EA014112B1

EA014112B1 - Моноклональное антитело к миостатину и способы его применения

Info

Publication number: EA014112B1
Application number: EA200601752A
Authority: EA
Inventors: Росамунд Кэрол Смит; Кристин Кей Кикли; Линда О. Тобиас; Боми Хан
Original assignee: Эли Лилли Энд Компани
Priority date: 2004-03-23
Filing date: 2005-03-17
Publication date: 2010-10-29
Also published as: JP2007530551A; EP1733041B1; EP1733041A4; IL177956A0; EA200601752A1; MXPA06010929A; WO2005094446A3; JP4695133B2; KR20060133049A; EP1733041A2; CA2558805C; IL177956A; US20070178095A1; ATE557042T1; NO20064788L; WO2005094446A2; BRPI0508716A; AU2005227896B2; AU2005227896A1; ES2384176T3

Abstract

Заявлены варианты моноклонального антитела к миостатину (GDF-8), которые специфично связываются или распознают аминокислотную последовательность из зрелой формы миостатина. Антитела могут быть химерными или гуманизированными либо их фрагментами. Также предложена фармацевтическая композиция на основе указанных антител. Антитела по изобретению полезны для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или для лечения различных расстройств у млекопитающих.

Description

Данное изобретение относится к области медицины, конкретно - к области моноклональных антител против миостатина. Более конкретно, изобретение относится к нейтрализующим антимиостатиновым моноклональным антителам, которые связываются с новым эпитопом, идентифицированным на зрелой форме миостатина. Антитела по изобретению могут быть мышиными, химерными или гуманизированными антителами, иммуноконъюгатами антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Антитела по изобретению полезны для млекопитающих для увеличения мышечной массы, увеличения плотности костей или для лечения состояний, при которых присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию, или состояний, при которых снижение уровней миостатина способствует желательному терапевтическому действию.

Уровень техники

Члены суперсемейства белков трансформирующего фактора роста бета (ΤΟΕ-β) участвуют в развитии эмбриона и гомеостазе взрослой ткани. Члены суперсемейства ΤΟΕ-β разделяют общую структуру, которая включает короткую пептидную сигнальную последовательность, необходимую для секреции белка, и аминоконцевой фрагмент, который протеолитически отщепляется приблизительно через 105-140 аминокислот от карбоксильного конца большого белка-прекурсора (пробелок) с образованием зрелого белка. Зрелый белок характеризуется в значительной мере сохранением остатков цистеина, тогда как активная форма белка представляет собой связанный дисульфидными связями димер зрелого белка (Отау, А., апб МаЫоп, А., 8с1епсе, 247:1328, 1990). Обнаружено, что гетеродимеры членов суперсемейства ΤΟΕ-β также, по-видимому, обладают биологическими свойствами, отличными от гомодимеров.

Миостатин, который также называют фактором-8 дифференциации роста (ΟΌΕ-8), является членом суперсемейства ΤΟΕ-β белков. Миостатин экспрессируется главным образом в развивающих и взрослых скелетных мышцах и действует как отрицательный регулятор скелетной мышцы. Структура миостатина является в высокой степени константной у разных видов; аминокислотная последовательность зрелой формы миостатина у человека, мыши, крысы и коровы является идентичной на 100%. Иммуногенный эпитоп, идентифицированный в данном изобретении, является на 100% идентичным у человека, мыши, крысы, цыпленка, собаки, лошади, козы, овцы, коровы и свиньи. Фактор-11 дифференциации роста, который также называют ΟΌΕ-11 или ВМР-11, является членом суперсемейства ΤΟΕ-β белков, которые являются наиболее гомологичными в отношении миостатина. Человеческий миостатин и ΟΌΕ-11 являются на 90% идентичными на уровне аминокислот в рамках зрелой цепи.

Патент США № 5827833 раскрывает последовательность полинуклеотида и последовательность аминокислот человеческого миостатина, тогда как патент США № 6096506 заявляет антитело, которое специфически реагирует с полипептидом ΟΌΕ-8 или его эпитопом. Патентная заявка США 2003/0138422 заявляет антитело, которое специфически связывается с белком ΟΌΕ-8, включающим конкретный пептид. Патент США № 6468535 заявляет способ увеличения мышечной массы у животного путем введения антитела анти-Ο^Ε-8. Патент США № 6368597 раскрывает применение антитела против ΟΌΕ-8 для лечения диабета.

В настоящее время существует ограниченное количество эффективных средств для лечения расстройств или состояний, которые могут выигрывать от увеличения мышечной массы и/или силы мышц, в том числе мышечная дистрофия, дряхлость, реанимационная миопатия и кахексия в результате рака или другие расстройства, которые включают, не ограничиваясь ими, ВИЧ-инфекцию, неотложные состояния и миопатии. Вследствие роли миостатина как отрицательного регулятора роста скелетных мышц он является желательной мишенью для терапевтического вмешательства при таких расстройствах. Существует большая терапевтическая потребность в средствах для специфического ингибирования активности миостатина при отсутствии ингибирования или минимальном ингибировании активности других белков суперсемейства ΤΟΕ-β. Существует также терапевтическая потребность в специфическом снижении уровня миостатина у пациента при отсутствии одновременного снижения уровня других белков суперсемейства ΤΟΕ-β. Конкретно, моноклональное антитело, специфически реагирующее с миостатином (например, специфически связывающее или распознающее миостатин или его часть) и значительно в меньшей степени реагирующее или не реагирующее с другими членами суперсемейства белков ΤΟΕ-β (например, ΟΌΕ-11), может обеспечить особенно полезную терапию для увеличения мышечной массы и/или силы мышцы. Особенную терапевтическую ценность имеют химерные или гуманизированные формы такого моноклонального антитела. Структура и функция миостатина являются в высокой степени константными в различных видах; следовательно, такое антитело может быть полезным не только для лечения таких расстройств у человека, но также у других млекопитающих, включая, например, домашних животных (например, собака и кошка), спортивных животных (например, лошадь) и сельскохозяйственных животных (например, бык, свинья, птица и овца), особенно если каркасные и константные участки антитела в значительной мере происходят из видов животных, у которых антитело будет применяться в лечебных целях. Антимиостатиновые антитела по изобретению также могут быть полезны для лечения расстройств или состояний, когда пациенты получают пользу от снижения уровня миостатина, включая, не ограничиваясь ими, такие, где пациенты получают пользу от увеличения плотности костей (например,

- 1 014112 остеопороз), диабет II типа, метаболический синдром, остеоартрит, сепсис, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) и расстройства, связанные с мышечным истощением, такие как заболевание почек, сердечная недостаточность или заболевание сердца и заболевание печени.

Антимиостатиновые антитела по данному изобретению часто обладают преимуществами по сравнению с другими антимиостатиновыми антителами из уровня техники. Изобретение представляет нейтрализующие антимиостатиновые моноклональные антитела, способные связываться с полипептидом, состоящим из аминокислот с остатками 40-64 (например, 8ЕО Ш N0: 46 для человеческого миостатина) зрелой формы миостатина, и нейтрализовать активность миостатина ίη νίίτο, ίη νίνο или ίη δίΐιι. Поскольку члены семейства ТСЕ-β обладают высокой степенью гомологии (например, миостатин приблизительно на 90% гомологичен с СЭЕ-11), антиомиостатиновые антитела, такие как раскрытые в настоящем изобретении, которые перекрестно не реагируют или минимально реагируют перекрестно с СЭЕ-11, играющем важную роль в формировании скелета (МсРйеггоп, А., е1 а1., №1Шгс Сепейек, 22:260-265, 1999), являются предпочтительными для терапевтического применения при сравнении с антителами, которые перекрестно реагируют с СЭЕ-11 в более высокой степени.

Краткое описание изобретения

Антимиостатиновые моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются или распознают полипептид, состоящий из аминокислот 40-64 зрелой формы миостатина из млекопитающего животного-источника, предпочтительно человека, ΑΝΥί.’ί^Εί.ΈΕνΕΕΟΙ<ΥΡΗΤΗΕνΗΟΑ (8Е0 Ш N0: 46) или полипептида, состоящего из последовательности ΑΝΥΕ’ί^ΕδΕΕνΕΕΟΚΥΡΗΤΗΕνΗΟΑ (8Е0 Ш N0: 43), описаны в данном изобретении. Такие антитела в данном описании называются моноклональными антителами по изобретению или антителами по изобретению. Моноклональные антитела по изобретению могут быть мышиными, химерными или гуманизированными антителами, иммуноконъюгатами таких антител или их антигенсвязывающими фрагментами. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению существует в виде гомогенной или в значительной мере гомогенной популяции. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению связывает миостатин (пробелок зрелой формы или белок, мономерный или димерный) в домене, охватывающем аминокислоты/АNΥС8СΕСΕЕVЕ^^ΚΥРΗΤΗ^VΗ^А (8Е0 Ш N0: 46), и, таким образом, осуществляет антагонизм или нейтрализует ίη νίίτο, ίη νίνο или ίη δίΐιι по крайней мере один вид биологической активности или свойство миостатина.

Моноклональные антитела по изобретению преимущественно связываются или распознают миостатин в сравнении с СЭЕ-11, членом суперсемейства ТСЕ-β, зрелая форма которого обладает приблизительно 90% гомологичностью аминокислот со зрелой формой миостатина. Предпочтительно указанные антитела связываются с миостатином с большим сродством или специфичностью, чем они связываются с СЭЕ-11, что определяется, например, с помощью пробы ЕЫ8А, конкурентной пробы ЕЫ8А или значений К пробы ΒΙΑοοκ® (например, см. пример 4).

Кроме того, моноклональные антитела по изобретению могут иметь более благоприятные значения Κ_οη, Κ_ο££ или К_а для миостатина в сравнении со связыванием СЭЕ-11. Предпочтительно антитело по изобретению не реагирует перекрестно с СЭЕ-11 или перекрестно реагирует с СЭЕ-11 на уровне 5, 4, 3, 2, 1% или меньше.

В одном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает вариабельный участок легкой цепи (ЬСУК.) полипептида с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из 8Е0 Ш N0: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11. В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепи (НСУК.) полипептида с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из 8ЕС 1Э N0: 12, 13, 14, 15, 16 и 17.

В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает полипептид НСУК. с 8Е0 1Э N0: 12 с заменой аминокислот 26-37 на 8Е0 Ш N0: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54. Последовательности, связанные с каждым номером 8Е0 Ш, показаны в табл. 1 и 2 и на фиг. 4 и 5 в данном описании.

В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает (а) полипептид ЬСУК. с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из 8Е0 Ш N0: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11; и (Ь) полипептид НСУК. с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из 8Е0 1Э N0: 12, 13, 14, 15, 16 и 17, или полипептид НСУК. с 8Е0 Ш N0: 12 с заменой аминокислот 26-37 на 8Е0 Ш N0: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54. Рассматривается антитело по изобретению, которое включает любую комбинацию описанных выше ЬСУК. и НСУК. полипептидов, но антитела, которые включают следующие комбинации ЬСУК. и НСУК, являются предпочтительными:

(1) 8 ЕС) Ш N0: 3 и 12;

(ίί) 8ЕС) Ш N0: 4 и 13;

(ίίί) 8ЕС) Ш N0: 3 и 14;

(ίν) 8ЕС) Ш N0: 5 и 12;

- 2 014112 (ν) 8ΕΟ ΙΌ N0: 6 и 15;

(νί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 7 и 17;

(νίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 8 и 12;

(νίίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 9 и 16;

(ίχ) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 10 и 12;

(χ) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 11 и 12;

(χί) 8Ε0 ΙΌ N0: 3 и 8Ε0 ΙΌ N0: 12 с заменой аминокислот 26-37 на 8Ε0 ΙΌ N0: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54.

В другом воплощении моноклональное антитело по изобретению является таким, которое может конкурировать за связывание с человеческим миостатином или частью человеческого миостатина с конкурирующим антителом, которое включает два полипептида с последовательностями, показанными в группе, состоящей из (ί) 8ΕΟ ΙΌ N0: 3 и 12;

(ίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 4 и 13;

(ίίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 3 и 14;

(ίν) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 5 и 12;

(ν) 8ΕΟ ΙΌ N0: 6 и 15;

(νί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 7 и 17;

(νίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 8 и 12;

(νίίί) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 9 и 16;

(ίχ) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 10 и 12;

(χ) 8ΕΕ) ΙΌ N0: 11 и 12;

В другом воплощении ЬСУК антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 38, 23 и 56 (см. табл. 1). Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 38, если присутствует в указанном антителе, находится в ЬСУК СПЕР Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 23, если присутствует в указанном антителе, находится в ЬСУК СОК2. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 56, если присутствует в указанном антителе, находится в ЬСУК СОК3.

В другом воплощении НСУК антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 55, 41 и 42 (см. табл. 2). Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 55, если присутствует в указанном антителе, находится в НСУК СОК1. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 41, если присутствует в указанном антителе, находится в НСУК СОК2. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в 8Ε0 ΙΌ N0: 42, если присутствует в указанном антителе, находится в НСУК СОК3.

В гуманизированном антителе для терапевтического применения у людей каркасная последовательность может быть в значительной мере человеческого происхождения. В антителе каркасная последовательность может в значительной мере происходить из генома животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение.

Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может дополнительно включать константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из Ι§Οι, Ι§0₂, Ι§0₃, Ι§0₄, ΙβΑ. Ι§Ε, Ι§Μ и Ι§Ό. Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может дополнительно включать константный участок каппа или лямбда легкой цепи. Если антитело представляет собой такое, которое планируется применять как лечебное для человека, предпочтительно константный участок в значительной мере имеет человеческое происхождение. Если антитело представляет собой такое, которое планируется использовать в качестве терапевтического для животного, кроме человека, константный участок предпочтительно в значительной мере происходит из животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела.

Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может включать или состоять из интактного антитела (т.е. с полной длиной), в значительной мере интактного антитела, фрагмента РаЬ, фрагмента Р(аЬ')₂ или одноцепочечного фрагмента Ρν.

В предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой химерное антитело. В более предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело, где последовательность каркасной области и последовательность константного участка, присутствующие в антителе, в значительной мере имеют человеческое происхождение. Гуманизированное антитело предпочтительно представляет собой антитело полной длины. Альтернативно, каркасная область или ее часть и любой константный участок, присутствующие в антителе, могут в значительной мере происходить из генома животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела, например домашние

- 3 014112 животные (например, собака, кошка), спортивные животные (например, лошадь) и сельскохозяйственные животные (например, бык, свинья, птица и овца).

В другом воплощении изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую ЬСУК антитела по изобретению, НСУК антитела по изобретению или антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Примерный полинуклеотид, кодирующий ЬСУК по изобретению, имеет последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ N0: 44. Примерный полинуклеотид, кодирующий НСУК по изобретению, имеет последовательность, показанную в 8Е0 ΙΌ N0: 45.

В другом воплощении изобретение обеспечивает вектор, предпочтительно (не ограничиваясь ими) плазмиду, рекомбинатный вектор экспрессии, дрожжевой вектор экспрессии или ретровирусный вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, который кодирует антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Альтернативно, вектор по изобретению включает полинуклеотид, кодирующий ЬСУК, и/или полинуклеотид, кодирующий НСУК по изобретению. Когда обе последовательности, кодирующие ЬСУК и НСУК, присутствуют в одном и том же векторе, они могут быть транскрибированы от одного промотора, с которым они функционально связаны, или они могут быть транскрибированы независимо, каждая от отдельного промотора, с которым она функционально связана. Если последовательности, кодирующие ЬСУК и НСУК, присутствуют в одном векторе и транскрибированы от одного промотора, с которым они функционально связаны, ЬСУК может находиться в положении 5' по отношению НСУК или ЬСУК может находиться в положении 3' по отношению НСУК, кроме того, участок, кодирующий ЬСУК и НСУК в векторе, может быть отделен последовательностью линкера любого размера или содержания; предпочтительно такой линкер, если он присутствует, представляет собой полинуклеотид, кодирующий внутренний сайт входа в рибосому.

В другом воплощении изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Предпочтительно клетка-хозяин по изобретению включает один или больше векторов или конструктов, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку, в которую введен вектор по изобретению (например, путем трансформации, трансдукции, инфицирования), причем указанный вектор включает полинуклеотид, кодирующий ЬСУК антитела по изобретению, и/или полинуклеотид, кодирующий НСУК по изобретению. Изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, в которую введены два вектора по изобретению; один включает полинуклеотид, кодирующий ЬСУК антитела по изобретению, и один включает полинуклеотид, кодирующий НСУК, присутствующий в антителе по изобретению, и каждый из них функционально связан с последовательностью промотора. Типы клеток-хозяева включают клетки млекопитающих, бактерий, растений и дрожжей.

Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клетку С08, клетку 8Р2/0, клетку N80, дрожжевую клетку или производное или потомство любого предпочтительного вида клеток.

В другом воплощении изобретение обеспечивает способ приготовления антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению, включающий поддержание клетки-хозяина по изобретению (т.е. клетка-хозяин трансформирована, трансдуцирована или инфицирована вектором (или векторами) по изобретению) в условиях, подходящих для экспрессии моноклонального антитела по изобретению, посредством чего такое антитело экспрессируется. Способ может дополнительно включать стадию выделения моноклонального антитела по изобретению из клетки или предпочтительно из среды культивирования, где выращена указанная клетка.

Изобретение воплощает процесс производства антитела по изобретению путем инъекционного введения животному, кроме человека, предпочтительно грызуну, более предпочтительно мыши (1) иммуногенного пептида, состоящего из пептида с последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 46 или 43; или (ίί) иммуногенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида с последовательностью, показанной в 8Е0 ΙΌ N0: 46 или 43, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении 0ΌΕ-11 (см. фиг. 3); или (ш) иммуногенного пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (ίν) иммуногенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении 0ΌΕ-11 в том же млекопитающем. Антимиостатиновые моноклональные антитела производятся иммунизированными животными с применением любого способа, известного из уровня техники, предпочтительно путем синтеза гибридомы. Антимиостатиновые моноклональные антитела подвергают скринингу любым методом, доступным из уровня техники (например, фаговый дисплей, рибосомальный дисплей, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, проба ЕЫ8А), на предмет связывания со зрелым миоста

- 4 014112 тином или его частью, включающей иммуногенный пептид, или с иммуногенным пептидом.

Антимиостатиновые поликлональные антитела необязательно подвергают скринингу любым методом, доступным из уровня техники для связывания со зрелым СЭЕ-11 или его частью. Отобраны антимиостатиновые моноклональные антитела, которые специфично или преимущественно связываются с миостатином по сравнению с СЭЕ-11. Изобретение далее воплощает моноклональное антитело, приготовленное с помощью такого процесса. Предпочтительно указанное моноклональное антитело связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с СЭЕ-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз больше, чем оно связывается с СЭЕ-11, что определяют по методу, известному специалисту в данной области из уровня техники, например, с помощью пробы ЕЬ18А, конкурентной пробы ЕЫ8А или значений К_с в пробе В1Асоге®. Наиболее предпочтительно моноклональные антитела не связываются с СЭЕ-11 выше фоновых уровней в любой пробе связывания, доступной из уровня техники.

Изобретение также воплощает способ получения антитела по изобретению путем инъекционного введения животному, кроме человека, предпочтительно грызуну, более предпочтительно мыши (1) иммуногенного пептида, включающего последовательность, показанную в 8ЕО 1Э N0: 46 или 43; или (и) иммуногенного пептида, включающего 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в 8ЕО 1Э N0: 46 или 43, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении СЭЕ-11 (см. фиг. 3); или (ίίί) иммуногенного пептида, включающего аминокислоты в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (ίν) иммуногенного пептида, включающего 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении СЭЕ-11 в том же млекопитающем.

Антимиостатиновые моноклональные антитела производятся с использованием иммунизированных животных с применением любого способа, известного из уровня техники, предпочтительно путем синтеза гибридомы. Антимиостатиновые моноклональные антитела подвергают скринингу любым способом, доступным из уровня техники (например, фаговый дисплей, рибосомальный дисплей, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, проба ЕЬ18А) для связывания с (1) антигенным пептидом, состоящим из последовательности, показанной в 8ЕО 1Э N0: 46 или 43; или (и) антигенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в 8ЕО 1Э N0: 46 или 43, предпочтительно указанный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении СЭЕ-11 (см. фиг. 3); или (ίίί) антигенного пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (ίν) антигенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении СЭЕ-11 в том же млекопитающем. Антимиостатиновые поликлональные антитела необязательно подвергают скринингу любым способом, доступным из уровня техники, на предмет связывания со зрелым СЭЕ-11 или его частью. Отбирают антимиостатиновые моноклональные антитела, которые специфично или преимущественно связываются с миостатином по сравнению с СЭЕ-11. Изобретение далее воплощает моноклональное антитело, приготовленное с помощью такого процесса. Предпочтительно указанное моноклональное антитело связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с СЭЕ-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз больше, чем оно связывается с СЭЕ-11, что определяют по методу, известному специалисту в данной области из уровня техники, например, с помощью пробы ЕЬ18А, конкурентной пробы ЕЫ8А или значений К_с в пробе В1Асоге®. Наиболее предпочтительно моноклональные антитела не связываются с СЭЕ-11 выше фоновых уровней в любой пробе связывания, доступной из уровня техники.

Считается, что указанное антитело, изготовленное с помощью любого процесса по изобретению, может быть далее изменено в химерное антитело, где по меньшей мере часть каркаса и/или константного участка происходит из млекопитающего, отличного от того, которое иммунизировали для создания моноклонального антитела и которое все еще охватывают рамками изобретения. Антитела по изобретению

- 5 014112 могут быть гуманизированы, т.е. мышиные участки СЭЯ существуют внутри в значительной мере человеческого каркасного участка и константный участок, до той степени, в которой он присутствует в антителе, также в значительной мере имеет человеческое происхождение. Антитела по изобретению могут быть такими, что мышиные участки СОЯ существуют внутри каркасной области и константный участок (до той степени, в которой он присутствует в антителе) происходит из последовательности зародышевой линии животного, где антитело представляет собой такое, которое используется терапевтически.

В данном описании рассматриваются различные формы антител по изобретению. Например, антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может быть антителом с полной длиной (например, содержащим константный участок иммуноглобулина) или фрагментом антитела (например, Р(аЬ')г). Понятно, что все такие формы антител охватываются в данном описании в рамках термина антитело. Кроме того, антитело может быть помечено меткой, которая поддается обнаружению, иммобилизировано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (например, фермент или токсин) в соответствии со способами, известными из уровня техники.

Рассматривается диагностическое применение моноклональных антител по изобретению. В одном виде диагностического применения изобретение обеспечивает способ определения присутствия белка миостатина, который включает контакт исследуемого образца, где предполагается наличие белка миостатина, с антимиостатиновым антителом по изобретению и определение специфического связывания антитела с образцом. Антимиостатиновое антитело по изобретению может использоваться для определения уровней миостатина в исследуемых образцах путем сравнения значений исследуемого образца со стандартной кривой, полученной связыванием указанного антитела с образцами, содержащими известные количества миостатина. Изобретение далее обеспечивает набор, включающий антитело по изобретению, и предпочтительно инструкции по применению антитела для обнаружения белка миостатина, например, в исследуемом образце.

В другом воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая включает антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой активный ингредиент. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает гомогенную или в значительной степени гетерогенную популяцию антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению. Композиция для терапевтического применения является стерильной и может быть лиофилизирована.

Изобретение обеспечивает способ ингибирования активности миостатина у млекопитающего, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, который включает введение терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению указанному млекопитающему. Изобретение далее обеспечивает способ лечения или профилактики заболевания или уменьшения расстройства путем ингибирования преобразования сигнала в результате связывания миостатина с его рецептором, который включает введение пациенту (например, человек), нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению.

В данном описании лечение или профилактика относится к расстройству или заболеванию, связанному с аномальными уровнями миостатина, или такому, при котором пациент получает пользу от ингибирования активности миостатина, или такому, при котором пациент получает пользу от изменения существующего уровня миостатина. Заболевания или расстройства, которые лечат или предупреждают антителом по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дряхлость, кахексию, возрастную саркопению, мышечное истощение, миопатию, мышечную дистрофию, остеопороз, ожирение, ХОЗЛ, почечную недостаточность или заболевание почек, печеночную недостаточность или заболевание печени, сердечную недостаточность или заболевание сердца, метаболический синдром и диабет II типа. Изобретение далее обеспечивает способ увеличения мышечной массы, повышения мышечной силы и повышение плотности костей у млекопитающего, предпочтительно человека, которое нуждается в этом, путем введения терапевтически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению.

Изобретение воплощает антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению для применения при получении лекарственного средства для введения млекопитающему, предпочтительно человеку, для лечения, например, дряхлости, кахексии, возрастной саркопении, мышечного истощения, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ожирения, ХОЗЛ, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности или заболевания сердца, метаболического синдрома и диабета II типа у млекопитающего, предпочтительно человека, которое нуждается в этом, путем введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению.

- 6 014112

Изобретение воплощает промышленное изделие, включающее упаковочный материал и антитело по изобретению, которое содержится в указанном упаковочном материале, и где упаковочный материал включает листок-вкладыш, в котором указано, что антитело специфично нейтрализует активность миостатина или снижает уровень миостатина. В листке-вкладыше, который вкладывают в упаковку, необязательно дополнительно указано, что антитело преимущественно нейтрализует активность миостатина в сравнении с активностью ΟΌΡ-11 или преимущественно снижает уровень миостатина в сравнении со снижением уровня ΟΌΡ-11 путем преимущественного связывания с миостатином в сравнении со связыванием с ΟΌΡ-11.

Таблица 1

Последовательности вариабельного участка ΟΌΚ легкой цепи (ЬСУК)

ЕАЬ	сши	С1Ш2	СПКЗ
3	8Α888Ι8ΥΜΗ (8Ε9ΙΟΝΟ: 18)	ОТ8КЬА8 (8Ε(2 ГО ΝΟ: 23)	ΟΟν/ΥδΝΡΕΓ (8Ε0 ГО ΝΟ: 24)
5	8А888УНУМН (8Е(2 ΓΟΝΟ: 19)	ϋΤδΚΣΑδ (8Ε(^ ГО ΝΟ: 23)	ΟΟΑνδδΝΡΕΤ (8Ε() ГО ΝΟ: 25)
7	8Α888Ι8ΥΜΗ (δΕΟΙϋΝΟ: 18)	ОТ8КЬА8 (8Ε(} ГО ΝΟ: 23)	Ρ9ν/Υ8ΝΡΕΤ (8Ε() ГО ΝΟ: 24)
8	8А888У8УМН (8Е(2 ГО N0: 20)	ОТ8КЬА8 (8Ε(} ГО ΝΟ: 23)	ΟΟΑΥδδΝΡΕΤ (8Ε0 ГО ΝΟ: 25)
9	8А888У8УМН (8Е(} ГО N0: 20)	ОТ8КЬА8 (8Ε0ΙϋΝΟ:23)	ΡΟλνδΚΝΡΕΓ (δΕΟΙϋΝΟ: 26)
10	8Α888Ι8ΥΜΗ (8Е() ΙϋΝΟ: 18)	ОТ8КЬА8 (8Ε() ГО ΝΟ: 23)	ΡΟΥ/ΥδΝΡΕΓ (8Ε<3 ГО ΝΟ: 24)
И	8Α888Ι8ΥΜΗ (8Ε9ΙϋΝΟ: 18)	ϋΤδΚΥΑδ (8Ε() ГО ΝΟ: 23)	(^λνΝδΝΡΕΤ (8Ε<2 ГО ΝΟ: 27)
12	8А888УУУМН (8Е(2 ГО ΝΟ: 21)	ϋΤδΚΧΑδ (8Ε() ГО ΝΟ: 23)	ΟΟν/ΤΥΝΡΕΤ (8Ε(2 ГО ΝΟ: 28)
14	8А888У8УМН (8Ε0ΙΟΝΟ:20)	ОТ8КЬА8 (8Εζ) ГО ΝΟ: 23)	ΡΡΑΥΥδΝΡΕΤ (8Ε0 ГО ΝΟ: 24)
15	8Α888ΙΝΥΜΗ (8Е0 ГО ΝΟ: 22)	ОТ8КЬА8 (8Ε(2 ГО ΝΟ: 23)	Ρζ)ΑνΝ8ΝΡΕΓ (8Ε0 ГО ΝΟ: 27)
Консенсус	8Α888Χ₂9Χ30*ΥΜΗ (8ΕρΐϋΝΟ:38)	ОТ8КЬА8 (8Ε<2 ГО ΝΟ: 23)	ΡΡλνΧ₉ιΧ9₂ΝΡΕΤ** (8Ε0 ГО ΝΟ: 56)

*Х₂₉ представляет собой гидрофобную аминокислоту, Х₃₀ представляет собой

8, Т, Η, Υ или N.

**Х₉₁ представляет собой Υ, 8, N или Т, Х₉₂ представляет собой К, К, Υ, 8 или Т.

- 7 014112

Таблица 2

Последовательности вариабельного участка СОК тяжелой цепи (НСУК)

РАЬ	ΟϋΚΙ	СОК2	ΟϋΚ3
3	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Εζ) ГО N0: 29)	ΗΙΥλνΟΟϋΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Εζ) ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε(2 ГО ΝΟ: 36)
5	ОР8Ь8Т8ОМ8У8 (8ΕρΐϋΝΟ:30)	ΗΙΥλνϋΟΟΚΚΥΝΡ8ΕΚ8 (8Ε(} ГО N0:33)	КСЛТТУЬОООТМОУ (8Ε(} ГО ΝΟ: 37)
7	ОР8ЕГТ8ОМ1У8 (8ΕρΐϋΝΟ:31)	ΗΙΥλνϋΟΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е(2 ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε(2 ГО N0: 36)
8	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Е0 ГО ΝΟ: 29)	ΗΙΥλνΟϋΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Еф ΙϋΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Εζ) ГО N0: 36)
9	ОР8Ь8Т8ОМ8У8 (8Еф ГО ΝΟ: 30)	ΗΙΥΑνΟΟϋΚΚΥΝΡδΕΚδ (8Е0 ГО N0: 34)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Εφ ГО N0: 36)
10	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Е0 ГО ΝΟ: 29)	ΗΙΥλνΟΟϋΕΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е<2 ГО N0:35)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε0 ГО N0: 36)
11	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Е0 ГО N0: 29)	ΗΙΥλνΟϋΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е() ГО ΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Εζ) ГО N0: 36)
12	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Е(^ Ш N0: 29)	ΗΙΥΨΟϋΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е(^ ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε(^ ГО N0: 36)
14	ОР8ЬКТ8ОМ8У8 (8Εζ) ГО N0: 29)	ΗΙΥλνϋΟΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е(2 ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ер ГО N0: 36)
15	СгР8ЕКТ8ОМ8У8 (8Е0 10 N0: 29)	ΗΙΥΑνϋΟΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Ер ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8ΕΡ ΤΟΝΟ: 36)
16	ОР8ЬКТ8Сг88У8 (8Еф ГО N0: 47)	ΗΙΥν/ΟΟΟΚΚΥΝΡδΙΑΝ (8Еф ΙϋΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε0 ГО N0: 36)
17	ОР8ЬКК8ОМ8У8 (8Е0 ГО N0:48)	ΗΙΥλνϋΟΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Е(2 ГО ΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε(} ГО N0: 36)
18	ОР8ЬКТУОМ8У8 (8Е0 ГО N0: 49)	ΗΙΥ\νθϋΟΚΚΥΝΡ8ΕΚΝ (8Е(} ГО ΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜΟΥ (8Ε() ГО ΝΟ: 36)
19	0Р8ЬКТЬ0М8У8 (8Е() ГО N0: 50)	ΗΙΥΨΟΟΟΚΚΥΝΡ8ΕΚΝ (81-() ΙϋΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε0 ГО N0: 36)
20	ОР8ЬКТЬО88У8 (8Е() ΙϋΝΟ: 51)	Ι1ΙΥ\ν000ΚΚΥΝΡ8ΡΚΝ (δΕρίϋΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Εζ) ГО N0: 36)
21	ОР8ЬККУО88У8 (8Εζ) ГО N0: 52)	ΗΙΥλνϋϋΟΚΚΥΝΡδΕΚΝ (8Ε(2 ГО N0: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Ε0 ГО N0: 36)
22	ОР8ЬККЬО88У8 (8Ε0ΙΟΝΟ: 53)	ΙΙΙΥ\\’ΟΟΟΚΚΥΝΡ8ΙΚΝ (8ΕφΙϋΝΟ: 32)	ΚΑίττνιοοστΜϋΥ (8Ερ ГО N0: 36)
23	ОР8ЬКК8О88У8 (8Е0 ГО N0: 54)	ΗΙΥλΥΟΟΟΚΙΤΥΝΡδΙ.ΚΝ (8Ε0ΙΟΝΟ: 32)	ΚΑΙΤΤνίΟΟΟΤΜϋΥ (8Εζ) ГО N0: 36)
Консенсус	ОРЗЬХзХбХтОХдХю У8* (8Εζ) ГО ΝΟ: 55)	ΗΙΥλνϋΟΟΧ₈ΚΥΝΡ8ΕΧΐ5 Χΐ6**(8ΕΟ ГО N0:41)	КХ₂1ТТУХ₇ОООТМ ΟΥ***(8Ε() ГО N0:42)

*Х₅ представляет собой К, К, Т или 8; Х₆ представляет собой Т или К; Х₇ представляет собой 8, V или Ь; Х₉ представляет собой М или 8; Хю представляет собой 8, Т, I, Ь или V.

**Х₈ представляет собой К, К, Е или Ό; Х₁₅ представляет собой К или К; Х₁₆представляет собой 8, Т, N или С).

***Х₂ представляет собой А или О; Х₇ представляет собой I, Ь или V.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает последовательность аминокислот человеческого промиостатина с подчеркнутой сигнальной последовательностью и выделенной полужирным шрифтом частью белка на карбоксильном конце, которая образует мономер зрелой формы миостатина.

Фиг. 2 показывает последовательность аминокислот зрелого миостатина человека. Подчеркнут антигенный эпитоп по данному изобретению.

Фиг. 3 показывает выравнивание последовательности аминокислот зрелой формы человеческого миостатина и человеческого ΟΌΕ-11 с подчеркнутым антигенным эпитопом по данному изобретению, полужирным шрифтом показаны остатки в пределах антигенного эпитопа, которые различаются между миостатином и ΟΌΕ-11. Символ (+) указывает на консервативные различия аминокислот между миостатином и ΟΌΕ-11 в обозначенном положении, тогда как символ (-) указывает на не консервативное различие аминокислот между миостатином и ΟΌΕ-11 в данном положении.

Фиг. 4 показывает выравнивание ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 с доменами СОК ^СVК, обозначенными полужирным шрифтом. Символ (*) указывает на остаток аминокислоты, где присутствуют вариации между различными ЕаЬ.

- 8 014112

Фиг. 5 показывает выравнивание ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 НСУК с доменами СБК, обозначенными полужирным начертанием. Символ (*) указывает на остаток аминокислоты, где присутствуют вариации между различными ЕаЬ.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к моноклональным антителам или их функциональным фрагментам (например, антигенсвязывающий фрагмент), которые специфично связываются с миостатином млекопитающих или его частью. Антигенный эпитоп, с которым связываются моноклональные антитела по изобретению, расположен в пределах остатков 40-64 зрелого миостатина. В одном воплощении моноклональное антитело по изобретению блокирует связывание с лигандом (например, рецептор миостатина), миостатином или ингибирует биологическую активность миостатина.

Антитела по изобретению специфично связываются со зрелым миостатином или его частью со сродством по меньшей мере около 1х10^-7 М, предпочтительно со сродством по меньшей мере около 9х10^-8 или 7х10^-8 М и более предпочтительно по меньшей мере около 5х10^-8 М. Предпочтительно антитела по изобретению не связываются с СОЕ-11 на уровне выше фоновых уровней любой стандартной пробы связывания, известной из уровня техники. В одном воплощении антитела по изобретению демонстрируют ингибирование биологической активности миостатина ίη νίίτο или ίη νίνο при концентрации менее чем 150 мкг/мл, предпочтительно менее чем 100 мкг/мл, более предпочтительно менее чем 90, 80, 70, 60 или 50 мкг/мл, даже более предпочтительно менее чем около 20 мкг/мл, и даже более предпочтительно менее чем около 2 или 0,2 или 0,02 мкг/мл.

В данном описании термин зрелый миостатин может означать мономерную или димерную форму, предпочтительно гомодимерную, белка, полученного протеолитическим расщеплением пробелковой формы миостатина.

Антитело полной длины, которое встречается в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, включающую четыре пептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа при наличии полной длины) и две легкие (Ь) цепи (около 25 кДа при наличии полной длины), связанные между собой дисульфидными связями. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельный участок длиной около 100-110 или больше аминокислот, который в основном ответственен за распознавание антигена. Карбоксильный константный участок каждой цепи определяет константный участок, который в основном ответственен за эффекторную функцию.

Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда и характеризуются специфическим константным участком. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон и определяют изотип антитела как 1дС, 1дМ, 1дА, 1дБ и 1дЕ соответственно. Каждый вид тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком.

Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (в данном описании НСУК) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена (СН1, СН2 и СН3) для 1дС, Ι§ϋ и 1дА и 4 домена (СН1, СН2, СН3 и СН4) для 1дМ и 1дЕ. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (в данном описании ЬСУК) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен СЬ. Участки НСУК. и ЬСУК могут дополнительно подразделяться на участки гиперизменчивости, которые называют определяющими комплементарность участками (СБК). перемежающиеся с более консервативными участками, которые называют каркасными областями (ЕК). Каждый НСУК и ЬСУК состоит из трех СБК и четырех ЕК, расположенных в направлении от аминного конца к карбоксильному концу в следующем порядке: ЕК1, СБК1, ЕК2, СБК2, ЕК3, СБК3, ЕК4. Назначение аминокислот в каждом домене соответствует хорошо известным соглашениям [например, КаЬа!, 8сс.|испес5 οί ргсИснъ οί 1шшипо1од1са1 1п1еге§1, Ναΐίοηαΐ ΙηδΙίΙιιΚδ οί НеаНЬ, ВеШекйа, Мй. (1991) или схема нумерации Оюина, которая описана в А1-Ьа71каш е1 а1., ί. Μο1. ΒΐοΙ. 273:927-948, 1997, см. также интернет-сайт Ьΐίρ:^^^.^иЬ^с.^йд.ас.ик/~аηй^е^/Ь^ο^ηί.ο^д/аЬ8]. Функциональная способность антитела связываться с конкретным антигеном коллективно определяется шестью СБК. Однако даже один изменчивый домен, содержащий только три СБК, специфичных для антигена, может обладать способностью распознавать антиген и связываться с ним, хотя и с более низким сродством, чем полный ЕаЬ.

Термин антитело для обозначения антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению (или просто моноклональное антитело по изобретению) в данном описании означает моноклональное антитело. Моноклональное антитело в данном описании обозначает антитело грызуна, предпочтительно мыши, химерное антитело, приматизированное антитело или гуманизированное антитело. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, техник гибридомы, хорошо известных из уровня техники, а также с помощью рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или сочетания таких технологий, хорошо известных из уровня техники.

- 9 014112

Термин моноклональное антитело в данном описании не ограничивается антителами, произведенными по технологии гибридомы. Моноклональное антитело означает антитело, полученное из одной копии или клона, включая, например, любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не способ, по которому оно произведено. Моноклональное антитело может быть интактным (полным или с полной длиной) антителом, в значительной мере интактным антителом или частью либо фрагментом антитела, который включает антигенсвязывающую часть, например фрагмент РаЬ, фрагмент РаЬ' или фрагмент Р(аЬ')₂ мышиного антитела, или химерного антитела, или гуманизированного антитела.

В данном описании термины антигенсвязывающая часть, или антигенсвязывающий участок, или антигенсвязывающий домен используются взаимозаменяемым образом для обозначения той части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и обеспечивающие антителу специфичность и сродство к антигену. Часть антитела включает каркасные остатки аминокислот, необходимые для сохранения правильной конформации антигенсвязывающих остатков.

Предпочтительно СЭВ антигенсвязывающего участка антител по изобретению будут иметь мышиное происхождение. В других воплощениях антигенсвязывающий участок может происходить из других видов, кроме человека, в том числе, не ограничиваясь ими, кролика, крысы или хомяка.

Кроме того, термин моноклональное антитело в данном описании может означать одноцепочечный фрагмент Ρν, который может быть создан для соединения ДНК, кодирующей ЬСУВ и НСУК, с последовательностью линкер (см. Р1иск1йип, ТНе Рйагшасо1о§у οί Мопос1опа1 ЛпйЬоФек, νοί. 113, ВокепЬигд апб Мооге еб§., 8ргшдег-Уег1ад, Ыете Уогк, р. 269-315, 1994). Следует понимать, что независимо от того, указаны или нет фрагменты, термин антитело в данном описании включает такие фрагменты, а также одноцепочечные формы. До тех пор пока белок сохраняет способность специфично или преимущественно связываться с целевой мишенью (т.е. эпитопом или антигеном), он охватывается термином антитело. Антитела могут быть или не быть гликозилированными и все еще включены в рамки изобретения. Популяция моноклональных антител означает гомогенную или в значительной мере гомогенную (или чистую) популяцию антител (т.е. по меньшей мере около 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по меньшей мере около 97 или 98% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% антител в популяции являются идентичными и в пробе ЕЫ8А будут конкурировать за связывание с одним и тем же антигеном или эпитопом).

Термины специфично связывается или преимущественно связывается в данном описании означают ситуацию, в которой один член специфически связывающейся пары не связывается в значительной мере с другими молекулами, кроме специфичного партнера(ов) по связыванию. Термин также применяется, если, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфичным для конкретного эпитопа, который несут на себе различные антигены, и в этом случае специфичное антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно связываться с различными антигенами, несущими эпитоп. Соответственно моноклональное тело по изобретению специфично связывается и/или преимущественно связывается с миостатином и в то же время не связывается специфично или преимущественно с СЭР-11.

В одном воплощении моноклональное антитело по изобретению обладает менее чем 20% перекрестной реактивности (более предпочтительно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% перекрестной реактивности) с немиостатиновым белком или пептидом (таким как, например, СЭР 11) или белком, который не включает 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд последовательности, показанной в 8ЕО Ш N0: 46 или 43 по стандартной методике уровня техники, такой как проба ЕЫ8А, конкурентная проба ЕЬ18А или значения К_с, измеренные в пробе В1Асоге®. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с СЭР-11: более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз больше, чем оно связывается с СЭР-11, что определяют, например, конкурентной пробой ЕЬ18А или пробой В1Асоге®. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с СЭР-11 на уровне, более высоком, чем базовые уровни любой пробы связывания, доступной из уровня техники. Моноклональное антитело по изобретению может связываться с мономерной или димерной формой миостатина или его частью.

Фразы биологическое свойство или биологическая характеристика или термины активность или биологическая активность (биоактивность) для обозначения антитела по данному изобретению в данном описании применяются взаимозаменяемым образом и включают, не ограничиваясь ими, сродство и специфичность в отношении эпитопа/антигена (например, связывание антимиостатинового моноклонального антитела с миостатином или пептидом, состоящим из последовательности, показанной в 8ЕО Ш N0: 46 или 43), способность к антагонизму в отношении активности миостатина ш νί\Ό. ш уйго. или ш 811и, стабильность антитела ш νί\Ό и иммуногенные свойства антитела. Другие биологические свойства или характеристики антитела, которые поддаются определению, признанные в уровне техники, включают, например, перекрестную реактивность (т. е. с нечеловеческими гомологами целевого пептида или с другими белками или тканями в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка

- 10 014112 в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться или быть измерены или оценены с использованием признанных в уровне техники методик, которые включают, не ограничиваясь ими, пробу ЕЫ8А, конкурентную пробу ЕБ18А, анализ резонанса поверхности плазмона В1Асоге®, пробы нейтрализации ίη νίίτο и ίη νΐνο без ограничений, связывания рецептора, выработки и/или секреции цитокина или фактора роста, развитие анимального полюса Хепорик, преобразование сигнала и иммуногистохимию с секциями ткани из разных источников, включая человека, примата, или любой другой источник, который может потребоваться.

Термин ингибировать или нейтрализовать в данном описании, если он используется для обозначения активности антитела по изобретению, обозначает способность в значительной мере осуществлять антагонизм, запрещать, предупреждать, ограничивать, замедлять, разрушать, устранять, останавливать или обращать, например, прогресс или выраженность того явления, которое подлежит ингибированию, в том числе, не ограничиваясь ими, биологическую активность или свойство, заболевание или состояние.

Термин изолированный (выделенный), если он используется для обозначения нуклеиновой кислоты или белка (например, антитела), означает последовательность нуклеиновой кислоты или белок, который идентифицирован и отделен по меньшей мере от одного загрязняющего компонента, который обычно сопровождает его в природном источнике. Предпочтительно изолированное антитело (выделенное антитело) представляет собой антитело, которое является в значительной мере свободным от других антител, обладающих другими видами антигенной специфичности (например, фармацевтические композиции по изобретению включают выделенное антитело, которое специфично связывается с миостатином и является в значительной мере свободным от антител, которые специфично связываются с другими антигенами, кроме миостатина).

Термины нумерация К.аЬа1 и маркировка КаЬа! в данном описании используются взаимозаменяемым образом. Эти термины, которые приняты в уровне техники, обозначают систему нумерации аминокислотных остатков, которые являются более изменчивыми (например, гиперизменчивыми), чем другие аминокислотные остатки в изменчивых участках тяжелой и легкой цепи антитела (КаЬа!, е! а1., Апп. ΝΥ Асаб. 8с1. 190:382-93 (1971); КаЬа!, е! а1., 8ес.|иепсе5 οί рго1еш8 οί 1тшипо1од1са1 1п1еге81, ΕίΠΙι Ебйюп, и.8. Эерайшеп! οί НеаИй апб Нитап 8еМсе§, ΝΙΗ РиЬБсабоп, № 91-3242 (1991)).

Полинуклеотид функционально связан, если он размещен в функциональном взаимодействии с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности.

Термины особь, субъект или пациент в данном описании используются взаимозаменяемым образом и обозначают млекопитающих, в том числе, не ограничиваясь ими, мышей, обезьян, людей, сельскохозяйственных млекопитающих животных, спортивных млекопитающих животных и домашних млекопитающих животных; предпочтительно термин обозначает людей.

Термин вектор включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, в том числе, не ограничиваясь ими, плазмиды и вирусные векторы. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как другие векторы при введении в клетку-хозяина могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют рекомбинантными векторами экспрессии (или просто векторами экспрессии), и примеры таких векторов хорошо известны из уровня техники.

Термин клетка-хозяин включает отдельную клетку или культуру клеток, которая является реципиентом любого выделенного нуклеотида по изобретению или любого рекомбинантного вектора(ов), включающего НСУВ, ЬСУК. или моноклональное антитело по изобретению. Клетки-хозяева включают потомство одиночной клетки-хозяина, и потомство не обязательно должно быть полностью идентичным (с точки зрения морфологии и полной комплементарности ДНК) исходной оригинальной родительской клетке из-за природной случайной мутации или мутации высвобождения и/или изменения. Клеткахозяин включает трансформированные, трансдуцированные или инфицированные ш νί\Ό. ш δίΐιι или ш νίΙΐΌ рекомбинантные векторы или полинуклеотиды, экспрессирующие моноклональное антитело по изобретению или легкой цепи, или тяжелой цепи. Клетка-хозяин, которая включает рекомбинантный вектор по изобретению (стабильно инкорпорированного в хромосому хозяина или нет), также может обозначаться как рекомбинантная клетка-хозяин. Предпочтительные клетки-хозяева для использования в изобретении представляют собой клетки СНО (например, АТСС СВЕ-9096), клетки N80, клетки 8Р2/0 и клетки СО8 (АТСС, например, СВЕ-1650, СВЕ-1651), НеЬа (АТСС ССЬ-2). Дополнительные клеткихозяева для использования в изобретении включают клетки растений, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и прокариотические клетки.

- 11 014112

Данное изобретение относится к выделенным, моноклональным антителам, которые связываются со зрелой формой миостатина, охватывающего аминокислоты 40-64. Кроме того, антитела по изобретению нейтрализуют биологическую активность миостатина ίη νίνο, ίη νίίτο или ίη κίΐιι. Специфичное связывание антимиостатиновых моноклональных антител по изобретению (включая их антигенсвязывающие части и гуманизированные моноклональные антитела с подобной специфичностью) с миостатином позволяет использовать указанные антитела в качестве терапевтических или профилактических средств при связанных с миостатином заболеваниях и расстройствах, т.е. заболеваниях или расстройствах, при которых пациент получает пользу от снижения уровней миостатина или ингибирования биологической активности миостатина.

Эпитоп, с которым связываются антитела по изобретению (эпитоп миостатина по изобретению), расположен в пределах пептида, охватывающего аминокислоты 40 и 64 зрелого миостатина любого вида млекопитающих, предпочтительно человека. Антитела, которые связываются с указанным эпитопом, специфично или преимущественно связываются с миостатином в сравнении с их связыванием с ΟΌΕ-11.

Термин эпитоп обозначает часть молекулы, способной к распознаванию и связыванию с антителом в одном или более антигенсвязывающих участков антитела. Эпитопы часто состоят из химически активной поверхностной группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, такими как специфические характеристики заряда.

Термины ингибируюший эпитоп и/или нейтрализующий эпитоп предназначены для обозначения эпитопа, который в контексте интактной молекулы (в данном случае миостатина) и при связывании с антителом приводит к утрате или снижению биологической активности молекулы или содержащего ее организма ίη νίνο, ίη νίίτο или ίη κίΐιι.

Термин эпитоп в данном описании дополнительно относится к части пептида, обладающего антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши или человека.

Термин антигенный эпитоп в данном описании определяется как часть пептида, с которой может специфично связываться антитело, что определяют с помощью любого метода, хорошо известного из уровня техники, например с помощью традиционных иммунопроб. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными.

Иммуногенный эпитоп в данном описании определяется как часть пептида, которая вызывает иммунный ответ в виде антител у животного, что определяют по способу, известному из уровня техники (см., например, Сеукен е1 а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. 8с1. И8А 81:3998-4002 (1983)). Антигенный эпитоп человеческого миостатина данного изобретения имеет последовательность аминокислот, которая показана в 8ЕО ГО N0: 43 и 46. Антигенный эпитоп миостатина данного изобретения для любого вида млекопитающих существует в рамках пептида, состоящего из аминокислот 40-64 зрелой формы миостатина.

Антимиостатиновые моноклональные антитела по изобретению связываются с антигенным эпитопом, расположение которого обнаружено в области аминокислот 40-64 зрелого миостатина. Иммуногенный и/или антигенный эпитоп миостатина по изобретению состоит из последовательности, показанной в 8ЕО ГО N0: 46 или 43, или состоит из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 46 или 43, предпочтительно иммуногенный эпитоп охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, т.е. где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении ΟΌΕ-11 (см. фиг. 3). Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина по изобретению находится в пределах положений 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего или состоит из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный эпитоп охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении ΟΌΕ-11 в том же млекопитающем. Иммуногенный эпитоп по изобретению также рассматривается как антигенный эпитоп. Антигенный эпитоп может включать дополнительные остатки миостатина вне аминокислот 40-64 зрелого миостатина, но моноклональные антитела по изобретению не требуют этих дополнительных остатков для специфического связывания с миостатином. Кроме того, остатки миостатина вне аминокислот 40-64 (т.е. антигенного эпитопа) могут влиять на конформационную структуру антигенного домена и в связи с этим изменять связывание антитела по изобретению с антигенным эпитопом. Моноклональные антитела по изобретению связываются с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше (например, более высокое сродство или более высокая специфичность), чем они связываются с ΟΌΕ-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз больше, чем они связываются с ΟΌΕ-11, что определяют, например, с помощью пробы ЕЬ18А, конкурентной пробы ЕЫ8А или значений К_с в пробе В1асоге®.

- 12 014112

Домен, охватывающий аминокислоты 40-64 (включительно) зрелого миостатина, или любой пептид, состоящий из иммуногенного эпитопа, раскрытого в данном описании, может использоваться как иммуногенный пептид, предпочтительно конъюгированный с белком-носителем, например КЬН, для создания моноклональных антител по изобретению. Иммуногенный пептид может использоваться для иммунизации животного, кроме человека, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно мыши. Затем антимиостатиновые антитела выделяют из иммунизированных животных и подвергают скринингу способами, хорошо известными из уровня техники, для выделения тех антител, которые специфически связываются с аминокислотами 40-64 миостатина.

В целом, гибридома может быть получена путем слияния подходящей бессмертной линии клеток (например, клеточной линии миеломы, такой как 8Р2/0) с клетками иммунизированного животного, вырабатывающими антитело. Клетку, вырабатывающую антитело предпочтительно из селезенки или лимфатических узлов, получают из животного, иммунизированного интересующим антигеном. Слитые клетки (гибридомы) могут быть выделены с применением условий избирательного культивирования и клонированы с помощью ограничивающего разведения. Клетки, которые вырабатывают антитела с желательными связывающими свойствами, могут быть отобраны с помощью подходящей пробы.

Способы такого выделения и скрининга хорошо известны из уровня техники. Выбор фрагментов антитела из библиотек с применением технологий обогащения, такого как фаговый дисплей (Маййете Ό.Ι аиб ^е1к 1.А.. 8с1епсе. 260:1113-7, 1993), рибосомы ВЕРЕДУ (Напек, е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. (И8А), 95:14130-5, 1998), бактериальный дисплей (8атие1коп Р., е! а1., 1оита1 оГВю!есйпо1оду. 96:129-54, 2002) или дрожжевой дисплей (К1еке МС, е! а1., Рго!ет Епдтееппд. 10:1303-10, 1997), которые доказано являются успешными альтернативами классической технологии гибридомы (недавние обзор: Ый1е М. е! а1., Iттиηо1оду Тобау, 21:364-70, 2000). Антитела по изобретению могут быть изменены до химерной или гуманизированной формы с применением способов, хорошо известных из уровня техники.

Могут применяться другие подходящие способы выработки или выделения антител, которые связываются с аминокислотами 40-64 зрелого миостатина, включая человеческие или искусственные антитела, в том числе, например, способы, которые отбирают рекомбинантное антитело (например, одноцепочечный Εν или ЕаЬ) из библиотеки или которые основываются на иммунизации трансгенных животных (например, мышей), способных вырабатывать набор человеческих антител (см., например, Ιπ^^νίΐκ е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8А, 90:2551-2555, 1993; 1акоЬоу1й е! а1., №!иге, 362:255-258, 1993; ЬопЬегд е! а1., патент США № 5545806; 8игап1 е! а1., патент США № 5545807).

Одноцепочечные антитела, а также химерные, гуманизированные или приматизированные (с пересаженным СЭЯ) антитела, такие как химерные или одноцепочечные антитела с пересаженным СЭЯ и т.п., включающие части, происходящие из разных видов, также охватываются данным изобретением и термином антитело. Различные части таких антител могут быть соединены вместе химически с помощью традиционных техник, синтетически или могут быть приготовлены как беспрерывный белок с применением техник генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения беспрерывного белка. См., например, патент США № 4816567; Европейский патент № 0125023 В1; патент США № 4816397; Европейский патент № 0120694 В1; XVО 86/01533; Европейский патент № 0194276 В1; патент США № 5225539; Европейский патент № 0239400 В1 и патенты США № 5585089 и 5698762, см. также Ые^тап, Я. е! а1. ВюТесйпо1оду, 10:1455-1460, 1993, в отношении приматизированного антитела, и Ьабпег е! а1., патент США № 4946778 и В1гб, Я.Е. е! а1., 8с1епсе, 242:423-426, 1988, относительно одноцепочечных антител.

Кроме того, могут быть получены функциональные фрагменты антител, в том числе фрагменты химерных, гуманизированных, приматизированных или одноцепочечных антител. Функциональные фрагменты перечисленных антител сохраняют по меньшей мере одну связывающую функцию или биологическую функцию антитела с полной длиной, из которого они произошли. Предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего антитела с полной длиной (например, способность связываться со зрелой формой миостатина млекопитающего). Особенно предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют способность ингибировать одну или более функций или видов биологической активности, характерных для зрелого миостатина млекопитающего, таких как связывающая активность, сигнальная активность и/или стимуляция клеточного ответа. Например, в одном воплощении функциональный фрагмент может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или более из его лигандов и/или может ингибировать одну или более опосредованных рецептором функций.

Фрагменты антитела, способные связываться со зрелым миостатином млекопитающего или его частью, включают, не ограниваясь ими, фрагменты Εν, ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, которые охватываются изобретением. Такие фрагменты могут быть получены с помощью ферментного расщепления или рекомбинантных техник. Например, расщепление папаином или пепсином может давать фрагменты ЕаЬ или Е(аЬ')2 соответственно. Антитела также могут быть образованы в разнообразных обрезанных формах с применением генов антител, в которых один или более останавливающих кодонов введены выше природного останавливающего сайта. Например, химерный ген, кодирующий часть тяжелой цепи Е(аЬ')₂, может быть спроектирован включающим последовательности ДНК, кодирующие домен СН1 и петлевой участок тя

- 13 014112 желой цепи.

В предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает антимиостатиновое моноклональное антитело, полученное с помощью описанного процесса, которое предпочтительно связывается со зрелым миостатином или его частью со сродством по меньшей мере около 1х10^-7 М, предпочтительно по меньшей мере около 9х10^-8 или 7х10^-8 М и более предпочтительно по меньшей мере около 5х10^-8 М (что определяют, например, с помощью твердофазного анализа поверхностого плазмонного резонанса В1Асоге®) и обладает способностью противодействовать биологической активности зрелого миостатина.

Предпочтительное моноклональное антитело по изобретению включает ЬСУК, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, которая состоит из 8ЕО ГО N0: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11, и/или НСУК, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, которая состоит из 8Е0 ГО N0: 12, 13, 14, 15, 16, 17 и 8Е0 ГО N0: 12, с заменой аминокислот 26-37 на аминокислоты в 8Е0 ГО N0: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 (см. табл. 1 и 2 и фиг. 4 и 5 в данном описании относительно последовательностей и их расположения в ЕаЬ). Кроме того, моноклональное антитело по изобретению является таким, связывание которого со зрелым человеческим миостатином (или его частью) полностью ингибируется моноклональным антителом, которое включает два полипептида с последовательностями, показанными в группе, состоящей из (ί) 8 ЕС) ГО N0: 3 и 12;

(ίί) 8ЕС) ГО N0: 4 и 13;

(ш) 8ЕС) ГО N0: 3 и 14;

(ίν) 8ЕС) ГО N0: 5 и 12;

(ν) 8 ЕС) ГО N0: 6 и 15;

(νί) 8ЕС) ГО N0: 7 и 17;

(νίί) 8ЕС) ГО N0: 8 и 12;

(νίίί) 8ЕС) ГО N0: 9 и 16;

(ίχ) 8ЕС) ГО N0: 10 и 12;

(х) 8 ЕС) ГО N0: 11 и 12;

(χί) 8Е0 ГО N0: 3 и 8 ЕС ГО N0: 12 с заменой аминокислот 26-37 на аминокислоты в 8ЕС) ГО N0: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54.

В другом воплощении ЬСУК антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью, показанной в 8Е0 ГО N0: 38, 23 и 56 (см. табл. 1). НСУК антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранные из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью, показанной в 8Е0 ГО N0: 55, 41 и 42 (см. табл. 2).

В предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Альтернативно, каркас и любой константный участок, присутствующие в антителе, могут в значительной мере происходить из генома животного, где антитело представляет собой такое, которое используется в качестве терапевтического. Предпочтительное антитело представляет собой антитело с полной длиной.

Данное изобретение также направлено на линии клеток, которые экспрессируют антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению или его часть. Создание и выделение клеточных линий, вырабатывающих моноклональное антитело по изобретению, может быть осуществлено с использованием стандартных методик, известных из уровня техники. Предпочтительные линии клеток включают С08, СН0, 8Р2/0, N80 и дрожжевые (доступны из публичных репозиториев, таких как АТСС, Ашепсаи Туре Сийиге Со11ес11оп. Маиаккак, УА).

Широкое разнообразие систем-хозяев экспрессии может использоваться для экспрессии антитела по данному изобретению, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы экспрессии (такие как клетки дрожжей, бакуловирусов, растений, млекопитающих и других животных, трансгенные животные и клетки гибридомы), а также системы экспрессии фагового дисплея. Примером подходящего вектора бактериальной экспрессии является рИС119 и примером подходящего эукариотического вектора экспрессии является модифицированный вектор рИС119 с ослабленной системой селекции ΌΗΕΚ. Другие системы экспрессии антител также известны из уровня техники и рассматриваются в данном описании.

Антитело по изобретению может быть приготовлено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для экспрессии антитела рекомбинантным способом клетку-хозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т. п. с помощью одного или более рекомбинантных векторов экспрессии, несущих фрагменты ДНК, которые кодируют легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулинового антитела таким образом, что легкие и/или тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепи могут экспрессироваться независимо от различных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе или, альтернативно, тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться независимо от различных промоторов, к которым они оперативно присоединены, в двух векторах - один экспрессирует тяжелую цепь и один экспрессирует легкую цепь.

- 14 014112

Тяжелая и легкая цепи необязательно могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду культивирования клеток-хозяев, из которой антитела могут быть извлечены или очищены. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК применяются для получения генов тяжелой и легкой цепей антигена, для инкорпорации данных генов в векторы рекомбинантной экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Такие стандартные рекомбинантные технологии ДНК описаны, например, в ЗатЬгоок, Етйксй, апб ΜαηίαΙίδ (Ебк.), Мо1еси1аг С1ошпд; А ЬаЬота!огу Мапиа1, Зесопб Ебйюп, Со1б Зрппд НагЬог, Ν.Υ., 1989; АнщЬек е! а1. (Ебк.) Сиггеп! Рто!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Стеепе РиЫЫнпд Аккоаайк, 1989.

Изолированная ДНК, кодирующая участок НСУК, может быть превращена в ген тяжелой цепи полной длины путем действующего присоединения ДНК, кодирующей НСУК, к другой молекуле ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности человеческих генов константного участка тяжелой цепи известны из уровня техники. См., например, СаЬа!, е! а1., 8ес.|иепсе5 о! рго!ет§ о! 1ттипо1од1са1 1п!еге§!, Е1йй Ебйюп, ϋ.δ. Оерайтеп! о! Неайй апб Нитап ЗеМсек, МН РиЬйсайоп, № 91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, охватывающие данные участки, могут быть получены, например, с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок тяжелой цепи может быть константным участком любого типа (например, 1дС, 1дА, 1дЕ, 1дМ или 1дЭ), класса (например, 1дС|, 1дС₂, 1дС₃ и 1дС₄) или подкласса и любым его аллотипическим вариантом, как описано у КаЬа! (выше). Альтернативно, антигенсвязывающий участок может быть фрагментом ЕаЬ, фрагментом ЕаЬ', фрагментом Е(аЬ')₂, Еб или одноцепочечным фрагментом Εν (ксЕу). Для гена фрагмента ЕаЬ тяжелой цепи ДНК, кодирующая НСУК, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок СН1 тяжелой цепи.

Изолированная ДНК, кодирующая участок ЬСУК, может быть превращена в ген легкой цепи с полной длиной (а также в ген ЕаЬ легкой цепи) путем функционального связывания ДНК, кодирующей ЬСУК, с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи СЬ. Последовательности человеческих генов константного участка легкой цепи известны из уровня техники. См., например, КаЬа!, выше. Фрагменты ДНК, охватывающие данные участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок легкой цепи может быть константным участком каппа или лямбда.

Для создания гена 5сЕ\^г кодирующие НСУК и ЬСУК фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (С1у₄-Зег)₃, таким образом, что последовательности НСУК и ЬСУК могут быть экспрессированы в виде беспрерывного одноцепочечного белка с участками ЬСУК и НСУК, соединенными с помощью гибкого линкера. См., например, Впб, е! а1., 8с1епсе, 242:423-6, 1988; Нийоп, е! а1., Ргос. Ν;Π1. Асаб. 8сг ИЗА, 85:5879-83, 1988; МсСайейу, е! а1., Уинге, 348:552-4, 1990.

Для экспрессии антитела по изобретению ДНК, кодирующую легкую и/или тяжелую цепь с полной длиной, получают, как описано выше, вставляют в вектор экспрессии таким образом, что ген был функционально связан с контрольными последовательностями транскрипции и трансляции. Вектор экспрессии и контролирующие экспрессию последовательности выбирают совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставляют в один вектор экспрессии. Гены антитела вставляют в вектор экспрессии с помощью стандартных способов. Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела клеткой-хозяином. Ген легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид функционально связывается в рамке с аминным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом.

В дополнение к гену(ам) тяжелой и/или легкой цепи антитела рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена(ов) цепи антитела в клетке-хозяине.

Термин регуляторная последовательность предназначен для включения промоторов, энхансеров и других элементов, контролирующих экспрессию (например, сигналов полиаденилирования), которые при необходимости контролируют транскрипцию или трансляцию гена(ов) цепи антитела. Дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, которая подлежит трансформации, уровня экспрессии целевого белка.

Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (ЦМВ), обезьяньего вируса 40 (ЗУ40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и полиовируса полиомы.

- 15 014112

Кроме генов тяжелой и/или легкой цепи антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию векторов в клетках-хозяевах (например, источники репликации) и один или более маркерных генов, которые обеспечивают отбор. Маркерный ген, который обеспечивает отбор, облегчает отбор клеток-хозяев, в которые вводят вектор. Например, типично маркерный ген обеспечивает устойчивость к действию медикаментов, таких как 0418, гигромицин или метотрексат, для клетки-хозяина, в которую введен вектор. Предпочтительные маркерные гены, которые обеспечивают отбор, включают ген дигидрофолатредуктазы (ЭНЕК) (для применения в ОНЕКминус клетках-хозяевах с метотрексатным отбором/амплификацией), ген пео (для отбора 0418), а также глутаминсинтетазы (08) в 08-отрицательной клетке (такой как N80) для отбора/амплификации.

Для экспрессии тяжелых и/или легких цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующие тяжелые и/или легкие цепи, вводят в клетку-хозяин с помощью стандартных методик, например электрокорпорации, осаждения с кальция фосфатом, трансфекции ΌΕΑΕ-декстраном, трансдукции, инфекции и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительны эукариотические клетки и наиболее предпочтительны клетки-хозяева млекопитающих, поскольку такие клетки с большей вероятностью собирают и секретируют надлежащим образом свернутое и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клеткихозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), включая ОНЕК-СН0 клетки, описанные в Иг1аиЬ апй Сйакт, Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А, 77:4216-20, 1980, которые используются с маркером ЭНЕЕ, обеспечивающим отбор, например, как описано в КаиЕтап апй 8йагр, 1. Мо1. Бю1. 159:601-21, 1982, клетки миеломы N80, клетки С08 и клетки 8Р2/0. Если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела вырабатываются культивируемыми клетками-хозяевами, или более предпочтительно секреция антитела осуществляется в среду культивирования, где выращены клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из клетки-хозяина и/или среды культивирования с применением стандартных методов очистки.

Клетки-хозяева также могут быть использованы для выработки частей или фрагментов интактных антител, например фрагментов ЕаЬ или молекул 5сЕ\\ с помощью методик, которые сами по себе являются традиционными. Следует понимать, что вариации вышеописанной методики находятся в рамках данного изобретения. Например, может быть желательным трансфицировать клетку-хозяина с помощью ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь антитела по данному изобретению. Технология рекомбинантной ДНК также может применяться для удаления части или всей ДНК, кодирующей одну или обе цепи (легкую и тяжелую), которые не являются необходимыми для связывания с миостатином. Молекулы, которые экспрессируются такими обрезанными молекулами ДНК, также охватываются антителами по изобретению. В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела по изобретению рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, вводят в клетки ОНЕК-СН0 путем, например, опосредованной карбонатом кальция трансфекции. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии гены тяжелой и легкой цепи антитела функционально связаны с энхансерными/промоторными регуляторными элементами (например, полученными из 8У40, ЦМВ, аденовируса и т.п., такими как регуляторный элемент ЦМВ энхансер/АйМЬР промотор или регуляторный элемент 8У40 энхансер/АйМЬР промотор) для обеспечения высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген ОНЕК, который позволяет осуществить отбор клеток СНО, трансфицированных вектором, с использованием метотрексатного отбора/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для обеспечения возможности экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела и интактное антитело извлекают из среды культивирования. Стандартные методики молекулярной биологии применяют для изготовления рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицирования клеток-хозяев, отбора трансформированных клеток, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из среды культивирования. Антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению могут быть экспрессированы в животном (например, мыши), которое является трансгенным для генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Тау1ог, е1 а1., МШею Ас1йк Кек. 20:6287-95, 1992).

Сразу после экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или их иммуноглобулиновые формы по данному изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными методиками из уровня техники, в том числе методиками осаждения аммония сульфатом, ионного обмена, аффинной, обращенно-фазной, колоночной хроматографией гидрофобного взаимодействия, гель-электрофореза и т.п.

Предпочтительными являются в значительной мере чистые иммуноглобулины по меньшей мере с гомогенностью около 90, 92, 94 или 96%, наиболее предпочтительными с гомогенностью 98-99% или более для фармацевтических целей. После частичной очистки или до очистки желательной гомогенности пептиды могут использоваться в терапевтических или профилактических целях, как описано в данном описании.

- 16 014112

В данном описании термин химерное антитело включает моновалентные, двухвалентные или поливалентные иммуноглобулины. Одновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной через дисульфидные мостики с химерной легкой цепью. Двухвалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами легкая цепь-тяжелая цепь, связанными с помощью по меньшей мере одного дисульфидного мостика.

Химерная тяжелая цепь антитела для применения у людей включает антигенсвязывающий участок, происходящий из тяжелой цепи нечеловеческого антитела, специфичного по отношению к миостатину, который связан с по меньшей мере одной частью константного участка человеческой тяжелой цепи, такой как СН1 или СН2. Химерная легкая цепь антитела для применения у людей включает антигенсвязывающий участок, происходящий из легкой цепи нечеловеческого антитела, специфичный в отношении миостатина, связанный по меньшей мере с частью константного участка человеческой тяжелой цепи (СЬ). Антитела, фрагменты или производные, имеющие химерные тяжелые цепи и легкие цепи с одинаковой или различной связывающей специфичностью изменчивого участка, также могут быть приготовлены путем соответствующего сочетания отдельных полипептидных цепей, в соответствии со стадиями известного способа.

При таком подходе хозяев, экспрессирующих тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев, экспрессирующих легкие цепи, и цепи иммуноглобулина извлекают по отдельности, а затем соединяют. Альтернативно, хозяева могут культивироваться совместно, и цепям позволяют связываться спонтанно в среде культивирования с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента.

Способы образования химерных антител известны из уровня техники (см., например, патенты США № 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397).

В предпочтительном воплощении создается ген, который включает первый сегмент ДНК, который кодирует по меньшей мере один антигенсвязывающий участок нечеловеческого происхождения (например, РаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15, как в табл. 1, 2 и на фиг. 4 и 5 данного описания), например функционально реконструированный вариабельный (V) участок с соединяющим (б) сегментом, присоединенным ко второму сегменту ДНК, кодирующему по меньшей мере часть человеческого константного (С) участка, как описано в патенте США № 6284471.

Предпочтительно антитело по изобретению для использования в терапевтических целях имеет такую последовательность каркасной области и константного участка, которая существует в антителе, происходящем из млекопитающего, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела, таким образом, чтобы уменьшить возможность возникновения у млекопитающего иммунной реакции против лечебного антитела.

Особенный интерес представляют гуманизированные антитела, поскольку они рассматриваются как ценные с точки зрения терапевтического применения и позволяют избежать у человека реакции против мышиных антител, которая часто наблюдается при использовании антител грызунов. Термин гуманизированное антитело в данном описании обозначает иммуноглобулин, который включает части антител различного происхождения, где по меньшей мере одна часть имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может включать части, происходящие из антитела нечеловеческого происхождения с требуемой специфичностью, такого как мышиное, и из антитела человеческого происхождения, соединенные вместе химически с помощью традиционных методик (например, синтетических) или приготовленные как беспрерывный полипептид с применением генно-инженерных методик. Предпочтительно гуманизированное антитело включает участки СБЯ происходящие из нечеловеческого антитела (предпочтительно мышиного моноклонального антитела), тогда как каркасная область и константный участок до той степени, в которой они присутствуют (или их значительная или существенная часть, т.е. по меньшей мере около 90, 92, 94, 96, 98 или 99%), кодируются информационной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая встречается в участке иммуноглобулина зародышевой линии человека (см., например, 11зе 1п1егпа1юпа1 1тМипо6епеТ1С8 Ба!аЬа§е), или существуют в их рекомбинантных или мутантных формах, независимо от того, вырабатываются ли указанные антитела в человеческой клетке. Гуманизированное антитело может быть интактным антителом, в значительной мере интактным антителом, частью антитела, включающей антигенсвязывающий сайт, или частью антитела, включающей фрагмент РаЬ, фрагмент РаЬ', фрагмент Р(аЬ')₂ или одноцепочечный фрагмент Ρν. Считается, что в процессе создания гуманизированного антитела аминокислота на любом конце СБИ (см., например, табл. 1 и 2) может быть замещена аминокислотой, которая встречается в зародышевой линии человека для такого сегмента присоединенной каркасной последовательности.

Гуманизированные антитела могут поддаваться мутагенезу ш νίίτο с применением рутинных способов, известных из уровня техники (или, если используется животное, трансгенное для последовательностей человеческого 1д соматическому мутагенезу ш νίνο), и, таким образом, последовательности аминокислот каркасной области участков Ηθνκ и ЬСνκ гуманизированных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи происходящими от последовательностей, родственных последовательностям Ηθνκ и БСУЯ зародышевой линии человека, могут не встречаться в природе в пределах набора антител зародышевой линии человека ш νίνο. Считается, что такие последовательности аминокислот каркасных участков Ηθνκ и БСУЯ гуманизированных рекомбинантных антител

- 17 014112 являются по меньшей мере на 90, 92, 94, 96, 98% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичными последовательности зародышевой линии человека.

Гуманизирование антитела обладают по меньшей мере тремя потенциальными преимуществами перед негуманизированными и химерными антителами при применении их для лечения человека:

(ί) эффекторная часть является человеческой, она может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать целевые клетки более эффективно с помощью комплемент-зависимой цитотоксичности или зависимой от антител клеточной цитотоксичности);

(ίί) иммунная система человека не должна распознавать каркасную область или константный участок гуманизированного антитела как чужеродные, и, следовательно, иммунный ответ в виде антител против такого антитела, введенного инъекционным способом, должен быть меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела; и (ш) сообщалось, что период полувыведения из кровотока человека для введенных инъекционным способом нечеловеческих антител намного короче, чем период полувыведения человеческих антител. Введенные инъекционным способом гуманизированные антитела могут иметь период выведения, который намного ближе к периоду полувыведения встречающихся в природе человеческих антител, что дает возможность вводить меньшие дозы и делать это реже.

Гуманизация в некоторых случаях может оказать побочное влияние на связывание антитела с антигеном. Предпочтительно гуманизированное антимиостатиновое моноклональное антитело по данному изобретению будет обладать сродством связывания для миостатина не менее приблизительно 50%, более предпочтительно не менее чем около 30% и наиболее предпочтительно не менее чем около 25, 20, 15, 10 или 5% связывающей активности исходного антитела, предпочтительно ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15 для миостатина (см. фиг. 4 и 5 в данном описании). Предпочтительно гуманизированное антитело по данному изобретению будет связываться с тем же эпитопом, что и ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15, раскрытые в данном описании. Указанное антитело может быть идентифицировано по его способности конкурировать с ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15 за связывание со зрелым миостатином или пептидом с последовательностью, показанной в 8ЕЦ Ш N0: 46 или 43.

В целом, гуманизированные антитела получают путем получения последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих НСУК и ЬСУК антитела, которые связываются с эпитопом миостатина по изобретению, идентификацией участков СЭВ в указанных НСУК и ЬСУК (нечеловеческих) и пересадки таких кодирующих СЭК последовательностей нуклеиновой кислоты в выбранные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческий каркас. Предпочтительно последовательности аминокислот человеческого каркаса выбираются таким образом, что полученное антитело, вероятно, будет пригодным для введения ίη νίνο людям. Это может быть определено, например, на основе предварительного применения антител, содержащих такую последовательность человеческого каркаса. Предпочтительно последовательность человеческого каркаса сама по себе не будет в значительной степени иммуногенной.

Альтернативно, аминокислотные последовательности каркасов для антитела, подлежащего гуманизации (например, ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15), будут сравниваться с таковыми известных последовательностей человеческого каркаса последовательности человеческого каркаса, подлежащие использованию для пересадки СЭК, будут выбираться на базе включенных последовательностей, в большой степени сходных с последовательностями исходного антитела, например мышиного антитела, которое связывается с миостатином. Выделены многочисленные последовательности человеческого каркаса и их последовательности раскрыты в уровне техники. Это повышает вероятность того, что полученное гуманизированное антитело с пересаженным СЭК, которое содержит участки СЭК исходного (например, мышиного) антитела, пересаженные на выбранные человеческие каркасы (и возможно также на константный участок человека), будут в существенной мере сохранять антигенсвязывающую структуру и, таким образом, сохранять связывающую способность исходного антитела. Для сохранения в значительной мере антигенсвязывающей способности выбранные человеческие каркасные области предпочтительно будут такими, что ожидается, что они будут пригодными для введения ίη νίνο, т.е. неиммуногенными.

В любом способе получают последовательность ДНК, кодирующую участки НСУК и ЬСУК предпочтительно мышиного антимиостатинового антитела. Способы клонирования последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих иммуноглобулины, хорошо известны из уровня техники. Такие способы могут, например, включать амплификацию кодирующих иммуноглобулины последовательностей, которые подлежат клонированию, с использованием подходящих праймеров путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры, пригодные для амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты иммуноглобулина и, конкретно, последовательностей мышиных НСУК и ЬСУК, опубликованы в литературе. После клонирования таких кодирующих иммуноглобулин последовательностей они будут секвенированы способами, хорошо известными из уровня техники.

- 18 014112

Как только идентифицированы последовательности ДНК, кодирующие участки СОК и каркасные области антитела, подлежащего гуманизации, то идентифицируют последовательности аминокислот, кодирующие участки СОК (методом дедукции на базе последовательностей нуклеиновой кислот и генетического кода, а также путем сравнения с предыдущими последовательностями антитела), и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие СОК, пересаживают на выбранные последовательности, кодирующие человеческий каркас. Это может осуществляться с использованием соответствующих праймеров и линкеров. Способы выбора подходящих праймеров и линкеров для праймирования для лигирования целевых последовательностей нуклеиновой кислоты входят в рамки навыков среднего специалиста в данной области.

После того как кодирующие СЭК последовательности пересажены на выбранные последовательности, кодирующие человеческий каркас, полученные последовательности ДНК, кодирующие гуманизированные последовательности вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей далее экспрессируют для получения гуманизированного Ρν или гуманизированного антитела, которое связывается с миостатином. Типично, гуманизированные НСУК и ЬСУК экспрессируют как часть целой молекулы антимиостатинового антитела, т.е. как белок слияния с последовательностями константного участка человека, для которых кодирующие их последовательности ДНК были получены из коммерчески доступной библиотеки или которые были получены с применением, например, одного из описанных выше способов получения последовательностей ДНК или описанных в уровне техники. Однако последовательности НСУК и ЬСУК также могут экспрессироваться в отсутствие константных последовательностей для выработки гуманизированного антимиостатинового Ρν. В любом случае слияние человеческих константных последовательностей потенциально является желательным, поскольку полученное гуманизированное антимиостатиновое антитело может обладать человеческими эффекторными функциями.

Способы синтеза ДНК, кодирующей белок с известной последовательностью, хорошо известны из уровня техники. С применением таких способов синтезируют последовательности ДНК, кодирующие субъект гуманизированные последовательности НСУК и ЬСУК (с константными участками или без них), и затем экспрессируют в системе вектора, подходящей для экспрессии рекомбинантных антител. Это может быть осуществлено любой системой векторов, которая обеспечивает экспрессию субъекта гуманизированных последовательностей НСУК и ЬСУК как белков слияния с человеческими последовательностями константного домена и связывание для получения функциональных (антигенсвязывающих) антител или фрагментов антител.

Человеческие последовательности константного домена хорошо известны из уровня техники и описаны в литературе. Предпочтительные последовательности константной легкой цепи включают последовательности константной легкой цепи каппа и лямбда. Предпочтительные человеческие последовательности константной тяжелой цепи включают человеческую гамма 1, человеческую гамма 2, человеческую гамма 3, человеческую гамма г и их мутантные версии, которые обеспечивают измененный эффект или функцию, например увеличивают период полувыведения ίη νίνο, уменьшают связывание с рецептором Рс и т.п.

Человеческие каркасные области, если они присутствуют, предпочтительно происходят из вариабельного участка человеческого антитела, имеющего последовательность, сходную с аналогичным или эквивалентным участком антигенсвязывающего участка донора. Другие источники каркасных областей для участков гуманизированного антитела человеческого происхождения включают человеческие вариабельные консенсусные последовательности (см., например, КеШеЬогоидк С.А. е1 а1. РгсЛет Бпдтеегтд 4:773-783 (1991); Сайег е1 а1., XV0 94/04679). Например, последовательность антитела или изменчивого участка, которая используется для получения нечеловеческого участка, может сравниваться с человеческими последовательностями, как описано в КаЬа1 е1 а1. 8ес.|иепсе5 белков οί Iттиηο1οд^са1 БИегеН, ΡίΓΐΙι Εάίίίοη, МН, и.8. Соуегптеп! Ргтйпд 0йюе (1991). В особенно предпочтительном воплощении каркасные области цепи гуманизированного антитела происходят из человеческого вариабельного участка, обладающего по меньшей мере 60% идентичностью общей последовательности, предпочтительно по меньшей мере 70% идентичностью общей последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью общей последовательности, с вариабельным участком нечеловеческого донора. Человеческий участок также может происходить из человеческого антитела, которое обладает по меньшей мере около 65% идентичностью последовательности и предпочтительно по меньшей мере 70% идентичностью последовательности в рамках конкретного участка (например, РК), которая должна быть использована, при сравнении с эквивалентным участком (например, РК) нечеловеческого донора.

В некоторых случаях гуманизированные антитела, образованные пересадкой участков СЭК (из антитела, которое связывается с миостатином), на выбранные человеческие каркасы, могут давать гуманизированные антитела с желательным сродством к миостатину. Однако может быть необходимым или желательным далее модифицировать конкретные остатки выбранного человеческого каркаса с целью усиления связывания с антигеном. Предпочтительно такие каркасные остатки исходного (например, мышиного) антитела, которые поддерживают или влияют на структуры объединяющего сайта, будут сохранены. Данные остатки могут быть идентифицированы путем рентгеновской кристаллографии исходного антитела или фрагмента РаЬ, таким образом идентифицируя трехмерную структуру антигенсвя

- 19 014112 зывающего сайта.

В следующих ссылках описаны способы, задействованные в гуманизации мышиного антитела, которые могут применяться: Циееп е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 88:2869, 1991; патент США № 5693761; патент США № 4816397; патент США № 5225539; компьютерные программы ΛΒΜΟΌ и ЕЫСАЭ, как описано в Ьеуй!, Μ., 1. Мо1. Βΐο1. 168:595-620, 1983.

Антитела по настоящему изобретению полезны в терапевтических, диагностических и исследовательских приложениях, как описано в данном описании. Антитело по изобретению может применяться для диагностики расстройства или заболевания, связанного с экспрессией человеческого миостатина. Подобным образом, антитело по изобретению может применяться в пробе для контроля уровней миостатина у субъекта, получающего лечения в связи со связанным с миостатином состоянием. Диагностические пробы включают способы использования антитела по изобретению и метки для обнаружения миостатина в образце, например, в биологической жидкости человека или в клетке или в экстракте ткани. Связывающие композиции, такие как, например, антитела, применяют с модификацией или без нее и метят ковалентным или нековалентным присоединением фрагмента, который поддается обнаружению. Фрагмент, который поддается обнаружению, может быть любым, который способен вырабатывать прямо или непрямо сигнал, который поддается обнаружению. Например, фрагмент, который поддается обнаружению, может представлять собой радиоизотоп, такой как, например, Н, С, Р, 8 или I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена. Может применяться любой способ, известный из уровня техники, для отдельного конъюгирования антитела с фрагментом, который поддается обнаружению, в том числе методы, описанные в Нии1ег, е! а1., №1Шге 144:945, 1962; Оау1б. е! а1., В1осйеш181гу 13: 1014, 1974; Рат, е! а1., 1. 1ттипо1. Ме111. 40: 219, 1981 и Ыудгеи, 1. Н18!осйет. Апб СуЮсйет. 30: 407, 1982.

Из уровня техники известно множество традиционных протоколов измерения миостатина, включая, например, пробы ЕЫ8Л. К1А и РАС8, которые обеспечивают основу для диагностики измененных или аномальных уровней экспрессии миостатина. Нормальные или стандартные значения экспрессии определяют с применением любой известной из уровня техники методикий, например комбинируя образец, включающий миостатиновый полипептид, например, с антителами в условиях, пригодных для образования комплекса антиген/антитело. Антитело прямо или косвенно метят субстанцией, поддающейся обнаружению, для облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела. Пригодные субстанции, поддающиеся обнаружению, включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примеры люминесцентного материала включает люминол и примеры радиоактивного материала включают ¹²⁵1, ¹³¹1, ³⁵8 или ³Н (см., например, 2о1а, Мопос1опа1 Ап!1Ьоб1е8. А Маииа1 о£ Тес11пк|ие5. СКС Ргезз, 1пс. (1987)).

Количество образовавшегося стандартного комплекса измеряют с помощью различных методов, таких как, например, фотометрические средства. Количества миостатинового полипептида, которые экспрессируются в субъекте, контролируют и образцы (например, из биопсированной ткани) затем сравнивают со стандартными значениями.

Отклонение между стандартными и установленными для субъекта значениями параметров для корреляции конкретного расстройства, состояния, синдрома или заболевания с определенным уровнем экспрессии (или ее отсутствия) миостатинового полипептида.

Как только установлено присутствие расстройства, состояния, синдрома или заболевания и начата схема лечения, пробы повторяют на регулярной основе для контроля уровня экспрессии миостатина. Результаты, полученные для удовлетворительных проб, используют для демонстрации эффективности лечения в течение периода, который длится от нескольких дней до месяцев. С учетом конкретных расстройств (например, дряхлость или кахексия) присутствие измененного количества миостатина в биопсии ткани или жидкости (например, сыворотка или моча) от субъекта может показывать предрасположенность к развитию расстройства, состояния, синдрома или заболевания, или может обеспечивать средства для обнаружения такого расстройства, состояния, синдрома или заболевания до появления фактических клинических симптомов, или может определять популяцию, которая с большей вероятностью будет отвечать терапевтически на антитело по изобретению. Более определяющее начальное обнаружение может дать возможность более раннего лечения и, таким образом, предупреждения и/или уменьшения дальнейшего прогресса пролиферации клеток.

Антитело по изобретению может быть введено в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту. Соединения по изобретению могут вводиться отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентами, в виде однократной или множественных доз. Фармацевтические композиции для введения разрабатываются подходящими для выбран

- 20 014112 ного способа введения с надлежащим использованием фармацевтически приемлемых разбавителей, носителя и/или эксципиентов, таких как диспергирующие агенты, буферы, сурфактанты, консерванты, солюбилизирующие агенты, агенты для создания изотоничности, стабилизаторы и т.п. Указанные композиции разрабатываются в соответствии с традиционными методами, как, например, описанные в Κ^^η^ΐοη, ТНе 8с1Спсс αηά Ргасйсе ο£ Рйагтасу, 19⁴¹¹ ЕбНю!! Сеηηа^ο, Ей., Маск РиЫйктд СЪ., ЕакФщ РА 1995, который обеспечивает исчерпывающее руководство по методам создания препаратов, в целом известных практикующим специалистам.

Фармацевтическая композиция, которая включает антимиостатиновое моноклональное антитело по данному изобретению, может вводиться субъекту, для которого существует риск появления патологии, как описано в данном описании, с применением стандартных методик введения, в том числе перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутрилегочно, трансдермально, внутримышечно, интраназально, буккально, сублингвально или в виде свечей.

Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно представляет собой терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество антитела по изобретению. Терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное с точки зрения доз и необходимых периодов времени для достижения желательного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность антитела или части антитела вызывать у индивидуума желательный ответ. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое, при котором польза от терапевтического воздействия перевешивает любые токсические или вредное действия антитела. Профилактически эффективное количество означает количество, эффективное в дозах и с точки зрения необходимых периодов времени для достижения желательного профилактического результата. Типично, поскольку профилактическая доза применяется у субъекта до начала или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Терапевтически эффективное количество представляет собой, по меньшей мере, минимальную дозу, но меньше токсической дозы, активного ингредиента, которая необходима для оказания терапевтического действия у субъекта. Иначе говоря, терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, увеличивает мышечную массу, увеличивает костную плотность или лечит состояния, при которых присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию или уменьшение уровней миостатина ведет к благоприятному терапевтическому воздействию у млекопитающего, предпочтительно человека, в том числе, не ограничиваясь ими, мышечное истощение, дряхлость, возрастная саркопения, остеопороз, ожирение, мышечная дистрофия любого типа, реанимационная миопатия, сепсис, кахексия (например, связанная с раком или вызванная ВИЧ), ХОЗЛ, остеоартрит, почечная недостаточность, печеночная недостаточность, сердечная недостаточность или заболевания сердца, метаболический синдром и диабет II типа.

Способ введения антитела по данному изобретению может быть пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть введены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин парентеральный в данном описании включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Периферическая системная доставка путем внутривенной или внутрибрюшинной или подкожной инъекции является предпочтительной. Походящие растворители для таких инъекций понятны из уровня техники.

Фармацевтическая композиция типично должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в предусмотренном контейнере, в том числе, например, укупоренный флакон или шприц. Таким образом, фармацевтические композиции могут быть стерилизованы фильтрацией после приготовления рецептуры или другим способом сделаны приемлемыми с микробиологической точки зрения. Типичная композиция для внутривенной инфузии будет иметь объем жидкости 260-1000 мл, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или раствор Хенкса, и терапевтически эффективную дозу (например, от 1 до 100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и выраженности заболевания. Как хорошо известно в медицинской области, дозы для любого конкретного субъекта зависят от многих факторов, в том числе размера пациента, площади поверхности тела, возраста, а также от конкретного соединения, которое будет вводиться, пола, времени и способа введения, общего состояния здоровья и одновременного введения других медикаментов. Типичная доза может находиться, например, в интервале от 0,001 до 1000 мкг; однако дозы могут быть выше или ниже представленного примерного интервала, особенно с учетом перечисленных выше факторов. Схема ежедневного парентерального введения может составлять около 0,1 до приблизительно 100 мг/кг общей массы тела, предпочтительно от 0,3 до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно от приблизительно 1 до 1 мкг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мкг/кг массы тела в день. Прогресс может контролироваться с помощью периодической оценки. Для повторного введения на протяжении нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до достижения желательного угнетения заболевания. Однако другие схемы ле

- 21 014112 чения могут быть полезными и не исключаются. Желательная схема дозирования может вводиться путем введения однократного болюса, введения множественных болюсов или беспрерывной инфузией антител, в зависимости от образца фармакокинетического разрушения, которого хочет достигнуть врач.

Эти рекомендованные количества антител в большой степени подлежат терапевтической оценке. Ключевым фактором в выборе подходящей дозы и схемы введения является полученный результат. Факторы, которые следует рассматривать в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, область введения антитела, конкретный тип антитела, способ введения, расписание введения и другие факторы, известные специалистам в области медицины. Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и растворения в подходящем стерильном носителе перед использованием. Лиофилизация и растворение могут вести к различной степени потери активности антитела. Может возникнуть потребность в коррекции доз для компенсации этого явления. В целом, предпочтительным является рН от 6 до 8.

Терапевтическое применение.

Миостатин играет роль в развитии мышц и множества родственных расстройств и заболеваний (см., например, патентные заявки США 2003/0074680 и 2003/0082181). У взрослых мРНК миостатина в основном обнаружена в скелетной мускулатуре, хотя более низкие концентрации также найдены в жировой ткани и ткани сердца (8йагта, М., е1 а1, 1. Се11 Р11у5ю1. 180:1, 1999). Лишенные миостатина мыши имеют в 2-3 раза большую мышечную массу, чем их однопометные сородичи дикого типа. Увеличение мышечной массы является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (МсРйеггоп, А., е1 а1. №11иге 387:8390, 1997 и Ζΐιιι. X. е1 а1., РЕВ8 Ьебегк 474:71). Кроме того, лишенные миостатина мыши накапливают меньше жира, чем их дикие однопометные сородичи, но в других отношениях выглядят нормальными и здоровыми. Недавно показано также, что миостатин является важным регулятором образования жировой ткани (КеЬЬаргадаба, А., е1 а1., Мо1. апб Се11. Вю. 23:7230-7242, 2003). Кроме того, недавно исследована структура и содержание костной ткани у миостатин-дефицитных мышей (Натиск М.А., е1 а1., 1. Оййораебю Кекеагсй 21:1025, 2003; Натиск, М.А., е1 а1., Са1с1£ Т188ие 1п1. 71:63, 2002).

Таким образом, фармацевтическая композиция, включающая антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению, может использоваться для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или может быть полезна для лечения состояний, где присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию или снижение уровней миостатина оказывает терапевтическое действие у млекопитающих, в том числе, не ограничиваясь ими, состояния мышечного истощения, дряхлости, возрастной сарколении, остеопороза, ожирении, мышечной дистрофии, миопатии, кахексии, сепсиса, остеоартрита, ХОЗЛ, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или заболевания сердца, метаболического синдрома и диабета II типа.

В данном описании рассматривается применение антимиостатинового моноклонального антитела по данному изобретению для лечения или профилактики по меньшей мере одного из перечисленных выше расстройства, где активность миостатина наносит ущерб или пациент получит пользу от сниженных уровней биологически активного миостатина. Кроме того, рассматривается применение антимиостатинового моноклонального антитела по данному изобретению для получения лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из перечисленных выше расстройств.

В данном описании термины лечение, лечить и т.п. обозначают достижение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или побочного действия, связанного с заболеванием. Лечение в данном описании включает введение соединения по данному изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, особенно человека, и обеспечивает:

(a) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но данное заболевание еще не диагностировано у субъекта;

(b) ингибирование заболевания, т. е. остановку его развития; и (c) облегчение заболевания, т. е. вызов регрессии заболевания или расстройства или облегчение его симптомов или осложнений.

Схемы лечения могут корректироваться для обеспечения оптимального желательного ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может вводиться однократный болюс, могут вводиться несколько разделенных доз в течение периода времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как определяется конкретной терапевтической ситуацией.

Следующие примеры предлагаются исключительно для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.

- 22 014112

Примеры

Пример 1. Синтез антимиостатинового ЕаЬ.

Клоны антимиостатиновых ЕаЬ изолировали из библиотеки ЕаЬ, созданной путем иммунизации диких мышей С57В1/6 с применением технологии антител Оттс^ва!™ (Вюзйе®, 8ап 1)κ®ο, СА). Мышей иммунизировали иммуногенным полипептидом с последовательностью аминокислот АNΥС8СЕ8ЕЕУЕ^^КΥРНТН^УН^А (8ЕР ΙΟ N0: 43). Данная последовательность идентична последовательности, которая охватывает аминокислоты 40-64 зрелой формы человеческого миостатина (8ЕР ΙΟ N0: 2), за исключением того, что остаток Суз в положении 47 в зрелом человеческом миостатине дикого типа (подчеркнуты в 8ЕР ΙΟ N0: 43 выше) заменен на остаток 8ег для предупреждения связывания носителя или неполный антиген с пептидом около этого остатка. Для улучшения иммуногенных свойств данного пептида белок-носитель, гемоцианин лимфы улитки и хелперный пептид Т-клетки конъюгированы с иммуногенным пептидом в соответствии со стандартными способами. НСУК и ЬСУК СЭК, а также аминокислотные последовательности каркаса, раскрытые в данном описании (табл. 1 и 2, фиг. 4 и 5), идентифицируют как последовательности ЕаЬ из библиотеки, которые связываются со зрелым миостатином (например, 8Е(9 II) N0: 2), а также связываются с иммуногенным пептидом и нейтрализуют активность миостатина. Репрезентативные последовательности нуклеотида, кодирующего ЬСУК и НСУК ЕаЬ, приведены в табл. 3.

Таблица 3

Репрезентативные последовательности нуклеотида, кодирующего ЕаЬ ЬСУК и НСУК

ЬСУК (8ЕР Ι0 N0: 44)

5' сааа'ЕЕд'Ь'Ьс'Ьсасссад'ЬсЕссадсааЕса'ЬдЕсЕдса'Ес'ЬссаддддадааддЕсасс аЕдассЕдсад'Ьдссадс'Ьсаад'Ьа-Ьаад'ЬЕасаЕдсасЕддЕассадсадаадссаддсас сЕсссссаааадаЕдда'ЬЕЕаЕдасасаЕссааас'Ьддс'ЬЕсЕддадЕсссЕдсЕсдсЕЕса д-Ьддсад‘Ьддд'Ес‘Ьдддасс-Ьс'ЬЕас'Ьс‘ЬсЕсасаа'ЬсадсадсаЕддаддс'ЬдаадаЕдсЕ дссасΐ.Ьаΐ.^ас^дссадсад^ддЬа^адЬаасссас^сасдί1ΐ1сдд·^дсύдддассаадс^1 ддадс'Ьдааасдддс'Ьда'Ь 3'

НСУК (8ЕР Ι0 N0: 45)

5' саддСЕасдсЕдааададЕс'Ьддссс'Ьддда’ЬаЕЕдсад'Ьсс’Ьсссадассс'ЬсадЕс'Ьд асЕЕд-Ь'ЕсЕсЕсЕсЕдддЕ'Ь-Ь-ЬсасЕдадаасдСс'Ьдд’ЬаЕдад’Ьд-ЬдадсЕдда'Ь’ЬсдЕса дЕсЕЕсаддаааддд'ЬсЬддад’ЬддсЕддсасасаЕ'ЬЕа'Ь'Ьддда'Ьда'Ьдасаадсдс'Ьа'Ьа ассса'Ьссс-ЬдаддаассдасЕсасаа’ЬсСссааддаЕасс'ЫздадааассаддСс-Ь-Ьсс’Ьс аадаЕсассадСдЕдддсасЕдсада'ЬасЕдссасаЕас'ЬасСдСдсЕсдаададсСаЕЕас Ьасдд’ЬааЕадддддадддасЕаСддас’басЕддддЕсааддаассЕсад'Ьсассд'ЬсЕсс-Ь са 3'

Пример 2. Анализ ЕЫ8А.

А. Антимиостатиновые ЕаЬ преимущественно связываются со зрелым миостатином.

Мышиные антимиостатиновые ЕаЬ по настоящему изобретению (см. фиг. 4 и 5) исследовали в анализе ΕΙ.Ι8.Λ, в котором измеряли связывание ЕаЬ со зрелым миостатином (димерная форма), которым в различных концентрациях покрыта 96-ячейковая пластина. Также исследовали связывание ЕаЬ с СОЕ-11.

Каждую ячейку 96-ячеичных планшетов покрывали 70 мкл рекомбинантного мышиного миостатина (системы К&1), кат. № 788-С8/СЕ, свободный от носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) или 70 мкл рекомбинантного человеческого СЭЕ-11 (Рерго1есЪ, Итс. кат. № 120-11, свободный от носителя 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4°С в течение ночи. Содержимое ячеек извлекают аспирацией и дважды промывают промывающим буфером (20 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,1% Т\\'ееп-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% СапиПюп Ι^Ι^ί т11к в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 5 ч.

ЕаЬ исследовали разведенными в блокирующем буфере при 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл; 50 мкл каждого раствора ЕаЬ добавляли к ячейкам, покрытым СЭЕ-8 и САЕ-11 в двойном повторении. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Ячейки затем промывают трижды промывочным буфером.

Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-НКР (8οιιΐΙκτη Вю1есЕ), разведенного 1:2000 в блокирующем буфере) добавляют в каждую ячейку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Ячейки затем промывают трижды промывочным буфером; 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата 0РЭ) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 13 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. НС1 в каждую ячей

- 23 014112 ку. Поглощение ячеек измеряют при длине волны 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двух повторениях.

Полученные данные демонстрируют, что ЕаЬ 3, 5 и 7 по изобретению (фиг. 4 и 5) связываются со связанным с пластиной зрелым миостатином человека и преимущественно связываются с миостатином в сравнении со связыванием СЭЕ-11.

B. Антимиостатиновые ЕаЬ связываются с пептидным иммуногеном миостатина (1).

Мышиные антимиостатиновые ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 исследовали при помощи анализа ЕЫ8А, в котором измеряли связывание ЕаЬ с полипептидом, который использовали для иммунизации мышей (пептидный иммуноген). Данный полипептид охватывает аминокислоты 40-64 зрелого миостатина и имеет последовательность аминокислот АNΥС8СЕ8ЕЕVЕ^^КΥРΗΤΗ^VΗ^А (8ЕС ΙΌ N0: 43), как раскрыто в данном описании.

Каждую ячейку двух 96-ячеичных планшетов покрывали 70 мкл пептидного иммуногена, который использовали для создания ЕаЬ (2 мкг/мл) в карбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты инкубировали в сухой печи при 37°С в течение ночи с удаленными крышками. Содержимое ячеек извлекали аспирацией и дважды промывали промывочным буфером (20 мМ трис-(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,1% Т\уееп-20). Планшеты блокировали с помощью 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% молоко ВюКаб для блоттинга в указанном выше промывочном буфере) в течение 2,5 ч.

ЕаЬ разбавляли блокирующим буфером до концентрации при 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл. Крысиное антимиостатиновое моноклональное антитело (К&Э 8у51еш5, кат. № МАВ788, клон № 84214) и поликлональное антимиостатиновое антитело (К&Э 8у51еш5, кат. № АЕ788) использовали в качестве контроля при указанных выше концентрациях и также разбавляли блокирующим буфером; 50 мкл каждого раствора антитела добавляли к ячейкам, покрытым пептидом в двойном повторении. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером.

Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-НКР (8ои111егп Вю1ес11) для ЕаЬ, 50 мкл мышиного антикрысиного (Заскюп ШтипоКекеагсй) для моноклонального, 50 мкл кроличьего антикозьего (Засккоп 1тшипоКе8еагсй) для поликлонального, все разведены 1:2000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером. 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата ОРЭ) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н. НС1 в каждую ячейку. Поглощение ячеек измеряли при 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двойном повторении; полученные значения приведены в табл. 4.

ЕаЬ связываются со связанным с планшетом пептидным иммуногеном. Поликлональное антитело также связывается с пептидным иммуногеном в меньшей степени, чем ЕаЬ. Связывание моноклонального антитела К&Э соответствует базовым уровням, что согласуется с тем, что моноклональное тело К&Э распознает другой эпитоп, чем тот, который охватывается иммуногенным пептидом.

C. Связывание антимиостатиновых ЕаЬ с различными членами суперсемейства ТСЕ-β.

Мышиные антимиостатиновые ЕаЬ 3, 5, 7 (см. фиг. 4 и 5) и поликлональное антимиостатиновое антитело (К&Э 8у51еш5) исследовали при помощи анализа ЕЫ8А, где измеряли связывание ЕаЬ и антитела с членами семейства антигена (СЭЕ-8/миостатин), которым покрыта ячейка. Исследовали связывание ЕаЬ со следующей панелью членов суперсемейства ТСЕ-β: СЭЕ-11, ВМР-2, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7, Активин А, Активин В, ТСЕ-α, ТСЕ-β 1 и ТСЕ-βΣ. Также тестировали 1СЕ-1 как отрицательный контроль.

Каждую ячейку 96-ячеичного планшета покрывали 70 мкл одного из перечисленных выше факторов роста (10 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) в двойном повторении. См. табл. 5 ниже относительно источников и номеров в каталоге. Планшеты инкубировали в течение 4°С в течение ночи. Содержимое ячеек извлекали аспирацией и дважды промывали промывочным буфером (20 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 М №С1, 0,1% Т\уееп-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% быстрорастворимого молока Сагпабоп в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 3 ч.

Антитела разводили в блокирующем буфере до 10 мкг/мл; 50 мкл каждого раствора антитела добавляли к ячейкам, покрытым фактором роста. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывают промывочным буфером.

Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-НКР (8ои111егп Вю1ес11) для ЕаЬ, 50 мкл кроличьего антикозьего (Заскюп 1тшипоКе8еагсй) для поликлонального, разведенного 1:2000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером; 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата ОРЭ) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н. НС1 в каждую ячейку. Поглощение ячеек измеряли при 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двойном повторении, полученные

- 24 014112 значения приведены в табл. 6.

Полученные данные демонстрируют, что РаЪ 3, 5 и 7 преимущественно связываются с миостатином в сравнении с другими исследованными белками. Отсутствие связывание или незначительное связывание в сравнении с фоновыми значениями обнаружены для РаЪ и любого из других членов суперсемейства ΤΟΕ-β при этих условиях, за исключением очень небольшого связывания РаЪ 3 с ΟΌΡ-11. Однако Κ&Ό антимиостатиновое поликлональное антитело также связывается с 601-11 (см. табл. 6).

Таблица 5

Компания-поставщик Номер в каталоге

ΟϋΕ-8	Β&ϋ	ВузЬетз
СЮЕ-11	РергоЬесН,
Ι6Ε-1	В&О	ВузЬетз
ВМР-2	В&О	ВузЬетз
ВМР-5	Κ&ϋ	ВузЬетз
ВМР-6	Р.& В	ВузЪетз
ВМР-7	в&о	ВузЬетз
Активин А	в&о	ВузЬетз
Активин В	Κ&ϋ	ВузЬетз
ТСЕ-а	Β&ϋ	ВузЬетз
ТСЕ-Ы	РергоТесЬ,

788-68/СЕ

120-11

291-01

355-ВЕС/СЕ

615-ВМ

507-ВР

354-ВР

338-АС

659-АВ

239-А

100-21К

ТСЕ-Ъ2 РергойесЬ, 1пс. 100-35 '

Таблица 6

	СОЕ-8	СОЕ-11	1СЕ-1	ВМР-2	ВМР-5	ВМР-6
В&О поли	2,941	2,621	0,045	0,0525	0,038	0,0745
ГаЬ 3	0,4195	0,0705	0,034	0,0345	0,034	0,0335
ЕаЬ 5	0,202	0,034	0,035	0,032	0,033	0,0325
ГаЬ 7	0,358	0,04	0,034	0,0335	0,0345	0,035
	ВМР-7	Активин	А Активин	В ТСЕ-а	ТСГ-Ы	ТСГ-Ь2
В&О поли	0,042	0,049	0,0485	0,0445	0,0425	0,0525
ГаЬ 3	0,033	0,033	0,032	0,033	0,034	0,034
ГаЬ 5	0,032	0,033	0,033	0,033	0,0325	0,034
ГаЬ 7	0,031	0,0325	0,031	0,0315	0,032	0,0345

Пример 3. Проба нейтрализации миостатина.

Эктодермальные эксплантаты извлекали из стадии 8-9 бластулы эмбрионов Хеворш с помощью стандартных процедур и культивировали в 0,5Х МВ8 (1Х МВ8: 88 мМ №С1, 1 мМ КС1, 0,7 мМ СаС1₂, 1 мМ Мд80₄, 5 мМ НЕРЕ8, 2,5 мМ №11СС)₃, 1:1000 об./об. гентамицина, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением фактора роста (ΟΌΕ8 или 601-11), плюс или показано, в течение 18 часов при 18°С, к этому моменту контрольные эмбрионы достигают стадии ранней неврулы (стадия 15-16). Эксплантаты фотографировали и длину каждого эксплантата измеряли с использованием алгоритма анализа изображений, разработанного для количественного определения анимального полюса. Экспланты, не обработанные ни фактором роста, ни ΡаЪ (контроль), погружали в шарики эпидермиса. Миостатин и ΟΌΕ-11 индуцирует мезодерм в данных эктодермальных эксплантатах, что вызывает удлинение эксплантатов и формирование гантелеподобных структур. Антитела к ΡаЪ, при тестировании на предмет нейтрализующей активности, добавляли к среде культивирования, содержащей миостатин, на всем протяжении периода культивирования и оценивали их способность ингибировать вызванные фактором роста движения продления. Миостатин добавляли к эксплантату в концентрации 25 нг/мл. Антитела к ΡаЪ добавляли в концентрации 20 мкг/мл. ΡаЪ34 представляет собой ΡаЪ, созданное с посторонним антигеном. Также исследовали коммерчески доступное антимиостатиновое поликлональное антитело; данное антитело вырабатывали козы, иммунизированные очищенным мышиным 601-8 и производителем, была продемонстрирована их способность нейтрализовать продление анимальных полюсов Хепори8, вызванное 25 нг/мл мышиного ΟΌΕ8, если они присутствовали в концентрации около 10-50 мкг/мл (Κ&Ό 8у81еш8, 1пс. кат. № АΡ788). Коммерчески доступные моноклональные антимышиные 601-8 исследовали, производителем продемонстрировано, что данное антитело нейтрализует удлинение анимальных полюсов Хепорик, вызванное 25 нг/мл мышиного 601-8, если они присутствуют в концентрации около 10-20 мкг/мл (Κ&Ό 8у81еш8 кат. № МАВ788). Следует отметить, что данные пробы ЕЫ8А в примере 2

- 25 014112 данного описания показывают, что данные К&Э антитела связываются с другим участком миостатина, чем ЕаЬ по данному изобретению.

Для обработки изображений использовали 1тадеРго (ν 4.5.1.22, от МеЛа СуЬетеБсз). Для автоматизации обработки изображений был написан макрос. Данный макрос обрабатывает изображение и записывает длину в единицах битов. Могут применяться альтернативные способы измерения, как известно из уровня техники. ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 способны в значительной степени нейтрализовать активность СЭЕ8 в пробе анимального полюса.

Пример 4. Измерение сродства моноклональных ЕаЬ.

Сродство значений (К_с) и К_оп и К_о££ антимиостатиновых ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 измеряли с использованием устройства В1Асоге® 2000, содержащего сенсорный чип СМ5. Устройство В1Асоге® использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для определения изменений концентрации белка взаимодействующих молекул в декстрановой биосенсорной матрице. За исключением оговоренных случаев, все реактивы и материалы покупали у В1Асоге® АВ (Ир8а1а, 8\\'ебеи).

Все измерения проводили при 25°С. Образцы, содержащие крысиный или человеческий миостатин, растворяли в буфере НВ8-ЕР (150 мМ натрия хлорид, 3 мМ ЭДТА, 0,0005% (мас.) сурфактанта Р-20 и 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4). Захватывающее антитело, козье антимышиное каппа-антитело (8ои1Еегп Вю1ес11по1оду. 1пс) иммобилизировали на проточных клетках с использованием химии аминного присоединения. Проточные ячейки (1-4) активировали в течение 7 мин смесью 0,1 М №гидроксисукцинимида и 0,1 М 3-(^№диметиламино)пропил-Ы-этилкарбодиимида 1:1 при скорости потока 10 мкл/мин. Козье антимышиное каппа-антитело (30 мкг/мл в 10 мМ раствора натрия ацетата, рН 4,5) вручную вводили инъекционно во все проточные ячейки при скорости потока 10 мкл/мин. Поверхностную плотность контролировали и при необходимости осуществляли инъекцию дополнительного количества козьего антимышиного каппа-антитела в отдельную клеточную ячейку для тех проточных ячеек, в которых поверхностная плотность достигла значений 4500-500 единиц эквивалента (КЕ8Р0^Е ИМТ8, КИ). Поверхность блокировали в течение 7 мин инъекцией 1 М этаноламина-НС1, рН 8,5 (10 мкл/мин). Для того чтобы убедиться в полном удалении козьих антимышиных каппа-антител, не связанных ковалентно, 15 мкл 10 мМ раствора глицина, рН 1,5 вводили дважды. Буфер пробы, который использовали для кинетических экспериментов, содержал 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,005% Р-20.

Сбор данных кинетики связывания осуществляли при максимальной скорости потока (100 мкл/мин) при низкой плотности поверхности для минимизации массовых транспортных эффектов. Каждый цикл анализа состоит из (ί) захвата 300-350 КИ ЕаЬ (Вю8Пе) путем инъекции 5-10 мкл раствора 5 мкг/мл в проточные ячейки 2, 3 и 4 для различных ЕаЬ при скорости потока 10 мкл/мин;

(ίί) инъекции 200 мкл (2 минуты) человеческого миостатина (интервал концентрации от 50 до 1,56 нМ с двукратными разведениями) во все 4 проточные ячейки с проточной ячейкой 1 как проточной ячейкой сравнения;

(ίίί) 10 мин диссоциации (поток буфера);

(ίν) регенерации поверхности козьих антимышиных каппа-антител с помощью 15 с инъекции 10 мМ раствора глицина, рН 1,5;

(ν) 30 с холостой инъекции буфера пробы и (νί) 2 мин стабилизации перед началом следующего цикла.

Сигнал контролировали как проточная ячейка 2 минус проточная ячейка 1, проточная ячейка 3 минус проточная ячейка 1 и проточная ячейка 4 минус проточная ячейка 1. Инъекции образцов и холостого буфера осуществляли в двукратном повторении в случайном порядке. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения В1Аеуа1иа1юп 3.1 и данные адаптировали к модели связывания 1:1 в программном обеспечении СЬАМР §1оЬа1 апа1у§18.

ЕаЬ 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 демонстрируют значения К_с между 7х10^-6 и 4,0х10^-8.

Пример 5. Мышиная модель скелетно-мышечной эффективности ίη νί\Ό.

Мышей-самцов 1СК (в возрасте 8 недель, Тасошс NΥ) кастрировали (гонадэктомия, СЭХ) в соответствии с зарегистрированными процедурами и позволяли гормонам вымываться из организма в течение 10 недель. Также получали ложно оперированных (ложных) мышей соответствующего возраста. Ложно оперированные мыши обработаны таким же способом, как и кастрированные, за исключением того, что их яички не удаляли. Животных содержали в комнате с контролируемой температурой (24°С) с обращенным 12-часовым циклом света и темноты и со свободным доступом к воде и пище.

Для демонстрации эффективности ίη νί\Ό соединение по данному изобретению вводили каждую вторую неделю подкожной инъекцией кастрированным мышам в возрасте 18 недель (масса тела около 48-50 г) и ложным мышам соответствующего возраста. Исследуемое соединение вводили животным в фосфатном буферном солевом растворе (ФБР). Кастрированным мышам вводили только согласованный изотип 1дС1 в качестве негативного контроля лечения. Исследуемым животным (12 мышей в каждой группе) вводили дозы на протяжении 15-недельного периода подкожно, приблизительно 60 мг/кг/каждые 2 недели соединения по данному изобретению. В каждой временной точке введения дозы дозу для вве

- 26 014112 дения корректировали в соответствии с массой тела каждого животного. Следующие измерения проводили в начале и в конце исследования: масса тела, мышечная масса тела (анализ с помощью количественного магнитного резонанса, ЦМЯ, ЕсНо Меб1са1 8ук!етк, ТХ) и бЯШ-ЗТЯЕЫбТН тела (Со1итЬик Шкйитейк, ОН).

После 15 недель лечения в качестве показателя мышечной активности определяли влажную массу скелетной мышцы (квадрицепс) в исследуемых группах и сравнивали с массой в группе кастрированных животных, получавших только ЦС. В качестве показателя активности скелета костную массу (минеральная плотность кости, ВМО, мг/см³) бедренных костей исследуемых животных подобным образом сравнивали с костной массой бедренных костей в группе кастрированных животных, получавших только ЦС, с помощью микрокомпьютерной томографии (ЦМЯ, ЕсНо Меб1са1 8ук!етк, ТХ) и прочности хватки (Ьобу дпр-к!гепд!й, Со1итЬик Шкйитейк, ОН). Антимиостатиновое антитело, включающее ЕаЬ 3, в описанных условиях оказывало анаболическое действие как на мышцы, так и на кости.

- 27 014112

Список последовательностей <110> Ε1Ϊ ЬШу апй Сотрапу <120> Антисмысловые антитела <130> Х-16397 <140> из 60/559,621 <141> 2004-04-05 <150> из 60/555,456 <151> 2004-03-24 <160> 56 <170> РаРепЫп νθΓδίοη 3.3 <210> 1 <211> 375 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 1

Мер 1

С1п Ьуз Ьеи

С1п Ьеи 5

Суз Уа1

Туг

11е Туг 10

Ьеи

РЬе

Мер

Ьеи 15

Не

Уа1

А1а

С1у

Рго

Уа1

Азр

Ьеи

Азп

С1и

Азп

Зег

С1и

С1п

Ьуз

61и

Азп

20

25

30

Уа1

С1и

Ьуз

С1и

С1у

Ьеи

Суз

Азп

А1а

Суз

ТЬг

Тгр

Агд

61п

Азп

ТЬг

35

40

4 5

Ьуз

Зег

Агд

11е

С1и

А1а

Не

Ьуз

Не

61п

Не

Ьеи

Зег

Ьуз

Ьеи

50

55

60

Агд

Ьеи

61и

ТЬг

А1а

Рго

Азп

Не

Зег

Ьуз

Азр

Уа1

11е

Агд

С1п

Ьеи

65

70

75

80

Ьеи

Рго

Ьуз

А1а

Рго

Ьеи

Агд

С1и

Ьеи

11е

Азр

С1п

Туг

Азр

Уа1

85

90

95

С1п

Агд

Азр

Зег

Азр

С1у

Зег

Ьеи

61и

Азр

Туг

Нхз

100

105

НО

А1а

ТЬг

С1и

ТЬг

11е

Не

ТЬг

Мер

Рго

ТЬг

С1и

Зег

Азр

РЬе

Ьеи

115

120

125

Мер

С1п

Уа1

Азр

С1у

Ьуз

Рго

Ьуз

Суз

РЬе

Ьуз

РЬе

Зег

130

135

140

Ьуз

11е

С1п

Туг

Азп

Ьуз

Уа1

Ьуз

А1а

61п

Ьеи

Тгр

Не

Туг

Ьеи

145

150

155

160

Агд

Рго

Уа1

61и

ТЬг

Рго

ТЬг

Уа1

РЬе

Уа1

С1п

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

165

170

175

Не

Ьуз

Рго

Мер

Ьуз

Азр

С1у

ТЬг

Агд

Туг

ТЬг

61у

Не

Агд

Зег

Ьеи

180

185

190

- 28 014112

Ьуз

Ьеи

Азр 195

Мей Азп

Рго

С1у

ТЬг С1у 200

11е

Тгр

С1п

Зег 205

11е

Азр

Уа1

Ьуз

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1п

Азп

Тгр

Ьеи

Ьуз

С1п

Рго

С1и

Зег

Азп

Ьеи

С1у

210

215

220

Не

С1и

11е

Ьуз

А1а

Ьеи

Азр

С1и

Азп

С1у

Н13

Азр

Ьеи

А1а

Уа1

ТЬг

225

230

235

240

РЬе

Рго

С1у

Рго

С1у

С1и

Азр

С1у

Ьеи

Азп

Рго

РЬе

Ьеи

С1и

Уа1

Ьуз

245

250

255

Уа1

ТЬг

Азр

ТЬг

Рго

Ьуз

Агд

Зег

Агд

Азр

РЬе

С1у

Ьеи

Азр

Суз

260

265

270

Азр

С1и

ΗΪ3

Зег

ТЬг

61и

Зег

Агд

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

275

280

285

Азр

РЬе

С1и

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр

Тгр

11е

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

290

295

300

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

С1у

С1и

Суз

С1и

РЬе

Уа1

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

305

310

315

320

Туг

Рго

ΗΪ3

ТЬг

ΗΪ3

Ьеи

Уа1

Низ

61п

А1а

Азп

Рго

Агд

С1у

Зег

А1а

325

330

335

С1у

Рго

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

Мер

Зег

Рго

Не

Аз п

МеЕ

Ьеи

Туг

340

345

350

РЬе

Азп

С1у

Ьуз

С1и

С1п

11е

Туг

С1у

Ьуз

11е

Рго

А1а

Мер

Уа1

355

360

365

Уа1

Азр

Агд

Суз

С1у

Суз

Зег

370 375 <210> 2 <211> 109 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 2

Азр 1

РЬе

С1у

Ьеи Азр Суз 5

Азр

С1и Низ

Зег 10

ТЬг

С1и

Зег

Агд

Суз 15

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

РЬе

С1и

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр

Тгр

Не

20

25

30

11е

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

С1 у

С1и

Суз

С1и

35

40

45

РЬе

Уа1

РЬе

Ьеи

С1п

Ьуз

Туг

Рго

ΗΪ8

ТЬг

Н13

Ьеи

Уа1

ΗΪ3

С1п

А1а

50

55

60

Азп

Рго

Агд

61у

Зег

А1а

С1у

Рго

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

Мер

Зег

65

70

75

80

Рго

11е

Азп

МеЬ

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

С1у

Ьуз

61и

С1п

11е

Не

Туг

С1у

85

90

95

- 29 014112

Ьуз Не Рго А1а Мей Уа1 Уа1 Азр Агд Суз С1у Суз

100 105

Зег <210> 3 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 3
С1п	Не	\⁷а1	Ьеи	тъг	С1п	3 с х?	Рго
1				5
С1и	Ьуз	Уа1	ТЬг 20	МеЬ	ТЬг	Суз	Зег
Низ	Тгр	Туг 35	С1п	С1п	Ьуз	Рго	С1у 40
Азр	ТНг 50	Зег	Ьуз	Ьеи	А1а	Зег 55	С1у
С1у 65	Зег	С1у	ТЬг	Зег	Туг 70	Зег	Ьеи
Азр	А1а	А1а	ТЬг	Туг 85	Туг	Суз	Θΐη
РЬе С1у А1а С1у 100 <210> 4 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр. <400> 4	ТЬг	Ьуз	Ьеи	С1и
С1п 1	Уа1	Уа1	Ьеи	ТЬг 5	Θΐη	Зег	Рго
С1и	Ьуз	Уа1	ТЬг 20	МеЬ	ТЬг	Суз	Зег
НЬз	Тгр	Туг 35	С1п	С1п	Ьуз	Зег	С1у 40
Азр	ТЬг 50	Зег	Ьуз	Ьеи	А1а	Зег 55	61у
С1у 65	Зег	С1у	ТЬг	Зег	Туг 70	Зег	Ьеи
Азр	А1а	А1а	ТЬг	Туг 85	Туг	Суз	С1п
РЬе	С1у	А1а	С1у 100	ТЬг	Ьуз	Ьеи	С1и

а. 11ο Ά1·3. Ρτ?ο

	10					15
А1а 25	Зег	Зег	Зег	Не	Зег 30	Туг	МеЬ
ТЬг	Зег	Рго	Ьуз	Агд 4 5	Тгр	Не	Туг
Уа1	Рго	А1а	Агд 60	РЬе	Зег	С1у	Зег
ТЬг	Не	Зег 75	Зег	Мег	С1и	А1а	61и 80
С1п	Тгр 90	Туг	Зег	Азп	Рго	Ьеи 95	ТЬг
Ьеи 105	Ьуз	Агд	А1а	Азр

А1а 11е МеЬ Зег А1а Зег Ьеи 61у

	10					15
А1а 25	Зег	Зег	Зег	Уа1	ΗΪ3 30	Туг	МеЬ
ТЬг	Зег	Рго	Ьуз	Агд 45	Тгр	Не	Туг
Уа1	Рго	А1а	Агд 60	РЬе	Зег	С1у	Зег
ТЬг	Не	Зег 75	Зег	МеЬ	С1и	А1а	С1и 80
С1п	Тгр 90	Зег	Зег	Азп	Рго	Ьеи 95	ТЬг
Ьеи 105	Ьуз	Агд	А1а	Азр

- 30 014112 <210> 5 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 5

61η 1

Не

УаЬ

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Бег

Рго АТа

Не 10

МеТ

Бег АЬа

Бег

Рго 15

С1у

С1и

Ьуз

УаЬ

ТЬг

МеТ

ТЬг

Суз

Бег

АТа

Бег

УаТ

Бег

Туг

МеТ

20

25

30

Η13

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Бег

С1у

ТЬг

Бег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Бег

С1у

УаТ

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Бег

С1у

Бег

50

55

60

С1у

Бег

С1у

ТЬг

Бег

Туг

Бег

Ьеи

ТЬг

Не

Бег

Ме!

СТи

АЬа

С1и

65

70

75

80

Азр

АЬа

ТЬг

Туг

Суз

СТп

Тгр

Бег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

рЬе

С1у

АЬа

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СТи

Ьеи

Ьуз

Агд

АТа

Азр

100

105

<210> 6 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 6

СТп 1

Не

УаТ

Ьеи

ТЬг 5

СТп

Бег

Рго

АТа

Не 10

МеТ

Бег АТа

Зег

Рго 15

С1у

СТи

Ьуз

УаТ

ТЬг

МеТ

ТЬг

Суз

Бег

АТа

Бег

УаТ

Бег

Туг

МеТ

20

25

30

НЬз

Тгр

Туг

СТп

Ьуз

Бег

С1у

ТЬг

Бег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

4 5

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

АТа

Зег

СТу

УаТ

Рго

УаЬ

Агд

РЬе

Бег

С1у

Бег

50

55

60

СТу

Бег

СТу

ТЬг

Бег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

11е

Бег

МеТ

С1и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

АТа

ТЬг

Туг

Суз

СТп

Тгр

Зег

Агд

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

СТу

АТа

СТу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СТи

Ьеи

Ьуз

Агд

АТа

Азр

100

105

<210> 7

- 31 014112 <211> 109 <2Ь2> Белок <213> Миз зр.

<400> 7

С1п 1

УаЬ

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

АЬа

ЬЬе ьо

МеЕ

Зег

АЬа

Зег

Рго Ь5

СЬу

СЬи

Ьуз

УаЬ

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Суз

Зег

АЬа

Зег

ЬЬе

Зег

Туг

МеЕ

20

25

30

НЬз

Тгр

Туг

СЬп

61п

Ьуз

Рго

СЬу

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

ЬЬе

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

ЬЬе

Зег

МеЕ

СЬи

АЬа

СЬи

65

70

75

80

Азр

А1а

АЬа

ТЬг

Туг

Суз

СЬп

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

61 у

АЬа

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

Агд

АЬа

Азр

100

Ь05

<210> 8 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 8

СЬп Ь

ЬЬе

УаЬ

Ьеи

ТЬг СЬп 5

Зег

Рго

АЬа

ЬЬе ЬО

МеЕ

Зег

АЬа

Зег

Рго Ь5

СЬу

СЬи

Ьуз

УаЬ

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Суз

Зег

АЬа

Зег

ЬЬе

Зег

Туг

МеЕ

20

25

30

НЬз

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

ЬЬе

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

АЬа

Агд

РЬе

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

СЬу

Зег

СЬу

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

ЬЬе

Зег

МеЕ

СЬи

АЬа

СЬи

65

70

75

80

Азр

АЬа

ТЬг

Туг

Суз

СЬп

Тгр

Азп

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

СЬу

АЬа

СЬу

ТЬг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

Агд

АЬа

Азр

ЬОО

Ь05

<210> 9 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр.

- 32 014112

<400> 9

СЬп

УаЬ

Ьеи

ТНг

СЬп

Зег

Рго

АЬа

Не

Ме!

Зег

АЬа

Зег

Рго

СЬу

1

5

10

15

СЬи

Ьуз

УаЬ

ТНг

Ме!

ТНг

Суз

Зег

АЬа

Зег

УаЬ

Туг

Ме!

20

25

30

ΗΪ3

Тгр

Туг

СЬп

Агд

Зег

СЬу

АЬа

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

11е

Туг

35

40

45

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Зег

С1у

УаЬ

Рго

АЬа

Агд

РНе

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

6Ьу

Зег

СЬу

ТНг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТНг

ЬЬе

Зег

Ме!

СЬи

АЬа

СЬи

65

70

75

80

Азр

АЬа

ТНг

Туг

Суз

СЬп

Тгр

ТНг

Туг

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

85

90

95

РЬе

СЬу

АЬа

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

Агд

АЬа

Азр

100 105 <210> 10 <211> 109 <212> Белок <213> Миз зр <400> 10

СЬп 1

ЬЬе

УаЬ

Ьеи ТНг 5

СЬп

Зег

Рго

АЬа

ЬЬе 10

Ме!

Зег

АЬа

Зег

Рго 15

СЬу

СЬи

Ьуз

УаЬ

ТНг

Ме!

ТНг

Суз

Зег

АЬа

Зег

Уа!

Зег

Туг

Ме!

20

25

30

ΗΪ3

Тгр

Туг

СЬп

Ьуз

Рго

СЬу

ТНг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Пе

Туг

35

40

45

Азр

ТНг

Зег

Ьуз

Ьеи

АЬа

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

АЬа

Агд

РНе

Зег

СЬу

Зег

50

55

60

СЬу

Зег

СЬу

ТНг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТНг

Не

Зег

Ме!

СЬи

А1а

СЬи

65

70

75

80

Азр

АЬа

ТНг

Туг

Суз

СЬп

Тгр

Туг

Зег

Азп

Рго

Ьеи

ТНг

О с

п г\

и и

РНе

СЬу

АЬа

СЬу

ТНг

Ьуз

Ьеи

СЬи

Ьеи

Ьуз

Агд

АЬа

Азр

100 105

<210>	11
<211>	109
<212>	Белок
<213>	Миз зр
<400>	11

- 33 014112

С1п 1

Не

Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

А1а

Не 10

МеТ

Зег

А1а

Зег

Рго 15

61у

С1и

Уа1

ТЬг

МеЕ

ТЬг

Суз

Зег

А1а

Зег

Не

Азп

Туг

МеЬ

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

С1п

Ьуз

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Рго

Ьуз

Агд

Тгр

Не

Туг

35

40

45

Азр

ТЬг

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Зег

С1у

Уа1

Рго

А1а

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

50

55

60

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Зег

Туг

Зег

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

МеЬ

С1и

А1а

С1и

65

70

75

80

Азр

А1а

ТНг

Туг

Суз

С1п

Тгр

Азп

Зег

Аз п

Рго

Ьеи

ТЬг

85

90

95

РЬе

61у

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

61и

Ьеи

Ьуз

Агд

А1а

Азр

100 105 <210> 12 <211> 124 <212> Белок <213> Миз зр <400> 12

С1п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи Ьуз 5

С1и

Зег

С1у

Рго

С1у 10’

Не

Ьеи

С1п

Зег

Зег 15

С1п

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

Ьеи

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

20

25

30

01 у

МеЬ

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

61п

Зег

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Нхз

Не

Туг

Тгр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Агд

Азп

61п

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Ьеи

Ьуз

Не

ТЬг

Зег

Уа1

С1у

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

А1а

Не

ТЬг

Уа1

Не

С1у

61 у

ТЬг

МеБ

Азр

100

105

но

Туг

Тгр

С1у

61п

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

	115
<210>	13
<211>	124
<212>	Белок
<213>	Миз зр
<400>	13

- 34 014112

С1п 1

Уа1

ТЬг

Беи Буз 5

61и

Бег

61у

Рго

61у 10

Пе

Беи

61п

Бег

Бег 15

61п

ТЬг

Беи

5ег

Беи

ТЬг

Суз

Бег

РЬе

Бег

С1у

РЬе

Бег

Беи

Бег

ТЬг

Бег

20

25

30

61у

Меб

Бег

Уа1

Бег

Тгр

Не

Агд

61п

Бег

61 у

Буз

61у

Беи

61и

35

40

45

Тгр

Беи

А1а

ΗΪ5

11е

Туг

Тгр

Азр

Буз

Агд

Туг

Азп

Рго

Бег

50

55

60

Беи

Агд

Бег

Агд

Беи

ТЬг

Не

Бег

Буз

Азр

ТЬг

Зег

Агд

Азп

61п

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Беи

Буз

Не

ТЬг

Бег

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

61у

11е

ТЬг

Уа1

Беи

61у

ТЬг

Меб

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

61у

61п

С1у

ТЬг

Бег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Бег

115 120 <210> 14 <211> 123 <212> Белок <213> Миз зр <400> 14

61п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи Ьуз 5

Бег

61у

Рго 61у

Не 10

Ьеи

61п

Бег

61п 15

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Суз

Бег

Ьеи

Зег

61у

РЬе

Бег

Ьеи

ТЬг

Бег

61у

20

25

30

Меб

Не

Уа1

Бег

Тгр

Не

Агд

С1п

Бег

61у

Агд

61 у

Ьеи

61и

Тгр

35

40

45

Ьеи

А1а

ΗΪ3

Не

Туг

Тгр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Бег

Ьеи

50

55

60

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Бег

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Агд

Азп

61п

Уа1

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

Тгр

Не

Бег

Уа1

61у

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

А1а

Не

ТЬг

Уа1

Не

С1у

61у

С1у

ТЬг

Меб

Азр

Туг

100

105

110

Тгр

61у

61п

С1у

ТЬг

Бег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Бег

115 120 <210> 15 <211> 124 <212> Белок <213> Миз зр

- 35 014112 <400> 15

61п 1

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз 5

(Ии Зег

С1у

Рго

С1у 10

Не

Ьеи

С1п

Зег

Зег 15

С1п

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

Уа1

Зег

(Ну

РЬе

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

МеЬ

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

(Ип

Рго

Зег

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

ΗΪ3

Не

Туг

Тгр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Ьуз

Зег

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Зег

Агд

Азп

С1п

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Ьеи

Ьуз

Не

ТЬг

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

А1а

Не

ТЬг

Уа1

Ьеи

С1у

(Пу

61у

ТЬг

МеЬ

Азр

100

105

но

Туг

Тгр

(Пу

С1п

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115

120

<210> 16 <211> 124 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 16

(Ип

Уа1

ТЬг

Ьеи

Ьуз

61и

Зег

С1у

Рго

С1у

Меб

Ьеи

(Ип

Зег

С1п

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

Ьеи

Зег

С1у

РЬе

Зег

Ьеи

Агд

ТЬг

Зег

20

25

30

С1у

Меб

Зег

Уа1

Зег

Тгр

Не

Агд

(Ип

Зег

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

А1а

Н1з

Не

Туг

Тгр

Азр

Ьуз

Агд

Туг

Азп

Рго

Зег

50

55

60

Ьеи

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

Агд

Азп

С1п

Уа1

65

70

75

80

РЬе

Ьеи

Ьуз

Не

ТЫ

Зег

Уа1

С1у

ТЬг

А1а

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

85

90

95

Суз

А1а

Агд

А1а

Не

ТЬг

Уа1

Не

С1у

(Иу

С1у

ТЬг

МеЬ

Азр

100

105

110

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

115 120 <210> 17

- 36 014112 <211> 124 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 17

Θΐη Уа1 ТЬг Беи Буз	С1и	Бег	С1у
1	5
ТЬг	Беи Бег	Ьеи	ТЬг	Суз	Бег	Ьеи
			20
С1у	МеБ Бег	Уа1	Бег	Тгр	Не	Агд
		35					40
Тгр	Беи А1а	Н1з	Не	Туг	Тгр	Азр
	50				55
Беи	Агд Азп	Агд	Ьеи	ТЬг	Не	Бег
65					70
РЬе	Ьеи Ьуз	Не	ТЬг	Бег	Уа1	С1у
				85
Суз	А1а Агд	Агд	А1а	11е	ТЬг	ТЬг
			100
Туг	Тгр С1у	С1п	С1у	ТЬг	Бег	Уа1
		115					120
<210>	18
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	18
Бег	А1а Бег	Бег	Бег	11е	Бег	Туг
1				5
<210>	19
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	19
Зех	А1с1 Зег	ЗеГ	Бег	V а1	НЬз	Туг
1				5
<210>	20
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	20
Бег	А1а Бег	Бег	Бег	Уа1	Бег	Туг

Меб ΗΪ3

Меи Н1ь

МеЕ НЬз

Рго	61у 10	Не	Ьеи	С1п	Рго	Бег 15	С1п
Бег 25	С1у	РЬе	Бег	Ьеи	Агд 30	ТЬг	Бег
С1п	Бег	Бег	61у	Ьуз 45	С1у	Ьеи	С1и
Азр	Азр	С1и	Агд 60	Туг	Азп	Рго	Бег
Ьуз	Азр	ТЬг 75	Ьеи	Агд	Азп	С1п	Уа1 80
ТЬг	А1а 90	Азр	ТЬг	А1а	ТЬг	Туг 95	Туг
Уа1 105	Не	С1у	С1у	61у	ТЬг 110	Мер	Азр
ТЬг	Уа!	Бег	Бег

- 37 014112

1	5	10
<210>	21
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	21
Зег А1а Зег Зег	Зег	Уа1	Туг	Туг	Меб	НЬз
1		5					10
<210>	22
<211>	10
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	22
Зег А1а Зег Зег	Зег	Не	Азп	Туг	Меб	НЬз
1		5					10
<210>	23
<211>	7
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	23
Азр ТНг Зег Ьуз	Ьеи	АЬа	Зег
1		5
<210>	24
<211>	9
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	24
СЬп СЬп Тгр Туг	Зег	Азп	Рго	Ьеи	ТНг

5 <210> 25 <211> 9 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 25

С1п С1п Тгр 8ег Зег Азп Рго Ьеи ТНг

5 <210> 26 <211> 9 <212> Белок

- 38 014112 <213> Миз зр.

<400> 26

СЬп СЬп Тгр Зег Агд Азп	Рго Ьеи	ТЬг
Ь	5
<2Ь0>	27
<21Ь>	9
<2Ь2>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	27
СЬп СЬп Тгр Азп	Зег	Азп	Рго	Ьеи	ТЬг

5 <210> 28 <211> 9 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 28

СЬп СЬп Тгр ТЬг Туг Азп Рго Ьеи ТЬг

5 ζΟΙ о а <211> 12 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 29

СЬу РЬе Зег Ьеи Агд ТЬг Зег СЬу МеЕ Зег УаЬ Зег Ь 5 ЬО <2Ь0> 30 <2ЬЬ> Ь2 <2Ь2> Белок <2ЬЗ> Миз зр.

<400> 30

СЬу РЬе Зег Ьеи Зег ТЬг Зег СЬу МеЕ Зег УаЬ Зег Ь 5 ЬО <2Ь0> ЗЬ <2ЬЬ> Ь2 <2Ь2> Белок <2ЬЗ> Миз зр.

<400> ЗЬ

СЬу РЬе Зег Ьеи ТЬг ТЬг Зег СЬу МеЕ ЬЬе УаЬ Зег Ь 5 ЬО

- 39 014112 <210> 32 <211> 16 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 32 ΗΪ3 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Ьуз
1	5
<210>	33
<211>	16
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	33
ΗΪ3 11е Туг Тгр	Азр	Азр	Азр	Ьуз
1		5
<210>	34
1 ч
ν,ζ. ± ιζ	х о
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	34
Н13 11е Туг Тгр	Азр	Азр	Азр	Ьуз
1		5
<210>	35
<211>	16
1 с <	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	35
ΗΪ8 11е Туг Тгр	Азр	Азр	Азр	СЬи
1		5
<210>	36
<211>	14
<212>	Белок
<213>	Миз зр.
<400>	36
Агд АЬа 11е ТЬг	ТЬг	УаЬ	11е	СЬу
1		5

Агд Туг Азп Рго Зег Ьеи Агд Азп

10	15
Агд Туг Азп	Рго Зег Ьеи Агд Зег
10	15

Агд Туг Азп Рго Зег Ьеи Ьуз Зег

10	15
Агд Туг Азп Рго Зег	Ьеи Агд Азп
10	15

С1у С1у ТЬг МеТ Азр Туг <210> 37 <211> 14 <212> Белок <213> Миз зр.

- 40 014112 <400> 37

Агд 61у Не ТЬг ТНг Уа1 Ьеи С1у С1у (31у ТЬг Ме! Азр Туг 15 10 ’ <210> 38 <211> 10 <212> Белок <213> Миз зр.

<220>

<221> ΜΙ30_ΕΕΑΤϋΗΕ <222> (6) . .(б) <223> X представляет собой гидрофобную аминокислоту <220>

<221> М13С_ЕЕАТОКЕ <222> (7)..(7) <223> X представляет собой Зег, ТЬг, Нгз, Туг или Азп <400> 38

<210> 39 <211> 109 <212> Белок <213> Ното заргепз <220>

<221> М13С ЕЕАТЖЕ <222> (1)..(1) <223> X представляет собой Азр или Азп <220>

<221> М13С_ЕЕАТЖЕ <222> (2) .. (2) <223> X представляет собой РЬе или Ьеи <220>

<221> М15С_ЕЕАТЖЕ <222> (11)..(11) <223> X представляет собой ТЬг или Зег <220>

<221> ΜΙ36_ΓΕΑΤϋΚΕ <222> (46)..(46) <223> X представляет собой С1и или 61п <220>

<221> М15С_ЕЕАТЖЕ <222> (49)..(49) <223> X представляет собой РЬе или Туг <220>

<221> М15С_ЕЕАТЖЕ <222> (50)..(50)

- 41 014112

<223>	X представляет	собой	Уа1	ИЛИ	Мер
<220>
<221>	М13С ЕЕАТиКЕ
<222>	(52) . . (52)
<223>	X представляет	собой	Ьеи	или	Мер
<220>
<221>	М13С ГЕАТиКЕ
<222>	(62) . . (62)
<223>	X представляет	собой	Нхз	или	С1п
<220>
<221>	М13С ЕЕАТиКЕ
<222>	(89)..(89)
<223>	X представляет	собой	С1у	или	Азр
<220>
<221>	М13С ΕΕΑΤϋΚΕ
<222>	(91)..(91)
<223>	X представляет	собой	С1и	или	С1п
<220>
<221>	М13С ΕΕΑΤϋΚΕ
<222>	(100)..(100)
<223>	X представляет	собой	А1а	или	С1у
<400>	39

Хаа 1

Хаа

С1у

Ьеи

Азр 5

Суз

Азр

С1и

Нхз

Зег 10

Хаа

С1и Зег

Агд

Суз 15

Суз

Агд

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

РЬе

С1и

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр

Тгр

Не

20

25

30

Не

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

С1у

Хаа

Суз

С1и

35

40

4 5

Хаа

РЬе

Хаа

С1п

Ьуз

Туг

Рго

Нхз

ТЬг

Нхз

Ьеи

Уа1

Хаа

61п

А1а

50

55

60

Азп

Рго

Агд

61у

Зег

А1а

61у

Рго

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

Мер

Зег

65

70

75

80

Рго

11е

Азп

Мер

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

Хаа

Ьуз

Хаа

С1п

Не

Туг

С1у

85

90

95

Ьуз

Не

Рго

Хаа

Мер

Уа1

Азр

Агд

Суз

С1у

Суз

Зег

100 105 <210> 40 <211> 109 <212> Белок <213> Ното зархепз <400> 40

Азп Ьеи С1у Ьеи Азр Суз Азр С1и Нхз Зег Зег С1и Зег Агд Суз Суз

10 15

Агд

Туг

Рго

Ьеи ТЬг Уа1 Азр 20

РЬе

С1и 25

А1а

РЬе

С1у

Тгр

Азр 30

Тгр

Не

11е

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Туг

Ьуз

А1а

Азп

Туг

Суз

Зег

61 у

С1п

Суз

С1и

35

40

45

Туг

Мер

РЬе

МеЬ

С1п

Ьуз

Туг

Рго

Н13

ТЬг

ΗΪ3

Ьеи

Уа1

С1п

61п

А1а

50

55

60

Азп

Рго

Агд

61у

Зег

А1а

С1у

Рго

Суз

ТЬг

Рго

ТЬг

Ьуз

МеЬ

Зег

65

70

75

80

Рго

11е

Азп

МеЬ

Ьеи

Туг

РЬе

Азп

Азр

Ьуз

С1п

61п

11е

Не

Туг

61у

85

90

95

Ьуз

11е

Рго

С1у

МеЬ

Уа1

Азр

Агд

Суз

61у

Суз

Зег

100 105 <210> 41 <211> 16 <212> Белок <213> Миз зр.

<220>

<221> М1БС_ГЕАТиКЕ <222> (8) .. (8) <223> X представляет собой Ьуз, Агд, С1и или Азр <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (15)..(15) <223> X представляет собой Ьуз или Агд <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (16)..(16) <223> X представляет собой Зег, ТЬг, Азп или С1п <400> 41

Н1з 11е Туг Тгр Азр Азр Азр Хаа Агд Туг Азп Рго Зег Ьеи Хаа Хаа

10 15

<210> 42 <211> 14 <212> Белок <213> Миз зр.

<220>

<221> М13С ΕΕΑΤϋΚΕ

<222> (2) .. (2)

<223> X представляет собой А1а или С1у <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (7) .. (7) <223> X представляет собой 11е, Ьеи или Уа1 <400> 42

- 43 014112

<210> 43 <211> 25 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 43

А1а 1	Азп	Туг	Суз	8ег 5	01 у	С1и	8ег	С1и	РЬе Уа1 10	РЬе Ьеи С1п Ьуз Туг 15
Рго	НЬз	ТЬг	ΗΪ3 20	Ьеи	Уа1	ΗΪ3	01п	А1а 25

<210> 44 <211> 327 <212> ДНК <213> Миз зр.

<400> 44

саааЫдЬЬс	ЬсасссадЬс	ЬссадсааЬс	аЬд'Ьс'ЬдсаЬ	сЕссадддда	дааддЕсасс	60
аЕдассЬдса	дЬдссадсЬс	аад-ЬаЬаадЕ	Еаса-Ьдсаси	ддЬассадса	даадссаддс	120
ассЬссссса	ааадаЬддаЬ	ЕЕаЬдасаса	ЕссааасЬдд	сЬисЕддадЕ	сссЬдсЬсдс	180
ЫсадЬддса	дЬдддЬсЕдд	дассЕсииас	ЬсЕсЬсасаа	ЬсадсадсаЕ	ддаддсЬдаа	240
даЬдсЬдсса	сЬЬаЬЬасЬд	ссадсадЬдд	ЬаЕадЬаасс	сасЬсасд-ьи	сддЬдсЕддд	300
ассаадсЬдд	адсЬдааасд	ддсЬдаЬ				327

<210> 45 <211> 372 <212> ДНК <213> Миз зр.

<400> 45

саддЕЕасдс	ЕдааададЕс	ЕддсссЬддд	аЕаиидсадЕ	ссЬсссадас	ссЕсадЬсЬд	60
асЫдЫсЕс	ЬсЕсЬдддЫ	ЕЕсасЕдада	асдЬсЬддЬа	ЬдадЕдЕдад	саддаЬЬсдЕ	120
садЬсЬЬсад	дааадддЬс!	ддадЬддсЬд	дсасасаЬЫ	аЫдддаЬда	Ьдасаадсдс	180
ЬаЬаасссаЕ	сссЬдаддаа	ссдасЕсаса	аЬсЬссаадд	аЕассЫдад	ааассаддЬс	240
ЬЬссЕсаада	ЬсассадЬди	дддсасЬдса	даЕасЕдсса	саЕасЬасЬд	ЕдсЬсдаада	300
дсЬаПасЬа	сддЬааЬадд	дддадддасЬ	аЬддасиасЕ	ддддЬсаадд	аассЬсадЬс	360

ассдЕсЬссЕ са

372

- 44 014112 <210> 46 <211> 25 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 46

АЬа Азп Туг Суз 1	Зег СЬу СЬи Суз 5	СЬи	РНе УаЬ 10	РНе Ьеи СЬп Ьуз Туг 15
Рго	Н13	ТНг	Низ	Ьеи	УаЬ	Н13	СЬп	АЬа
			20					25

<210> 47 <211> 12 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 47

С1у РНе Бег Ьеи Агд ТНг Бег СЬу Бег Бег УаЬ Зег

10 <210> 48 <2И> 12 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 48

СЬу РНе Бег Ьеи Агд Ьуз Зег СЬу Меб Бег УаЬ Бег

10 <210> 49 <211> 12 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 49

СЬу РНе Бег Ьеи Агд ТНг УаЬ СЬу Меб Бег УаЬ Бег

10 <210> 50 <211> 12 <212> Белок <213> Миз зр.

<400> 50

СЬу РНе Бег Ьеи Агд ТНг Ьеи СЬу Меб Бег УаЬ Бег

10 <210> 51 <211> 12 <212> Белок

- 45 014112 <213> Миз зр.

<400> 51

СЬу РЬе Зег Ьеи

Ь

Агд

ТЬг

Ьеи

СЬу

Зег

ЬО

УаЬ

Зег <2Ь0>

<2ЬЬ>

<2Ь2>

<2ЬЗ>

Ь2 Белок Миз зр.

<400>

СЬу РЬе Зег Ьеи

Агд

Ьуз

Уа1

СЬу

Зег

ЬО

УаЬ

Зег <2Ь0>

<2ЬЬ>

<2Ь2>

<213>

Ь2 Белок Миз зр.

<400>

СЬу РЬе Зег Ьеи

Ь

Агд

Ьуз

Ьеи

СЬу

Зег

ЬО

УаЬ

Зег <210>

<2ЬЬ>

<212>

<2ЬЗ>

Ь2 Белок Миз зр.

<400>

СЬу РЬе Зег Ьеи Ь

Агд

Ьуз

Зег

СЬу

Зег

ЬО

УаЬ

Зег <2Ь0>

<2ЬЬ>

<2Ь2>

<213>

Ь2 Белок Миз зр.

<220>

<22Ь>

<222>

<223>

МЬЗС_ЕЕАТиКЕ (5) . . (5)

X представляет собой

Агд,

Ьуз

ТЬг или Зег <220>

<22Ь>

<222>

<223>

М13С_ГЕАТиКЕ (6) . . (6)

X представляет собой

ТЬг или Ьуз <220>

<22Ь>

<222>

<223>

МЬЗС_ГЕАТиКЕ (7) .. (7)

X представляет собой

Зег, УаЬ или Ьеи

- 46 014112 <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (9)..(9) <223> X представляет собой Ме! или Зег <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (10)..(10) <223> X представляет собой Зег, ТНг, 11е, Ьеи или Уа1 <400> 55

61у РНе Зег Ьеи Хаа Хаа Хаа С1у Хаа Хаа Уа1 Зег

10 <210> 56 <211> 9 <212> Белок <213> Миз зр.

<220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (4)..(4) <223> X представляет собой Туг, Зег, Азп или ТНг <220>

<221> М13С_ЕЕАТиКЕ <222> (5) . . (5) <223> X представляет собой Агд, Ьуз, Туг, Зег или ТНг <400> 56

С1п С1п Тгр Хаа Хаа Азп Рго Ьеи ТНг

5

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Моноклональное антитело к миостатину (ΟΏΕ-8), включающее полипептид вариабельного участка легкой цепи (БСУК) и полипептид вариабельного участка тяжелой цепи (НСУК) соответственно, с аминокислотными последовательностями:

(ι) 8Е(Э И) N0: 3 и 12;

(и) 8Е(Э И) N0: 4 и 13;

(111) 8Е(Э И) N0: 3 и 14;

(ιν) 8Е(Э И) N0: 5 и 12;

(ν) 8Е(Э И) N0: 6 и 15;

(νι) 8Е(Э И) N0: 7 и 17;

(νιι) 8Е(Э И) N0: 8 и 12;

(νιιι) 8Е(Э И) N0: 9 и 16;

(ιχ) 8Е(Э И) N0: 10 и 12 или (χ) 8Е(Э И) N0: 11 и 12.
2. Моноклональное антитело к миостатину (ΟΏΕ-8), которое конкурирует за связывание с аминокислотами 40-64 зрелой формы человеческого миостатина (8ЕР И) N0: 46) с антителом по п.1 и преимущественно связывается с миостатином в сравнении с ΟΏΕ-11.
3. Моноклональное антитело по п.2, которое связывается с миостатином по меньшей мере в 20 раз сильнее, чем оно связывается с ΟΏΕ-11.
4. Моноклональное антитело к миостатину (ΟΏΕ-8), включающее вариабельный участок тяжелой цепи (НСУК), который содержит по меньшей мере один СОК, выбранный из СОК1 с последовательностью 8ЕР И) N0: 55, С1)К2 с последовательностью 8Е(Э И) N0: 41 и С1)К3 с последовательностью 8ЕР П) N0: 42.
5. Моноклональное антитело по п.4, которое включает НСУК, содержащий 2 или 3 СОКз, выбранных из СОК1 с последовательностью 8ЕР И) N0: 55, С1)К2 с последовательностью 8ЕР И) N0: 41 и С1)К3 с последовательностью 8ЕР И) N0: 42.
6. Моноклональное антитело по п.4 или 5, которое преимущественно связывается с миостатином в сравнении с ΟΏΕ-11.
7. Моноклональное антитело по п.6, которое связывается с миостатином по меньшей мере в 20 раз сильнее, чем оно связывается с ΟΏΕ-11.
8. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, которое представляет собой антитело полной длины, по существу интактное антитело, химерное антитело, фрагмент ЕаЬ, фрагмент Е(аЬ')₂ или одноцепочечный фрагмент Ρν.

- 47 014112
9. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, которое представляет собой гуманизированное антитело.
10. Моноклональное антитело по любому из пп.1-7, дополнительно включающее константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из Σ^θι, ^Сг, !дС₃ и !дС₄.
11. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по любому из пп.1-10.
12. Применение моноклонального антитела по любому из пп.1-10 для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения дряхлости, кахексии, мышечного истощения, мышечной слабости, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ХОЗЛ, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности, диабета II типа или метаболического синдрома.