KR20060133049A - 항-마이오스타틴 항체 - Google Patents

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KR20060133049A
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로사먼드 캐롤 스미쓰
크리스틴 케이 키클리
린다 오. 토비아스
보미 한
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

성숙형 인간 마이오스타틴의 아미노산 40-64 내에서 중화 에피토프가 확인된다. 이러한 에피토프에 결합하는 항체가 본 발명의 범주 내에 속하고, 이는 마우스, 키메라 또는 인간화 항체, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 면역접합체일 수 있다. 본 발명의 항체는 근육 질량의 증가, 골 밀도의 증가, 또는 포유동물에서의 다양한 장애의 치료에 유용하다.
마이오스타틴, 항-마이오스타틴 항체, 중화 항체, 근육 질량, 골 밀도

Description

항-마이오스타틴 항체{ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES}
본 발명은 의약 분야, 특히 마이오스타틴에 대한 모노클로날 항체 분야에 속한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 성숙형 마이오스타틴 상에서 확인된 신규 에피토프에 결합하는 항-마이오스타틴 모노클로날 중화 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 마우스, 키메라 또는 인간화 항체, 이들 항체의 면역접합체(immunoconjugate) 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 본 발명의 항체는 근육 질량의 증가, 골 밀도의 증가, 또는 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하는 용태 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 바람직한 치료 효과에 기여하는 용태의 치료를 위해 포유동물에서 유용하다.
전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 상과 단백질의 구성원들은 배발생 및 성인 조직 항상성에 관련되어 있다. TGF-β 상과 구성원들은 단백질의 분비에 필요한 짧은 펩티드 신호 서열, 및 대형 전구체 단백질 ("전단백질(proprotein)")의 카르복시-말단으로부터 아미노산 약 105-140 개 만큼 떨어진 위치에서 단백질분해에 의해 절단되어 성숙 단백질을 생성하는 아미노-말단 단편을 포함하는 공통적인 구조를 공유한다. 성숙 단백질은 고도로 보존된 시스테인 잔기들을 특징으로 하고, 활성형 단백질은 성숙 단백질의 디술피드-연결된 이량체이다 (Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990). TGF-β 상과의 구성원의 이종이량체(heterodimer)가 또한 검출되었고, 이는 동종이량체와 상이한 생물학적 성질을 갖는 것으로 나타난다.
성장 분화 인자-8 (GDF-8)로 또한 지칭되는 마이오스타틴은 TGF-β 상과 단백질의 구성원이다. 마이오스타틴은 발생 및 성인 골격근에서 주로 발현되고, 골격근의 음성 조절인자로서 기능한다. 마이오스타틴은 여러 종(種)에 걸쳐 고도로 보존된다; 인간, 마우스, 래트 및 소에서의 성숙형 마이오스타틴의 아미노산 서열은 100 ％ 동일하다. 본 발명에서 확인된 면역원성 에피토프는 인간, 마우스, 래트, 닭, 개, 말, 염소, 양, 소 및 돼지에서 100 ％ 동일하다. GDF-11 또는 BMP-11로 또한 지칭되는 성장 분화 인자-11은 마이오스타틴과 가장 상동성인 TGF-β 상과 단백질의 구성원이다. 인간 마이오스타틴과 GDF-11은 성숙 사슬 내에서 아미노산 수준에서 90 ％ 동일하다.
미국 특허 제5,827,733호에는 인간 마이오스타틴의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 교시되어 있고, 미국 특허 제6,096,506호는 GDF-8 폴리펩티드 또는 이의 에피토프와 특이적으로 반응성인 항체를 청구한다. 미국 특허 출원 제2003/0138422호는 특정 펩티드를 포함하는 GDF-8 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 청구한다. 미국 특허 제6,468,535호는 항-GDF-8 항체를 투여함으로써 동물 근육 질량을 증가시키는 방법을 청구한다. 미국 특허 제6,368,597호에는 당뇨병 치료를 위해 GDF-8 항체를 사용하는 것이 교시되어 있다.
근육 퇴행위축, 허약, 중환자 근육병증, 및 암 또는 HIV 감염, 중환자 및 근 육병증이 포함되지만 이에 한정되지 않는 기타 장애로부터 기인하는 악액질이 포함되는, 근육 질량 및/또는 근육 강도의 증가가 이로울 장애 또는 용태에 대한 효과적인 치료법이 현재 제한되어 있다. 골격근 성장의 음성 조절인자로서의 역할로 인해, 마이오스타틴은 이같은 장애의 치료적 개입에 바람직한 표적이다. 다른 TGF-β 상과 단백질의 활성을 저해하지 않거나 또는 최소한도로 저해하면서 마이오스타틴 활성을 특이적으로 저해하는 수단이 치료적으로 매우 요구된다. 다른 TGF-β 상과 단백질의 수준을 상응하여 감소시키지 않으면서 환자 내에 존재하는 마이오스타틴의 수준을 특이적으로 감소시키는 것이 또한 치료상으로 요구된다. 특히, 마이오스타틴에 특이적으로 반응성 (예를 들어, 특이적으로 마이오스타틴 또는 이의 일부에 결합하거나 이를 인식함)이고 TGF-β 상과 단백질의 다른 구성원 (예를 들어, GDF-11)과는 현저하게 덜 반응성이거나 비-반응성인 모노클로날 항체가 근육 질량을 증가시키고/시키거나 근육 강도를 증가시키는 특히 이로운 치료법을 제공할 수 있다. 키메라 또는 인간화 형태의 이같은 모노클로날 항체가 특히 치료적으로 유용하다. 마이오스타틴은 종들 간에 서열 및 기능이 고도로 보존된다; 따라서, 항체의 골격 및 불변 영역이 항체가 치료용으로 사용될 동물 종(種)으로부터 실질적으로 유래되는 경우에 특히, 이같은 항체는 인간에서뿐만 아니라, 예를 들어, 가축 동물 (예를 들어, 개과 동물 및 고양이과 동물), 운동 동물 (예를 들어, 말) 및 식품-공급원 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 조류, 및 양)이 포함되는 다른 포유동물에서의 이같은 장애의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 골 밀도의 증가가 이로운 장애 또는 용태 (예를 들어, 골다공증), 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 비만, 골관절염, 패혈증, 만성 폐쇄성 폐 장애 ("COPD(chronic obstructive pulmonary disorder)") 및 근육 소모와 관련된 장애 예컨대 신장 장애, 심부전 또는 심장 질환 및 간 질환이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 마이오스타틴 수준의 감소가 이로운 장애 또는 용태의 치료에 또한 유용할 수 있다.
본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 당업계의 다른 항-마이오스타틴 항체를 능가하는 장점을 제공한다. 본 발명에서는 성숙형 마이오스타틴의 잔기 40-64에 해당하는 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 마이오스타틴에 대한 서열 46)에 결합하여 시험관내(in vitor), 생체내(in vivo) 또는 원위치(in situ)에서 마이오스타틴 활성을 중화할 수 있는 항-마이오스타틴 모노클로날 중화 항체가 제시된다. TGF-β 과 구성원은 높은 정도의 상동성을 갖기 때문에 (예를 들어, 마이오스타틴은 GDF-11과 약 90 ％ 상동성임), 골격 패턴의 구축에 중요한 역할을 하는 GDF-11 (McPherron, A., et al., Nature Genetics, 22:260-265, 1999)과 교차 반응하지 않거나 또는 최소한도로 교차 반응하는 항-마이오스타틴 항체 예컨대 본 발명의 항체는 더 큰 정도로 GDF-11과 교차 반응하는 항체와 비교했을 때 치료적으로 사용하기에 바람직하다.
발명의 개요
포유류 공급원, 바람직하게는 인간으로부터의 성숙형 마이오스타틴의 아미노산 40-64로 구성된 폴리펩티드, ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (서열 46), 또는 서열 ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (서열 43)으로 구성된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하 거나 이를 인식하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 본 발명에 기술된다. 이같은 항체는 본원에서 "본 발명의 모노클로날 항체" 또는 "본 발명의 항체"로 지칭된다. 본 발명의 모노클로날 항체는 마우스, 키메라 또는 인간화 항체, 이같은 항체의 면역접합체, 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 균질한 또는 실질적으로 균질한 집단으로 존재한다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 아미노산 ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (서열 46)에 걸쳐진(spanning) 도메인 내에서 마이오스타틴 (전단백질 또는 성숙형 단백질, 단량체성 또는 이량체성)과 결합함으로써, 마이오스타틴 또는 이의 일부와 관련된 하나 이상의 시험관내, 생체내 또는 원위치 생물학적 활성에 길항작용을 하거나 이를 중화시킨다.
본 발명의 모노클로날 항체는 성숙형이 성숙형 마이오스타틴과 약 90 ％의 아미노산 상동성을 갖는 TGF-β 상과의 구성원인 GDF-11보다 우선적으로 마이오스타틴과 결합하거나 이를 인식한다. 바람직하게는, 상기 항체는, 예를 들어, ELISA 분석, 경쟁적 ELISA 분석, 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00001
분석에서의 KD 값으로 측정할 때 (예를 들어, 실시예 4 참조), GDF-11에 결합하는 것보다 더 큰 친화력 또는 특이성으로 마이오스타틴에 결합한다. 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 GDF-11에 결합하는 것보다 마이오스타틴에 결합하는 것에 관련하여 더욱 유리한 Kon, Koff, 또는 Ka 값을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 GDF-11과 비-교차반응성이거나, GDF-11과 5 ％, 4 ％, 3 ％, 2 ％, 1 ％ 미만의 수준으로 교차반응성이 다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 ("LCVR(light chain variable region)") 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 서열 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 ("HCVR(heavy chain variable region)") 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54로 대체된 서열 12를 갖는 HCVR 폴리펩티드를 포함한다. 각각의 서열 번호와 관련된 서열은 본원의 표 1 및 2 및 도 4 및 5에 제시된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 (a) 서열 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCVR 폴리펩티드 및 (b) 서열 12, 13, 14, 15, 16 및 17로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCVR 폴리펩티드 또는 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54로 대체된 서열 12를 갖는 HCVR 폴리펩티드를 포함한다. 상기 언급된 LCVR 및 HCVR 폴리펩티드의 임의의 조합을 포함하는 본 발명의 항체가 구현되지만, 하기의 LCVR 및 HCVR 조합을 포함하는 항체가 바람직하다: (i) 서열 3 및 12; (ii) 서열 4 및 13; (iii) 서열 3 및 14; (iv) 서열 5 및 12; (v) 서열 6 및 15; (vi) 서열 7 및 17; (vii) 서열 8 및 12; (viii) 서열 9 및 16; (ix) 서열 10 및 12; (x) 서열 11 및 12; (xi) 서열 3 및 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54로 대체된 서열 12.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 인간 마이오스타틴 또는 인간 마이오스타틴의 일부에 대한 결합에 대해 하기로 구성된 군에 제시된 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 경쟁 항체와 경쟁할 수 있는 것이다: (i)서열 3 및 12, (ii) 서열 4 및 13, (iii) 서열 3 및 14, (iv) 서열 5 및 12, (v) 서열 6 및 15, (vi) 서열 7 및 17, (vii) 서열 8 및 12, (viii) 서열 9 및 16, (ix) 서열 10 및 12, (x) 서열 11 및 12, 및 (xi) 서열 3 및 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54로 대체된 서열 12.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 LCVR은 서열 38, 23 및 56 (표 1 참조)에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 서열 38에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR1에 존재한다. 바람직하게는, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR2에 존재한다. 바람직하게는, 서열 56에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR3에 존재한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 LCVR은 (a) 서열 18, 19, 20, 21 또는 22; (b) 서열 23, 및 (c) 서열 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 서열 18, 19, 20, 21, 또는 22에 제시된 서열 을 갖는 펩티드는, 본 발명의 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR1에 존재한다. 바람직하게는, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 본 발명의 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR2에 존재한다. 바람직하게는, 서열 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 본 발명의 항체 내에 존재할 때, LCVR CDR3에 존재한다. LCVR은 골격 서열을 추가로 포함할 것이다. 인간에서의 치료적 사용을 위한 인간화 항체에서, 골격 서열은 실질적으로 인간에서 유래된 것일 수 있다. 비-인간 동물에서 사용하기 위한 항체에서, 골격 영역 서열은 항체가 치료적으로 사용될 동물의 게놈으로부터 실질적으로 유래될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 HCVR은 서열 55, 41 및 42 (표 2 참조)에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 서열 55에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR1에 존재한다. 바람직하게는, 서열 41에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR2에 존재한다. 바람직하게는, 서열 42에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 상기 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR3에 존재한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 HCVR은 (a) 서열 29, 30, 31, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54; (b) 서열 32, 33, 34, 또는 35 ; 및 (c) 36 또는 37에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 서열 29, 30, 31, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 본 발명 의 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR1에 존재한다. 바람직하게는, 서열 32, 33, 34, 또는 35에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 본 발명의 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR2에 존재한다. 바람직하게는, 서열 36 또는 37에 제시된 서열을 갖는 펩티드는, 본 발명의 항체 내에 존재할 때, HCVR CDR3에 존재한다. HCVR은 골격 서열을 추가로 포함할 것이다. 인간에서의 치료적 사용을 위한 인간화 항체에서, 골격 서열은 실질적으로 인간에서 유래된 것일 수 있다. 비-인간 동물에서 사용하기 위한 항체에서, 골격 서열은 항체가 치료적으로 사용될 동물의 게놈으로부터 실질적으로 유래될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는 서열 38, 23, 56, 55, 41 및 42에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 38에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 56에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 55에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 41에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 42에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 (i) 18; (ii) 23; (iii) 24; (iv) 29, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54; (v) 32; 및 (vi) 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 18에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23 에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 24에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 19, 23, 25, 30, 33 및 37에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 19에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 25에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 30에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 33에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 37에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 18, 23, 24, 31, 32 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 18에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 24에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 31에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 20, 23, 25, 29, 32 및 36에 제시된 서열을 갖는 6 개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 20에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 25에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 20, 23, 26, 30, 34 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 20에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 26에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 30에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 34에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 18, 23, 24, 29, 35 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 18에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 24에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 35에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 18, 23, 27, 29, 32 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 18에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 27에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 21, 23, 28, 29, 32, 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 21에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 28에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 20, 23, 24, 29, 32 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 20에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 24에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
또다른 실시양태는 서열 22, 23, 27, 29, 32 및 36에 제시된 서열을 갖는 6개의 펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체에서, 서열 22에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR1에 위치하고, 서열 23에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR2에 위치하고, 서열 27에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 LCVR CDR3에 위치하고, 서열 29에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR1에 위치하고, 서열 32에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR2에 위치하고, 서열 36에 제시된 서열을 갖는 펩티드는 HCVR CDR3에 위치한다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 및 IgD로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 항체가 인간 치료제로서 사용되는 경우, 바람직하게는 불변 영역은 실질적으로 인간에서 유래된 것이다. 항체가 비-인간 동물에서 치료제로서 사용되는 경우, 바람직하게는 불변 영역은 항체가 치료제로서 사용될 동물로부터 실질적으로 유래된다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 무손상 항체 (즉, 전장(全長)), 실질적인 무손상 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 키메 라 항체이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 항체 내에 존재하는 골격 서열 및 불변 영역 서열이 실질적으로 인간에서 유래된 것인 인간화 항체이다. 별법으로, 항체 내에 존재하는 골격 영역, 또는 이의 일부, 및 임의의 불변 영역은 항체가 치료제로 사용되는 동물, 예를 들어, 가축 동물 (예를 들어, 개과 동물 및 고양이과 동물), 운동 동물 (예를 들어, 말) 및 식품-공급원 동물 (예를 들어, 소, 돼지, 조류, 및 양)의 게놈으로부터 실질적으로 유래될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 LCVR, 본 발명의 항체의 HCVR 또는 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 LCVR을 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 44에 제시된 서열을 갖는다. 본 발명의 HCVR을 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 45에 제시된 서열을 갖는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게는 (이에 제한되지는 않음) 플라스미드, 재조합 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 별법으로, 본 발명의 벡터는 본 발명의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. LCVR을 코딩하는 서열 및 HCVR을 코딩하는 서열 모두가 동일한 벡터 내에 존재하는 경우, 이들은 이 둘 모두가 작동가능하게 연결된 하나의 프로모터로부터 전사될 수 있거나, 또는 각각 작동가능하게 연결된 별도의 프로모터로부터 독립적으로 전사될 수 있다. LCVR 및 HCVR을 코딩하는 서열이 동일한 벡터 내에 존재하고 이들이 모두 작동가능하게 연결된 하나의 프로모터로부터 전사된다면, LCVR이 HCVR에 대해 5'이거나 또는 LCVR이 HCVR에 대해 3'일 수 있고, 또한 벡터 내의 LCVR 및 HCVR 코딩 영역은 임의의 크기 또는 구성의 링커(linker) 서열에 의해 분리될 수 있고, 바람직하게는 이같은 링커는, 존재하는 경우, 내부 리보솜 진입 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 구축물을 1개 이상으로 포함한다. 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 벡터가 도입 (예를 들어, 형질전환, 형질도입, 감염을 통해)된 세포이고, 상기 벡터는 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한 본 발명은 2개의 본 발명의 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다; 한 벡터는 본 발명의 항체의 LCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 한 벡터는 본 발명의 항체 내에 존재하는 HCVR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 각각은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포 유형에는 포유류, 박테리아, 식물 및 효모 세포가 포함된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CHO 세포, COS 세포, SP2/0 세포, NS0 세포, 효모 세포 또는 임의의 바람직한 세포 유형의 유도체 또는 후손이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포 (즉, 본 발명의 벡터(또는 벡터들)로 형질전환, 형질도입 또는 감염된 숙주 세포)를 본 발명의 모노클로 날 항체의 발현에 적절한 조건 하에 유지시킴으로써 이같은 항체가 발현되도록 하는 것을 포함하는 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 모노클로날 항체를 세포로부터 또는 바람직하게는 상기 세포가 성장된 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 비-인간 동물, 바람직하게는 설치류, 더욱 바람직하게는 마우스에게 (i) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 면역원성 펩티드, 또는 (ii) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 면역원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 면역원성 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 성숙 마이오스타틴의 잔기 번호 46, 49, 50, 52 및 62에서의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 걸쳐지고, 상기 잔기 번호에서의 아미노산은 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 면역원성 펩티드 (도 3 참조), 또는 (iii) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 면역원성 펩티드, 또는 (iv) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 면역원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 면역원성 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 동일한 포유동물에서의 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 아미노산인 아미노산 잔기에 걸쳐지는 면역원성 펩티드를 주사하는 것에 의한 본 발명의 항체의 제조 방 법이 구현된다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 면역화된 동물로부터 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 바람직하게는 하이브리도마 합성에 의해 생성시킨다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 당업계에서 이용가능한 임의의 방법 (예를 들어, 파지 디스플레이(display), 리보솜 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, ELISA 분석)에 의해 성숙 마이오스타틴, 또는 면역원성 펩티드를 포함하는 이의 일부, 또는 면역원성 펩티드에 대한 결합에 대해 스크리닝한다. 임의로, 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 성숙 GDF-11 또는 이의 일부에 대한 결합에 대해 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 스크리닝한다. GDF-11과 관련하여 마이오스타틴에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 선택한다. 본 발명에서는 이러한 방법에 의해 제조된 모노클로날 항체가 추가로 구현된다. 바람직하게는, 상기 모노클로날 항체는, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, ELISA, 경쟁 ELISA 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00002
분석에서의 KD 값에 의해 결정된 바와 같이, GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 크게 마이오스타틴에 결합한다; 더욱 바람직하게는, GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600-배 더 크게 결합한다. 가장 바람직하게는, 모노클로날 항체는 당업계에서 이용가능한 어떠한 결합 분석에서도 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다.
본 발명에서는 비-인간 동물, 바람직하게는 설치류, 더욱 바람직하게는 마우 스에게 (i) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 포함하는 면역원성 펩티드, 또는 (ii) 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 면역원성 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 성숙 마이오스타틴의 잔기 번호 46, 49, 50, 52 및 62에서의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 걸쳐지고, 상기 잔기 번호에서의 아미노산은 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 면역원성 펩티드 (도 3 참조), 또는 (iii) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드, 또는 (iv) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 면역원성 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 동일한 포유동물에서의 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 아미노산인 아미노산 잔기에 걸쳐지는 면역원성 펩티드를 주사하는 것에 의한 본 발명의 항체 제조 방법이 또한 구현된다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 면역화된 동물로부터 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 바람직하게는 하이브리도마 합성에 의해 생성시킨다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 당업계에서 이용가능한 임의의 방법 (예를 들어, 파지 디스플레이(display), 리보솜 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, ELISA 분석)에 의해 (i) 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성된 항원성 펩티드, 또는 (ii) 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 항원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 성숙 마이오스타틴의 잔기 번호 46, 49, 50, 52 및 62에서의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 걸쳐지고, 상기 잔기 번호에서의 아미노산은 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 항원성 펩티드 (도 3 참조), 또는 (iii) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 항원성 펩티드, 또는 (iv) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 항원성 펩티드로서, 바람직하게는 상기 면역원성 펩티드가 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 동일한 포유동물에서의 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 아미노산인 아미노산 잔기에 걸쳐지는 항원성 펩티드에 대한 결합에 대해 스크리닝한다. 임의로, 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 성숙 GDF-11 또는 이의 일부에 대한 결합에 대해 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 스크리닝한다. GDF-11과 관련하여 마이오스타틴에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 선택한다. 본 발명에서는 이러한 방법에 의해 제조된 모노클로날 항체가 추가로 구현된다. 바람직하게는, 상기 모노클로날 항체는, 당업자에게 공지된 방 법, 예를 들어, ELISA, 경쟁 ELISA 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00003
분석에서의 KD 값에 의해 결정된 바와 같이, GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 크게 마이오스타틴에 결합한다; 더욱 바람직하게는, GDF-11에 결합하는 것보다 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600-배 더 크게 결합한다. 가장 바람직하게는, 모노클로날 항체는 당업계에서 이용가능한 어떠한 결합 분석에서도 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다.
임의의 본 발명의 방법에 의해 제조된 상기 항체가 골격 및/또는 불변 영역의 적어도 일부가 모노클로날 항체를 생성하기 위해 면역화된 것과 상이한 포유류로부터 유래되는 키메라 항체로 추가로 변형될 수 있고 여전히 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 구현된다. 본 발명의 항체는 마우스 CDR 영역이 실질적으로 인간의 것인 골격 영역 내에 존재하고, 불변 영역이, 항체 내에 존재하는 경우, 또한 실질적으로 인간에서 유래되도록 인간화될 수 있다. 본 발명의 항체는 마우스 CDR 영역이 항체가 치료적으로 사용될 동물의 생식계열 서열로부터 유래된 골격 영역 및 불변 영역 (항체 내에 존재하는 경우)내에 존재하는 것일 수 있다.
다양한 형태의 본 발명의 항체가 본원에서 구현된다. 예를 들어, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 전장 항체 (예를 들어, 면역글로불린 불변 영역을 가짐) 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2)일 수 있다. 모든 이같은 형태의 항체가 본원에서 용어 "항체" 내에 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라, 검출가능한 표지로 표지되고/되거나, 고체 지지체 상에 고정되고/되거나, 이종 화합물 (예를 들어, 효소 또는 독소)과 접합될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에 대한 진단 용도가 구현된다. 한 진단 용도에서, 본 발명은 마이오스타틴 단백질을 함유할 것으로 추측되는 테스트 샘플을 본 발명의 항-마이오스타틴 항체에 노출시키고, 샘플에 대한 항체의 특이적 결합을 결정하는 것을 포함하는, 마이오스타틴 단백질의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항-마이오스타틴 항체는 테스트 샘플 값을 상기 항체를 공지된 양의 마이오스타틴을 갖는 샘플과 결합시킴으로써 생성된 표준 곡선과 비교함으로써 테스트 샘플 내의 마이오스타틴의 수준을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체, 및 바람직하게는 예를 들어 테스트 샘플 내의 마이오스타틴 단백질을 검출하는데 항체를 사용하기 위한 사용설명서를 포함하는 키트를 또한 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 활성 성분이다 바람직하게는, 약제학적 조성물은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 균질한 또는 실질적으로 균질한 집단을 포함한다. 치료적 사용을 위한 조성물은 무균성이고, 동결건조될 수 있다.
본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 마이오스타틴 활성을 저해하는 방법으로, 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항-마 이오스타틴 모노클로날 항체를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 마이오스타틴이 이의 수용체에 결합하는 것에 기인하는 신호 전달의 저해에 의해 개선되는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로, 이같은 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자 (예를 들어, 인간)에게 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다. 본원에서 사용된 "치료 또는 예방"은 비정상적인 마이오스타틴 수준과 관련된 또는 마이오스타틴 활성을 저해하는 것이 이로운 또는 기존의 마이오스타틴 수준의 변화가 이로운 질환 또는 장애를 지칭한다. 본 발명의 항체에 의해 치료 또는 예방되는 질환 또는 장애로는 허약, 악액질, 연령-관련 근육감소증, 근육 소모, 근육병증, 근육 퇴행위축, 골다공증, 비만, COPD, 신부전 또는 신장 질환, 간부전 또는 간 질환, 심부전 또는 심장 질환, 대사 증후군 및 제II형 당뇨병이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 투여함으로써 이를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 근육 질량을 증가시키고, 근육 강도를 증가시키고, 골 밀도를 증가시키는 방법을 또한 제공한다.
본 발명에서는 이를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에서, 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 상기 포유동물에게 투여하는 것에 의한, 예를 들어, 허약, 악액질, 연령-관련 근육감소증, 근육 소모, 근육병증, 근육 퇴행위축, 골다공증, 비만, COPD, 신부전 또는 신장 질환, 간부전 또는 간 질환, 심부전 또는 심장 질환, 대사 증후군 및 제II형 당뇨병 의 치료를 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 약제의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체가 구현된다.
본 발명에서는 포장재 및 상기 포장재 내에 함유된 본 발명의 항체를 포함하는 제조품으로서, 항체가 특이적으로 마이오스타틴 활성을 중화시키거나 마이오스타틴의 수준을 감소시킨다는 것이 표시된 포장 삽입설명서를 포장재가 포함하는 제조품이 구현된다. 임의로, 포장 삽입설명서에는 GDF-11에 결합하는 것과 관련하여 마이오스타틴에 우선적으로 결합함으로써 항체가 GDF-11활성과 관련하여 마이오스타틴 활성을 우선적으로 중화시키거나 GDF-11의 수준을 감소시키는 것과 관련하여 우선적으로 마이오스타틴의 수준을 감소시킨다는 것이 또한 표시된다.
Figure 112006076007538-PCT00004
Figure 112006076007538-PCT00005
Figure 112006076007538-PCT00006
도 1은 인간 프로마이오스타틴의 아미노산 서열을 나타내고, 신호 서열에는 밑줄이 쳐지고, 성숙형 마이오스타틴의 단량체를 구성하는 카르복시-말단에서의 단백질의 부분은 진한 글자로 표시된다.
도 2는 인간 성숙 마이오스타틴의 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명의 항원성 에피토프에 밑줄이 쳐진다.
도 3은 성숙형 인간 마이오스타틴 및 인간 GDF-11의 아미노산의 정렬을 나타내고, 본 발명의 항원성 에피토프에는 밑줄이 쳐지고, 마이오스타틴과 GDF-11 사이에서 상이한 항원성 에피토프 내의 잔기는 진하게 인쇄된다. 기호 (+)는 그 위치에서의 마이오스타틴과 GDF-11 사이의 보존적 아미노산 차이를 가리키고, 기호 (-)는 그 위치에서의 마이오스타틴과 GDF-11 사이의 비보존적 아미노산 차이를 가리킨다.
도 4는 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 15의 LCVR의 정렬을 나타내고, CDR 도메인은 진하게 인쇄된다. 기호 (*)는 Fab 간에 변이가 있는 아미노산 잔기를 가리킨다.
도 5는 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 15의 HCVR의 정렬을 나타내고, CDR 도메인은 진하게 인쇄된다. 기호 (*)는 Fab 간에 변이가 있는 아미노산 잔기를 가리킨다.
본 발명은 포유류 마이오스타틴 또는 이의 일부에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편 (예를 들어, 항원-결합 단편)에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체가 결합하는 항원성 에피토프는 성숙 마이오스타틴의 잔기 40-64로 파악된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 리간드 (예를 들어, 마이오스타틴 수용체)가 마이오스타틴에 결합하는 것을 차단하거나, 마이오스타틴의 생물학적 활성을 저해한다.
본 발명의 항체는 적어도 약 1×10-7 M, 바람직하게는 적어도 약 9×10-8 M 또는 7×10-8 M, 더욱 바람직하게는 적어도 약 5×10-8 M의 친화력으로 성숙 마이오스타틴 또는 이의 일부에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 어떠한 표준 결합 분석에서도 배경 수준을 초과하여 GDF-11에 결합하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 150 ㎍/㎖ 미만, 바람직하게는 100 ㎍/㎖ 미만, 더욱 바람직하게는 90, 80, 70, 60 또는 50 ㎍/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 20 ㎍/㎖ 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 2 또는 0.2 또는 0.02 ㎍/㎖ 미만에서 시험관내 또는 생체내에서 마이오스타틴 생물학적 활성의 저해를 나타낸다. 본원에서 사용된 용어 "성숙 마이오스타틴"은 전단백질 형태의 마이오스타틴의 단백질분해 절단 후에 생성된 단량체성 또는 이량체성 형태, 바람직하게는 동종이량체 형태의 단백질을 지칭할 수 있다.
천연적으로 존재하는 전장 항체는 디술피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) (전장인 경우 약 50-70 kDa) 및 2개의 경쇄 (L) (전장인 경우 약 25 kDa)의 4개의 펩티드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자이다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식에 주로 책임이 있는 약 100-110 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단 부분은 이펙터(effector) 기능에 주로 책임이 있는 불변 영역을 한정짓는다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류되고, 특정 불변 영역을 특징으로 한다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE로 한정짓는다. 각각의 중쇄 유형은 특정 불변 영역을 특징으로 한다.
각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 "HCVR") 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 IgG, IgD, 및 IgA에 대해서는 3개의 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)으로; IgM 및 IgE에 대해서는 4개의 도메인 (CH1, CH2, CH3, 및 CH4)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 "LCVR") 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 한 개의 도메인 CL로 구성된다. HCVR 및 LCVR 영역은 골격 영역 (FR: framework region)으로 칭해지는 좀더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR: complementarity determining region)으로 칭해지는 과가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LCVR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산 할당은 주지된 약조에 따른다 [예를 들어, [Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)], 또는 [Al-Lazikani et al., J. Mol . Biol . 273:927-948, 1997]에 기술된 Chothia 넘버링(numbering) 도식, 또한 인터넷 사이트 http:www.rubic.rdg.ac.uk/∼andrew/bioinf.org/abs 참조]. 특정 항원에 결합하는 항체의 기능적 능력은 6개의 CDR에 의해 총체적으로 결정된다. 그러나, 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 단일 가변 도메인은, 비록 완전한 Fab보다 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하여 이에 결합하는 능력을 가질 수 있다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 (또는 간단히 "본 발명의 모노클로날 항체")와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체를 지칭한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 설치류, 바람직하게는 마우스 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체 또는 인간화 항체를 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어, 당업계에 주지된 하이브리도마 기술, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이같은 기술들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 제조된 항체에 한정되지 않는다. "모노클로날 항체"는 예를 들어, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론이 포함되는 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하고, 항체가 제조된 방법을 지칭하지 않는다. "모노클로날 항체"는 마우스 항체 또는 키메라 항체 또는 인간화 항체의 무손상 (완전 또는 전장) 항체, 실질적인 무손상 항체, 또는 항원-결합 부분을 포함하는 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다.
본원에서 사용된 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 영역" 또는 "항원-결합 도메인"은 항원과 상호작용하고 항원에 대한 특이성 및 친화력을 항체에 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항체 분자의 부분을 본원에서 상호교환적으로 지칭한다. 이러한 항체 부분은 항원-결합 잔기의 적절한 구조를 유지하기 위해 필요한 "골격" 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체의 항원-결합 영역의 CDR은 마우스에서 유래된 것일 것이다. 또다른 실시양태에서, 항원-결합 영역은 토끼, 래트 또는 햄스터가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다른 비-인간 종으로부터 유래될 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"는 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 DNA를 링커 서열과 연결시킴으로써 생산될 수 있는 단일쇄 Fv 단편일 수 있다 ([Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994] 참조). 단편이 특정되는지 여부와 상관없이 본원에서 사용된 용어 "항체"에는 이같은 단편뿐만 아니라 단일쇄 형태도 포함되는 것으로 이해된다. 단백질이 이의 의도된 표적 (즉, 에피토프 또는 항원)에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 능력을 유지하는 한, 이는 용어 "항체"에 포함된다. 항체는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있고, 여전히 본 발명의 범위 내에 속한다.
"모노클로날 항체"의 집단은 균질한 또는 실질적으로 균질한 (또는 순수한) 항체 집단을 지칭한다 (즉, 집단 내 항체의 적어도 약 90 ％, 91 ％, 92 ％, 93 ％, 94 ％, 95 ％, 96 ％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 97 ％ 또는 98 ％, 가장 바람직하게는 적어도 99 ％가 동일하고 ELISA 분석에서 동일한 항원 또는 에피토프에 대해 경쟁할 것이다).
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합" 또는 "우선적으로 결합"은 특이적 결합 쌍의 한 구성원이 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자에는 현저하게 결합하지 않는 상황을 지칭한다. 이 용어는 예를 들어, 본 발명의 항체의 항원결합 도메인이 다수의 항원이 지닌 특정 에피토프에 특이적인 경우에도 또한 적용가능하고, 이러한 경우 항원결합 도메인을 지닌 특이적 항체는 이 에피토프를 지닌 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 GDF-11에 특이적으로 결합하거나 우선적으로 결합하지 않으면서 마이오스타틴에 특이적으로 결합하고/하거나 우선적으로 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는, 당업계의 표준 기술 예컨대 ELISA 분석, 경쟁적 ELISA 분석 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00007
분석에서 측정된 KD 값에 의해 측정했을 때, 비-마이오스타틴 단백질 또는 펩티드 (예를 들어, GDF11) 또는 서열 46 또는 43에 제시된 서열의 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산을 포함하지 않는 단백질과 약 20 ％ 미만의 교차-반응성 (더욱 바람직하게는, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ％ 교차-반응성)을 갖는다 바람직하게는, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 경쟁 ELISA 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00008
분석에 의해 측정했을 때, GDF-11과 결합하는 것보다 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 크게, 더욱 바람직하게는 GDF-11과 결합하는 것보다 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600-배 더 크게 마이오스타틴에 결합한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체는 당업계에서 이용가능한 어떠한 결합 분석에서도 배경 수준을 초과하는 수준으로 GDF-11에 결합하지 않는다. 본 발명의 모노클로날 항체는 단량체 또는 이량체 형태의 마이오스타틴 또는 이의 일부에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체와 관련된 어구 "생물학적 성질" 또는 "생물학적 특징" 또는 용어 "활성" 또는 "생활성"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 에피토프/항원 친화력 및 특이성 (예를 들어, 마이오스타틴 또는 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성된 펩티드에 대한 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 결합), 생체내, 시험관내 또는 원위치에서 마이오스타틴의 활성에 길항하는 능력, 항체의 생체내 안정성, 및 항체의 면역원성 성질이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 당업계에서 인정되는 항체의 다른 확인가능한 생물학적 성질 또는 특징에는, 예를 들어, 교차-반응성 (즉, 일반적으로, 표적 펩티드의 비-인간 상동체와의 교차 반응성, 또는 다른 단백질 또는 조직과의 교차 반응성), 및 포유동물 세포에서 단백질의 고발현 수준을 보존하는 능력이 포함된다. 상기 언급된 성질 또는 특징은 필요에 따라 ELISA, 경쟁적 ELISA, BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00009
표면 플라즈몬 공명 분석, 비제한적인 시험관내 및 생체내 중화 분석, 수용체 결합, 사이토카인 또는 성장 인자 생산 및/또는 분비, 제노푸스(Xenopus) 동물 캡 발생, 신호 전달, 및 인간, 영장류 또는 기타 공급원이 포함되는 여러 공급원으로부터의 조직 절편으로의 면역조직화학이 포함되지만 이에 한정되지 않는 당업계에 인정된 기술을 사용하여 관찰 또는 측정 또는 평가할 수 있다.
본 발명의 항체의 활성과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "저해" 또는 "중화"는, 예를 들어, 생물학적 활성 또는 성질, 질환 또는 용태가 포함되지만 이에 한정되지 않는 저해될 것의 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 방해하거나, 방지하거나, 억제하거나, 속도저하시키거나, 파괴하거나, 제거하거나, 정지시키거나, 또는 역행하는 능력을 의미한다.
핵산 또는 단백질 (예를 들어, 항체)와 관련되어 사용될 때 용어 "단리된"은 천연 공급원 내에서 통상적으로 회합된 적어도 하나의 오염물로부터 확인 및 분리된 핵산 서열 또는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체이다 (예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 마이오스타틴에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 포함하고, 마이오스타틴 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다).
용어 "카밧(Kabat) 넘버링" 및 "카밧 라벨링"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인정되는 이러한 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 다른 아미노산 잔기보다 더욱 가변성인 (즉, 초가변성인) 아미노산 잔기의 넘버링 시스템을 지칭한다 ([Kabat, et al., Ann . NY Acad . Sci. 190:382-93 (1971)]; [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)]).
폴리뉴클레오티드는 또다른 폴리뉴클레오티드와 기능상 관계를 갖게 될 때 "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "개체", "대상" 및 "환자"는 마우스, 원숭이, 인간, 포유류 농장 동물, 포유류 운동 동물, 및 포유류 애완동물이 포함되지만 이에 한정되지 않는 포유동물을 지칭한다; 바람직하게는, 이 용어는 인간을 지칭한다.
용어 "벡터"에는 플라스미드 또는 바이러스 벡터가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 자신이 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자가 포함된다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있고, 또다른 벡터들은 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭되고, 예시적인 벡터는 당업계에 주지되어 있다.
용어 "숙주 세포"에는 임의의 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 HCVR, LCVR 또는 모노클로날 항체를 포함하는 임의의 재조합 벡터(들)의 수용체인 개별적인 세포 또는 세포 배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 후손이 포함되고, 후손은 자연적인, 우연한 또는 계획적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 원래의 모(母) 세포와 반드시 완전하게 동일하지 않을 수 있다 (형태학 또는 전체 DNA 상보체의 관점에서). 숙주 세포에는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 경쇄 또는 중쇄를 발현하는 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 시험관내, 생체내 또는 시험관내 형질전환, 형질도입 또는 감염된 세포가 포함된다. 본 발명의 재조합 벡터 (숙주 염색체 내로 혼입되었는지 여부와 상관없음)를 포함하는 숙주 세포를 "재조합 숙주 세포"로 또한 지칭할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 숙주 세포는 CHO 세포 (예를 들어, ATCC CRL-9096), NS0 세포, SP2/0 세포 및 COS 세포 (예를 들어, ATCC CRL-1650, ATCC CRL-1651), HeLa (ATCC CCL-2)이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가적인 숙주 세포로는 식물 세포, 효모 세포, 기타 포유류 세포 및 원핵생물 세포가 포함된다.
본 발명은 마이오스타틴에 결합하는 단리된 모노클로날 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 성숙형 마이오스타틴의 아미노산 40-64에 걸친 영역에 결합한다. 또한, 본 발명의 항체는 생체내, 시험관내 또는 원위치에서 마이오스타틴 생물학적 활성을 중화한다. 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 (이의 항원-결합 부분, 및 유사한 특이성을 갖는 인간화 모노클로날 항체 포함)가 마이오스타틴에 특이적으로 결합하는 것은 상기 항체를 마이오스타틴-관련 질환 및 장애, 즉 마이오스타틴 수준을 저하시키거나 마이오스타틴 생물학적 활성을 저해하는 것이 이로운 질환 또는 장애의 치료제 또는 예방제로서 사용하도록 한다.
본 발명의 항체가 결합하는 에피토프 ("본 발명의 마이오스타틴 에피토프")는 임의의 포유류 종의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40과 64를 잇는 펩티드 내에 위치한다. 상기 에피토프에 결합하는 항체는 GDF-11에 결합하는 것에 비하여 마이오스타틴에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
용어 "에피토프"는 어떤 분자에 있어서 항체가 항원결합 영역 중 하나 이상을 통해 인식하여 결합하는 부분을 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 군체(grouping)으로 종종 구성되고, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. "저해 에피토프" 및/또는 "중화 에피토프"는 무손상 분자 (이러한 경우, 마이오스타틴)의 경우 및 항체에 결합되었을 때 생체내, 시험관내 또는 원위치에서 분자 또는 분자를 함유하는 생물의 생물학적 활성이 결과적으로 소실 또는 감소되는 에피토프를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유류, 예를 들어, 마우스 또는 인간에서 항원성 및/또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드의 부분을 또한 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 당업계에 주지된 임의의 방법, 예를 들어, 통상적인 면역분석법에 의해 결정될 때 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 부분으로 정의된다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없지만, 면역원성일 수 있다. 본원에서 사용된 "면역원성 에피토프"는 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 결정될 때 동물에서 항체 응답을 도출해 내는 폴리펩티드의 부분으로 정의된다 (예를 들어, [Geysen et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 81:3998-4002 (1983)] 참조). 본 발명의 인간 마이오스타틴 항원성 에피토프는 서열 43 및 46에 제시된 아미노산 서열을 갖는다. 임의의 포유류 종에 대한 본 발명의 마이오스타틴 항원성 에피토프는 성숙형 마이오스타틴의 아미노산 40-64로 구성되는 펩티드 내에 존재한다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40 내지 64에 국소화된 것으로 발견된 항원성 에피토프에 결합한다. 본 발명의 마이오스타틴 면역원성 및/또는 항원성 에피토프는 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성되거나, 또는 서열 46 또는 43에 제시된 서열로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성되고, 바람직하게는 면역원성 에피토프는 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 성숙 마이오스타틴의 잔기 번호 46, 49, 50, 52 및 62에서의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기에 걸쳐지고, 즉, 상기 잔기 번호에서의 아미노산은 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이하다 (도 3 참조). 또한, 본 발명의 마이오스타틴 면역원성 에피토프는 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64 내에 존재하거나, 또는 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성되고, 바람직하게는 상기 면역원성 에피토프는 상기 인접 아미노산 중 1, 2, 3, 4 또는 5 개가 동일한 포유동물에서의 GDF-11의 등가 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 아미노산인 아미노산 잔기에 걸쳐진다. 본 발명의 면역원성 에피토프는 또한 항원성 에피토프인 것으로 구현된다. 항원성 에피토프는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 이외의 추가적인 마이오스타틴 잔기를 가질 수 있지만, 마이오스타틴에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 모노클로날 항체가 이러한 추가적인 잔기를 필요로 하지는 않는다. 추가적으로, 아미노산 40-64 (즉, 항원성 에피토프) 이외의 마이오스타틴의 잔기는 항원성 도메인의 입체형태적 구조에 영향을 미쳐, 본 발명의 항체가 항원성 에피토프에 결합하는 것을 변경시킬 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체는, 예를 들어, ELISA 분석, 경쟁 ELISA 분석 또는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00010
분석에서의 KD 값에 의해 결정했을 때, GDF-11에 결합하는 것에 비해 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100-배 더 크게 (예를 들어, 더 큰 친화력 또는 더 큰 특이성), 더욱 바람직하게는 GDF-11에 결합하는 것에 비해 적어도 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 또는 600-배 더 크게 마이오스타틴에 결합한다.
성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64 (경계 포함)에 걸쳐진 도메인 또는 본원에 기술된 면역원성 에피토프로 구성된 임의의 펩티드를, 바람직하게는 캐리어 단백질, 예를 들어, KLH와 접합시켜, 면역원성 펩티드로 사용하여 본 발명의 모노클로날 항체를 생성시킬 수 있다. 면역원성 펩티드를 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스를 면역화시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 면역화된 동물로부터 항-마이오스타틴 항체를 단리하고, 당업계에 주지된 방법에 의해 스크리닝하여, 마이오스타틴의 아미노산 40-64에 특이적으로 결합하는 이러한 항체를 단리한다.
일반적으로, 면역화된 동물의 항체 생산 세포를 적절한 불멸 세포주 (예를 들어, 골수종 세포주 예컨대 SP2/0)와 융합시킴으로써 하이브리도마를 생산할 수 있다. 항체 생산 세포, 바람직하게는 지라 또는 림프절의 항체 생산 세포를 당해 항원으로 면역화된 동물로부터 수득한다. 융합된 세포 (하이브리도마)를 선택 배양 조건을 사용하여 단리하고 제한 희석에 의해 클로닝할 수 있다. 원하는 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 세포를 적절한 분석에 의해 선택할 수 있다. 이같은 단리 및 스크리닝 방법은 당업계에 주지되어 있다. 파지 디스플레이 (Matthews DJ and Wells JA. Science . 260:1113-7, 1993), 리보솜 디스플레이 (Hanes, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) 95:14130-5, 1998), 박테리아 디스플레이 (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) 또는 효모 디스플레이 (Kieke MC, et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997)와 같은 강화 기술을 사용하여 라이브러리로부터 항체 단편을 선택하는 것은 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 성공적인 대안으로 입증되었다 (최근의 검토: [Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000). 당업계에 주지된 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 키메라 또는 인간화 형태로 변경시킬 수 있다.
예를 들어, 재조합 항체 (예를 들어, 단일쇄 Fv 또는 Fab)를 라이브러리로부터 선택하는 방법, 또는 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)의 면역화에 의지하는 방법이 포함되는, 인간 또는 인공 항체를 포함하여 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64에 결합하는 항체를 생산 또는 단리하는 또다른 적절한 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA , 90:2551-2555, 1993]; [Jakobovits et al., Nature , 362:255-258, 1993]; 미국 특허 제5,545,806호 (Lonberg et al.); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.) 참조).
상이한 종으로부터 유래된 부분을 포함하는, 단일쇄 항체, 및 키메라, 인간화 또는 영장류화 (CDR-그래프트(grafted)) 항체, 뿐만 아니라 키메라 또는 CDR-그래프트 단일쇄 항체 등이 또한 본 발명 및 용어 "항체"에 포함된다. 이러한 항체의 다양한 부분을 합성적으로 통상적인 기술에 의해 화학적으로 함께 연결시킬 수 있거나, 유전자 조작 기술을 사용하여 인접 단백질로서 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 또는 인간화 사슬을 코딩하는 핵산을 발현시켜 인접 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 제0,125,023 B1호 ; 미국 특허 제4,816,397호; 유럽 특허 제0,120,694 B1호; WO 86/01533; 유럽 특허 제0,194,276 B1호; 미국 특허 제5,225,539호; 유럽 특허 제0,239,400 B1호 및 미국 특허 제5,585,089호 및 제5,698,762호 참조. 또한, 영장류화 항체에 관해서 [Newman, R. et al., BioTechnology , 10:1455-1460, 1993], 및 단일쇄 항체에 관해서 미국 특허 제4,946,778호 (Ladner et al.) 및 [Bird, R. E. et al., Science, 242:423-426, 1988] 참조.
또한, 키메라, 인간화, 영장류화 또는 단일쇄 항체가 포함되는 항체의 기능성 단편 또한 생산될 수 있다. 상기 항체들의 기능성 단편들은 이들이 유래된 전장 항체의 하나 이상의 결합 기능 및/또는 생물학적 기능을 유지한다. 바람직한 기능성 단편은 상응하는 전장 항체의 항원-결합 기능 (예를 들어, 포유류 성숙형 마이오스타틴에 결합하는 능력)을 유지한다. 특히 바람직한 기능성 단편은 포유류 성숙 마이오스타틴의 하나 이상의 기능 또는 생활성 특징, 예컨대 결합 활성, 신호전달 활성 및/또는 세포 응답의 자극을 저해하는 능력을 유지한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 기능성 단편은 마이오스타틴과 이의 하나 이상의 리간드와의 상호작용을 저해할 수 있고/있거나 하나 이상의 수용체-매개 기능을 저해할 수 있다.
포유류 성숙 마이오스타틴 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 항체 단편에는 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편이 포함되지만 이에 한정되지 않고, 이들은 본 발명에 포함된다. 이같은 단편은 효소 절단에 의해 또는 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인 또는 펩신 절단으로 각각 Fab 또는 F(ab')2 단편이 생성될 수 있다. 또한 하나 이상의 정지 코돈이 천연 정지 부위의 상류에 도입된 항체 유전자를 사용하여 다양한 말단절단된(truncated) 형태로 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 중쇄의 경첩(hinge) 영역 및 CH1 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 키메라 유전자를 고안할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (예를 들어, 고체 상 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00011
표면 플라즈몬 공명 분석에 의해 결정했을 때) 적어도 약 1×10-7 M, 바람직하게는 적어도 약 9×10-8 M 또는 7×10-8 M, 더욱 바람직하게는 적어도 약 5×10-8 M의 친화력으로 성숙 마이오스타틴 또는 이의 일부에 바람직하게 결합하고, 성숙 마이오스타틴의 생물학적 성질에 길항하는 능력을 갖는, 본원에 기술된 방법으로부터 생성된 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 제공한다.
바람직한 본 발명의 모노클로날 항체는 서열 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 LCVR 및/또는 서열 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54의 아미노산으로 대체된 서열 12로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 HCVR을 갖는다. (서열 및 Fab 내에서의 이의 위치에 대해서는 본원의 표 1 및 2; 및 도 4 및 5 참조). 또한, 본 발명의 모노클로날 항체는 (i) 서열 3 및 12, (ii) 서열 4 및 13, (iii) 서열 3 및 14, (iv) 서열 5 및 12, (v) 서열 6 및 15, (vi) 서열 7 및 17, (vii) 서열 8 및 12, (viii) 서열 9 및 16, (ix) 서열 10 및 12, 및 (x) 서열 11 및 12, 및 (xi) 서열 3 및 아미노산 26-37이 서열 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54로 대체된 서열 12로 구성된 군에 제시된 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 모노클로날 항체에 의해 성숙 인간 마이오스타틴 (또는 이의 일부)에 결합하는 것이 경쟁적으로 저해되는 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 LCVR은 서열 38, 23 및 56 (표 1 참조)에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다. 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 HCVR은 서열 55, 41 및 42 (표 2 참조)에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체이다. 별법으로, 항체 내에 존재하는 골격 및 임의의 불변 영역은 항체가 치료제로서 사용될 동물의 게놈으로부터 실질적으로 유래할 수 있다. 바람직한 항체는 전장 항체이다.
또한 본 발명은 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 또는 이의 일부를 발현하는 세포주에 관한 것이다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주의 생성 및 단리는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 달성할 수 있다. 바람직한 세포주로는 COS, CHO, SP2/0, NS0 및 효모가 포함된다 (ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA)와 같은 공공 기탁기관으로부터 입수가능함).
원핵생물 (박테리아) 및 진핵생물 발현 시스템 (예컨대, 효모, 배큘로바이러스, 식물, 포유류 및 기타 동물 세포, 트랜스제닉 동물, 및 하이브리도마 세포), 뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템이 포함되는 광범위한 숙주 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있다. 적절한 박테리아 발현 벡터의 예는 pUC119이고, 적절한 진핵생물 발현 벡터는 약화된 DHFR 선택 시스템과 함께 사용되는 변형된 pcDNA3.1 벡터이다. 기타 항체 발현 시스템이 당업계에 또한 공지되어 있고, 본원에서 구현된다.
본 발명의 항체는 숙주 세포에서의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조할 수 있다. 재조합에 의해 항체를 발현시키기 위해, 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포 내에서 발현되도록 항체의 면역 글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로의 형질전환, 형질도입, 감염 등이 숙주 세포에 이루어진다. 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 별법으로 중쇄 및 경쇄는 하나는 중쇄를 발현하고 또다른 하나는 경쇄를 발현하는 두 개의 벡터 내의 이들이 작동가능하게 연결된 상이한 프로모터들로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로, 중쇄 및 경쇄가 상이한 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양된 배지 내로 분비되고, 배지로부터 항체를 회수 또는 정제할 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이러한 유전자를 재조합 발현 벡터 내로 혼입시키고, 벡터를 숙주 세포 내로 도입한다. 이같은 표준 재조합 DNA 기술은, 예를 들어, [Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989]; [Ausubel, et al (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989]에 기술되어 있다.
HCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 HCVR-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2, 및 CH3)을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)] 참조. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편을, 예를 들어, 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. [Kabat, 상기 문헌]에 기술된 바와 같이 중쇄 불변 영역은 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 서브클래스 불변 영역 및 이의 임의의 동종이형 변이체일 수 있다. 별법으로, 항원 결합 부분은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd, 또는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자에 대해, HCVR-코딩 DNA는 오직 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
LCVR 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 LCVR-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 코딩하는 또다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Kabat, 상기 문헌] 참조. 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편을 표준 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성시키기 위해, LCVR 및 HCVR 영역이 연성 링커에 의해 연결된 인접 단일쇄 단백질로서 HCVR 및 LCVR 서열이 발현될 수 있도록, HCVR- 및 LCVR-코딩 DNA 단편이 연성 링커를 코딩하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 코딩하는 또다른 단편에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, [Bird, et al., Science 242:423-6, 1988]; [Huston, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-83, 1988]; [McCafferty, et al., Nature 348:552-4, 1990] 참조.
본 발명의 항체를 발현시키기 위해, 상기 기술된 바와 같이 수득된, 부분적 또는 전장 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA를 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 혼화성이도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별도의 벡터 내로 삽입할 수 있거나, 또는 더욱 전형적으로는 양 유전자를 동일한 발현 벡터 내로 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 추가적으로, 재조합 발현 벡터는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포로부터 분비되는 것을 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임(frame)에 맞게 작동가능하게 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다.
항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자(들)에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 항체 사슬 유전자(들)의 발현을 제어하는 조절 서열을 지닌다. 용어 "조절 서열"은 항체 사슬 유전자(들)의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 필요한 경우, 기타 발현 제어 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준과 같은 요소에 의존할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에 대한 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안(Simian) 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 메이져(major) 레이트(late) 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마(polyoma) 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다.
항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자 및 조절 서열에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가적인 서열, 예컨대 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 조절하는 서열 (예를 들어, 복제 기원) 및 하나 이상의 선택가능 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선택가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다. 예를 들어, 전형적으로 선택가능 마커 유전자는 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 저항성을 벡터가 도입된 숙주 세포에 부여한다. 바람직한 선택가능 마커 유전자에는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 DHFR-마이너스 숙주 세포에서 사용하기 위해), neo 유전자 (G418 선택을 위해), 및 선택/증폭을 위한 GS-음성 세포주 (예컨대 NSO)에서의 글루타민 합성 효소 (GS)가 포함된다.
경쇄 및/또는 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)을 표준 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입한다. 본 발명의 항체를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 이론적으로 가능하지만, 진핵생물 세포가 바람직하고, 포유동물 숙주 세포가 가장 바람직한데, 이같은 세포가 조립하기에 더 적절하고, 적절하게 폴딩되고(folded) 면역학적으로 활성인 항체를 분비하기 때문이다. 본 발명의 재조합 항체의 발현에 바람직한 포유류 숙주 세포로는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO 세포) (예를 들어, [Kaufman and Sharp, J. Mol . Biol . 159:601-21, 1982]에 기술된 바와 같이 DHFR 선택가능 마커와 함께 사용되는 [Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216-20, 1980]에 기술된 DHFR-CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2/0 세포가 포함된다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입되면, 항체가 숙주 세포 내에서 발현되도록, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장된 배양 배지 내로 항체가 분비되도록 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 항체가 생산된다. 항체를 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 표준 정제 방법을 사용하여 회수할 수 있다.
그 자체로 통상적인 기술에 의해, 무손상 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는데 숙주 세포를 사용할 수 있다. 상기 절차의 변형이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA로 형질전환시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 마이오스타틴에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 모두를 코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이같은 말단절단 DNA 분자로부터 발현된 분자 또한 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명의 항체의 재조합 발현을 위한 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 모두를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 DHFR-CHO 세포 내로 예를 들어 인산칼슘-매개 형질감염에 의해 도입한다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 인핸서/프로모터 조절 요소 (예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된 것들, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 각각 작동가능하게 연결되어 유전자의 고수준의 전사가 구동된다. 재조합 발현 벡터는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포가 선택되도록 하는 DHFR 유전자를 또한 운반한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 하고, 무손상 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)에서 발현될 수 있다 (예를 들어, [Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992] 참조).
일단 발현되면, 무손상 항체, 이의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 본 발명의 기타 면역글로불린 형태물을 황산암모늄 침전, 이온 교환, 친화, 역상, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등이 포함되는 당업계의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다. 약제학적 용도를 위해, 적어도 약 90 ％, 92 ％, 94 ％ 또는 96 ％ 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99 ％ 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 부분적으로 또는 원하는 균질성으로 일단 정제한 후, 펩티드를 본원에 지시된 바와 같이 치료적 또는 예방적으로 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"에는 일가, 이가 또는 다가 면역글로불린이 포함된다. 일가 키메라 항체는 디술피드 다리를 통해 키메라 경쇄에 회합된 키메라 중쇄에 의해 형성된 이량체이다. 이가 키메라 항체는 하나 이상의 디술피드 다리를 통해 회합된 2개의 중쇄-경쇄 이량체에 의해 형성된 사량체이다.
인간에서 사용하기 위한 항체의 키메라 중쇄는 인간 중쇄 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 CH1 또는 CH2에 연결된, 마이오스타틴에 특이적인 비인간 항체의 중쇄로부터 유래된 항원-결합 영역을 포함한다. 인간에서 사용하기 위한 항체의 키메라 경쇄는 인간 경쇄 불변 영역 (CL)의 적어도 일부에 연결된, 마이오스타틴에 특이적인 비인간 항체의 경쇄로부터 유래된 항원 결합 영역을 포함한다. 동일한 또는 상이한 가변 영역 결합 특이성의 키메라 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체, 단편 또는 유도체를, 공지된 방법 단계에 따라, 개별적인 폴리펩티드 사슬의 적절한 회합에 의해 또한 제조할 수 있다. 이러한 접근법으로, 키메라 중쇄를 발현하는 숙주를 키메라 경쇄를 발현하는 숙주와 별도로 배양하고, 면역글로불린 사슬을 별도로 회수한 후, 회합시킨다. 별법으로, 숙주를 공-배양하고, 배양 배지 내에서 사슬들이 자발적으로 회합하도록 한 후, 조립된 면역글로불린 또는 단편을 회수할 수 있다.
키메라 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,284,471호; 제5,807,715호; 제4,816,567호; 및 제4,816,397호 참조).
바람직한 실시양태에서, 미국 특허 제6,284,471호에 기술된 바와 같이, 인간 불변 (C) 영역의 적어도 일부를 코딩하는 제 2 DNA 절편에 연결된, 비인간 기원의 항원-결합 영역을 적어도 코딩하는 제 1 DNA 절편 (예를 들어, 본원의 표 1, 2 및 도 4 및 5에서의 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 또는 15의 것), 예컨대 결합 (J) 절편을 갖는 기능적으로 재배열된 가변 (V) 영역을 포함하는 유전자가 생성된다.
바람직하게는, 치료적 목적을 위해 사용될 본 발명의 항체는 치료적 항체에 대한 면역 응답을 포유동물이 이끌어낼 가능성이 감소되도록 항체가 치료제로서 사용될 포유동물로부터 유래된 항체 내에 존재하는 바와 같은 골격 및 불변 영역의 서열을 가질 것이다.
인간화 항체는 설치류 항체의 경우에 종종 관찰되는 인간 항-마우스 항체 응답을 피하면서 치료적 용도에 유용할 것으로 간주되기 때문에 특히 흥미롭다. 본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 적어도 한 부분이 인간 기원인, 상이한 기원의 항체들의 부분을 포함하는 면역글로불린을 지칭한다. 예를 들어, 인간화 항체는 통상적인 기술 (예를 들어, 합성)에 의해 화학적으로 연결된 또는 유전자 조작 기술을 사용하여 인접 폴리펩티드로서 제조된, 필수적인 특이성을 갖는 비인간 기원, 예컨대 마우스의 항체로부터 유래된 부분 및 및 인간 기원의 항체로부터 유래된 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, "인간화 항체"는 비인간 항체 (바람직하게는 마우스 모노클로날 항체)로부터 유래된 CDR을 갖고, 골격 및 불변 영역 (또는 이의 상당한 또는 실질적인 부분, 즉 적어도 약 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 98 ％ 또는 99 ％)은, 존재한다면, 상기 항체가 인간 세포에서 생산되었는지 여부와 상관없이, 인간 생식계열 면역글로불린 영역 (예를 들어, International ImMunoGeneTics Database 참조) 또는 이의 재조합 또는 돌연변이 형태물에서 발생하는 핵산 서열 정보에 의해 코딩된다. 인간화 항체는 무손상 항체, 실질적인 무손상 항체, 항원-결합 부위를 포함하는 항체의 일부, 또는 Fab 단편, Fab' 단편, F (ab')2 또는 단일쇄 Fv 단편을 포함하는 항체의 부분일 수 있다. 인간화 항체를 생성시키는 방법에서, CDR의 어느 한쪽 말단에서의 아미노산 (예를 들어, 표 1 및 2 참조)은 접합 골격 서열의 절편에 대해 인간 생식계열에서 발생하는 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 생각된다.
인간화 항체를 당업계에서 일상적으로 사용되는 방법을 사용하여 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물을 사용할 때는, 생체내 체세포 돌연변이 유발)시킬 수 있고, 따라서, 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 영역의 골격 영역 아미노산 서열은, 인간 생식계열 HCVR 및 LCVR 서열에 관련된 것들로부터 유래되면서, 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 인간화 재조합 항체의 HCVR 및 LCVR 골격 영역의 이같은 아미노산 서열은 인간 생식계열 서열과 적어도 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 98 ％, 가장 바람직하게는 적어도 99 ％ 동일한 것으로 생각된다.
인간화 항체는 인간 치료에서 사용하기에 비인간 및 키메라 항체에 비해 적어도 3개의 잠재적인 장점을 갖는다: (i) 이펙터(effector) 부분이 인간이고, 인간 면역 시스템의 다른 부분과 더 잘 상호작용할 수 있다 (예를 들어, 보체-의존적 세포독성 또는 항체-의존적 세포형 세포독성에 의해 표적 세포를 더욱 효율적으로 파괴함); (ii) 인간 면역 시스템이 인간화 항체의 골격 또는 불변 영역을 외래물로 인식하지 않고, 따라서 이러한 주사된 항체에 대한 항체 응답이 전체적으로 외래성인 비인간 항체 또는 부분적으로 외래성인 키메라 항체에 대한 것보다 더 적다; (iii) 주사된 비인간 항체는 인간 항체의 반감기보다 훨씬 더 짧은 인간 순환에서의 반감기를 갖는 것으로 보고되었다. 주사된 인간화 항체는 천연 발생 인간 항체의 반감기와 더욱 유사한 반감기를 가질 수 있어서, 더 적고 더 적은 빈도의 용량이 제공되도록 할 수 있다.
인간화는 일부 경우에 항체의 항원 결합에 불리하게 영향을 미칠 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항-마이오스타틴 모노클로날 항체는 마이오스타틴에 대한 결합 친화력이 모(母) 마우스 항체, 바람직하게는 마이오스타틴에 대한 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 또는 15 (본원의 도 4 및 5 참조)의 결합 친화력의 약 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 30 ％ 이상, 가장 바람직하게는 약 25 ％, 20 ％, 15 ％, 10 ％ 또는 5 ％ 이상일 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 본원에 기술된 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 또는 15와 동일한 에피토프에 결합할 것이다. 상기 항체는 성숙 마이오스타틴 또는 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드에 대한 결합에 대해 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 또는 15와 경쟁하는 능력을 기초로 확인할 수 있다.
일반적으로, 인간화 항체는 본 발명의 마이오스타틴 에피토프에 결합하는 항체의 HCVR 및 LCVR을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 상기 HCVR 및 LCVR (비인간) 내의 CDR을 확인하고, 이같은 CDR-코딩 핵산 서열을 선택된 인간-골격 코딩 핵산 서열 상에 그래프트시킴으로써 생산된다. 바람직하게는, 인간 골격 아미노산 서열은 생성된 항체가 인간에서의 생체내 투여에 적절할 수 있도록 선택된다. 이는, 예를 들어, 이같은 인간 골격 서열을 함유하는 서열의 이전의 사용을 기초로 결정할 수 있다. 바람직하게는, 인간 골격 서열은 그 자체는 유의하게 면역원성이지 않을 것이다.
별법으로, 인간화될 항체 (예를 들어, Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 또는 15)에 대한 골격의 아미노산 서열을 공지된 인간 골격 서열과 비교하고, CDR-그래프트화에 사용될 인간 골격 서열을 모 항체, 예를 들어, 마이오스타틴에 결합하는 마우스 항체의 것과 매우 유사한 서열을 포함하는 것을 기초로 선택할 수 있다. 수많은 인간 골격 서열이 단리되었고, 이들의 서열이 당업계에 보고되었다. 이는 선택된 인간 골격 (및 가능하게는 또한 인간 불변 영역) 상에 그래프트된 모 (예를 들어, 마우스) 항체의 CDR을 함유하는 생성된 CDR-그래프트 인간화 항체가 항원 결합 구조를 실질적으로 유지하고 따라서 모 항체의 결합 친화력을 유지하는 가능성을 증강시킨다. 유의한 정도의 항원 결합 친화력을 유지하기 위해, 선택된 인간 골격 영역은 생체내 투여에 적절할 것으로 예상되는, 즉 면역원성이 아닌 것들인 것이 바람직할 것이다.
양쪽의 방법에서, 바람직하게는 마우스의 항-마이오스타틴 항체의 HCVR 및 LCVR 영역을 코딩하는 DNA 서열이 수득된다. 면역글로불린을 코딩하는 핵산 서열의 클로닝 방법은 당업계에 주지되어 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 적절한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 면역글로불린-코딩 서열을 증폭시키는 것을 수반할 수 있다. 면역글로불린 핵산 서열, 특히 마우스 HCVR 및 LCVR 서열의 증폭에 적절한 프라이머는 문헌에 보고되어 있다. 이같은 면역글로불린-코딩 서열을 클로닝한 후, 당업계에 주지된 방법에 의해 이를 서열분석할 수 있다.
인간화될 항체의 CDR 및 골격을 코딩하는 DNA 서열이 일단 확인되면, CDR을 코딩하는 아미노산 서열이 확인되고 (핵산 서열 및 유전자 코드를 기초로 추정되고, 이전의 항체 서열과의 비교에 의해), CDR-코딩 핵산 서열이 선택된 인간 골격-코딩 서열 상에 그래프트된다. 이는 적절한 프라이머 및 링커의 사용에 의해 달성될 수 있다. 원하는 핵산 서열의 결찰에 준비시키기 위한 적절한 프라이머 및 링커의 선택 방법은 당업자의 능력으로 충분히 할 수 있다.
CDR-코딩 서열을 선택된 인간 골격 코딩 서열 상에 그래프트시킨 후, "인간화된" 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열을 코딩하는 생성된 DNA 서열을 발현시켜 마이오스타틴에 결합하는 인간화 Fv 또는 인간화 항체를 생산한다. 전형적으로, 인간화 HCVR 및 LCVR은 전체 항-마이오스타틴 항체 분자의 일부로서, 즉 코딩하는 DNA 서열이 시판되는 라이브러리로부터 수득된, 또는 예를 들어 상기 기술된 DNA 서열 수득 방법 중 하나를 사용하여 수득되거나 당업계에 존재하는 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현된다. 그러나, 인간화 항-마이오스타틴 Fv가 생산되도록 불변 영역의 부재 하에서 HCVR 및 LCVR 서열이 발현될 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 생성된 인간화 항-마이오스타틴 항체가 인간 이펙터 기능을 가질 수 있기 때문에, 인간 불변 서열의 융합이 잠재적으로 바람직하다.
공지된 서열의 단백질을 코딩하는 DNA의 합성 방법은 당업계에 주지되어 있다. 이같은 방법을 사용하여, 대상으로 하는 인간화 HCVR 및 LCVR 서열을 코딩하는 DNA 서열을 합성한 후 (불변 영역과 함께 또는 불변 영역 없이), 이를 재조합 항체의 발현에 적절한 벡터 시스템 내에서 발현시킨다. 이는 대상으로 하는 인간화 HCVR 및 LCVR 서열이 인간 불변 도메인 서열과의 융합 단백질로서 발현되고 회합하여 기능성 (항원 결합) 항체 또는 항체 단편이 생산되는 임의의 벡터 시스템에서 실행될 수 있다.
인간 불변 도메인 서열은 당업계에 주지되어 있고, 문헌에 보고되어 있다. 바람직한 인간 불변 경쇄 서열에는 카파 및 람다 불변 경쇄 서열이 포함된다. 바람직한 인간 불변 중쇄 서열에는 인간 감마 1, 인간 감마 2, 인간 감마 3, 인간 감마 r, 및 변경된 효과 또는 기능, 예를 들어, 증강된 생체내 반감기, 저하된 Fc 수용체 결합 등을 제공하는 이의 돌연변이된 버젼이 포함된다.
존재한다면, 인간 골격 영역은 항원 결합 영역 도너(donor)의 유사 또는 등가 영역과 서열 유사성을 갖는 인간 항체 가변 영역으로부터 바람직하게는 유래된다. 인간화 항체의 인간 기원 부분에 대한 골격 영역의 기타 공급원으로는 인간 가변 컨센서스 서열이 포함된다 (예를 들어, [Kettleborough, C. A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991)]; WO94/04679 (Carter et al.) 참조). 예를 들어, 비인간 부분을 수득하기 위해 사용된 항체 또는 가변 영역의 서열을 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U. S. Government Printing Office (1991)]에 기술된 인간 서열과 비교할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 인간화 항체 사슬의 골격 영역은 비인간 도너의 가변 영역과 적어도 약 60 ％ 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 70％ 전체 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85％ 전체 서열 동일성을 갖는 인간 가변 영역으로부터 유래된다. 또한 인간 부분은 비인간 도너의 등가 부분 (예를 들어, FR)과 비교했을 때, 사용될 특정 부분 (예를 들어, FR)과 적어도 약 65 ％ 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 70 ％ 서열 동일성을 갖는 인간 항체로부터 유래될 수 있다.
일부 예에서, CDR (마이오스타틴에 결합하는 항체로부터의 CDR)을 선택된 인간 골격 상에 그래프트시킴으로써 생산된 인간화 항체는 마이오스타틴에 대해 원하는 친화력을 갖는 인간화 항체를 제공할 수 있다. 그러나, 항원 결합을 증강시키기 위해 선택된 인간 골격의 특정 잔기를 추가로 변형시키는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 결합-부위 구조를 유지하거나 이에 영향을 미치는 모 (예를 들어, 마우스) 항체의 골격 잔기는 계속 유지될 것이다. 이러한 잔기는 모 항체 또는 Fab 단편의 X-선 결정학에 의해 항원-결합 부위의 3차원 구조를 확인함으로써 확인될 수 있다.
사용될 수 있는 마우스 항체의 인간화에 수반되는 방법을 추가로 기술하는 참고문헌은, 예를 들어, [Queen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:2869, 1991; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제4,816,397호; 미국 특허 제5,225,539호; [Levitt, M., J. Mol . Biol . 168:595-620, 1983]에 기술된 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD이다.
본 발명의 항체는 본원에 기술된 바와 같은 치료제, 진단제 및 연구 용도에 유용하다. 본 발명의 항체는 인간 마이오스타틴의 발현과 관련된 장애 또는 질환의 진단에 사용될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 항체는 마이오스타틴-관련 용태에 대해 치료될 대상에서 마이오스타틴 수준을 모니터링하는 분석법에서 사용될 수 있다. 진단 분석법에는 샘플, 예를 들어, 인간 체액 또는 세포 또는 조직 추출물 내의 마이오스타틴을 검출하기 위해 표지 및 본 발명의 항체를 사용하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 항체와 같은 결합 조성물을 변형시켜 또는 변형 없이 사용하고, 검출가능한 모이어티(moiety)의 공유 또는 비-공유 부착에 의해 표지시킨다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생산할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I와 같은 방사성동위원소, 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 양고추냉이 과산화효소일 수 있다. [Hunter, et al., Nature 144:945, 1962]; [David, et al., Biochemistry 13:1014, 1974]; [Pain, et al., J. Immunol . Meth . 40:219, 1981]; 및 [Nygren, J. Histochem . And Cytochem . 30:407, 1982]에 기술된 방법들을 포함하여, 항체를 검출가능한 모이어티에 별도로 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
예를 들어, ELISA, RIA, 및 FACS를 포함하여, 마이오스타틴을 측정하기 위한 다양한 통상적인 프로토콜이 당업계에 공지되어 있고, 마이오스타틴 발현의 변경된 또는 비정상 수준을 진단하기 위한 기초를 제공한다. 임의의 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 예를 들어, 마이오스타틴 폴리펩티드를 포함하는 샘플을, 예를 들어, 항원:항체 복합체를 형성하기에 적절한 조건 하에 항체와 조합함으로써 정상 또는 표준 발현 값을 정한다. 항체를 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 물질로 표지시켜 결합된 또는 결합되지 않은 항체의 검출을 용이하게 한다. 적절한 검출가능한 물질에는 다양한 효소, 인공 기, 형광 재료, 발광 재료 및 방사능 재료가 포함된다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제기 포함되고; 적절한 인공 기 복합체의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되고; 적절한 형광 재료의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되고; 발광 재료의 예로는 루미놀이 포함되고; 방사능 재료의 예로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 포함된다. (예를 들어, [Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)] 참조).
형성된 표준 복합체의 양을 예를 들어 광도측정 수단과 같은 다양한 방법에 의해 정량한다. 그 후 대상, 대조군 및 샘플 (예를 들어, 생검 조직으로부터의 샘플)에서 발현된 마이오스타틴 폴리펩티드의 양을 표준 값과 비교한다. 표준 값과 대상 값 간의 편차로 특정 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환을 마이오스타틴 폴리펩티드에 대한 특정 수준의 발현 (또는 발현 결여)과 상관시키는 파라메터를 정한다.
일단 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 존재가 정해지고 치료 프로토콜이 개시되면, 분석법을 규칙적으로 반복하여 마이오스타틴 발현 수준을 모니터링한다. 연속적인 분석법으로부터 수득된 결과를 사용하여 수일 내지 수개월 범위의 기간에 걸친 치료의 효능을 나타낸다. 특정 장애 (예를 들어, 허약 또는 악액질)와 관련하여, 대상으로부터의 생검 조직 또는 체액 (예를 들어, 혈청 또는 소변) 내의 마이오스타틴의 변경된 양의 존재는 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 발생에 대한 소인을 가리킬 수 있거나, 또는 실제 임상 증상이 나타나기 전에 이같은 장애, 상태, 용태, 증후군 또는 질환의 검출 수단을 제공할 수 있거나, 또는 본 발명의 항체에 대해 더욱 치료적으로 응답할 것 같은 집단을 한정지을 수 있다. 더욱 한정적인 초기 검출은 더 빨리 치료되도록 할 수 있어, 세포 증식의 추가적인 진행을 방지 및/또는 개선할 수 있다.
본 발명의 항체는 대상에게의 투여에 적절한 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여용 약제학적 조성물은 선택된 투여 방식에 적절하도록 고안되고, 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및/또는 부형제 예컨대 분산제, 완충제, 계면활성제, 방부제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 적절하게 사용된다. 상기 조성물은, 예를 들어, 진료의에게 일반적으로 공지된 제형 기술의 개요를 제공하는 [Remington, The Science and Practiceof Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995]에서와 같은 통상적인 기술에 따라 고안된다.
본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 구강, 설하, 또는 좌약 투여가 포함되는 표준 투여 기술을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 병리학의 위험이 있거나 이러한 병리학을 나타내는 대상에게 투여할 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 발명의 항체이다. "치료적 유효량"은 투여량에서 및 필요한 시간 기간 동안 원하는 치료적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 항체의 치료적 유효량은 질환 상태, 개인의 연령, 성별 및 체중, 및 개인에게서 원하는 응답을 이끌어내는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 또한 치료적 유효량은 또한 치료적으로 이로운 효과가 항체의 임의의 독성 또는 불리한 효과를 능가하는 것이다. "예방적 유효량"은 투여량에서 및 필요한 시간 기간 동안 원하는 예방적 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
치료적 유효량은 대상에게 치료적 이점을 부여하기 위해 필요한 활성제의 적어도 최소의 용량이지만 독성 용량보다 적다. 다시 말하면, 치료적 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 근육 질량을 증가시키거나, 골 밀도를 증가시키거나, 또는 근육 소모, 허약, 연령-관련 근육감소증, 골다공증, 비만, 임의 유형의 근육 퇴행위축, 중환자 근육병증, 패혈증, 악액질 (예를 들어, 암-관련 또는 HIV-유도), COPD, 골관절염, 신부전, 간부전, 심부전 또는 심장 질환, 대사 증후군 및 제II형 당뇨병이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하는 용태 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 포유동물, 바람직하게는 인간에서 이로운 치료적 효과를 초래하는 용태를 치료하는 양이다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입, 또는 국소적일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 비경구 투여에 적절한 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구에는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질, 또는 복강내 투여가 포함된다. 정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 비경구 전신 전달이 바람직하다. 이같은 주사를 위한 적절한 비히클은 당업계에서 간단하다.
약제학적 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하고, 제조 및 보관 조건 하에 예를 들어 밀봉 바이알 또는 주사기가 포함되는 제공된 용기 내에서 안정적이어야 한다. 따라서, 약제학적 조성물은 제형의 제조 후에 무균 여과될 수 있거나, 또는 다르게는 미생물학적으로 허용가능하게 제조될 수 있다. 전형적인 정맥내 주입용 조성물은 무균 링거액, 생리식염수, 덱스트로스 용액 및 행크 용액(Hank's solution)과 같은 유체 250-1000 ㎖의 부피 및 치료적 유효 용량 (예를 들어, 1 내지 100 ㎎/㎖ 이상)의 항체 농도를 가질 수 있다. 용량은 질환의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있다. 의학 업계에 주지된 바와 같이, 임의의 한 대상에 대한 투여량은 환자의 사이즈, 신체 표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강, 및 함께 투여되는 기타 약물이 포함되는 많은 인자에 따라 좌우된다. 전형적인 용량은, 예를 들어, 0.001 내지 1000 ㎍ 범위일 수 있다; 그러나, 특히 상기 언급된 인자들을 고려하여, 이러한 예시적인 범위보다 낮은 또는 높은 용량이 구현된다. 일일 비경구 투여량 계획은 전체 체중 1 ㎏ 당 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 100 mg/㎏, 바람직하게는 약 0.3 ㎍/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎍/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 내지 10 ㎎/㎏/일일 수 있다. 주기적인 평가에 의해 진행을 모니터링할 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여를 위해, 용태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 치료를 반복할 수 있다. 그러나, 기타 투여량 계획이 유용할 수 있고, 본 발명에서 배제되지 않는다. 원하는 투여량은 진료의가 달성하기 바라는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 단일 볼루스(bolus) 투여, 다중 볼루스 투여, 또는 항체의 연속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
항체의 이러한 제안된 양은 많은 치료적 판단에 영향을 받기 쉽다. 적절한 용량 및 스케쥴의 선택에서의 주요 요소는 수득된 결과이다. 이러한 상황에서 고려할 요소에는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 용태, 장애의 원인, 항체의 전달 부위, 항체의 특정 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 진료의에게 공지된 기타 요소가 포함된다.
본 발명의 치료제는 보관을 위해 동결 또는 동결건조되어, 사용 전에 적절한 무균 캐리어 내에서 재구축될 수 있다. 동결건조 및 재구축으로 항체 활성이 여러 정도로 손실될 수 있다. 보상되도록 투여량이 조절되어야 할 수 있다. 일반적으로, 6 내지 8 사이의 pH가 바람직하다.
치료적 용도
마이오스타틴은 근육 발생, 및 다수의 관련 장애 또는 질환에서 기능을 나타낸다 (예를 들어, 미국 특허 출원 제2003/0074680호 및 제2003/0082181호 참조). 성인에서, 마이오스타틴 mRNA는 골격근에서 주로 검출되지만, 더 낮은 농도로 지방 조직 및 심장 조직에서 또한 발견된다 (Sharma, M., et al., J. Cell Physiol . 180:1, 1999). 마이오스타틴 녹아웃(knockout) 마우스는 야생형 한배새끼에 비해 2배 내지 3배 더 큰 근육 질량을 갖는다. 증가된 근육 질량은 섬유 비대증 및 증식증의 결과이다 ([McPherron, A., et al. Nature 387:83-90, 1997] 및 [Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71]). 또한, 마이오스타틴 녹아웃 마우스는 야생형 한배새끼보다 지방을 덜 축적하지만, 다른 점에서는 정상이고 건강하게 나타난다. 또한 마이오스타틴은 지방생성의 중요한 조절인자인 것으로 최근 나타났다 (Rebbapragada, A., et al., Mol . and Cell . Bio . 23:7230-7242, 2003). 추가적으로, 마이오스타틴 결핍 마우스에서 골 구조 및 함량이 최근 연구되었다 ([Hamrick M. W., et al., J. Orthopaedic Research 21:1025, 2003]; [Hamrick, M. W., et al., Calcif Tissue Int 71:63, 2002]).
따라서, 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 근육 질량을 증가시키거나 골 밀도를 증가시키는데 사용될 수 있거나, 또는 근육 소모, 허약, 연령-관련 근육감소증, 골다공증, 비만, 근육 퇴행위축, 근육병증, 악액질, 패혈증, 골관절염, COPD, 신부전, 간부전, 심부전 또는 심장 질환, 대사 증후군 및 제II형 당뇨병의 용태가 포함되지만 이에 한정되지 않는, 포유동물에서 마이오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 이에 기여하는 용태 또는 마이오스타틴 수준의 감소가 포유동물에서 치료적 이점을 갖는 용태의 치료에 유용할 수 있다.
마이오스타틴 활성이 해롭거나 생활성 마이오스타틴의 감소된 수준이 이로운 상기 언급된 장애 중 적어도 하나의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 용도가 본원에서 구현된다. 추가적으로, 상기 언급된 장애 중 적어도 하나의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 용도가 구현된다.
본원에서 사용된 용어 "치료"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 방지하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 역효과에 대한 부분적인 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환 또는 용태의 치료를 위해 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하고, (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직은 질환에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상에서 질환이 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 저해하는 것, 즉 이의 발달을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 경감시키는 것, 즉 질환 또는 장애의 퇴행을 야기하거나 이의 증상 또는 합병증을 완화시키는 것이 포함된다. 투여량 계획은 최적의 원하는 응답 (예를 들어, 치료적 또는 예방적 응답)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할된 용량이 장기간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료적 상황의 요건에 의해 지시되는 대로 용량이 비례적으로 저하되거나 증가될 수 있다.
하기의 예들은 예시적 목적을 위해서만 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항- 마이오스타틴 Fab 합성
항-마이오스타틴 Fab의 클론을 C57Bl/6 야생형 마우스를 Omniclonal™ 항체 기술 (Biosite
Figure 112006076007538-PCT00012
, San Diego, CA)을 사용하여 면역화시킴으로써 생성된 Fab 라이브러리로부터 단리하였다. 마우스를 아미노산 서열 ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (서열 43)을 갖는 면역원성 폴리펩티드로 면역화시켰다. 이러한 서열은 야생형 인간 성숙 마이오스타틴의 위치 47 (상기 서열 43에서 밑줄쳐짐)에 있는 Cys 잔기가 Ser 잔기로 변화되어 캐리어 또는 합텐이 이러한 잔기에서 펩티드에 연결되는 것이 방지된 것을 제외하고는 성숙형 인간 마이오스타틴 (서열 2)의 아미노산 40-64에 걸친 서열과 동일하였다. 이러한 펩티드의 면역원성을 증가시키기 위해, 캐리어 단백질, 키홀 림피트(keyhole limpet) 헤모시아닌 및 헬퍼(helper) T-세포 펩티드를 표준 방법에 따라 면역원성 펩티드에 접합시켰다. 본원에 개시된 HCVR 및 LCVR CDR 및 골격 아미노산 서열 (표 1 및 2; 도 4 및 5)이 성숙 마이오스타틴 (예를 들어, 서열 2)에 결합하는 라이브러리로부터의 Fab의 서열로 확인되었고, 면역원성 펩티드에 결합하고 마이오스타틴 활성을 중화시켰다. Fab의 LCVR 및 HCVR을 코딩하는 대표적인 뉴클레오티드 서열이 하기 표 3에 열거된다.
Figure 112006076007538-PCT00013
실시예 2: ELISA 분석
A. 항- 마이오스타틴 Fab 가 성숙 마이오스타틴에 우선적으로 결합함
본 발명의 마우스 항-마이오스타틴 Fab (도 4 및 5 참조)을 Fab가 96웰 플레이트 상에서 다양한 농도로 코팅된 성숙 마이오스타틴 (이량체 형태)에 결합하는 것을 측정하는 ELISA 분석에서 테스트하였다. Fab가 GDF-11에 결합하는 것을 또한 테스트하였다.
2개의 96웰 플레이트의 각 웰을 70 ㎕ 재조합 마우스 마이오스타틴 (R&D systems, 카탈로그# 788-G8/CF, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충액 내의 1 ㎍/㎖, pH 9.6) 또는 70 ㎕ 재조합 인간 GDF-11 (Peprotech, Inc., 카탈로그# 120-11, 캐리어 없음, 카르보네이트 완충액 내 1 ㎍/㎖, pH 9.6)로 코팅하였다. 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인시키고, 세정 완충액 (20 mM 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1 ％ Tween-20)으로 2회 세정하였다. 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충액 (상기 세정 완충액 내의 5 ％ 카네이션 인스턴트 밀크(Carnation Instant milk))으로 5 시간 동안 차단시켰다.
테스트할 Fab을 차단 완충액 내로 10 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 0.4 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 및 0.016 ㎍/㎖로 희석하였다. 50 ㎕의 각각의 Fab 용액을 두 벌의 GDF-8 및 GDF-11로 코팅된 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다.
과산화효소가 접합된 2차 항체 (50 ㎕ 염소 항-마우스 카파 HRP (Southern Biotech), 차단 완충액 내에서 1:2000으로 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 발색성 기질 (즉, OPD 기질)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 13 분 동안 발색시켰다. 100 ㎕의 1N HCl을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도를 490 nm의 OD에서 판독하였다. 두 벌의 웰로부터의 평균 흡광도를 결정하였다.
이러한 데이타는 본 발명의 Fab 3, 5 및 7 (도 4 및 5)이 플레이트에 결합된 인간 성숙 마이오스타틴에 결합하고, GDF-11 결합과 비교했을 때 마이오스타틴에 우선적으로 결합한다는 것을 나타냈다.
B. 항- 마이오스타틴 Fab 가 마이오스타틴 (I)의 펩티드 면역원에 결합함.
마우스 항-마이오스타틴 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 15를 마우스의 면역화에 사용된 폴리펩티드 ("펩티드 면역원")에 Fab가 결합하는 것을 측정하는 ELISA 분석에서 테스트하였다. 이러한 폴리펩티드는 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40 내지 64에 걸쳐지고, 본원에 기술된 바와 같은 아미노산 서열 ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (서열 43)을 갖는다.
2개의 96웰 플레이트의 각 웰을 Fab의 생성에 사용된 펩티드 면역원 (카르보네이트 완충액 내의 2 ㎍/㎖, pH 9.6) 70 ㎕로 코팅하였다. 플레이트를 뚜껑을 제거한 건조 오븐 내에서 37 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인시키고, 세정 완충액 (20 mM 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1％ Tween-20)으로 2회 세정하였다. 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충액 (상기 세정 완충액 내의 5 ％ BioRad 블롯팅(blotting) 등급유)으로 2.5 시간 동안 차단시켰다.
Fab를 차단 완충액 내로 10 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 0.4 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 및 0.016 ㎍/㎖로 희석하였다. 래트 항-마이오스타틴 모노클로날 항체 (R&D Systems, 카탈로그# MAB788, 클론# 84214) 및 폴리클로날 항-마이오스타틴 항체 (R&D Systems, 카탈로그# AF788)를 상기 농도에서 대조군으로 사용하였고, 또한 차단 완충액 내에서 희석하였다. 50 ㎕의 각 항체 용액을 펩티드로 코팅된 웰에 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 1.5 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다.
과산화효소가 접합된 2차 항체 (Fab에 대해 50 ㎕ 염소 항-마우스 카파 HRP (Southern Biotech), 모노클로날에 대해 50 ㎕ 마우스 항-래트 (Jackson ImmunoResearch), 폴리클로날에 대해 50 ㎕ 토끼 항-염소 (Jackson ImmunoResearch), 모두 차단 완충액 내에 1:2000 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 발색성 기질 (즉, OPD 기질)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 발색시켰다. 100 ㎕ 1N HCl을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 이중 웰로부터의 평균 흡광도를 결정하였고, 이러한 값들이 하기 표 4에 열거된다.
Fab는 플레이트에 결합된 펩티드 면역원에 결합하였다. 폴리클로날 항체 또한 펩티드 면역원에 Fab보다 낮은 정도로 결합하였다. R&D 모노클로날 항체 결합은 배경 수준이었고, 이는 R&D 모노클로날 항체가 면역원성 펩티드에 들어있는 것과 상이한 에피토프를 인식한다는 사실과 합치하였다.
C. 항- 마이오스타틴 Fab 와 TGF -β 상과의 다양한 구성원의 결합
마우스 항-마이오스타틴 Fab 3, 5, 7 (도 4 및 5 참조), 및 폴리클로날 항-마이오스타틴 항체 (R&D Systems)를 플레이트 상에 코팅된 과 구성원 항원 (GDF-8/마이오스타틴)에 대한 Fab 및 항체의 결합을 측정하는 ELISA 분석법에서 테스트하였다. 하기 패널의 TGF-베타 상과 구성원들에 대한 Fab의 결합을 테스트하였다: GDF-8/마이오스타틴 (대조군), GDF-11, BMP-2, BMP-5, BMP-6, BMP-7, 액티빈 A, 액티빈 B, TGF-알파, TGF-베타1, 및 TGF-베타2. IGF-1 또한 음성 대조군으로 테스트하였다.
96웰 플레이트의 각 웰을 70 ㎕의 상기 열거된 성장 인자 중 하나 (카르보네이트 완충액 내 10 ㎍/㎖, pH 9.6)로 이중으로 코팅하였다. 공급원 및 카탈로그#에 대해서는 하기 표 5 참조. 플레이트를 4 ℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 웰을 흡인시키고 세정 완충액 (20 mM 트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1 ％ Tween-20)으로 2회 세정하였다. 플레이트를 웰 당 200 ㎕의 차단 완충액 (상기 세정 완충액 내의 5 ％ 카네이션 인스턴트 밀크)으로 3 시간 동안 차단시켰다.
항체를 차단 완충액 내에 10 ㎍/㎖로 희석하였다. 50 ㎕의 각 항체 용액을 성장 인자로 코팅된 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다.
과산화효소가 접합된 2차 항체 (Fab에 대해 50 ㎕ 염소 항-마우스 카파 HRP (Southern Biotech), 폴리클로날에 대해 50 ㎕ 토끼 항-염소 (Jackson ImmunoResearch), 모두 차단 완충액 내에 1:2000 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 웰을 세정 완충액으로 3회 세정하였다. 50 ㎕의 발색성 기질 (즉, OPD 기질)을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 발색시켰다. 100 ㎕ 1N HCl을 각 웰에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 웰의 흡광도를 490 nm에서 판독하였다. 이중 웰로부터의 평균 흡광도를 결정하였고, 이러한 값들이 하기 표 6에 열거된다.
이러한 데이타들은 Fab 3, 5, 및 7이 테스트된 다른 단백질에 결합하는 것보다 우선적으로 마이오스타틴에 결합하는 것을 나타낸다. 이러한 조건 하에 다른 TGF-베타 상과 구성원 중 어느 것에 대해서도 Fab의 결합이 배경 수준 이상으로는 거의 검출되지 않거나 검출되지 않고, 단 Fab 3에 의한 GDF-11에 대한 매우 소량의 결합이 검출되었다. 그러나, R&D 항-마이오스타틴 폴리클로날 항체는 또한 GDF-11에 결합하였다 (하기 표 6 참조).
Figure 112006076007538-PCT00014
Figure 112006076007538-PCT00015
실시예 3 마이오스타틴 중화 분석법
외배엽 외식편을 표준 절차에 의해 단계 8-9 포배 제노푸스 배아로부터 제거하고, 0.5× MBS (1× MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES, 2.5 mM NaHCO3, 1:1000 v/v 젠타마이신, 0.1 ％ 소 혈청 알부민)에서 성장 인자 (GDF8 또는 GDF11) 플러스 또는 지정물을 첨가하여 18 시간 동안 18 ℃에서 배양하였고, 이 시간 동안 대조군 배아는 초기 신경배 단계 (단계 15-16)에 도달한다. 외식편을 사진찍고, 각 외식편의 길이를 동물 캡(cap) 정량을 위해 고안된 이미지 분석 알고리즘을 사용하여 측정하였다. 성장 인자 또는 Fab으로 처리되지 않은 외식편 (대조군)은 표피 구로 성장하였다. 마이오스타틴 및 GDF-11은 이러한 외배엽 외식편에서 외식편이 신장하여 아령형 구조를 형성하도록 하는 중배엽을 유도하였다. 중화 활성에 대해 테스트할 때, 항체 또는 Fab를 전체 길이의 배양 기간 동안 마이오스타틴을 함유하는 배양 배지에 첨가하고, 성장 인자에 의해 유도된 신장 운동을 저해하는 능력을 평가하였다. 마이오스타틴은 외식편에 25 ng/㎖로 첨가하였다. 항체 또는 Fab는 20 ㎍/㎖로 첨가하였다. Fab34는 무관한 항원에 대해 생성된 Fab였다. 시판되는 항-마이오스타틴 폴리클로날 항체를 또한 테스트하였다; 이 항체는 정제된 마우스 GDF8로 면역화된 염소에서 생산되었고, 약 10-50 ㎍/㎖로 존재할 때 25 ng/㎖의 마우스 GDF8에 의해 도출된 제노푸스 동물 캡의 신장을 중화시키는 것으로 제조업자에 의해 증명되었다 (R&D Systems, Inc. 카탈로그# AF788). 시판되는 모노클로날 항-마우스 GDF8 항체를 테스트하였고, 이 항체는 약 10-20 ㎍/㎖로 존재할 때 25 ng/㎖의 마우스 GDF8에 의해 도출된 제노푸스 동물 캡의 신장을 중화시키는 것으로 제조업자에 의해 증명되었다 (R&D Systems, Inc. 카탈로그# MAB788). 본원의 실시예 2의 ELISA 데이타는 이러한 R&D 항체가 본 발명의 Fab와는 상이한 마이오스타틴의 영역에 결합하는 것을 나타낸다는 것을 유념한다.
ImagePro (v4.5.1.22, Media Cybernetics)를 이미지 프로세싱에 사용하였다. 마크로를 기록하여 이미지 프로세싱을 자동화하였다. 마크로는 이미지를 프로세싱하여 길이를 비트의 단위로 기록하였다. 대안적인 측정 방법을 당업계에 공지된 바와 같이 사용할 수 있다. Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 15는 동물 캡 분석법에서 GDF8 활성을 유의하게 중화시킬 수 있었다.
실시예 4: 모노클로날 Fab 의 친화력 측정
본 발명의 항-마이오스타틴 Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15의 친화력 (KD) 및 Kon 및 Koff 속도를 CM5 센서 칩을 함유하는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00016
2000 기구를 사용하여 측정하였다. BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00017
는 표면 플라즈몬 공명의 광학 성질을 이용하여 덱스트란 바이오센서 매트릭스 내의 상호작용 분자의 단백질 농도에서의 변화를 검출한다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 시약 및 재료는 BIAcore
Figure 112006076007538-PCT00018
AB (Upsala, Sweden)에서 구입하였다. 모든 측정은 25 ℃에서 수행하였다. 래트 또는 인간 마이오스타틴을 함유하는 샘플을 HBS-EP 완충액 (150 mM 염화나트륨, 3 mM EDTA, 0.005 ％ (w/v) 계면활성제 P-20, 및 10 mM HEPES, pH 7.4)에 용해시켰다. 포획(capture) 항체인 염소 항-마우스 카파 (Southern Biotechnology, Inc)를 아민-커플링 화학을 사용하여 유동 세포 상에 고정시켰다. 유동 세포 (1-4)를 7 분 동안 0.1 M N-히드록시숙신이미드와 0.1 M 3-(N,N-디메틸아미노)프로필-N-에틸카르보디이미드의 1:1 혼합물로 10 ㎕/분의 유속에서 활성화시켰다. 염소 항-마우스 카파 (1O mM 아세트산나트륨 내의 30 ㎍/㎖, pH 4.5)를 10 ㎕/분의 유속으로 모든 4종의 유동 세포에 수동으로 주사하였다. 표면 밀도를 모니터링하고, 모든 유동 세포가 4500-5000 응답 단위 (RU)의 표면 밀도에 도달할 때까지 필요하다면 추가적인 염소 항-마우스 카파를 개별적인 세포에 주사하였다. 1 M 에탄올아민-HCl, pH 8.5 (10 ㎕/분)을 7 분 동안 주사하여 표면을 차단시켰다. 모든 비공유 결합된 염소 항-마우스 카파의 완전한 제거를 확실히 하기 위해. 15 ㎕의 1O mM 글리신, pH 1.5를 2회 주사하였다. 동력학 실험에서 사용된 러닝(running) 완충액은 1O mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005 ％ P20를 함유하였다.
동력학 결합 데이타의 수집은 최대 유속 (100 ㎕/분) 및 낮은 표면 밀도에서 수행하여, 질량 수송 효과를 최소화시켰다. 각각의 분석 사이클은 (i) 10 ㎕/분의 유속에서 여러 Fab에 대해 유동 세포 2, 3 및 4에 5 ㎍/㎖ 용액 5-10 ㎕를 주사함으로써 300-350 RU의 Fab (BioSite)를 포획함, (ii) 유동 세포 1을 참조 유동 세포로 하여 모든 4종의 유동 세포에 대해 인간 마이오스타틴 (2배 희석 증가분의 50 nM 내지 1.56 nM의 농도 범위)을 200 ㎕ 주사함 (2 분), (iii) 10 분 동안 해리시킴 (완충액 유동), (iv) 10 mM 글리신, pH 1.5를 15 초 동안 주사하여 염소 항-마우스 카파 표면을 재생시킴, (v) 러닝 완충액을 30 초 동안 블랭크(blank) 주사함, 및 (vi) 다음 사이클을 시작하기 전에 2 분 동안 안정화시킴. 유동 세포 2 빼기 유동 세포 1, 유동 세포 3 빼기 유동 세포 1 및 유동 세포 4 빼기 유동 세포 1로 신호를 모니터닝하였다. 샘플 및 완충액 블랭크를 무작위 순서로 이중으로 주사하였다. 데이타를 BIAevaluation 3.1 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하고, 데이타를 CLAMP 글로벌 분석 소프트웨어에서 1:1 결합 모델로 피팅하였다.
Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 및 15는 KD 값이 7×10-6 및 4.0×10-8 사이였다.
실시예 5 근골격 효능의 생체내 마우스 모델
수컷 ICR 마우스 (8주령, Taconic NY)을 인가된 절차에 따라 거세시키고 (생식샘절제, GDX), 10 주 동안 쇠약해지게 하였다. 필적하는 연령의 허위 수술된 마우스 (Sham)를 또한 수득하였다. 허위 수술된 마우스는 고환을 제거하지 않은 것을 제외하고는 거세된 마우스와 동일한 방식으로 수술하였다. 동물들을 온도-제어실 (24 ℃)에서 역전된 12 시간의 빛/어두움 사이클로 사육하고, 물 및 식품은 자유롭게 이용가능하였다.
생체내 효능을 증명하기 위해, 본 발명의 화합물을 거세된 18주령 마우스 (체중 약 48-50 g) 및 필적하는 연령의 허위 마우스에게 피하 주사에 의해 격주로 투여하였다. 테스트 화합물은 포스페이트 완충 염수 (PBS) 내에서 동물에게 투여하였다. 이소타입 일치 IgG1으로만 처리된 거세된 마우스를 처리 음성 대조군으로 사용하였다.
테스트 동물 (각 군 당 12 마리의 마우스)에게 15 주 시간-프레임에 걸쳐, 예를 들어, 60 ㎎/㎏/2주의 본 발명의 화합물을 피하 투약하였다. 각각의 투약 시점에서, 제공된 용량은 각 동물의 체중에 따라 조정하였다. 연구 시작 및 말기에 하기의 치수를 기록하였다: 체중, 정량적 자기 공명 (QMR, Echo Medical Systems, TX) 분석법에 의한 신체 근육 질량, 및 신체 악력 (Columbus Instruments, OH).
15-주 처리 후, 근육 활성의 지표로서, 테스트 군에서의 골격근 (대퇴사두근)의 습중량을 결정하고, 거세되고 IgG로만 처리된 제어군에서의 중량과 비교하였다. 골격 활성의 지표로서, 테스트 동물로부터의 대퇴부골의 골 질량 (골 미네랄 밀도, BMD, ㎎/cc)을 마이크로컴퓨터를 사용한 단층촬영술 (qCT) (Research M, Stratec) 분석법에 의해 거세되고 IgG로만 처리된 군으로부터의 대퇴부골의 골 질량과 유사하게 비교하였다. Fab 3을 포함하는 항-마이오스타틴 항체는 여기에 기술된 조건 하에서 근육 및 골 모두에 대해 동화작용 효과를 보였다.
SEQUENCE LISTING <110> Han, Bomie Kristine , Kikly Kay Smith , Rosamund Carol Tobias, Linda O. <120> Anti-Myostatin Antibodies <130> X-16397 <140> PCT/US2005/009307 <141> 2005-03-17 <150> US60/559,621 <151> 2004-04-05 <150> US60/555,456 <151> 2004-03-24 <160> 56 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser 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Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 5 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 6 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 7 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 9 Gln Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser Gly Ala Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 10 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 11 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Glu Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp 100 105 <210> 12 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 12 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 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Ile Leu Gln Ser Ser Gln Thr 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly 20 25 30 Met Ile Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val Phe 65 70 75 80 Leu Trp Ile Ser Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 15 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 16 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Met Leu Gln Ser Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 124 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 17 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Leu Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Gly Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 18 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 19 Ser Ala Ser Ser Ser Val His Tyr Met His 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 20 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 21 Ser Ala Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 22 Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 23 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 24 Gln Gln Trp Tyr Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 25 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 26 Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 27 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28 Gln Gln Trp Thr Tyr Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 29 Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Met Ser Val Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 30 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser Val Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 31 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser Gly Met Ile Val Ser 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 32 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 33 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 34 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 35 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Asn 1 5 10 15 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 36 Arg Ala Ile Thr Thr Val Ile Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 37 Arg Gly Ile Thr Thr Val Leu Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is Ser, Thr, His, Tyr or Asn <400> 38 Ser Ala Ser Ser Ser Xaa Xaa Tyr Met His 1 5 10 <210> 39 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Asp or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is Phe or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> X is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is Phe or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X is Val or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> X is Leu or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62) <223> X is His or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> X is Gly or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> X is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> X is Ala or Gly <400> 39 Xaa Xaa Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Xaa Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Xaa Cys Glu 35 40 45 Xaa Xaa Phe Xaa Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Xaa Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Xaa Lys Xaa Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Xaa Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 40 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is Lys, Arg, Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is Ser, Thr, Asn or Gln <400> 41 His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Xaa Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is Ala or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is Ile, Leu or Val <400> 42 Arg Xaa Ile Thr Thr Val Xaa Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 43 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Ser Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 20 25 <210> 44 <211> 327 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 44 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtataagt tacatgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg tatagtaacc cactcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaacg ggctgat 327 <210> 45 <211> 372 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 45 caggttacgc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagt cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctc tctctgggtt ttcactgaga acgtctggta tgagtgtgag ctggattcgt 120 cagtcttcag gaaagggtct ggagtggctg gcacacattt attgggatga tgacaagcgc 180 tataacccat ccctgaggaa ccgactcaca atctccaagg ataccttgag aaaccaggtc 240 ttcctcaaga tcaccagtgt gggcactgca gatactgcca catactactg tgctcgaaga 300 gctattacta cggtaatagg gggagggact atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 46 <211> 25 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 46 Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr 1 5 10 15 Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 20 25 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 47 Gly Phe Ser Leu Arg Thr Ser Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 48 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Ser Gly Met Ser Val Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 49 Gly Phe Ser Leu Arg Thr Val Gly Met Ser Val Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 50 Gly Phe Ser Leu Arg Thr Leu Gly Met Ser Val Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 51 Gly Phe Ser Leu Arg Thr Leu Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 52 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Val Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 53 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 54 Gly Phe Ser Leu Arg Lys Ser Gly Ser Ser Val Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is Arg, Lys, Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is Thr or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is Ser, Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is Met or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is Ser, Thr, Ile, Leu or Val <400> 55 Gly Phe Ser Leu Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Val Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is Tyr, Ser, Asn or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is Arg, Lys, Tyr, Ser or Thr <400> 56 Gln Gln Trp Xaa Xaa Asn Pro Leu Thr 1 5

Claims (17)

  1. (i) 서열 3 및 12;
    (ii) 서열 4 및 13;
    (iii) 서열 3 및 14;
    (iv) 서열 5 및 12;
    (v) 서열 6 및 15;
    (vi) 서열 7 및 17;
    (vii) 서열 8 및 12;
    (viii) 서열 9 및 16;
    (ix) 서열 10 및 12; 및
    (x) 서열 11 및 12
    로 구성된 군에 제시된 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드를 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체.
  2. (i) 서열 38에 제시된 서열을 갖는 CDR1에서의 펩티드, (ii) 서열 23에 제시된 서열을 갖는 CDR2에서의 펩티드, 및 (iii) 서열 56에 제시된 서열을 갖는 CDR3에서의 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하는 LCVR을 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체.
  3. (i) 서열 55에 제시된 서열을 갖는 CDR1에서의 펩티드, (ii) 서열 41에 제시된 서열을 갖는 CDR2에서의 펩티드, 및 (iii) 서열 42에 제시된 서열을 갖는 CDR3에서의 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하는 HCVR을 포함하는 항-마이오스타틴 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, (i) 서열 38에 제시된 서열을 갖는 CDR1에서의 펩티드, (ii) 서열 23에 제시된 서열을 갖는 CDR2에서의 펩티드, 및 (iii) 서열 56에 제시된 서열을 갖는 CDR3에서의 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하는 LCVR을 추가로 포함하는 모노클로날 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, LCVR이 (i) 서열 18, 19, 20, 21 또는 22에 제시된 서열을 갖는 LCVR CDR1에서의 펩티드, (ii) 서열 23에 제시된 서열을 갖는 LCVR CDR2에서의 펩티드, 및 (iii) 서열 24, 25, 26, 27 또는 28에 제시된 서열을 갖는 LCVR CDR3에서의 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하는 모노클로날 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HCVR이 (i) 서열 29, 30, 31, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54에 제시된 서열을 갖는 HCVR CDR1에서의 펩티드, (ii) 서열 32, 33, 34, 또는 35에 제시된 서열을 갖는 HCVR CDR2에서의 펩티드, 및 (iii) 서열 36 또는 37에 제시된 서열을 갖는 HCVR CDR3에서의 펩티드로 구 성된 군으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 펩티드를 포함하는 모노클로날 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 전장 항체, 실질적인 무손상 항체, 키메라 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편 또는 단일쇄 Fv 단편인 모노클로날 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 인간화 항체인 모노클로날 항체.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 내에 존재하는 불변 영역이 가축 동물, 운동 동물 및 식품-공급원 동물로 구성된 군으로부터 선택된 동물의 게놈으로부터 유래되는 모노클로날 항체.
  10. (i) a) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 면역원성 펩티드,
    b) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 면역원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드,
    c) 임의 포유동물의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64로 구성된 면역원성 펩티드,
    d) 임의 포유동물의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 면역원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 주사함으로써 비인간 동물을 면역화시키는 단계,
    (ii) 면역화된 동물로부터 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 생성시키는 단계, 및
    (iii) 성숙 마이오스타틴, 또는 면역원성 펩티드를 포함하는 이의 일부, 또는 면역원성 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 생성된 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 스크리닝하는 단계
    에 의한 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 제조 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 제조된 모노클로날 항체.
  12. (i) a) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 면역원성 펩티드,
    b) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드,
    c) 임의 포유동물의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64를 포함하는 면역원성 펩티드,
    d) 임의 포유동물의 성숙 마이오스타틴의 아미노산 40-64로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 주사함으로써 비인간 동물을 면역화시키는 단계:
    (ii) 면역화된 동물로부터 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 생성시키는 단계, 및
    (iii) a) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드로 구성된 항원성 펩티드,
    b) 서열 46 또는 43에 제시된 서열을 갖는 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 항원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드,
    c) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노 산으로 구성된 항원성 펩티드,
    d) 임의 포유동물의 성숙형 마이오스타틴의 위치 40-64에서의 아미노산으로 구성된 펩티드의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개의 인접 아미노산으로 구성된 항원성 펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 등가 위치에서의 GDF-11의 아미노산과 상이한 펩티드
    로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체에 대해 생성된 항-마이오스타틴 모노클로날 항체를 스크리닝하는 단계
    에 의한 항-마이오스타틴 모노클로날 항체의 제조 방법.
  13. 제12항의 방법에 의해 제조된 모노클로날 항체.
  14. 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 근육 질량을 증가시키는 방법.
  17. 제14항 또는 제15항의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 필요로 하는 대상에게 투여함으로써 허약, 악액질, 근육 소모, 근육 허약, 근육병증, 근육 퇴행위축, 골다공증, COPD, 신부전 또는 신장 질환, 간부전 또는 간 질환, 심부전, 제II형 당뇨병 또는 대사 증후군을 치료 또는 예방하는 방법.
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KR1020067021903A KR20060133049A (ko) 2004-03-23 2005-03-17 항-마이오스타틴 항체

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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003301195B2 (en) 2002-12-20 2010-01-07 Amgen Inc. Binding agents which inhibit myostatin
KR20080011403A (ko) * 2005-04-25 2008-02-04 화이자 인크. 미오스타틴에 대한 항체
EA015589B1 (ru) 2005-10-06 2011-10-31 Эли Лилли Энд Компани Антитела против миостатина и их применение
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
AU2006321906C1 (en) * 2005-12-06 2014-01-16 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP2066695B1 (en) * 2006-09-05 2013-03-27 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
PL2170396T3 (pl) 2007-08-03 2017-07-31 Summit (Oxford) Limited Kombinacje leków do leczenia dystrofii mięśniowej Duchenne'a
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
MX369784B (es) 2007-09-26 2019-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos mediante la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
PE20091163A1 (es) * 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CN107551270A (zh) 2008-04-11 2018-01-09 中外制药株式会社 与多个分子的抗原反复结合的抗原结合分子
WO2010002862A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
HUP0800448A2 (en) * 2008-07-21 2011-02-28 Pecsi Tudomanyegyetem Diagnosis of systemic diseases
AR074777A1 (es) 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
FR2943249B1 (fr) * 2009-03-18 2011-08-12 Genethon Utilisation de la decorine pour augmenter la masse musculaire
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
TW201210612A (en) 2010-06-03 2012-03-16 Glaxo Group Ltd Humanised antigen binding proteins
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
RS56796B1 (sr) 2011-11-14 2018-04-30 Regeneron Pharma Kompozicije i postupci za uvećanje mišićne mase i jačine mišića specifičnim antagonizovanjem gdf8 i/ili aktivina a
FR2982860B1 (fr) 2011-11-18 2015-07-10 Ass Fr Contre Les Myopathies Utilisation de la fibromoduline et du lumican pour augmenter la masse musculaire
ES2698606T3 (es) * 2012-01-20 2019-02-05 Genzyme Corp Anticuerpos anti-CXCR3
NZ702269A (en) * 2012-06-15 2017-07-28 Pfizer Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
EP3711771A1 (en) 2012-08-01 2020-09-23 Ikaika Therapeutics, LLC Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (ltbp4)
KR20210084688A (ko) 2012-08-24 2021-07-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ영역 개변체
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
KR20220107082A (ko) 2012-09-13 2022-08-01 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
EP2983694B1 (en) 2013-04-08 2022-06-22 President and Fellows of Harvard College Compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
JP2016521283A (ja) * 2013-05-06 2016-07-21 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 成長因子モジュレーションのための組成物および方法
WO2014201143A1 (en) * 2013-06-11 2014-12-18 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for increasing neurogenesis and angiogenesis
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
MX2016012124A (es) * 2014-03-19 2017-04-06 Mackay Medical Found The Presbyterian Church In Taiwan Mackay Memorial Hospital Anticuerpos contra glicopeptidos inmunogenicos, composicion que los comprende y usos de estos.
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CN107771081A (zh) 2015-04-15 2018-03-06 瑞泽恩制药公司 用gdf8抑制剂增加力量和功能的方法
JP7141336B2 (ja) * 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
EP3949979A1 (en) 2016-01-06 2022-02-09 President and Fellows of Harvard College Treatment with gdf11 prevents weight gain, improves glucose tolerance and reduces hepatosteatosis
AU2017206069A1 (en) 2016-01-08 2018-07-19 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent myostatin antibodies and methods of use thereof
KR102306744B1 (ko) 2016-06-17 2021-09-28 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체 및 사용 방법
SG11201801024XA (en) 2016-08-05 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Therapeutic or preventive compositions for il-8-related diseases
PL3565592T3 (pl) * 2017-01-06 2023-08-21 Scholar Rock, Inc. Leczenie chorób metabolicznych poprzez inhibicję aktywacji miostatyny
CA3092334A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for altering body composition
CN113195532A (zh) 2018-12-18 2021-07-30 瑞泽恩制药公司 使用针对瘦素受体、gdf8和活化素a的拮抗剂增加体重和瘦肌肉质量的组合物和方法
AU2019406214A1 (en) 2018-12-21 2021-08-05 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
US20220062299A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
US20240199728A1 (en) 2022-09-21 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US20030074680A1 (en) * 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US5994618A (en) * 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
EP0690873B1 (en) * 1993-03-19 2003-06-11 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
JP3946256B2 (ja) * 1995-09-11 2007-07-18 協和醗酵工業株式会社 ヒトインターロイキン５受容体α鎖に対する抗体
US6103466A (en) * 1997-07-14 2000-08-15 University Of Liege Double-muscling in mammals
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
GB2333706A (en) * 1998-02-02 1999-08-04 Merck & Co Inc Method for increasing muscle mass in animals
AU765214B2 (en) * 1998-05-06 2003-09-11 Metamorphix International, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
US6537781B1 (en) * 1999-08-10 2003-03-25 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions concerning canine interleukin 5
US7320789B2 (en) * 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof

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Publication number Publication date
MXPA06010929A (es) 2007-01-16
JP4695133B2 (ja) 2011-06-08
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