加工資訊位點諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點以及轉錄終止子序列。表現控制序列可包括來源於內源性基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒及其類似者的啟動子。參見Co等人,J. Immunol . 148:1149 (1992)。
替代地，可將抗體編碼序列併入轉殖基因中以供引入基因轉殖動物之基因體中且隨後於基因轉殖動物之乳汁中表現(參見例如，美國專利第5,741,957號；美國專利第5,304,489號；以及美國專利第5,849,992號)。合適的轉殖基因包括與諸如酪蛋白或β乳球蛋白的乳腺特異性基因之啟動子及強化子可操作地連接的輕鏈及/或重鏈的編碼序列。
含有感興趣之DNA區段的載體可藉由取決於細胞宿主類型的方法轉移至宿主細胞中。例如，對於原核細胞，通常利用氯化鈣轉染，而對於其他細胞宿主，可使用磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染、基因槍法或基於病毒的轉染。用於轉型哺乳動物細胞之其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合物、脂質體、電穿孔及顯微注射。就產生基因轉殖動物而言，可將轉殖基因顯微注射至受精卵母細胞中或可併入至胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞(iPSC)之基因體中，並將此類細胞之細胞核轉移至除核卵母細胞中。
將編碼抗體重鏈及輕鏈的一種或多種載體引入至細胞培養物中，可在無血清培養基中針對生長生產率及產物品質對細胞池進行篩選。最佳產量的細胞池然後可進行基於FACS的單細胞選殖以產生單株株系。可以使用高於每個細胞每天50 pg或100 pg的比生產率，其對應於大於7.5 g/L培養物的產物效價。由單細胞殖株產生的抗體亦可進行濁度、過濾特性、PAGE、IEF、UV掃描、HP-SEC、醣-寡醣圖譜定位、質譜以及結合檢定(諸如ELISA或Biacore)的測試。所選擇之殖株可隨後保存入庫於多個小瓶中且冷凍儲存以供後續使用。
一旦表現，就可根據此項技術之標準程序純化抗體，其包括蛋白A捕獲、HPLC純化、柱層析、凝膠電泳及其類似程序(一般而言參見，Scopes,Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982))。
可採用商業生產抗體之方法，包括密碼子最佳化、啟動子之選擇、轉錄元件之選擇、終止子之選擇、無血清單細胞選殖、細胞保存入庫、針對複本數之擴增的選擇標誌物之使用、CHO終止子或蛋白效價之改善(參見例如，US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US 7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；以及US 5,888,809)。IV. 主動免疫原
用於主動免疫的劑用於在患者中誘導與結合上文被動免疫所述之抗體相同類型的抗體。用於主動免疫的劑為用於在實驗室動物中生成單株抗體的相同類型的免疫原，例如，來自tau之對應於SEQ ID NO:3之殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271或320-334)的區域的3-15或3-12或5-12或5-8個連續胺基酸的肽，例如像包括SEQ ID NO:3之殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之殘基257-271或320-334)的肽；或來自tau之對應於SEQ ID NO:1之殘基259-268或290-299或321-330或353-362的區域的肽，例如像包括SEQ ID NO:1之殘基259-268或290-299或321-330或353-362的肽。為了誘導結合與3D6相同或重疊的抗原決定位的抗體，可以對這些抗體之抗原決定位特異性進行圖譜定位(例如，藉由測試與跨越tau之一系列重疊肽的結合)。然後可使用由該抗原決定位組成、或包括該抗原決定位、或與該抗原決定位重疊的tau片段作為免疫原。此類片段通常以非磷酸化形式使用。
若使用，異源性載劑及佐劑可同樣用於生成單株抗體，但亦可針對在人類中使用的更好的醫藥適用性進行選擇。合適的載劑包括血清白蛋白、鎖眼帽血藍蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風類毒素或來自其他致病細菌諸如白喉(例如，CRM197)、大腸桿菌、霍亂或幽門螺桿菌(H. pylori )的類毒素或減毒的毒素衍生物。T細胞抗原決定位亦為合適的載劑分子。一些綴合物可以藉由將本發明之劑連接至免疫刺激性聚合物分子(例如，三棕櫚醯基-S-甘油半胱胺酸(Pam3 Cys)、甘露聚糖(甘露糖聚合物)或葡聚糖(β 1→2聚合物))、細胞介素(例如，IL-1、IL-1α及β肽、IL-2、γ-INF、IL-10、GM-CSF)以及趨化介素(例如，MIP1-α及β以及RANTES)來形成。免疫原可以連接至載劑，且具有或不具有間隔胺基酸(例如，gly-gly)。另外的載劑包括病毒樣顆粒。病毒樣粒子(VLP)，亦稱為假型病毒(pseudovirion)或病毒衍生顆粒，代表由能夠在體內自組裝成具有限定的球形對稱性的VLP的病毒殼體及/或套膜蛋白的多個複本構成的次單元結構。(Powilleit等人, (2007) PLoS ONE 2(5):e415。)替代地，肽免疫原可連接至至少一個人工T細胞抗原決定位，該T細胞抗原決定位能夠結合大部分MHC II類分子，諸如pan DR抗原決定位(「PADRE」)。PADRE描述於US 5,736,142、WO 95/07707及Alexander J等人, Immunity, 1:751-761 (1994)中。主動免疫原可以多聚物形式呈現，在該形式中免疫原及/或其載劑之多個複本呈現為單個共價分子。
片段通常與醫藥學上可接受之佐劑一起投與。相對於單獨使用肽之情況，佐劑增加誘導抗體之效價及/或誘導抗體之結合親和力。多種佐劑可與tau之免疫原性片段組合使用以引起免疫反應。較佳佐劑增強對免疫原的固有反應，而不導致影響反應之定性形式的免疫原構形變化。較佳佐劑包括鋁鹽諸如氫氧化鋁及磷酸鋁、3 De-O-醯化之單磷醯基脂質A (MPLTM )(參見GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana,現為Corixa之一部分))。StimulonTM QS-21為從在南美洲發現的石鹼木(Quillaja Saponaria Molina)樹之樹皮中單離之三萜醣苷或皂素(參見Kensil等人,Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell及Newman編, Plenum Press, NY, 1995)；US 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA；現為Antigenics, Inc., New York, NY)。其他佐劑為水中油乳液(諸如角鯊烯或花生油)，視情況組合免疫刺激劑，諸如單磷醯基脂質A (參見Stoute等人,N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997))、普羅尼克(pluronic)聚合物以及殺死的分枝桿菌。Ribi佐劑為水中油乳液。Ribi含有用含有Tween 80的鹽水乳化之可代謝油(角鯊烯)。Ribi亦含有充當免疫刺激劑的精製分枝桿菌產物及細菌單磷醯基脂質A。另一佐劑為CpG (WO 98/40100)。佐劑可以作為治療組成物之組分與活性劑一起投與，或可以在投與治療劑之前、同時或之後單獨投與。
亦可使用誘導針對tau的抗體的tau之天然片段之類似物。例如，一或多種或所有L-胺基酸可經此類肽中之D胺基酸取代。胺基酸之順序亦可逆轉(逆向肽(retro peptide))。視情況，肽包括逆向順序的所有D-胺基酸(逆反肽(retro-inverso peptide))。肽及其他化合物不一定與tau肽具有顯著的胺基酸序列相似性，但仍然充當tau肽之模擬物並誘導相似的免疫反應。亦可使用針對如上所述之tau之單株抗體的抗獨特型抗體。此類抗Id抗體模擬抗原並且產生對該抗原的免疫反應(參見Essential Immunology, Roit編, Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 第6版, 第181頁)。
肽(及視情況與肽融合之載劑)亦可以以編碼肽之核酸的形式投與並且在患者中原位表現。編碼免疫原的核酸區段通常連接至調控元件，諸如啟動子及強化子，其允許DNA區段在患者之預期靶細胞中表現。為了在血細胞中表現，如免疫反應的誘導所希望的，來自輕鏈或重鏈免疫球蛋白基因或CMV主要立即早期啟動子及強化子的啟動子和強化子元件適於指導表現。通常將連接之調控元件及編碼序列選殖至載體中。抗體亦可以編碼抗體重鏈及/或輕鏈的核酸的形式投與。若重鏈及輕鏈均存在，則各鏈較佳作為單鏈抗體連接。用於被動投與的抗體亦可以例如藉由親和層析法從用肽免疫原處理之患者的血清中製備。
DNA可以以裸露的形式(即，在沒有膠體或包封材料之情況下)遞送。替代地，可使用許多病毒載體系統，包括反轉錄病毒系統(參見例如，Lawrie及Tumin, Cur.Opin.Genet.Develop.3, 102-109 (1993))；腺病毒載體(參見例如，Bett等人, J. Virol.67, 591 1 (1993))，包括反轉錄病毒來源之載體，諸如MMLV、HIV-1及ALV；腺相關病毒載體(參見例如，Zhou等人, J. Exp.Med.179, 1867 (1994))；慢病毒載體，諸如基於HIV或FIV gag序列之病毒；來自痘科之病毒載體，包括牛痘病毒及禽痘病毒；來自α病毒屬的病毒載體，諸如來源於辛德比病毒及塞姆利基森林病毒之病毒(參見例如，Dubensky等人, J. Virol.70, 508-519 (1996))；委內瑞拉馬腦炎病毒(參見US 5,643,576)及彈狀病毒，諸如水皰性口炎病毒(參見WO 96/34625)以及乳頭瘤病毒(Ohe等人, Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995)；Woo等人，WO 94/12629以及Xiao及Brandsma, Nucleic Acids.Res.24, 2630-2622 (1996))。
編碼免疫原或編碼重鏈及/或輕鏈之DNA或含有其之載體可包裝至脂質體中。合適的脂質及相關類似物由US 5,208,036、US 5,264,618、US 5,279,833及US 5,283,185描述。編碼免疫原或編碼重鏈及/或輕鏈之載體及DNA亦可經吸附至微粒載劑或與其相關聯，微粒載劑之實例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物及聚乳酸以及聚(乳酸交酯-共-乙交酯)，(參見例如，McGee等人, J. Micro Encap. 1996)。
可將編碼抗體重鏈及/或輕鏈之載體或區段離體併入細胞中，例如自個別患者外植之細胞(例如，淋巴球、骨髓吸出物、組織生檢)或通用供體造血幹細胞，接著通常在選擇已併入轉殖基因的細胞之後將細胞再植入患者中。(參見例如，WO 2017/091512)。示範性患者來源之細胞包括患者來源之誘導多能幹細胞(iPSC)或其他類型的幹細胞(胚胎幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞或間質幹細胞)。
可將編碼抗體重鏈及/或輕鏈的載體或其片段離體引入細胞中任何感興趣之區，諸如白蛋白基因或其他安全港基因。併入載體之細胞可在有或沒有先前分化之情況下植入。可將細胞植入至特定組織中，諸如分泌組織或病理部位，或全身性植入，諸如藉由輸注至血液中。例如，可將細胞植入患者之分泌組織中，諸如肝，任選地事先分化為存在於該組織中的細胞，諸如在肝之情況下為肝細胞。抗體在肝中之表現導致抗體向血液分泌。 H. 抗體篩選檢定
可如上所述針對預期結合特異性對抗體進行初始篩選。同樣可針對誘導具有此類結合特異性之抗體的能力對主動免疫原進行篩選。在此情況下，使用主動免疫原對實驗室動物進行免疫，並針對適當的結合特異性對所得血清進行測試。
然後可在細胞及動物模型中對具有所要結合特異性的抗體進行測試。用於此類篩選之細胞優先為神經元細胞。已報導了tau病理之細胞模型，在該細胞模型中用視情況具有與tau病理相關聯的突變的tau之四重複序列域(four-repeat domain)轉染神經母細胞瘤細胞(例如，ΔK280，參見Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007))。在另一模型中，藉由添加強力黴素(doxycyclin)在神經母細胞瘤N2a細胞株中誘導tau。細胞模型使得能夠研究在可溶或聚集狀態中tau對細胞的毒性、開啟tau基因表現後tau聚集體之出現、再次關閉基因表現後tau聚集體之溶解以及抗體在抑制tau聚集體之形成或使其解聚方面的功效。
亦可在與tau相關聯的疾病之基因轉殖動物模型中篩選抗體或主動免疫原。此類基因轉殖動物可包括tau轉殖基因(例如，人類同功型中任一者)及視情況人類APP轉殖基因等，諸如磷酸化tau、ApoE、早老素或α突觸核蛋白的激酶。此類基因轉殖動物經設置成發展與tau相關聯的疾病的至少一種徵象或症狀。
示範性基因轉殖動物為K3系小鼠(Itner等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(41):15997-6002 (2008))。這些小鼠具有人類tau轉殖基因，該人類tau轉殖基因具有K 369 I突變(該突變與匹克病相關聯)及Thy 1.2啟動子。此模型顯示出快速的神經退化、運動缺陷以及傳入纖維及小腦顆粒細胞退化的過程。另一示範性動物為JNPL3系小鼠。這些小鼠具有人類tau轉殖基因，該人類tau轉殖基因具有P301L突變(該突變與額顳葉失智相關聯)及Thy1.2啟動子(Taconic, Germantown, N.Y., Lewis等人, Nat Genet.25:402-405 (2000))。這些小鼠具有更漸進的神經退化過程。小鼠在若干腦部區域疾脊髓中發展神經纖維纏結，其據此以全文引用之方式併入)。小鼠在幾個腦區域和脊髓中發展神經原纖維纏結，其據此以引用方式整體併入)。這些動物之另一優點為病理之相對早發。在同型接合系中，至少早在3個月就可以觀察到與tau病理相關聯的行為異常，但動物至少在8月齡之前都保持相對健康。換言之，在8個月時，動物走動、自己覓食且可充分良好地執行行為任務以允許監測治療效果。使用- AI wI KLH-PHF-1對這些小鼠進行6-13個月的主動免疫產生約1,000的效價，且相對於未處理的對照小鼠顯示出較少的神經纖維纏結、較少的pSer422以及體重減輕減少。
抗體或活性劑之活性可藉由各種標準評估，包括總tau或磷酸化tau之量的減少、其他病理特徵諸如Aβ之類澱粉沉著物的減少以及抑制或延遲或行為缺陷。亦可以針對血清中抗體之誘導對主動免疫原進行測試。可以針對抗體穿過血腦障壁進入基因轉殖動物之腦部中對被動及主動免疫原進行測試。亦可在天然地或透過誘導發展以tau為特徵的疾病之症狀的非人類靈長類動物中測試抗體或誘導抗體的片段。對抗體或活性劑的測試通常與對照結合執行，在對照中進行平行實驗，除了不存在抗體或活性劑(例如，由媒劑置換)。然後可相對於對照評估可歸因於測試之抗體或活性劑的疾病徵象或症狀之減少、延遲或抑制。V. 適合治療的患者
已在若干疾病中發現神經原纖維纏結之存在，該等疾病包括阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)及進行性核上神經麻痺症(PSP)。本發明方案亦可用於治療或預防這些疾病中任一者。由於神經疾病及病狀與tau之間的廣泛關聯，本發明方案可用於治療或預防與沒有神經疾病的個體中的平均值相比顯示出tau或磷酸化tau (例如，在CSF中)之水準升高的任何個體。本發明方案亦可用於治療或預防具有與神經疾病相關聯的tau突變的個體中之神經疾病。本發明方法特別適用於治療或預防阿茲海默氏病，並且尤其是在患者中進行治療或預防。
適合治療的患者包括處於疾病風險但未顯示出症狀的個體，以及目前顯示出症狀的患者。處於疾病風險的患者包括具有已知的疾病遺傳風險的那些。此類個體包括有親屬經歷過此疾病的那些個體，以及藉由遺傳或生化標誌物之分析確定風險的那些個體。風險之遺傳標誌物包括tau之突變，諸如文所討論的那些，以及與神經疾病相關聯的其他基因之突變。例如，以異型接合及甚至尤其同型接合形式的ApoE4對偶基因與阿茲海默氏病之風險相關聯。阿茲海默氏病之風險之其他標誌物包括APP基因之突變特別是在位置717以及位置670和671處的突變(分別稱為Hardy及Swedish突變)、早老素基因PS1和PS2之突變、AD之家族史、高膽固醇血症或動脈粥樣硬化。目前患有阿茲海默氏病的個體可藉由PET成像、由特徵性失智以及如上文所述之風險因素之存在來識別。此外，許多診斷測試可用於鑑別患有AD的個體。這些包括CSF tau或磷酸-tau以及Aβ42水準之量測。升高的tau或磷酸-tau及降低的Aβ42水準意謂存在AD。一些突變與巴金森氏病相關聯。Ala30Pro或Ala53或與巴金森氏病相關聯的其他基因諸如富白胺酸重複序列激酶PARK8中之突變。根據DSM IV TR之標準，個體亦可經診斷為患有上文提及之任何神經疾病。
在無症狀患者中，治療可在任何年齡開始。(例如，10、20、30歲)。然而，通常，在患者達到40、50、60或70歲之前不必開始治療。治療通常在一段時間內需要多個劑量。可藉由檢定隨時間推移的抗體水準來對治療進行監測。若反應下降，則指示需要加強劑量。在潛在的唐氏徵候群患者之情況下，可在出生前藉由向母親投與治療劑開始治療或在出生後不久開始治療。 I. 核酸
本發明進一步提供編碼上文所述之重鏈及輕鏈(例如，SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:76-80、SEQ ID NO:90-91、SEQ ID NO:146-148、SEQ ID NO:83-85、SEQ ID NO:93-145及SEQ ID NO:178-181)中任一者之核酸。編碼本發明之重鏈的示範性核酸為SEQ ID NO:182，且編碼本發明之輕鏈的示範性核酸為SEQ ID NO:183。視情況，此類核酸進一步編碼訊息肽且可在具有連接至可變區的訊息肽之情況下經表現。核酸之編碼序列可與調控序列可操作地連接以確保編碼序列之表現，諸如啟動子、強化子、核糖體結合位點、轉錄終止訊息及其類似者。調控序列可包括啟動子，例如原核啟動子或真核啟動子。編碼重鏈或輕鏈之核酸可經密碼子最佳化以供在宿主細胞中表現。編碼重鏈及輕鏈之核酸可編碼可選擇基因。編碼重鏈及輕鏈之核酸可以經單離形式存在或可選殖至一或多種載體中。核酸可藉由例如重疊寡核苷酸之固態合成或PCR來合成。編碼重鏈及輕鏈之核酸可接合為一種連續核酸，例如，在表現載體內，或可為單獨的，例如，各自選殖至其自己的表現載體中。 J. 綴合抗體
特異性結合抗原諸如tau的綴合抗體可用於偵測tau之存在；監測及評估用於治療經診斷具有阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)之患者的治療劑之功效；抑制或減少tau聚集；抑制或減少tau原纖維形成；減少或清除tau沉著物；穩定tau之無毒性構形；或在患者中治療阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)或實現其預防。例如，此類抗體可與其他治療部分、其他蛋白質、其他抗體及/或可偵測標記綴合。參見WO 03/057838；US 8,455,622。此類治療部分可為可用於在患者中治療、抗擊、緩解、預防或改善非所要病狀或疾病的任何劑，該等病狀或疾病諸如阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化 (CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型 (LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變 (GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
綴合之治療部分可包括細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、神經營養劑、神經保護劑、放射治療劑、免疫調節劑或促進或增強抗體活性的任何生物活性劑。細胞毒性劑可為對細胞有毒性的任何劑。細胞生長抑制劑可為抑制細胞增殖的任何劑。神經營養劑可為促進神經元維持、生長或分化的任何劑，包括化學劑或蛋白質劑。神經保護劑可為保護神經元免於急性侵害或退化過程的劑，包括化學劑或蛋白質劑。免疫調節劑可為刺激或抑制免疫反應之發展或維持的任何劑。放射治療劑可為發射輻射的任何分子或化合物。若此類治療部分偶聯於tau特異性抗體，諸如本文所述之抗體，則偶聯之治療部分將對tau相關疾病影響之細胞具有優於正常細胞的特異性親和力。因此，綴合之抗體之投與直接靶向癌細胞，而對周圍正常健康組織的傷害最小。這對於毒性太大而不能自身投與的治療部分可為特別有用的。此外，可以使用較少量的治療部分。
一些此類抗體可經修飾以充當免疫毒素。參見例如，美國專利第5,194,594號。例如，藉由使用針對抗體之雙功能試劑S-乙醯基巰基琥珀酸酐及針對蓖麻毒素之3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀醯亞胺酯，可將來源於植物的細胞毒素蓖麻毒素偶聯於抗體。參見Pietersz等人,Cancer Res . 48(16):4469-4476 (1998)。偶聯導致蓖麻毒素之B鏈結合活性喪失，同時不損害蓖麻毒素之A鏈之毒性潛力及抗體活性。類似地，核糖體組裝之抑制劑皂草素可經由化學插入之硫氫基(sulfhydryl)之間的二硫鍵來偶聯於抗體。參見Polito等人,Leukemia 18:1215-1222 (2004)。
一些此類抗體可連接至放射性同位素。放射性同位素之實例包括例如釔90 (90Y)、銦111 (111In)、131 I、99 mTc、放射銀-111、放射銀-199以及鉍213 。放射性同位素與抗體之鍵聯可用習知雙功能螯合物進行。對於放射銀-111及放射銀-199鍵聯，可以使用基於硫之連接子。參見Hazra等人,Cell Biophys .24-25:1-7 (1994)。銀放射性同位素之鍵聯可涉及用抗壞血酸還原免疫球蛋白。對於諸如111In及90Y之放射性同位素，可以使用替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)且將使其與此類同位素反應以分別形成111In-替伊莫單抗及90Y-替伊莫單抗。參見Witzig,Cancer Chemother. Pharmacol ., 48 增刊1:S91-S95 (2001)。
一些此類抗體可以連接於其他治療部分。此類治療部分可具有例如細胞毒性、細胞生長抑制性、神經營養性或神經保護性。例如，抗體可與毒性化學治療藥物諸如美登木素(maytansine)、格爾德黴素(geldanamycin)、微管蛋白抑制劑諸如微管蛋白結合劑(例如，澳瑞他汀(auristatin))或小溝結合劑諸如卡奇黴素(calicheamicin)綴合。其他代表性治療部分包括已知可用於以下疾病之治療、管理或改善的劑：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
抗體亦可與其他蛋白偶聯。例如，抗體可與Fynomer偶聯。Fynomer為來源於人類Fyn SH3域之小結合蛋白(例如，7 kDa)。其可為穩定且可溶的，且其可缺乏半胱胺酸殘基及二硫鍵。Fynomer可經工程改造以結合具有與抗體相同的親和力及特異性的靶分子。它們適用於基於抗體產生多特異性融合蛋白。例如，Fynomer可融合至抗體之N末端及/或C末端，以產生具有不同架構的雙特異性及三特異性FynomAb。可使用Fynomer文庫，透過篩選技術，使用FACS、Biacore及允許有效選擇具有最佳特性的Fynomer的基於細胞之檢定來選擇Fynomer。Fynomer之實例揭示於Grabulovski等人,J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007)；Bertschinger等人,Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007)；Schlatter等人,MAbs. 4:497-508 (2011)；Banner等人,Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013)；及Brack等人,Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014)。
本文所揭示之抗體亦可偶聯或綴合於一或多種其他抗體(例如，以形成抗體異源綴合物)。此類其他抗體可結合tau內之不同抗原決定位或可結合不同的靶抗原。
抗體亦可與可偵測標記偶聯。此類抗體可例如用於診斷阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)及/或用於評估治療功效。此類抗體特別可用於在患有或易患以下疾病之個體中或在獲自此類個體之適當生物樣本中進行此類確定：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。可與抗體偶聯或連接的代表性可偵測標記包括各種酶，諸如山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如鏈親和素/生物素及親和素/生物素；螢光材料，諸如繖形酮、螢光素、螢光異硫氰酸鹽、玫瑰紅、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，諸如流明諾；生物發光材料，諸如螢光素酶、蟲螢光素以及水母素；放射性材料，諸如放射銀-111、放射銀-199、鉍213 、碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(5 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In、111 In)、鎝(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn及117 Tin；正電子發射金屬，使用各種正電子發射斷層攝影術；非放射性順磁性金屬離子；以及經放射性標記或綴合於特定放射性同位素的分子。
放射性同位素與抗體之鍵聯可用習知雙功能螯合物進行。對於放射銀-111及放射銀-199鍵聯，可以使用基於硫之連接子。參見Hazra等人,Cell Biophys . 24-25:1-7 (1994)。銀放射性同位素之鍵聯可涉及用抗壞血酸還原免疫球蛋白。對於諸如111In及90Y之放射性同位素，可以使用替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)且將使其與此類同位素反應以分別形成111In-替伊莫單抗及90Y-替伊莫單抗。參見Witzig,Cancer Chemother. Pharmacol ., 48 增刊1:S91-S95 (2001)。
治療部分、其他蛋白、其他抗體及/或可偵測標記可直接或透過中間物(例如，連接子)間接與本發明之抗體偶聯或綴合。參見例如，Arnon等人, 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等人(編), 第243-56頁 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等人, 「Antibodies For Drug Delivery」, Controlled Drug Delivery (第2版), Robinson等人(編), 第623-53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等人(編), 第475-506頁 (1985)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin等人(編), 第303-16頁 (Academic Press 1985)；及Thorpe等人,Immunol. Rev ., 62:119-58 (1982)。合適的連接子包括例如可切割及非可切割連接子。可採用在酸性或還原條件下，在暴露於特定蛋白酶時或在其他限定條件下釋放所偶聯之治療部分、蛋白、抗體及/或可偵測標記的不同連接子。VI. 醫藥組成物及使用方法
在預防性應用中，抗體或用於誘導抗體的劑或其醫藥組成物以有效降低風險、減輕嚴重性或延遲疾病之至少一種徵象或症狀的之發作的方案(劑量、頻率及投與途徑)向易患疾病(例如，阿茲海默氏病)或以其他方式處於疾病風險的患者投與。具體地講，方案較佳有效抑制或延遲腦部中之tau或磷酸-tau和由其形成之成對絲，及/或抑制或延遲其毒性作用及/或抑制/或延遲行為缺陷之發展。在治療應用中，抗體或誘導抗體的劑以有效改善或至少抑制疾病(例如，阿茲海默氏病)之至少一種徵象或症狀之進一步惡化的方案(劑量、頻率及投與途徑)向懷疑患有或已經患有該疾病的患者投與。具體地講，方案較佳有效減少或至少抑制與毒性及/或行為缺陷相關聯的tau、磷酸-tau或由其形成之成對絲之水準的進一步增加。
若個別經治療之患者達成之結果未藉由本發明之方法治療的可比患者之對照群體中的平均結果更有利，或在p＜0.05或0.01或甚至0.001之水準下，若經治療之患者的結果相對於受控臨床試驗(例如，II期、II/III期或III期試驗)中的對照患者被證明更有利，認為方案為治療或預防有效。
有效劑量取決於許多不同的因素而變化，諸如投與手段、靶位點、患者之生理狀態、患者是否為ApoE攜帶者、患者為人類還是動物、投與之其他藥物以及治療為預防性還是治療性。
抗體之示範性劑量範圍為每公斤患者體重約0.01至60 mg，或約0.1至3 mg或0.15-2 mg或0.15-1.5 mg。抗體可每天、隔天、每週、每兩週、每月、每季度或根據藉由經驗分析確定之任何其他時間排程投與此類劑量。示範性治療需要歷經長時期(例如至少六個月)投與多個劑量。另外的示範性治療方案需要每兩週投與一次或一月投與一次或每3至6個月投與一次。
對於人類投與，用於主動投與之劑之量在每個患者0.1-500 μg，且更通常每次注射1-100或1-10 μg變化。注射之時間可從一天一次至一年一次至十年一次顯著變化。典型的方案由免疫，繼之以諸如6週間隔或兩個月的時間間隔進行加強注射組成。另一方案由免疫，繼之以1、2和12個月後進行加強注射組成。另一方案需要每兩月一次注射持續終身。替代地，加強注射可以如藉由監測免疫反應所指示之無規律地進行。
抗體或用於誘導抗體的劑較佳經由周邊途徑(即，投與或誘導之抗體穿過血腦障壁到達腦部中預期部位的途徑)投與。投與途徑包括局部、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、鼻內、眼內或肌內。抗體之較佳投與途徑為靜脈內及皮下。主動免疫之較佳途徑為皮下及肌內。這種類型的注射最通常在手臂或腿部肌肉中進行。在一些方法中，將劑直接注射至聚集沉著物的具體組織中，例如顱內注射。
用於腸胃外投與之醫藥組成物較佳為無菌且實質上等滲的並在GMP條件下製造。醫藥組成物可以單位劑型(即，用於單次投與之劑量)提供。可使用一或多種生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑調配醫藥組成物。配方取決於所選擇之投與途徑。對於注射，抗體可在水溶液中、較佳在生理上相容的緩衝液諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水或乙酸鹽緩衝液中(以減少注射部位的不適)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，抗體可為凍乾形式，以在使用前用合適的媒劑(例如，無菌無熱原水)復原。
本發明方案可以與有效治療或預防正在治療之疾病的另一劑組合投與。例如，在阿茲海默氏病之情況下，本發明方案可以與針對Aβ的免疫療法(WO/2000/ 072880)、膽鹼酯酶抑制劑或美金剛(memantine)組合，或在巴金森病之情況下，本發明方案可以與針對α突觸核蛋白的免疫療法WO/2008/103472、左旋多巴、多巴胺促效劑、COMT抑制劑、MAO-B抑制劑、金剛烷胺或抗膽鹼能劑組合。
抗體以有效方案投與，該有效方案意謂延遲發作、降低嚴重性、抑制進一步惡化及/或改善正在治療的病症之至少一種徵象或症狀的劑量、投與途徑及投與頻率。若患者已經患有病症，則該方案可稱為治療有效方案。若患者處於相對於一般人群高的病症風險，但仍未經歷症狀，則該方案可稱為預防有效方案。在一些情況下，治療或預防功效可在個別患者中相對於病史對照或相同患者之過去經驗進行觀察。在其他情況下，治療或預防功效可在臨床前或臨床試驗中於治療之患者群體中相對於未治療之對照患者群體進行證明。
抗體之示範性劑量為每公斤體重0.1-60 mg (例如，0.5、3、10、30或60 mg)或0.5-5 mg (例如，0.5、1、2、3、4或5 mg)或作為固定劑量的10-4000 mg或10-1500 mg。劑量取決於患者之病狀及治療前反應(若存在)、治療為預防性還是治療性以及病症為急性還是慢性以及其他因素。
投與可為腸胃外、靜脈內、經口、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌內。可藉由靜脈內或皮下投與將一些抗體投與至體循環中。靜脈內投與可例如藉由輸注在諸如30-90 min之時間段進行。
投與頻率取決於循環中抗體之半衰期、患者之病狀及投與途徑以及其他因素。頻率可回應於患者病狀之變化或治療之病症之進展為每天、每週、每月、每季度或無規間隔。靜脈內投與之示範性頻率為在連續治療過程內的每週與每季度之間，但也可以更頻繁或更不頻繁地給藥。對於皮下投與，示範性給藥頻率為每天至每月，但也可以更頻繁或更不頻繁地給藥。
投與之劑量數取決於病症為急性的還是慢性的以及該病症對治療的反應。對於急性病症或慢性病症之急性加重，1與10之間的劑量通常是足夠的。有時單次推注劑量，視情況以分開的形式，足以用於急性病症或慢性病症之急性加重。可重複治療以用於急性病症或急性加重之復發。對於慢性病症，抗體可在規律間隔下投與，例如，每週、每兩週、每月、每季度、每六個月持續至少1、5或10年或患者終身。 A. 診斷及監測方法 體內成像、診斷方法及最佳化免疫療法
本發明提供在患者中對tau蛋白沉著物(例如，神經纖維纏結及tau內含物)體內成像的方法。該等方法藉由向患者投與諸如結合tau之抗體(例如，小鼠、人源化、嵌合或鑲飾3D6抗體)之試劑，然後在其結合後偵測該劑來進行。結合在SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213或262-276 (分別對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271或320-334)內或在SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268或290-299或321-330或353-362內的tau之抗原決定位的抗體為較佳的。在一些方法中，抗體結合在SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213 (對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271)內或在SEQ ID NO:3之胺基酸262-276 (對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基320-334)內的抗原決定位。在一些方法中，抗體結合在SEQ ID NO:1之胺基酸殘基259-268內、在SEQ ID NO:1之胺基酸290-299內、在SEQ ID NO:1之胺基酸321-330內或在SEQ ID NO:1之胺基酸353-362內的抗原決定位。藉由使用缺乏全長恆定區的抗體片段，諸如Fab，可避免或減少對所投與之抗體的清除反應。在一些方法中，相同抗體可以用作治療及診斷試劑。
診斷試劑可藉由靜脈內注射至患者體內來投與，或藉由顱內注射或藉由在顱骨上鑽孔來直接投與至腦部中。試劑之劑量應在與治療方法相同的範圍內。通常，對試劑進行標記，但在一些方法中，對tau具有親和力的一級試劑未經標記且使用二級標記劑結合該一級試劑。標記之選擇取決於偵測手段。例如，螢光標記適用於光學偵測。順磁標記之使用適用於在無手術干預之情況下的斷層攝影偵測。亦可使用正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)偵測放射性標記。
tau蛋白沉著物之體內成像之方法可用於診斷tau蛋白病變(諸如阿茲海默氏病、額顳葉退化、進行性核上神經麻痺症及匹克病)或對這種疾病的易感性或者確認其診斷。例如，該等方法可用於表現出失智症狀的患者。若患者具有異常的神經纖維纏結，則患者可能患有阿茲海默氏病。替代地，若患者具有異常的tau內含物，則根據內含物之定位，患者可能患有額顳葉退化。該等方法亦可用於無症狀患者。異常tau蛋白沉著物之存在表明對未來症狀性疾病的易感性。該等方法亦可用於在先前已診斷為患有tau相關疾病的患者中監測疾病進展及/或對治療的反應。
可藉由將標記基因座之數量、大小及/或強度與對應的基線值相比較來進行診斷。基線值可代表未患病個體群體中之平均水準。基線值亦可表示在同一患者中確定之先前水準。例如，可以在開始tau免疫療法治療之前在患者中確定基線值，且之後將測量之值與基線值進行比較。值相對於基線訊號的減小指示對治療的陽性反應。
在一些患者中，可藉由進行PET掃描來輔助tau蛋白病變之診斷。可使用例如習知PET成像器及輔助設備進行PET掃描。掃描通常包括通常已知與tau蛋白沉著物相關聯的一或多個腦部區域以及通常存在很少(如果有的話)沉著物以用作對照的一或多個區域。
在PET掃描中偵測之訊號可表示為多維影像。多維影像可為表示穿過腦部之橫截面的二維、表示三維腦部的三維或表示三維腦部隨時間的變化的四維。可使用具有不同顏色的色標，從而指示不同的標記量且推測性地指示所偵測之tau蛋白沉著物。掃描結果亦可以數字方式呈現，其中數字與偵測之標記量以及因此tau蛋白沉著物之量相關。可將具體tau蛋白病變(例如，阿茲海默氏病)之已知與沉著物相關聯的腦部區域中存在之標記與已知與沉著物無關的區域中存在之標記進行比較，以提供指示前一區域內沉著物程度的比率。對於相同的放射性標記之配體，此類比率提供了不同患者之間的tau蛋白沉著物及其變化的可比較的量度。
在一些方法中，PET掃描與MRI或CAT掃描同時或在同一次患者訪視時進行。MRI或CAT掃描提供比PET掃描多的腦部解剖細節。然而，來自PET掃描的影像可疊加在MRI或CAT掃描影像上，從而更精確地指示相對於腦部解剖結構的PET配體之定位並由此推出tau沉著物之定位。一些機器可執行PET掃描及MRI或CAT掃描，而無需患者在掃描之間改變位置，從而有利於影像之疊加。
合適的PET配體包括本發明之放射性標記之抗體(例如，小鼠、人源化、嵌合或鑲飾3D6抗體)。所使用之放射性同位素可為例如C11 、N13 、O15 、F18 或I123 。投與PET配體與進行掃描之間的間隔可取決於PET配體，且特別是其在腦部的攝取和清除速率以及其放射性標記之半衰期。
PET掃描亦可以作為預防措施在無症狀患者中或在有輕度認知障礙症狀但尚未經診斷為患有tau蛋白病變但發展tau蛋白病變的風險高的患者中進行。對於無症狀患者，掃描特別適用於由於家族史、遺傳或生化風險因素或中老年而被認為處於tau蛋白病變之高風險的個體。例如在45與75歲之間的患者年齡就可以開始預防性掃描。在一些患者中，在50歲時進行第一次掃描。
預防性掃描可以以例如在六個月與十年之間、較佳在1-5年之間的間隔進行。在一些患者中，每年進行預防性掃描。若作為預防措施進行的PET掃描指示異常高的tau蛋白沉著物水準，則可開始免疫療法且隨後進行PET掃描，就像在經診斷為患有tau蛋白病變的患者中那樣。若作為預防措施進行之PET掃描指示tau蛋白沉著物之水準在正常水準內，則可像之前一樣以在六個月與10年之間、且較佳1-5年的間隔，或回應於tau蛋白病變或輕度認知障礙之徵象或症狀的出現而進行另外的PET掃描。若且當偵測到高於正常水準的tau蛋白沉著物時，藉由將預防性掃描與tau定向免疫療法之投與組合，可將tau蛋白沉著物之水準降低至或接近正常水準，或至少抑制進一步增加，且與沒有接受預防性掃描及tau定向免疫療法相比，患者可以保持更長時間不患tau蛋白病變(例如，至少5年、10年、15年或20年，或患者餘生)。
tau蛋白沉著物之正常水準可藉由未經診斷為患有具體tau蛋白病變(例如，阿茲海默氏病)且不被認為處於發展這種疾病之高風險的普通群體中之個體之代表性樣本(例如，50歲以下無疾病個體之代表性樣本)的腦部神經纖維纏結或tau內含物之量來確定。替代地，若已知發展了tau蛋白沉著物的腦部區域中之根據本方法的PET訊號不同於(在測量之準確度內)來自已知此類沉著物通常不發展的腦部區域的訊號，則可在個別患者中識別出正常水準。藉由與正常水準(例如，外部平均值及標準偏差之方差)進行比較，或者簡單地由與已知與沉著物無關的區域相比與tau蛋白沉著物相關聯的腦部區域中超出實驗誤差的升高的訊號，可識別個體中的升高水準。出於比較個體及群體中tau蛋白沉著物之水準之目的，tau蛋白沉著物應較佳在腦部之一或多個相同區域中確定，這些區域包括已知形成與具體tau蛋白病變(例如，阿茲海默氏病)相關聯的tau蛋白沉著物的至少一個區域。具有升高水準的tau蛋白沉著物的患者為開始免疫療法的候選者。
在開始免疫療法後，可首先將tau蛋白沉著物水準的降低視為治療具有所要效果的指示。所觀察之降低可為例如在基線值之1-100%、1-50%或1-25%的範圍內。此類效果可在腦部之已知形成沉著物的一或多個區域中量測，或可由此類區域值平均值量測。治療之總效果可藉由將相對於基線的減少百分比與平均未治療患者中將可能存在的tau蛋白沉著物的增加相加來近似計算。
tau蛋白沉著物在大約恆定水準下的維持或甚至tau蛋白沉著物之少量增加亦可指示對治療的反應，但為次最佳反應。可將此類反應與未接受治療的具有具體tau蛋白病變(例如，阿茲海默氏病)的患者中之tau蛋白沉著物水準的時間過程進行比較，以確定免疫療法是否具有抑制tau蛋白沉著物進一步增加的作用。
tau蛋白沉著物之變化的監測允許回應於治療來調整免疫療法或其他治療方案。PET監測提供對治療的反應的性質及程度之指示。然後，可確定是否調整治療，且若需要，可回應於PET監測來調整治療。因此，PET監測允許在其他生物標誌物、MRI或認知量度已經可偵測地反應之前調整tau定向免疫療法或其他治療方案。顯著變化意謂治療後的參數值相對於基線的比較提供了治療已經或尚未產生有益效果的一些證據。在一些情況下，患者自身中參數值之變化提供了治療已經或尚未產生有益效果的證據。在其他情況下，將患者中之值之變化(如果有的話)與未進行免疫療法的患者之代表性對照群體中之值之變化(如果有的話)進行比較。具體患者中之反應與對照患者中之正常反應的差異(例如，平均值加標準偏差之方差)亦可提供免疫療法方案在患者中達成或未達成有益效果的證據。
在一些患者中，監測指示tau蛋白沉著物之可偵測的減少，但是tau蛋白沉著物之水準仍保持高於正常水準。在此類患者中，若沒有不可接受之副作用，則治療方案可按原樣繼續，或甚至增加投與頻率及/或劑量(若尚未達到最大推薦劑量的話)。
若監測指示患者中tau蛋白沉著物之水準已經降低至tau蛋白沉著物之正常或接近正常的水準，則免疫療法方案可從誘導之方案(即，降低tau蛋白沉著物之水準)調整為維持之方案(即，將tau蛋白沉著物維持在大致恆定的水準)。這種方案可藉由減少投與免疫療法之劑量及/或頻率來實現。
在其他患者中，監測可指示免疫療法具有一些有益效果但為次最佳效果。最佳效果可定義為在開始療法後在給定時間點進行免疫療法的tau蛋白病變患者之代表性樣本所經歷的tau蛋白沉著物之變化的上半部分或四分點之內的tau蛋白沉著物水準的百分比減少(在整個腦部或已知形成tau蛋白沉著物的一或多個其代表性區域中量測或計算)。經歷較小降低的患者或其tau蛋白沉著物保持恆定或甚至增加但程度小於在不存在免疫療法的情況下所預期的程度(例如，如從不投與免疫療法的患者的對照組所推斷的那樣)的患者可被歸類為經歷陽性但次最佳的反應。此類患者可視情況進行方案調整，其中增加了劑之劑量及或投與頻率。
在一些患者中，tau蛋白沉著物可以與未接受免疫療法的患者中之tau沉著物類似或更大的方式增加。若此類增加持續一段時間，諸如18個月或2年，甚至在劑之頻率或劑量的任何增加之後，則可根據需要停止免疫療法，以有利於其他治療。
診斷、監測及調整tau蛋白病變之治療的前述描述主要集中在使用PET掃描。然而，可以使用用於可視化及/或量測適於本發明之tau抗體(例如，小鼠、人源化、嵌合或鑲飾3D6抗體)之使用的tau蛋白沉著物的任何其他技術代替PET掃描來執行此類方法。
亦提供了在患有或易患與tau相關聯的疾病的患者中偵測針對tau的免疫反應的方法。該等方法可用於監測用本文所提供之劑的治療性或預防性治療之過程。被動免疫之後的抗體曲線通常顯示抗體濃度之當前峰，繼之以指數衰減。在無另一劑量之情況下，衰減在數天至數月的時間段內接近治療前水準，其取決於所投與抗體之半衰期。例如，一些人類抗體之半衰期為約20天。
在一些方法中，在投與之前量測個體之針對tau的抗體之基線，之後不久進行第二次量測以確定峰值抗體水準，且間隔地進行一或多次進一步量測以監測抗體水準之衰減。當抗體之水準下降至基線或低於基線的峰值(peak less baseline)之預定百分比(例如，50%、25%或10%)時，投與另一劑量抗體之投與。在一些方法中，將低於背景的峰值或後續量測的水準與先前確定的參考水準進行比較以構成其他個體中有益的預防性或治療性治療方案。若所量測的抗體水準顯著小於參考水準(例如，在受益於治療的個體之群體中小於平均值減一倍或較佳兩倍參考值之標準偏差)，則指示投與額外劑量的抗體。
亦提供偵測個體中之tau的方法，例如藉由量測來自個體的樣品中之tau或藉由個體中之tau之體內成像。此類方法可用於診斷與tau相關聯的疾病或其易感性或者確認其診斷。該等方法亦可用於無症狀個體。tau之存在指示對未來症狀性疾病的易感性。該等方法亦可用於監測先前已經診斷為患有以下疾病的個體中之疾病進展及/或對治療的反應：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
可使獲自患有阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)、疑似患有該等疾病或處於患有該等疾病之風險的個體之生物樣本與本文所揭示之抗體接觸以評估tau之存在。例如，可將此類個體中之tau水準與健康個體中存在的水準進行比較。替代地，可將接受疾病之治療的此類個體中之tau水準與尚未治療以下疾病之個體之tau水準進行比較：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。一些此類測試涉及獲自此類個體之組織的生檢。ELISA檢定亦可為有用的方法，例如，用於評估流體樣本中之tau。VII. 套組
本發明進一步提供包含本文所揭示之抗體及諸如使用說明書(例如，包裝插頁)之相關材料的套組(例如，容器)。使用說明書可含有例如投與抗體及視情況一或多種額外劑的說明書。抗體之容器可為單位劑量、大包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。
包裝插頁係指習慣上包括於治療產品之商業包裝中之說明書，其含有關於涉及此類治療產品之使用之適應症、用法、劑量、投與、禁忌及/或警告之資訊。
套組亦可包括第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可亦包括自商業及使用者觀點看來合乎需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。VIII. 其他應用
抗體可用於在臨床診斷或治療或研究之情況下偵測tau或其片段。例如，抗體可用於偵測生物樣本中tau之存在作為生物樣本包含tau沉著物之指示。抗體對生物樣本之結合可與抗體對對照樣本之結合比較。對照樣本及生物樣本可包含相同組織來源之細胞。對照樣本及生物樣本可自相同個體或不同個體且在相同情況下或在不同情況下獲得。若需要，在多種情況下評估多個生物樣本及多個對照樣本以避免與樣本之間差異無關的隨機變化。然後可在一或多個生物樣本與一或多個對照樣本之間進行直接比較，以確定相對於抗體與一個或多個對照樣本之結合，抗體與一個或多個生物樣本之結合(即，tau之存在)增加、減少還是相同。相對於一或多個對照樣本，抗體與一或多個生物樣本之結合增加指示一或多個生物樣本中存在tau。在一些情況下，抗體結合增加為統計學顯著的。視情況，抗體與生物樣本之結合比抗體與對照樣本之結合高至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
此外，抗體可用於偵測生物樣本中tau之存在，以監測及評價用於治療經診斷為患有以下疾病的患者的治療劑之功效：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。對來自經診斷為患有阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)之患者之生物樣本進行評估以在用治療劑開始療法之前建立抗體與樣本之結合的基線(即，樣本中tau存在之基線)。在一些情況下，在多個情況下評估患者之多個生物樣本以建立與治療無關的隨機變異之基線及量度。隨後以一方案投與治療劑。方案可包括在一段時間內劑之多次投與。視情況，在多個情況下在來自患者之多個生物樣本中評估抗體之結合(即，tau之存在)，以建立隨機變異之量度並顯示出回應於免疫療法的趨勢。隨後比較抗體與生物樣本結合之各種評估值。若僅進行兩次評估，則可在這兩次評估之間進行直接比較，以確定抗體結合(即，tau之存在)在兩次評估之間是增加、減少還是保持相同。若進行多於兩次的量測，則可將量測分析為在用治療劑治療之前開始及在整個療程中進行的時間過程。在抗體與生物樣本之結合(即，tau之存在)減少的患者中，可推斷出治療劑在患者中有效治療以下疾病：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。抗體結合之減少可為統計學顯著的。視情況，結合減少至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。抗體結合之評估可與評估以下疾病之其他徵象及症狀結合進行：阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
抗體亦可用作偵測tau或其片段的實驗室研究的研究試劑。在此類用途中，抗體可用螢光分子、自旋標記分子、酶或放射性同位素標記，且可以具有執行偵測檢定的所有必需試劑的套組形式提供。抗體亦可用於例如藉由親和層析法純化tau或tau之結合搭配物。
上文或下文引用的所有專利文件、網站、其他出版物、登錄號及其類似者皆出於所有目的以全文引用之方式併入，其程度如同各單獨項皆特定且單獨地指示以引用之方式如此併入一樣。若序列之不同版本在不同的時間與登錄號相關聯，則意謂在該申請案之有效申請日期下與登錄號相關聯的版本。有效申請日期意謂實際申請日期或指代登錄號(若適用)的優先權申請案之申請日期中之較早者。同樣，除非另外指示，否則若出版物、網址或其類似者之不同版本在不同時間公開，則意謂在申請案之有效申請日期最早公開的版本。除非另外特定指示，否則本發明之任何特徵、步驟、元件、實施例或態樣可與任何其他者組合使用。儘管已出於清楚及理解之目的藉由說明及實例詳細描述本發明，但明顯的是，可在隨附申請專利範圍之範疇內進行某些改變及修改。實例 實例 1 .   tau單株抗體之鑑別
如下產生針對tau的單株抗體。用含有P301S突變之重組的帶有N末端His標籤的383 a.a.人類tau (4R0N) [免疫原A]或含有P301S突變、缺乏N末端His標籤的重組的383 a.a.人類tau (4R0N) [免疫原B]進行免疫。將免疫原在RIBI佐劑中乳化。
在第0天用25 µg免疫原A且在第7、14、21、27、34、48、55及62天各用10 µg免疫原A對五週齡雌性Balb/c小鼠進行腹膜內免疫。在第76天及第90天用10 µg免疫原B對小鼠進行免疫。在第43天及第98天，將小鼠取血並針對免疫原A進行滴定；在第101天，將具有最高效價之動物用½腹膜內及½靜脈內遞送之50 µg免疫原B之末尾免疫(terminal immunization)進行加強。經由ELISA針對兩種免疫原對融合之融合瘤進行篩選，且將具有最高訊號之陽性融合瘤進行抗原決定位圖譜定位(參見實例2)。3D6對於對應於SEQ ID NO:3之胺基酸殘基199-213及對應於SEQ ID NO:3之胺基酸殘基262-276 (根據tau之最長CNS同功型之編號，這對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基257-271及SEQ ID NO:1之胺基酸殘基320-334)的肽起反應。實例 2. 抗體3D6之抗原決定位圖譜定位
將跨越整個383aa 4R0N人類tau蛋白的一系列重疊生物素化肽用於對鼠3D6抗體進行圖譜定位。使用額外肽來對蛋白之C末端及N末端之潛在轉譯後修飾進行建模。
生物素化肽結合至鏈親和素蛋白塗佈之ELISA盤之單獨孔。將盤封閉並用鼠3D6處理，繼之以與山葵過氧化酶綴合之抗小鼠抗體一起孵育。徹底洗滌後，將OPD施加至盤上並使其顯影。讀取盤在450 nm處的吸光度。用不含一級抗體之孔的吸光度值進行背景扣除，且將陽性結合之臨限設定為0.2個吸光度單位。
對於跨越胺基酸殘基199-213 (SEQ ID NO:3)及胺基酸殘基262-276 (SEQ ID NO:3)的肽偵測到陽性結合。使用全長4R2N人類tau蛋白(441個胺基酸)之編號，這些肽對應於胺基酸殘基257-271 (SEQ ID NO:1)及320-334 (SEQ ID NO:1)。(圖1)實例 3 .   人源化3D6抗體之設計
人源化之起始點或供體抗體為小鼠抗體3D6。成熟m3D6之重鏈可變胺基酸序列提供為SEQ ID NO:7。成熟m3D6之輕鏈可變胺基酸序列提供為SEQ ID NO:11。重鏈Kabat/Chothia複合物CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列分別提供為SEQ ID NO:8-10。輕鏈Kabat CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列分別提供為SEQ ID NO:12-14。始終使用Kabat編號。
3D6之可變κ (Vk)屬於小鼠Kabat第2亞組，其對應於人Kabat第2亞組，且可變重鏈(Vh)屬於小鼠Kabat第2c亞組，其對應於人類Kabat第1亞組[Kabat E.A.等人, (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH出版號91-3242]。在Vk中，16殘基Chothia CDR-L1屬於正則類別4，7殘基Chothia CDR-L2屬於類別1，9殘基Chothia CDR-L3屬於類別1 [Martin A.C及Thornton J.M.(1996) J. Mol.Biol.263:800-15. [Martin及Thornton, 1996]。10殘基Chothia CDR-H1屬於類別1，17殘基Chothia CDR-H2屬於類別2 [Martin及Thornton, 1996]]。CDR-H3沒有歸於正則類別中。對PDB資料庫中之蛋白序列進行搜索[Deshpande N等人, (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7.]以找出可提供3D6之粗糙結構模型的結構。為了建立3D6之Fv模型，使用具有1.4 A之解析度的抗焦麩胺酸-Aβ抗體Fab c#24 (pdb代碼5MYX)[Piechotta, A.等人, 2017, J Biol Chem. 292: 12713-12724]。它保留了與3D6相同的環之正則結構。
3D6 VH之架構與Wedemayer, G. J.等人(1997; Science 276: 1665-1669)設計之人源化48G7 Fab PDB: 2RCS之對應區具有高度的序列相似性。3D6及48G7 fab之可變域之CDR-H1、CDR-H2環亦共有相同的長度。類似地，3D6 VL之架構與由Dafferner, A. J.等人(2017; Direct Submission)選殖之人類抗體ARX71335 VL之對應區具有高度的序列相似性。3D6及ARX71335抗體之可變輕域之CDR-L1、L2及L3環亦共有相同的長度。據此，選擇48G7 VH (2RCS-VH)及ARX71335 VL之架構區作為3D6之CDR之受體序列。建立了接枝至VH及VL的相應人類架構上之3D6 CDR模型且用作進一步回復突變之指導。
使用IMGT Domain GapAlign工具將得自抗體人源化過程之重鏈及輕鏈變異體序列與人類生殖系序列進一步比對，以評估重鏈及輕鏈之人源性(humanness)，如WHO INN委員會準則所概述。(WHO-INN: International nonproprietary names (INN) for biological and biotechnological substances (綜述) (網際網路) 2014。獲自：http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014. pdf)在可能的情況下，將殘基改變為與對應的人類生殖系序列比對，以增強人源性並降低潛在的免疫原性。對於人源化VLvb2及VLvb3變異體，引入突變以使序列更類似於人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)。對於人源化VHvb2、VHvb3、VHvb4、VHvb5、VHvb6及VHvb6變異體，引入突變以使序列更類似於人類生殖系基因IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)
設計hu3D6-VH及hu3D6-VL型式以使能夠評估各種架構殘基之抗原結合、熱穩定性及免疫原性之貢獻，且實現醣化、聚集、N末端異質性、熱穩定性、表面暴露之帶電區塊、表面暴露之電荷區塊、去胺及蛋白酶敏感性之最佳化。考慮突變的位置包括以下位置，其： -     定義正則CDR構形(概述於Martin, A.C.R. (2010) Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains. Kontermann R and Dübel S (編).Antibody Engineering . Heidelberg, Germany: Springer International Publishing AG.)， -     在遊標區域內(Foote J及Winter G. (1992) Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops.J Mol Biol . 224(2):487-99.)， -     定位於VH/VL域界面(概述於Léger OJP及Saldanha J. (2000) Preparation of recombinant antibodies from immune rodent spleens and the design of their humanisation by CDR grafting. Shepherd P and Dean C (編).Monoclonal Antibodies: a Practical Approach . Oxford, UK: Oxford University Press.)， -     易受轉譯後修飾(諸如醣化或焦麩醯胺化)的影響， -     根據接枝至VH及VL架構上的3D6 CDR之模型，由經預測與CDR衝突的殘基佔據，或 -     由在經定序之人類抗體中罕見的殘基佔據，其中親體小鼠3D6殘基或某些其他殘基在人類抗體庫中更為普遍。
顯示鼠3D6及各種人源化抗體之輕鏈可變區(表4及圖3)及重鏈可變區(表3及圖2)之比對。
構築7種人源化重鏈可變區變異體及3種人源化輕鏈可變區，其含有取代之不同排列：hu3D6VHvb1、hu3D6VHvb2、hu3D6VHvb3、hu3D6VHvb4、hu3D6Hvb5、hu3D6VHvb6或hu3D6VHvb7 (分別為SEQ ID NO:76-80及90-91)；及hu3D6VLvb1、hu3D6VLvb2或hu3D6VLvb3 (分別為SEQ ID NO:83-85)(表3及表4)。具有基於所選擇之人類架構的回復突變及其他突變的示範性人源化Vk及Vh設計分別顯示於表3及表4。表3及表4中之粗體區域指示如Kabat/Chothia複合物所定義之CDR。SEQ ID NO:76-80及SEQ ID NO:90-91含有如表5所示之回復突變及其他突變。hu3D6VHvb1、hu3D6VHvb2、hu3D6VHvb3、hu3D6VHvb4、hu3D6VHvb5、hu3D6VHvb6及hu3D6VHvb7中各位置處的胺基酸列出於表6。hu3D6VLvb1、hu3D6VLvb2及hu3D6VLvb3中各位置處之胺基酸列出於表7。
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在小鼠與人類受體序列之間正則、遊標或界面殘基不同的位置為取代候選。正則/CDR相互作用殘基之實例包括表3中之Kabat殘基H54及H94。遊標殘基之實例包括表3中之Kabat殘基H28、H67、H93及H94。界面/堆積(VH+VL)殘基之實例包括表3中之Kabat殘基H91及H93。
選擇重鏈可變區中表3中所指示之位置作為取代候選的基本原理如下。重鏈可變區 hu3D6VHvb1 -     由接枝至48G7-VH (RCS-VH)架構上的3D6-VH之CDR-H1、H2及H3環組成，在位置H91 (Y91F)，H93 (A93S)及H94 (S94T)處具有回復突變。hu3D6VHvb2 -     在對於定義Chothia正則類別來說為關鍵、為遊標區域之一部分或定位於VH/VL域界面或有助於結構穩定性的位置處，還原所有架構取代。3D6-VH_vb2併入回復突變或取代Q1E、Q5V、L11V、L20I、T23K、K38R、E42G、Q43K、K66R、S75T、N76D、Q81E,Y91F、A93S、S94T、T108L及L109V，以使能夠評估這些位置對抗原結合親和力及免疫原性的貢獻。hu3D6VHvb3 、 hu3D6VHvb4 、 hu3D6VHvb5 、 hu3D6VHvb6 及 hu3D6VHvb7
由進一步取代組成，且任一者增加抗體穩定性及/或最佳化醣化、聚集、N末端異質性、熱穩定性、表面暴露之帶電區塊、表面暴露之電荷區塊、去胺及蛋白酶敏感性。
Q1E：為減輕焦麩胺酸形成潛力的穩定性增強突變(Liu, 出處同前)。
Q5V：為基於頻率且生殖系對齊的突變。Val為人類序列中此位置處最頻繁的。Val在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
L11V：為生殖系對齊的突變。Val在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
S17T：為生殖系對齊的突變。Thr在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
L20I：為生殖系對齊的突變。Ile在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
T23K：為基於頻率且生殖系對齊的突變。Lys為此位置處更頻繁的。Lys在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
N28T：這為Thr之CDR-H1殘基取代。
K38R：為基於頻率的回復突變。Arg為此位置處最頻繁的。預測在此位置處的Arg除了在重鏈中與Asp86及Tyr 90各自形成一個H鍵外還與Glu 46形成兩個H鍵；因此，在此位置處，Arg取代與Lys相比可增強穩定性。
E42G：為基於頻率且生殖系對齊的突變。Gly在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。Gly為此位置處最頻繁的。預測Gly取代不影響穩定性。
Q43K：預測在此位置處的Lys側鏈除了主鏈與Gln 39及Arg 40形成H鍵外還與G42形成H鍵，由此在此位置處，Lys取代與Q相比可增強穩定性。
N54D及D56E為CDR殘基之取代且根據同源性模型，經預測為非抗原接觸位置。預測N54D及D56E取代穩定抗體結構。
V58I：為CDR-H2殘基之取代。生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)在此位置處具有Ile。預測此殘基不接觸抗原。
K66R：預測在此位置處的Arg除了與Asp 86形成H鍵及鹽橋外還與Ser 82a及Thr 83形成H鍵。
A67V：為遊標區域殘基之取代。生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)在此位置處具有Val。
S75T：預測在此位置處的Ser與Asp 72及Tyr 76形成H鍵。預測在此位置處的Thr亦進行這些接觸，但為表面暴露之殘基Thr可增強抗體穩定性。
N76D：Asp為生殖系對齊的突變。Asp在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
L80M：Met為生殖系對齊的突變。Met在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
Q81E：預測Glu與K19形成H鍵加鹽橋，因此在此位置處的Glu增強抗體穩定性。
T83R增強熱穩定性並增加人源性。Arg為生殖系對齊的突變。Arg在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。Arg為此位置處最頻繁的。
F91Y：為界面殘基之突變且為基於頻率的回復突變。Tyr通常在此位置處且可增強抗體穩定性。
A93S：為遊標區域及界面區域殘基之回復突變。
S94T：為Chothia定義之正則結構殘基及遊標殘基之回復突變。
T108L：Leu為生殖系對齊的突變。Leu在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。預測在此位置的Leu使抗體之免疫原性降低且對抗體穩定性沒有影響。
L109V：為基於頻率的突變。Val為此位置處最頻繁的。
選擇輕鏈可變區中表4中所指示之位置作為取代候選的基本原理如下。κ 輕鏈可變區 hu3D6VLvb1 -     由接枝至ARX71335 VL架構上之3D6-VL之CDR-L1、L2及L3環組成。hu3D6VLvb2 及hu3D6VLvb3 -     在對於定義Chothia正則類別來說為關鍵且為遊標區域之一部分或定位於VH/VL域界面性的位置處，還原所有架構取代。Hu3D6-VLvb2及Hu3D6-VLvb3亦包括有助於結構穩定性的取代。hu3D6-VL_vb2併入回復突變T7S、I15L、L83V、H86Y及L106I，以使能夠評估這些位置對抗原結合親和力及免疫原性的貢獻。 Hu3D6-VL_vb3針對vb2提及之所有取代連同在Q17E、K24R、L37Q、K45R及L106I處之額外變化
T7S:為生殖系對齊的突變。Ser在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
T10S：為基於頻率且生殖系對齊的突變。Ser為此位置處頻繁的。Ser在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
I15L：為生殖系對齊的突變。Leu在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
Q17E：預測在此位置處的Glu與T14形成H鍵並與Lys 107形成鹽橋(T14及Lys 107兩者均為輕鏈殘基)並增強抗體穩定性。
K24R：為CDR殘基之突變。預測Lys及Arg均與輕鏈中之Asp 70形成H鍵及鹽橋。預測Arg之構形更適合。Arg亦為生殖系對齊的突變。Arg在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
L37Q：預測此為深埋殘基，預測Leu不與周圍殘基相互作用，而預測Gln與輕鏈中之Q38及Asp 82形成H鍵。Gln亦為生殖系對齊的突變。Gln在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
K45R：儘管預測Lys與S56計Gly 57形成H鍵；但預測之Arg與相鄰殘基的相互作用廣泛得多，因為預測其與D55形成鹽橋，與Arg46形成H鍵且與S56形成雙H鍵。Arg亦為生殖系對齊的突變。Arg在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
L83V：此為預測為表面暴露的殘基之基於頻率的突變。Val亦為生殖系對齊的突變。Val在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
H86Y：鼠3D6 VL在此位置處具有Tyr。Tyr亦為此位置處最頻繁的殘基。
A100Q：Ala為此位置處罕見的。預測Ala為表面暴露之殘基且預測去不與周圍殘基相互作用。Gln為此位置處最頻繁的且亦為生殖系對齊的突變。Gln在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。預測Gln與Ser 7形成H鍵，使鏈內穩定。
L106I：為基於頻率且生殖系對齊的突變。Ile為此位置處最頻繁的。Ile在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ (ID NO: 27)中在此位置處。
基於這些人類架構的設計為：重鏈可變區 ＞hu3D6VHvb1 (SEQ ID NO:76) QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTVYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTTLTVSS ＞hu3D6VHvb2 (SEQ ID NO:77) EVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPENGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLELSSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSS ＞hu3D6VHvb3 (SEQ ID NO:78) EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPENGDTIYDPKFQGRATITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVTVSS hu3D6VHvb4 (SEQ ID NO:79) EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPENGDTIYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVTVSS ＞hu3D6VHvb5 (SEQ ID NO:80) EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPEDGETIYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVTVSS ＞hu3D6VHvb6 (SEQ ID NO:90) EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPEDGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSS ＞hu3D6VHvb7 (SEQ ID NO:91) EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFTIKDYYLHWVRQRPGKGLEWIGWIDPEDGETVYDPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCSTLDFWGQGTLVTVSSκ 輕鏈可變區 hu3D6VLvb1 (SEQ ID NO:83) DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVHYCWQGTHFPYTFGAGTKLELK ＞hu3D6VLvb2 (SEQ ID NO:84) DVVMTQSPLSLSVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGAGTKLEIK ＞hu3D6VLvb3 (SEQ ID NO:85) DVVMTQSPLSLSVTLGEPASISCRSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK
使用兩階段PCR方案生成人源化序列，該方案允許使用QuikChange定點誘變引入多個突變、缺失及插入[Wang, W.及Malcolm, B.A.(1999) BioTechniques 26:680-682]。實例 4. 小鼠單株抗體在ELISA檢定中結合tau
方法：間接ELISA：96孔聚苯乙烯盤用懸浮於1xPBS中的捕獲抗體抗6xHis (圖4A)或多株抗tau (Dako #A0024，圖4B)塗佈，在室溫下持續2 h或在4℃下持續16 h。移除塗層，將各盤用在1xPBS中之1% BSA封閉1 h，接著與人類重組tau一起孵育，其中在蛋白之N末端具有聚組胺酸標籤(圖5A)或不具有聚組胺酸標籤(圖4B)。洗滌後，將各盤與指示之抗體一起孵育、洗滌並與HRP綴合之山羊抗小鼠二級抗體一起孵育。用TMB使各盤顯影，並且用盤讀數器量測A450 。
夾心ELISA：96孔聚苯乙烯盤用在1xPBS中之抗小鼠抗體塗佈，在室溫下持續2 h或在4℃下持續16 h。移除塗層，且將各盤用在1xPBS中之1% BSA封閉1 h。接著將盤與稀釋於在1xPBS中之0.1% BSA中的相同濃度的指示之抗體一起孵育。依次用人類tau、多株兔抗tau (Dako# A0024)及HRP綴合之山羊抗兔抗體(均稀釋於在PBS中之0.1% BSA中)對各盤進行處理，其中各步驟之間存在洗滌。添加鏈親和素-HRP，用TMB使各盤顯影，且用盤讀數器量測A450 。參見圖4C。
結果：經由多種不同的ELISA格式檢定一組融合瘤產生之抗體之與tau的結合。使用間接格式，使用藉由其N末端融合之聚組胺酸標籤固定之tau蛋白確認tau之偵測(圖4A)。亦確認了與天然不帶標籤的蛋白之結合(圖4B)。為了評估各種抗體之溶液親和力，使用夾心ELISA格式，其中使用所測試之融合瘤抗體作為捕獲試劑(圖4C)。實例 5. 小鼠單株抗體與tau之親和力
方法：使用Biacore T200進行SPR分析以確定鼠抗體與重組人類tau之結合動力學。為了製備感測器表面，經由胺偶聯將抗小鼠抗體(GE Life Sciences)固定在感測器晶片CM5上，並以一定水準捕獲抗體以確保最大結合為50 RU。在運行緩衝液(HBS + 0.05% P-20，1 mg/mL BSA)中，使在10-0.14 nM範圍內的各種濃度的重組tau以50 µL/min的流速經過捕獲之配體，進行180 sec締合及900 sec解離。資料雙重參考不含抗體配體之不相關感測器及0 nM分析物濃度，以考慮到配體與捕獲部分的解離。然後使用全域1:1擬合對資料進行分析。
結果：基於抗體在一連串ELISA檢定中之表現選擇多種鼠抗體，並經由SPR評估它們結合親和力。以平行組測試抗體，並比較其結合締合及解離速率，以選擇重組人類tau之最高結合物。在抗體殖株3D6中觀察到最高的結合親和力。結合親和力顯示於圖5。實例 6. 小鼠單株抗體防止人類tau與永生化神經元細胞表面之結合 方法：用抗Tau單株抗體抑制Tau與B103神經母細胞瘤細胞之結合 1.   將B103細胞以5×105 個細胞/mL重懸於PBS中。在MSD High Bind盤中每孔鋪板50 µL細胞懸浮液。此舉得到25K個細胞/孔。蓋上盤並使細胞在37℃、5% CO2 下貼附2 h。 2.   細胞貼附後，藉由翻轉盤並輕輕敲打來從孔中移除PBS，以移除過量的緩衝液。向各孔中添加50 µL在PBS中之3% MSD封閉劑A或其他合適的封閉緩衝液，且在沒有振盪之情況下將盤在室溫下孵育1 h。 3.   在盤封閉步驟期間，如下共同孵育Tau及抗Tau抗體： a.   以2 mg/mL的抗Tau抗體開始，且在PBS中1:2連續稀釋，以得到7份額外稀釋液。 b.   將Tau在PBS中稀釋至20 nM。各孔中之Tau濃度將為恆定的。 c.    將Tau及抗Tau抗體1:1混合，以得到10 nM最終Tau濃度及1 mg/mL抗Tau起始濃度。 d.   在振盪(600 rpm)之情況下將混合物在室溫下孵育大約1 h。 4.   在盤封閉(步驟2)後，藉由將翻轉盤並輕輕敲打來從孔中移除封閉緩衝液，並且使用多通道移液管用PBS洗滌盤2x。確保過量的緩衝液經完全移除。將鋪板之細胞冷卻至4℃，之後添加Tau:抗Tau複合物。 5.   將50 µL冷卻複合物(步驟3)添加至鋪板之細胞中並在冰上孵育30分鐘。 6.   如先前所述用冰冷的PBS洗滌盤2x。 7.   每孔添加50 µL 16B5.SULFO-TAG，以用於偵測細胞表面結合之Tau。在冰上孵育30分鐘。 8.   再次如先前所述用冰冷的PBS洗滌盤2x。 9.   每孔添加150 µL 1X無界面活性劑的讀數緩衝液T (稀釋於H2 O中)並立即在MSD SECTOR™ 600儀器上讀取。添加讀取緩衝液時避免引入氣泡。 10.  報告MSD訊號對抗Tau之濃度。
所測試之抗體為抗tau抗體3D6、16G7、3H9、4C5及5G8以及同型對照。 結果：
隨著測試抗體之遞增而發生SulfoTag抗tau訊號之遞減指示tau與神經元細胞表面之結合之功能性阻斷。在同型對照、16G7或3H9之情況下未觀察到阻斷。在4C5、5G8及3D6之情況下觀察到功能性阻斷活性之量遞增。3D6展示出所測試之抗體之最深阻斷活性。參見圖6。實例 7. 解聚活性
方法：重組tau之聚集：將具有N末端6xHis標籤之經純化之重組tau與等莫耳量的低分子量肝素在1xPBS (pH 7.4)中組合，並在章動器上於37℃下孵育96 h。藉由與硫磺素T之結合確認樣本之聚集。
與抗體一起孵育：將抗體與聚集之重組tau以指示之莫耳比一起孵育，在沒有旋轉或章動之情況下在37℃下孵育96 h。在實驗結束時，藉由將樣本與25 mM硫磺素T一起孵育並量測發射之螢光(450/482 ex/em)來量測聚集。將訊號背景扣除至緩衝樣本。
結果：如圖7所示，3D6優先分解完整tau原纖維。將不同莫耳比的3D6 (三角形)、同型對照(圓圈)及16G7 (方形)與含有類澱粉之tau原纖維一起孵育96小時。在這一時間段結束時，藉由與硫磺素T之結合評估聚集程度。與同型對照抗體以及16G7 (結合tau之不同區的抗tau抗體)相比，3D6優先降低樣本中存在之硫磺素T訊號。實例 8. 3D6及5G8免疫捕獲來自人類疾病組織的tau。
方法：將高鹽可溶性蛋白級分製備成1 mg/ml。對於各免疫沉澱，使用200 µg的樣本。將10 µg的指示之抗體(同型對照、3D6或抗tau抗體5G8)添加至高鹽樣本製備物中，並孵育2 h。然後將蛋白G磁珠添加至混合物中，且再孵育一小時以捕獲抗體/抗原複合物。用1xPBS徹底洗滌樣本，並將珠粒在還原/變性樣本緩衝液中煮沸以釋放捕獲之蛋白。藉由SDS-PAGE解析所得樣本，並使用多株抗tau抗體(Dako，#A0024)進行西方墨點法。
結果：如圖8所示，3D6及5G8免疫沉澱來自阿茲海默氏病組織之tau。用指示之抗體使高鹽可溶性級分免疫沉澱，並用針對tau分子之單獨區之多株抗tau抗體從3D6及tau抗體A之結合位點偵測。3D6從此級分強健地捕獲tau。輸入(高鹽可溶性樣本)顯示在右側。實例 9. 3D6之免疫組織化學免疫反應性
自在死後評估時確認沒有神經退化性疾病或患有阿茲海默氏病的患者中獲得額顳葉皮質。對輕度丙酮固定之10 um載玻片安裝之冷凍切片進行免疫組織化學。使用Leica消耗品，使用Leica BOND Rx自動染色儀進行所有染色步驟。將3D6之鼠或人類形式與組織切片一起孵育，接著添加綴合於HRP聚合物的物種適當的二級抗體。當在人類組織上使用人源化抗體時，為了防止內源免疫球蛋白之非特異性結合，在體外用生物素綴合之抗人類單價Fab片段非共價標記抗體，之後在組織上孵育。使用抗生物素蛋白-生物素擴增系統(Vector Laboratories, Burlingame, CA)進一步擴增用一級抗體-生物素Fab片段複合物標記之組織。用DAB色素原使染色可視化，產生褐色沉著物。陰性對照由用IgG同型對照抗體對相鄰切片進行整個免疫組織化學程序組成。
所測試之抗體為鼠CD6、嵌合3D6 (其含有來自具有人類恆定區、重鏈SEQ ID NO:72及輕鏈SEQ ID NO:73的鼠抗體之VH和VL)以及人源化變異體hu3D6VHv5/hu3D6VLv2。
對用3D6之鼠、嵌合及人源化形式進行之染色進行定性比較並評估染色之強力及強度，以及免疫反應性之定位。對於3D6之嵌合及人源化形式，染色強度為相似的，且與抗體之鼠形式相比表現出相似的定位模式。在神經纖維纏結、原纖維、神經纖維網線以及退化軸突中偵測到tau。亦偵測到明顯的神經元體細胞(somal)染色。實例 10. 人源化變異體對tau的親和力
方法：間接ELISA：將96孔聚苯乙烯盤用懸浮於1xPBS中的人類重組tau塗佈，在室溫下持續2 h或在4℃下持續16 h。移除塗層，且將各盤用在1xPBS中之1% BSA封閉1 h。將在1xPBS中之0.1% BSA中的1 µg/mL人源化變異體抗體添加至盤，持續1小時，然後洗滌且添加HRP綴合之山羊抗人類抗體。用TMB使各盤顯影，並且用盤讀數器量測A450 。
夾心ELISA：96孔聚苯乙烯盤用在1xPBS中之抗人類抗體塗佈，在室溫下持續2 h或在4℃下持續16 h。移除塗層，且將各盤用在1xPBS中之1% BSA封閉1 h。將稀釋於在1xPBS中之0.1% BSA中的各種濃度的人源化變異體抗體添加至盤，持續1小時，然後洗滌且添加稀釋於在1xPBS中之0.1% BSA中的生物素化重組人類tau。洗滌後，添加鏈親和素-HRP，用TMB使各盤顯影，且用盤讀數器量測A450 。
使用Biacore T200進行SPR分析以確定h3D6-VHv5-L2與重組人類tau之結合動力學。為了製備感測器表面，經由胺偶聯將抗人類抗體(GE Life Sciences)固定在感測器晶片CM5上，並以一定水準捕獲人源化變異體抗體以確保最大結合為50 RU。在運行緩衝液(HBS + 0.05% P-20，1 mg/mL BSA)中，使在10-0.14 nM範圍內的各種濃度的重組tau以50 µL/min的流速經過捕獲之配體，進行180 s締合及900 s解離。資料雙重參考不含抗體配體之不相關感測器及0 nM分析物濃度，以考慮到配體與捕獲部分的解離。然後使用全域1:1擬合對資料進行分析。實例 11 hu3D6VLv2輕鏈可變區之免疫原性
使用iedb.org去免疫工具分析hu3D6VLv2輕鏈可變區之胺基酸序列(SEQ ID NO:21)(Dhanda等人, Immunology. 2018 Jan;153(1):118-132)。表9顯示了可以選擇用於hu3D6VLv2之去免疫的肽，即表明可進行進一步取代以降低潛在免疫原性的區域。
Figure 02_image031
基於表9中所示之分析結果，設計hu3D6VLv2輕鏈可變區之變異體，其靶向表10中粗體顯示之胺基酸殘基。各變異體均併入以下胺基酸取代之一，如表11所示。
Figure 02_image033
Figure 02_image035
設計hu3D6VLv2輕鏈可變區之其他變異體，如表12所示，其在表10中突出顯示之一或兩個胺基酸殘基處併入取代。表12中之一些變異體亦併入取代L37Q  (SEQ ID NO:119-135及145)或者取代L37Q及取代G100Q (SEQ ID NO:136-142)。
如表12及表13中所指示選擇輕鏈可變區中之位置L37Q及G100Q作為取代候選的基本原理如下。
L37Q為增加序列之人源性的突變。Gln為生殖系對齊的突變。Gln在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)中在此位置處。
G100Q為增加序列之人源性的突變。Gln為生殖系對齊的突變。Gln在人類生殖系基因IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)中在此位置處。
Figure 02_image037
Figure 02_image039
hu3D6VLv2輕鏈可變區之額外變異體經設計為併入L37Q (SEQ ID NO:143)或併入G100Q (SEQ ID NO:144)，如表13所示。
Figure 02_image041
圖10A、圖10B、圖10C及圖10D顯示3D6抗體之人源化型式之輕鏈可變區之比對：hu3D6VLv2 (SEQ ID NO:21)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、 hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)及hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)。實例 12 hu3D6VHv1bA11 (重鏈可變區)之免疫原性
設計hu3D6VHv1bA11 (亦稱為h3D6Hu5)(SEQ ID NO:18)之額外重鏈可變區變亦體，如表14所示。
圖9A及圖9B顯示鼠3D6之重鏈可變區(SEQ ID NO:7)及3D6抗體之人源化型式(hu3D6VHvb1、hu3D6VHvb2、hu3D6VHvb3、hu3D6VHvb4、hu3D6VHvb5、hu3D6VHvb6、hu3D6VHvb7、hu3D6VHv1bA11、h3D6VHvb8及h3D6VHvb9)與人類生殖系重鏈可變區序列IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)以及與人類受體重鏈可變區序列2RCS VH hFrwk (SEQ ID NO:75)之比對。hu3D6VHvb1為SEQ ID NO:76，hu3D6VHvb2為SEQ ID NO:77，hu3D6VHvb3為SEQ ID NO:78，hu3D6VHvb4為SEQ ID NO:79，hu3D6VHvb5為SEQ ID NO:80，hu3D6VHvb6為SEQ ID NO:90，hu3D6VHvb7為SEQ ID NO:91，hu3D6VHv1bA11為SEQ ID NO:18，h3D6VHvb8為SEQ ID NO:146且h3D6VHvb9為SEQ ID NO:148。
Figure 02_image043
選擇重鏈可變區中表14中所指示之位置作為取代候選的基本原理如下。
D60E：減少潛在蛋白水解。已知Asp-Pro模體為潛在的蛋白水解切割位點。在hu3D6VHv1bA11 (h3D6Hu5) VH中在Kabat位置60-61處存在Asp-Pro模體。基於同源性模型，在位置60處的Glu取代被視為構形保守的。因此，進行D60E取代以減少潛在蛋白水解。
Q81E，增強熱穩定性並增加人源性。預測Glu與K19形成H鍵加鹽橋，因此在此位置處的Glu增強抗體穩定性。Glu為生殖系對齊的突變。Glu在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
L82cV減少免疫原性。使用IEDB (免疫抗原決定位資料庫)免疫原性分析工具對人源化hu3D6VHv1bA11 (h3D6Hu5)免疫原性之電腦模擬分析預測包括L82c的潛在免疫原性肽。設計L82cV 取代以減少免疫原性。在此位置處的纈胺酸取代保存環構形。
L80M，減少免疫原性並增加人源性。Met為生殖系對齊的突變。Met在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。
T83R增強熱穩定性並增加人源性。Arg為生殖系對齊的突變。Arg在人類生殖系基因IMGT# IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)中在此位置處。Arg為此位置處最頻繁的。實例 13 人源化3D6變異體之分析
分析了具有預測之去免疫取代的人源化3D6變異體之若干特徵，包括靶標結合親和力、在基於細胞之檢定中之活性、熱穩定性、表現特徵及取代數。在所有情況下，將結果與親體序列hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2相比較，以確定是否發現任何活性或穩定性損失。
使用Biacore T200進行靶標結合分析，以比較人源化3D6變異體與重組人類4R0N tau之結合親和力。經由胺偶聯將抗人類Fc抗體固定於感測器晶片CM3上，並將人源化3D6變異體捕獲至等效水準。將各種濃度的重組4R0N人類tau蛋白(範圍為0.02 nM至12.5 nM)在運行緩衝液(HBS + 0.05% P-20，1 mg/mL BSA)中以50 μL/min通過捕獲配體，以單循環之形式進行180秒締合/420秒解離。將資料空白扣除至不含抗體之不相關感測器及0 nM分析物濃度。用與Biacore評估軟體使用全域1:1擬合進行分析。
親和力確定揭示許多保留了親體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2之親和力的去免疫變異體，其可藉由將各抗體之KD 與親體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2之KD 進行比較來確定。經確定KD 相當於hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2之4倍內的抗體(表15)包括hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4、hu3D6VHv1bA11/ L2-DIM9、hu3D6VHv1bA11/L2-DIM5、hu3D6VHv1bA11/ L2-DIM3、h3D6VHvb8/L2-DIM4、hu3D6VHv1bA11/L2-DIM7、h3D6VHvb8/L2-DIM7、h3D6VHvb8/L2-DIM8、hu3D6VHv1bA11/L2-DIM12、hu3D6VHv1bA11/L2-DIM21及hu3D6VHv1bA11/L2-DIM22。hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4顯示出優於親體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2的親合力改善，如藉由締合速率、解離速率及Kd數所證明。
Figure 02_image045
另外，作為次要特徵，分析所有去免疫變異體之熱穩定性及效價。基於親和力量測值，比較與hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2相當的抗體之熱穩定性及效價水準，且基於與hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2之Tm 之變異按順序列出表16中之抗體。
使用微差掃描熱量法(DSC)確定熱穩定性值。使用VP-Capillary DSC系統(Malvern)進行所有DSC掃描。所有樣本均在1xPBS中製備成0.5 mg/mL並參考1xPBS。將大約0.5 mL蛋白溶液及緩衝液引入樣本及參考池中。熱量法掃描速率為在恆壓下自25℃至110℃以60℃/小時的掃描速率進行。使用origin軟體進行分析。報導之值為記錄Fab峰的最大熱容量時的溫度。
如下確定效價。在293懸浮細胞中表現之後，利用標準方法使用蛋白A層析法純化抗體。純化後，將抗體交換至1xPBS中並藉由在280 nm處的吸光度確定蛋白濃度。藉由將純化蛋白之最終產量除以表現培養物之起始體積來計算效價，並以毫克每公升報導。hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4顯示出優於親代hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2的較高熱穩定性及效價。熱穩定性及瞬時表現水準(效價)均為藥物開發之重要考慮因素。
Figure 02_image047
基於對上文所列出之實驗值之分析，選擇表16中之七種抗體之中和活性，以用於在基於細胞之tau內化模型中進一步分析：指出重鏈及輕鏈中相對於親體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2的取代。
進行採用螢光活化細胞分選(FACS)的內化檢定，以評估各種抗體阻斷tau之神經元內化的能力。阻斷內化的抗體可能阻斷tau之傳播。
藉由將重組全長tau與等莫耳量低分子量肝素一起在37℃下孵育3天生成可溶性tau聚集體。孵育後，藉由在10,000xg 下離心15分鐘來分離不可溶及可溶性tau。然後藉由製備型粒徑排阻層析法解析上清液，且收集聚集體峰(大於100 kDa)並濃縮。為了量測內化，用pHrodo Red琥珀醯亞胺酯標記可溶性聚集體級分，從而當內化至溶酶體途徑時發出螢光。
pHrodo標記之4R0N人類tau P301L可溶性寡聚物(最終濃度為1.5 µg/ml)與抗tau抗體(劑量滴定：起始濃度為80 µg/ml，繼之以4倍連續稀釋)一起在細胞培養基中於室溫下預孵育30 min。然後將Tau/抗體混合物以500,000個細胞/ml最終濃度添加至B103神經母細胞瘤細胞株中並在組織培養孵育器(5% CO2 )中在37℃下孵育3-4 h。然後用培養基將細胞洗滌3x，繼之以進行10分鐘培養基孵育並用FACS緩衝液(在PBS中之1% FBS)洗滌2x。將細胞重懸於100 µl FACS緩衝液中，並藉由FACS LSR II量測德克薩斯紅(Texas Red)平均螢光強度。來自pHrodo之德克薩斯紅螢光藉由在內化時與溶酶體區室(endolysosomal compartment)相關聯的低pH值激活。因為FACS偵測出細胞且pHrodo僅在內化時發螢光，所以將僅偵測由細胞內化之tau。平均螢光強度越低，內化之tau之量越少，表明所測試之抗體之阻斷活性更高。
除hu3D6VHv1bA11/L2-DIM22外，所有經測試之變異體皆顯示出在tau內化模型中在當量濃度下高度的抑制活性(圖11及表17)。
Figure 02_image049
實例 14 3D6之抗原決定位圖譜定位之細化
初始肽圖譜定位指示，3D6之抗原決定位在微管結合重複序列區(MTBR，圖1)中。此外，肽圖譜定位指示，3D6結合MTBR內之多個位點，表明抗原決定位重複且不連續。
因為用於抗原決定位研究的初始肽圖譜利用不含有完整微管結合重複序列之重疊肽重疊，所以用個別完整微管重複序列進行額外的肽圖譜定位。將對應於MTBR重複序列1-4之胺基酸的生物素化肽添加至鏈親和素塗佈之ELISA盤、洗滌並在1% BSA/PBS中封閉。然後在盤上孵育不同量的3D6 (範圍為50 ug/ml-10 ng/ml)。洗滌後，將山羊抗小鼠HRP添加至ELISA盤、洗滌並使用OPD顯影。在490 nm處偵測吸光度，並使用4參數對數曲線擬合結合曲線以確定EC50值(表18)。3D6相對當量地結合MTBR 1-3，EC50值分別為72.5、35.5及25.1 ng/ml。但是，與MTBR 4之結合低大約60-170倍，表觀EC50為4309 ng/ml。來自MTBR 1、2、3及4之MTBR 4中之重複抗原決定位之序列變異可解釋與MTBR 4之結合較弱。
Figure 02_image051
為了更清楚地闡明負責3D6結合的特定胺基酸，使用肽NVKSKIGSTENLKHQPG (SEQ ID NO:184)進行經由微陣列之取代圖譜定位，該肽為使用全長tau同功型之編號的殘基255-271之序列。該檢定將肽序列中之各胺基酸皆交換為所有20個胺基酸，以高精確度地確定3D6之核心抗原決定位。用所有肽一式三份地連同HA對照肽一起印刷微陣列，以確保檢定性能。為了進行檢定，將陣列在封閉緩衝液中與3D6 (10 ug/ml)一起孵育，用PBS-T洗滌，接著與綴合於DyLight-680之山羊抗小鼠二級抗體一起孵育。此外，將微陣列與直接綴合於DyLight-800之抗HA抗體12CA5一起孵育。使用LiCor掃描儀掃描微陣列，並對三次重複之強度取平均。
藉由確定當天然殘基經突變時損失之3D6結合與所有其他19個胺基酸之總和之比率來計算各殘基之取代效果。結果繪製在圖12A中。結合之損失大於50% (虛線)表示3D6結合之重要殘基。探針肽(441aa同功型之殘基255-271)與3D6之結合揭示具有保守核心模體KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)之抗原決定位取代模式，由可變N末端及C末端段NVKS (SEQ ID NO:189)及QPG (SEQ ID NO:190)加框，這兩者對於結合來說均不重要。在此核心抗原決定位中，不允許取代的殘基為Lys5 、Asn11 及His14 ；此外，位置13證明對除Lys及His以外的殘基的取代耐受性降低。除這些重要的殘基之外，Ser8 僅允許有限的取代。如圖12B所示，這導致KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)之不連續抗原決定位。tau微管結合重複序列之相關區段以對齊方式呈現，重要的3D6結合殘基經突出顯示。當與tau中之微管重複序列比較時，所有重複序列中皆存在重要的殘基，除了核心抗原決定位中之倒數第二個位置(K/H，由^指示)。在此位置中，重複序列4含有蘇胺酸，其可能負責較低的3D6 ELISA結合。核心抗原決定位限定於KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188，SEQ ID NO:1之殘基259-268，MBTR重複序列1中)、KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192，SEQ ID NO:1之殘基290-299，MBTR重複序列2中)、KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193，SEQ ID NO:1之殘基321-330，MBTR重複序列3中)，較少結合位於KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194，SEQ ID NO:1之殘基353-362，MBTR重複序列4中)。 實例15   小鼠3D6結合來自阿茲海默氏病患者之患者樣本，免疫組織化學實驗
將新鮮的冷凍人腦樣本(約0.5 g)之解剖塊埋入OCT中，且使用極冷恆溫器切割以產生10 μm切片。在疊氮化鈉存在下，將切片放置於葡萄糖氧化酶及βD-葡萄糖溶液中，以封閉內源性過氧化物酶。一旦組織切片經製備，便按照製造商之說明書，使用抗小鼠聚合物及基於DAB之偵測套組(Leica BOND細化偵測套組)以在指示之濃度下用3D6對它們進行染色。結果顯示於圖13中。
在AD組織中，3D6結合tau中標誌性病理特徵，包括神經纖維纏結以及營養不良神經突。此外，3D6結合可溶性細胞內tau；這藉由正常健康對照組織中存在之染色而明顯。實例 16 小鼠3D6結合可溶性tau聚集體，交聯高質量MALDI質譜實驗
為了確定3D6是否結合單個或多個tau次單元，利用交聯高質量MALDI質譜法評估結合化學計量。交聯實現非共價相互作用之直接分析。藉由將含有非共價相互作用的蛋白樣本與交聯混合物混合(Bich, C等人, Anal. Chem., 2010, 82 (1), 第172-179頁)，有可能以高靈敏度特異性偵測非共價複合物。在此檢定中，測試3D6與可溶性tau聚集體之相互作用。藉由將重組全長tau與等莫耳量低分子量肝素一起在37℃下孵育3天生成可溶性tau聚集體。孵育後，藉由在10,000xg 下離心15分鐘來分離不可溶及可溶性tau。然後藉由製備型粒徑排阻層析法解析上清液，且收集聚集體峰(大於100 kDa)並濃縮。
將3D6與各種比率的可溶性tau聚集體混合，並藉由高質量MALDI質譜法進行偵測。此外，進行個別組分之對照實驗，以實現所偵測之峰之正確標記。在線性陽性模式下用具有標準氮雷射之HM4相互作用模組(CovalX)進行分析，集中於0-1500 kDa之質量範圍。
結果顯示於圖14中。在對照(未交聯)結果中，tau及3D6分別經偵測為40.93及146.938 kDa之個別實體。然而，當交聯時，3D6之抗體峰消失，而出現了兩個新峰，表示3D6與一及兩種抗原(分別在194.788及228.963處)相互作用。如在疊加之插圖中所偵測，交聯樣本中明顯不存在在146.938 kDa處的3D6峰。這些資料表明3D6非常強地結合tau之可溶性聚集體且透過每種抗體之一或兩種複合物之結合來實現。實例 17 小鼠3D6在阿茲海默氏病病理之體內疾病模型中中斷tau播種
在AD病理傳播之體內疾病模型中研究3D6中斷tau播種的能力。使用來自終末期hTauP301L小鼠或野生型對照的腦幹勻漿產生病理種子。為了誘導病理，將種子單側注射於3.5月齡小鼠之海馬迴中，之後開始自然病理之進展。為了測試抗體影響tau播種的能力，在注射前對抗體進行預孵育。一個月後，藉由AT8免疫反應性評估小鼠同側中之播種量；確定海馬迴內每個切片之神經元之數目。
結果顯示於圖15中。與同型對照相比，tau種子與3D6之預孵育能夠顯著減少一個月後在小鼠中偵測之播種量，表明在注射部位近端tau內化之中斷且表明3D6可削弱tau吸收及傳播。實例 18 小鼠3D6及人源化變異體體外中斷tau與肝素之相互作用
若干研究指示，tau內化至細胞中係經由tau與表面締合之硫酸肝素蛋白多醣(HSPG)之初始相互作用介導，並且此相互作用為導致tau吸收、播種及傳播的基本初始步驟(Holmes等人, PNAS, 110(33), 2013；Katsinelos等人, Cell Rep, 23, 2018)。因此，治療性抗tau抗體之有利性質可為阻斷可tau與能存在於細胞表面上的肝素之間的相互作用的能力。
為了測試鼠及人源化3D6變異體中斷tau與肝素的相互作用的能力，首先在室溫下用在PBS中的2% BSA封閉塗佈有低分子量肝素的ELISA盤2 h。用TBST洗滌各盤。封閉後，在室溫下將盤與生物素化重組tau連同指示濃度的未標記抗體在1% BSA/PBS中孵育1小時。再次洗滌各盤，然後與鏈親和素-HRP在0.1% BSA/PBS中孵育45 min。然後洗滌各盤並用OPD顯影，且在490 nm下量測吸光度。使用4參數對數擬合分析抑制曲線。
結果顯示於圖16及表19中。在檢定中測試之3D6之鼠以及兩種人源化形式皆顯示出阻斷tau/肝素相互作用的能力，指示3D6抗原決定位對於此相互作用來說為重要的，且抗體能夠抑制該相互作用。這表明中斷tau吸收至細胞中的能力。儘管所測試之所有抗體均顯示出抑制活性，但變異體hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4保留的活性更接近於抗體之鼠形式(IC50=422.7 pM，相較之下鼠為409.2 pM)。相比之下，與hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4相比，hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2表現出較低的抑制活性(IC50=564.6 pM)，指示hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4具有較高程度的鼠抗體特性保留，且表明hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4之抑制活性由於輕鏈CDR中之胺基酸變異體而改善。
Figure 02_image053
實例 19 3D6人源化變異體結合tau之原纖維形式
藉由與等莫耳量的具有4重複序列tau之低分子量肝素一起孵育(「原纖維tau」)或3重複序列及4重複序列tau之播種生長(「混合原纖維」)來產生重組tau原纖維。將tau在37℃下孵育3-5天。為了單離原纖維，將製備之樣本在100,000xg 下超離心30分鐘。將顆粒重懸於它們的原始體積中，之後在-80℃下保存直至使用。
用預成型之原纖維塗佈ELISA盤(在4℃下，於pH 9.6 50 mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中隔夜)，洗滌並用在PBS中的1% BSA封閉。封閉後，將盤與指示濃度的在0.1% BSA/PBS中的生物素化一級抗體在室溫下孵育1 h。洗滌各盤，然後與鏈親和素-HRP在0.1% BSA/PBS中孵育45 min。然後洗滌各盤並用OPD顯影，且在490 nm下量測吸光度。使用4參數對數擬合分析結合曲線。
結果顯示於圖17及表20中。在該檢定中測試之3D6之兩種人源化形式均顯示出與tau之原纖維形式之強結合，無論原纖維僅含有4R tau還是含有3R及4R tau兩者。與hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2 (EC50=236.7 pM)相比，變異體hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4顯示優先結合兩種物質(EC50=191.8 pM)，指示hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4之結合能力由於輕鏈CDR中之胺基酸變異體而改善。
Figure 02_image055
實例 20 示範性CDR
本發明之抗體之示範性CDR在表21中。
Figure 02_image057
Figure 02_image059
Figure 02_image061
序列表 P10636-8 (SEQ ID NO:1) MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL P10636-7 (SEQ ID NO:2) MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL P10636-6 (4RON人類tau) (SEQ ID NO:3) MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIINKKLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL P10636-5 (SEQ ID NO:4) MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSDDKKAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGSRSRTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSIDMVDSPQLATLADEVSASLAKQGL P10636-4 (SEQ ID NO:5) 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DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYDVSKGDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:133；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54R，亦稱為L2-DIM18 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYDVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:134；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50E_L54G，亦稱為L2-DIM19 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYEVSKGDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:135；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50E_L54R，亦稱為L2-DIM20 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYEVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:136；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54R_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYGVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:137；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50G_L54G_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYGVSKGDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:138；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVGKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:139；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54D_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVGKDDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:140；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54G_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYDVSKGDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:141；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50D_L54R_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYDVSKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:142；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L50V_L54D_G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYVVSKDDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:143；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q，亦稱為L2-DIM8 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:144；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體G100Q DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPRRLIYLVSKLDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO:145；輕鏈可變區hu3D6VLv2變異體L37Q_L54E DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVSKEDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO:146；重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體D60E，亦稱為h3D6VHvb8 EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWIDPENGDTVYEPKFQGRATITADTSTDTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:147；重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體L82cV EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWIDPENGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLQLGSVTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:148；重鏈可變區hu3D6VHv1bA11變異體D60E_L80M_Q81E_L82cV_T83R，亦稱為h3D6VHvb9 EVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWIDPENGDTVYEPKFQGRATITADTSTDTAYMELGSVRSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:149；人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-H2 (如h3D6VHvb8及h3D6VHvb9中)之胺基酸序列 WIDPENGDTVYEPKFQG SEQ ID NO:150；人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L54D及hu3D6VLv2 L37Q_L54D中)之胺基酸序列： LVSKDDS SEQ ID 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ID NO:173；人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54G中)之胺基酸序列： EVSKGDS SEQ ID NO:174；人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50E_L54R中)之胺基酸序列： EVSKRDS SEQ ID NO:175；人源化3D6抗體之替代Kabat CDR-L2 (如hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q中)之胺基酸序列： VVSKDDS SEQ ID NO:176；重鏈恆定區(IgG1：同種異型G1m17,1)之胺基酸序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:177；輕鏈恆定區(κ)之胺基酸序列： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:178；3D6人源化變異體之成熟重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之胺基酸序列 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MMSFVSLLLVGILFHATQAEVQLVQSGAEVVKPGATVKISCKASGFNIKDYYLHWVRQRPGQGLEWIGWIDPENGDTVYDPKFQGRATITADTSTDTAYLQLGSLTSEDTAVYFCSTLDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO:181；在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之胺基酸序列 MMSFVSLLLVGILFHATQADVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLQQRPGQSPRRLIYLVGKRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO:182；編碼在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之重鏈(hu3D6VHv1bA11 IgG1 G1m17同種異型)之核苷酸序列 ATGATGTCCTTTGTCTCTCTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTTGTGAAGCCAGGGGCCACAGTCAAGATCTCCTGTAAGGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATCTGCACTGGGTGCGGCAGAGGCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGATACTGTGTATGACCCGAAGTTCCAGGGCAGGGCCACTATAACAGCAGACACATCCACCGACACAGCCTACCTGCAGCTCGGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTTCTGTTCTACCCTGGACTTCTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCTAGCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGAGAGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGATGAGATCTCGAG SEQ ID NO:183；編碼在N末端具有牛α-乳白蛋白訊息肽的3D6人源化變異體之輕鏈(hu3D6VLv2變異體L37Q_S52G_L54R，L2-DIM4κ)之核苷酸序列 ATGATGTCCTTTGTCTCTCTGCTCCTGGTTGGCATCCTATTCCATGCCACCCAGGCCGATGTTGTGATGACCCAGTCTCCACTCTCTTTGCCCGTTACCCTTGGACAACCTGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGCAACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCACGGCGCCTAATCTATCTGGTGGGCAAACGGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGCACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGCTTAAGTCCGGAACTGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTGAGATCTCGAG SEQ ID NO:184；tau微管結合重複序列1之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基255-271)之胺基酸序列 NVKSKIGSTENLKHQPG SEQ ID NO:185；tau微管結合重複序列2之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基286-302)之胺基酸序列 NVQSKCGSKDNIKHVPG SEQ ID NO:186；tau微管結合重複序列3之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基317-333)之胺基酸序列 KVTSKCGSLGNIHHKPG SEQ ID NO:187；tau微管結合重複序列4之區(SEQ ID NO:1之胺基酸殘基349-365)之胺基酸序列 RVQSKIGSLDNITHVPG SEQ ID NO:188；3D6所結合之tau之核心模體之胺基酸序列 KIGSTENLKH SEQ ID NO:189；tau序列之在3D6所結合之tau之核心模體之N末端的胺基酸序列 NVKS SEQ ID NO:190；tau序列之在3D6所結合之tau之核心模體之C末端的胺基酸序列 QPG SEQ ID NO:191；3D6之抗原決定位之胺基酸序列 KXXSXXNX(K/H)H SEQ ID NO:192；3D6所結合之tau之核心模體之胺基酸序列 KCGSKDNIKH SEQ ID NO:193；3D6所結合之tau之核心模體之胺基酸序列 KCGSLGNIHH SEQ ID NO:194；3D6所結合之tau之核心模體之胺基酸序列 KIGSLDNITH
[圖1]描繪經設計以圖譜定位由鼠3D6單株抗體結合之一或多個抗原決定位的實驗之結果。
[圖2]描繪小鼠3D6抗體(SEQ ID NO:7)及3D6抗體之人源化型式(hu3D6VHvb1、hu3D6VHvb2、hu3D6VHvb3、hu3D6VHvb4、hu3D6VHvb5、hu3D6VHvb6及hu3D6VHvb7)之重鏈可變區與人類生殖系重鏈可變區IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)及與人類受體重鏈可變區序列2RCS VH hFrwk (SEQ ID NO:75)之比對。hu3D6VHvb1為SEQ ID NO:76，hu3D6VHvb2為SEQ ID NO:77，hu3D6VHvb3為SEQ ID NO:78，hu3D6VHvb4為SEQ ID NO:79，hu3D6VHvb5為SEQ ID NO:80，hu3D6VHvb6為SEQ ID NO:90，且hu3D6VHvb7為SEQ ID NO:91。如由Kabat/Chothia複合物所定義之CDR以粗體顯示。
[圖3]描繪小鼠3D6抗體(SEQ ID NO:11)及3D6抗體之人源化型式(hu3D6VLvb1、hu3D6VLvb2及hu3D6VLvb3)之輕鏈可變區與人類生殖系輕鏈可變區序列IGKV2-30*02 (SEQ ID NO:27)及與人類受體ARX71335_VL_hFrwk (SEQ ID NO:82)之比對。hu3D6VLvb1為SEQ ID NO:83，hu3D6VLvb2為SEQ ID NO:84，且hu3D6VLvb3為SEQ ID NO:85。如由Kabat所定義之CDR以粗體顯示。
[圖4A、圖4B及圖4C]描繪所選擇之小鼠單株抗tau抗體之ELISA篩選檢定之結果。
[圖5]描繪所選擇之小鼠單株抗tau抗體與重組人類tau之結合動力學。
[圖6]描繪所選擇之小鼠單株抗tau抗體之功能性阻斷檢定之結果。
[圖7]描繪所選擇之小鼠單株抗tau抗體之解聚檢定之結果。
[圖8]描繪示出3D6及5G8免疫捕獲來自人類阿茲海默氏病組織之tau的實驗之結果。
[圖9A及圖9B]顯示鼠3D6之重鏈可變區(SEQ ID NO:7)及3D6抗體之人源化型式(hu3D6VHvb1、hu3D6VHvb2、hu3D6VHvb3、hu3D6VHvb4、hu3D6VHvb5、hu3D6VHvb6、hu3D6VHvb7、hu3D6VHv1bA11、h3D6VHvb8及h3D6VHvb9)與人類生殖系重鏈可變區序列IGHV1-69-2*01 (SEQ ID NO:25)以及與人類受體重鏈可變區序列2RCS VH hFrwk (SEQ ID NO:75)之比對。hu3D6VHvb1為SEQ ID NO:76，hu3D6VHvb2為SEQ ID NO:77，hu3D6VHvb3為SEQ ID NO:78，hu3D6VHvb4為SEQ ID NO:79，hu3D6VHvb5為SEQ ID NO:80，hu3D6VHvb6為SEQ ID NO:90，hu3D6VHvb7為SEQ ID NO:91，hu3D6VHv1bA11為SEQ ID NO:18，h3D6VHvb8為SEQ ID NO:146且h3D6VHvb9為SEQ ID NO:148。與鼠3D6 (SEQ ID NO:7)之重鏈可變區相同的殘基用「.」指出。如由Kabat/Chothia複合物所定義之CDR以粗體顯示。
[圖10A、圖10B、圖10C及圖10D]顯示3D6抗體之人源化型式之輕鏈可變區之比對：hu3D6VLv2 (SEQ ID NO:21)、hu3D6VLv2 L37Q (SEQ ID NO:143)、hu3D6VLv2 L50G (SEQ ID NO:103)、hu3D6VLv2 S52G (SEQ ID NO:110)、hu3D6VLv2 L54G (SEQ ID NO:94)、hu3D6VLv2 L54D (SEQ ID NO:93)、hu3D6VLv2 L54K (SEQ ID NO:100)、hu3D6VLv2 L54R (SEQ ID NO:101)、hu3D6VLv2 L54T (SEQ ID NO:102)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G (SEQ ID NO:128)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D (SEQ ID NO:129)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G (SEQ ID NO:131)、hu3D6VLv2 L37Q_L54G (SEQ ID NO:126)、hu3D6VLv2 L37Q_L54R (SEQ ID NO:125)、hu3D6VLv2 L37Q_L54T (SEQ ID NO:130)、hu3D6VLv2 L37Q_L54D (SEQ ID NO:127)、hu3D6VLv2 L37Q_L54E (SEQ ID NO:145)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R (SEQ ID NO:119)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G (SEQ ID NO:120)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R (SEQ ID NO:133)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G (SEQ ID NO:132)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D (SEQ ID NO:124)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54G (SEQ ID NO:121)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54T (SEQ ID NO:123)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R (SEQ ID NO:122)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54G_G100Q (SEQ ID NO:140)、hu3D6VLv2 L37Q_L50D_L54R_G100Q (SEQ ID NO:141)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54G_G100Q (SEQ ID NO:137)、hu3D6VLv2 L37Q_L50G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:136)、hu3D6VLv2 L37Q_L50V_L54D_G100Q (SEQ ID NO:142)、hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54D_G100Q (SEQ ID NO:139)及hu3D6VLv2 L37Q_S52G_L54R_G100Q (SEQ ID NO:138)。與hu3D6VLv2 (SEQ ID NO:21)之輕鏈可變區相同的殘基用「.」指出。如由Kabat所定義之CDR以粗體顯示。
[圖11]顯示針對所選擇之人源化3D6變異體之tau內化檢定之結果。
[圖12A及圖12B]顯示取代圖譜定位微陣列實驗之結果。圖12A顯示取代效果之圖，且圖12B顯示tau微管結合重複序列之部分之比對，用於結合3D6之重要殘基經突出顯示。aa 255-271為SEQ ID NO:184，aa 286-302為SEQ ID NO:185，aa 317-333為SEQ ID NO:186，且aa 349-365為SEQ ID NO:187。
[圖13]描繪免疫組織化學實驗之結果，其顯示3D6結合正常(上圖)及阿茲海默氏病組織(中圖及下圖)中之tau。
[圖14]顯示評估3D6之結合化學計量的質譜實驗之結果。
[圖15]顯示3D6在阿茲海默氏病之體內疾病模型中中斷tau播種。
[圖16]顯示3D6人源化變異體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2及hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4阻斷tau與肝素之間的相互作用。
[圖17]顯示3D6人源化變異體hu3D6VHv1bA11/hu3D6VLv2及hu3D6VHv1bA11/L2-DIM4結合tau之原纖維形式。
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Claims (73)

  1. 一種特異性結合人類tau之經單離抗體，其包含： 成熟重鏈可變區，其包含有：分別包含SEQ ID NO:8之CDR-H1，包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:149之CDR-H2及包含SEQ ID NO:10之CDR-H3，其中該重鏈可變區與SEQ ID NO:18具有至少90%一致性；及 成熟輕鏈可變區，其包含有：包含SEQ ID NO:12之CDR L1，包含SEQ ID NO:150、151、153、156、158、159、160、163、165、166、167、168、169、170、171、172、173或174之CDR L2及包含SEQ ID NO:14之CDR L3，其中該輕鏈可變區與SEQ ID NO:122具有至少90%一致性。
  2. 如請求項1之抗體，其中位置H12、H13、H17、H24、H40、H43、H48、H66、H67、H76、H80、H81及H91中之至少一者可分別由V、K、T、A、R、Q、I、R、A、D、L、Q及F佔據，且位置L2、L12、L15、L37、L39、L45、L60及L100中之至少一者可分別由V、P、L、Q、R、R、D及Q佔據。
  3. 如請求項1之抗體，其中CDR L2包含SEQ ID NO:150、151、163、167、168或169。
  4. 如請求項3之抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:18，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:110、121、122或123。
  5. 如請求項4之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:110。
  6. 如請求項4之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:121。
  7. 如請求項4之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。
  8. 如請求項4之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:123。
  9. 如請求項3之抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:146，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:122。
  10. 如請求項9之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:94。
  11. 如請求項9之抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。
  12. 如請求項3之抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO:18或146，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO:122。
  13. 如請求項1-12中任一項之抗體，其中該抗體為嵌合抗體、鑲飾(veneered)抗體或人源化抗體。
  14. 如請求項1-13中任一項之抗體，其為完整抗體。
  15. 如請求項1-13中任一項之抗體，其為結合片段。
  16. 如請求項15之抗體，其中該結合片段為單鏈抗體、Fab或Fab'2片段。
  17. 如請求項1-13中任一項之抗體，其為Fab片段或單鏈Fv。
  18. 如前述請求項中任一項之抗體，其中同型為人類IgG1。
  19. 如請求項1-14及18中任一項之人源化抗體，其中該成熟輕鏈可變區與輕鏈恆定區融合，且該成熟重鏈可變區與重鏈恆定區融合。
  20. 如請求項19之人源化抗體，其中該重鏈恆定區為天然人類重鏈恆定區之突變體形式，其相對於該天然人類重鏈恆定區與Fcγ受體之結合減少。
  21. 如請求項19或請求項20之人源化抗體，其中該重鏈恆定區屬於IgG1同型。
  22. 如請求項21之人源化抗體，其中該重鏈恆定區具有胺基酸序列SEQ ID NO:176。
  23. 如請求項19之人源化抗體，其中與重鏈恆定區融合之該成熟重鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:178。
  24. 如請求項19之人源化抗體，其進一步包含與該成熟重鏈及/或輕鏈可變區融合之訊息肽。
  25. 如請求項23之人源化抗體，其中該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:180。
  26. 如請求項19之人源化抗體，其中該輕鏈恆定區具有胺基酸序列SEQ ID NO:177。
  27. 如請求項19之人源化抗體，其中與輕鏈恆定區融合之該成熟輕鏈可變區具有胺基酸序列SEQ ID NO:179。
  28. 如請求項27之人源化抗體，其中該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:181。
  29. 如請求項23之人源化抗體，其中該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:178，且該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:179。
  30. 如請求項25之人源化抗體，其中該重鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:180，且該輕鏈具有胺基酸序列SEQ ID NO:181。
  31. 如前述請求項中任一項之抗體，其在該恆定區中具有至少一個突變。
  32. 如請求項31之抗體，其中該突變減少藉由該恆定區之補體固定或活化。
  33. 如請求項32之抗體，其在藉由EU編號之位置241、264、265、270、296、297、318、320、322、329及331中之一或多者處具有突變。
  34. 如請求項33之抗體，其在位置318、320及322處具有丙胺酸。
  35. 如請求項1-20中任一項之抗體，其中同型屬於人類IgG2或IgG4同型。
  36. 如請求項1-35中任一項之抗體，其中該抗體為至少95% w/w純。
  37. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體綴合於治療劑、細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、神經營養劑或神經保護劑。
  38. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1-37中任一項所定義之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  39. 一種核酸，其編碼如請求項1-38中任一項所述之抗體之重鏈及/或輕鏈。
  40. 如請求項39之核酸，其中該重鏈係由包含SEQ ID NO:182之序列編碼，且該輕鏈係由包含SEQ ID NO:183之序列編碼。
  41. 一種產生人源化抗體的方法，該方法包含： (a) 培養用如請求項40之核酸轉型之細胞，使得該等細胞分泌該抗體；且 (b) 從細胞培養基中純化出該抗體。
  42. 一種產生細胞株的方法，該細胞株產生人源化抗體、嵌合抗體或鑲飾抗體，該方法包含： (a) 將編碼如請求項40之核酸以及可選擇標誌物的載體引入細胞中； (b) 在選擇該載體之複本數增加之細胞的條件下使該等細胞繁殖； (c) 自該等所選擇之細胞單離出單細胞；且 (d) 將由基於抗體之產率選擇之單細胞選殖之細胞存入庫。
  43. 一種產生人源化抗體、嵌合抗體或鑲飾抗體的方法，該方法包含： (a) 培養用編碼如請求項1之抗體之重鏈及輕鏈的核酸轉型之細胞，使得該等細胞分泌該抗體；且 (b) 從細胞培養基中純化出該抗體。
  44. 一種產生細胞株的方法，該細胞株產生人源化抗體、嵌合抗體或鑲飾抗體，該方法包含： (a) 將編碼如請求項1之核酸之重鏈及輕鏈以及可選擇標誌物的載體引入細胞中； (b) 在選擇該載體之複本數增加之細胞的條件下使該等細胞繁殖； (c) 自該等所選擇之細胞單離出單細胞；且 (d) 將由基於抗體之產率選擇之單細胞選殖之細胞存入庫。
  45. 一種抑制或減少患有tau介導之類澱粉變性或處於發展tau介導之類澱粉變性之風險的個體中之tau聚集的方法，其包含向該個體投與如請求項1-38中任一項之抗體之有效方案，從而抑制或減少該個體中之tau聚集。
  46. 如請求項45之方法，其中該抗體為3D6之人源化型式。
  47. 一種治療個體中之tau相關疾病或實現tau相關疾病之預防的方法，其包含投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體之有效方案，且由此治療該疾病或實現該疾病之預防。
  48. 如請求項47之方法，其中該tau相關疾病為阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變(tauopathy)、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病(type C Niemann-Pick disease)、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症(amyotrophic lateral sclerosis/parkinsonism dementia complex of Guam)、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(Lewy body variant of Alzheimer disease；LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
  49. 如請求項47之方法，其中該tau相關疾病為阿茲海默氏病。
  50. 如請求項49之方法，其中該患者為ApoE4攜帶者。
  51. 一種減少tau之異常傳播的方法，其包含投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體之有效方案且從而減少tau之傳播。
  52. 一種誘導tau之吞噬的方法，其包含投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體之有效方案且從而誘導tau之吞噬。
  53. 一種抑制tau聚集或沉著的方法，其包含投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體之有效方案，從而抑制tau聚集或沉著。
  54. 一種抑制tau纏結形成的方法，其包含投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體之有效方案。
  55. 一種偵測患有與tau聚集或沉著相關聯之疾病或處於該疾病之風險的個體中之tau蛋白沉著物的方法，其包含向該個體投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體，及偵測該個體中之結合tau之該抗體。
  56. 如請求項55之方法，其中與tau聚集或沉著相關聯之疾病為阿茲海默氏病、唐氏徵候群、輕度認知障礙、原發性年齡相關tau蛋白病變、腦炎後巴金森氏病、創傷後失智或拳擊手失智、匹克病、C型尼曼匹克病、核上神經麻痺症、額顳葉失智、額顳葉退化、嗜銀顆粒病、球狀神經膠tau蛋白病變、關島肌肉萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏病失智複合症、皮質基底核退化(CBD)、路易氏體失智、阿茲海默氏病之路易氏體變異型(LBVAD)、慢性創傷性腦病(CTE)、球狀神經膠tau蛋白病變(GGT)或進行性核上神經麻痺症(PSP)。
  57. 如請求項55之方法，其中該抗體係藉由靜脈內注射至該個體體內來投與。
  58. 如請求項55之方法，其中該抗體係藉由顱內注射或藉由鑽取穿透該個體之顱骨的孔來直接向該個體之腦部投與。
  59. 如請求項55之方法，其中該抗體係經標記。
  60. 如請求項59之方法，其中該抗體用螢光標記、順磁性標記或放射性標記進行標記。
  61. 如請求項60之方法，其中使用正電子發射斷層攝影術(PET)或單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)偵測該放射性標記。
  62. 一種量測正治療與tau聚集或沉著相關聯之疾病的個體中之治療功效的方法，其包含： (a) 在藉由向該個體投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體進行治療之前量測該個體中之tau蛋白沉著物之第一水準，且偵測該個體中之結合tau之該抗體之第一量， (b) 向該個體投與該治療， (c) 在藉由向該個體投與該抗體進行治療之後量測該個體中之tau蛋白沉著物之第二水準，且偵測該個體中之結合tau之該抗體， 其中tau蛋白沉著物水準之降低指示對治療的陽性反應。
  63. 一種量測正治療與tau聚集或沉著相關聯之疾病的個體中之治療功效的方法，其包含： (a) 在藉由向該個體投與如請求項1-38中任一項所定義之抗體進行治療之前量測該個體中之tau蛋白沉著物之第一水準，且偵測該個體中之結合tau之該抗體之第一量， (b) 向該個體投與該治療， (c) 在藉由向該個體投與該抗體進行治療之後量測該個體中之tau蛋白沉著物之第二水準，且偵測該個體中之結合tau之該抗體之第二量， 其中tau蛋白沉著物之水準沒有變化或tau蛋白沉著物之少量增加指示對治療的陽性反應。
  64. 一種產生在式KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)或KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194)之模體內的抗原決定位處特異性結合人類tau的抗體的方法，其包含用人類tau或其片段使動物免疫以產生抗體且篩選出所產生之該等抗體中在該模體內特異性結合的抗體。
  65. 一種產生特異性結合由殘基KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)或KIGSLDNITH (SEQ ID NO:194)組成之肽的抗體的方法，其包含用人類tau或其片段使動物免疫以產生抗體且篩選出所產生之該等抗體中特異性結合該肽的抗體。
  66. 一種產生特異性結合包含KXXSXXNX (K/H)H (SEQ ID NO:191)之抗原決定位的抗體的方法，其包含用tau或其片段使動物免疫且篩選出特異性結合該抗原決定位的抗體。
  67. 如請求項64-66中任一項之方法，其中該動物用383個胺基酸的人類tau (4R0N)進行免疫。
  68. 如請求項67之方法，其中該人類tau含有P301S突變。
  69. 如請求項68之方法，其中該人類tau為重組的帶有N末端His標籤的。
  70. 如請求項66之方法，其中該篩選確定該等抗體與一或多種至多15個胺基酸的肽之間的特異性結合，該一或多種肽分別包含KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)、KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)、KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)或由KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)表示之任何其他共通模體。
  71. 如請求項70之方法，其中該一或多種肽分別包含KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)或KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)或KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)。
  72. 如請求項66之方法，其中該動物用連接至載劑的至多15個胺基酸的tau片段進行免疫，該tau片段包含KXXSXXNX(K/H)H (SEQ ID NO:191)。
  73. 如請求項72之方法，其中該肽為KIGSTENLKH (SEQ ID NO:188)或KCGSKDNIKH (SEQ ID NO:192)或KCGSLGNIHH (SEQ ID NO:193)。
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