CN111587123A - 用于生成和使用人源化构象特异性磷酸化的τ抗体的方法和组合物 - Google Patents
用于生成和使用人源化构象特异性磷酸化的τ抗体的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111587123A CN111587123A CN201880086054.0A CN201880086054A CN111587123A CN 111587123 A CN111587123 A CN 111587123A CN 201880086054 A CN201880086054 A CN 201880086054A CN 111587123 A CN111587123 A CN 111587123A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- cis
- tau
- hupt
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本公开总体上涉及可以结合至磷酸化的苏氨酸231‑τ蛋白(pT231‑τ)并中和该磷酸化的苏氨酸231‑τ蛋白(pT231‑τ)的活性的构象特异性抗体。本技术的抗体可用于用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式‑pT231‑τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月9日提交的美国临时专利申请No.62/583,850的权益和优先权，该申请的全部公开内容出于任何和所有目的在此通过引用整体并入。
技术领域
本技术总体上涉及特异性地结合磷酸化的苏氨酸231-τ(tau)蛋白(pT231-τ)的构象特异性抗体的制备及其用途。特别地，本技术涉及顺式-pT231-τ中和抗体的制备及其在治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症中的用途。
背景技术
提供以下描述以帮助读者理解。提供的信息或引用的参考文献均不被认为是本方法的现有技术。
患有阿尔茨海默氏病(AD)和多种其他中枢神经系统病症(诸如额颞叶痴呆、皮克氏病、皮质基底节变性、创伤性脑损伤(TBI)、慢性创伤性脑病变(CTE)和进行性核上性麻痹)的患者的脑部含有包含τ蛋白的神经纤维缠结(NFT)。这种共同的病理特征导致这些各种神经退行性疾病(被称为“τ蛋白病”)。τ相关病理与AD中的神经元和记忆力的进行性丧失密切相关。AD的τ蛋白病中的极早期事件是τ过度磷酸化，特别是在Ser/Thr-Pro基序上的τ过度磷酸化，其引起微管破坏和神经毒性。已发现τ中的磷酸化的Thr231-Pro基序(pT231-τ)以两种不同的顺式和反式构象存在。pT231-τ蛋白的顺式构象主要在AD患者的脑中表达。
由于神经元功能障碍发生在缠结形成之前很久，因此主要的挑战是开发免疫疗法，其专门针对在τ蛋白病和AD中记忆力丧失之前的早期致病事件。
发明内容
本技术总体上涉及特异性地结合磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)并中和磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)活性的构象特异性抗体。本技术的抗体可用于用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。
在一方面，本技术提供了抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体，和SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。
在另一方面，本技术提供了抗体的抗原结合片段，其中，抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。
在以上实施方式中的任一者中，抗体结合至包含氨基酸序列KVAVVRTPPKSPS(SEQID NO:56)的磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白的表位。在一些实施方式中，抗体特异性地结合至磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)的顺式构象。在一些实施方式中，抗体具有选自由以下组成的组的同种型：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
在一方面，本技术提供了编码本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体的重组核酸序列。在又一方面，本技术提供了宿主细胞或载体，其包含编码本文所描述的抗-顺式-pT231-τ抗体的重组核酸。
在一方面，本技术提供了组合物，其包含抗-顺式-pT231-τ抗体和药学上可接受的载剂。在一些实施方式中，组合物包含抗-顺式-pT231-τ抗体，所述抗-顺式-pT231-τ抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体，和任选的SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在另一方面，本技术提供了用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法，所述方法包括向对象施用有效量的包含SEQ ID NO:1至SEQID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体的抗体，其中，该抗体特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并中和该顺式-pT231-τ蛋白。
在该方法的某些实施方式中，抗体还包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ IDNO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在该方法的一些实施方式中，神经病症是τ蛋白病、创伤性脑损伤(TBI)或中风。在另一个实施方式中，τ蛋白病选自由以下组成的组：进行性核上性麻痹(PSP)、慢性创伤性脑病变(CTE)、额颞叶痴呆(FTD)、额颞叶变性、Lytico-Bodig病、缠结优势型痴呆、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、皮克氏病、皮质基底节变性和阿尔茨海默氏病(AD)。
在某些实施方式中，对象处于所述τ蛋白病的早期。在一个实施方式中，所述τ蛋白病的早期通过获自所述对象的样品中升高水平的顺式pT231-τ或顺式pT231-τ:反式pT231-τ比率的增加来确定。在一些实施方式中，该方法还包括确定获自对象的样品中CSF t-τ、pT181-τ、Αβ42的水平或ApoE4水平。在某些实施方式中，样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。
在一些实施方式中，对象具有反复的脑创伤史。
另外地或替选地，在该方法的一些实施方式中，将抗体与附加的治疗剂分开地、依序地或同时地施用给对象。在一些实施方式中，附加的治疗剂是多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚和氯化锂中的一者或多者。
在一方面，本技术提供了用于选择用本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体治疗的对象的方法，其包括：(a)检测获自所述对象的样品中的相对于在参考样品中观察到的顺式pT231-τ蛋白水平的提高或顺式pT231-τ蛋白:反式pT231-τ蛋白比率的增加；和(b)选择所述对象用本文公开的抗-顺式-pT231-τ抗体治疗。在一些实施方式中，获自对象的样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。
在某些实施方式中，参考样品获自健康对照对象。
在另一方面，本技术提供了用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的试剂盒，该试剂盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并中和该顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用抗体的说明书，其中，抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。在试剂盒的一些实施方式中，抗体还包含SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在一方面，本技术提供了用于检测样品中的顺式-pT231-τ蛋白的试剂盒，该试剂盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用抗体的说明书，其中，抗体包含SEQID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。在试剂盒的一些实施方式中，抗体还包含SEQID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在某些实施方式中，抗体偶联至一种或多种可检测的标记。在一个实施方式中，一种或多种可检测的标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记。
另外地或替选地，在一些实施方式中，试剂盒还包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白抗体的二级抗体。在一些实施方式中，二级抗体偶联至选自由以下组成的组的至少一种可检测的标记：放射性标记、荧光标记或发色标记。
附图说明
图1显示了鼠抗体PT-113的重链免疫球蛋白可变(VH)结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。一部分的CH1序列被包括在图中。
图2显示了鼠抗体PT-113的轻链免疫球蛋白可变(VL)结构域的核苷酸序列和氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。一部分的Cκ序列被包括在图中。
图3以单字母码显示了小鼠PT-113抗体的成熟VH结构域的氨基酸序列，与其推断的亲本种系V区段IGHV1S127*01和JH2区段的氨基酸序列比对。残基编号根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interests,NIH公布号91-3242,美国卫生和公众服务部(第5版，1991)来指定。PT-113VH结构域的CDR序列加下划线。星号表示PT-113VH氨基酸序列和IGHV1S127*01氨基酸序列之间的差异。
图4以单字母码显示了小鼠PT-113抗体的成熟VL结构域的氨基酸序列，与其推断的亲本种系V区段IGKV1-110*02和Jk1区段的氨基酸序列比对。残基编号根据Kabat等人(1991)来指定。PT-113VL结构域的CDR序列加下划线。星号表示PT-113VL氨基酸序列和IGKV1-110*02氨基酸序列之间的差异。
图5显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的经合成的小鼠PT-113VH基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。
图6显示了侧接有NheI和EcoRI位点(加下划线)的经合成的小鼠PT-113VL基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VL结构域的N-末端氨基酸残基(D)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接EcoRI位点的内含子序列呈斜体。
图7显示了pChPT-113、pHuPT-113A、pHuPT-113B、pHuPT-113C、pHuPT-113D和pHuPT-113D-AA载体(统称为表达载体)的示意性结构。从SalI位点顺时针开始，质粒含有重链转录单元，从人巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子和增强子(CMV-P)开始，以启动抗体重链基因的转录。CMV启动子后接VH外显子、含有人γ-1重链恒定区(包括CH1、铰链、CH2和CH3外显子，连同居间内含子)的基因组序列、以及CH3外显子后的聚腺苷酸化位点。在重链基因序列之后，轻链转录单元以CMV启动子开始，随后是VL外显子和含有人κ链恒定区外显子(CL)的基因组序列，内含子的一部分位于其前，并且聚腺苷酸化位点在CL外显子后。轻链基因则后跟SV40早期启动子(SV40-P)、对嘌呤霉素具有抗性的嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶基因(puro)和含有SV40聚腺苷酸化位点(SV40-A)的区段。最后，质粒含有质粒pUC19的一部分，其包含细菌复制起点(pUC ori)和β-内酰胺酶基因(β内酰胺酶)。在pHuPT-113D-AA中，CH2区在位置234和位置235处带有Leu-至-Ala氨基酸取代(Kabat等人(1)的Eu编号)。相关限制酶位点的位置显示于图中。
图8显示了小鼠PT-113VH结构域、四种类型的人源化PT-113VH(HuPT-113VH1、HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4)结构域和人受体AF174092VH结构域的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位置。小鼠PT-113VH结构域的CDR序列加下划线。AF174092VH结构域中的CDR残基从图中省略。据预测，HuPT-113VH1、HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4中的加下划线的残基在抗原结合位点的形成中起重要作用，因此相应的小鼠残基保留在这些位置。
图9显示了小鼠PT-113VL结构域、人源化PT-113VL(HuPT-113VL1)结构域和人受体M99608 VL结构域的氨基酸序列的比对。氨基酸残基以单字母码显示。序列上方的数字表示根据Kabat等人(1991)的位置。小鼠PT-113VL结构域的CDR序列加下划线。M99608 VL结构域中的CDR残基从图中省略。当设计HuPT-113VL1时，不需要框架氨基酸取代。
图10显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH1基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。
图11显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH2基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。
图12显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH3基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。
图13显示了侧接有SpeI和HindIII位点(加下划线)的HuPT-113VH4基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VH结构域的N-末端氨基酸残基(Q)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接HindIII位点的内含子序列呈斜体。
图14显示了侧接有NheI和EcoRI位点(加下划线)的HuPT-113VL1基因的核苷酸序列连同推断的氨基酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。信号肽序列呈斜体。成熟VL结构域的N-末端氨基酸残基(D)加双下划线。根据Kabat等人(1991)定义的CDR序列加下划线。邻接EcoRI位点的内含子序列呈斜体。
图15显示了瞬时表达的ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113DIgG1(I)抗体与本文公开的pT231-Dmpτ肽的结合。
图16显示了ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体的SDS PAGE分析。在还原条件下，在MES缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中在4-12％SDSPAGE凝胶上跑抗体(各5μg)。PageRuler Prestained Protein Ladder(Thermo FisherScientific)用作分子量标准品(泳道4)。泳道1，ChPT-113IgG1；泳道2，HuPT-113D IgG1(I)；泳道3，HuPT-113D IgG1-AA(I)。H和L分别表示每种经测试的抗体的重链和轻链。
图17显示了用于ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)重链和轻链cDNA的PCR扩增和测序的寡核苷酸的序列。
图18显示了由pChPT-113构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。
图19显示了由pChPT-113构建体编码的κ轻链的编码区(可变区和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。
图20显示了由pHuPT-113D构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。
图21显示了由pHuPT-113D和pHuPT-113D-AA构建体编码的κ轻链的编码区(可变区和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。
图22显示了由pHuPT-113D-AA构建体编码的γ-1重链的编码区(可变区和恒定区)的核苷酸序列。氨基酸残基以单字母码显示。终止密码子由“·”表示。
图23显示了小鼠PT-113 IgG2b抗体与四种不同的τ肽结合的ELISA分析。
图24显示了ChPT-113 IgG1抗体与四种不同的τ肽结合的ELISA分析。
图25显示了(i)生物素化的小鼠PT-113 IgG2b和(ii)ChPT-113 IgG1抗体与pThr231-Dmpτ肽在不同浓度的竞争抗体的存在下的结合。
图26A显示了ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体与pThr231-Dmpτ肽的结合的ELISA分析。图26B显示了ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体与pThr231-Proτ肽的结合的ELISA分析。图26C显示了ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体与np-Thr231-Proτ肽的结合的ELISA分析。图26D显示了ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体与pThr231-Alaτ肽的结合的ELISA分析。
图27A显示了HuPT-113D IgG1-AA(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ IDNO:128)。
图27B显示了由SEQ ID NO:128编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)。
图27C显示了HuPT-113D IgG1-AA(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)。
图27D显示了由SEQ ID NO:129编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)。
图28A显示了HuPT-113D IgG4(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:130)。
图28B显示了由SEQ ID NO:130编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。
图28C显示了HuPT-113D IgG4(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)。
图28D显示了由SEQ ID NO:129编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)。
图29A显示了HuPT-113D IgG1(II)构建体的可变重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:131)。
图29B显示了由SEQ ID NO:131编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:132)。
图29C显示了HuPT-113D IgG1(II)构建体的κ轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:129)。
图29D显示了由SEQ ID NO:129编码的氨基酸序列(SEQ ID NO:55)。
图30A是显示THP-1细胞中对CD16染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色的抗-CD16抗体染色的细胞。
图30B是显示THP-1细胞中对CD32染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色的抗-CD32抗体染色的细胞。
图30C是显示THP-1细胞中对CD64染色的直方图。呈红色的未染色的细胞和呈蓝色的抗-CD64抗体染色的细胞。
图31A是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数(5,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗体。
图31B是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗体。
图31C是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数(5,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗体。
图31D是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含兔多克隆抗-卵清蛋白抗体。
图32A是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图32B是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图32C是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图32D是显示如通过TNFα分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图33A是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1mg/ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图33B是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml包衣)和细胞数(50,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图33C是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(0.1μg/ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图33D是显示如通过IL-6分泌测量的卵清蛋白免疫复合物(IC)包衣密度(10μg/ml包衣)和细胞数(150,000个细胞/孔)对THP-1细胞活化的影响的图。卵清蛋白IC包含鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体。
图34A是显示卵清蛋白IC浓度和Jurkat细胞数(50,00个细胞/孔)对FcR活化的影响的图。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔(10μg/mL)和一系列浓度的兔多克隆抗-卵清蛋白抗体和鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体两者生成。
图34B是显示卵清蛋白IC浓度和Jurkat细胞数(100,00个细胞/孔)对FcR活化的影响的图。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔(10μg/mL)和一系列浓度的兔多克隆抗-卵清蛋白抗体和鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体两者生成。
图35是显示在每种pThr-Dmp肽包衣浓度(1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml)下每种抗体(HuPT-113D IgG1-AA(II)(IgG1-AA)、HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)和HuPT-113D IgG1(II)(IgG1))的结合曲线的图。
图36A是显示响应于在2,2,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释的pThr-Dmp肽的在THP-1细胞中TNFα分泌的图。
图36B是显示响应于在2,2,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释的pThr-Dmp肽的在THP-1细胞中IL-6分泌的图。
图37是显示用在2,2,2-三氟乙醇(TFE)或DPBS中稀释至1μg/ml的pThr-Dmp肽包被的Jurkat细胞中FcγRIIIa活化的水平的图。
图38A是显示诱导TNFα从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图38B是显示诱导IL-1β从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图38C是显示诱导IL-6从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图38D是显示诱导TNFα从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113DIgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图38E是显示诱导IL-1β从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113DIgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图38F是显示诱导IL-6从与生物素化的pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113D IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113DIgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图39是显示HuPT-113D IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)和HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色)的来自图38A至图38C的EC50值的图。
图40是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa活化的图。将孔用天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣、10μg/ml包衣或100μg/ml包衣下包被。
图41A是显示诱导TNFα从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图41B是显示诱导IL-1β从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图41C是显示诱导IL-6从与天然pThr-Dmp肽IC和每种HuPT-113D抗体(HuPT-113DIgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色))接触的THP-1细胞中释放的图。
图42是显示HuPT-113D IgG1(II)(IgG1；蓝色)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA；红色)和HuPT-113D IgG4(II)(IgG4；绿色)的来自图41A至图41C的EC50值的图。
图43是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa活化的图。
图44A是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa V158活化的图。将孔用TFE中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用增殖细胞。
图44B是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa V158活化的图。将孔用TFE中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。
图45A是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa V158活化的图。将孔用TFE中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。
图45B是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa F158活化的图。将孔用TFE中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。
图45C是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIa H131活化的图。将孔用TFE中的天然pThr-Dmp肽IC在1μg/ml包衣下包被。使用经解冻和使用的细胞。
图46是显示用HuPT-113D IgG1(II)(IgG1)、HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)或HuPT-113D IgG4(II)(IgG4)处理的Jurkat细胞中的FcγRIIIa V158活化的图。将孔用DBPS中的pTau在10μg/ml包衣下包被。
图47是经纯化的HuPT-113D IgG-AA(II)(IgG-AA)的SDS-PAGE分析。
具体实施方式
应当理解，下面以各种详细程度描述本方法的某些方面、模式、实施方式、变化和特征，以便提供对本技术的实质理解。
本公开总体上提供了可以特异性地结合至磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)并中和磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(pT231-τ)的活性的构象特异性抗体。本技术的抗体可用于用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。因此，本方法的各个方面涉及抗-顺式-pT231-τ抗体的制备、表征和操作。本技术的抗体可单独或与附加的治疗剂组合使用以治疗τ蛋白病。在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。
在一些实施方式中，抗体偶联至可检测的标记。在其他实施方式中，试剂盒包括偶联至可检测的标记的二级抗体。
在实践本方法时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。参见，例如Sambrook和Russell编辑(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版；系列Ausubel等人编辑(2007)Current Protocolsin Molecular Biology；系列Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,纽约)；MacPherson等人(1991)PCR 1:A Practical Approach(IRL Press，Oxford UniversityPress)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2005)Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique,第5版；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；美国专利No.4,683,195；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription andTranslation；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986))；Perbal(1984)APractical Guide to Molecular Cloning；Miller和Calos编辑(1987)Gene TransferVectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,伦敦)；和Herzenberg等人编辑(1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology。检测和测量多肽基因表达产物水平(即，基因翻译水平)的方法是本领域众所周知的，并且包括使用多肽检测方法，诸如抗体检测和定量技术。(还参见，Strachan&Read,Human MolecularGenetics,第二版(John Wiley和Sons,Inc.,纽约1999))。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数参考物，除非内容另外明确指出。例如，提及“细胞”包括两个或更多个细胞的组合等等。通常，本文所用的命名法和下文所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域众所周知的和常用的那些。本文引用的所有参考文献通过引用整体并出于所有目的而并入本文，其程度与每个出版物、专利或专利申请具体地和单独地通过引用出于所有目的整体并入的程度相同。
如本文使用的，在引用数字时，术语“约”通常被认为包括落入该数字的任一方向(大于或小于)的1％、5％或10％范围内的数字，除非另有说明或除非从上下文中是明显的(除了该数字小于可能值的0％或超过可能值的100％)。
如本文所用，“施用”药剂或药物给对象包括向对象引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何适合的途径进行施用，包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、经直肠或局部。施用包括自己施用和由他人施用。
“佐剂”是指引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在该上下文中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原或抗体的免疫响应。佐剂可以在施用疫苗之前、与疫苗组合或在施用疫苗之后施用给对象。用作佐剂的化合物的实例包括铝化合物、油、嵌段聚合物、免疫刺激复合物、维生素和矿物质(例如，维生素E、维生素A、硒和维生素B12)、Quil A(皂苷)、细菌和真菌细胞壁组分(例如，脂多糖、脂蛋白和糖蛋白)、激素、细胞因子和共刺激因子。
如本文所用，术语“抗体”统称为免疫球蛋白或免疫球蛋白类分子，通过举例的方式包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在免疫响应期间在任何脊椎动物中(例如在诸如人、山羊、兔和小鼠的哺乳动物中以及非哺乳动物物种中)产生的类似分子，诸如鲨鱼免疫球蛋白。术语“抗体”包括完整免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，它们特异性地结合至感兴趣的分子(或一组高度相似的感兴趣的分子)，基本上排除了结合至其他分子(例如，对感兴趣的分子具有的结合常数比对生物样品中的其他分子的结合常数大至少103M-1、大至少104M-1或大至少105M-1的抗体和抗体片段)。术语“抗体”还包括遗传工程化形式，诸如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异缀合抗体(heteroconjugateantibodies)(诸如双特异性抗体)。还参见，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,伊利诺伊州罗克福德)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,纽约,1997。
更特别地，抗体是指至少包含轻链免疫球蛋白可变区或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性地识别并结合抗原的表位。抗体由重链和轻链组成，每条链具有可变区，分别称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。共同地，VH区和VL区负责结合由抗体识别的抗原。通常，免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型，拉姆达(λ)和卡帕(κ)。有五种决定抗体分子的功能活性的主要重链类别(或同种型)：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链和轻链都含有恒定区和可变区(这些区也称为“结构域”)。组合地，重链可变区和轻链可变区特异性地结合抗原。轻链可变区和重链可变区含有被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。已经定义了框架区和CDR的范围(参见，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,美国卫生和公众服务部,1991，其在此通过引用并入)。Kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架区的序列在物种内相对保守。抗体的框架区(即组分轻链和重链的组合框架区)主要采用β-折叠构象，并且CDR形成连接β-折叠结构并在某些情况下形成β-折叠结构一部分的环。因此，框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N-末端开始依序编号，并且通常也由特定CDR所在的链来标识。因此，VH CDR3位于它所在的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自它所在的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。结合顺式-pT231-τ蛋白的抗体将具有特异性的VH区和VL区序列，并从而具有特异性的CDR序列。具有不同特异性(即对不同抗原的不同组合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR随抗体而异，但CDR中只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
抗体的实例包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、多特异性抗体和抗体片段。抗体可以是例如构象特异性抗体(例如，结合至Xaa-Pro基序的顺式或反式构象的抗体，其中，Xaa是氨基酸)。抗体特异性地结合至抗原。
如本文所用，术语“抗体相关多肽”意指抗原结合抗体片段，包括单链抗体，其可以包含单独的可变区、或可以包含与以下全部或部分多肽元件组合的可变区：抗体分子的铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。该技术中还包括一个或多个可变区和铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任何组合。可用于本方法中的抗体相关分子例如但不限于Fab,Fab′和F(ab′)2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)和包含VL结构域或VH结构域的片段。实例包括：(i)Fab片段，一种由VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种包括由二硫化物桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH结构域和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL结构域和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)经分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段”可以包含一部分的全长抗体，通常其抗原结合或可变区。“抗体片段”的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；直链抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在相同多肽链(VH VL)中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不能允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体更充分描述于例如EP 404,097；WO93/11161；和30Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
如本文所用，术语“单链抗体”或“单链Fv(scFv)”是指Fv片段的两个结构域VL和VH的抗体融合分子。单链抗体分子可包含具有多个单个分子的聚合物，例如二聚体、三聚体或其他聚合物。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接起来，该合成接头使它们成为单蛋白链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。Bird等人(1988)Science 242:423-426和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879-5883。此类单链抗体可以通过重组技术或完整抗体的酶促或化学切割来制备。
使用本领域技术人员已知的常规技术获得任何上述抗体片段，并以与完整抗体相同的方式针对结合特异性和中和活性筛选片段。
如本文所用，“抗原”是指抗体可以选择性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质(例如，抗原肽)、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。靶抗原可以是多肽(例如，含有Xaa-Pro基序(例如，磷酸化或非磷酸化的Ser/Thr-Pro基序)的多肽)或肽模拟物(例如，含有Xaa-高脯氨酸基序(例如，磷酸化或非磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸基序)的多肽)。抗原也可以施用给动物以在动物中产生免疫响应。
“结合亲和力”意指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原或抗原肽)之间的总的非共价相互作用的强度。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的标准方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力复合物含有通常倾向于容易与抗原解离的抗体，而高亲和力复合物含有通常倾向于更长时间地保持与抗原结合的抗体。
如本文所用，术语“生物样品”意指源自活细胞的样品材料。生物样品可包括从对象分离的组织、细胞、细胞的蛋白或细胞膜提取物以及生物流体(例如，腹水或脑脊液(CSF))，以及存在于对象体内的组织、细胞和流体。本技术的生物样品包括但不限于取自以下的样品：乳腺组织、肾组织、子宫颈、子宫内膜、头或颈、胆囊、腮腺组织、前列腺、大脑、垂体、肾脏组织、肌肉、食道、胃、小肠、结肠、肝脏、脾脏、胰腺、甲状腺组织、心脏组织、肺组织、膀胱、脂肪组织、淋巴结组织、子宫、卵巢组织、肾上腺组织、睾丸组织、扁桃体、胸腺、血液、头发、颊、皮肤、血清、血浆、CSF、精液、前列腺液、精浆、尿液、粪便、汗液、唾液、痰、粘液、骨髓、淋巴液和眼泪。生物样品也可以从内部器官的活检或癌症中获得。生物样品可以从对象中获取以进行诊断或研究，或可以从未患病的个体获得，作为对照或用于基础研究。样品可通过标准方法获得，包括例如静脉穿刺和手术活检。在某些实施方式中，生物样品是通过针活检获得的乳房、肺、结肠或前列腺组织样品。
如本文所用，术语“CDR移植的抗体”意指其中“受体”抗体的至少一个CDR被来自具有所期望抗原特异性的“供体”抗体的CDR“移植物”替代的抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”意指其中使用重组DNA技术将来自一个物种的单克隆抗体的Fc恒定区(例如，小鼠Fc恒定区)用来自另一物种的抗体的Fc恒定区(例如，人Fc恒定区)替代的抗体。通常参见，Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利No.4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人,Science 240:1041-1043,1988；Liu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443,1987；Liu等人,J.Immunol 139:3521-3526,1987；Sun等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218,1987；Nishimura等人,Cancer Res47:999-1005,1987；Wood等人,Nature 314:446-449,1885；和Shaw等人,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559,1988。
“构象特异性抗体”是识别并特异性地结合至其互补抗原的特定构象(例如，构象异构体或构象子)的抗体或其片段。例如，如本文所述，构象特异性抗体可以特异性地结合至Xaa-Pro基序的顺式构象(例如，顺式pT231-τ)，但不特异性地结合至Xaa-Pro基序的反式构象(例如，反式pT231-τ)，其中，Xaa是丝氨酸或苏氨酸。在某些实施方式中，Ser/Thr-Pro基序可被磷酸化(即，pSer/Thr-Pro)。在这种情况下，构象特异性抗体例如对Xaa-Pro基序的顺式构象的亲和力比对Xaa-Pro基序的反式构象的亲和力大至少10倍至100倍。
如本文所用，术语“共有FR”意指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。抗体的FR区不接触抗原。
如本文所用，术语组合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以实现所期望治疗效果的量，例如，导致与所治疗的疾病(例如与靶多肽相关的疾病或医学疾患(例如，τ蛋白病、创伤性脑损伤(TBI)、中风))相关的症状减少的量。施用给对象的本技术的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的特征，诸如总体健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它也将取决于疾病的程度、严重性和类型。技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。本技术的组合物也可以与一种或多种附加的治疗化合物组合施用。在一些实施方式中，有效量是指在中和顺式-pT231-τ蛋白的活性方面部分或完全有效的本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的量。
如本文所用，术语“效应细胞”意指与免疫响应的认知和活化阶段相反，参与免疫响应的效应阶段的免疫细胞。示例性免疫细胞包括髓样或淋巴样来源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。效应细胞表达特异性的Fc受体并执行特异性的免疫功能。效应细胞可以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcαR的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞参与靶细胞的特异性杀伤，并将抗原呈递给免疫系统的其他组分，或结合至呈递抗原的细胞。
如本文所用，术语“表位”意指能够特异性结合至抗体的蛋白质决定簇。表位通常由化学活性表面分组的分子组成，诸如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性表位和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，失去了与构象性表位而非与非构象性表位的结合。在一些实施方式中，pT231-τ蛋白的顺式构象的“表位”是本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体特异性地结合的蛋白质的区域。
为了筛选与表位结合的抗-顺式-pT231-τ抗体，可以进行常规的交叉阻断测定，诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow和DavidLane编辑(1988)中所述。该测定可以用于确定抗-τ抗体是否结合与本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体相同的位点或表位。替选地或另外地，可以通过本领域已知的方法来进行表位作图。例如，可以例如通过丙氨酸扫描诱变抗体序列，以鉴定接触残基。在不同的方法中，可以将与pT231-τ蛋白不同区域相对应的肽用于与测试抗体或者与测试抗体和具有经表征或已知表位的抗体的竞争测定中。
如本文所用，“表达”包括以下中的一者或多者：将基因转录至前体mRNA中；将前体mRNA剪接和其他处理以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；将成熟mRNA翻译成蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；将翻译产物糖基化和/或其他修饰，如果需要适当的表达和功能。
如本文所用，“升高的表达”是指基因表达或蛋白质表达相较于对照或参考样品增加(例如，相较于对照或正常参考样品增加至少2倍、约2倍至约150倍、5倍至150倍、5倍至100倍、10倍至150倍、10倍至100倍、50倍至150倍、50倍至100倍、75倍至150倍或75倍至100倍)。“降低的表达”是指基因表达或蛋白质表达相较于对照或参考样品总体降低(例如，20％或更大、50％或更大、或75％、80％、85％、90％、95％或更大)。基因表达或蛋白质表达的增加或降低可以使用本领域已知的或本文描述的任何有用的方法(例如ELISA)来确定。对于治疗应用，“降低”可以指与病症(例如，τ蛋白病、TBI或中风)相关的多肽或蛋白质水平的降低。对于诊断或监测应用，“降低”可以是指通过诊断或监测测定检测到的蛋白质或核酸水平的降低。
如本文所用，术语“基因”意指含有RNA产物的受调控生物合成的所有信息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子和其他控制表达的非翻译区域。
如本文所用，术语非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中接受者的高变区残基被来自具有所期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体，诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替代。在一些实施方式中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能，诸如结合亲和力。通常，人源化抗体将包括至少一个并且通常是两个可变结构域(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv)中的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有FR序列的FR区，尽管FR区可以包含一个或多个改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这些氨基酸取代的数目在H链中通常不超过6，并且在L链中不超过3。人源化抗体还可以任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。关于另外的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
如本文所用，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，大概VL中残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)周围，和大概VH中的残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)周围(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.美国国家卫生研究院公共卫生署,马里兰州贝塞斯达.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文所用，术语“同一的”或“同一性”百分比当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，是指两个或更多个相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的序列或子序列(即，当在比较窗上或指定区域上比较并比对最大对应性时，与指定区(例如，编码本文所述的抗体的核苷酸序列或本文所述的抗体的氨基酸序列)具有约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或者通过人工比对和视觉检查(例如NCBI网站)来测量)。此类序列然后被称为“基本上同一的”。该术语也是指或可以应用于测试序列的互补序列。术语还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些。在一些实施方式中，在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸或长度为50至100个氨基酸或核苷酸的区域上存在同一性。
如本文所用，术语“免疫交叉反应”意指与使用不同抗原产生的抗体反应的抗原。
如本文所用，术语“完整抗体”意指具有通过二硫键互连的至少两个重(H)链多肽和两个轻(L)链多肽的抗体。每个重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布着更为保守的区(称为框架区(FR))。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端至羧基末端以以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语关于抗原肽的“模拟物”是指具有与抗原肽KVAVVRTPPKSPS(SEQ ID NO:56)基本相同的结构和/或功能特征的合成化学化合物。模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成，或者可以是天然氨基酸和非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物还可以掺入任何量的保守取代，只要此类取代基本上不改变模拟物的结构或活性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能少量存在的天然存在的突变以外，包含该群的各个抗体是同一的。例如，单克隆抗体可以是源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，而不是其产生的方法。单克隆抗体组成对特定表位展示了单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的性质是从基本上同质的抗体群中获得的，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。可以使用本领域已知的多种技术来制备单克隆抗体，包括例如但不限于杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。例如，待根据本方法使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人,Nature256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以使用以下中描述的技术从噬菌体抗体文库分离：例如Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)。
如本文所用，“神经病症”是指由发育异常、病症、损伤或毒素产生的神经系统的结构或功能中的紊乱，诸如轻度认知损害(MCI)、帕金森氏病(PD)、创伤性脑损伤、进行性核上性麻痹、慢性创伤性脑病变(CTE)、额颞叶痴呆、额颞叶变性、Lytico-Bodig病、缠结优势型痴呆、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、皮克氏病、皮质基底节变性和阿尔茨海默病。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌化合物、等渗和吸收延迟化合物等。药学上可接受的载剂及其制剂是本领域技术人员已知的并且描述于例如Remington’s PharmaceuticalSciences(第20版,A.Gennaro编辑,2000,Lippincott,Williams&Wilkins,宾夕法尼亚州费城)中。
如本文所用，术语“多克隆抗体”意指源自至少两种(2)不同的产生抗体的细胞系的抗体的制备物。该术语的使用包括至少两(2)种抗体的制备物，其含有与抗原的不同表位或区域特异性地结合的抗体。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意指可以是未修饰或经修饰的RNA或DNA的任何RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、作为单链区和双链区的混合物的RNA、及包含DNA和RNA(其可以是单链的或更常见的是双链的或是单链区和双链区的混合物)的杂合分子。此外，多核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一种或多种修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因经修饰的主链的DNA或RNA。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以意指包含两个或更多个通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸的聚合物，即肽等排体。多肽既指通常称为肽、糖肽或寡聚物的短链，又指通常称为蛋白质的长链。多肽可含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽包含通过自然过程(诸如翻译后加工)或通过本领域公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。在基础课本和更详细的专著以及大量研究文献中都对此类修饰进行了充分的描述。
当已经采用物理、机械或化学方法从细胞成分中去除多肽时，多肽或肽可以被认为是“经分离的”或“基本上纯的”。通常认为“经分离的多肽”(例如，经分离的抗体)、“基本上纯的多肽”或“基本上纯的和经分离的多肽”是从细胞成分中去除的，并且当其至少60重量％不含蛋白质和与其天然缔合的天然存在的有机分子时是基本上纯的。多肽可以是至少75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％或99重量％纯。基本上纯的多肽(例如，基本上纯的抗体或其片段)可以通过标准技术、例如通过编码该多肽的重组核酸的表达或通过化学合成多肽来获得。可以通过任何适当的方法(例如通过柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析)来测量纯度。
如本文所用，术语“重组”当指代例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者通过天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或该物质源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或表达以其他形式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
如本文所用，术语“分开的”治疗使用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“依序的”治疗使用是指在不同时间施用至少两种活性成分，施用途径相同或不同。更具体地，依序使用是指在一种或多种其他活性成分开始施用之前一种活性成分的全部施用。因此可以在施用一种或多种其他活性成分之前的几分钟、几小时或几天内施用一种活性成分。在这种情况下，没有同时治疗。
如本文所用，术语“同时的”治疗使用是指通过相同途径并同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所用，术语“对象”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指人或非人动物，例如家养动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马等)、野生动物(蝙蝠、浣熊、狐狸、臭鼬、松鼠、花栗鼠、小鼠、兔等)和实验动物(例如猴子、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。
如本文所用，术语“治疗剂”意指当以有效量存在时对有需要的对象产生期望的治疗效果的化合物。
考虑了本文所述的抗-顺式-pT231-τ抗体的氨基酸序列修饰。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成来制备抗-顺式-pT231-τ抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。只要获得的抗体具有所期望的性质，就可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得感兴趣的抗体。修饰还包括蛋白质糖基化模式的改变。最感兴趣的取代诱变位点包括高变区，但也可以考虑FR改变。“保守取代”示于下表中。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基。用于产生此类取代变体的方便方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。具体来说，将几个高变区位点(例如6个至7个位点)突变以在每个位点生成所有可能的氨基酸取代。因此生成的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒中的M13的基因III产物的融合物。然后如本文公开的，筛选噬菌体展示的变体的生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定候选的高变区位点用于修饰，可以进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合起重要作用的高变区残基。一旦生成了此类变体，就对这组变体进行如本文所述的筛选，并且可以选择在一种或多种相关测定中具有相似或优越性能的抗体用于进一步开发。
如本文所用，“参考样品”是指用于比较目的的任何样品。“正常参考样品”可以是在病症(例如，τ蛋白病、创伤性脑损伤(TBI)或中风)发作之前从同一对象获得的先前样品，来自未患有病症的对象的样品，来自已经成功治疗了病症的对象的样品，或在已知的正常浓度下经纯化的参考多肽的样品。术语“参考标准”或“参考水平”是指源自参考样品的一种或多种基因或蛋白质的值、数字或表达模式。正常参考标准或水平可以是通过以下标准中的至少一者与对象的样品相匹配的源自正常对象的值、数字或表达模式：年龄、体重、疾病阶段和总体健康。在一个实例中，例如指示病症的多肽或者指示病症的多肽构象的正常参考水平在血清样品中小于5ng/ml，在血清样品中小于4ng/ml、小于3ng/ml、小于2ng/ml或小于1ng/ml。“阳性参考”样品、标准品或值是通过以下标准中的至少一者与对象的样品相匹配的源自已知患有病症(例如τ蛋白病、TBI或中风)的对象的样品、标准品、值或数字：年龄、体重、疾病阶段和总体健康。例如，例如指示病症的多肽的阳性参考值大于5ng/ml血清、大于10ng/ml血清、大于20ng/ml血清、大于30ng/ml血清、大于40ng/ml血清或大于50ng/ml血清。
如本文所用，“特异性地结合”是指识别并结合另一种分子(例如，抗原)但基本上不识别并结合其他分子的的分子(例如，抗体)。在一个实例中，特异性地结合pT231-τ的顺式构象的抗体不特异地性结合pT231-τ的反式构象。如本文所用，术语“特异性的结合”、“特异性地结合至”或“特异性于”特定分子(例如，多肽、多肽上的表位或多肽的构象)可以例如通过对其所结合的分子具有至少约10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或更大的Kd的分子表现。术语“特异性地结合”还可以指其中分子(例如，抗体)结合至特定多肽(例如，含Xaa-Pro基序的多肽，其中Xaa是丝氨酸或苏氨酸)、特定多肽上的表位或特定多肽的构象(例如，Xaa-Pro基序的顺式构象，例如顺式pT231-τ)且基本上不结合至任何其他多肽、多肽表位或多肽构象(例如，Xaa-Pro基序的反式构象，例如反式pT231-τ)的结合。例如，构象特异性抗体可对例如Ser/Thr-Pro基序的一种构象(例如，顺式构象)具有的亲和力比对另一种构象(例如，反式构象)的亲和力大例如至少10倍至100倍(例如，亲和力大101倍、102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍、109倍或1010倍)。
如本文所用，“测试样品”意指从感兴趣的对象获得的生物样品。例如，测试样品可以是生物流体(例如，血清)、细胞或组织样品、来自培养或生长培养基的样品、或衍生自其的经分离的核酸或多肽。
“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”涵盖了在诸如人的对象中对本文所述的疾病或病症的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或病症，即引起病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。“治疗τ蛋白病、TBI或中风”意指与τ蛋白病、TBI或中风相关的症状例如被减轻、减少、治愈或处于缓解状态。
还应理解，如本文所述的神经病症的各种治疗模式旨在表示“基本上”，其包括总治疗但也包括小于总治疗，并且其中获得了一些生物学或医学相关的结果。该治疗可以是针对慢性疾病的连续延长治疗，或者是用于治疗急性疾患的单次或几次施用。
I.本技术的组合物
本技术描述了用于生成和使用构象特异性抗体或其片段的方法和组合物。构象特异性抗体可以例如特异性地结合至特定多肽的顺式构象或反式构象。在一些实施方式中，本技术的构象特异性抗体结合至多肽的磷酸化的Ser/Thr-Pro基序的顺式构象(例如，顺式pT231-τ)。构象特异性抗体与其抗原(例如，pT231-τ)的结合可用于治疗、诊断或监测与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的进展中。
本技术的构象特异性抗体可以使用含有例如磷酸化的Xaa-Pro基序的免疫原性抗原来生成，其中Xaa是固定在特定构象中(例如，顺式构象或反式构象)或混合的顺式构象和反式构象中的丝氨酸或苏氨酸。
例如，本技术的含磷酸化的Ser/Thr-Pro的抗原肽的顺式或反式含量可以通过立体选择性合成(Z)-和(E)-烯烃模拟物由Still-Wittig和Ireland-Claisen重排来固定(J.Org.Chem.68:2343-2349(2003)，其在此通过引用并入)。替选地，可以通过用脯氨酸类似物取代脯氨酸氨基酸残基来增加或固定本技术的含磷酸化的Ser/Thr-Pro的抗原肽的顺式或反式含量。脯氨酸类似物包括但不限于高脯氨酸、哌啶酸(Pip)、二甲基脯氨酸(Dmp)、氮杂环丁烷-2-羧酸(Aze)、叔丁基-L-脯氨酸(TBP)、反式4-氟-L-脯氨酸(t-4F-Pro)和顺式-4-氟-L-脯氨酸(c-4F-Pro)。给定抗原的顺式或反式含量可以通过例如核磁共振(NMR)分析来分析。
本技术的抗原肽可以含有磷酸化的或非磷酸化的Xaa-Pro基序，其中Xaa是丝氨酸或苏氨酸，其能够进行顺式/反式异构化。在一些实施方式中，抗原肽可含有τ蛋白的Ser/Thr-Pro基序的氨基酸残基，其中脯氨酸残基被脯氨酸类似物取代。抗原肽还可以含有全长τ多肽的Ser/Thr-Pro基序的氨基酸残基。抗原肽还可包含围绕全长τ多肽的Ser/Thr-Pro基序的另外残基。例如，抗原肽可包含全长τ多肽N-末端的Ser/Thr残基的3-10个氨基酸残基和全长τ多肽的脯氨酸C-末端的3-10个氨基酸残基。本技术的抗原肽可以是例如长度为至少4、5、6、7或8个氨基酸残基。抗原肽可以是长度为8至20个氨基酸残基(例如，长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基)或可以是长度超过20个氨基酸残基。
可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种来产生和纯化此类抗原。抗原肽可以通过例如固相化学合成、体外转录/翻译或通过重组技术来产生和纯化。抗原肽可以任选地化学偶联至载体蛋白，或者所述肽可以作为融合蛋白生成以增加抗原性。抗原肽可以基于其诱导构象特异性抗体产生的能力来筛选。在这方面，此类筛选技术可包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀或其他免疫测定。
可用于产生构象特异性抗体的示例性抗原包括含有磷酸化的或非磷酸化的Ser/Thr-高脯氨酸、Ser/Thr-Pip、Ser/Thr-Dmp、Ser/Thr-Aze、Ser/Thr-TBP、Ser/Thr-t-4F-Pro或Ser/Thr-c-4F-Pro基序的抗原。此类抗原的特定实例包括例如pT231-Pipτ肽和pT231-Dmpτ肽(KVAVVR-pT231-Pro-PKSPS)。此类肽可用作用于生成例如多克隆抗体或单克隆抗体(例如，兔或小鼠单克隆抗体)的抗原。
在一方面，本公开提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域的经分离的抗体，其中，重链免疫球蛋白可变结构域具有以下的氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在另一方面，本公开提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域的经分离的抗体，其中，重链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和本文所述的重链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，信号序列是MRWSCIILFLVATATGVNS(SEQ ID NO:5)或MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:6)。
通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，经分离的抗体包含重链免疫球蛋白可变结构域，其包含信号序列(加下划线)并具有选自以下的氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在另一方面，本公开提供了包含本文所述的重链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列和重链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，重链免疫球蛋白恒定结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：
通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，包含重链免疫球蛋白可变结构域和重链免疫球蛋白恒定结构域(黑体字型)的经分离的抗体具有选自以下的氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在另一方面，本公开提供了包含重链免疫球蛋白可变结构域和重链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体，其中，重链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和重链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，包含重链免疫球蛋白可变结构域和重链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体具有选自以下的氨基酸序列(信号序列加下划线并且重链免疫球蛋白恒定结构域呈黑体)，其中，重链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和重链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
另外地或替选地，在一些实施方式中，本技术的经分离的抗体包含轻链免疫球蛋白可变结构域，其中，轻链免疫球蛋白可变结构域具有以下的氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
另外地或替选地，在另一方面，本公开提供了包含轻链免疫球蛋白可变结构域的经分离的抗体，其中，轻链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和轻链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，信号序列是MKLPVRLLVLMFWIPASNS(SEQ ID NO:43)或MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO:44)。
通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，经分离的抗体包含轻链免疫球蛋白可变结构域，所述轻链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列并具有选自以下的氨基酸序列(信号序列加下划线)：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
另外地或替选地，在另一方面，本公开提供了包含轻链免疫球蛋白可变结构域和轻链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，轻链免疫球蛋白恒定结构域具有以下的氨基酸序列：
通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，包含轻链免疫球蛋白可变结构域和轻链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体具有选自以下的氨基酸序列(轻链免疫球蛋白恒定结构域呈粗体)：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
另外地或替选地，在另一方面，本公开提供了包含轻链免疫球蛋白可变结构域和轻链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体，其中，轻链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和轻链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。通过举例，但不是通过限制，在一些实施方式中，包含轻链免疫球蛋白可变结构域和轻链免疫球蛋白恒定结构域的经分离的抗体具有选自以下的氨基酸序列(信号序列加下划线并且轻链免疫球蛋白恒定结构域呈粗体)，其中，轻链免疫球蛋白可变结构域包含信号序列和轻链免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列：
或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方式中，本技术的经分离的抗体包含含有选自由SEQ ID NO:1-4、7-14、17-40和132-133组成的组的氨基酸序列的至少一条重链。在一些实施方式中，本技术的经分离的抗体包含含有选自由SEQ ID NO:41-42、45-48、50-54和55组成的组的氨基酸序列的至少一条轻链。在一些实施方式中，本技术的经分离的抗体包含含有选自由SEQ ID NO:1-4、7-14、17-40和132-133组成的组的氨基酸序列的至少一条重链和含有选自由SEQ IDNO:41-42、45-48、50-54和55组成的组的氨基酸序列的至少一条轻链。
在一些实施方式中，重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列形成抗原结合位点，所述抗原结合位点结合至包含氨基酸序列KVAVVRTPPKSPS(SEQ ID NO:56)的人顺式-pT231-τ蛋白或其模拟物的表位。
在抗体的一些实施方式中，重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列是相同多肽链的组分。在抗体的一些实施方式中，重链和轻链免疫球蛋白可变结构域序列是不同多肽链的组分。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。
在另一方面，本公开提供了本文公开的抗体的抗原结合片段，其中，抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab)'2、Fab'、scFv和Fv。
在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白。在一些实施方式中，本技术的抗体以小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M或10-12M的解离常数(KD)结合顺式-pT231-τ蛋白。在某些实施方式中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，抗体包含人抗体框架区。
本技术的范围内的抗-顺式-pT231-τ抗体包括例如但不限于特异性地结合靶多肽的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和双体抗体、其同源物、衍生物或片段。可用于本文公开的方法的抗体可包含任何同种型的Fc结构域，例如但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE或IgM和IgY。恒定区序列的非限制实例包括：
人IgD恒定区，Uniprot：P01880 SEQ ID NO:134
人IgG1恒定区，Uniprot：P01857 SEQ ID NO:135
人IgG2恒定区，Uniprot：P01859 SEQ ID NO:136
人IgG3恒定区，Uniprot：P01860 SEQ ID NO:137
人IgM恒定区，Uniprot：P01871 SEQ ID NO:138
人IgG4恒定区，Uniprot:P01861 SEQ ID NO:139
人IgA1恒定区，Uniprot:P01876 SEQ ID NO:140
人IgA2恒定区，Uniprot:P01877 SEQ ID NO:141
人Igκ恒定区，Uniprot:P01834 SEQ ID NO:142
在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体包含与SEQ ID NO:134-140或141至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的重链恒定区。另外地或替选地，在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体包含与SEQ ID NO:142至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一的轻链恒定区。
HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D抗体(包括前导序列)的重链(HC)和轻链(LC)免疫球蛋白可变结构域序列提供在下文中：
| 抗体 | HC可变结构域 | LC可变结构域 |
| HuPT-113A | SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:45 |
| HuPT-113B | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:45 |
| HuPT-113C | SEQ ID NO:9 | SEQ ID NO:45 |
| HuPT-113D | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:45 |
HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II)抗体的重链(HC)和轻链(LC)免疫球蛋白序列提供于下：
| 抗体 | HC | LC |
| HuPT-113D IgG1-AA(II) | SEQ ID NO:39 | SEQ ID NO:55 |
| HuPT-113D IgG4(II) | SEQ ID NO:40 | SEQ ID NO:55 |
| HuPT-113D IgG1(II) | SEQ ID NO:132 | SEQ ID NO:55 |
在抗体的一些实施方式中，HC可变结构域序列包含HuPT-113A的可变结构域序列并且LC可变结构域序列包含HuPT-113A的可变结构域序列。在某些实施方式中，抗体还包含选自由以下组成的组的HC恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。在某些实施方式中，抗体含有在位置234和235处包含Leu至Ala的氨基酸取代的IgG1恒定区。
在抗体的一些实施方式中，HC可变结构域序列包含HuPT-113B的可变结构域序列并且LC可变结构域序列包含HuPT-113B的可变结构域序列。在某些实施方式中，抗体还包含选自由以下组成的组的HC恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。在某些实施方式中，抗体含有在位置234和235处包含Leu至Ala的氨基酸取代的IgG1恒定区。
在抗体的一些实施方式中，HC可变结构域序列包含HuPT-113C的可变结构域序列并且LC可变结构域序列包含HuPT-113C的可变结构域序列。在某些实施方式中，抗体还包含选自由以下组成的组的HC恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。在某些实施方式中，抗体含有在位置234和235处包含Leu至Ala的氨基酸取代的IgG1恒定区。
在抗体的一些实施方式中，HC可变结构域序列包含HuPT-113D的可变结构域序列并且LC可变结构域序列包含HuPT-113D的可变结构域序列。在某些实施方式中，抗体还包含选自由以下组成的组的HC恒定区：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM。在某些实施方式中，抗体含有在位置234和235处包含Leu至Ala的氨基酸取代的IgG1恒定区。
在某些实施方式中，经分离的抗体包含以下特征中的一者或多者：(a)轻链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:45至少85％同一；和/或(b)重链免疫球蛋白可变结构域序列与SEQ ID NO:7-10中的任一者至少85％同一。在另一方面，本文提供的抗体中的一种或多种氨基酸残基被另一种氨基酸取代。取代可以是如本文所定义的“保守取代”。
在本文提供的抗体的一些方面中，抗体含有促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的结构修饰。在一些方面，顺式-pT231-τ抗体含有抗体的CH2恒定重链区中的促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放的缺失。在一些方面，Fab片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。在一些方面，F(ab)’2片段用于促进快速结合和细胞摄取和/或缓慢释放。
在一些实施方式中，本技术提供了编码本技术的顺式-pT231-τ中和抗体或其片段的核酸序列。在一些实施方式中，本技术提供了表达编码本技术的顺式-pT231-τ中和抗体的核酸序列的宿主细胞。
本技术的抗体可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更多的多特异性。多特异性抗体可以对本技术的顺式-pT231-τ蛋白的不同表位是特异性的或可以对顺式-pT231-τ蛋白以及异源组合物(诸如异源多肽或固体支撑物材料)两者是特异性的。参见，例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,J.Immunol.147:60-69(1991)；美国专利No.5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；6,106,835；Kostelny等人,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。在一些实施方式中，抗体是嵌合的。在某些实施方式中，抗体是人源化的。
本技术的抗体还可以在N-末端或C-末端重组地融合至异源多肽或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，可以将本技术的抗体重组地融合或缀合至在检测测定中用作标记的分子和效应分子，诸如异源多肽、药物或毒素。参见，例如WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995；和EP 0 396 387。
A.制备本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的方法
总体概述.首先，选择本技术的抗体可以针对的靶多肽。例如，抗体可以针对全长τ蛋白、或τ蛋白的在位置231含磷酸化的苏氨酸的一部分(pT231)。用于生成针对此类靶多肽的抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。此类技术的实例包括例如但不限于涉及展示文库、异种或人小鼠杂交瘤等的那些。在本技术范围内的靶多肽包括能够引发免疫响应的任何源自含pT231的τ蛋白的多肽。对顺式-pT231-τ蛋白具有特异性的抗体的制备说明于实施例2至实施例8中。
应当理解，针对顺式-pT231-τ蛋白及其片段的重组工程化的抗体和抗体片段(例如抗体相关的多肽)适合根据本公开使用。
可以经受本文所述的技术的抗-顺式-pT231-τ抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体以及抗体片段，诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、scFv、双体抗体、抗体轻链、抗体重链和/或抗体片段。已经描述了用于高产量产生含抗体Fv的多肽(例如Fab′和F(ab′)2抗体片段)的方法。参见美国专利No.5,648,237。
通常，抗体获自起源物种。更特别地，获得了对靶多肽抗原具有特异性的起源物种抗体的轻链、重链或两者的可变部分的核酸或氨基酸序列。起源物种是可用于生成本技术的抗体或抗体文库的任何物种，例如大鼠、小鼠、兔、鸡、猴、人等。
噬菌体或噬菌粒展示技术是衍生本技术抗体的有用技术。用于生成和克隆单克隆抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。编码本技术的抗体的序列的表达可以在大肠埃希氏菌(E.coli)中进行。
由于核酸编码序列的简并性，在本技术的实践中可以使用编码与天然存在的蛋白质的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的其他序列。这些包括但不限于包括编码上述多肽的全部或部分核酸序列的核酸序列，其通过在序列内编码功能上等效的氨基酸残基的不同密码子的取代而改变，从而产生沉默变化。应当理解，根据本技术的免疫球蛋白的核苷酸序列容许通过标准方法(“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,”Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications,第127-149页,1998,Alan R.Liss,Inc.)计算的至多25％的序列同源变异，只要这样的变体形成识别顺式-pT231-τ蛋白的协同抗体。例如，多肽序列内的一个或多个氨基酸残基可以被具有相似极性的另一种氨基酸(充当功能等效物)取代，从而导致沉默改变。序列内氨基酸的取代基可以在该氨基酸所属类别的其他成员中选择。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在翻译期间或之后例如通过糖基化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等被差异修饰的蛋白质或其片段或衍生物也包括在本技术的范围内。另外，编码免疫球蛋白的核酸序列可以在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或在编码区产生变异和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏先前存在的限制性核酸内切酶位点以促进进一步的体外修饰。可以使用本领域已知的任何用于诱变的技术，包括但不限于体外定点诱变，J.Biol.Chem.253:6551，使用Tab接头(Pharmacia)等。
多克隆抗血清和免疫原的制备.生成本技术的抗体或抗体片段的方法通常包括用经纯化的顺式-pT231-τ蛋白或其片段或用表达顺式-pT231-τ蛋白或其片段的细胞使对象(通常是非人对象，诸如小鼠或兔)免疫。适当的免疫原性制备物可以含有例如重组表达的顺式-pT231-τ蛋白或化学合成的顺式-pT231-τ肽。pT231-τ蛋白或其部分或片段的顺式构象可以用作免疫原，以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术生成与顺式-pT231-τ蛋白或其部分或片段结合的抗-顺式-pT231-τ抗体。
全长pT231-τ蛋白或其片段可与免疫原一样用作片段。在一些实施方式中，pT231-τ片段包含氨基酸序列KVAVVRTPPKSPS(SEQ ID NO:56)或其模拟物的至少八个氨基酸残基，并且涵盖了pT231-τ蛋白的表位，使得针对肽的抗体与顺式-pT231-τ蛋白形成特异性免疫复合物。
在一些实施方式中，含pT231的抗原性τ肽包含至少5、8、10、15、20或30个氨基酸残基。根据用途和根据本领域技术人员公知的方法，有时更长的抗原肽比更短的抗原肽更符合期望。给定表位的多聚体有时比单体更有效。
如果需要，可以通过融合或缀合至半抗原(诸如钥孔戚血蓝素(KLH)或卵清蛋白(OVA))来提高顺式-pT231-τ蛋白(或其片段)的免疫原性。许多此类半抗原是本领域已知的。也可以将顺式-pT231-τ蛋白与常规佐剂(诸如弗氏完全或不完全佐剂)组合，以增加对象对该多肽的免疫反应。用于提高免疫响应的各种佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚等)、人佐剂(诸如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))或类似的免疫刺激化合物。这些技术在本领域中是标准的。
在描述本技术中，免疫响应可被描述为“初级”或“次级”免疫响应。初级免疫响应也被称为“保护性”免疫响应，是指由于对特定抗原(例如顺式-pT231-τ蛋白)的一些初始暴露(例如，初始“免疫”)而在个体中产生的免疫响应。在一些实施方式中，免疫可以通过用含有抗原的疫苗给个体接种疫苗而发生。例如，疫苗可以是包含一种或多种顺式-pT231-τ蛋白-源性抗原的顺式-pT231-τ疫苗。随着时间推移，初级免疫响应可以变弱或减弱，甚至可以消失或至少减弱到无法检测。因此，本技术还涉及“次级”免疫响应，也被描述为“记忆免疫响应”。术语次级免疫响应是指在已经产生初级免疫响应后在个体中引发的免疫响应。
因此，可以引发次级免疫响应，例如以增强已经变弱或减弱的现有免疫响应，或者重建已经消失或不可以再被检测到的先前的免疫响应。次级或记忆免疫响应可以是体液(抗体)响应或细胞响应。次级或记忆体液响应发生在第一次呈递抗原时生成的记忆B细胞的刺激之后。延迟型超敏反应(DTH)是一类由CD4+T细胞介导的细胞次级或记忆免疫响应。首次暴露于抗原启动免疫系统，并且附加的一次或多次暴露导致DTH。
适当的免疫后，可以从对象的血清中制备抗-顺式-pT231-τ抗体。如果期望，针对顺式-pT231-τ蛋白的抗体分子可以从哺乳动物(例如从血液)分离，并通过众所周知的技术(诸如多肽A色谱)进一步纯化以获得IgG部分。
单克隆抗体.在本技术的一个实施方式中，抗体是抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体。例如，在一些实施方式中，抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体可以是人或小鼠抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体。为了制备针对pT231-τ蛋白的顺式构象的单克隆抗体或其衍生物、片段、类似物或同源物，可以利用任何由持续细胞系培养提供抗体分子产生的技术。此类技术包括但不限于杂交瘤技术(参见，例如Kohler&Milstein,1975.Nature 256:495-497)；三源杂交瘤技术；人B-细胞杂交瘤技术(参见，例如Kozbor等人,1983.Immunol.Today 4:72)和EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(参见，例如Cole等人,1985.In:MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)。人单克隆抗体可用于实践本技术并可通过使用人杂交瘤(参见，如Cote,等人,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030)或通过用Epstein Barr病毒体外转化人B-细胞(参见，如Cole等人,1985.In:MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)来产生。例如，可以分离出编码抗体区的核酸群。利用源自编码抗体保守区的序列的引物的PCR用于从该群中扩增编码抗体部分的序列，然后从经扩增的序列重建编码抗体或其片段(诸如可变结构域)的DNA。此类经扩增的序列也可以融合至编码其他蛋白(例如噬菌体外壳或细菌细胞表面蛋白)的DNA，以在噬菌体或细菌上表达和展示融合多肽。然后经扩增的序列可以被表达并基于例如经表达的抗体或其片段对pT231-τ蛋白的顺式构象上存在的抗原或表位的亲和力来进一步选择或分离。替选地，可以通过免疫对象并然后使用常规方法从对象的脾脏中分离杂交瘤来制备表达抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体的杂交瘤。参见，例如Milstein等人,(Galfre和Milstein,Methods Enzymol(1981)73:3-46)。使用标准方法筛选杂交瘤将产生具有不同特异性(即针对不同表位)和亲和力的单克隆抗体。具有所期望性质(例如，顺式-pT231-τ结合)的选定的单克隆抗体可以如杂交瘤表达所使用，其可以结合至分子(诸如聚乙二醇(PEG))以改变其性质，或可以将编码其的cDNA以各种方式分离、测序并操作。可以将合成树状聚合树添加到反应性氨基酸侧链(例如赖氨酸)，以增强顺式-pT231-τ蛋白的免疫原性质。同样，CPG-二核苷酸技术可以用于增强顺式-pT231-τ蛋白的免疫原性。其他操作包括取代或缺失在储存过程中或在施用给对象后导致抗体不稳定的特定氨基酰基残基，以及亲和力成熟技术以改善顺式-pT231-τ蛋白的抗体的亲和力。
杂交瘤技术.在一些实施方式中，本技术的抗体是通过杂交瘤产生的抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体，其包括融合至永生化细胞的获自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如，转基因小鼠)的B细胞。杂交瘤技术包括本领域已知并且Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,纽约州冷泉港,349(1988)；Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,563-681(1981)中教导的那些。用于产生杂交瘤和单克隆抗体的其他方法是本领域技术人员众所周知的。
噬菌体展示技术.如上所述，可以通过应用重组DNA和噬菌体展示技术来产生本技术的抗体。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来制备抗-顺式-pT231-τ抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。通过直接用抗原(通常具有结合或捕获至固体表面或珠粒的抗原)选择，从库或组合抗体文库(例如人或鼠)中选择具有所期望结合特性的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括带有Fab、Fv或二硫化物稳定的Fv抗体结构域的fd和M13，它们重组地融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白。此外，方法可以适用于构建Fab表达文库(参见，例如Huse等人,.Science 246:1275-1281,1989)以允许快速且有效地鉴定对顺式-pT231-τ多肽(例如多肽或其衍生物、片段、类似物或同源物)具有所期望特异性的单克隆Fab片段。可以用于制备本技术的抗体的噬菌体展示方法的其他实例包括以下中公开的那些：Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,85:5879-5883,1988；Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,87:1066-1070,1990；Brinkman等人,J.Immunol.Methods182:41-50,1995；Ames等人,J.Immunol.Methods 184:177-186,1995；Kettleborough等人,Eur.J.Immunol.24:952-958,1994；Persic等人,Gene187:9-18,1997；Burton等人,Advances in Immunology 57:191-280,1994；PCT/GB91/01134；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；WO 96/06213；WO 92/01047(Medical Research Council等人)；WO 97/08320(Morphosys)；WO 92/01047(CAT/MRC)；WO 91/17271(Affymax)；和美国专利No.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743。用于通过经由二硫键附接多肽而在噬菌体颗粒表面上展示多肽的方法由Lohning,美国专利No.6,753,136描述。如以上参考文献中所述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并用于生成完整抗体，包括人抗体或任何其他所期望的抗原结合片段，并在包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌的任何所期望宿主中表达。例如，重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术还可以使用本领域已知的方法来采用，诸如以下中公开的那些：WO 92/22324；Mullinax等人,BioTechniques12:864-869,1992；和Sawai等人,AJRI 34:26-34,1995；和Better等人,Science240:1041-1043,1988。
通常，可以针对适当的抗原选择克隆到展示载体中的杂合抗体或杂合抗体片段，以鉴定保持良好结合活性的变体，因为抗体或抗体片段将存在于噬菌体或噬菌粒颗粒的表面上。参见，例如Barbas III等人,Phage Display,A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press,纽约州冷泉港,2001)。然而，其他载体形式也可以用于该过程，诸如将抗体片段文库克隆至裂解噬菌体载体(修饰的T7或Lambda Zap系统)中用于选择和/或筛选。
重组抗-顺式-pT231-τ抗体的表达.如上所述，可以通过应用重组DNA技术来产生本技术的抗体。编码本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的重组多核苷酸构建体通常包括可操作地连接至抗-顺式-pT231-τ抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然缔合的或异源的启动子区。因此，本技术的另一方面包括含有一个或多个编码本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的核酸序列的载体。为了本技术的一种或多种多肽的重组表达，将含有编码抗-顺式-pT231-τ抗体的全部或部分核苷酸序列的核酸通过本领域公知和如下所详述的重组DNA技术插入适当的克隆载体、或表达载体(即，含有用于转录和翻译插入的多肽编码序列所必需的元件的载体)中。用于产生多种载体群的方法已由Lerner等人,美国专利No.6,291,160和6,680,192描述。
通常，可用于重组DNA技术中的表达载体通常为质粒形式。在本公开中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本技术旨在包括在技术上不是质粒的此类其他形式的表达载体，诸如用作等效功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。此类病毒载体允许对象感染以及此对象中构建体的表达。在一些实施方式中，表达控制序列是载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统。一旦将载体掺入适当的宿主中，就将宿主维持在适用于高水平表达编码抗-顺式-pT231-τ抗体的核苷酸序列以及收集和纯化抗-顺式-pT231-τ抗体(例如，交叉反应性抗-顺式-pT231-τ抗体)的条件下。通常参见，U.S.2002/0199213。这些表达载体通常可以作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体含有选择标记，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测用所期望DNA序列转化的那些细胞。载体还可以编码可用于指导细胞外抗体片段的分泌的信号肽，例如果胶酸裂合酶。参见美国专利No.5,576,195。
本技术的重组表达载体包含呈适合于在宿主细胞中表达核酸的形式的编码具有顺式-pT231-τ结合特性的蛋白的核酸，这意味着重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞选择的一个或多个调控序列，其与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”意指感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接至一个或多个调控序列。术语“调控序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于例如Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,加利福利亚州圣地亚哥(1990)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些，以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所期望多肽的表达水平的因素。用作重组多肽表达(例如，抗-顺式-pT231-τ抗体)的启动子的典型调控序列包括例如但不限于3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶的启动子。诱导型酵母启动子尤其包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。在一个实施方式中，编码本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的多核苷酸可操作地连接至ara B启动子并可在宿主细胞中表达。参见美国专利5,028,530。可以将本技术的表达载体引入宿主细胞中，从而产生如由本文所述的核酸编码的多肽或肽、包括融合多肽(例如，抗-顺式-pT231-τ抗体等)。
本技术的另一方面涉及表达抗-顺式-pT231-τ抗体的宿主细胞，其含有编码一种或多种抗-顺式-pT231-τ抗体的核酸。可以设计本技术的重组表达载体以在原核或真核细胞中表达抗-顺式-pT231-τ抗体。例如，抗-顺式-pT231-τ抗体可以在细菌细胞(诸如大肠埃希氏菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞(例如酵母、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,加利福利亚州圣地亚哥(1990)中。替选地，重组表达载体可以例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。先前已经描述了用于经由表达随机生成的多核苷酸序列来制备和筛选具有预定特性的多肽、例如抗-顺式-pT231-τ抗体的方法。参见美国专利No.5,763,192；5,723,323；5,814,476；5,817,483；5,824,514；5,976,862；6,492,107；6,569,641。
多肽在原核生物中的表达最常见的是在大肠埃希氏菌中用含有指导融合或非融合多肽表达的组成型或诱导型启动子的载体进行。融合载体向其中编码的多肽、通常向重组多肽的氨基末端添加多个氨基酸。此类融合载体通常用于三个目的：(i)增加重组多肽的表达；(ii)增加重组多肽的溶解度；和(iii)通过在亲和纯化中充当配体来帮助重组多肽的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组多肽的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在纯化融合多肽之后能够从融合部分分离重组多肽。此类酶及其同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,马塞诸塞州贝弗利)和pRIT5(Pharmacia,新泽西州皮斯卡塔韦)，其将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合多肽或多肽A分别融合至靶重组多肽。
适合的诱导型非融合大肠埃希氏菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,加利福利亚州圣地亚哥(1990)60-89)。用于经由多肽融合来靶向组装不同的活性肽或蛋白结构域以产生多功能多肽的方法由Pack等人,美国专利No.6,294,353；6,692,935描述。一种最大化重组多肽(例如抗-顺式-pT231-τ抗体)在大肠埃希氏菌中表达的策略是在蛋白水解切割重组多肽的能力受损的宿主细菌中表达该多肽。参见，例如Gottesman,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS INENZYMOLOGY 185,Academic Press,加利福利亚州圣地亚哥(1990)119-128。另一种策略是改变要插入表达载体的核酸的核酸序列，以使每个氨基酸的各个密码子是在表达宿主(例如大肠埃希氏菌)中优先使用的那些(参见，例如Wada,等人,1992.Nucl.Acids Res.20:2111-2118)。本技术的核酸序列的此类改变可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方式中，抗-顺式-pT231-τ抗体表达载体是酵母表达载体。用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari,等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,Cell 30:933-943,1982)、pJRY88(Schultz等人,Gene 54:113-123,1987)、pYES2(Invitrogen Corporation,加利福利亚州圣地亚哥)和picZ(Invitrogen Corp,加利福利亚州圣地亚哥)。替选地，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达抗-顺式-pT231-τ抗体。可用于在培养的昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达多肽(例如抗-顺式-pT231-τ抗体)的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人,Mol.Cell.Biol.3:2156-2165,1983)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.Virology 170:31-39)。
在又一个实施方式中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达编码本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括例如但不限于pCDM8(Seed,Nature 329:840,1987)和pMT2PC(Kaufman等人,EMBO J.6:187-195,1987)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于其他适用于可用于表达本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的原核和真核细胞两者的表达系统，参见，例如Sambrook,等人,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,纽约州冷泉港,1989的第16章和17章。
在另一个实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够指导特定细胞类型(例如组织特异性调控元件)中核酸的表达。组织特异性调控元件是本领域已知的。适合的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert,等人,Genes Dev.1:268-277,1987)、淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton,Adv.Immunol.43:235-275,1988)、T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore,EMBO J.8:729-733,1989)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等人,1983.Cell 33:729-740；Queen和Baltimore,Cell 33:741-748,1983.)、神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477,1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等人,1985.Science 230:912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请公开No.264,166)。还涵盖了发育调控的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss,Science 249:374-379,1990)和α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,Genes Dev.3:537-546,1989)。
本方法的另一方面涉及其中已引入本技术的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，此类术语不仅指代特定的对象细胞，而且还指此类细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，因此此类后代实际上可与亲本细胞不相同，但仍包含在如本文所用的术语的范围内。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，抗-顺式-pT231-τ抗体可以在细菌细胞(诸如大肠埃希氏菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达。哺乳动物细胞是适用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段的宿主。参见Winnacker,From Genes ToClones,(VCH Publishers,纽约,1987)。在本领域中已经开发了许多能够分泌完整异源蛋白质的适合的宿主细胞系，其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、L细胞和骨髓瘤细胞系。在一些实施方式中，细胞是非人的。这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子、以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。Queen等人,Immunol.Rev.89:49,1986。说明性表达控制序列是源自内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。Co等人,J Immunol.148:1149,1992。其他适合的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
可以经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意在指代用于将外来核酸(例如DNA)引入宿主细胞的各种本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、生物弹射或基于病毒的转染。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见Sambrook等人,Molecular Cloning)。适用于转化或转染宿主细胞的方法可以见于Sambrook等人(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约州冷泉港,1989)和其他实验室手册。根据细胞宿主的类型，可以通过众所周知的方法将含有感兴趣的DNA区段的载体转移至宿主细胞中。
为了稳定地转染哺乳动物细胞，已知根据所使用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。各种选择标记包括赋予药物抗性的那些，诸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。可以将编码选择标记的核酸如编码抗-顺式-pT231-τ抗体的核酸在相同的载体上引入到宿主细胞中，或者可以在单独的载体上引入到宿主细胞中。可以通过药物选择来鉴定被引入的核酸稳定转染的细胞(例如，掺入选择标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
包含本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的宿主细胞(诸如培养中的原核或真核宿主细胞)可以用于产生(即表达)重组抗-顺式-pT231-τ抗体。在一个实施方式中，该方法包括在适合的培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码抗-顺式-pT231-τ抗体的重组表达载体)，以产生抗-顺式-pT231-τ抗体。在另一个实施方式中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离抗-顺式-pT231-τ抗体的步骤。一旦表达，就从培养基和宿主细胞中纯化抗-顺式-pT231-τ抗体的集合，例如抗-顺式-pT231-τ抗体或抗-顺式-pT231-τ抗体相关多肽。抗-顺式-pT231-τ抗体可以根据本领域的标准程序纯化，包括HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等。在一个实施方式中，抗-顺式-pT231-τ抗体是通过Boss等人，美国专利No.4,816,397的方法在宿主生物体中产生的。通常，抗-顺式-pT231-τ抗体链被表达为具有信号序列，并因此释放到培养基。然而，如果抗-顺式-pT231-τ抗体链不是由宿主细胞天然分泌的，则抗-顺式-pT231-τ抗体链可以通过用温和的去污剂处理而释放。重组多肽的纯化是本领域众所周知的，并且包括硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化技术、柱色谱、离子交换纯化技术、凝胶电泳等(通常参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,纽约,1982)。
可以将编码抗-顺式-pT231-τ抗体的多核苷酸(例如抗-顺式-pT231-τ抗体编码序列)掺入转基因中，以引入转基因动物的基因组中，并随后在转基因动物的乳汁中表达。参见，例如美国专利No.5,741,957、5,304,489和5,849,992。适合的转基因包括与来自乳腺特异性基因的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列，诸如酪蛋白或β-乳球蛋白。为了产生转基因动物，可以将转基因显微注射到受精的卵母细胞中，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的核转移到去核卵母细胞中。
单链抗体.在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体是单链抗-顺式-pT231-τ抗体。根据本技术，技术可以适用于产生对顺式-pT231-τ蛋白具有特异性的单链抗体(参见，例如美国专利No.4,946,778)。可以用于产生单链Fv的技术和本技术的抗体的实例包括以下中描述的那些：美国专利No.4,946,778和5,258,498；Huston等人,Methods inEnzymology,203:46-88,1991；Shu,L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7995-7999,1993；和Skerra等人,Science240:1038-1040,1988。
嵌合抗体和人源化抗体.在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体是嵌合抗-顺式-pT231-τ抗体。在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体是人源化抗-顺式-pT231-τ抗体。在本技术的一个实施方式中，供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体。例如，受体抗体是人抗体(以使其对人体的抗原性最小)，在这种情况下，所得的CDR移植抗体被称为“人源化”抗体。
包含人部分和非人部分的重组抗-顺式-pT231-τ抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体)可以使用标准重组DNA技术制备，并且在本技术的范围内。对于一些用途，包括在人体内使用本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体以及在体外检测测定中使用这些试剂，可以使用嵌合或人源化抗-顺式-pT231-τ抗体。可以通过本领域已知的重组DNA技术来产生此类嵌合和人源化单克隆抗体。此类有用的方法包括例如但不限于以下中描述的方法：国际申请No.PCT/US86/02269；美国专利No.5,225,539；欧洲专利No.184187；欧洲专利No.171496；欧洲专利No.173494；PCT国际公开No.WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；5,225,539；欧洲专利No.125023；Better等人,1988.Science 240:1041-1043；Liu等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人,1987.J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987.CancerRes.47:999-1005；Wood等人,1985.Nature 314:446-449；Shaw等人,1988.J.Natl.CancerInst.80:1553-1559；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4:214；Jones等人,1986.Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988.Science 239:1534；Morrison,Science229:1202,1985；Oi等人,BioTechniques4:214,1986；Gillies等人,J.Immunol.Methods,125:191-202,1989；美国专利No.5,807,715；和Beidler,等人,1988.J.Immunol.141:4053-4060。例如，抗体可以使用多种技术来人源化，包括CDR-移植(EP 0 239400；WO 91/09967；美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,248,516；EP460167)、镶面或表面重修(EP 0 592 106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,Molecular Immunology,28:489-498,1991；Studnicka等人,Protein Engineering7:805-814,1994；Roguska等人,PNAS91:969-973,1994)、和链改组(美国专利No.5,565,332)。在一个实施方式中，编码鼠抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体的cDNA用特别选择的限制酶消化以去除编码Fc恒定区的序列，并将编码人Fc恒定区的cDNA的等效部分取代(参见Robinson等人,PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利No.4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988)Science 240:1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人(1987)JImmunol139:3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res 47:999-1005；Wood等人(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；美国专利No.6,180,370；美国专利No.6,300,064；6,696,248；6,706,484；6,828,422)。
在一个实施方式中，本技术提供了不可能诱导人抗-小鼠抗体(在下文中称为“HAMA”)响应同时仍然具有有效抗体效应子功能的人源化抗-顺式-pT231-τ抗体的构建。如本文所用，就抗体而言的术语“人”和“人源化”涉及预期在人对象中诱发治疗上可耐受的弱免疫原性响应的任何抗体。在一个实施方式中，本技术提供了人源化抗-顺式-pT231-τ抗体、重链和轻链免疫球蛋白。
CDR抗体.在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体是抗-顺式-pT231-τCDR抗体。通常，用于生成抗-顺式-pT231-τCDR抗体的供体和受体抗体是来自不同物种的单克隆抗体；通常，受体抗体是人抗体(以最小化其在人体内的抗原性)，在这种情况下，所得的CDR移植抗体被称为“人源化”抗体。移植物可以属于受体抗体的单个VH或VL内的单个CDR(或甚至单个CDR的一部分)，或可以属于VH和VL中的一者或两者内的多个CDR(或其部分)。通常，受体抗体的所有可变结构域中的所有三个CDR都将被相应的供体CDR取代，尽管只需要替代尽可能多的CDR，以使所得的CDR移植抗体与顺式-pT231-τ蛋白充分结合。用于生成CDR-移植抗体和人源化抗体的方法由以下教导：Queen等人,美国专利No.5,585,089；美国专利No.5,693,761；美国专利No.5,693,762；和Winter U.S.5,225,539；和EP 0682040。用于制备VH和VL多肽的方法由以下教导：Winter等人,美国专利No.4,816,397；6,291,158；6,291,159；6,291,161；6,545,142；EP 0368684；EP0451216；和EP0120694。
在从同一家族和/或同一家族成员中选择适合的框架区候选物后，通过将来自起源物种的CDR移植至杂合框架区中来产生重链和轻链可变区中的任一者或二者。可以使用本领域技术人员已知的常规方法完成就上述方面中任一方面而言具有杂合可变链区的杂合抗体或杂合抗体片段的组装。例如，可以通过寡核苷酸合成和/或PCR来产生编码本文所述的杂合可变结构域的DNA序列(即，基于靶物种的框架和来自起源物种的CDR)。也可以使用适合的限制酶从起源物种抗体中分离出编码CDR区的核酸，并通过与适合的连接酶连接而将其连接至靶物种框架中。替选地，可以通过定点诱变来改变起源物种抗体的可变链的框架区。
由于杂合体是从对应于每个框架区的多个候选物中的选择来构建的，因此存在许多根据本文所述的原理可修改以构建的序列组合。因此，可以组装杂合体的文库，其成员具有各个框架区的不同组合。此类文库可以是序列的电子数据库集合或杂合体的物理集合。
该过程通常不改变侧接有移植CDR的受体抗体的FR。然而，本领域技术人员有时可以通过替换给定FR的某些残基以使FR与供体抗体的相应FR更相似，来提高所得抗-顺式-pT231-τCDR-移植抗体的抗原结合亲和力。适合的取代位置包括与CDR相邻或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见，例如US5,585,089，特别是第12-16列)。或者，本领域的技术人员可以从供体FR开始并对其进行修饰，使其更类似于受体FR或人共有FR。用于进行这些修饰的技术是本领域已知的。特别是如果所得的FR符合此位置的人共有FR，或与此类共有FR是至少90％或更多同一的，则与具有完全人FR的相同抗体相比，这样做可能不显著增加所得修饰的抗-顺式-pT231-τCDR-移植抗体的抗原性。
融合蛋白.在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体是融合蛋白。当与第二蛋白质融合时，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可以用作抗原标记。可以与多肽融合的结构域的实例不仅包括异源信号序列，而且还包括其他异源功能区。融合不一定必须是直接的，但可以通过接头序列发生。此外，本技术的融合蛋白也可以被工程化以改善抗-顺式-pT231-τ抗体的特性。例如，可以添加附加的氨基酸(特别是带电荷的氨基酸)的区至抗-顺式-pT231-τ抗体的N-末端，以提高从宿主细胞纯化或后续处理和储存期间的稳定性和持久性。此外，可以将肽部分添加至抗-顺式-pT231-τ抗体以促进纯化。可以在最终制备抗-顺式-pT231-τ抗体之前去除此类区。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域熟知和常规的技术。可以将本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体融合至有助于纯化融合的多肽的标记序列，诸如肽。在选择的实施方式中，标记氨基酸序列是六-组氨酸肽，诸如尤其是在pQE载体(QIAGEN,Inc.,加利福利亚州查茨沃思)中提供的标记，其中许多是可商购获得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824,1989所述，例如，六-组氨酸提供了方便地纯化融合蛋白。另一种可用于纯化的肽标记即“HA”标记对应于源自流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。
因此，可以使用本技术的多核苷酸或多肽来工程化这些上述融合蛋白中的任一种。另外，在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白在体内显示出增加的半衰期。
与单独的单体分泌蛋白或蛋白片段相比，具有二硫化物连接的二聚体结构(由于IgG)的融合蛋白可以更有效地结合和中和其他分子。Fountoulakis等人,J.Biochem.270:3958-3964,1995。
类似地，EP-A-O 464 533(加拿大同族2045869)公开了融合蛋白，其包含免疫球蛋白分子恒定区的各个部分以及另一种人蛋白或其片段。在许多情况下，融合蛋白中的Fc部分在治疗和诊断中是有益的，并因此可以导致例如改善的药代动力学性质。参见EP-A 0232262。替选地，可能期望在表达、检测和纯化融合蛋白后缺失Fc部分。例如，如果将融合蛋白用作免疫接种的抗原，则Fc部分可以阻碍治疗和诊断。在药物开发中，例如人蛋白(诸如hIL-5)已与Fc部分融合在一起，目的是进行高通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂。Bennett等人,J.Molecular Recognition8:52-58,1995；Johanson等人,J.Biol.Chem.,270:9459-9471,1995。
经标记的抗-顺式-pT231-τ抗体.在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体与标记部分(即可检测基团)偶联。与抗-顺式-pT231-τ抗体缀合的特定标记或可检测基团不是该技术的关键方面，只要它不显著干扰本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体与顺式-pT231-τ蛋白的特异性结合。可检测基团可以是具有可检测物理或化学性质的任何材料。此类可检测标记在免疫测定和成像领域已经得到了很好的发展。通常，在此类方法中有用的几乎任何标记都可以应用于本技术。因此，标记是通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组合物。在本技术的实践中有用的标记包括磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如3H、14C、35S、125I、121I、131I、112In、99mTc)、其他成像剂诸如微泡(用于超声成像)、18F、11C、15O(用于正电子发射断层成像)、9mTC、111In(用于单光子发射断层成像)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)和量热标记诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。描述此类标记用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241，每个通过引用并出于所有目的整体并入本文。还参见Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals(第6版,Molecular Probes,Inc.,俄勒冈州尤金)。
可以根据本领域众所周知的方法将标记直接或间接偶联至测定的所期望组分。如上所指示，可以使用各种各样的标记，标记的选择取决于诸如以下的因素：所需的灵敏度、与化合物缀合的难易程度、稳定性要求、可用的仪器以及处置规定。
非放射性标记通常通过间接方式附接。通常，配体分子(例如生物素)与分子共价结合。然后，配体结合至抗配体(例如，链霉亲和素)分子，所述分子是固有可检测的或共价结合至信号系统，诸如可检测的酶、荧光化合物或化学发光化合物。可以使用许多配体和抗配体。当配体具有天然抗配体(例如生物素、甲状腺素和皮质醇)时，可以与标记的天然存在的抗配体结合使用它。替选地，可以将任何半抗原或抗原性化合物与抗体(例如抗-顺式-pT231-τ抗体)组合使用。
分子也可以例如通过与酶或荧光团缀合而直接缀合至信号产生化合物。作为标记的感兴趣的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，或氧化还原酶，特别是过氧化物酶。可用作标记部分的荧光化合物包括但不限于例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。可用作标记部分的化学发光化合物包括但不限于例如荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利No.4,391,904。
检测标记的装置是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，在标记是放射标记的情况下，用于检测的装置包括如放射自显影中的闪烁计数器或摄影胶片。如果标记是荧光标记，则可以通过用适当波长的光激发荧光色素并检测产生的荧光来检测它。荧光可以通过照相胶片的手段、通过使用电子检测器(诸如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等)在视觉上检测。类似地，可以通过为酶提供适当的底物并检测所得的反应产物来检测酶促标记。最后，可以简单地通过观察与标记相关的颜色来检测简单的比色标记。因此，在各种试纸条(dipstick)测定中，缀合金通常看起来为粉红色，而各种缀合珠粒看起来是珠粒的颜色。
一些测定形式不需要使用标记的组分。例如，凝集测定可以用于检测靶抗体(例如抗-顺式-pT231-τ抗体)的存在。在这种情况下，抗原包被的颗粒被包含靶抗体的样品凝集。以这种形式，不需要标记任何组分，并且可以通过简单的目视检查来检测靶抗体的存在。
B.鉴定和表征本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体
用于鉴定和/或筛选本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的方法。用于对对顺式-pT231-τ蛋白具有所期望的特异性的那些鉴定和筛选针对顺式-pT231-τ多肽的抗体的方法包括本领域已知的任何免疫介导的技术。可以通过本领域普通技术人员熟知的各种方法在体外检测免疫响应的组分。例如，(1)可以将细胞毒性T淋巴细胞与放射性标记的靶细胞一起孵育，并通过放射性释放来检测这些靶细胞的裂解；(2)辅助T淋巴细胞可以与抗原和抗原呈递细胞一起孵育，并通过标准方法测量细胞因子的合成和分泌(Windhagen A等人,Immunity,2:373-80,1995)；(3)抗原呈递细胞可以与全蛋白抗原一起孵育，并通过T淋巴细胞活化测定或生物物理方法检测此抗原在MHC上的呈递(Harding等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,86:4230-4,1989)；(4)肥大细胞可以与交联其Fc-ε受体的试剂一起孵育并通过酶免疫测定测量组胺释放(Siraganian等人,TIPS,4:432-437,1983)；和(5)酶联免疫吸附测定(ELISA)。
类似地，还可以通过本领域普通技术人员众所周知的各种方法来检测模型生物体(例如小鼠)或人对象中免疫响应的产物。例如，(1)可以通过临床实验室当前使用的标准方法(例如ELISA)容易地检测出响应于疫苗接种的抗体产生；(2)可以通过划伤皮肤表面并放置无菌容器以捕获划伤部位上的迁移细胞来检测免疫细胞向炎症部位的迁移(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；(3)响应于有丝分裂原的外周血液单核细胞(PBMC)增殖或混合的淋巴细胞反应可以使用3H-胸苷测量；(4)PBMC中的粒细胞、巨噬细胞和其他吞噬细胞的吞噬能力可以通过将PBMC与标记的颗粒一起放置在孔中进行测量(Peters等人,Blood,72:1310-5,1988)；和(5)免疫系统细胞的分化可以通过用CD分子(诸如CD4和CD8)的抗体标记PBMC并测量表达这些标记的PBMC的部分来测量。
在一个实施方式中，使用顺式-pT231-τ肽展示于可复制的遗传包装表面上来选择本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体。参见，例如美国专利No.5,514,548；5,837,500；5,871,907；5,885,793；5,969,108；6,225,447；6,291,650；6,492,160；EP 585 287；EP 605522；EP616640；EP 1024191；EP 589 877；EP 774 511；EP 844 306。已经描述了用于产生/选择含有编码具有所期望特异性的结合分子的噬菌粒基因组的丝状噬菌体颗粒的方法。参见，例如EP 774 511；US 5871907；US 5969108；US 6225447；US 6291650；US 6492160。
在一些实施方式中，使用顺式-pT231-τ肽展示于酵母宿主细胞表面上来选择本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体。用于通过酵母表面展示来分离scFv多肽的方法已经由以下描述：Kieke等人,Protein Eng.1997Nov；10(11):1303-10。
在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体使用核糖体展示来选择。用于在肽文库中使用核糖体展示来鉴定配体的方法已经由以下描述：Mattheakis等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9022-26,1994；和Hanes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937-42,1997。
在某些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体使用顺式-pT231-τ肽的tRNA展示来选择。用于使用tRNA展示进行体外选择配体的方法已经由以下描述：Merryman等人,Chem.Biol.,9:741-46,2002。
在一个实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体使用RNA展示来选择。用于使用RNA展示文库选择肽和蛋白的方法已经由以下描述：Roberts等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-302,1997；和Nemoto等人,FEBS Lett.,414:405-8,1997。用于使用非天然的RNA展示文库选择肽和蛋白的方法已经由以下描述：Frankel等人,Curr.Opin.Struct.Biol.,13:506-12,2003。
在一些实施方式中，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体在革兰氏阴性细菌的周质中表达，并与经标记的顺式-pT231-τ蛋白混合。参见WO 02/34886。在表达对顺式-pT231-τ蛋白具有亲和力的重组多肽的克隆中，与抗-顺式-pT231-τ抗体结合的经标记的顺式-pT231-τ蛋白的浓度增加，并允许从文库的剩余部分分离细胞，如Harvey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.22:9193-98 2004和美国专利公开No.2004/0058403所述。
在选择了所期望的抗-顺式-pT231-τ抗体之后，预期可以通过本领域技术人员已知的任何技术(例如原核或真核细胞表达等)大量产生所述抗体。例如但不限于抗-顺式-pT231-τ杂合抗体或片段的抗-顺式-pT231-τ抗体可以通过使用常规技术来构建编码抗体重链的表达载体而产生，其中保留原始物种抗体结合特异性(根据本文所述技术进行工程化)所需的CDR和必要时可变区构架的最小部分源自起源物种抗体并且剩余的抗体源自可以如本文所述操纵的靶物种免疫球蛋白，从而产生用于表达杂合抗体重链的载体。
顺式-pT231-τ结合的测量.在一些实施方式中，顺式-pT231-τ结合测定是指以下测定形式：其中顺式-pT231-τ蛋白和抗-顺式-pT231-τ抗体在适用于在顺式-pT231-τ蛋白和抗-顺式-pT231-τ抗体之间结合并评估顺式-pT231-τ蛋白和抗-顺式-pT231-τ抗体之间结合的量的条件下混合。将结合量与适合的对照比较，该对照可以是在顺式-pT231-τ蛋白不存在下的结合量、在非特异性免疫球蛋白组合物存在下的结合量、或两者。结合量可以通过任何适合的方法来评估。结合测定包括例如ELISA、放射免疫测定、闪烁邻近测定、荧光能量转移测定、液相色谱、膜过滤测定等。用于直接测量顺式-pT231-τ蛋白与抗-顺式-pT231-τ抗体结合的生物物理测定是例如核磁共振、荧光、荧光偏振、表面等离振子共振(BIACORE芯片)等。通过本领域已知的标准测定来测定特异性结合，例如放射性配体结合测定、ELISA、FRET、免疫沉淀、SPR、NMR(2D-NMR)、质谱等。如果候选抗-顺式-pT231-τ抗体的特异性结合比不存在候选抗-顺式-pT231-τ抗体下观察到的结合大至少1％，则候选抗-顺式-pT231-τ抗体可用作本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体。
顺式-pT231-τ中和的测量.如本文所用，“顺式-pT231-τ中和”是指通过抗-顺式-pT231-τ抗体的结合降低顺式-pT231-τ蛋白的活性和/或表达。可以使用本领域已知的方法在体外或体内评估本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体中和顺式-pT231-τ活性/表达的能力。参见，例如WO 2014152157；Yanamandra等人,Ann Clin Transl Neurol.2(3):278-288(2015)。
II.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的用途
概况.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可用于与顺式-pT231-τ蛋白的定位和/或定量有关的本领域已知的方法中(例如，用于测量在适当的范围内的顺式-pT231-τ蛋白的水平)。本技术的抗体可用于通过诸如亲和色谱或免疫沉淀的标准技术分离顺式-pT231-τ蛋白。本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可以促进纯化来自生物样品(例如哺乳动物血清或细胞)的天然免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白以及在宿主系统中表达的重组产生的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白。此外，抗-顺式-pT231-τ抗体可以用于检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白(例如，在血浆、细胞裂解液或细胞上清液中)，以评价免疫反应性多肽的表达的丰度和模式。本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可以作为临床测试程序的一部分诊断性地用于监测组织中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白水平，例如以确定给定治疗方案的功效。如上所述，可以通过将本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体偶联(即物理连接)至可检测物质来促进检测。
顺式-pT231-τ蛋白的检测.用于检测生物样品中免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的存在或不存在的示例性方法涉及从测试对象获得生物样品，并使生物样品与能够检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体接触，使得在生物样品中检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的存在。可以通过附接至抗体的可检测标记来完成检测。
关于抗-顺式-pT231-τ抗体的术语“标记的”旨在涵盖通过将可检测的物质偶联(即物理连接)至抗体而直接标记抗体，以及通过与直接标记的另一种化合物(诸如二级抗体)的反应性来间接标记抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体，以及用生物素末端标记DNA探针，使得可以用荧光标记的链霉亲和素对其进行检测。
本技术的检测方法可以用于在体外以及在体内检测生物样品中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白。用于检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、放射免疫测定和免疫荧光。此外，用于检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的体内技术包括将标记的抗-顺式-pT231-τ抗体引入对象中。例如，抗-顺式-pT231-τ抗体可以用放射性标记来标记，该放射性标记在对象中的存在和位置可以通过标准成像技术检测。在一个实施方式中，生物样品含有来自测试对象的顺式-pT231-τ蛋白分子。
免疫测定和成像.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可以用于使用基于抗体的技术来测定生物样品(例如，人血浆)中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白水平。例如，组织中的蛋白表达可以用典型的免疫组织学方法研究。Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.101:976-985,1985；Jalkanen,M.等人,J.Cell.Biol.105:3087-3096,1987。可用于检测蛋白基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。适合的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记(诸如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素或其他放射性试剂(例如碘(125I、121I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))、以及荧光标记(诸如荧光素、罗丹明和绿色荧光蛋白(GFP))以及生物素。
除了测定生物样品中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白水平外，本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体还可用于顺式-pT231-τ的体内成像。可用于该方法的抗体包括通过X射线照相、NMR或ESR可检测到的那些。对于X射线照相，适合的标记包括放射性同位素，诸如钡或铯，其发出可检测的辐射，但不对对象造成明显伤害。适用于NMR和ESR的标记包括具有可检测特征自旋的标记，诸如氘，其可以通过标记相关scFv克隆的营养物质而掺入抗-顺式-pT231-τ抗体中。
将已用适当的可检测成像部分(诸如放射性同位素(如131I、112In、99mTc)、不透射线的物质或通过核磁共振可检测的物质)标记的抗-顺式-pT231-τ抗体引入(例如，肠胃外、皮下或腹膜内)对象中。在本领域中将理解，对象的大小和所使用的成像系统将确定产生诊断图像所需的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人对象，注入的放射性量通常为约5至20毫居里的99mTc。然后，经标记的抗-顺式-pT231-τ抗体将积聚在含有特异性靶多肽的细胞的位置处。例如，本技术的经标记的抗-顺式-pT231-τ抗体将在对象内在顺式-pT231-τ蛋白所定位的细胞和组织中积累。
因此，本技术提供了医学疾患的诊断方法，其涉及：(a)通过测量本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体在个体的细胞或体液中的结合来测定免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的表达；(b)将样品中存在的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的量与标准参考进行比较，其中，免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白水平与标准品相比的升高或降低指示医学疾患。
亲和力纯化.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可用于纯化来自样品的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白。在一些实施方式中，抗体固定在固体支撑物上。此类固体支撑物的实例包括塑料(诸如聚碳酸酯)、复合的碳水化合物(诸如琼脂糖和琼脂糖凝胶)、丙烯酸树脂以及诸如聚丙烯酰胺和乳胶珠粒。用于偶联抗体至此类固体支撑物的技术是本领域公知的(Weir等人,“Handbook of Experimental Immunology”第4版,Blackwell ScientificPublications,英国牛津,第10章(1986)；Jacoby等人,Meth.Enzym.34Academic Press,纽约(1974))。
使抗原与抗体支撑物基质结合的最简单方法是将珠粒收集在柱中，并将抗原溶液从柱中通下来。该方法的效率取决于经固定的抗体与抗原之间的接触时间，这可以通过使用低流速来延长。经固定的抗体在抗原流过时捕获抗原。替选地，可以通过将抗原溶液与支撑物(例如珠粒)混合并旋转或摇动浆液来使抗原与抗体支撑物基质接触，从而使抗原和固定的抗体之间达到最大接触。结合反应完成后，将浆液通入柱中以收集珠粒。使用适合的洗涤缓冲液洗涤珠粒，然后洗脱纯的或基本上纯的抗原。
感兴趣的抗体或多肽可以缀合至固体支撑物，诸如珠粒。另外，如果期望，还可以通过任何适合的方式(包括本文公开的用于将多肽缀合至支撑物的那些方式)将第一固体支撑物(诸如珠粒)缀合至第二固体支撑物，该第二固体支撑物可以是第二珠粒或其他支撑物。因此，本文公开的关于多肽与固体支撑物的缀合的任何缀合方法和手段也可以应用于将第一支撑物缀合至第二支撑物，其中第一和第二固体支撑物可以相同或不同。
用于将多肽缀合至固体支撑物的适当接头(可以是交联剂)包括可以与支撑物表面上存在的官能团或与多肽或两者反应的多种试剂。用作交联剂的试剂包括均双功能试剂，并且特别是杂双功能试剂。有用的双功能交联剂包括但不限于N-SIAB、二马来酰亚胺、DTNB、N-SATA、N-SPDP、SMCC和6-HYNIC。可以选择交联剂以在多肽和固体支撑物之间提供选择性地可切割的键。例如，可以使用光不稳定的交联剂、诸如3-氨基-(2-硝基苯基)丙酸作为从固体支撑物上切割多肽的手段。(Brown等人,Mol.Divers,第4-12页(1995)；Rothschild等人,Nucl.Acids Res.,24:351-66(1996)；和美国专利No.5,643,722)。其他交联试剂是本领域公知的。(参见，例如Wong(1991)，同上；和Hermanson(1996)，同上)。
可以通过在羧基基团官能化珠粒与多肽的氨基末端之间形成的共价酰胺键，或者相反地，通过在氨基基团官能化珠粒与多肽的羧基末端之间形成的共价酰胺键，将抗体或多肽固定在固体支撑物、诸如珠粒上。另外，双官能的三苯甲基接头可以经由氨基树脂通过树脂上的氨基基团或羧基基团附接至支撑物，例如至树脂(诸如Wang树脂)上的4-硝基苯基活性酯。使用双功能三苯甲基方法，固体支撑物可以需要用挥发性酸(诸如甲酸或三氟乙酸)处理，以确保多肽被切割并可以去除。在此类情况下，多肽可以作为无珠贴片沉积在固体支撑物的孔的底部或固体支撑物的平坦表面上。添加基质溶液后，可以将多肽解吸到MS中。
通过使用挥发性酸或适当的基质溶液(例如含有3-HPA的基质溶液)从多肽上切割氨基连接的三苯甲基基团，疏水的三苯甲基接头也可以用作酸不稳定的接头。也可以改变酸不稳定性。例如，可以将三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三甲氧基三苯甲基改变为该多肽的适当的对位取代的或更酸不稳定的三苯甲基胺衍生物，即可以将三苯甲基醚键和三苯甲基胺键连接至该多肽。因此，可以在酸性条件下(包括，如果期望，在典型的MS条件下，其中基质、诸如3-HPA用作酸)，例如通过破坏疏水吸引力或通过切割三苯甲基醚键或三苯甲基胺键从疏水性接头去除多肽。
正交可切割的接头也可以用于将第一固体支撑物(例如珠粒)结合至第二固体支撑物，或用于将感兴趣的多肽结合至固体支撑物。使用此类接头，可以从第二固体支撑物选择性地切割第一固体支撑物、例如珠粒，而无需从支撑物上切割多肽；然后可以在以后的时间从珠粒切割多肽。例如，可以采用可以使用还原剂、诸如DTT切割的二硫化物接头以将珠粒结合至第二固体支撑物，并且可以将酸可切割的双官能三苯甲基基团用于将多肽固定至支撑物。根据期望，可以首先切割多肽与固体支撑物的键联，例如使第一和第二支撑物之间的键联完整。三苯甲基接头可以提供共价或疏水缀合，并且不论缀合的性质如何，三苯甲基基团在酸性条件下均易于切割。
例如，珠粒可以通过连接基团结合至第二支撑物，可以选择连接基团的长度和化学性质使得促进珠粒与固体支撑物的高密度结合、或多肽与珠粒的高密度结合。此类连接基团可以具有例如“树状”结构，从而为固体支撑物上的每个附接位点提供多个官能团。此类连接基团的实例；包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、季戊四醇和三-羟基-氨基甲烷。
非共价结合缔合.通过非共价相互作用，抗体或多肽可以缀合至固体支撑物，或者第一固体支撑物也可以缀合至第二固体支撑物。例如，由能够被磁化的铁磁性材料制成的磁珠可以被吸引到磁性固体支撑物，并且可以通过去除磁场而从支撑物释放。替选地，固体支撑物可以提供有离子部分或疏水部分，其可以允许离子部分或疏水部分分别与多肽(例如含有附接的三苯甲基基团的多肽)或具有疏水性特性的第二固体支撑物相互作用。
固体支撑物也可以提供有特异性结合对的成员，并且因此可以缀合至含有互补结合部分的多肽或第二固体支撑物。例如，涂有亲和素或链霉亲和素的珠粒可以结合至其中掺入有生物素部分的多肽，或结合至涂有生物素或生物素衍生物、诸如亚氨基生物素的第二固体支撑物。
应当认识到，本文公开的或本领域另外已知的任何结合成员都可以反转。因此，可以将例如生物素掺入多肽或固体支撑物中，相反，可以将亲和素或其他生物素结合部分分别掺入支撑物或多肽中。预期用于本文的其他特异性结合对包括但不限于激素及其受体，酶及其底物，核苷酸序列及其互补序列，抗体和与其特异性地相互作用的抗原，以及本领域技术人员已知的其他此类对。
A.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的诊断用途
概况.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体可用于诊断方法中。因此，本技术提供了使用该抗体来诊断对象中的顺式-pT231-τ活性的方法。可以选择本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体，使得它们具有任何水平的表位结合特异性和对顺式-pT231-τ蛋白的非常高的结合亲和力。通常，抗体的结合亲和力越高，可以在免疫测定中进行更严格的洗涤条件以去除非特异性结合的物质而不去除靶多肽。因此，可用于诊断测定的本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体通常具有至少108、109、1010、1011或1012M-1的结合亲和力。此外，期望的是，用作诊断试剂的抗-顺式-pT231-τ抗体具有足够的动力学速率以在标准条件下在至少12h、至少五(5)h或至少一(1)小时内实现平衡。
抗-顺式-pT231-τ抗体可以用于检测多种标准测定形式的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白。此类形式包括免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、放射免疫测定和免疫计量测定。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(Cold Spring HarborPublications,纽约,1988)；美国专利No.3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,879,262；4,034,074，3,791,932；3,817,837；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；和4,098,876。可以从对象的任何组织或体液中获得生物样品。在某些实施方式中，对象处于所述τ蛋白病的早期。在一个实施方式中，所述τ蛋白病的早期通过获自所述对象的样品中升高水平的顺式pT231-τ或顺式pT231-τ:反式pT231-τ比率的增加来确定。在一些实施方式中，该方法还包括确定获自对象的样品中CSF t-τ、pT181-τ、Αβ42的水平或ApoE4水平。在某些实施方式中，样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。在一些实施方式中，对象具有反复脑创伤史。
免疫计量或夹心测定是用于本技术的诊断方法的一种形式。参见美国专利No.4,376,110、4,486,530、5,914,241和5,965,375。此类测定使用固定至固相的一种抗体(例如抗-顺式-pT231-τ抗体)或抗-顺式-pT231-τ抗体群，和在溶液中的另一种抗-顺式-pT231-τ抗体或抗-顺式-pT231-τ抗体群。通常，将溶液抗-顺式-pT231-τ抗体或抗-顺式-pT231-τ抗体群被标记。如果使用抗体群，则该群在靶多肽内可以含有抗体结合至不同表位特异性。因此，相同的群既可以用于固相又可用于溶液抗体。如果使用抗-顺式-pT231-τ单克隆抗体，则将具有不同结合特异性的第一和第二顺式-pT231-τ单克隆抗体用于固相和溶液相。固相(也称为“捕获”)和溶液(也称为“检测”)抗体可以按顺序或同时与靶抗原接触。如果首先接触固相抗体，则该测定称为正向测定。相反，如果首先接触溶液抗体，则该测定称为反向测定。如果靶标同时与两种抗体接触，则该测定称为同时测定。在使顺式-pT231-τ蛋白与抗-顺式-pT231-τ抗体接触后，将样品孵育一段时间，通常从约10分钟变化至约24小时并且通常为约1小时。然后执行洗涤步骤以去除未与用作诊断试剂的抗-顺式-pT231-τ抗体特异性结合的样品组分。当固相和溶液抗体在单独的步骤中结合时，可以在任何一个或两个结合步骤之后进行洗涤。洗涤后，通常通过检测通过标记的溶液抗体的结合而与固相连接的标记来定量结合。通常对于给定的抗体对或抗体群以及给定的反应条件，由含有已知浓度的靶抗原的样品制备校准曲线。然后通过从校准曲线(即标准曲线)内插来读取被测试的样品中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的浓度。可以从平衡时结合的标记的溶液抗体的量或通过在达到平衡之前的一系列时间点对结合的标记的溶液抗体的动力学测量来测量分析物。此类曲线的斜率是样品中顺式-pT231-τ蛋白浓度的量度。
适用于上述方法的支撑物包括，例如硝酸纤维素膜、尼龙膜和衍生化的尼龙膜，以及还有颗粒，诸如琼脂糖、基于葡聚糖的凝胶、试纸条、颗粒、微球、磁性颗粒、试管、微量滴定仪孔、SEPHADEXTM(Amersham Pharmacia Biotech,新泽西州皮斯卡塔韦)等。固定化可以通过吸收或通过共价附接进行。任选地，抗-顺式-pT231-τ抗体可以连接至接头分子(诸如生物素)，以附接至表面结合的接头(诸如亲和素)。
B.本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体的治疗用途
本技术的抗体可用于治疗特征在于病理学上高水平的磷酸化的τ蛋白的顺式构象的神经病症。此类治疗可以用于被鉴定为具有病理学上高水平的磷酸化的τ的顺式构象的患者(例如，通过本文所述的方法诊断的那些)或被诊断有已知与此类病理学上水平相关的疾病的患者。可以通过本技术的抗体治疗的神经病症的实例包括：阿尔茨海默氏病(AD)、轻度认知损害(MCI)、帕金森氏病(PD)、皮质基底节变性、皮克氏病、中风、创伤性脑损伤(TBI)、慢性创伤性脑病变(CTE)、进行性核上性麻痹、额颞叶变性、Lytico-Bodig病、缠结优势型痴呆、脑膜血管瘤病和亚急性硬化性全脑炎。
本技术的组合物可以与可用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的其他治疗剂结合使用。例如，本技术的抗体可以与至少一种选自由多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚和氯化锂组成的组的附加治疗剂分开地、依序地或同时地施用。
本技术的组合物可以任选地以单次弹丸注射(bolus)的形式施用于有需要的对象。替选地，给药方案可包括在τNFT出现后的不同时间进行的多次施用。
可以通过任何适合的途径进行施用，包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、经直肠、颅内、鞘内或局部。施用包括自己施用和由他人施用。还应理解，如所述的医学疾患的各种治疗模式旨在表示“基本上”，其包括总治疗但也包括小于总治疗，并且其中获得了一些生物学或医学相关的结果。
在一些实施方式中，本技术的抗体包括药物制剂，其可以以一种或多种剂量施用给有需要的对象。可以调整剂量方案以提供所期望的响应(例如治疗响应)。
通常，足以实现治疗效果的本技术的抗体组合物的有效量为每天每千克体重约0.000001mg至每天每千克体重约10,000mg。通常，剂量为约0.0001mg/千克体重/天至约100mg/千克体重/天。对于抗-顺式-pT231-τ抗体的施用，每周、每两周或每三周的剂量为每千克对象体重的约0.0001至100mg，并且更通常为0.01至5mg。例如，剂量可以是每周、每两周或每三周1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在每周、每两周或每三周1mg/kg至10mg/kg内。在一个实施方式中，抗体的单个剂量为0.1-10,000毫克/kg体重。在一个实施方式中，载体中抗体的浓度为每递送毫升0.2至2000微克。示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月施用一次。抗-顺式-pT231-τ抗体可以多次施用。单次剂量之间的间隔可以是每小时、每天、每周、每月或每年。如通过测量对象中抗体的血液水平所指示的，间隔也可以是不规律的。在一些方法中，调节剂量以使对象中的血清抗体浓度达到约75μg/mL至约125μg/mL、100μg/mL至约150μg/mL、约125μg/mL至约175μg/mL或约150μg/mL至约200μg/mL。替选地，抗-顺式-pT231-τ抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少频率的施用。剂量和频率根据抗体在对象中的半衰期而改变。施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要相对短的间隔的相对高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，或直到对象显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向对象施用预防性方案。
毒性.最佳地，本文所述的抗-顺式-pT231-τ抗体的有效量(例如剂量)将提供治疗益处，而不引起对对象的显著毒性。本文所述的抗-顺式-pT231-τ抗体的毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来确定，例如通过确定LD50(群体50％的致死剂量)或LD100(群体100％的致死剂量)。毒性效果和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于制定对于在人体内使用无毒的剂量范围。本文所述的抗-顺式-pT231-τ抗体的剂量在循环浓度的范围内，该循环浓度包括几乎没有毒性或没有毒性的有效剂量。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的施用途径。确切的制剂、施用途径和剂量可以由各个医师根据对象的情况来选择。参见，例如Fingl等人,In:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第1章(1975).
药物组合物制剂.根据本技术的方法，可以将抗-顺式-pT231-τ抗体掺入适用于施用的药物组合物中。药物组合物通常包含适于施用给对象的形式的重组或基本上纯化的天然抗体和药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂部分地通过所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，存在多种适用于施用抗体组合物的药物组合物制剂(参见，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿,第18版,1990)。通常将药物组合物配制成无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药品管理局的所有良好生产规范(GMP)规定。
术语“药学上可接受的”、“生理学上可耐受的”及其语法变体当指组合物、载剂、稀释剂和试剂时可互换使用，并且表示该物质能够施用于或施用给对象而不产生不期望的生理作用至将阻止施用组合物的程度。例如，“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备药物组合物的赋形剂，其通常是安全、无毒且期望的并且包括兽医用以及人药学用可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体、或者在气雾剂组合物的情况下是气体。“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有所期望药理性质的盐和酯。此类盐包括在组合物中存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应的情况下可以形成的盐。适合的无机盐包括与碱金属(例如钠和钾、镁、钙和铝)形成的那些。适合的有机盐包括与有机碱(诸如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等)形成的那些。此类盐还包括与无机酸(例如盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如乙酸、柠檬酸、马来酸以及烷烃-磺酸和芳烃-磺酸，诸如甲磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由抗-顺式-pT231-τ抗体中存在的羧基、磺酰氧基和膦酰氧基基团形成的酯，例如C1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸-单盐或酯或二盐或酯；并且类似地，当存在多于两个酸性基团时，此类基团中的一些或全部可以被盐化或酯化。以该技术命名的抗-顺式-pT231-τ抗体可以以未盐化或未酯化形式或以盐化和/或酯化形式存在，并且此类抗-顺式-pT231-τ抗体的命名旨在包括原始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。此外，本技术的某些实施方式可以以多于一种的立体异构体形式存在，并且此类抗-顺式-pT231-τ抗体的命名意在包括所有单一的立体异构体以及此类立体异构体的所有混合物(是外消旋的或其他形式)。对于本技术的特定药物和组合物，本领域普通技术人员将不难确定适当的施用时机、顺序和剂量。
此类载剂或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性媒介物，诸如不挥发性油。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或化合物与抗-顺式-pT231-τ抗体不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
将本技术的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。本技术的抗-顺式-pT231-τ抗体组合物可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、皮内、透皮、经直肠、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内；或肌内途径，或作为吸入剂来施用。抗-顺式-pT231-τ抗体可以任选地与至少部分地有效治疗包括各种肌动蛋白-相关疾病或微丝-相关疾病的各种疾病的其他试剂组合施用。
用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或混悬液可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌化合物，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的化合物，诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱、诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以装入玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当水可溶时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内施用，适合的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,新泽西州帕西波尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的，并且应该以易于注射存在的程度流动。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须进行防腐处理以防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌化合物(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现防止微生物的作用。在许多情况下，理想的是在组合物中包含等渗化合物，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现注射组合物的延长吸收。
无菌注射溶液可以通过将所需量的抗-顺式-pT231-τ抗体与(根据需要)以上列举的成分中的一者或组合掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将抗-顺式-pT231-τ抗体掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所期望成分的粉末。本技术的抗体可以以贮库(depot)注射剂或植入物制剂的形式施用，其可以以允许活性成分缓释或脉冲式释放的方式配制。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以装入明胶胶囊中或压成片剂。出于口服治疗性施用的目的，抗-顺式-pT231-τ抗体可以与赋形剂一起掺入并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以使用流体载剂制备以用作漱口水，其中将流体载剂中的化合物口服施加和漱口、并吐出或吞咽。药学上相容的结合化合物和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有以下成分或具有类似性质的化合物中任一种：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解性化合物，诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味化合物，诸如蔗糖或糖精；或调味化合物，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙色调味料。
为了通过吸入施用，抗-顺式-pT231-τ抗体以气溶胶喷雾的形式从含有适合的推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压容器或分配器、或者喷雾器中递送。
全身性施用也可以通过经粘膜或透皮方式进行。对于经粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如对于经粘膜施用，去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮施用，将抗-顺式-pT231-τ抗体配制成软膏、药膏、凝胶或乳膏，如本领域通常已知的。
抗-顺式-pT231-τ抗体也可以以栓剂形式(例如与常规栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯一起)或保留灌肠剂形式制备为药物组合物，用于经直肠递送。
在一个实施方式中，抗-顺式-pT231-τ抗体用将保护抗-顺式-pT231-τ抗体免于从身体快速消除的载剂制备，诸如控释制剂，包括植入物和微囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对本领域技术人员而言是明显的。该材料也可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。脂质体悬浮液(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如如美国专利No.4,522,811所述。
1.C.试剂盒
本技术提供了用于诊断和/或治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的试剂盒，其包括本技术的至少一种抗体或其功能变体(例如，取代变体)。任选地，将本技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并标记用于诊断和/或治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症。可以将以上提及的组分以水性、任选地无菌的溶液或复溶用的冻干、任选地无菌的制剂形式储存在单位或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶、小瓶、瓶、注射器和试管。试剂盒还可包括第二容器，其容纳适用于将药物组合物稀释为更高体积的稀释剂。合适的稀释剂包括但不限于药物组合物和盐溶液的药学上可接受的赋形剂。此外，试剂盒可包括用于稀释药物组合物的说明书和/或用于施用药物组合物的说明书，无论是否稀释。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)制成，并且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或带有塞子的小瓶，其可以被皮下注射针刺穿)。试剂盒还可以包括更多的容器，这些容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户的角度来看所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器、用于一种或多种合适的宿主的培养基。试剂盒可任选地包括通常包括在治疗或诊断产品的商业包装中的说明书，该说明书含有关于例如关于此类治疗或诊断产品的使用的适应症、用法、剂量、制造、施用、禁忌症和/或警告的信息。
试剂盒可用于检测生物样品中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的存在，该生物样品例如任何体液，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、囊性液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，并且包括人体组织的活检样品。例如，试剂盒可以包括：能够结合生物样品中的顺式-pT231-τ蛋白的本技术的一种或多种抗-顺式-pT231-τ抗体(或其抗原结合片段)；用于测定样品中的顺式-pT231-τ蛋白的量的装置；以及用于将样品中的免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的量与标准品进行比较的装置。可以标记一种或多种抗-顺式-pT231-τ抗体。试剂盒组分(例如试剂)可以包装在适合的容器中。试剂盒还可以包括使用试剂盒检测免疫反应性顺式-pT231-τ蛋白的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包括，例如1)第一抗体，例如本技术的顺式-pT231-τ抗体，其附接至与顺式-pT231-τ蛋白结合的固体支撑物；以及任选地；2)第二不同的抗体，其结合至顺式-pT231-τ蛋白或第一抗体，并缀合至可检测的标记。
试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包括检测可检测的标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品比较。试剂盒的每个组分都可以封装在单独的容器中，并且所有各种容器都可以连同解释使用该试剂盒执行的测定的结果的说明书在单个包装中。本技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或在试剂盒容器中含有书面产品。书面产品描述了在有需要的对象中如何使用试剂盒中所含的试剂，例如用于体外或体内检测顺式-pT231-τ蛋白，或用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症。在某些实施方式中，试剂的使用可以根据本技术的方法。
实施例
通过以下实施例进一步说明本技术，其不应以任何方式解释为限制。以下实施例说明了本技术的示例性构象特异性磷酸化的τ(pT231-τ)抗体的制备、表征和用途。实施例1至实施例12证明了本技术的嵌合抗体和人源化抗体的产生，以及它们的结合特异性的表征。
实施例1–小鼠PT-113单克隆抗体的可变区的序列
根据供应商的方案，使用TRIzol试剂(Invitrogen,加利福尼亚州卡尔斯巴德)从约106个小鼠PT-113杂交瘤细胞中提取总RNA(参见WO 2014152157)。根据供应商的方案，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech，加利福尼亚州山景城)合成了用于5’-RACE的Oligo dT-引发的cDNA。重链和轻链的可变结构域cDNA使用特异性重组至小鼠重链和轻链恒定区的3’引物和在SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒中提供的5’-RACE引物，通过利用高保真DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific,美国马塞诸塞州沃尔瑟姆)的聚合酶链反应(PCR)来扩增。MCG2b(5’-GCCAGTGGATAGACTGATGG-3’)用作基因特异性3’引物以扩增VH。对于VL扩增，使用MCK(5’-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3’)。
将经扩增的VH和VL cDNA亚克隆到pJet1.2载体(Thermo Fisher Scientific)中用于序列测定。DNA测序是在Eurofins Genomics(肯塔基州路易斯维尔)以JetRev(5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’)作为引物进行的。对若干个重链和轻链克隆测序，并鉴定与典型的小鼠重链和轻链可变区同源的独特序列。小鼠PT-113 IgG2b/κ单克隆抗体的重链和轻链可变区(分别为VH和VL)的核苷酸序列与它们推导的氨基酸序列分别显示在图1和图2中。
图3基于Kabat定义，显示了小鼠PT-113VH结构域的每个氨基酸残基的位置以及互补决定区(CDR)的位置。图3还显示了PT-113VH结构域与其预测的小鼠亲本种系V区段IGHV1S127*01及其JH2区段之间的氨基酸序列的比对。星号指示PT-113VH和IGHV1S127*01氨基酸序列之间的差异，这最可能是由于体细胞超突变引起的。
图4基于Kabat定义，显示了小鼠PT-113VL结构域的每个氨基酸残基的位置和CDR的位置。图4还显示了PT-113VL结构域与其预测的小鼠亲本种系V区段GKV1-110*02(2)及其Jκ1区段之间的氨基酸序列的比对。星号指示PT-113VL和IGKV1-110*02氨基酸序列之间的差异，这最可能是由于体细胞超突变引起的。
实施例2：嵌合PT-113
IgG1抗体的构建
编码小鼠PTPT-113抗体的VH结构域的基因被设计为外显子，包括编码区后的剪接供体信号、5’端处的SpeI位点和3’端处的HindIII位点(图5)。类似地，编码小鼠PT-113抗体的VL结构域的基因被设计为外显子，包括编码区后的剪接供体信号、5’端处的NheI位点和3’端处的EcoRI位点(图6)。哺乳动物中不常用的密码子被PT-113VH和VL外显子中常用的相应密码子替代。
PT-113VH和VL基因由Eurofins MWG Operon(阿拉巴马州亨茨维尔)合成。用SpeI和HindIII(对于VH基因)或NheI和EcoRI(对于VL基因)消化后，将所得的PT-113VH和VL片段克隆到带有人γ-1和κ恒定区的哺乳动物表达载体中以产生嵌合PT-113(ChPT-113)IgG1/κ抗体。所得表达载体pChPT-113的示意性结构显示在图7中。
实施例3：人源化PT-113VH和VL基因的设计
人源化PT-113VH和VL氨基酸序列的设计如下所述进行。
与鼠PT-113VH框架同源的人VH序列在GenBank数据库内查询，并且选择由人AF174092cDNA编码的Vh序列(GenBank登录号：AF174092，描述于Wang&Stollar,Clin.Immunol.93:132-142(1999)中)作为受体用于人源化。首先将PT-113VH的CDR序列转移到AF174092VH的相应位置。接下来，在框架位置48、67、69、71、93和94处，当PT-113可变结构域的三维模型指示与CDR显著接触时，将AF174092VH的氨基酸残基替换为小鼠PT-113VH的相应残基。所得的人源化VH结构域(HuPT-113VH1)的氨基酸序列连同小鼠PT-113和人AF174092VH序列显示在图8中。
虽然在小鼠PT-113VH中位置67的Ala和位置69的Leu位于CDR附近，并且据预测对CDR结构的形成很重要，但对PT-113CDR结构的详细分析表明，HuPT-113VH1中位置67和位置69的两个氨基酸残基中的一者或可能两者会被人受体AF174092VH序列的一个或多个相应残基替代的可能性。为了进一步降低潜在的免疫原性，设计了附加的三种人源化VH结构域(HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4)。在HuPT-113VH2中，HuPT-113VH1中位置67处的Ala变为Val。在HuPT-113VH3中，HuPT-113VH1中位置69处的Leu变为Met。在HuPT-113VH4，HuPT-113VH1中在位置67处的Ala和在位置69处的Leu分别变为Val和Met。HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4的氨基酸序列显示于图8中。
基于鼠PT-113VL框架序列的同源性搜索，选择由M99608 cDNA编码的人Vκ区(GenBank登录号：M99608，描述于Weng等人J.Immuno.149:2518-2529(1992)中)作为受体用于人源化。首先将PT-113VL的CDR序列转移到M99608VL的相应位置。在框架区中不需要用小鼠残基进行氨基酸取代。所得人源化VL(HuPT-113VL1)的氨基酸序列与小鼠PT-113序列和人M99608 VL序列一起显示于图9中。
实施例4：人源化PT-113VH和VL基因的构建
设计了编码HuPT-113VH1的基因作为外显子，包括信号肽、剪接供体信号、5'端处的SpeI位点和3'端处的HindIII位点(图10)。小鼠PT-113VH外显子(图5)中的信号肽序列和剪接供体信号用于HuPT-113VH1。
同样，将编码HuPT-113VL1的基因设计为外显子，包括信号肽、剪接供体信号、5'端处的NheI位点和3'端处的EcoRI位点(图14)。小鼠PT-113VL外显子(图6)中的信号肽序列和剪接供体信号用于HuPT-113VL1。
HuPT-113VH1和VL1基因由Eurofins MWG Operon合成。用SpeI和HindIII(对于VH)或NheI和EcoRI(对于VL)消化后，将HuPT-113VH1和HuPT-113VL1基因亚克隆到哺乳动物表达载体的相应位点中，用于以人IgG1/κ形式产生。所得表达载体pHuPT-113A表达含有HuPT-113VH1和VL1(HuPT-113A)的人源化PT-113 IgG1/κ抗体。
编码HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4外显子的基因(图8)是通过HuPT-113VH1基因的定点诱变使用Higuchi,R.,Using PCR to Engineer DNA.In PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification.61-67(H.A.Erlich,编辑,纽约州纽约(1989))中所述的重叠延伸PCR方法生成的。HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4的核苷酸序列连同它们的推导的氨基酸序列分别显示于图11、图12和图13中。pHuPT-113A表达载体中的HuPT-113VH1基因被HuPT-113VH2、HuPT-113VH3和HuPT-113VH4替代以分别生成pHuPT-113B、pHuPT-113C和pHuPT-113D。HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D IgG1(I)抗体分别从pHuPT-113B、pHuPT-113C和pHuPT-113D载体表达。
实施例5：表征ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D
IgG1(I)
抗体的抗原结合
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D IgG1(I)抗体与pThr-Dmp肽(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH,X＝5,5-二甲基-L-脯氨酸)的结合由ELISA表征。为了产生这五种抗体，使用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen,加利福利亚州卡尔斯巴德)遵循供应商的方案将pChPT-113、pHuPT-113A、pHuPT-113B、pHuPT-113C和pHuPT-113D载体分别转染至人胚胎肾细胞系HEK293中。将HEK293细胞在含有10％胎牛血清(FBS；HyClone,犹他州洛根)的DME培养基中在7.5％的CO2孵育箱中在37℃下生长。
通过ELISA分析瞬时转染的HEK293细胞的培养上清液中的抗体表达。将ELISA板在4℃下用100μl/孔的1/2,000-稀释的山羊抗人IgG、Fcγ-特异性多克隆抗体(Sigma-Aldrich,密苏里州圣路易斯)的PBS溶液包被过夜，用洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的PBS)洗涤，并用300μl/孔的封闭缓冲液(含2％脱脂奶和0.05％Tween 20的PBS)封闭。用洗涤缓冲液洗涤后，将在结合缓冲液(含1％脱脂奶和0.025％Tween 20的PBS)中适当稀释的100μl/孔的测试样品施加至ELISA板。适当的人源化IgG1/κ抗体用作标准品。将ELISA板在室温下孵育1小时并用洗涤缓冲液洗涤后，使用100μl/孔的1/2,000-稀释的HRP-缀合的山羊抗人κ链多克隆抗体(SouthernBiotech,阿拉巴马州伯明翰)检测结合的抗体。在室温下孵育0.5小时并用洗涤缓冲液洗涤后，通过添加100μl/孔的ABTS底物(Sigma-Aldrich)引发显色，并用100μl/孔的2％草酸终止显色。在405nm处读取吸光度。
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D IgG1(I)抗体与pThr-Dmp的结合通过ELISA测试。为了包被MaxiSorp ELISA板(Thermo Fisher Scientific,马萨诸塞州沃尔瑟姆)，使用50μl在2,2,2-三氟乙醇中的1μg/ml pThr-Dmp(批号1556880,AnaSpec,加利福利亚州菲蒙)施加至每个孔。将肽溶液在37℃下干燥过夜后，将孔用ELISA缓冲液(10mM TrisHCl(pH 7.6)，含150mM NaCl、5％脱脂乳、0.4％牛血清白蛋白和0.05％Tween 20)封闭。将各种浓度的于ELISA缓冲液(50μl/孔)中的测试抗体加载，并在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液(含有150mM NaCl、0.4％牛血清白蛋白和0.05％Tween 20的10mMTrisHCl(pH 7.6))洗涤孔后，50μl/孔的HRP-缀合的山羊抗人κ链抗体(1/2,000-稀释于ELISA缓冲液中)施加至每个孔。在室温下孵育1小时后，将孔用洗涤缓冲液洗涤。用50μl/孔的TMB底物(1-Step Ultra TMB-ELISA,Cat#34028,Thermo Fisher Scientific)引发显色，并用50μl/孔的2N H2SO4终止显色。在450nm处测量吸光度。
ChPT-113、HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C和HuPT-113D IgG1(I)抗体与pThr-Dmp肽的结合模式显示于图15中。在这五种抗体之间，未观察到pThr-Dmp结合模式中的显著差异。选择了在四种人源化PT-113抗体中携带最少数量的小鼠框架残基的HuPT-113D IgG1(I)用于进一步分析。
实施例6：HuPT-113DIgG1-AA(I)抗体的构建
为了消除HuPT-113D IgG1(I)抗体的潜在杀细胞活性，已知消除IgG抗体的效应功能的在位置234和235处从Leu至Ala的氨基酸取代(Kabat的Eu编号)(Xu等人,Cell.Immunol.200:16-26(2000)；Hezareh等人,J.Virol.75:12161-12168(2001))使用重叠延伸PCR方法通过定点诱变引入pHuPT-113D内的CH2恒定区中(参见上述Higuchi,R(1989))。所得质粒pHuPT-113D-AA表达HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体。
实施例7：产生ChPT-113
IgG1、HuPT-113DIgG1(I)和HuPT-113DIgG1-AA(I)抗体的
CHO-K1稳定转染子的生成
为了获得稳定产生ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体的细胞系，将表达载体pChPT-113、pHuPT-113D和pHuPT-113D-AA分别引入中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1(ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)的染色体中。将CHO-K1细胞在SFM4CHO培养基(HyClone,犹他州洛根)中于37℃在7.5％的CO2孵育箱中生长。通过电穿孔进行稳定转染至CHO-K1中。转染前，使用FspI将每个表达载体线性化。将约2.5x 106个细胞用20μg线性化质粒转染，悬浮在SFM4CHO培养基中，并在适当稀释细胞后涂铺到数个96孔板中。48小时后，加入10μg/ml嘌呤霉素用于分离稳定的转染子。在选择开始后约十天，如上所述，通过夹心ELISA测定转染子的培养上清液的抗体产生。
产生高水平的ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D-AA(I)抗体的CHO-K1稳定转染子(分别是CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6和CHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2)用PCR Mycoplasma Detection Set(Takara Bio USA,威斯康星州麦迪逊)测试，并发现对支原体存在呈阴性。
实施例8：ChPT-113和HuPT-113DIgG1/κ(I)抗体的纯化
将CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D 1D6和CHO-K1-HuPT-113D-AA 1D2细胞分别在滚瓶内的SFM4CHO中生长至约106个/ml的密度，用1/10体积的35mg/ml CellBoost 4(HyClone,犹他州洛根)饲喂，并进一步生长直至细胞存活力变得低于50％。离心和过滤后，将培养上清液上样至蛋白-A Sepharose柱(HiTrap MabSelect SuRe,GEHealthcare,新泽西州皮斯卡塔韦)上。将柱用PBS洗涤，然后用0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.0)洗脱抗体。用1M Tris-HCl(pH 8)中和后，通过透析将洗脱抗体的缓冲液更改为PBS。通过测量在280nm下的吸光度来确定抗体浓度(1.4OD＝1mg/ml)。从500ml培养上清液中，ChPT-113IgG1的产量为20mg，HuPT-113D IgG1(I)的产量为38mg，和HuPT-113D IgG1-AA(I)的产量为16mg。
根据标准程序，通过SDS-PAGE对经纯化的ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体进行表征。在还原条件下的分析表明，这些抗体中的每一种均由分子量约为50kDa的重链和分子量约为25kDa的轻链组成(图16)。每种抗体的纯度显现大于95％。
实施例9：从CHO-K1-ChPT-113
1D11、CHO-K1-HuPT-113D
1D6和CHO-K1-HuPT-
113D-AA
1D2细胞分离的重链和轻链mRNA序列的cDNA分析
通过cDNA测序确认了由CHO-K1-ChPT-113 1D11、CHO-K1-HuPT-113D1D6和CHO-K1-HuPT-113D-AA1D2细胞产生的重链和轻链的真实性。使用TRIzol试剂从这些细胞中提取总RNA，并根据供应商的方案，使用ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA合成试剂盒(NewEngland Biolabs,马塞诸塞州伊普斯维奇)合成Oligo dT-引发的cDNA。使用CMV2和JNT098作为引物(图17)和高保真DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)通过PCR扩增γ重链的编码区。将PCR片段进行凝胶纯化，并以CMV2和JNT098作为引物进行测序。类似地，使用CMV2和JNT026扩增κ轻链的编码区(图17)。使凝胶纯化的DNA片段经受以CMV2和JNT026作为引物的测序。
获得的ChPT-113 IgG1重链、ChPT-113 IgG1轻链、HuPT-113D IgG1(I)重链、HuPT-113D IgG1(I)轻链、HuPT-113D IgG1-AA(I)重链和HuPT-113D IgG1-AA(I)轻链的编码区的核苷酸序列均与pChPT-113、pHuPT-113D和pHuPT-113D-AA载体中的相应序列完全匹配(图18至图22)。
实施例10：小鼠PT-113 IgG2b和ChPT-113
IgG1抗体的抗原结合
通过ELISA分析经纯化的小鼠PT-113 IgG2b和ChPT-113 IgG1抗体与以下四种Thr231-τ肽(由AnaSpec(加利福利亚州菲蒙)合成)的结合：pThr-Dmp(H-KVAVVRT(PO3H2)XPKSPS-OH,X＝5,5-二甲基-L-脯氨酸)(批号1556880)
pThr-Pro(H-KVAVVRT(PO3H2)PPKSPS-OH)(批号1556878)
pThr-Ala(H-KVAVVRT(PO3H2)APKSPS-OH)(批号1556881)
np-Thr-Pro(H-KVAVVRTPPKSPS-OH)(批号1556879)
将MaxiSorp板的孔用50μl/孔的以1μg/ml溶解于2,2,2-三氟乙醇中的每种肽包被。ELISA的后续程序在实施例5中描述，不同之处在于用HRP-缀合的山羊抗-小鼠κ链抗体(SouthernBiotech,阿拉巴马州伯明翰)进行小鼠PT-113IgG2b的检测。
小鼠PT-113 IgG2b和ChPT-113 IgG1与四种肽的结合模式分别显示于图23和图24中。在这两种抗体之间，与四种测试的T231-τ肽结合的总体趋势相似。特别地，小鼠PT-113IgG2b和ChPT-113 IgG1两者都与pThr-Dmpτ肽牢固结合(锁定在顺式构象中)，并与pThr-Alaτ肽较差结合(锁定在反式构象中)。此外，图23和图24显示了ChPT-113 IgG1与np-Thr-Proτ肽(即，非磷酸化的T231-τ肽)的结合比小鼠PT-113更弱。该结果证明，与用小鼠PT-113抗体观察到的相比，ChPT-113 IgG1抗体与非磷酸化的T231-τ肽表现出较少的免疫交叉反应性。
实施例11：与小鼠PT-113 IgG2b和ChPT-113
IgG1抗体的竞争结合测定
经由竞争性结合测定评估小鼠PT-113抗体和嵌合PT-113抗体的亲和力。如实施例5所述，将MaxiSorp板的孔用pThr-Dmpτ肽包被，并用ELISA缓冲液封闭。洗涤孔后，将2μg/ml生物素化的小鼠PT-113 IgG2b抗体和各种浓度的竞争抗体(10μg/ml，连续三倍稀释)于ELISA缓冲液中的50μl混合物施加至每个孔。在室温下孵育2小时并用洗涤缓冲液洗涤后，将50μl HRP缀合的链霉亲和素(在ELISA缓冲液中1/2,000-稀释；SouthernBiotech,阿拉巴马州伯明翰)施加至每个孔，以在室温下孵育1h。用洗涤缓冲液洗涤后，用50μl/孔的TMB底物引发显色，并用50μl/孔的2N H2SO4终止显色。在450nm处读取吸光度。
竞争结合ELISA的结果示于图25中。小鼠PT-113 IgG2b的竞争模式与ChPT-113IgG1的竞争模式相似，表明这两种抗体之间与pThr-Dmpτ肽(锁定在顺式构象中)结合的亲和力非常相似；然而，即使在使用的最高浓度(10μg/ml)下，也未观察到完全阻断生物素化的PT-113的结合。
实施例12：分析HuPT-113DIgG1(I)和HuPT-113DIgG1-AA(I)抗体的抗原结合
将经纯化的HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体与四种T231-τ肽(pThr-Dmp、pThr-Pro、pThr-Ala和np-Thr-Pro)中每一者的抗原结合与ChPT-113 IgG1通过ELISA按照实施例5和实施例10所述的程序进行比较。如图26所示，这三种抗体与四种T231-τ肽的每一者显示相似的结合模式。特别地，在ChPT-113 IgG1、HuPT-113D IgG1(I)和HuPT-113D IgG1-AA(I)抗体中，与pThr-Dmpτ肽(锁定在顺式构象中)的结合几乎无法区分。
这些结果表明，本技术的抗体特异性地结合至磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白(顺式-pT231-τ)的顺式构象，并因此可用于治疗有需要的对象中与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法中。
实施例13：HuPT-113D(II)抗体
瞬时转染.12mg经纯化的双基因载体用于转染2x 109个GS-KO CHO细胞。将转染的细胞以3x 106个细胞/ml接种在补充有(II)专有饲料和1mM谷氨酰胺的培养基中，并在31℃、5％CO2、85％湿度和140rpm下在5L(Generon,931116)摇瓶中培养。
初次回收.2L培养物通过在8000rpm下离心收获，并在蛋白A纯化之前通过0.22μm过滤对其进行过滤器灭菌。
通过Octet QKe的蛋白A测定.使用蛋白A生物传感器(ForteBio,18-5010)在OctetQKe上分析经澄清的细胞培养上清液样品。将用0.22μm过滤器过滤的200μL等分的上清液样品上样至96孔板中，并根据八点标准曲线进行定量。稀释后重新分析浓度超出标准曲线范围的样品。
蛋白A亲和色谱.对于瞬时培养，在AKT A纯化器(以I 0mL/min运行)上使用一个或四个5mL HiTrap MabSelect SuRE柱纯化澄清的上清液。在所有情况下，将柱均用50mM磷酸钠、125mM氯化钠，pH 7.0平衡，用50mM磷酸钠和1M氯化钠pH 7.0洗涤，然后在洗脱之前重新引入平衡。用10mM甲酸钠(pH 3.5)洗脱分子。将洗脱的部分通过用2x PBS缓冲液(pH 7.4)中和来立即调节pH，并通过添加稀释的氢氧化钠溶液滴定至大约pH 7.2。
SE-HPLC.使用Zorbax GF-250 9.4mm ID x 25cm柱(Agilent)，在Agilent1200系列HPLC系统上通过SE-HPLC分析复制的样品。注入80μl的1mg/ml样品等分试样(或如果样品<1mg/mL，则原液浓度)并以1mL/min在50mM磷酸钠、150mM氯化钠、500mM精氨酸，pH 6.0中运行15分钟。使用Chemstation软件分析可溶性聚集物水平。除非另外指明，否则通过空白缓冲液进样分析由缓冲液成分产生的信号，并在数据分析中将其省略。
SDS-PAGE分析.通过与NuPage 4x LOS样品缓冲液(Life Technologies,NP0007)和NuPage I Ox样品还原剂(Life Technologies,Np0009)混合来制备还原样品用于分析，并在70℃下孵育10分钟。对于未还原的样品，省略还原剂和加热孵育。在变性条件下，将样品在具有NuPage MES SOS运行缓冲液的1.5mm NuPage 4％-12％Bis-Tris Novex预制凝胶(Life Technologies,NP0315/6)上电泳。凝胶上包括10μl的SeeBlue Plus 2预染分子量标准品(Life Technologies,LC5925)的等分试样和1mg/ml的对照抗体的等分试样。将1μg每种样品上样至凝胶上。一旦电泳，就将凝胶在室温下用InstantBlue(TripleRed,ISBO 1L)染色30分钟。在BioSpectrum成像系统(UVP)上分析染色凝胶的图像。
蛋白A纯化结果.使用单个5mL柱进行初始纯化。这导致回收60.8mg物质，相当于约25％(根据Octet测量)，并且结合能力约为每克树脂12mg抗体。
使用四个串联的5mL MabSelect SURE柱进行随后纯化，其以过量的产物滴度给出了对所有三种抗体(即HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))的结合能力。所有三种抗体产物的纯化导致洗脱单个明确定义的峰。未结合部分的Octet分析表明，所有产物均已回收。
图47确认存在高水平纯度的抗体产物。抗体产物与对照lgG1抗体(泳道10和泳道11)很好地吻合。对于所有产物，在还原条件下观察到两个条带，与重链(>49kDa)和轻链(<28kDa)(泳道5、泳道7和泳道9)的大小一致，并且与对照抗体(泳道11)发现的条带吻合。批间测定对照IgG1抗体(泳道10和泳道11)的结果如预期。在非还原条件下，看到所有产物(泳道2、泳道4、泳道6和泳道8)的蛋白种类条带在98kDa和198kDa之间，与在相同条件下跑的对照IgG1抗体(泳道10)吻合，并且与全长抗体的预期分子量一致。对于HuPT-l13D IgG1-AA(II)的批次455-030417-01，在未还原的样品中可以看到在约198kDa的条带，表明存在聚集体并且与SE-HPLC的结果一致。
实施例14：HuPT-113D抗体的FcR活化
该研究表明，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II)不活化FcR(即，本技术的抗体不诱导表达不同Fc受体的免疫细胞的活化)。
方法和材料
卵清蛋白购自Sigma-Aldrich并储存在+2-8℃下直至使用。抗-卵清蛋白(兔多克隆)购自Sigma-Aldrich并储存在-20℃下直至使用。抗-卵清蛋白(小鼠单克隆IgG2a)购自Biolegend并储存在+2-8℃下直至使用。
使用以下HuPT-113D抗体：HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II)。
使用来自人τ蛋白的以下肽：
1)WT-pThr-Pro(KVAVVRpTPPKSPS)，来自人τ的10个氨基酸序列。
2)pThr-Dmp(KVAVVRpT(5,5-二甲基-L-脯氨酸)PKSPS)，与WT肽类似的10个氨基酸“顺式锁定”序列。
将两个肽(≥10mg/肽)冻干并储存在-80℃下直至复溶。将肽以1mg/mL的浓度复溶在2,2,2-三氟乙醇(Fisher Scientific)中，并在多个等分试样中于-80℃下储存，以最小化冻融循环数。还使用
快速生物素试剂盒(Innova Biosciences)对pThr-Dmp肽进行生物素化处理，并储存在-20℃直至使用。
细胞系.将THP-1细胞(DSMZ)在THP-1培养基(RPMI 1640((II))+10％热灭活的(hi)FBS((II)))中培养，并每周传代3次。将表达FcγRIIIa V158变体和荧光素酶基因(Promega)的Jurkat细胞在Jurkat培养基(RPMI 1640((II))、10％hiFBS((II))、100μg/mL潮霉素(LifeTechnologies)、250μg/mL G-418硫酸盐溶液(Promega)、1mM丙酮酸钠(LifeTechnologies)、0.1mM MEM非必需氨基酸(Life Technologies))中培养并每周传代三次。
细胞系FcR表达.将THP-1或Jurkat细胞收集，在冷CellWASH溶液(BD)中洗涤，并针对CD16(FcγRIII)、CD32(FcγRII)和CD64(FcγR1)的细胞表面表达进行染色。在添加染色抗体之前，还包括FcR封闭步骤(Biolegend)，以最小化非特异性结合。使用抗-CD16 A647、抗-CD32 PE和抗-CD64 A488(Biolegend)通过流式细胞术确定FcR表达，并在
easyCyte 8HT系统(Merck Millipore)上分析。
HuPT-113D酶联免疫吸附测定.将MaxiSorp板(Fisher Scientific)的孔在+4℃下用溶解在2,2,2-三氟乙醇或DPBS((II))中的1μL/孔、10μL/孔或100μL/孔的pThr-Dmp肽包被过夜。然后将孔用洗涤缓冲液(DPBS+0.05％Tween-20(Sigma-Aldrich))洗涤，并在室温下用DPBS+1％BSA(Miltenyi Biotec)封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗涤孔，并将100μl/孔的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II))中的一者在室温下一式两份添加60分钟。用洗涤缓冲液洗涤孔后，用生物素化的抗-人Fc抗体和链霉亲和素-HRP检测结合的抗体，并用100μL TMB底物(Sigma-Aldrich)检测信号。通过添加50μL TMB终止溶液(Sigma-Aldrich)终止反应，并在450nm下测量吸光度。
THP-1细胞因子测定.将测定板(Lumitrac 600,Greiner Bio-One)在+4℃下用100μL/孔的含卵清蛋白的DPBS溶液或溶解于2,2,2-三氟乙醇或DPBS中的pThr-Dmp肽包被过夜。然后将孔用DPBS洗涤，并用200μL封闭介质(RPMI+5％超低IgG血清(GE LifeSciences))在室温下封闭60分钟。封闭后，将100μl抗体(抗-卵清蛋白或HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II)))在室温下每孔添加60分钟。在一些测定中，通过在洗涤缓冲液中洗涤来去除未结合的抗体，并将THP-1细胞添加在每孔100μl测定培养基(RPMI+0.5％超低IgG血清)中，并于37℃，5％CO2下在潮湿的气氛中孵育24小时。收集上清液样品，并以300x G离心10分钟以除去任何细胞，然后将其储存在-80℃进行细胞因子分析。通过在
多重平台(Luminex)上的
测定(Merck Millipore)评估上清液中的细胞因子水平(TNFα、IL-1β和IL-6)。
Jurkat FcRIIIa活化测定.将测定板在+4℃下用100μL/孔的含卵清蛋白的DPBS溶液或溶解于2,2,2-三氟乙醇或DPBS中的pThr-Dmp肽包被过夜。然后将孔用DPBS洗涤，并用200μL封闭介质(RPMI+5％超低IgG血清(GE Life Sciences))在室温下封闭60分钟。封闭后，将100μL抗体(抗-卵清蛋白或HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II)))在室温下每孔添加60分钟。在一些测定中，通过在洗涤缓冲液中洗涤来去除未结合的抗体，并将Jurkat细胞添加在每孔100μL测定培养基(RPMI+0.5％超低IgG血清)中，并于37℃，5％CO2下在潮湿的气氛中孵育24小时。通过添加BioGloTM试剂10分钟来评估FcγRIIIa的活化，并通过
发光计(Promega)测量RLU。
结果
THP-1细胞Fc受体表达.用针对3种主要Fc受体(CD16、CD32和CD64)的抗体对THP-1细胞染色，以评估细胞表面表达。图30A至图30C显示了每种FcR的直方图，未染色细胞呈红色和抗FcR抗体染色的细胞呈蓝色。THP-1细胞似乎表达高水平的CD32(FCγRII)和CD64(FCγRI)，但几乎没有或没有CD16(FCγRIII)。这显示了THP-1测定评估了主要的CD32和CD64的HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II)的结合和活化，而Jurkat测定评估了仅仅经过CD16的HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II)的结合和活化。
还通过流式细胞术评估了Jurkat FcγRIIIa(CD16)V158细胞，但未检测到FcR表达(数据未显示)。这是将预期的，因为Jurkat中CD16水平非常低，并且通常通过萤光素酶报告基因测定来检测信号传导。制造商提供了显示了当添加抗-CD16封闭抗体时信号传导的抑制的数据，表明萤光素酶信号是CD16依赖性的。
阳性对照诱导免疫复合物(IC)对THP-1细胞的活化.固定IC(通过用抗原包被板)以增强FcR的交联和随后的活化。IC含有卵清蛋白蛋白和抗-卵清蛋白抗体。分别使用两种不同的抗-卵清蛋白抗体来生成IC；一种鼠单克隆抗体和一种兔多克隆抗体。已知兔多克隆刺激免疫细胞，但未在这些测定中检测鼠单克隆。包含鼠单克隆抗体来模拟HuPT-113D抗体的单克隆性质。
图31A至图31D显示了卵清蛋白IC包衣密度和细胞数对THP-1细胞活化的影响。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔和兔多克隆抗-卵清蛋白抗体(在添加抗体至用卵清蛋白包被的孔之后，未洗涤孔，因此在一些条件下可能是一些游离的抗体)生成。上面两个图显示了TNFα分泌，并且下面两个图显示了响应于增加量的IC(用固定量的兔抗体在50μg/mL下进行的0.1μg/mL、1μg/mL和10μg/mL卵清蛋白包被)和THP-1细胞(5,000个细胞/孔和50,000个细胞/孔)的IL-6分泌。增加卵清蛋白IC的量和THP-1细胞的数量导致测定期间分泌的TNFα和IL-6水平升高。
图32A至图32D(TNFα释放)和图33A至图33D(IL-6释放)显示了使用鼠单克隆抗体对IC浓度和THP-1细胞数的进一步优化以生成卵清蛋白IC。图32A至图32B和图33A至图33B使用50,000个THP-1细胞/孔和图32C至图32D和图33C至图33D使用150,000个THP-1细胞/孔。图32A和图32C和图33A和图33C显示了当使用0.1μg/mL卵清蛋白对孔进行包被时的数据。图32B和图32D和图33B和图33D显示了当使用10μg/mL卵清蛋白对孔进行包被时的数据。图32A至图32D和图33A至图33D显示使用了用10μg/mL的卵清蛋白包被的150,000个THP-1细胞/孔得到最高水平的细胞因子释放并且THP-1细胞活化是抗体剂量依赖性的。
该数据显示了，THP-1细胞因子测定可以用于评估抗体结合并随后在结合至经固定的蛋白抗原之后活化细胞的能力。
阳性对照诱导的Jurkat细胞的活化.这项研究显示了由特征明确的免疫复合物(IC)进行的Jurkat细胞中的FcR活化。固定IC(通过用抗原包被板)以增加FcR的交联和随后活化。IC含有卵清蛋白蛋白和抗-卵清蛋白抗体。分别使用两种不同的抗-卵清蛋白抗体来生成IC；一种鼠单克隆抗体和一种兔多克隆抗体。先前都未在这些测定中测试任一抗体。包含鼠单克隆抗体以模拟用于该研究中的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))的单克隆性质。
图34A至图34B显示了卵清蛋白IC浓度和Jurkat细胞数对FcR活化的影响。卵清蛋白IC用卵清蛋白包被的孔(10μg/mL)和多种浓度的兔多克隆抗-卵清蛋白抗体和鼠单克隆抗-卵清蛋白抗体两者(在添加抗体至用卵清蛋白包被的孔之后，未洗涤孔，因此在一些条件下可能存在一些游离的抗体)生成。图34A显示了使用50,000个Jurkat细胞/孔进行的FcR活化，并且图34B显示了使用100,000个Jurkat细胞/孔进行的活化。这两个图均显示了兔多克隆抗体对FcR活化，但鼠单克隆抗体未对FcR活化，其中100,000个Jurkat生成比50,000个Jurkat细胞/孔更强的响应。
该数据表明，Jurkat FcR活化测定可以用于评估抗体在结合至固定化的蛋白抗原之后结合并随后活化FcγRIIIa的能力。该数据还表明，鼠抗体在活化FcγRIIIa方面的效力不及兔抗体。
HuPT-113D肽结合ELISA.为了显示所有三种HuPT-113D抗体(HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))都能成功形成IC，结合ELISA用于评估HuPT-113D抗体与pThr-Dmp肽的结合。每种HuPT-113D抗体的剂量响应是用包被有1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL的于2,2,2-三氟乙醇中的pThr-Dmp肽的ELISA板生成的。
图35显示了在每种pThr-Dmp肽包衣浓度下每种抗体的结合曲线。所有三种HuPT-113D抗体都给出了非常相似的结合曲线，并且增加pThr-Dmp肽包衣浓度没有影响，表明1μg/mL的浓度已经使孔饱和。所有条件的EC50值约为21ng/mL(140pM)。
THP-1细胞因子测定中HuPT-113D pThr-Dmp肽包被优化.进行这项研究以确定2,2,2-三氟乙醇对THP-1细胞是否有任何影响。将pThr-Dmp肽在2,2,2-三氟乙醇或DPBS中稀释至1μg/mL，并用于包被测定板的孔。包被后，将孔用DPBS洗涤，并加入各种浓度的HuPT-113D IgG1(II)并使其在添加THP-1细胞之前形成IC(150,1000个细胞/孔)。24小时后，评估TNFα和IL-6的水平。
图36A显示了TNFα分泌的水平并且图36B显示了IL-6分泌的水平。数据显示了两种细胞因子的分泌均以剂量依赖性方式增加，并且在2,2,2-三氟乙醇和DPBS肽包被条件之间没有显著差异。
Jurkat FcR活化测定中HuPT-113D pThr-Dmp肽包被优化.进行该研究以确定2,2,2-三氟乙醇对Jurkat细胞是否有任何影响。将pThr-Dmp肽在2,2,2-三氟乙醇或DPBS中稀释至1μg/mL，并用于包被测定板的孔。包被后，将孔用DPBS洗涤，并添加各种浓度的HuPT-113DIgG1(II)，并使其在添加Jurkat细胞之前形成IC(100,000个细胞/孔)。24小时后，用
试剂评估FcγRIIIa的活化。
图37显示了在每种肽包被条件下FcγRIIIa活化的水平。2,2,2-三氟乙醇和DPBS肽包被条件之间没有显著差异，并且显现出都不能活化FcγRIIIa。
HuPT-113D THP-1细胞因子测定1.为了比较在THP-1细胞测定中每种HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))诱导细胞因子分泌的能力，使用天然和生物素化的pThr-Dmp肽两者生成IC。天然肽(pThr-Dmp肽)用于以1μg/mL包被测定板的孔，并且生物素化的肽用于包被链霉亲和素预包被板(GreinerBio-one)的孔。用肽包被过夜后，洗涤两个板，并将连续稀释的HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II))一式三份地添加至板。添加HuPT-113D抗体后，包括附加的洗涤步骤，以确保添加THP-1细胞时仅存在IC。该附加的洗涤步骤去除了可能充当封闭抗体并防止固定在板上的IC与FcR交联的任何游离的HuPT-113D抗体。
图38A至图38C显示了用每种HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))在天然pThr-Dmp肽的情况下诱导细胞因子释放(TNFα、IL-1β和IL-6)。图38D至图38F显示了用每种HuPT-113D抗体在生物素化的pThr-Dmp肽的情况下诱导细胞因子释放(TNFα、IL-1β和IL-6)。HuPT-113D IgG1(II)以蓝色显示，HuPT-113D IgG1-AA(II)以红色显示并且HuPT-113D IgG4(II)以绿色显示。所有三种HuPT-113D抗体以剂量依赖性方式诱导细胞因子释放，尽管每种抗体都倾向于生成不同的曲线，其中IgG1抗体特别是产生更低的最大细胞因子释放水平。
然而，当使用天然肽生成IC时，在所有三种细胞因子中均观察到相似的模式，其中IgG1抗体显示出最高的细胞因子诱导效力，而IgG1-AA显示出最低的细胞因子诱导效力。生物素化的肽图显示出相似的模式，其中IgG1-AA是最小效力的细胞因子释放刺激剂。
直接比较天然肽和生物素化的肽的结果表明，生物素化的肽提高了细胞因子释放的本底水平。这可能是由于链霉亲和素用于包被板，而不是生物素化的肽本身。为了使THP-1细胞活化的本底水平保持尽可能低，随后的测定使用了天然pThr-Dmp肽来包被板并生成IC。
图39显示了针对三种HuPT-113D抗体(天然肽)计算的EC50值。对于所有三种细胞因子，IgG1抗体的EC50值最低，并且IgG1-AA的EC50值最高，这表明IgG1-AA抗体具有诱导细胞因子从THP-1细胞释放的最低能力。
HuPT-113D Jurkat FcR活化测定1.为了在Jurkat细胞测定中比较每种HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II))活化FcγRIIIa的能力，天然pThr-Dmp肽用于生成IC(天然肽用于以1μg/mL、10μg/mL或100μg/mL包被测定板的孔)。然后洗涤板，并将连续稀释的HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)和HuPT-113D IgG1(II)一式三份地添加至板。添加HuPT-113D抗体后包括附加的洗涤步骤，以确保添加Jurkat细胞时仅存在IC。该附加的洗涤步骤去除了可能充当封闭抗体并防止固定在板上的IC与FcγRIIIa交联的任何游离的HuPT-113D抗体。
图39显示了每种HuPT-113D抗体对FcγRIIIa的活化。IgG1抗体能够以剂量依赖的方式活化Jurkat细胞，其针对每种肽包衣浓度生成了相似的曲线。IgG1-AA和IgG4抗体未显示对Jurkat细胞的任何活化。
HuPT-113D THP-1细胞因子测定2.重复THP-1细胞因子测定，以验证HuPT-113DIgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II)抗体确实是细胞因子释放的较小效力的诱导剂。将板用1μg/mL天然肽和更大剂量范围的包括的每种抗体包被。在添加THP-1细胞之前，冲洗掉所有未结合的抗体，以确保仅存在IC。
图41A至图41C显示了针对三种细胞因子中每种的每种HuPT-113D抗体的图。该图类似于以上在图38A至38F中看到的那些，其中在THP-1细胞中，IgG1是最有效力的细胞因子释放诱导剂，而IgG1-AA是最小效力的细胞因子释放诱导剂。
图42显示了针对三种HuPT-113D抗体计算的EC50值。与IgG1-AA和IgG4抗体相比，IgG1抗体对所有三种细胞因子的EC50值均较低，这表明IgG1-AA和IgG4抗体诱导从THP-1细胞释放细胞因子的能力较低。
HuPT-113D Jurkat FcR活化测定.重复Jurkat FcR活化测定，以验证IgG1-AA和IgG4抗体确实是较小效力的FcR活化诱导剂。将板用1μg/mL天然肽和更大剂量范围的包括的每种抗体包被。在添加Jurkat细胞之前，冲洗掉所有未结合的抗体，以确保仅存在IC。
图43显示了每种HuPT-113D抗体的图。该图类似于以上在图40中所见的那些，只有IgG1抗体能够活化FcγRIIIa。
结果还显示，在THP-1细胞因子测定中，HuPT-113D IgG1(II)在所有三种细胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6)中均诱导了剂量依赖性响应。
结果还显示，IgG1-AA和IgG4类型是较小效力的细胞因子诱导剂，其EC50值比IgG1的EC50值高至多30倍。
结果显示，HuPT-113D IgG1(II)在Jurkat FcγRIIIa活化测定中诱导了剂量依赖性响应。HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II)抗体未见活化。
结果表明，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II)表现出较低的经由其FcR结合和活化免疫细胞的能力，并且因此应被认为是在对象内诱导不期望的免疫响应的风险较低。
这些结果显示，本技术的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))不活化FcγRIIIa，这表明本技术的抗体在对象中不诱导细胞毒性响应。
实施例15：JurkatFcγRIIIaV158活化测定–解冻和使用试剂盒对比增殖细胞系
该研究评估了本技术的抗体活化FcRIIIa V158细胞的能力。
方法.将孔于TFE中的pThr-Dmp肽在1μg/ml下包被。添加HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II)60分钟。添加Jurkat细胞持续24小时。在24小时后添加
试剂并在
上读取发光。
结果.仅HuPT-113D IgG1(II)抗体能够活化该细胞。参见图44A至图44B。结果显示了，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II)抗体均未活化。参见图44A至图44B。增殖和解冻以及使用细胞具有相似的结果。
这些结果显示，本技术的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))不活化FcγRIIIa，这表明本技术的抗体不在对象中诱导细胞毒性响应。
实施例16：使用HuPT-113D抗体的JurkatFcγRIIIa和FcγRIIa活化
该研究评估了本技术的抗体活化FcγRIIIa V158、FcγRIIIa F158和FcγRIIaH131的能力。
方法.
将孔于TFE中的pThr-Dmp肽在1μg/ml下包被。添加HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113D IgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II)60分钟。添加Jurkat细胞持续24小时。在24小时后添加
试剂并在
上读取发光。
结果
HuPT-113D IgG1(II)活化了FcγRIIIa V158和FcγRIIa H131细胞。参见图45A和图45C。HuPT-113D IgG4(II)在FcγRIIa H131细胞中显示了低水平活化并且在FcγRIIIaV158中未显示活化。参见图45A和图45C。HuPT-113D IgG1-AA(II)不活化FcγRIIIa V158细胞和FcγRIIa H131细胞。参见图45A和图45C。无一抗体活化FcγRIIIa F158。参见图45B。
这些结果显示，本技术的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))不活化FcγRIIIa，这表明本技术的抗体在对象中不诱导细胞毒性响应。
实施例17：JurkatFcγRIIIaV158活化测定–增殖细胞
该研究评估了FcγRIIIa V158细胞的HuPT-113D活化。
方法
将孔于DBPS中的pτ在10μg/ml下包被。添加HuPT-113D IgG1-AA(II)、HuPT-113DIgG4(II)或HuPT-113D IgG1(II)60分钟。添加Jurkat细胞持续24小时。在24小时后添加
试剂并在
上读取发光。
结果
没有抗体诱导FcγRIIIa V158细胞活化。参见图46。
这些结果显示，本技术的HuPT-113D抗体(例如，HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))不活化FcγRIIIa，这表明本技术的抗体在对象中不诱导细胞毒性响应。
实施例18：使用HuPT-113D抗体预防创伤性脑损伤(TBI)
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防TBI。
方法
将wt C57/Bl6小鼠在TBI之前3天用单剂量的HuPT-113D抗体或对照抗体(200μgip＝～8mg/kg)处理。TBI模型选自：单次重度TBI(冲击；ssTBI)，反复轻度TBI(撞击；rmTBI)或单次轻度TBI(撞击；smTBI)。损伤前15分钟，经由脑室内给药用单剂量的HuPT-113D抗体或对照抗体(20μg/5μl)处理所有小鼠。在一些实施方式中，将小鼠在3个剂量(例如，3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)水平下处理。
在一些实施方式中，将假手术组的小鼠(即没有TBI)用作对照。
损伤后14天处死第一群组(每4天将小鼠用8mg/kg ip预处理，持续12天(总共3个剂量))以进行ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)和fEPSP。
在损伤后2个月处死第二群组(小鼠如上处理但继续处理，每周8mg/kg ip，再持续6周)。在处死前评估行为终点(例如EPM、MWM和运动测试(旋转杆))。
处死第三群组(小鼠继续每周接受8mg/kg ip，直到损伤后6个月)，并评估τ聚集(例如顺式τ和总τ)和神经元萎缩。其他终点包括IHC测定和使用ALZ50、MC1和/或AT8的测定。
结果
预期与未处理的对照小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠显示出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化(cistauosis)、减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA (II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如TBI。
实施例19：在阿尔茨海默氏病的TMHT小鼠模型中使用HuPT-113D抗体预防神经退
行性疾患
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA (II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防神经退行性疾患，诸如阿尔茨海默氏病。
方法
将TMHT(Thy-1突变的人τ)转基因小鼠(Flunkert等人,2013)在1月龄时开始用HuPT-113D抗体或对照抗体(1mg/kg至100mg/kg)处理。每周通过腹膜内(IP)注射、皮下(SC)注射或静脉内(IV)施用用HuPT-113D抗体或对照抗体处理小鼠。在替选测定中，不同的剂量频率可以包括但不限于每天、每2天、每3天、每4天、每两周、每3周和每月。WT小鼠用作对照。
在3月龄时处死第一群组(小鼠每周用1mg/kg至100mg/kg IP处理，持续2个月)以进行ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)。
在5月龄时处死第二群组(小鼠每周用1mg/kg至100mg/kg IP处理，持续4个月)。在处死之前评估行为终点(例如MWM、高架十字迷宫、新物体识别、自主活动的一般度量，包括旋转杆性能、嗅觉)。
处死第三群组(小鼠每周用1mg/kg至100mg/kg IP处理持续8个月，直到9月龄)，并评估τ聚集(例如顺式τ和总τ)和神经元萎缩。其他终点可包括IHC测定和使用ALZ50、MC1和/或AT8的测定。
结果
预期与未处理的对照小鼠或用不识别顺式τ的对照抗体处理的小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠展现出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化、整体减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA (II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如阿尔茨海默氏病。
实施例20：在阿尔茨海默氏病的THMT小鼠模型中使用HuPT-113D抗体治疗神经退
行性疾患
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗神经退行性疾患，诸如阿尔茨海默氏病。
方法
将TMHT(Thy-1突变的人τ)转基因小鼠(Flunkert等人,2013)在5月龄时开始用HuPT-113D抗体或对照抗体(200μg ip＝～8mg/kg)处理。WT小鼠用作对照。
每4天以8mg/kg ip对小鼠处理，共12天(共3次治疗)。在处死之前评估行为终点(例如，MWM、嗅觉)。然后处死小鼠用于ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)。在替选测定中，对于每种处理，用3种不同的增加剂量水平(例如3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)处理小鼠。
结果
预期与对照抗体处理的小鼠和未处理的对照小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠显示出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化、减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如阿尔茨海默氏病。
实施例21：在阿尔茨海默氏病的hTau小鼠模型中使用HuPT-113D抗体预防神经退
行性疾患
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防神经退行性疾患，诸如阿尔茨海默氏病。
方法
将hTau转基因小鼠(Andorfer等人,2003)在1月龄时开始用HuPT-113D抗体或对照抗体(200μg ip＝～8mg/kg)处理。WT小鼠用作对照。
在6月龄时处死第一群组(小鼠每4天用8mg/kg ip处理，持续5个月)以进行ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)。
第二群组(小鼠继续每周接受8mg/kg ip，持续11个月，直至12月龄)。在处死之前评估行为终点(例如，MWM、新物体识别)。评估τ聚集(例如顺式τ和总τ)和神经元萎缩。其他终点可包括IHC测定和使用ALZ50、MC1和/或AT8的测定。
结果
预期与对照抗体处理的小鼠和未处理的对照小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠显示出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化、减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于预防与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如阿尔茨海默氏病。
实施例22：在阿尔茨海默氏病的hTau小鼠模型中使用HuPT-113D抗体治疗神经退
行性疾患
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗神经退行性疾患，诸如阿尔茨海默氏病。
方法
将hTau转基因小鼠(Andorfer等人,2003)在12月龄时开始用HuPT-113D抗体或对照抗体(200μg ip＝～8mg/kg)处理。WT小鼠用作对照。
每4天以8mg/kg ip处理小鼠，共12天(总共3个剂量)。在处死之前评估行为终点(例如，MWM、新物体识别)。在3月龄时处死小鼠用于ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)。在替选测定中，对于每种处理，用3种不同的增加剂量水平(例如3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)处理小鼠。
结果
预期与对照抗体处理的小鼠和未处理的对照小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠显示出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化、减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如阿尔茨海默氏病。
实施例23：使用HuPT-113D抗体治疗创伤性脑损伤(TBI)
该研究显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗TBI。
方法
将wt C57/Bl6小鼠在TBI之后立即用单剂量的HuPT-113D抗体或对照抗体(200μgip＝～8mg/kg)处理。TBI模型选自：单次重度TBI(冲击；ssTBI)，反复轻度TBI(撞击；rmTBI)或单次轻度TBI(撞击；smTBI)。损伤后15分钟，经由脑室内给药用单剂量的HuPT-113D抗体或对照抗体(20μg/5μl)处理所有小鼠。在一些实施方式中，将小鼠在3个剂量(例如，3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)水平下处理。
在一些实施方式中，将假手术组的小鼠(即没有TBI)用作对照。
损伤后14天处死第一群组(每4天以8mg/kg ip处理小鼠，持续12天(总共3个剂量))以进行ELISA/蛋白质印迹分析(例如，以评估脑和CSF中的顺式τ和总(中间结构域)τ)和fEPSP。
在损伤后2个月处死第二群组(小鼠如上处理但继续处理，每周8mg/kg ip，再持续6周)。在处死前评估行为终点(例如EPM、MWM和运动测试(旋转杆))。
处死第三群组(小鼠继续每周接受8mg/kg ip，直到损伤后6个月)，并评估τ聚集(例如顺式τ和总τ)和神经元萎缩。其他终点包括IHC测定和使用ALZ50、MC1和/或AT8的测定。
结果
预期与未处理的对照小鼠相比，用本技术的抗体处理的小鼠显示出以下的一种或多种：减少的顺式τ蛋白化、减少的τ蛋白病发展和扩展、减少的神经变性、以及改善的组织病理学和功能结果。
这些结果显示，本技术的抗体(例如，HuPT-113A、HuPT-113B、HuPT-113C、HuPT-113D、HuPT-113D IgG1-AA(II)和HuPT-113D IgG4(II))可用于治疗与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症，诸如TBI。
等效方案
本技术不受在本申请中描述的特定实施方式的限制，所述实施方式旨在作为本技术的各个方面的单个说明。如对于本领域的技术人员明显的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对该技术进行许多修改和变型。从前述中，除了本文列举的那些之外，在本技术范围内的在功能上等效的方法和装置对于本领域技术人员而言将是明显的。此类修改和变型旨在落入所附权利要求的范围内。本技术仅由所附权利要求的术语以及此类权利要求有权享有的等效物的全部范围来限制。应理解，该技术不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物体系，这些当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并非旨在进行限制。
另外，在马库什组方面中描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也在马库什组的任何单个成员或成员的子组方面中描述本公开。
如本领域技术人员将理解的，出于任何目的和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地认为充分描述，并且使得相同范围能够被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分子之一、中三分之一和上三分子一等。如本领域的技术人员还将理解的，所有用语，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所引述的数字并指代范围，该范围随后可以如上所讨论分解为子范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1个至3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1个至5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，依此类推。
本文所引用或引述的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，包括所有附图和表格，均通过引用整体并入，到它们与本说明书的明确教导不相悖的程度。
在所附权利要求书内阐述了其他实施方式。
Claims (31)
1.一种抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体；和SEQID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体结合至包含氨基酸序列KVAVVRTPPKSPS(SEQ ID NO:56)的磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白的表位。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体特异性地结合至磷酸化的苏氨酸231-τ蛋白的顺式构象。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述抗体是人源化抗体。
5.一种如权利要求1至4中任一项所述的抗体的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自由以下组成的组：Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv和Fv。
6.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中，所述抗体具有选自由以下组成的组的同种型：IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM。
7.一种重组核酸序列，其编码如权利要求1至2中任一项所述的抗体。
8.一种宿主细胞或载体，其包含如权利要求7所述的重组核酸序列。
9.一种组合物，其包含如权利要求1至2中任一项所述的抗体和药学上可接受的载剂。
10.一种用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体的抗体，其中，所述抗体特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并中和所述顺式-pT231-τ蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述抗体还包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述神经病症是τ蛋白病、创伤性脑损伤(TBI)或中风。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述τ蛋白病选自由以下组成的组：进行性核上性麻痹(PSP)、慢性创伤性脑病变(CTE)、额颞叶痴呆(FTD)、额颞叶变性、Lytico-Bodig病、缠结优势型痴呆、脑膜血管瘤病、亚急性硬化性全脑炎、皮克氏病、皮质基底节变性和阿尔茨海默氏病(AD)。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述对象处于所述τ蛋白病的早期。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述τ蛋白病的早期通过获自所述对象的样品中的升高水平的顺式pT231-τ或顺式pT231-τ:反式pT231-τ比率的增加来确定。
16.如权利要求15所述的方法，其还包括确定获自所述对象的所述样品中的CSF t-τ、pT181-τ、Αβ42或ApoE4的水平。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。
18.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述对象具有反复的脑创伤史。
19.如权利要求10或11所述的方法，将所述抗体与附加的治疗剂分开地、依序地或同时地施用给所述对象。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述附加的治疗剂是多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚和氯化锂中的一者或多者。
21.一种用于选择用如权利要求1至4中任一项所述的抗体治疗的对象的方法，所述方法包括：
(a)检测获自所述对象的样品中的相对于在参考样品中观察到的顺式pT231-τ蛋白水平的提高或顺式pT231-τ蛋白:反式pT231-τ蛋白比率的增加；和
(b)选择所述对象用如权利要求1至4中任一项所述的抗体治疗。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述参考样品获自健康对照对象。
23.如权利要求21所述的方法，其中，获自所述对象的所述样品选自由以下组成的组：尿液、血液、血清、血浆、唾液、羊水和脑脊液(CSF)。
24.一种用于治疗有需要的对象中的与升高的顺式-pT231-τ蛋白表达相关的神经病症的试剂盒，所述试剂盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白并中和所述顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用所述抗体的说明书，其中，所述抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
25.如权利要求24所述的试剂盒，其中，所述抗体还包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
26.一种用于检测样品中的顺式-pT231-τ蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白的抗体和使用所述抗体的说明书，其中，所述抗体包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的重链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中，所述抗体还包含SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:48的轻链免疫球蛋白可变结构域序列或其具有一种或多种保守氨基酸取代的变体。
28.如权利要求26或27所述的试剂盒，其中，所述抗体偶联至一种或多种可检测的标记。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，所述一种或多种可检测的标记包括放射性标记、荧光标记或发色标记。
30.如权利要求26或27所述的试剂盒，其还包括特异性地结合至顺式-pT231-τ蛋白抗体的二级抗体。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其中，所述二级抗体偶联至选自由以下组成的组的至少一种可检测的标记：放射性标记、荧光标记或发色标记。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762583850P | 2017-11-09 | 2017-11-09 | |
| US62/583,850 | 2017-11-09 | ||
| PCT/US2018/059833 WO2019094595A2 (en) | 2017-11-09 | 2018-11-08 | Methods and compositions for the generation and use of humanized conformation-specific phosphorylated tau antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111587123A true CN111587123A (zh) | 2020-08-25 |
Family
ID=66438910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880086054.0A Pending CN111587123A (zh) | 2017-11-09 | 2018-11-08 | 用于生成和使用人源化构象特异性磷酸化的τ抗体的方法和组合物 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11591385B2 (zh) |
| EP (1) | EP3706795A4 (zh) |
| JP (2) | JP2021502125A (zh) |
| CN (1) | CN111587123A (zh) |
| AU (1) | AU2018364630A1 (zh) |
| CA (1) | CA3082365A1 (zh) |
| WO (1) | WO2019094595A2 (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CU24446B1 (es) | 2013-03-13 | 2019-10-04 | Prothena Biosciences Ltd | Un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a tau |
| EP3452508A1 (en) | 2016-05-02 | 2019-03-13 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| CN109415432B (zh) | 2016-05-02 | 2022-07-08 | 普罗塞纳生物科学有限公司 | Tau免疫疗法 |
| KR20200030029A (ko) | 2017-05-02 | 2020-03-19 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 타우 인식 항체 |
| MA50465A (fr) | 2017-10-25 | 2020-09-02 | Ac Immune Sa | Compositions de peptides tau phosphorylés et leurs utilisations |
| SG11202108312PA (en) | 2019-02-08 | 2021-08-30 | Ac Immune Sa | Method of safe administration of phosphorylated tau peptide vaccine |
| PE20212324A1 (es) | 2019-03-03 | 2021-12-14 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos que reconocen tau |
| MA55902A (fr) | 2019-04-24 | 2022-03-16 | Ac Immune Sa | Administration hétérologue de vaccins tau |
| WO2022051489A1 (en) * | 2020-09-04 | 2022-03-10 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Conformation-specific antibodies that bind tau protein and uses thereof |
| WO2023092004A1 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120148592A1 (en) * | 2010-11-19 | 2012-06-14 | Toshio Imai | Neutralizing anti-ccl20 antibodies |
| CN105283196A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-27 | 贝丝以色列女执事医疗中心 | 用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物 |
Family Cites Families (114)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3817837A (en) | 1971-05-14 | 1974-06-18 | Syva Corp | Enzyme amplification assay |
| US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
| US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
| US3939350A (en) | 1974-04-29 | 1976-02-17 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
| US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
| US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
| US4277437A (en) | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4275149A (en) | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
| US4486530A (en) | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4376110A (en) | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4366241A (en) | 1980-08-07 | 1982-12-28 | Syva Company | Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays |
| US4474893A (en) | 1981-07-01 | 1984-10-02 | The University of Texas System Cancer Center | Recombinant monoclonal antibodies |
| US4714681A (en) | 1981-07-01 | 1987-12-22 | The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center | Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same |
| US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
| US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| US5028530A (en) | 1985-01-28 | 1991-07-02 | Xoma Corporation | AraB promoters and method of producing polypeptides, including cecropins, by microbiological techniques |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US6492107B1 (en) | 1986-11-20 | 2002-12-10 | Stuart Kauffman | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
| DE3590766C2 (zh) | 1985-03-30 | 1991-01-10 | Marc Genf/Geneve Ch Ballivet | |
| EP0232262A4 (en) | 1985-08-15 | 1989-09-19 | Stauffer Chemical Co | MICROORGANISM PRODUCING TRYPTOPHANE. |
| US5576195A (en) | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| DE122007000007I1 (de) | 1986-04-09 | 2007-05-16 | Genzyme Corp | Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern |
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
| US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| AU631802B2 (en) | 1988-06-14 | 1992-12-10 | Cetus Oncology Corporation | Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom |
| US4925648A (en) | 1988-07-29 | 1990-05-15 | Immunomedics, Inc. | Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions |
| US5601819A (en) | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
| US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| EP1892296A1 (en) | 1988-09-02 | 2008-02-27 | Dyax Corporation | Generation and selection of recombinant varied binding proteins |
| WO1990005144A1 (en) | 1988-11-11 | 1990-05-17 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
| IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| ZA902949B (en) | 1989-05-05 | 1992-02-26 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
| US6291159B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| US6291160B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| US6291158B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertoire |
| US6291161B1 (en) | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for tapping the immunological repertiore |
| US6680192B1 (en) | 1989-05-16 | 2004-01-20 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
| DK0479909T3 (da) | 1989-06-29 | 1997-04-07 | Medarex Inc | Bispecifikke reagenser til AIDS-behandling |
| US5633076A (en) | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
| GB8928874D0 (en) | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
| WO1991010737A1 (en) | 1990-01-11 | 1991-07-25 | Molecular Affinities Corporation | Production of antibodies using gene libraries |
| US5780225A (en) | 1990-01-12 | 1998-07-14 | Stratagene | Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules |
| US5314995A (en) | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
| DE69127749T2 (de) | 1990-03-20 | 1998-04-16 | Univ Columbia | Chimäre antikörper mit rezeptor-bindenden liganden anstelle ihrer konstanten region |
| US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
| EP0464533B1 (de) | 1990-06-28 | 1998-07-29 | Hoechst Aktiengesellschaft | Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| DK0585287T3 (da) | 1990-07-10 | 2000-04-17 | Cambridge Antibody Tech | Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer |
| US5698426A (en) | 1990-09-28 | 1997-12-16 | Ixsys, Incorporated | Surface expression libraries of heteromeric receptors |
| ATE175118T1 (de) | 1990-10-05 | 1999-01-15 | Medarex Inc | Gezielte immunostimulierung mit bispezifischen stoffen |
| DE69128253T2 (de) | 1990-10-29 | 1998-06-18 | Chiron Corp | Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen |
| DK0574395T3 (da) | 1990-11-09 | 2002-10-07 | Stephen D Gillies | Cytokin-immunkonjugater |
| ATE164395T1 (de) | 1990-12-03 | 1998-04-15 | Genentech Inc | Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften |
| CA2108147C (en) | 1991-04-10 | 2009-01-06 | Angray Kang | Heterodimeric receptor libraries using phagemids |
| US6106835A (en) | 1991-04-19 | 2000-08-22 | Tanox, Inc. | Modified binding molecules specific for T or B lymphocytes and their use as in vivo immune modulators |
| DE69214709T2 (de) | 1991-04-26 | 1997-02-20 | Surface Active Ltd | Neue Antikörper und Verfahren zu ihrer Verwendung |
| US6492160B1 (en) | 1991-05-15 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US6225447B1 (en) | 1991-05-15 | 2001-05-01 | Cambridge Antibody Technology Ltd. | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5871907A (en) | 1991-05-15 | 1999-02-16 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| DE69233482T2 (de) | 1991-05-17 | 2006-01-12 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen |
| AU2238292A (en) | 1991-06-14 | 1993-01-12 | Xoma Corporation | Microbially-produced antibody fragments and their conjugates |
| WO1993006217A1 (en) | 1991-09-19 | 1993-04-01 | Genentech, Inc. | EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES |
| EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
| US5565332A (en) | 1991-09-23 | 1996-10-15 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
| ES2241710T3 (es) | 1991-11-25 | 2005-11-01 | Enzon, Inc. | Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno. |
| EP2224006A1 (en) | 1991-12-02 | 2010-09-01 | MedImmune Limited | Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage |
| WO1993011236A1 (en) | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Medical Research Council | Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage |
| CA2131528C (en) | 1992-03-05 | 2004-07-13 | Philip E. Thorpe | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
| US5733743A (en) | 1992-03-24 | 1998-03-31 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US5639641A (en) | 1992-09-09 | 1997-06-17 | Immunogen Inc. | Resurfacing of rodent antibodies |
| US5914241A (en) | 1993-01-19 | 1999-06-22 | Biosite Diagnostics, Inc. | Assays and kits for detecting analytes in the presence of cross-reacting substances |
| DE614989T1 (de) | 1993-02-17 | 1995-09-28 | Morphosys Proteinoptimierung | Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine. |
| EP0733070A1 (en) | 1993-12-08 | 1996-09-25 | Genzyme Corporation | Process for generating specific antibodies |
| US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
| DK0744958T3 (da) | 1994-01-31 | 2003-10-20 | Univ Boston | Polyklonale antistofbiblioteker |
| US5643722A (en) | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
| US5516637A (en) | 1994-06-10 | 1996-05-14 | Dade International Inc. | Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage |
| GB9416721D0 (en) | 1994-08-18 | 1994-10-12 | Short Brothers Plc | A bias yarn assembly forming device |
| US6294353B1 (en) | 1994-10-20 | 2001-09-25 | Morphosys Ag | Targeted hetero-association of recombinant proteins to multi-functional complexes |
| AU725609C (en) | 1995-08-18 | 2002-01-03 | Morphosys Ag | Protein/(poly)peptide libraries |
| US6696248B1 (en) | 1995-08-18 | 2004-02-24 | Morphosys Ag | Protein/(poly)peptide libraries |
| JP2978435B2 (ja) | 1996-01-24 | 1999-11-15 | チッソ株式会社 | アクリロキシプロピルシランの製造方法 |
| US5965375A (en) | 1997-04-04 | 1999-10-12 | Biosite Diagnostics | Diagnostic tests and kits for Clostridium difficile |
| ATE417925T1 (de) | 1999-07-20 | 2009-01-15 | Morphosys Ag | Verfahren zur präsentation von (poly)peptiden/proteinen auf bakteriophagenpartikeln via disulfidbindungen |
| US7094571B2 (en) | 2000-10-27 | 2006-08-22 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Combinatorial protein library screening by periplasmic expression |
| US7083945B1 (en) | 2000-10-27 | 2006-08-01 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Isolation of binding proteins with high affinity to ligands |
| AU3942202A (en) | 2000-11-30 | 2002-06-11 | Medarex Inc | Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies |
| GB0624500D0 (en) * | 2006-12-07 | 2007-01-17 | Istituto Superiore Di Sanito | A novel passive vaccine for candida infections |
| IT1395574B1 (it) | 2009-09-14 | 2012-10-16 | Guala Dispensing Spa | Dispositivo di erogazione |
| SG11201406347TA (en) | 2012-04-05 | 2014-11-27 | Ac Immune Sa | Humanized tau antibody |
| US10171498B2 (en) * | 2016-02-19 | 2019-01-01 | International Business Machines Corporation | Secure crypto module including electrical shorting security layers |
-
2018
- 2018-11-08 CN CN201880086054.0A patent/CN111587123A/zh active Pending
- 2018-11-08 US US16/762,141 patent/US11591385B2/en active Active
- 2018-11-08 CA CA3082365A patent/CA3082365A1/en active Pending
- 2018-11-08 WO PCT/US2018/059833 patent/WO2019094595A2/en unknown
- 2018-11-08 EP EP18875373.5A patent/EP3706795A4/en active Pending
- 2018-11-08 AU AU2018364630A patent/AU2018364630A1/en active Pending
- 2018-11-08 JP JP2020544590A patent/JP2021502125A/ja active Pending
-
2023
- 2023-01-17 US US18/155,230 patent/US20230287093A1/en active Pending
- 2023-11-09 JP JP2023191357A patent/JP2024026071A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120148592A1 (en) * | 2010-11-19 | 2012-06-14 | Toshio Imai | Neutralizing anti-ccl20 antibodies |
| CN105283196A (zh) * | 2013-03-15 | 2016-01-27 | 贝丝以色列女执事医疗中心 | 用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ABHAY P SAGARE 等: ""Pericyte loss influences Alzheimer-like neurodegeneration in mice"", 《NAT COMMUN》, vol. 4, pages 10 * |
| KAZUHIRO NAKAMURA 等: ""Proline Isomer-Specific Antibodies Reveal the Early Pathogenic Tau Conformation in Alzheimer\'s Disease"", 《CELL》, vol. 149, no. 1, pages 232 - 244, XP055286257, DOI: 10.1016/j.cell.2012.02.016 * |
| R KOHNKEN 等: ""Detection of tau phosphorylated at threonine 231 in cerebrospinal fluid of Alzheimer\'s disease patients"", 《NEUROSCI LETT》, vol. 287, no. 3, pages 187 - 190, XP085019853, DOI: 10.1016/S0304-3940(00)01178-2 * |
| 李瑞力 等: ""P-tau蛋白在颅脑损伤及相关神经退行性病中的研究进展"", 《医学研究生学报》, vol. 30, no. 8, pages 889 - 892 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2024026071A (ja) | 2024-02-28 |
| US11591385B2 (en) | 2023-02-28 |
| US20200362022A1 (en) | 2020-11-19 |
| WO2019094595A3 (en) | 2020-04-02 |
| WO2019094595A2 (en) | 2019-05-16 |
| AU2018364630A1 (en) | 2020-05-21 |
| JP2021502125A (ja) | 2021-01-28 |
| CA3082365A1 (en) | 2019-05-16 |
| EP3706795A2 (en) | 2020-09-16 |
| US20230287093A1 (en) | 2023-09-14 |
| EP3706795A4 (en) | 2021-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230287093A1 (en) | Methods and compositions for the generation and use of humanized conformation-specific phosphorylated tau antibodies | |
| KR102596852B1 (ko) | 항-프로/잠재성-미오스타틴 항체 및 그의 용도 | |
| JP6797111B2 (ja) | イヌｐｄ−ｌ１と結合するｐｄ−ｌ１抗体 | |
| US8816058B2 (en) | Polynucleotides encoding anti-CD100 antibodies or antigen-binding fragments thereof | |
| AU2009245354C1 (en) | Antibodies to receptor of advanced glycation end products (RAGE) and uses thereof | |
| CA2780069C (en) | Monoclonal antibodies against the rgm a protein for use in the treatment of retinal nerve fiber layer degeneration | |
| JP5868549B2 (ja) | 狂犬病感染の予防および治療に関する組成物および方法 | |
| KR20060133049A (ko) | 항-마이오스타틴 항체 | |
| PT2260055E (pt) | Anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a e seus usos | |
| EA037397B1 (ru) | Гуманизированные антитела к рецептору ccr7 | |
| US20220348686A1 (en) | Anti-steap1 antibodies and uses thereof | |
| US20220259307A1 (en) | Cd33 antibodies and methods of using the same to treat cancer | |
| CN112955548B (zh) | 叶酸受体α特异性抗体 | |
| US20220251192A1 (en) | Anti-cd33 antibodies for treating cancer | |
| CN113039204A (zh) | 治疗类风湿性关节炎的方法 | |
| US20220177579A1 (en) | Cd19 antibodies and methods of using the same | |
| JP7386800B2 (ja) | 抗ポリシアル酸抗体およびその使用 | |
| US20220242967A1 (en) | Anti-glypican-3 antibodies and uses thereof | |
| EP4257195A2 (en) | Anti-cfae antibodies and methods of use | |
| WO2021190437A1 (en) | Antibodies against areg and its use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |