EA025245B1 - Антитела против cd100 и способы их применения - Google Patents

Антитела против cd100 и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
EA025245B1
EA025245B1 EA201171374A EA201171374A EA025245B1 EA 025245 B1 EA025245 B1 EA 025245B1 EA 201171374 A EA201171374 A EA 201171374A EA 201171374 A EA201171374 A EA 201171374A EA 025245 B1 EA025245 B1 EA 025245B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
binding
fragment
polypeptide
antibodies
Prior art date
Application number
EA201171374A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201171374A1 (ru
Inventor
Эрнест С. Смит
Терренс Ли Фишер
Original Assignee
Вэксинекс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вэксинекс, Инк. filed Critical Вэксинекс, Инк.
Publication of EA201171374A1 publication Critical patent/EA201171374A1/ru
Publication of EA025245B1 publication Critical patent/EA025245B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0001—Archaeal antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

Предложены композиции и способы для лечения заболеваний, ассоциированных с CD100, включая определенные аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания и злокачественные опухоли. В частности, были разработаны моноклональные антитела против CD100 для нейтрализации CD100.

Description

Уровень техники изобретения
00100, также известный как семафорин 4Ό (8ΕΜΆ4Ό), представляет собой трансмембранный белок (например, δΕΟ ГО N0: 1 (человек); δΕΟ ГО N0: 2 (мышь)), который принадлежит семейству генов семафоринов. СГО1()() экспрессируется на поверхности клетки в качестве гомодимера, однако при активации клеток СГО1()() может высвобождаться с клеточной поверхности путем протеолитического расщепления с образованием активного 5СО100 растворимой формы белка. См. διιζιιΐο с1 а1., №Иигс Кеу. 1ттипо1. 3:159-167 (2003); КикФаш е1 а1., Уинге 1ттипо1. 9:17-23 (2008).
С0100 первоначально был идентифицирован путем создания двух моноклональных антител мыши, ΒΌ16 и ВВ18, против активированных клонов Т-клеток человека (Него1б е1 а1., Ιηΐ. 1ттипо1. 7:1-8 (1994)). СГО100 был первым примером семафорина, экспрессируемого в иммунной системе. СГО100 экспрессируется в большом количестве на поверхности покоящихся Т-клеток, и слабо на покоящихся В-клетках, моноцитах и профессиональных антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки (ОС). Клеточная активация может стимулировать увеличение экспрессии на поверхности С0100 на В-клетках и ОС, а также образование 8С0100. Полагают, что С0100 функционирует как рецептор, который передает сигнал через его цитоплазматический домен, и как лиганд (На11 е1 а1., ΡΝΑδ 93:11780-11785 (1996)). Одним из рецепторов, идентифицированных для С0100, является плексин-В1. Плексин-В1 экспрессируется в нелимфоидных тканях и является высокоаффинным (1 нМ) рецептором для С0100 (Татадпопе е1 а1., Се11 99:71-80 (1999)).
С0100 является важным медиатором активации Т-клеток и В-клеток. Мыши с нокаутом С0100 (С0100-/-) имеют сниженные антительные ответы на Т-зависимые антигены и нарушенное примирование Т-клеток. Обе из этих функций восстанавливаются при введении 8С0100 (δΐιί е1 а1., йптипйу 13:633642 (2000)).
В дополнение к продемонстрированным эффектам С0100 на иммунные клетки С0100 также, повидимому, играет прямую роль в демиелинизации и аксональной дегенерации, наблюдаемых при нейровоспалительных заболеваниях. Патогенез воспалительных демиелинизирующих заболеваний, таких как Μδ, включает как воспалительную фазу, вовлекающую иммунные клетки, так и фазу селективной демиелинизации и нейродегенерации. С0100 экспрессируется в олигодендроцитах центральной нервной системы (ЦНС), и он является ингибитором регенерации аксонов. Экспрессия С0100 повышается в олигодендроцитах на периферии очагов повреждения спинного мозга (Могеаи-Раиуагдие е1 а1., 1. №иго8С1епсе 23:9229-9239 (2003)). Культивирование хронически активированных Т-клеток, экспрессирующих 8СО100, с мультипотентными предшественниками нейронов человека или первичными олигодендроцитами из головного мозга крысы индуцирует апоптоз и прекращение удлинения отростков (Ойаибоп е1 а1., 1. 1ттипо1. 172:1246-1255 (2004); Ойаибоп е1 а1., №игоМо1еси1аг Меб. 7:207-216 (2005)). Индуцируемый СО100 апоптоз предшественников нейронов можно ингибировать с помощью антитела против СО100 ΒΟ16.
Мыши с нокаутом СО100 являются устойчивыми к развитию экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ), который представляет собой модель на мышах для рассеянного склероза (Μδ) человека (Китаподой е1 а1., 1. 1ттипо1. 759:1175-1181 (2002)).
Ряд других исследований продемонстрировал, что СО100 индуцирует исчезновение конусов роста в нейронах, и, в качестве дальнейшего подтверждения функционального значения СО100 в нейровоспалении, описано, что в цереброспинальной жидкости (ΟδΡ) пациентов с ассоциированной с НТЬУ-1 миелопатией/трофическим спастическим парапарезом (ΗΑΜ/ΤδΡ) уровни 8СО100 значительно повышены. Таким образом, существует прямой вредоносный эффект 8СО100 на целостность олигодендроцитов и предшественников нейронов и СО100 может играть патогенную роль в демиелинизации. В связи с ролью важного медиатора как воспалительных ответов, так и прямой демиелинизации в данной области существует потребность в нейтрализующих СО100 молекулах, например антителах против СО100, для лечения воспалительных и демиелинизирующих заболеваний.
СО100 также является сильнодействующей проангиогенной молекулой. Активация плексина-В1 через связывание СО100 трансактивирует с^е1 и стимулирует инвазивную способность опухолевых клеток и стимулирует ангиогенез как ш уйго, так и ш У1уо. Иммуногистохимический анализ СО100 в большой коллекции образцов опухоли показал, что сверхэкспрессия СО100 является очень частым событием при раке головы и шеи, предстательной железы, толстого кишечника, молочной железы и легкого.
Также было показано, что передача сигнала СО100/плексин В1 индуцирует миграцию эндотелиальных клеток и стимулирует миграцию опухолевых клеток (Сопгойо е1 а1., В1ооб 705:4321-4329 (2005); Оюгбапо е1 а1., УИше Се11 Вю1оду 4:720-724 (2002)). Индуцируемую С0100 миграцию эндотелиальных клеток предотвращают с помощью блокирующих антител против С0100 и нокдауна СО100. Нокдаун экспрессии СО100 в клетках плоскоклеточной карциномы головы и шеи (ΗΝδΟΟ) посредством короткой шпилечной РНК (ΦΡΝΑ) для СО100 перед пересадкой мышам пибе вызывал резкое снижение васкуляризации опухоли и роста опухоли (Вакйе е1 а1., ΡΝΑδ 103:9017-9022 (2006)). В недавних сообщениях была показана тесная корреляция между воспалительной инфильтрацией стромы опухоли и высокой степенью васкуляризации. СО100 продуцируется воспалительными клетками, присутствующими в микроокружении опухоли. В окружении, лишенном СО100, способность клеток рака молочной железы мыши
- 1 025245 давать начало опухолевым массам и метастазам была в значительной степени нарушена, и источником СГО100 были ассоциированные с опухолью макрофаги (81егга с1 а1., 1ЕМ 205: 1673-1685 (2008)). Таким образом, в данной области, кроме того, существует потребность в нейтрализующих СГО100 молекулах, например антителах против ί'Ό100. для лечения связанной с СЭ100 злокачественной опухоли.
Область изобретения
Изобретение относится к нейтрализующим СИ100 антителам, например гуманизированным моноклональным антителам, к способам применения антител и к способам лечения состояний и заболеваний, ассоциированных с экспрессирующими СИ100 клетками.
Краткое описание сущности изобретения
Предусматриваются композиции и способы для лечения заболеваний, ассоциированных с СИ100, включая определенные типы аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, злокачественных опухолей и инвазивного ангиогенеза. В частности, были разработаны моноклональные антитела против СИ100 для нейтрализации СИ100. МАЬ67 мыши продемонстрировало способность блокировать активность СИ100 ίη νίίτο и снижать тяжесть клинических признаков экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ), индуцированного коллагеном артрита (С1А) и злокачественной опухоли в моделях на мышах. МАЬ2503 представляет собой гуманизированный вариант МАЬ67, который продемонстрировал увеличенную по сравнению с МАЬ67 аффинность к СИ100 человека и мыши и сходную с МАЬ67 активность блокирования СИ100.
В одном варианте осуществления изобретение относится к выделенной связывающей молекуле, которая специфично связывается с тем же эпитопом СИ100, что и эталонное моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из 2503, 67 или 76.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной связывающей молекуле, которая специфично связывается с СИ100, где указанная связывающая молекула конкурентно ингибирует специфическое связывание с СИ100 эталонного моноклонального антитела, выбранного из группы, состоящей из 2503, 67 или 76.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с СИ100, где указанные антитело или его фрагмент представляют собой моноклональное антитело 2503, 67 или 76.
В определенных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, которые специфично связываются с СИ100, содержат вариабельную область тяжелой цепи (УН), которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8Еф ГО N0: 9, 8Еф ГО N0: 10 или 8Еф ГО N0: 25. В другом аспекте изобретения УН указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотную последовательность, идентичную, за исключением 20 или менее консервативных аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 9, 8Еф ГО N0: 10 или 8Еф ГО N0: 25. В другом аспекте изобретения УН указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 9, 8Еф ГО N0: 10 или 8Еф ГО N0: 25 или состоит из нее.
В определенных вариантах осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, которые специфично связываются с СИ100, содержат вариабельную область легкой цепи (УЬ), которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18 или 8Еф ГО N0: 29. В другом аспекте изобретения УЬ указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотную последовательность, идентичную, за исключением 20 или менее консервативных аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18 или 8Еф ГО N0: 29. В другом аспекте изобретения УЬ указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 17, 8Еф ГО N0: 18 или 8Еф ГО N0: 29 или состоит из нее.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с СИ100, где УН указанного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну из следующих СИК: аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-1 тяжелой цепи (УН-СИК1) по СНоОйа-КаЬаЕ идентичную, за исключением двух или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 6, аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-2 тяжелой цепи (УН-СИК2) по КаЬа1, идентичную, за исключением четырех или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 7, или аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-3 тяжелой цепи (УН-СИК3) по КаЬа1, идентичную, за исключением двух или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 8.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с СИ100, где УЬ указанного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну из следующих СГОК: аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-1 легкой цепи (УЪ-СИИТ) по КаЬа1, идентичную, за исключением четырех или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 14, аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-2 легкой цепи (УЪ-СИИТ) по КаЬа1, идентичную, за исключением двух или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 15, или аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области-3 легкой цепи (УЪ-СИКЗ) по КаЬа1, идентичную, за исключением двух или менее аминокислотных замен, 8Еф ГО N0: 16.
- 2 025245
В другом аспекте УН антитела или его фрагмента по изобретению содержит аминокислотные последовательности УН-СОР.1, УН-СЭР2 и УН-СЭР3. содержащие §Еф ГО N0: 6, 7 и 8 соответственно, за исключением четырех или менее аминокислотных замен, в одной или нескольких из указанных УНС'ГОР. В следующем аспекте аминокислотные последовательности УН-СГОРК УН-СГОР2 и УН-СГОР3 представляют собой §Еф ГО N0: 6, 7 и 8 соответственно.
В другом аспекте УЬ антитела или его фрагмента по изобретению содержит аминокислотные последовательности УЬ-СГОРК УЬ-СОР2 и УЬ-СЭРЗ, содержащие 8Еф ГО N0: 14, 15 и 16 соответственно, за исключением четырех или менее аминокислотных замен в одной или нескольких из указанных УЬС'ГОР. В следующем аспекте аминокислотные последовательности УЬ-СПР1, УК-СЭР2 и УЬ-СГОРЗ представляют собой §Еф ГО N0: 14, 15 и 16 соответственно.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с ΤΌΚΙΟ, где УН указанного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну из следующих СОР: аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-1 тяжелой цепи (УН-СЭР1) по КаЬа1, идентичная, за исключением двух или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 26, аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-2 тяжелой цепи (УН-СЭР2) по КаЬа1, идентичная, за исключением четырех или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 27, или аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-3 тяжелой цепи (УН-СГОР3) по КаЬа1, идентичная, за исключением двух или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 28.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфично связываются с СЭ100, где УЬ указанного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну из следующих СОР: аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-1 легкой цепи (УЬ-СОР1) по КаЬа1, идентичная, за исключением четырех или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 30, аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-2 легкой цепи (УЬ-СОР2) по КаЬа1, идентичная, за исключением двух или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 31, или аминокислотная последовательность определяющей комплементарность области-3 легкой цепи (УЬ-СГОРЗ) по КаЬа1, идентичная, за исключением двух или менее аминокислотных замен, §Еф ГО N0: 32.
В другом аспекте УН антитела или его фрагмента по изобретению содержит аминокислотные последовательности УН-СГОРК УН-СГОР2 и УН-С0Р3, содержащие 8Еф ГО N0: 26, 27 и 28 соответственно, за исключением четырех или менее аминокислотных замен в одной или нескольких из указанных УН-СГОР. В следующем аспекте аминокислотные последовательности УН-СГОРК УН-СГОР2 и УН-СГОР3 представляют собой §Еф ГО N0: 26, 27 и 28 соответственно.
В другом аспекте УЬ антитела или его фрагмента по изобретению содержит аминокислотные последовательности УЬ-СГОРК УК-СГОР2 и УЬ-СПР3, содержащие 8Еф ГО N0: 30, 31 и 32 соответственно, за исключением четырех или менее аминокислотных замен в одной или нескольких из указанных УЬС'ГОР. В следующем аспекте аминокислотные последовательности УЬ-СГОРК УК-СГОР2 и УК-СГОР3 представляют собой §Еф ГО N0: 30, 31 и 32 соответственно.
В другом аспекте антитело или его фрагмент по изобретению связываются с СГОК 10 человека или мыши. В другом аспекте антитело или его фрагмент по изобретению специфично связываются с полипептидом СГО100 или его фрагментом, или с вариантным полипептидом СГО100 с аффинностью, характеризующейся константой диссоциации (Кс) не более 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 5,7х10-12 М, 8,4х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М. В некоторых аспектах полипептид СГОК 10 или его фрагмент, или вариантный полипептид СГОК 10 представляет собой полипептид человека или мыши. В следующих аспектах полипептид СГО100 или его фрагмент, или вариантный полипептид СГО100 представляет собой полипептид человека и указанная Кс составляет от приблизительно 5х10-9 М до приблизительно 6х10-9 М. В другом аспекте полипептид СГО100 или его фрагмент или вариантный полипептид СГО100 представляет собой полипептид мыши и указанная Кс составляет от приблизительно 1х 10-9 М до приблизительно 2х 10-9 М.
В другом аспекте антитело или его фрагмент по изобретению являются гуманизированными, приматизированными или химерными.
В другом варианте осуществления изобретение относится к композиции, содержащей антитело или его фрагмент по изобретению и носитель.
В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид УН или УЬ антитела по изобретению. В другом аспекте полинуклеотид по изобретению содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело или его фрагмент по изобретению, или состоит из нее. В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор по изобретению. В другом аспекте изобретение относится к способу продукции антитела по изобретению.
- 3 025245
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания у животного, нуждающегося в лечении, включающему введение указанному животному композиции, содержащей выделенное антитело или его фрагмент по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В следующих вариантах осуществления аутоиммунное заболевание или воспалительное заболевание представляет собой рассеянный склероз или артрит.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения злокачественной опухоли у животного, нуждающегося в лечении, включающему введение указанному животному композиции, содержащей выделенное антитело или его фрагмент по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу ингибирования ангиогенеза у животного, нуждающегося в лечении злокачественной опухоли, включающему введение указанному животному композиции, содержащей выделенное антитело или его фрагмент по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В следующем аспекте антитело или его фрагмент по изобретению ингибирует связывание СБ100 с рецептором СБ100. В другом аспекте изобретения рецептор СБ100 представляет собой плексин-В1.
Краткое описание чертежей/фигур
Фиг. 1. Диаграмма анализа блокирования СБ100. Показано связывание СБ100-Шв с плексином В1 на клеточной поверхности стабильной клеточной линии, экспрессирующей плексин В1 (293/плексин). Детекция связанного с плексином В1 СБ100-Н1в проведена с использованием конъюгированного с биотином специфичного моноклонального антитела против Ηίβ-метки и стрептавидин-АРС. МАЬ против СБ100, которые способны блокировать связывание СБ100-Шв с плексином В1, приводят к более низкой флуоресценции, ассоциированной с клетками 293/плексин при измерении проточной цитометрией.
Фиг. 2. Представлены результаты проточной цитометрии для антитела кролика против Ηίβ + стрептавидин-АРС (КЬ аий-Ыв+вАРС), СБ100 мыши (только шиСБ100), СБ100 мыши + 0,625 мкг/мл МАЬ (МАЬ67, МАЬ76 и изотип ш1§0), и СБ100 мыши + 0,156 мкг/мл МАЬ (МАЬ67, МАЬ76 и изотип ш1§0), протестированных в анализе блокирования СБ100, описанном на фиг. 1. Моноклональные антитела 67 и 76 блокируют связывание СБ100 мыши с рецептором плексина В1.
Фиг. 3. Моноклональные антитела 67 и 76 блокируют опосредуемое СБ100 мыши открепление клеток 293/плексин В от покрытого фибронектином планшета, как показано по увеличению поглощения для обоих МАЬ 67 (67-2) и 76 (76-1) по сравнению с изотипическим контролем.
Фиг. 4. Введение 30 мг/кг МАЬ76 (1Х/неделя или 2Х/неделя) или МАЬ67 (1Х/неделя или 2Х/неделя) против СБ100 ослабляет ремитирующий ЕАЕ у мышей δίΣ по сравнению с введением контрольного 1§О мыши, как показано по снижению клинического показателя (4А). Результаты далее иллюстрируются путем сравнения процентного снижения среднего показателя для группы (СМ8) для каждого введения МАЬ между 21 сутками и завершением исследования (4В).
Фиг. 5. Введение 30 мг/кг МАЬ76 (1Х/неделя) или МАЬ67 (1Х/неделя) против СБ100 ослабляет ремитирующий ЕАЕ у мышей δίΣ по сравнению с введением контрольного 1§О мыши, как показано по снижению клинического показателя (5А). Результаты далее проиллюстрированы путем сравнения процентного снижения среднего показателя для группы (СМ8) для введения обоих МАЬ между 18 сутками и завершением исследования (5В).
Фиг. 6. Введение 30 мг/кг МАЬ67 против СБ100, начиная на 7 сутки после иммунизации (1Х/неделя), ослабляет ремитирующий ЕАЕ у мышей δίΣ по сравнению с введением контрольного 1§О мыши, как показано по снижению клинического показателя.
Фиг. 7. Результаты ЕЫ8А, демонстрирующие процентное (%) блокирование связывание биотинилированного 67 с СБ100 человека (7А) или СБ100 мыши (7В) вследствие конкурентного связывания МАЬ 2503, МАЬ67 или контрольного 1§О.
Фиг. 8. Представлены результаты проточной цитометрии для стрептавидин-АРС (только вАРС), СБ100 человека (ЬиСБ100), СБ100 мартышки (шагтСБ100), СБ100 мыши (тиСБ100), 1,0 мкг изотипического антитела и 1,0 мкг МАЬ (67 или 2503), протестированных в анализе блокирования СБ100, описанном на фиг. 1. МАЬ67 и МАЬ2503 блокируют связывание СБ100 человека (8А), СБ100 мартышки (8В) или СБ100 мыши (8С) с рецептором плексином В1.
Фиг. 9. Представлено блокированное снижение поглощения, вызванное СБ100 вследствие нейтрализации СБ100 посредством МАЬ67, МАЬ2503 и контрольного 1§О. МАЬ67 и МАЬ2503 против СБ100 блокируют опосредуемое СБ100 человека (9А) и СБ100 мартышки (9В) открепление клеток 293/плексин с покрытого фибронектином планшета.
Фиг. 10. Показано изменение объема опухоли (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа и мышей СБ100 после инъекции 50000 клеток опухоли толстого кишечника СТ26 в мышцы конечностей мышей.
Фиг. 11. Показано изменение среднего объема конечности (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа, которым вводили 1 мг МАЬ67 или 1 мг контрольного 1§О мыши, и для мышей СЭ100 (КО) после инъекции 50000 клеток опухоли СТ26 в мышцы конечностей мышей.
Фиг. 12. Схема, демонстрирующая общую стратегию лечения индуцируемого коллагеном артрита (С1А).
- 4 025245
Фиг. 13. Было показано снижение развития артритического заболевания в модели С1А для групп, которым вводили 600 мкг МАЬ67. Антритический индекс (А1) у мышей, которым вводили 600 мкг МАЬ67, сравнивали с А1 у мышей, которым вводили 600 мкг отрицательного контроля (1§О1) и 600 мкг положительного контроля - этанерцепта (ЕпЬге1®), когда введение начинали на 20 сутки (13А). Результаты артритического индекса (А1) для лечения с помощью МАЬ67 сравнивали с введением отрицательного контроля (1§О1) и положительного контроля - этанерцепта (ЕтЬге1®), когда введение начинали либо на 20 сутки, либо когда А1 составлял >3 (13В).
Фиг. 14. У мышей Ва1Ь/с, иммунизированных конъюгированным с (4-гидрокси-3нитрофенил)ацетилом гамма-глобулином курицы, преципитированным с квасцами (гидроксид алюминия/магния) (ΝΡ-СОО), введение 600 мкг МАЬ67 снижало количество В-клеток в герминативном центре (ОС) (Β220+ί'Ό381ο\νΡΝΛ+) в селезенке (8Ρ) и лимфатических узлах (ΕΝ) после как первичной иммунизации (14А), так и вторичной иммунизации (14В). Результаты также показаны для мышей СИ100 и мышей Ва1Ь/с с иммунизацией посредством ΝΡ-СОО или без нее.
Фиг. 15. Показано изменение объема опухоли (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа после инъекции 50000 клеток опухоли толстого кишечника СТ26 в мышцу конечности мыши. Результаты представлены для мышей, которым инъецировали 1 мг МАЬ67 раз в неделю, начиная на 1 сутки, по сравнению с мышами, которым инъецировали контрольный 1дО. Исследование проводили до конечной точки замедления роста опухоли.
Фиг. 16. Представлено изменение объема опухоли (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа и мышей СИ100 (8ЕМА4И-/-) после подкожной инъекции 50000 фибробластных клеток опухоли ВСА34 в область живота мышей (16А). Представлено изменение среднего объема голени (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа, которым вводили 1 мг МАЬ67 или 1 мг контрольного 1дО мыши после инъекции 50000 фибробластных клеток опухоли ВСА34 в мышцу конечности мыши (16В).
Фиг. 17. Представлено изменение объема опухоли (мм3) для мышей Ва1Ь/с дикого типа и мышей СИ100 (8ЕМА4И-/- ) после инъекции 50000 клеток карциномы молочной железы мыши ЕМТ6 в мышцу конечности мыши.
Фиг. 18. Представлено изменение объема опухоли (мм3) для бестимусных мышей пибе после подкожных инъекций двух опухолей головы и шеи НЯ2/\(ышь в мышцу бока мыши. Результаты представлены для мышей, которым инъецировали 1 мг МАЬ2503 раз в неделю, начиная на 1 сутки после трансплантации, по сравнению с мышами, которым инъецировали контрольный 1дО4.
Фиг. 19. Представлено изменение объема опухоли (мм3) для бестимусных мышей пибе после подкожных инъекций двух опухолей головы и шеи ΗΝ6 Н1Р1а тОИИ в мышцу конечности мыши. Результаты представлены для мышей, которым инъецировали 1 мг МАЬ2503 раз в неделю, начиная с 1 суток после трансплантации, по сравнению с мышами, которым инъецировали контрольный 1дО4 (19А). Представлены изображения репрезентативных опухолей мышей, которым вводили контрольный 1дО4 и МАЬ2503 (19В).
Фиг. 20. Результаты процентного насыщения для анализа насыщения после однократной внутривенной инъекции МАЬ2503 у крыс. Крысам Зрюдие-ИаШеу проводили однократную внутривенную инъекцию МАЬ2503 в дозах 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 100 мг/кг. Основанный на проточной цитометрии анализ насыщения проводили на лизированной цельной крови в различные моменты времени для определения процента клеточной мишени (8ЕМА4И), насыщенной МАЬ2503 у самцов (20А) и самок (20В) крыс.
Фиг. 21. Результаты процентного насыщения для анализа насыщения после однократной внутривенной инъекции МАЬ2503 у яванского макака. Яванским макакам проводили однократную внутривенную инъекцию МАЬ2503 в дозах 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 100 мг/кг. Основанный на проточной цитометрии анализ насыщения проводили на лизированной цельной крови в различные моменты времени для определения процента клеточной мишени (8ЕМА4И), насыщенной МАЬ2503 (данные для самцов и самок объединяли).
Подробное описание изобретения
I. Определения.
Следует отметить, что форма единственного числа объекта относится к одному или нескольким таким объектам; например, под антителом против СИ100 подразумевают одно или несколько антител против СИ100. По существу, форма единственного числа, термины один или несколько и по меньшей мере один можно использовать в настоящем документе взаимозаменяемо.
Как используют в настоящем документе термин опухоль относится как к злокачественному, так и доброкачественному росту и пролиферации всех неопластических клеток и ко всем злокачественным и предзлокачественным клеткам и тканям.
Инвазивный ангиогенез относится к образованию кровеносных сосудов для поддержания патологических состояний, включая злокачественные и незлокачественные опухоли, а также аномальное образование новых кровеносных сосудов при дегенерации желтого пятна.
Термины злокачественная опухоль и злокачественный относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом кле- 5 025245 ток. Примеры злокачественной опухоли включают, но не ограничиваются ими, карциномы, лимфомы и лейкозы.
Как используют в настоящем документе, подразумевают, что термин полипептид охватывает форму единственного числа полипептид, а также форму множественного числа полипептиды и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот и не относится к конкретной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей двух или более аминокислот, включены в определение полипептид, и термин полипептид можно использовать вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Также подразумевают, что термин полипептид относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, включая, но не ограничиваясь ими, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, амидацию, преобразование в производное известными защищающими/блокирующими группами, протеолитическое расщепление или модификацию не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может происходить из природного биологического источника или он может быть продуцирован рекомбинантной технологией, но не обязательно транслирован с указанной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, включая химический синтез.
Полипептид по изобретению может иметь размер приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более либо 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой обозначают как свернутые, а полипептиды, которые не обладают определенной трехмерной структурой, а вместо этого могут принимать большое количество различных конформаций, называют несвернутыми. Как используют в настоящем документе, термин гликопротеин относится к белку, связанному по меньшей мере с одной углеводной группой, которая связана с белком через содержащую кислород или содержащую азот боковую цепь аминокислотного остатка, например, остатка серина или остатка аспарагина.
Под выделенным полипептидом или фрагментом, вариантом или его производным понимают полипептид, который не находится в его природной среде. Не требуется конкретного уровня очистки. Например, выделенный полипептид может быть удален из его нативного или природного окружения. Рекомбинантно продуцированные полипептиды и белки, экспрессированные в клетках-хозяевах, считаются выделенными для целей изобретения, как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые отделены, фракционированы или частично или по существу полностью очищены любым пригодным способом.
Также в качестве полипептидов по настоящему изобретению включены фрагменты, производные, аналоги или варианты указанных выше полипептидов и любая их комбинация. Термины фрагмент, вариант, производное и аналог при указании на антитела или полипептиды антител против ΟΌ100 по настоящему изобретению включают любые полипептиды, которые сохраняют, по меньшей мере, некоторые из антигенсвязывающих свойств соответствующего антитела или полипептида антитела по изобретению. Фрагменты полипептидов по настоящему изобретению включают протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, в дополнение к конкретным фрагментам антител, рассмотренных в настоящем документе. Варианты антител и полипептидов антител против ΟΌ100 по настоящему изобретению включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. Варианты могут встречаться в природе или они могут быть не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты можно получать с использованием известных в данной области способов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или вставки. Вариантные полипептиды также могут быть обозначены в настоящем документе как аналоги полипептидов. Как используют в настоящем документе производное антитела или полипептида антитела против ΟΌ100 относится к рассматриваемому полипептиду, имеющему один или несколько остатков, химически преобразованных путем реакции функциональной боковой группы. Также в качестве производных включаются пептиды, которые содержат одну или несколько встречающихся в природе аминокислот, являющихся производными двадцати стандартных аминокислот. Например, 4гидроксипролин может заменять пролин; 5-гидроксилизин может заменять лизин; 3-метилгистидин может заменять гистидин; гомосерин может заменять серин; орнитин может заменять лизин. Производные антител и полипептидов антител против ΟΌ100 по настоящему изобретению могут включать полипептиды, которые изменены так, чтобы они проявляли дополнительные признаки, не встречающиеся на эталонном антителе или полипептиде антитела по изобретению.
Подразумевают, что термин полинуклеотид охватывает единичную нуклеиновую кислоту, а также множество нуклеиновых кислот, и он относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты или конструкции, например, матричной РНК (мРНК) или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать традиционную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь,
- 6 025245 такую как встречается в пептидных нуклеиновых кислотах (ΡΝΑ)). Термин нуклеиновая кислота относится к любому одному или нескольким сегментам нуклеиновых кислот, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде. Под выделенной нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом понимают молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая извлечена из ее нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу против ΤΌΚΙΟ, например, антитело или его антигенсвязывающую часть, содержащийся в векторе, считается выделенным для целей настоящего изобретения. Следующие примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах или очищенные (частично или существенно) полинуклеотиды в растворе.
Выделенные молекулы РНК включают РНК-транскрипты полинуклеотидов по настоящему изобретению ίη νίνο или ίη νίΐτο. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, включают такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, участок связывания рибосом или терминатор транскрипции.
Как используют в настоящем документе, кодирующая область представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя стоп-кодон (ΤΑΟ, ΤΟΑ или ТАА) не транслируется в аминокислоту, его можно считать частью кодирующей области, однако какие-либо фланкирующие последовательности, например промоторы, участки связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны и т.п., не являются частью кодирующей области. В одной полинуклеотидной конструкции могут находиться две или более кодирующих областей по настоящему изобретению, например на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например на отдельных (различных) векторах. Более того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или он может содержать две или более кодирующих областей, например, один вектор может отдельно кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по изобретению могут кодировать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо неслитые с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело против СО100 или его фрагмент, вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, но не ограничиваются ими, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
В определенных вариантах осуществления полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляют собой ДНК. В случае ДНК, полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая обычно кодирует полипептид, может включать промотор и/или другие элементы контроля транскрипции или трансляции, функционально связанные с одной или несколькими кодирующими областями. Функциональная связь представляет собой связь, когда кодирующая область для продукта гена, например полипептида, ассоциирована с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия продукта гена находилась под влиянием или контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (такие как кодирующая полипептид область и промотор, ассоциированный с ней) являются функционально связанными если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желаемый продукт гена, и если природа связи между этими двумя фрагментами ДНК не препятствует способности регулирующих экспрессию последовательностей направлять экспрессию продукта гена или не препятствует способности ДНК-матрицы к транскрипции. Таким образом, промоторная область может быть функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен обеспечивать транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой клеточно-специфичный промотор, который обеспечивает транскрипцию ДНК по существу только в заданных клетках. Помимо промотора, для обеспечения клеточно-специфичной транскрипции с полинуклеотидом могут быть функционально связаны другие элементы контроля транскрипции, например энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции. Пригодные промоторы и другие участки контроля транскрипции описаны в настоящем документе.
Специалистам в данной области известно множество участков контроля транскрипции. Они включают, но не ограничиваются ими, участки контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, такие как, но не ограничиваясь ими, промоторные и энхансерные сегменты из цитомегаловирусов (предранний промотор совместно с интроном-А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (таких как вирус саркомы Рауса). Другие участки контроля транскрипции включают участки, происходящие из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока, бычьего гормона роста и β-глобина кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные пригодные участки контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
Аналогично специалистам в данной области известно множество элементов контроля трансляции. Они включают, но не ограничиваются ими, участки связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, происходящие из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы, или ΙΚΕδ, также обозначаемый как последовательность С1ТЕ).
- 7 025245
В других вариантах осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК).
Полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты кодирующих областей по настоящему изобретению могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые направляют секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом по настоящему изобретению. Согласно сигнальной гипотезе, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка после начала экспорта растущей белковой цепи через шероховатую эндоплазматическую сеть. Специалистам в данной области известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, обычно имеют сигнальный пептид, слитый с Ν-концом полипептида, который отщепляется от полного или полноразмерного полипептида с образованием секретируемой или зрелой формы полипептида. В определенных вариантах осуществления используют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина или функциональное производное этой последовательности, которые сохраняют способность обеспечивать секрецию полипептида, который функционально ассоциирован с ними. Альтернативно можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например лидерная последовательность дикого типа может быть замещена лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена (ТРА) человека или β-глюкуронидазы мыши.
Связывающая молекула или антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению относится в ее наиболее широком значении к молекуле, которая специфично связывает антигенную детерминанту. В одном варианте осуществления связывающая молекула специфично связывается с СЭ100, например, трансмембранным полипептидом СЭ100 размером приблизительно 150 кДа или растворимым полипептидом ί'.Ό100 размером приблизительно 120 кДа (обычно обозначаемым как 5СЭ100). В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере одну СОК тяжелой или легкой цепи молекулы антитела. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере две СОК из одной или нескольких молекул антител. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере три СОК из одной или нескольких молекул антител. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере четыре СОК из одной или нескольких молекул антител. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере пять СОК из одной или нескольких молекул антител. В другом варианте осуществления связывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере шесть СОК из одной или нескольких молекул антител.
Настоящее изобретение относится к определенным антителам против СО100 или их антигенсвязывающим фрагментам, вариантам или производным. Если нет конкретного указания на полноразмерные антитела, такие как встречающиеся в природе антитела, термин антитела против СО100 охватывает полноразмерные антитела, а также антигенсвязывающие фрагменты, варианты, аналоги или производные таких антител, например, встречающиеся в природе молекулы антител или иммуноглобулинов или сконструированные молекулы антител или фрагменты, которые связывают антиген аналогично молекулам антител.
Как используют в настоящем документе антитела человека или полностью человеческие антитела включают антитела, имеющие аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, и включают антитела, выделенные из библиотек иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или нескольким иммуноглобулинам человека и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, как описано ниже и, например, в патенте США № 5939598, Кисйег1арай с1 а1. Антитела человека или полностью человеческие антитела также включают антитела, содержащие, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи или, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи, где вариабельный домен(ы) имеют аминокислотную последовательность вариабельного домена(ов) иммуноглобулинов человека.
Антитела человека или полностью человеческие антитела также включают антитела человека или полностью человеческие антитела, как описано выше, которые содержат, по существу состоят или состоят из вариантов (включая производные) молекул антител (например, УН-областей и/или УЬобластей), описанных в настоящем документе, причем эти антитела или их фрагменты иммуноспецифично связываются с полипептидом СО100 или его фрагментом или вариантом. Для внесения мутаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против СО100 человека, можно использовать стандартные способы, известные специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез, который приводит к аминокислотным заменам. Предпочтительно варианты (включая производные) кодируют менее 50 аминокислотных замен, менее 40 аминокислотных замен, менее 30 аминокислотных замен, менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотных замен, менее 3 аминокислотных замен или менее 2
- 8 025245 аминокислотных замен относительно эталонной УН-области, УНСЭР1. УНСЭК2. УНСЭРЗ. УЪобласти, УЪСПК1, \ТС1)К2 или У1.С1ЖУ
В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены, дополнительно обсуждаемые ниже. Альтернативно мутации можно вносить случайным образом вдоль всей или части кодирующей последовательности, например мутагенезом с насыщением, и полученные мутанты можно подвергать скринингу в отношении биологической активности для идентификации мутантов, которые сохраняют активность (например, способность связывать полипептид СЭ100, например, СЭ100 человека, мыши и как человека, так и мыши). Такие варианты (или их производные) антител человека или полностью человеческих антител также могут называться антителами человека или полностью человеческими антителами, которые являются оптимизированными или оптимизированными в отношении связывания антигена, и они включают антитела, которые обладают увеличенной аффинностью к антигену.
Термины антитело и иммуноглобулин используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Антитело или иммуноглобулин содержит, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи и обычно содержит, по меньшей мере, вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры иммуноглобулинов в системах позвоночных относительно хорошо понятны. См., например, Нат1оте с1 а1., АийЬоФек: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1 (Со1б δρτίημ НагЬот ЬаЪогаЮгу Рте88, 2иб еб. 1988).
Как более подробно рассмотрено ниже, термин иммуноглобулин включает различные широкие классы полипептидов, которые могут быть отличены друг от друга биохимически. Специалистам в данной области понятно, что тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) с некоторыми подклассами среди них (например, γ1-γ4). Также природа этой цепи определяет класс антитела как 1§О, 1дМ, 1дА 1дС или 1дЕ соответственно. Подклассы иммуноглобулинов (изотипы), например, 1дО1, 1§О2, 1дО3, 1дО4, 1дА1 и т.д., хорошо охарактеризованы и известно, что они обеспечивают функциональную специализацию.
Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов будут понятны специалисту в данной области с учетом настоящего описания и, таким образом, они входят в объем настоящего изобретения. Все классы иммуноглобулинов, безусловно, находятся в объеме настоящего изобретения; представленное ниже описание, главным образом, относится к классу 1дС молекул иммуноглобулинов. Что касается 1§О, стандартная молекула иммуноглобулина содержит два идентичных полипептида легкой цепи с молекулярной массой приблизительно 23000 Да, и два идентичных полипептида тяжелой цепи с молекулярной массой 53000-70000. Эти четыре цепи, как правило, связаны дисульфидными связями в конфигурации Υ, где легкие цепи обхватывают тяжелые цепи, начиная у раздвоения Υ и продолжая через вариабельную область.
Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда (κ, λ). Каждый класс тяжелых цепей может быть связан либо с легкой цепью каппа, либо с легкой цепью лямбда. Как правило, легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом и хвостовые части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда иммуноглобулины получают с помощью гибридом, В-клеток или генетически сконструированных клеток-хозяев. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности располагаются с Ν-конца на вилкообразных концах Υ-конфигурации до С-конца внизу каждой цепи.
Как легкие, так и тяжелые, цепи разделяют на области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный используют функционально. В этом отношении понятно, что вариабельные домены частей как легкой (УЬ), так и тяжелой (УН) цепей, определяют распознавание антигена и специфичность. Напротив, константные домены легкой цепи (СЬ) и тяжелой цепи (СН1, СН2 или СН3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, способность проходить через плаценту, связывание Рс-рецептора, связывание комплемента и т.п. Обычно нумерация доменов константной области возрастает по мере того, как они становятся более дистальными от антигенсвязывающего центра или Ν-конца антитела. Ν-концевая часть представляет собой вариабельную область и на Сконцевой части находится константная область; СН3- и СЬ-домены в действительности содержат Сконец тяжелой и легкой цепей соответственно.
Как указано выше вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфично связывать эпитопы на антигенах. Значит, УЪ-домен и УН-домен, или подгруппа определяющих комплементарность областей (СОК) антитела объединяются с образованием вариабельной области, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий центр. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий центр, находящийся на конце каждого плеча Υ. Более конкретно, антигенсвязывающий центр определяется тремя СОК на каждой из цепей УН и УЪ. В некоторых случаях, например, в случае определенных молекул иммуноглобулинов, происходящих из видов верблюжьих или сконструированных на основе иммуноглобулинов верблюжьих, полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей, без легких цепей. См., например, Натеге-СаЧегтап е1 а1., №11иге 363:446-448 (1993).
Во встречающихся в природе антителах шесть определяющих комплементарность областей или
- 9 025245
СЭК. присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, являются короткими несмежными последовательностями аминокислот, которые расположены определенным образом так, чтобы образовывать антигенсвязывающий домен, когда антитело принимает его трехмерную конфигурацию в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые каркасными областями, демонстрируют меньшую внутримолекулярную вариабельность. Каркасные области по большей части принимают конформацию β-слоя, а СОК образуют петли, которые соединяют и в некоторых случаях формируют часть структуры β-слоя. Таким образом, каркасные области образуют остов, который обеспечивает расположение СОК в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный ориентированными СОК, определяет комплементарность поверхности эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность обеспечивает нековалентное связывание антитела с его собственным эпитопом. Специалист в данной области может легко идентифицировать аминокислоты, составляющие СОК и каркасные области, соответственно, для любой данной вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи, поскольку они были точно определены (см. ниже).
В случае, когда существует два или более определений термина, который используют и/или который принят в данной области, подразумевают, что определение термина, как используют в настоящем документе, включает все такие значения, если ясно не указано иное. Конкретным примером является применение термина определяющая комплементарность область (СОК) для описания несмежных антигенсвязывающих центров, находящихся в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепей. Эта конкретная область была описана КаЬа1 е! а1. (1983), И.8. Оер1. о£ НеаНй апй Нитап 8егу1се5, Зециепсек о£ Рго1еш5 оГ 1ттипо1ощса1 1п!егек! и Сйо!Ыа апй Ьекк., 1. Мо1. Βίο1. 196:901-917 (1987), которые включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме, где определения включают перекрывания подгрупп аминокислотных остатков при сравнении друг против друга. Тем не менее, подразумевают, что применение любого определения для обозначения СОК антитела или его вариантов входит в объем термина, определенного и применяемого в настоящем документе. Подходящие аминокислотные остатки, которые охватывают СОК, как определено в каждой из цитированных выше ссылок, указаны ниже в табл. 1 в качестве сравнения. Точные номера остатков, которые охватывают конкретную СОК, варьируют, в зависимости от последовательности и размера СОК. Специалисты в данной области могут обычными способами определить, какие остатки составляют конкретную СОК, учитывая аминокислотную последовательность вариабельной области антитела.
Таблица 1
Определения СОК1
КаЬа! СЬоьЫа
νΗ СЬЕ1 31-35 26-32
УН СБК2 50-65 52-58
УН ськз 95-102 95-102
УЬ СЬК1 24-34 26-32
УЬ СЬК2 50-56 50-52
УЬ ськз 89-97 91-96
1 Нумерация всех определений СОК приведена согласно правилам нумерации, установленным КаЬа! е! а1. (см. ниже).
КаЬа! е! а1. также определили систему нумерации для последовательностей вариабельных доменов, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области может недвусмысленно применить эту систему нумерации по КаЬа! к любой последовательности вариабельного домена, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные помимо самой последовательности. Как используют в настоящем документе, нумерация по КаЬа! относится к системе нумерации, представленной в КаЬа! е! а1. (1983), и.8. Оер!. о£ Неа1!й апй Нитап Зетуюек, Зециепсек о£ Рто!ешк о£ 1ттипо1ощса1 1п!егек!. Если нет иных указаний, указание на нумерацию конкретных положений аминокислотных остатков в антителе против СО100 или его антигенсвязывающем фрагменте, варианте или производном по настоящему изобретению, приводится согласно системе нумерации КаЬа!.
Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, полиспецифические, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, связывающие эпитоп фрагменты, например РаЬ, РаЬ' и Е(аЬ')2, Ей, Ρν, одночепочечные Ρν (ί^Ρν), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидной связью Ρν (5ЙΡν), фрагменты, содержащие либо УЪ-домен, либо УН-домен, фрагменты, продуцируемые экспрессирующей ЕаЬ библиотекой, и антиидиотипические (анти-1й) антитела (включая, например, анти-1й антитела к антителам против СО100, описанным в настоящем документе). Молекулы 8сЕу известны в данной области и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител по изобретению могут быть любого типа (например, 1дО, 1дЕ, 1дМ, 1дО, 1дА и Ι§Υ), класса (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дА1 и 1дА2 и т.д.) или подклас- 10 025245 са молекул иммуноглобулинов.
Как используют в настоящем документе, термин часть тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий часть тяжелой цепи, содержит по меньшей мере одно из: СН1-домен, шарнирный (например, верхний, средний и/или нижний шарнирный) домен, СН2-домен, СНЗ-домен, или их вариант или фрагмент. Например, связывающий полипептид для применения в изобретении может содержать полипептидную цепь, содержащую СН1-домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен, по меньшей мере часть шарнирного домена, и СН2-домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен и СНЗ-домен; полипептидную цепь, содержащую СН1-домен, по меньшей мере часть шарнирного домена и СНЗ-домен, или полипептидную цепь, содержащую СН1-домен, по меньшей мере часть шарнирного домена, СН2-домен и СНЗдомен. В другом варианте осуществления полипептид по изобретению содержит полипептидную цепь, содержащую СНЗ-домен. Кроме того, связывающий полипептид для применения в изобретении может быть лишен по меньшей мере части СН2-домена (например, всего СН2-домена или его части). Как указано выше, специалистам в данной области понятно, что эти домены (например, части тяжелой цепи) могут быть модифицированы так, чтобы их аминокислотная последовательность варьировала относительно встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина.
В определенных антителах против СП100 или их антигенсвязывающих фрагментах, вариантах или производных, описанных в настоящем документе, части тяжелых цепей одной полипептидной цепи мультимера идентичны частям тяжелых цепей на второй полипептидной цепи мультимера. Альтернативно содержащие часть тяжелой цепи мономеры по изобретению не являются идентичными. Например, каждый мономер может содержать отличающийся участок связывания мишени, образующий, например, биспецифическое антитело.
Части тяжелых цепей связывающей молекулы для применения в способах диагностики и лечения, описных в настоящем документе, могут происходить из различных молекул иммуноглобулинов. Например, часть тяжелой цепи полипептида может содержать СН1-домен, происходящий из молекулы 1дС1, и шарнирную область, происходящую из молекулы 1дС3. В другом примере часть тяжелой цепи может содержать шарнирную область, происходящую, частично, из молекулы 1§С1 и, частично, из молекулы 1дС3. В другом примере часть тяжелой цепи может содержать химерную шарнирную область, происходящую, частично, из молекулы 1§С1 и, частично, из молекулы 1дС4.
Как используют в настоящем документе, термин часть легкой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из легкой цепи иммуноглобулина, например, легкой цепи каппа или лямбда. Предпочтительно часть легкой цепи содержит по меньшей мере один из УЬ- или СЬ-домена.
Антитела против СП100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, описанные в настоящем документе, могут быть описаны или определены с точки зрения эпитопа(ов) или части(ей) антигена, например, полипептида-мишени, описанного в настоящем документе (например, ί'Ό100). который они могут распознавать или специфически связывать. Часть полипептида-мишени, которая специфично взаимодействует с антигенсвязывающим доменом антитела, представляет собой эпитоп или антигенную детерминанту. Полипептид-мишень может содержать единичный эпитоп, но, как правило, он содержит по меньшей мере два эпитопа и может включать любое количество эпитопов, в зависимости от размера, конформации и типа антигена. Более того, следует отметить, что эпитоп на полипептиде-мишени может представлять собой или может включать неполипептидные элементы, например, эпитоп может включать углеводную боковую цепь.
Считают, что минимальный размер пептидного или полипептидного эпитопа для антитела составляет приблизительно от четырех до пяти аминокислот. Пептидные или полипептидные эпитопы предпочтительно содержат по меньшей мере семь, более предпочтительно по меньшей мере девять и наиболее предпочтительно по меньшей мере от приблизительно 15 до приблизительно 30 аминокислот. Поскольку СОК может распознавать антигенный пептид или полипептид в третичной форме, аминокислоты, содержащие эпитоп, не должны быть непрерывными, и, в некоторых случаях, они могут даже не быть на одной пептидной цепи. Пептидный или полипептидный эпитоп, распознаваемый антителами против СЭ100 по настоящему изобретению, может содержать последовательность из по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, более предпочтительно по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или от приблизительно 15 до приблизительно 30 последовательно расположенных или не последовательно расположенных аминокислот СЭ100.
Под специфично связывает, главным образом, подразумевают, что антитело связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий домен, и что связывание вовлекает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению, говорят, что антигенсвязывающий полипептид специфично связывается с эпитопом, когда он связывается с этим эпитопом через его антигенсвязывающий домен легче, чем он бы связывался со случайным независимым эпитопом. Термин специфичность используют в настоящем документе для качественного определения относительной аффинности, с которой определенный антигенсвязывающий полипептид связывается с определенным эпитопом. Например, антитело А можно считать имеющим более высокую специфичность к
- 11 025245 данному эпитопу, чем антитело В, или антитело А можно называть связывающим эпитоп С с более высокой специфичностью, чем оно имеет к родственному эпитопу Ό.
Под предпочтительно связывает подразумевают, что антигенсвязывающий полипептид специфично связывается с эпитопом легче, чем он связывался бы с родственным, сходным, гомологичным или аналогичным эпитопом. Таким образом, антигенсвязывающий полипептид, который предпочтительно связывается с данным эпитопом, с большей вероятностью связывается с этим эпитопом, чем с родственным эпитопом, даже несмотря на то, что антитело может перекрестно реагировать с родственным эпитопом.
В качестве неограничивающего примера, антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающимся с первым эпитопом, если он связывает указанный первый эпитоп с константой диссоциации (Кс), которая является меньшей, чем Кс антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающим первый антиген, если он связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок величины меньше, чем Кс антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающим первый эпитоп, если он связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка величины ниже, чем Кс антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа.
В другом неограничивающем примере антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающим первый эпитоп, если он связывает первый эпитоп с константной диссоциации (к(о££)), которая ниже к(о££) антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающим первый эпитоп, если он связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на один порядок величины меньше, чем к(о££) антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа. В другом неограничивающем примере антигенсвязывающий полипептид можно считать предпочтительно связывающим первый эпитоп, если он связывает первый эпитоп с аффинностью, которая по меньшей мере на два порядка величины меньше, чем к(о££) антигенсвязывающего полипептида в отношении второго эпитопа. Можно сказать, что антигенсвязывающий полипептид или вариант, или производное, описанные в настоящем документе, связывает полипептид-мишень, описанный в настоящем документе (например, СЭ100, например, СЭ100 человека, мыши, или как человека, так и мыши) или его фрагмент, или вариант с константой диссоциации (к(о££)), меньшей или равной 5х10-2 с-1, 10-2 с-1, 5х10-3 с-1 или 10-3 с-1. Более предпочтительно, можно сказать, что антигенсвязывающий полипептид по изобретению связывает полипептид-мишень, описанный в настоящем документе (например, СЭ100, например, С'0100 человека, мыши, или как человека, так и мыши) или его фрагмент, или вариант, с константой диссоциации (к(о££)), меньшей или равной 5х10-4 с-1, 10-4 с-1, 5х10-5 с-1, или 10-5 с-1, 5х10-6 с-1, 10-6 с-1, 5х10-7 с-1 или 10-7 с-1.
Можно сказать, что антигенсвязывающий полипептид или вариант, или производное, описанные в настоящем документе, связывает полипептид-мишень, описанный в настоящем документе (например, СЭ100, например, СЭ100 человека, мыши, или как человека, так и мыши) или его фрагмент, или вариант, с константой ассоциации (коп) ), большей или равной 103 М-1с-1, 5х103 М-1с-1, 104 М-1с-1 или 5х104 М-1с-1. Более предпочтительно, можно сказать, что антигенсвязывающий полипептид по изобретению связывает полипептид-мишень, описанный в настоящем документе (например, 00100, например, С0100 человека, мыши, или как человека, так и мыши) или его фрагмент, или вариант, с константой ассоциации (к(оп)), большей или равной 105 М-1 с-1, 5х105 М-1с-1, 106 М-1с-1, 5х106 М-1с-1 или 107 М-1с-1.
Антитело называют конкурентно ингибирующим связывание эталонного антигенсвязывающего полипептида с данным эпитопом, если оно предпочтительно связывается с этим эпитопом так, что блокирует, в некоторой степени, связывание эталонного антигенсвязывающего полипептида с эпитопом. Конкурентное ингибирование можно определять любым способом, известным в данной области, например, конкурентными анализами ЕЬТЗА. Может быть указано, что антигенсвязывающий полипептид конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.
Как используют в настоящем документе, термин аффинность относится к мере прочности связывания отдельного эпитопа с СОК молекулы иммуноглобулина. См., например, Наг1оте с1 а1., АпбЬоШсх; А ЬаЬога1огу Мапиа1 (Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, 2пб сб. 1988) на с. 27-28. Как используют в настоящем документе, термин авидность относится к общей стабильности комплекса между совокупностью антигенсвязывающих полипептидов и антигеном, т.е. к функциональной совокупной прочности смеси иммуноглобулинов с антигеном. См., например, Наг1оте на с. 29-34. Авидность связана как с аффинностью отдельных антигенсвязывающих полипептидов в популяции к конкретным эпитопам, так и с валентностью антигенсвязывающих полипептидов и антигена. Например, взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и антигеном с высокоповторяющейся эпитопной структурой, такой как полимер, представляет собой взаимодействие с высокой авидностью.
- 12 025245
Антитела против ί'Ό100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению также могут быть описаны или определены по перекрестной реактивности. Как используют в настоящем документе, термин перекрестная реактивность относится к способности антитела, специфичного к одному антигену, реагировать со вторым антигеном; мере взаимосвязи между двумя различными антигенными веществами.
Таким образом, антитело является перекрестно-реагирующим, если оно связывается с эпитопом, отличным от эпитопа, который индуцировал его образование. Перекрестно-реактивный эпитоп, как правило, содержит многие из тех же комплементарных структурных элементов, что и в индуцирующем эпитопе, и, в некоторых случаях, он может подходить лучше, чем исходный эпитоп.
Например, определенные антитела имеют некоторую степень перекрестной реактивности в том, что они связывают родственные, но неидентичные эпитопы, например, эпитопы с по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 55% и по меньшей мере 50% идентичностью (как вычислено с использованием способов, известных в данной области и описанных в настоящем документе) с эталонным эпитопом. Антитело можно назвать имеющим небольшую перекрестную реактивность или не имеющим ее, если оно не связывает эпитопы с менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50% идентичностью (как вычисляют с использованием способов, известных в данной области и описанных в настоящем документе) с эталонным эпитопом. Антитело можно считать высокоспецифичным в отношении определенного эпитопа, если оно не связывает какой-либо другой аналог, ортолог или гомолог этого эпитопа.
Связывающие молекулы против СЭ100. например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, по изобретению также могут быть описаны или определены по их аффинности связывания с полипептидом по изобретению, например, СЭ100, например, СЭ100 человека, мыши, или как человека, так и мыши. Предпочтительная аффинность связывания включает аффинность с константой диссоциации или Кб менее 5х10-2 М, 10-2 М, 5х10-3 М, 10-3 М, 5х10-4 М, 10-4 М, 5х10-5 М, 10-5 М, 5х10-6 М, 10-6 М, 5х10-7 М, 10-7 М, 5х10-8 М, 10-8 М, 5х10-9 М, 10-9 М, 5х10-10 М, 10-10 М, 5х10-11 М, 10-11 М, 5х10-12 М, 10-12 М, 5х10-13 М, 10-13 М, 5х10-14 М, 10-14 М, 5х10-15 М или 10-15 М. В определенных вариантах осуществления связывающая молекула против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению, связывает СЭ100 человека с Кб от приблизительно 5х10-9 до приблизительно 6х10-9. В другом варианте осуществления связывающая молекула против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению, связывает СЭ100 мыши с Кб от приблизительно 1 х 10-9 до приблизительно 2х10-9.
Антитела против СЭ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению могут быть полиспецифическими, например биспецифическими, триспецифическими или более высокополиспецифическими, что означает, что они распознают и связываются с двумя или более различными эпитопами, присутствующими на одном или нескольких различных антигенах (например, белках) одновременно. Таким образом, то, является ли антитело против СЭ100 моноспецифическим или полиспецифическим, например, биспецифическим, относится к количеству различных эпитопов, с которыми реагирует связывающий полипептид. Полиспецифические антитела могут быть специфичными к различным эпитопам полипептида-мишени, описанным в настоящем документе, или они могут быть специфичными к полипептиду-мишени, а также к гетерологичному эпитопу, такому как гетерологичный полипептид или материал твердой подложки.
Как используют в настоящем документе, термин валентность относится к количеству потенциальных связывающих доменов, например, антигенсвязывающих доменов, присутствующих в связывающем полипептиде или связывающей СЭ100 молекуле, например, антителе или его антигенсвязывающей части. Каждый связывающий домен специфично связывает один эпитоп. Когда связывающий полипептид или связывающая СЭ100 молекула содержит более одного связывающего домена, каждый связывающий домен может специфично связывать тот же эпитоп для антитела с двумя связывающими доменами, называемого двухвалентным моноспецифическим, или с различными эпитопами для антитела с двумя связывающими доменами, называемого двухвалентным биспецифическим. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также может быть биспецифическим или двухвалентным для каждой специфичности (называемые биспецифическими четырехвалентными антителами). В другом варианте осуществления можно получать четырехвалентные миниантитела или антитела с делецией домена.
Биспецифические двухвалентные антитела и способы их получения описаны, например, в патентах США № 5731168; 5807706; 5821333 и публикациях патентных заявок США № 2003/020734 и 2002/0155537, содержание всех из которых включено в настоящий документ в качестве ссылки. Биспецифические четырехвалентные антитела и способы их получения описаны, например, в νθ 02/096948 и \νϋ 00/44788, содержание обеих из которых включено в настоящий документ в качестве ссылки. См., главным образом, публикации РСТ νθ 93/17715; νθ 92/08802; νθ 91/00360; νθ 92/05793; Тий е1 а1., I. 1ттипо1. 147:60- 69 (1991); патенты США № 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 5601819; Ко§1е1пу е1
- 13 025245 а1., ί. 1ттипо1. 148: 1547-1553 (1992).
Как указано выше, субъединичные структуры и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Как используют в настоящем документе, термин УН-домен включает Ν-концевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и термин СН1-домен включает первый домен (наиболее Ν-концевой) константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. СН1-домен является соседним с УН-доменом и является Ν-концевым для шарнирной области молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина.
Как используют в настоящем документе, термин СН2-домен включает часть молекулы тяжелой цепи, которая располагается, например, приблизительно от остатка 244 до остатка 360 антитела при использовании общепринятых схем нумерации (остатки с 244 по 360, система нумерации КаЬа!; и остатки 231-340, система нумерации ЕЙ; см. КаЬа! ЕА е! а1.). СН2-домен является уникальным в том, что он не спарен тесно с другим доменом. Вместо этого, между двумя СН2-доменами целой нативной молекулы 1дС расположены две Ν-связанные разветвленные углеводные цепи. Также убедительно документально подтверждено, что СН3-домен располагается от СН2 домена до С-конца молекулы 1§С и содержит приблизительно 108 остатков.
Как используют в настоящем документе, термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, которая связывает СН-домен с СН2-доменом. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 остатков и является подвижной, таким образом, позволяя двум Ν-концевым антигенсвязывающим участкам двигаться независимо. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирный домены (Коих е! а1., 1. 1ттипо1. 161:4083 (1998)).
Как используют в настоящем документе, термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул 1§С, области СН1 и СЬ связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 при использовании системы нумерации КаЬа! (положение 226 или 229, система нумерации ЕЙ).
Как используют в настоящем документе, термин химерное антитело означает любое антитело, где иммунореактивная область или участок получены или происходят из первого вида, а константная область (которая может быть целой, частичной или модифицированной согласно настоящему изобретению) получена из второго вида. В предпочтительных вариантах осуществления заданная связывающая область или участок может быть из источника, не являющегося человеком (например, из мыши или примата), а константная область является человеческой (например, моноклонального антитела (МАЬ) 2368, описанного в настоящем документе).
Как используют в настоящем документе, термин сконструированное антитело относится к антителу, в котором вариабельный домен либо в тяжелой цепи или легкой цепи, либо в обеих из них, изменен, по меньшей мере, частичной заменой одной или нескольких СЭК из антитела с известной специфичностью и, если необходимо, частичной заменой и изменением последовательности каркасной области. Хотя СЭК могут происходить из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого происходят каркасные области, предусматривается, что СЭК происходят из антитела отличающегося класса и предпочтительно из антитела отличающегося вида. Сконструированное антитело, в котором одна или несколько донорных СЭК из не являющегося человеческим антитела известной специфичности пересажена в каркасную область тяжелой или легкой цепи человека, называют в настоящем документе гуманизированным антителом. Замена всех СЭК полными СЭК из донорной вариабельного домена для переноса антигенсвязывающей способности одного с вариабельного домена на другой может не быть необходимой. Вместо этого, может быть необходимым только перенос тех остатков, которые необходимы для поддержания активности заданного участка связывания.
Кроме того, общепризнанно, что каркасные области в вариабельном домене в тяжелой или легкой цепи, или в обеих из них, гуманизированного антитела, могут содержать только остатки, происходящие из человека, в случае которых каркасные области гуманизированного антитела называют полностью человеческими каркасными областями (например, МАЬ 2503). Альтернативно один или несколько остатков каркасной области(ей) донорного вариабельного домена можно встраивать в соответствующее положение каркасной области(ей) вариабельного домена человека в тяжелой или легкой цепи, или в обеих из них, гуманизированного антитела, если необходимо, для поддержания надлежащего связывания или для усиления связывания с антигеном СЭ100. Каркасная область человека, которая сконструирована таким образом, следовательно, может содержать смесь каркасных остатков человека и донора, и ее обозначают в настоящем документе как частично человеческая каркасная область.
Например, гуманизацию антитела против СЭ100 можно по существу проводить в соответствии со способом ХУиНег и коллег Цопек е! а1., №!иге 321:522-525 (1986); КтесЬтаип е! а1., №Лиге 332:323-327 (1988); УегЬоеуеп е! а1., 8с1епсе 239:1534-1536 (1988)), путем замены СЭК или последовательностями СЭК грызунов или мутантными последовательностями СЭК или последовательностями СЭК грызунов соответствующих последовательностей антитела против СЭ100 человека. Также см. патенты США № 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205; включенные в настоящий документ в качестве ссылок.
- 14 025245
Полученное гуманизированное антитело против СЭ100 может содержать по меньшей мере одну СЭК грызуна или мутантную СОК грызуна в полностью человеческих каркасных областях вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи гуманизированного антитела. В некоторых случаях остатки в каркасных областях одного или нескольких вариабельных доменов гуманизированного антитела против СЭ100 заменяют соответствующими не являющимися человеческими остатками (например, грызунов) (см., например, патенты США № 5585089; 5693761; 5693762 и 6180370), и в этом случае полученное гуманизированное антитело против СЭ100 может содержать частично человеческие каркасные области в вариабельном домене тяжелой и/или легкой цепи.
Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации проводят для дальнейшего улучшения характеристик антител (например, для получения желаемой аффинности). Как правило, гуманизированное антитело может содержать по существу все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из СЭК соответствуют СЭК не являющегося человеческим иммуноглобулина и все или по существу все из каркасных областей представляют собой каркасные области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере часть константной области (Рс) иммуноглобулина, как правило, часть иммуноглобулина человека. Для дальнейших деталей см. ΐοηβδ с1 а1., №Лигс 331:522-525 (1986); ШесЬтапп е1 а1., №Лиге 332:323-329 (1988); и Ртейа, Сшт. Ор. §1гис1. ΒίοΙ. 2:593-596 (1992); включенные в настоящий документ в качестве ссылки. Таким образом, такие гуманизированные антитела могут включать антитела, где по существу менее чем целый вариабельный домен человека заменен соответствующей последовательностью из не являющихся человеком видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела человека, в которых некоторые остатки СЭК и, возможно, некоторые каркасные остатки заменены остатками из аналогичных участков в антителах грызунов. См., например, патенты США № 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205. Также см. патент США № 6180370, и международную публикацию № АО 01/27160, где описаны гуманизированные антитела и способы получения гуманизированных антител, имеющих улучшенную аффинность в отношении заданного антигена.
Как используют в настоящем документе, термины связанный, слитый или слияние используют взаимозаменяемо. Эти термины относятся к связыванию вместе двух или более элементов или компонентов любыми способами, включающими химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. Слияние в рамке считывания относится к связыванию двух или более открытых рамок считывания (ОКР) полинуклеотида с образованием непрерывной более длинной ОКР так, чтобы сохранялась правильная трансляционная рамка считывания исходных ОКР. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой единый белок, содержащий два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ОКР (эти сегменты в природе обычно не связаны друг с другом). Хотя рамка считывания, полученная таким образом, является непрерывной на протяжении слитых сегментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, линкерной последовательностью, находящейся в рамке считывания. Например, полинуклеотиды, кодирующие СЭК вариабельной области иммуноглобулина могут быть слитыми в рамке считывания, но разделенными полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные области СЭК, при условии что слитые СЭК транслируются совместно в качестве части непрерывного полипептида.
В контексте полипептидов линейная последовательность или последовательность представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от Ν- к С-концу, в которой остатки, которые являются соседними друг для друга в последовательности, являются смежными в первичной структуре полипептида.
Термин экспрессия, как используют в настоящем документе, относится к процессу, посредством которого с гена продуцируется биохимическое соединение, например полипептид. Этот процесс включает любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, но не ограничиваясь ими, нокдаун гена, а также как временную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, но не ограничиваясь ими, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК) и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если конечный желаемый продукт представляет собой биохимическое соединение, экспрессия включает создание этого биохимического соединения и любых предшественников. Экспрессия гена приводит к продукту гена. Как используют в настоящем документе, продукт гена может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, продуцируемую транскрипцией гена, либо полипептид, который транслируется с транскрипта. Продукты генов, описанные в настоящем документе, включают нуклеиновые кислоты с посттрансляционными модификациями, например, полиаденилированием, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, например метилированием, гликозилированием, добавлением липидов, ассоциацией с другими белковыми субъединицами, протеолитическим расщеплением и т.п.
Как используют в настоящем документе, термины лечить или лечение относятся как к терапевтическим, так и к профилактическим или предупреждающим мерам, где задачей является предупрежде- 15 025245 ние или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или нарушения, такого как прогрессирование рассеянного склероза, артрита или злокачественной опухоли. Благоприятные и желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, смягчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания, ослабление или смягчение болезненного состояния и ремиссию (как частичную, так и общую), как поддающиеся выявлению, так и не поддающиеся выявлению. Лечение также может означать продление выживания по сравнению с ожидаемым выживанием без проведения лечения. Индивидуумы, нуждающиеся в лечении, включают индивидуумов, уже имеющих состояние или нарушение, а также индивидуумов, предрасположенных к состоянию или нарушению, или индивидуумов, у которых состояние или нарушение подлежит профилактике.
Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевают любого субъекта, в частности субъекта-млекопитающего, для которого является желательной диагностика, прогнозирование или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных зоопарков, спортивных животных или животных-компаньонов, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и т.д.
Как используют в настоящем документе, выражения, такие как индивидуум, для которого может быть полезным введение антитела против СЭ100 и животное, нуждающееся в лечении, включают индивидуумов, таких как индивидуумы-млекопитающие, которым может быть полезно введение используемого антитела против СЭ100, например, для детекции полипептида против СЭ100 (например, для диагностического способа), и/или лечение, т.е. облегчение или предупреждение заболевания с помощью антитела против СГОНЮ. Как более подробно описано в настоящем документе, антитело против СГО100 можно использовать в неконъюгированной форме или его можно конъюгировать, например, с лекарственным средством, пролекарством или изотопом.
II. Описание полипептида-мишени.
Как используют в настоящем документе, термины СГО100 и полипептид СГО100 используют взаимозаменяемо. В определенных вариантах осуществления СГО100 экспрессируется на поверхности или секретируется клеткой. В другом варианте осуществления СГО100 является связанным с мембраной. В других вариантах осуществления СГО100 является растворимым, например, 8СЭ100. В других вариантах осуществления СГО100 может включать полноразмерный СГО100 или его фрагмент, или вариантный полипептид СГО100. где фрагмент СГО100 или вариантный полипептид СГО100 сохраняет некоторые или все функциональные свойства полноразмерного СГО100.
Полноразмерный белок СГО100 человека представляет собой гомодимерный трансмембранный белок, состоящий из двух полипептидных цепей размером 150 кДа. СГО100 относится к семейству рецепторов клеточной поверхности семафоринов и также обозначается как 8ΕΜΆ4Ό. 8ета4О/СГО100 как человека, так и мыши, протеолитически отщепляются от их трансмембранной формы с образованием растворимых форм массой 120 кДа, что указывает на существование двух изоформ 8ета4И (КитаподоЬ е! а1., I. Се11 8с1еисе 116(7):3464 (2003)). Семафорины состоят из растворимых и мембраносвязанных белков, которые первоначально были определены как факторы аксонального контроля, которые играют важную роль в установлении точных связей между нейронами и их соответствующей мишенью. Структурно рассматриваемый семафорин класса IV, СЭ100, состоит из Ν-концевой сигнальной последовательности, за которой следует характерный 8ета-домен, который содержит 17 консервативных остатков цистеина, 1д-подобный домен, лизин-богатый участок, гидрофобную трансмембранную область и цитоплазматическую хвостовую часть.
Каждая полипептидная цепь СГО100 включает сигнальную последовательность приблизительно из 13 аминокислот, за которой следует домен семафорина приблизительно из 512 аминокислот, иммуноглобулин-подобный (1д-подобный) домен приблизительно из 65 аминокислот, лизин-богатый участок из 104 аминокислот, гидрофобная трансмембранная область приблизительно из 19 аминокислот и цитоплазматическая хвостовая часть из 110 аминокислот. Консенсусный участок для фосфорилирования тирозина в цитоплазматической хвостовой части подтверждает предсказанную ассоциацию СГО100 с тирозинкиназой (8сЫо88таи, е! а1., Ебк. (1995), Ееисосу1е Τνρίημ V (Ох&тб ишуегейу Рте88, Ох&тб)).
Для СГО 100 идентифицировано два типа рецепторов. Один из рецепторов, плексин-В1, экспрессируется в нелимфоидных тканях и было показано, что он представляет собой высокоаффинный (1 нМ) рецептор для СИ100 (Татадпопе е! а1., Се11 99:71-80 (1999)).
Было показано, что стимуляция посредством СГО100 передачи сигнала плексина В1 индуцирует исчезновение конусов роста в нейронах и индуцирует остановку удлинения отростков и апоптоз олигодендроцитов (Оиаибоп е! а1., I. 1ттипо1. 772:1246-1255 (2004); Оиаибоп е! а1., №игоМо1еси1аг Меб. 7:207216 (2005)). После связывания с СГО100 передача сигнала плексина В1 опосредует инактивацию К-Ка8, что приводит к снижению опосредуемого интегрином присоединения к внеклеточному матриксу, а также к активации КЛо, приводящей к остановке реорганизации цитоскелета. См. Кгидег е! а1., №!ите Кеу. Мо1. Се11 Бю1 6:789-800 (2005); Ра5!еткатр, ΤΚΕΝΟ8 ш Се11 Бю1оду 75:61-64 (2005)).
В лимфоидных тканях СГО72 используют в качестве низкоаффинного (300 нМ) рецептора СГО100
- 16 025245 (Кишаподок е! а1., 1штипку 73:621-631 (2000)). В-клетки и АРС экспрессируют СЭ72, и антитела против СЭ72 обладают многими из тех же эффектов, что и 5СЭ100, такими как усиление индуцируемых СЭ40 В-клеточных ответов и слущивания с В-клеток СЭ23. Полагают, что СЭ72 действует в качестве отрицательного регулятора В-клеточных ответов путем привлечения тирозинфосфатазы 8НР-1, которая может связываться со многими ингибиторными рецепторами.
Взаимодействие СЭ100 с СЭ72 приводит к диссоциации 8НР-1 и утрате этого отрицательного сигнала активации. Было показано, что СЭ100 обеспечивает стимуляцию Т-клеток и агрегацию и выживание В-клеток ίη νίίτο. Добавление экспрессирующих СЭ100 клеток или 5СЭ100 усиливает индуцируемую СЭ40 пролиферацию В-клеток и продукцию иммуноглобулинов ίη νίίτο, и ускоряет ответы антител ίη νίνο (Ыийа е! а1., 1п1ег. 1шшипо1. 75:1027-1034 (2003); Кишаподок апй Н. Кики1ат, Ттепйк ίη 1шшипо1. 22:670-676 (2001)). 5СЭ100 усиливает индуцируемое СЭ40 созревание ОС, включая активацию костимуляторных молекул и увеличенную секрецию 1Ь-12. Кроме того, 5СЭ100 может ингибировать миграцию иммунных клеток, которая может быть обращена вспять добавлением блокирующих антител против СЭ100 мыши (Е1каЬа/1 е! а1., 1. 1шшипо1. 166:4341-4347 (2001); Эекиге е! а1., 1. 1шшипо1. 166:4348-4354 (2001)).
8еша4Э экспрессируется на высоких уровнях в лимфоидных органах, включая селезенку, тимус и лимфатические узлы, и в нелимфоидных органах, таких как головной мозг, сердце и почка. В лимфоидных органах 8еша4Э широко экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но только слабо экспрессируется на покоящихся В-клетках и антигенпредставляющих клетках (АРС), такие как дендритные клетки (ОС).
Клеточная активация увеличивает поверхностную экспрессию СЭ100, а также образование растворимого СЭ100 (5СЭ100). Паттерн экспрессии СЭ100 указывает на то, что он играет важную физиологическую, а также патологическую роль в иммунной системе. Было показано, что СЭ100 стимулирует активацию, агрегацию и выживание В-клеток; усиливает индуцируемую СЭ40 пролиферацию и продукцию антител; усиливает антительный ответ на зависимые от Т-клеток антигены; увеличивает пролиферацию Т-клеток; усиливает созревание дендритных клеток и способность стимулировать Т-клетки; и прямо вовлечен в демиелинизацию и аксональную дегенерацию (8кй е! а1., 1шшипку 73:633-642 (2000); Кишаподок е! а1., 1. 1шшипо1. 169:1175-1181 (2002) и \Уа1апаЬе е! а1., 1. 1шшипо1. 767:4321-4328 (2001)).
Мыши с нокаутом СЭ100 (СЭ100-/-) обеспечили дополнительные доказательства того, что СЭ100 играет важную роль как в гуморальных, так и в клеточных иммунных ответах. У мышей СЭ100-/- нет известных аномалий нелимфоидных тканей. Дендритные клетки (ОС) из мышей СЭ100-/- обладают плохой аллостимулирующей способностью и демонстрируют дефекты в экспрессии костимуляторных молекул, которые могут быть восстановлены добавлением 5СЭ100. У мышей с дефицитом СЭ100 (СЭ100-/-) не развивается экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, индуцируемый пептидом миелинового гликопротеина олигодендроцитов, поскольку специфичные к миелиновому гликопротеину олигодендроцитов Т-клетки не образуются в отсутствие СЭ100 (Кишаподок е! а1., ί. 1шшипо1. 7(59:1175-1181 (2002)). Значительное количество растворимого СЭ100 также выявлено в сыворотке склонных к аутоиммунитету мышей МКЬ/1рт (модель системных аутоиммунных заболеваний, таких как 8ЬЕ), но не у нормальных мышей. Кроме того, уровни 5СЭ100 коррелируют с уровнями аутоантител и возрастают с увеличением возраста (\Уапд е! а1., В1оой 97:3498-3504 (2001)). Было показано, что растворимый СЭ100 накапливается в цереброспинальной жидкости и сыворотке пациентов с демиелинизирующим заболеванием, и 5СЭ100 индуцирует апоптоз плюрипотентных предшественников нейронов человека (клетки Эеу), и как ингибирует удлинение отростков, так и индуцирует апоптоз олигодендроцитов крысы ш укго (Отаийоп е! а1., 1. 1шшипо1. 772(2): 1246-1255 (2004)). Этот апоптоз блокировался МАЬ против СЭ100.
III. Антитела против СЭ100.
Антитела, которые связывают СЭ100, описаны в данной области. См., например, публикацию США № 2008/0219971 А1, международную патентную заявку \УО 93/14125 и Него1й е! а1., 1п1. 1шшипо1. 7(1): 18 (1995), все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.
Антитела по изобретению включают антитела против СЭ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые связываются с СЭ100, например, МАЬ2503, МАЬ67 и МАЬ76. В определенных вариантах осуществления антитела против СЭ100 связывают СЭ100 человека, мыши или как человека, так и мыши. В других вариантах осуществления антитела против СЭ100 блокируют связывание СЭ100 с его рецептором, например, плексином-В.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенной связывающей молекуле, например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которая специфично связывается с тем же эпитопом СЭ100, что и моноклональные антитело 2503, 67 или 76. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенной связывающей молекуле, например антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которая специфично связывается с СЭ100 и конкурентно ингибирует специфичное связывание моноклонального антитела 2503, 67 или 76 с СЭ100, например СЭ100 человека, мыши, или как человека, так и мыши.
В определенных вариантах осуществления, связывающая молекула по изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере приблизительно 80%, приблизитель- 17 025245 но 85%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94% или приблизительно 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью эталонной молекулы антитела против СЭ100. В следующем варианте осуществления связывающая молекула обладает по меньшей мере приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или 100% идентичностью последовательности с эталонным антителом.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащим, по существу состоящим или состоящим из вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (УН-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УНдомена обладает аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична СЭК1, СИК2 или СИК3 8ЕЦ ГО N0: 9 или 10.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (УН-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УНдомена имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 7 или 8ЕЦ ГО N0: 8.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (УН-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УНдомена имеет аминокислотную последовательность, идентичную, за исключением 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен, 8ЕЦ ГО N0: 6, 8ЕЦ ГО N0: 7 или 8ЕЦ ГО N0: 8.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из УНдомена, который обладает аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% идентична 8ЕЦ ГО N0: 9 или 8ЕЦ ГО N0: 10, где антитело против СЭ100. содержащее кодируемый УН-домен, специфично или предпочтительно связывается с СИ 100.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (УЬ-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УЬдомена имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична СЭК1, СЭК2 или СЭК3 с 8ЕЦ ГО N0: 17 или 18.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (УЬ-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УЬдомена имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична 8ЕЦ ГО N0: 14, 8ЕЦ ГО N0: 15 или 8ЕЦ ГО N0: 16.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему, по существу состоящему или состоящему из вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (УЬ-домена), где по меньшей мере одна из СЭК УЬдомена имеет аминокислотную последовательность, идентичную, за исключением 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен, 8ЕЦ ГО N0: 14, 8ЕЦ ГО N0: 15 или 8ЕЦ ГО N0: 16.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие, по существу состоящие или состоящие из УЬ-домена, который обладает аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% идентична 8ЕЦ ГО N0: 17 или 8ЕЦ ГО N0: 18, где антитело против СЭ100, содержащее кодируемый УЬ-домен, специфично или предпочтительно связывается с СЭ100.
В способах по настоящему изобретению можно использовать пригодные биологически активные варианты антител против СЭ100. Такие варианты сохраняют желаемые связывающие свойства исходно- 18 025245 го антитела против СЭ100. Способы получения вариантов антител, главным образом, доступны в данной области.
Способы мутагенеза и изменений нуклеотидной последовательности хорошо известны в данной области. См., например, \Уа1кег апб Саазба, ебк. (1983), Тескпк|ие5 ίη Мо1еси1аг Вю1оду (МасМШап РиЫСкίη§ Сотрапу, Ые\у Уогк); Кипке1, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 52:488-492 (1985); Кипке1 е! а1., Ме!Ьоб8 Еп/уто1. 154:367-382 (1987); 8атЬгоок е! а1. (1989), Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1 (Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.); патент США № 4873192; и ссылки, цитированные в них; которые включены в настоящий документ в качестве ссылок. Руководство в отношении надлежащих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес полипептида, может быть найдено в модели ЭаукоГГ е! а1. (1978) в Абак оГ Рго!еш 8ес.|иепсе апб 81гис1иге (Ыа!1. Вютеб. Кек. Роипб., ^акк1пд1оп, Ό. С), р. 345-352, включенных в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. В модели ЭаукоГГ е! а1. используется матрица сходства аминокислот точковых общепринятых мутаций (РАМ) (матрица РАМ 250) для определения пригодных консервативных аминокислотных замен. Предпочтительными могут быть консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты другой, имеющей сходные свойства. Примеры консервативных аминокислотных замен, как обучена матрица РАМ 250 в модели ЭаукоГГ е! а1., включают, но не ограничиваются ими, С1у^А1а, Уа1^Пе^Ьеи, Акр^С1и, Ьук^Агд, Акп^С1п и РЬе^Тгр^Туг.
При конструировании вариантов связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представляющих интерес полипептидов, модификации вносят таким образом, что варианты продолжают обладать желаемыми свойствами, например, являясь способными специфично связываться с СЭ100, например, СЭ100 человека, мыши, или как человека, так и мыши, например, экспрессированным на поверхности или секретируемым клеткой и обладающим активностью блокирования СЭ100, как описано в настоящем документе. Очевидно, любые мутации, внесенные в ДНК, кодирующую вариантный полипептид, не должны помещать последовательность вне рамки считывания и предпочтительно не создают комплементарных областей, которые могут образовать вторичную структуру мРНК. См. публикацию патентной заявки ЕР № 75444.
Способы количественного определения специфичности связывания связывающей СЭ100 молекулы, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, включают, но не ограничиваются ими, стандартные конкурентные анализы связывания, анализы для мониторинга секреции иммуноглобулинов Т-клетками или В-клетками, анализы пролиферации Т-клеток, анализы апоптоза, анализы ЕЫ8А и т.п. См., например, такие анализы, описанные в \УО 93/14125; 8к е! а1., ЬптипПу 75:633-642 (2000); Китаподок е! а1., 1. 1ттипо1. 769:1175-1181 (2002); \Уа1апаЪе е! а1., 1. 1ттипо1. 767:4321-4328 (2001); \Уапд е! а1., В1ооб 97:3498-3504 (2001); и Сиаибоп е! а1., 1. 1ттипо1. 772(2): 1246-1255 (2004), все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок.
При обсуждении в настоящем документе того, является ли какой-либо конкретный полипептид, включая константные области, СОК, УН-домены или УЪ-домены, описанные в настоящем документе, по меньшей мере приблизительно на 65%, приблизительно на 70%, приблизительно на 75%, приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или даже приблизительно на 100% идентичными другому полипептиду, % идентичность можно определять с использованием способов и компьютерных программ/программного обеспечения, известных в данной области, таких как, но не ограничиваясь ими, программа ВЕ8ТР1Т (АУРсопмп 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде, Уегкюп 8 Гог Итх, Сепе!Ю5 Сотри!ег Сгоир, итуегкбу КекеагсЬ Рагк, 575 8с1епсе Опус, Маб18оп, \УР. 53711). ВЕ8ТР1Т использует алгоритм локальной гомологии 8ткк апб ^а!егтап (1981), Абу. Арр1. Ма!к. 2:482-489, для поиска наилучшего сегмента гомологии между двумя последовательностями. При использовании ВЕ8ТР1Т или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают, безусловно, так чтобы процент вычислялся на протяжении всей длины эталонной полипептидной последовательности и чтобы были допустимы пропуски в гомологии вплоть до 5% от общего количества аминокислот в эталонной последовательности.
Для целей настоящего изобретения процентную идентичность последовательностей можно определять с использованием алгоритма поиска гомологии 8тПк-\Уа1егтап с использованием аффинного поиска пропусков со штрафом за внесение делеции 12 и штрафом за продолжение делеции 2, матрицей ВЬО8ИМ 62. Алгоритм поиска гомологии 8тбЬ-^а!егтап описан в 8тбЬ апб \Уа1егтап (1981), Абу. Арр1. Ма!к. 2:482-489. Вариант может, например, отличаться от эталонного антитела против СЭ100 (например, МАЬ2503, 67 или 76) на от 1 до 15 аминокислотных остатков, на от 1 до 10 аминокислотных остатков, например 6-10, на 5, на 4, 3, 2 или даже на 1 аминокислотный остаток.
Точная химическая структура полипептида, способного специфично связывать СЭ100 и сохранять желаемую активность блокирования СЭ100, зависит от ряда факторов. Поскольку в молекуле присутст- 19 025245 вуют ионизируемые N и С-концевые группы, конкретный полипептид можно получать в качестве кислотной или основной соли или в нейтральной форме. Все такие препараты, которые сохраняют их биологическую активность, когда их помещают в подходящие условия окружающей среды, включены в определение антител против СЭ100, как используют в настоящем документе. Кроме того, первичную аминокислотную последовательность полипептида можно дополнять путем преобразования в производное с использованием групп сахаров (гликозилирования) или с помощью других вспомогательных молекул, таких как липиды, фосфатные, ацетильные группы и т.п. Также она может быть дополнена конъюгацией с сахаридами. Определенные аспекты такого усиления проводят с помощью систем посттрансляционного процессинга продуцирующего хозяина; другие такие модификации можно вносить ίη νίίτο. В любом случае, такие модификации включены в определение антитела против СЭ100, используемое в настоящем документе, при условии, что желаемые свойства антитела против СЭ100 не нарушаются. Ожидается, что такие модификации могут количественно или качественно влиять на активность, либо путем усиления, либо путем уменьшения активности полипептида, в различных анализах. Кроме того, отдельные аминокислотные остатки в цепи можно модифицировать путем окисления, восстановления или иного преобразования в производное, и полипептид можно расщеплять с получением фрагментов, которые сохраняют активность. Такие изменения, которые не нарушают желаемые свойства (например, специфичность связывания в отношении СЭ100, аффинность связывания и активность блокирования СЭ100) не устраняют полипептидную последовательность из определения представляющего интерес антитела против СЭ100, как используют в настоящем документе.
В данной области предоставлено значительное количество рекомендаций, касающихся получения и применения вариантов полипептидов. При получении вариантов связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специалист в данной области может легко определить, какие модификации нативной нуклеотидной или аминокислотной последовательности белка приведут к варианту, который пригоден для применения в качестве терапевтически активного компонента фармацевтической композиции, используемой в способах по настоящему изобретению.
В константную область антитела против СЭ100 можно вносить мутацию для изменения эффекторной функции рядом способов. Например, см. патент США № 6737056В1 и публикацию патентной заявки США № 2004/0132101 А1, в которой описаны мутации Рс, которые оптимизируют связывание антитела с Рс-рецепторами.
В определенных антителах против СЭ100 Рс-часть можно подвергать мутации для снижения эффекторной функции с использованием способов, известных в данной области. Например, делеция или инактивация (посредством точковых мутаций или другими способами) домена константной области может снизить связывание Рс-рецептора циркулирующего модифицированного антитела, тем самым увеличивая локализацию в опухоли. В других случаях может быть, что модификации константной области в соответствии с настоящим изобретением уменьшают связывание комплемента и, таким образом, снижают время полужизни в сыворотке и неспецифическое связывание конъюгированного цитотоксина. Другие модификации константной области можно использовать для модификации дисульфидных связей или олигосахаридных групп, которые обеспечивают увеличенную локализацию вследствие увеличенной специфичности к антигену или универсальности антитела. Полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций, такие как локализация в опухоли, биораспределение и время полужизни в сыворотке, можно легко измерять и количественно определять с использованием хорошо известных иммунологических способов без излишнего экспериментирования.
Антитела против СЭ100 по изобретению также включают производные, которые модифицированы, например путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так чтобы ковалентное присоединение не препятствовало специфичному связыванию антитела с его эпитопом. Например, но не ограничиваясь этим, производные антител включают антитела, модифицированные, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидации, преобразования в производные известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций можно проводить известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.
Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со сходным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Альтернативно, мутации можно вносить случайным образом вдоль всей кодирующей последовательности
- 20 025245 или ее части, например, путем мутагенеза с насыщением, и полученные мутации можно подвергать скринингу в отношении биологической активности для идентификации мутаций, которые сохраняют активность (например, способность связывать полипептид против СБ100).
Например, можно вносить мутации только в каркасные области или только в СБК-области молекулы антитела. Внесенные мутации могут представлять собой молчащие или нейтральные миссенсмутации, т.е. могут не иметь или иметь небольшой эффект на способность антитела связывать антиген. Эти типы мутаций могут быть пригодными для оптимизации использования кодонов или повышения продукции антитела гибридомой. Альтернативно не являющиеся нейтральными миссенс-мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Большинство молчащих и нейтральных миссенсмутаций, вероятно, могут располагаться в каркасных областях, в то время как большинство не являющихся нейтральными миссенс-мутаций, вероятно, могут располагаться в СБК, хотя это не является абсолютным требованием. Специалист в данной области способен сконструировать и протестировать мутантные молекулы с желаемыми свойствами, такими как отсутствие изменения антигенсвязывающей активности или изменение активности связывания (например, улучшение антигенсвязывающей активности или изменение специфичности антитела). После мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать общепринятыми способами и функциональную и/или биологическую активность кодируемого белка (например, способность иммуноспецифично связывать по меньшей мере один эпитоп полипептида СБ100) можно определять с использованием способов, описанных в настоящем документе, или путем стандартной модификации способов, известных в данной области.
В определенных вариантах осуществления антитела против СБ100 по изобретению содержат по меньшей мере одну оптимизированную определяющую комплементарность область (СБК). Под оптимизированной СБК понимают, что СБК является модифицированной и выбраны оптимизированные последовательности, исходя из устойчивой или улучшенной аффинности связывания и/или активности против СБ100, которая сообщается антителу против СБ100, содержащему оптимизированную СБК. Активность против СБ100 или активность блокирования СБ100 может включать активность, которая модулирует один или несколько из следующих видов активности, ассоциированных с СБ100: активация, агрегация и выживание В-клеток; индуцируемая СБ40 пролиферация и продукция антител; антительный ответ на зависимые от Т-клеток антигены; пролиферация Т-клеток или других иммунных клеток; созревание дендритных клеток; демиелинизация и аксональная дегенерация; апоптоз плюрипотентных предшественников нейронов и/или олигодендроцитов; индукция миграции эндотелиальных клеток; ингибирование самопроизвольной миграции моноцитов; связывание с плексином В1 клеточной поверхности; или любая другая активность, ассоциированная с растворимым СБ100 или СБ100, который экспрессируется на поверхности СБ100+ клеток. Активность против СБ100 также может быть объяснена снижением встречаемости или тяжести заболеваний, ассоциированных с экспрессией СБ100, включая, но не ограничиваясь ими, определенные типы лимфом, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, включая воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), отторжение трансплантата и инвазивный ангиогенез. Примеры оптимизированных антител на основе МАЬ мыши против СБ100 ВБ16 и ВВ18, описаны в публикации США № 2008/0219971 А1, международной патентной заявке \У0 93/14125 и НегоМ с1 а1., Ιηΐ. 1ттипо1. 7(1): 1-8 (1995), все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. Модификации могут вовлекать замену аминокислотных остатков в СБК, так чтобы антитело против СБ100 сохраняло специфичность в отношении антигена СБ100 и обладало увеличенной аффинностью связывания и/или увеличенной активностью против СБ100.
IV. Полинуклеотиды, кодирующие антитела против СБ100.
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим антитела против СБ100 по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему, по существу состоящему или состоящему из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (νΗ-домен), где по меньшей мере одна из СБК νΗдомена имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична полинуклеотидной последовательности, выбранный из группы, состоящей из 8ЕЦ 1Б N0: 3, §ЕЦ 1Б N0: 4 или §ЕЦ 1Б N0: 5.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему, по существу состоящему или состоящему из нуклеиновой кислоты, кодирующей νΗ-домен иммуноглобулина, где по меньшей мере одна из СБК νΗ-домена выбрана из группы, состоящей из: (а) СБК1, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в §ЕЦ 1Б N0: 6; (Ь) СБК2, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в §ЕЦ 1Б N0: 7; и (с) СБК3, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в §ЕЦ 1Б N0: 8.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей νΗдомен, который имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно
- 21 025245 на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% идентична эталонной полипептидной последовательности УН-домена, содержащей 8ЕО ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 10, где антитело против СЭ100, содержащее кодируемый УН-домен, специфично или предпочтительно связывается с СЭ100.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, содержащему, по существу состоящему или состоящему из нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен легкой цепи (УЪ-домен) иммуноглобулина, где по меньшей мере одна из СОК УЪдомена имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% идентична полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12 и 8Е0 ГО N0: 13.
В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится выделенному полинуклеотиду, содержащему, по существу состоящему или состоящему из нуклеиновой кислоты, кодирующей УЪдомен иммуноглобулина, где по меньшей мере одна из СОК УЪ-домена выбрана из группы, состоящей из: (а) СГОКЕ содержащей аминокислотную последовательность, указанную в 8Е0 ГО N0: 14; (Ь) СГОК2, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в 8Е0 ГО N0: 15; и (с) СГОК3, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в 8Е0 ГО N0: 16.
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенный полинуклеотид, содержащий, по существу состоящий или состоящий из нуклеиновой кислоты, кодирующей УЪдомен, который имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% идентична эталонной полипептидной последовательности УЪ-домена, содержащей 8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 18, где антитело против СГОНЮ, содержащее кодируемый УЪ-домен, специфично или предпочтительно связывается с СГО100.
Любой из полинуклеотидов, описанных выше, может, кроме того, включать дополнительные нуклеиновые кислоты, кодирующие, например, сигнальный пептид для направления секреции кодируемого полипептида, константные области антитела, как описано в настоящем документе, или другие гетерологичные полипептиды, как описано в настоящем документе. Также, как более подробно описано в настоящем документе, настоящее изобретение включает композиции, содержащие один или несколько из полинуклеотидов, описанных выше.
В одном варианте осуществления изобретение включает композиции, содержащие первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, где указанный первый полинуклеотид кодирует УН-домен, как описано в настоящем документе, и где указанный второй полинуклеотид кодирует УЪ-домен, как описано в настоящем документе. В частности, композиция содержит, по существу состоит или состоит из кодирующего УН-домен полинуклеотида, как указано в 8Е0 ГО N0: 19 или 8Е0 ГО N0: 20, и кодирующего УЪ-домен полинуклеотида, например полинуклеотида, кодирующего УЪ-домен, как указано в 8Е0 ГО N0: 21 или ЮЪ) ГО N0: 22.
Также настоящее изобретение относится к фрагментам полинуклеотидов по изобретению, как описано в настоящем документе. Кроме того, также изобретение предусматривает полинуклеотиды, которые кодирует слитые полиполипептиды, РаЬ-фрагменты и другие производные, как описано в настоящем документе.
Полинуклеотиды можно получать или изготавливать любым способом, известным в данной области. Например, если нуклеотидная последовательность антитела известна, полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано в КШтасг с1 а1., Βίο ТссНпкщсх 77:242 (1994)), что, в кратком изложении, вовлекает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, а затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов способом ПЦР.
Альтернативно полинуклеотид, кодирующий антитело против СГО100 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное по изобретению, можно получать из нуклеиновой кислоты из пригодного источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело, не доступен, но последовательность молекулы антитела известна, нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, можно химически синтезировать или получать из пригодного источника (например, библиотека кДНК антитела, или библиотека кДНК, полученная из, или нуклеиновая кислота, предпочтительно поли А+РНК, выделенная из, любой ткани или клеток, экспрессирующих антитело или другое антитело против СГОНЮ, таких как гибридомные клетки, выбранные для экспрессии антитела) амплификацией способом ПЦР с использованием синтетических праймеров, гибридизующихся с 3'- и 5'-концами последовательности или путем клонирования с использованием олигонуклеотидного зонда, специфичного к
- 22 025245 последовательности конкретного гена для идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, который кодирует антитело или другое антитело против СЭ100. Затем амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные способом ПЦР, можно клонировать в реплицируемые клонирующие векторы с использованием любого способа, хорошо известного в данной области.
После определения нуклеотидной последовательности и соответствующей аминокислотной последовательности антитела против СЭ100 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, можно осуществлять манипулирование нуклеотидной последовательностью с использованием способов манипулирования нуклеотидными последовательностями, хорошо известных в данной области, например способов рекомбинантных ДНК, сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и т.д. (см., например, способы, описанные в δатЪ^оок е1 а1. (1990), Μо1еси1а^ С1отпд, Α ЬаЪогаФгу Μаηиа1 (2пб еб.; Со1б δρπι^ НагЬог ЬаЪогаФгу, Со1б δρπι^ НагЪог, Ν. Υ.) и Аи8иЪе1 е1 а1., ебз. (1998), СиггеШ РгоЮсоЕ т Μо1еси1а^ Вю1оду ДоНп АПеу & δоη8, ΝΥ), обе из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме), для получения антител, имеющих отличающуюся аминокислотную последовательность, например, для создания аминокислотных замен, делеций и/или инсерций.
Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из любого полирибонуклеотида или полидезоксирибонуклеотида, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий антитело против СЭ100 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных областей, одноцепочечной и двухцепочечной РНК, и РНК, которая представляет собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных областей, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или, более конкретно, двухцепочечными или смесь одноцепочечных и двухцепочечных областей. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, может состоять из трехцепочечных областей, содержащих РНК или ДНК или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу против С0100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, также может содержать одно или несколько модифицированных оснований или каркасов из ДНК или РНК, модифицированных для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК можно вносить различные модификации; таким образом, полинуклеотид охватывает химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий неприродный вариант полипептида, происходящий из иммуноглобулина (например, части тяжелой цепи или части легкой цепи иммуноглобулина) можно создавать путем внесения одной или нескольких нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность иммуноглобулина, так чтобы в кодируемый белок была внесена одна или несколько аминокислотных замен, вставок или делеций.
Мутации можно вносить стандартными способами, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Предпочтительно консервативные аминокислотные замены вносят в одном или нескольких несущественных аминокислотных остатках.
У. Слитые белки и конъюгаты антител.
Как более подробно рассмотрено в настоящем документе, связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, кроме того, можно подвергать рекомбинантному слиянию с гетерологичным полипептидом на Νили С-конце или химически конъюгировать (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидами или другими композициями. Например, антитела против СЭ100 можно подвергать рекомбинантному слиянию или конъюгировать с молекулами, пригодными в качестве меток в анализах для детекции и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства, радионуклиды или токсины. См., например, публикации РСТ АО 92/08495; АО 91/14438; АО 89/12624; патент США № 5314995 и ЕР 396387.
Антитела против СО100 по изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные могут включать производные, которые модифицированы, т.е. путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так чтобы ковалентное присоединение не препятствовало связыванию антитела с СО100. Например, но не ограничиваясь этим, производные антител включают антитела, модифицированные, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидации, преобразования в производное с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любые из множества химических модификаций можно проводить известными способами, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или несколько неклассических аминокислот.
- 23 025245
Связывающие молекулы против СЭ100, например антитела по изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, могут состоять из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, пептидных изостер, и могут содержать аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Например, антитела против СЭ100 могут быть модифицированы с помощью природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или способами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Такие модификации хорошо описаны в основных руководствах и в более подробных монографиях, а также в многотомной научной литературе. Модификации могут происходить в любой части связывающей молекулы против СО100, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и N или С-концы, или в таких частях, как углеводы. Понятно, что один тип модификации может присутствовать в одинаковой или в различной степени в нескольких участках в данной связывающей молекуле против СЭ100. Также данная связывающая молекула против СЭ100 может содержать множество типов модификаций. Связывающие молекулы против СЭ100 могут быть разветвленными, например в результате убиквитинилирования, и они могут быть циклическими с ветвлением или без него. Циклическая, разветвленная и разветвленная циклическая связывающая молекула против СЭ100 может быть результатом посттрансляционных природных процессов или их можно получать синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АЭР-рибозилирование, амидацию, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, сшивание, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ-якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, опосредуемое транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинилирование (см., например, Рго!еш8 - §1гис1иге апб Мо1еси1аг Ргорегбез, Т.Е. Сге1дк!оп, У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк 2пб Еб. (1993); Ро8бгап81абопа1 Соуа1еп1 МобШсабоп 0£ Рго!еш8, В.С. 1окп8оп, Еб. (1983), Лсабетю Рге88, Уогк, р. 1-12; §с1Йег е! а1., Ме!к Еп/уто1 182:626-646 (1990); Рабап е! а1., Апп
НУ Асаб δά 663:48-62 (1992)).
Также настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антитело против СЭ100 или его вариант или производное, и гетерологичный полипептид. Гетерологичный полипептид, с которым проводят слияние антитела, может быть пригоден для функции или является пригодным для функционирования, или является пригодным для нацеливания на клетки, экспрессирующие полипептид против СЭ100.
В одном варианте осуществления слитый белок по изобретению содержит, по существу состоит или состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность любого одного или нескольких из УН-доменов антитела по изобретения или аминокислотную последовательность любого одного или нескольких из УЪ-доменов антитела по изобретению или их фрагментов или вариантов, и последовательность гетерологичного полипептида.
В другом варианте осуществления слитый белок для применения в способах диагностики и лечения, описанных в настоящем документе, состоит, по существу состоит или состоит из полипептида, имеющего аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех из СЭР УН-домена антитела против СЭ100 или его фрагментов, вариантов или производных, или аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех из СЭР УЪ-домена антитела против СЭ100, или его фрагментов, вариантов или производных, и последовательности гетерологичного полипептида. В одном варианте осуществления слитый белок содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере одного УН-домена антитела против СЭ100 по изобретению и аминокислотную последовательность по меньшей мере одного УЬ-домена антитела против СЭ100 по изобретению или его фрагментов, производных или вариантов, и последовательность гетерологичного полипептида. Предпочтительно УН- и УЪ-домены слитого белка соответствуют антителу из одного источника (или 8сРу- или РаЬ-фрагменту), которое специфично связывает по меньшей мере один эпитоп СЭ100. В другом варианте осуществления слитый белок для применения в способах диагностики и лечения, описанных в настоящем документе, содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех или более из СЭР УН-домена антитела против СЭ100 и аминокислотную последовательность любой одной, двух, трех или более из СЭР УЪ-домена антитела против СО100, или его фрагментов или вариантов, и последовательность гетерологичного полипептида. Предпочтительно две, три, четыре, пять, шесть или более из СЭР УН-домена или УЪ-домена соответствуют антителу из одного источника (или 8сРу или РаЬ-фрагменту) по изобретению, также изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие эти слитые белки.
Иллюстративные слитые белки, описанные в литературе, включают слитые белки Т-клеточного рецептора (Сахсощпе е! а1., Ргос №И1 Асаб δα υδΑ 54:2936-2940 (1987)); СГО4 (Сароп е! а1., №Циге 337:525531 (1989); Тгаипескег е! а1., Ыа1ше 339:68-70 (1989); 2е!!те1881 е! а1., ΌΗΑ Се11 Бю1. υδΑ 9:347-353
- 24 025245 (1990); и Вугп е! а1., №!иге 344:667-670 (1990)); Ь-селектина (рецептор хоминга) (Уайоп е! а1., ΐ. Се11 Вю1. 110:2221-2229 (1990); и Уайоп е! а1., №!иге 349:164-167 (1991)); СП44 (Агийо е! а1., Се11 (57:13031313 (1990)); СП28 и В7 (Пибеу е! а1., ΐ. Ехр Меб. 773:721-730 (1991)); СТЬА-4 (Ыз1еу е! а1., ΐ. Ехр Меб. 174:561-569 (1991)); СЭ22 (§!атепкоу1с е! а1., Се11 66: 1133-1144 (1991)); рецептора ΤΝΡ (А^Ькепа/! е! а1., Ргос №!1 Асаб 8а И8А 55:10535-10539 (1991); Ье551аиег е! а1., Еиг ΐ. 1ттиио1. 27:2883-2886 (1991); и Рерре1 е! а1., ΐ. Ехр Меб. 774: 1483-1489 (1991)); и рецептора 1дЕ (Шбдгау апб Оогтап, ΐ. Се11 Вю1 Уо1. 115, АЬккас! № 1448 (1991)).
Как рассмотрено в настоящем документе, связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно подвергать слиянию с гетерологичными полипептидами для увеличения времени полужизни полипептидов ш νί\Ό или для применения в иммуноанализах с использованием способов, известных в данной области. Например, в одном варианте осуществления РЕО можно конъюгировать с антителами против СЭ100 по изобретению для увеличения их времени полужизни ш νί\Ό. Ьеопд, 8.К., е! а1., СуЮкте 16 106 (2001), Лбу. 1п Эгид ЭеКу. Кеу. 54 531 (2002), или \Уеи е! а1., ВюсЬет. §ос. ТгапзасЬопк 30 512 (2002).
Более того, связывающие молекулы против СЭ100, например антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно подвергать слиянию с маркерными последовательностями, такими как пептид, для упрощения их очистки или детекции. В предпочтительных вариантах осуществления маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как маркер, предоставленный в векторе рОЕ (01АОЕН 1пс., 9259 Е!оп Ауепие, СЬа15\уог1к СаЬЕ, 91311), помимо прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в Оеп1/ е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сЕ И8А 55:821-824 (1989), например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другие пептидные метки, пригодные для очистки, включают, но не ограничиваются ими, НА-метку, которая соответствует эпитопу, происходящему из белка гемагглютинина вируса гриппа (ЛУбюп е! а1., Се11 37:161 (1984)), йад''-метку.
Слитые белки можно получать с использованием способов, которые хорошо известны в данной области (см. например патенты США № 5116964 и 5225538). Точный участок, в котором можно проводить слияние, можно выбирать эмпирически для оптимизации секреции или характеристик связывания слитого белка. Затем ДНК, кодирующую слитый белок, трансфицируют в клетку-хозяина для экспрессии.
Связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела по настоящему изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно использовать в неконъюгированной форме или их можно конъюгировать по меньшей мере с одним типом молекул, например, для улучшения терапевтических свойств молекулы, для упрощения детекции мишени или для визуализации и терапии пациента. Связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела по изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно метить или конъюгировать либо до, либо после очистки, или во время очистки.
В частности, антитела против СО100 по изобретению, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно конъюгировать с лекарственными средствами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими средствами или РЕО.
Специалистам в данной области понятно, что конъюгаты также можно формировать с использованием различных способов, в зависимости от выбранного агента, подлежащего конъюгации. Например, конъюгаты с биотином получают, например, путем реакции связывающего полипептида с активированным сложным эфиром биотина, таким как Ν-гидроксисукцинимидный эфир биотина. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентным маркером можно получать в присутствии присоединяющего агента, например агентов, перечисленных в настоящем документе, или посредством реакции с изотиоцианатом, предпочтительно флуоресцеин-изотиоцианатом.
Конъюгаты антител против СЭ100 по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные получают аналогичным образом.
Кроме того, настоящее изобретение охватывает связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела по изобретению или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, конъюгированные с диагностическим или терапевтическим средством. Антитела против СЭ100, включая их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, можно использовать в диагностических целях, например, для мониторинга развития или прогрессирования заболевания в качестве части процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данного режима лечения и/или профилактики. Например, детекцию можно облегчать путем связывания антитела против СЭ100, или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, с поддающимся детекции веществом. Примеры поддающихся детекции веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, позитронно-активные металлы при использовании различных способов позитронноэмиссионной томографии, и нерадиоактивных ионов парамагнитных металлов. См., например, патент США № 4741900 для ионов металлов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в качестве диагностических средств в соответствии с настоящим изобретением. Примеры пригодных фер- 25 025245 ментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры пригодного радиоактивного материала включают 1251, 131Ι, 1П1п, 90Υ или 99Тс.
Связывающую молекулу против СО100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, можно конъюгировать с терапевтической группой, такой как цитотоксин, лекарственное средство или ион радиоактивного металла. Цитотоксин или цитотоксическое средство включает любое средство, которое является вредоносным для клеток.
Связывающую молекулу против С0100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное также можно метить поддающейся детекции меткой путем присоединения его к хемилюминесцентному соединению. Затем присутствие меченной хемилюминесцентным соединением связывающей молекулы против С0100 определяют путем детекции наличия люминесценции, которая появляется в ходе химической реакции. Примерами особенно пригодных хемилюминесцентных соединений для мечения являются люминол, изолюминол, тероматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный эфир щавелевой кислоты.
Одним из путей, которым антитело против С0100, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, можно метить поддающейся детекции меткой, является его связывание с ферментом и использование связанного продукта в ферментном иммуноанализе (Е1А) (Уо11ег, А., ТЬе Еп/уте Ыпкеб 1ттипо5огЬеп1 Аккау (ЕЬ1§А) М1сгоЫо1од1са1 Аккоаа!ек Оиаг1ег1у РиЬЬсайоп, ^а1кегкуШе, Мб.; О1адпокЬс Ноп/опк 2:1-7 (1978); Уо11ег е! а1., I. СЬп. Ра!Ьо1. 37:507-520 (1978); БиНег, Ме!Ь. Еп/уто! 73:482-523 (1981); Маддю, еб. (1980), Еп/уте 1ттипоаккау, СКС Ргекк, Воса Ка!оп, Р1а.; Ыйказуа е! а1., ебк. (1981), Еп/уте 1ттипоаккау (Кдаки §Ьо1п, Токуо). Фермент, который связан с антителом против СО 100, реагирует с соответствующим субстратом, предпочтительно хромогенным субстратом, таким образом, чтобы образовывалась химическая группа, которую можно выявлять, например, спектрофотометрическими, флуориметрическими или визуальными способами. Ферменты, которые можно использовать для мечения поддающейся детекции меткой антитела, включают, но не ограничиваются ими, малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфаглицерофосфат, дегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкоза-6фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Кроме того, детекцию можно проводить колориметрическими способами, в которых используют хромогенный субстрат для фермента. Также детекцию можно проводить путем визуального сравнения степени ферментативной реакции субстрата по сравнению со сходным образом полученными стандартами.
Детекцию также можно проводить с использованием любого из множества других иммуноанализов. Например, путем радиоактивного мечения связывающей молекулы против С0100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, можно осуществлять детекцию связывающей молекулы с использованием радиоиммунного анализа (ΚΙΑ) (см., например, ^еиИганЬ (МагсЬ, 1986), Ргтар1ек оГ Рабюитпипоаккаук, ЗегеШЬ Тгаийпд Соигке оп КабюЬдапб Аккау ТесЬпищек (ТЬе Епбосгте 5ос1е1у), которая включена в настоящий документ в качестве ссылки). Детекцию радиоактивного изотопа можно проводить с помощью средств, включающих, но не ограничивающихся ими, гамма-счетчик, сцинтилляционный счетчик или радиоавтографию.
Связывающую молекулу против С0100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, также можно метить поддающейся детекции меткой с использованием испускающих флуоресценцию металлов, таких как 152Еи или другие металлы серии лантаноидов. Эти металлы можно присоединять к антителу с использованием таких хелатирующих металлы групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ОТРА) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕОТА).
Способы конъюгации различных частей с антителом (например, антителом против С0100) или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, хорошо известны, см., например, Агпоп е! а1., Мопос1опа1 АппЬоб1ек Рог 1ттипо1агде0пд ОГ Огидк 1п Сапсег ТЬегару, Мопос1опа1 АппЬоб1ек Апб Сапсег ТЬегару, Ке1кГе1б е! а1. (ебк.), р. 243-56 (А1ап К. Ыкк, 1пс. (1985); НеЬкйот е! а1., АпНЬоб1ек Рог Эгид ОеЬуегу, СойгоПеб Эгид ОеЬуегу (2пб Еб.), КоЫпкоп е! а1. (ебк.), Магсе1 Оеккег, 1пс., р. 623-53 (1987); ТЬогре, АпНЬобу Сатегк ОГ Су!о!ох1с Адеп!к 1п Сапсег ТЬегару: А Ре\ае\у, Мопос1опа1 АпЬЬоб1ек '84: Вю1од1са1 Апб СЬтса1 АррЬсайопк, РтсЬега е! а1. (ебк.), р. 475-506 (1985); Апа1ук1к, КекиЬк, Апб Ри!иге РгокресЬуе ОГ ТЬе ТЬегареиЬс Ике ОГ Кабю1аЬе1еб АпНЬобу 1п Сапсег ТЬегару, Мопос1опа1 АпНЬоб1ек Рог Сапсег Ое1есНоп Апб ТЬегару, Ва1б\ут е! а1. (ебк), Асабепис Ргекк р. 303-16 (1985), и ТЬогре е! а1. (1982), ТЬе Ргерагайоп Апб Су!о!ох1с РгорегЪек ОГ АпНЬобу-Тохт Сон)ида!ек, 1ттипо1. Кеу. 62:11958.
- 26 025245
VI. Экспрессия полипептидов антител.
Последовательности ДНК, которые кодируют легкую и тяжелую цепи антитела, можно получать либо одновременно, либо по отдельности, с использованием обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы согласно хорошо известным способам. ПЦР можно инициировать с помощью праймеров для консенсусной константной области или с помощью более специфических праймеров на основе опубликованных последовательностей ДНК и аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей. Как рассмотрено выше, ПЦР также можно использовать для выделения клонов ДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В этом случае библиотеки можно подвергать скринингу с помощью консенсусных праймеров или более крупных гомологичных зондов, таких как зонды константной области мыши.
ДНК, как правило, плазмидную ДНК, можно выделять из клеток с использованием способов, известных в данной области, подвергать рестрикционному картированию и секвенировать в соответствии со стандартными хорошо известными способами, представленными в деталях, например, в указанных выше ссылках, касающихся способов рекомбинантных ДНК. Безусловно, ДНК может быть синтетической в соответствии с настоящим изобретением в любой момент в процессе выделения или при последующем анализе.
После манипулирования выделенным генетическим материалом для получения антител против С.Н100 или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, по изобретению, полинуклеотиды, кодирующие антитела против СЭ100, обычно встраивают в экспрессирующий вектор для введения в клетки-хозяева, которые можно использовать для получения желаемого количества антитела против С0100.
Рекомбинантная экспрессия антигенсвязывающего полипептида, его производного или варианта, например тяжелой или легкой цепи антитела, которое связывает молекулу-мишень, описанную в настоящем документе, например, СЭ100, требует конструирования экспрессирующего вектора, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело. После получения полинуклеотида, кодирующего молекулу антитела или тяжелую или легкую цепь антитела, или его части (предпочтительно содержащей вариабельный домен тяжелой или легкой цепи) по изобретению, можно получать вектор для продукции молекулы антитела с помощью технологии рекомбинантных ДНК с использованием способов, хорошо известных в данной области. Таким образом, способы получения белка посредством экспрессии полинуклеотида, содержащего антитело, кодирующее нуклеотидную последовательность, описаны в настоящем документе. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно использовать для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих кодирующие антитело последовательности и подходящие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Эти способы включают, например, способы рекомбинантных ДНК ίη νίίτο, синтетические способы и генетическую рекомбинацию ίη νίνο. Таким образом, изобретение относится к реплицирующимся векторам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела по изобретению, или его тяжелую или легкую цепь, или вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, функционально связанные с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, публикацию РСТ АО 86/05807; публикацию РСТ АО 89/01036; и патент США № 5122464) и в такой вектор можно клонировать вариабельный домен антитела для экспрессии всей тяжелой или легкой цепи.
Термин вектор или экспрессирующий вектор используют в настоящем документе для обозначения векторов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, в качестве носителей для введения в клетку-хозяина и экспрессии в клетке-хозяине желаемого гена. Как известно специалистам в данной области, такие векторы можно легко выбирать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. Как правило, векторы, совместимые с настоящим изобретением, содержат селективный маркер и подходящие участки рестрикции для облегчения клонирования желаемого гена и способности проникать в эукариотические или прокариотические клетки и/или реплицироваться в них.
Для целей этого изобретения можно использовать множество систем экспрессирующих векторов. Например, в одном классе векторов используются элементы ДНК, которые происходят из вирусов животных, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус полиомы, аденовирус, вирус осповакцины, бакуловирус, ретровирусы (Εδν, ΜΜΤν или МОМ^) или вирус δν40. Другие векторы вовлекают применение полицистронных систем с внутренними участками связывания рибосом. Кроме того, клетки, в хромосомы которых встроилась ДНК, можно отбирать с использованием одного или нескольких маркеров, которые позволяют селекцию трансфицированных клеток-хозяев. Маркер может обеспечить фототрофность для ауксотрофного хозяина, устойчивость к биоцидам (например, антибиотикам) или устойчивость к тяжелым металлам, таким как медь. Ген селективного маркера можно либо прямо связывать с последовательностями ДНК, подлежащими экспрессии, либо вводить в ту же клетку способом котрансформации. Также для оптимального синтеза мРНК могут потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы включают сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также промоторы транскрипции, энхансеры и сигналы терминации.
В особенно предпочтительных вариантах осуществления клонированные гены вариабельной области встраивают в экспрессирующий вектор совместно с генами константной области тяжелой и легкой
- 27 025245 цепи (предпочтительно человеческими), синтезированными как описано выше. Безусловно, в настоящем изобретении можно использовать любой экспрессирующий вектор, который способен обеспечивать экспрессию в эукариотических клетках. Примеры пригодных векторов включают, но не ограничиваются ими, плазмиды ροΌΝΑ3, рНС\1У//ео, рСК3.1, рЕР 1/Ηΐδ, ρΙΝΏ/Οδ, рКс/НСМУ2, рЗУ40//ео2, рТКАСЕК-НСМУ, риВ6/У5-Н15, рУАХ1 и р2еоЗУ2 (доступные от 1пуйгодеп, 8ап Э1едо, Сай£), и плазмиду рС1 (доступную от Рготеда, Маб18оп, ^18.). Как правило, скрининг больших количеств трансформированных клеток в отношении клеток, которые экспрессируют пригодные высокие уровни тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, является стандартным экспериментированием, которое проводят, например, с помощью роботизированных систем.
В более общем смысле, после получения вектора или последовательности ДНК, кодирующей мономерную субъединицу антитела против Ο.Ό100, экспрессирующий вектор можно вводить в подходящую клетку-хозяина. Введение плазмиды в клетку-хозяина можно проводить различными способами, хорошо известными специалистам в данной области. Они включают, но не ограничиваются ими, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция, слияние клеток с заключенной в оболочку ДНК, микроинъекцию и инфекцию неизмененным вирусом. См. Шбдтеау (1988), Маттайап Ехрге88юп уес1огк, Уес1ог8, еб. Кобпдие/ апб ЭепНагб!, Ебк. (ВийегтеопЬк, Во81оп, Ма88.), СЬар1ег 24.2, р. 470-472 (1988). Как правило, плазмиду вводят в хозяина электропорацией. Клетки-хозяева, содержащие экспрессирующую конструкцию, выращивают в условиях, пригодных для продукции легких цепей и тяжелых цепей, и анализируют в отношении синтеза белков тяжелой и/или легкой цепей. Иллюстративные способы анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫЗА), радиоиммунный анализ (К1А), или анализ посредством активированной флуоресценцией сортировки клеток (РАСЗ), иммуногистохимию и т.п.
Экспрессирующий вектор переносят в клетку-хозяина общепринятыми способами, а затем перенесенные клетки культивируют общепринятыми способами для получения антитела для применения в способах, описанных в настоящем документе. Таким образом, изобретение включает клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению, или его тяжелую или легкую цепь, функционально связанные с гетерологичным промотором. В предпочтительных вариантах осуществления для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи, можно коэкспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии полной молекулы иммуноглобулина, как подробно описано ниже.
Как используют в настоящем документе, термин клетки-хозяева относится к клеткам, которые содержат векторы, сконструированные с использованием способов рекомбинантных ДНК и кодирующие по меньшей мере один гетерологичный ген. В описаниях способов выделения антител из рекомбинантных хозяев термины клетка и клеточная культура используют взаимозаменяемо для обозначения источника антитела, если явно не указано иное. Иными словами, выделение полипептида из клеток может означать выделение либо из осажденных целых клеток, либо из клеточной культуры, содержащей как среду, так и суспендированные клетки.
Для экспрессии молекул антител для применения в способах, описанных в настоящем документе, можно использовать множество систем хозяин-экспрессирующий вектор. Такие системы хозяинэкспрессирующий вектор представляют собой носители, посредством которых можно получать и затем очищать представляющие интерес кодирующие последовательности, а также они представляют собой клетки, которые могут, при трансформации или трансфекции подходящими нуклеотидными кодирующими последовательностями, экспрессировать молекулу антитела по изобретению ш 8ίΙιι. Они включают, но не ограничиваются ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. сой, В. 8иЬ1б18), трансформированные рекомбинантными экспрессирующими векторами с бактерофаговой ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие антитело последовательности; дрожжи (например, Зассйаготусе8, РюЫа), трансформированные рекомбинантными экспрессирующими векторами дрожжей, содержащими кодирующие антитело последовательности; системы клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспресирующими векторами (например, бакуловирусом), содержащими кодирующие антитело последовательности; системы клеток растений, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом табачной мозаики, ТМУ) или трансформированных рекомбинантыми плазмидными экспрессирующими векторами (например, плазмидой Τι), содержащими кодирующие антитело последовательности; или системы клеток млекопитающих (например, клетки СОЗ, СНО, ВЬК, 293, 3Т3), содержащие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7.5К вируса осповакцины). Предпочтительно для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела используют бактериальные клетки, такие как Е8сйепс1йа сой, и, более предпочтительно, эукариотические клетки, особенно для экспрессии целой рекомбинантной молекулы антитела. Например, эффективной экспрессирующей системой для антител являются клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), вместе с вектором, такой как основной средне-ранний промоторный элемент из цитомегаловируса (Роескшд е1 а1., Оепе 5:101 (1986); Соскей е1
- 28 025245 а1., Вю/ТесИио1оду 8:2 (1990)).
Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белков, часто происходит из млекопитающих; специалисты в данной области способны предпочтительно определить конкретные линии клеток-хозяев, которые наилучшим образом пригодны для экспрессии в них желаемого продукта гена. Иллюстративные линии клеток-хозяев включают, но не ограничиваются ими, клетки СНО (яичник китайского хомячка), ΌΟ44 и ИИХВЛ (линии яичника китайского хомячка, ИНТК-минус), НЕЬА (карцинома шейки матки человека), СУ1 (линия почки обезьяны), СО8 (производное СУ1 с Т-антигеном 8У40), УЕКУ, ВНК (почки детенышей хомячка), МИСК, 293, ^138, К1610 (фибробласты китайского хомячка) ВАИВС/3Т3 (фибробласты мыши), НАК (линия почки хомяка), 8Р2/0 (миелома мыши), Р3х63-Ад3.653 (миелома мыши), ВРА-1с 1ВРТ (эндотелиальные клетки крупного рогатого скота), КАЛ (лимфоциты человека) и 293 (почка человека). Линии клеток-хозяев, как правило, доступны от коммерческих служб, Атепсап Т1ззие Си1!иге Со11ес!юп или из опубликованной литературы.
Кроме того, можно выбирать линию клеток-хозяев, которая модулирует экспрессию встроенных последовательностей или модифицирует и процессирует продукт гена определенным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Различные клетки-хозяева обладают характерными специфическими механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и продуктов генов. Для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного экспрессируемого белка можно выбирать подходящие клеточные линии или системы хозяев. Для этого, можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена.
Для длительной продукции рекомбинантных белков с высоким выходом предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, можно конструировать клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо применения экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации, клетки-хозяева можно трансформировать посредством ДНК, контролируемой соответствующими элементами контроля экспрессии (например, промоторной, энхансерной последовательностями, терминаторами транскрипции, участками полиаденилирования и т.д.), с селективным маркером. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам можно позволять расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, а затем их можно переключать на селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость при селекции и позволяет клеткам стабильно встраивать плазмиду в их хромосомы и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать в клеточные линии. Этот способ можно преимущественно использовать для конструирования клеточных линий, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела.
Можно использовать ряд систем для селекции, включая, но не ограничиваясь ими гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (^1д1ег е! а1., Се11 11: 223 (1977)), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (8/уЬа1зка & 8/уЬа1зкг Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А 48:202 (1992)), и аденинфосфорибозилтрансферазы (Ьо^у е! а1., Се11 22:817, 1980) в !к-, Ьдрй- или арй-клетках соответственно. Также можно использовать гены, придающие устойчивость к антиметаболитам, в качестве основы для селекции с помощью следующих генов: бЬГг, который придает устойчивость к метотрексату (^1§1ег е! а1., №И. Асаб. 8с1. И8А 77:357 (1980); О'Наге е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 78: 1527 (1981)); др!, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (МиШдап & Вегд, Ргос. №Ш. Асаб. 8сг И8А 78:2072 (1981)); пео, который придает устойчивость к аминогликозиду С-418, С1шюа1 РИагтасу 12:488-505; \Уи апб \Уи. ВюШегару 3:87-95 (1991); То1з!озИеу, Апп. Кеу. РИагтасо1. Тохсо1. 32:573-596 (1993); МиШдап, 8с1епсе 260:926-932 (1993); и Могдап апб Апбегзоп, Апп. Кеу. ВюсИет. (52:191-217 (1993); Т1В ТЕСН 11(5): 155-215 (Мау, 1993); и Иудго, который придает устойчивость к гигромицину (8ап!егге е! а1., Сепе 30:147 (1984)). Способы, широко известные в области технологии рекомбинантных ДНК, которые можно использовать, описаны в АизиЬе1 е! а1. (1993), Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оИп \УПеу & 8опз, ΝΥ; Кпед1ег (1990), Сепе ТгапзГег апб Ехргеззюп, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 8!оск!оп Ргезз, ΝΥ; и в главах 12 и 13, Игасорой е! а1. (ебз) (1994), Сиггеп! Рго!осо1з ш Нитап Сепейсз. 1ойп \Уйеу & 8опз, ΝΥ; Со1ЬеггеСагарш е! а1. (1981), 1. Мо1. Вю1. 150:1, которые включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. Уровни экспрессии антигенсвязывающего полипептида можно увеличивать посредством амплификации вектора (для обзора см. ВеЬЬшд!оп апб Неп!зсИе1 (1987), ТИе Изе ОГ Уес!огз Вазеб Оп Сепе Атрййсайоп Рог ТИе Ехргеззюп ОГ С1опеб Сепез 1п Маттайап Се11з 1п ΌΝΛ С1отпд. (Асабетю Ргезз, №\ν Уогк), Уо1. 3). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, увеличение уровня ингибитора, присутствующее в культуре клеток-хозяев приведет к увеличению количества копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном антитела, продукция антитела также будет возрастать (Сгоизе е! а1., Мо1. Се11. Вю1. 3:257 (1983)).
Продукция ш уйго позволяет масштабирование для получения больших количеств желаемых полипептидов. Способы культивирования клеток млекопитающих в условиях культивирования тканей известны в данной области и включают гомогенную суспензионную культуру, например в эрлифтном ферментере или в реакторе с непрерывным перемешиванием, или иммобилизованную или заключенную клеточную культуру, например в полых волокнах, микрокапсулах, на агарозных микрогранулах или керами- 29 025245 ческих кассетах. Если необходимо и/или желательно, растворы полипептидов можно очищать стандартными способами хроматографии, например гель-фильтрацией, ионообменной хроматографией, хроматографией над ΌΕΑΕ-целлюлозой или (иммуно)аффинной хроматографией, например, после избирательного биосинтеза синтетического полипептида шарнирной области или перед или после стадии Н1Схроматографии, описанной в настоящем документе.
Гены, кодирующие антитела против СЭ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению, также можно экспрессировать в клетках не млекопитающих, таких как клетки бактерий или дрожжей, или растений. Бактерии, которые легко захватывают нуклеиновые кислоты, включают представителей еп!егоЬас!епасеае, таких как штаммы ЕксЬепсЫа сок или 8а1топе11а; ВасП1асеае, такие как ВасШик киЬЛЬк; Рпеитососсик; 8!гер!ососсик и НаеторЬЛик тЛиеп/ае. Кроме того, понятно, что при экспрессии в бактериях гетерологичные полипептиды, как правило, становятся частью телец включения. Гетерологичные полипептиды необходимо выделять, очищать, а затем собирать в функциональные молекулы. Когда являются желательными четырехвалентные формы антител, то субъединицы будут подвергаться самосборке в четырехвалентные антитела (АУО 02/096948А2).
В бактериальных системах количество экспрессирующих векторов можно преимущественно выбирать, в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемой молекулы антитела. Например, когда намереваются продуцировать большое количество такого белка для получения фармацевтических композиций молекулы антитела, могут быть желательными векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней слитых белковых продуктов. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, экспрессирующий вектор Е. соЬ рИК278 (Ки!Ьег е! а1., ЕМВО 1. 2: 1791 (1983)), в котором кодирующая антитело последовательность может быть лигирована индивидуально в вектор в рамке считывания с кодирующей ΕκΖ областью, так чтобы продуцировался слитый белок; векторы рГЫ (1поиуе & 1поиуе, Νυс1ею АсШк Кек. 73: 3101-3109 (1985); Уап Нееке апй 8сЬик!ег, 1. Вю1 СЬет. 24:5503-5509 (1989)); и т.п. Также можно использовать векторы рОЕХ для экспрессии чужеродных полипептидов в качестве слитых белков с глутатион-§-трансферазой (О8Т). Как правило, такие слитые белки являются растворимыми и их можно легко очищать из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с гранулами на основе матрицы из глутатион-агарозы, с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы рОЕХ конструируют так, чтобы они включали участки расщепления тромбином или фактором Ха, так чтобы продукт клонированного гена-мишени мог высвобождаться из группы О8Т.
В дополнение к прокариотам также можно использовать эукариотические микроорганизмы. §ассЬаготусек сегеуыае или обычные пекарские дрожжи наиболее часто используются среди эукариотических микроорганизмов, хотя широко доступен ряд других штаммов, например, РюЫа ракЮпк.
Для экспрессии в ЗассЬаготусек обычно используют, например, плазмиду Υ^7 (ЗЛпсЬсотЬ е! а1., №йиге 252:39 (1979); Кшдктап е! а1., Оепе 7: 141 (1979); ТксЬетрег е! а1., Оепе 10:157 (1980)). Эта плазмида уже содержит ген ТКР1, который обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти на триптофане, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (1опек, ОепеЬск 85:12 (1977)). Затем присутствие повреждения ТКР1 в качестве характеристики генома дрожжевых клеток-хозяев обеспечивает эффективную окружающую среду для детекции трансформации по росту в отсутствие триптофана.
В системе насекомых, как правило, в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов используют вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарЬа саЬГогшса (АсЖУ). Этот вирус растет в клетках 8ройор!ега Ггищрегйа. Кодирующую антитело последовательность можно клонировать индивидуально в не являющиеся необходимыми области (например, ген полиэдрина) вируса и помещать под контроль промотора АсЖУ (например, промотора полиэдрина).
После рекомбинантной экспрессии молекулы антитела по изобретению его можно очищать любым известным в данной области способом очистки молекулы иммуноглобулина, например, посредством хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, на основе аффинности к специфическому антигену после хроматографии с белком А, и колоночной хроматографии по размеру), центрифугирования, дифференциальной растворимости или любым другим стандартным способом очистки белков.
Альтернативно, предпочтительный способ увеличения аффинности антител по изобретению описан в публикации патентной заявки США № 2002-0123057 А1.
VII. Способы лечения с использованием терапевтических антител против СЭ100.
Способы по изобретению относятся к применению связывающих молекул против СЭ100, например, антител, включая их антигенсвязывающие фрагменты, варианты и производные, для лечения пациентов, имеющих заболевание, ассоциированное с растворимым СЭ100, секретируемым из экспрессирующих СЭ100 клеток или экспрессируемым на них. Под экспрессирующей СЭ100 клеткой подразумевают нормальные и злокачественные клетки, экспрессирующие антиген СЭ100. Способы детекции экспрессии СЭ100 в клетках хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, способы ПЦР, иммуногистохимию, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, ЕЫ8А и т.п.
Хотя нижеследующее обсуждение относится к диагностическим способам и лечению различных заболеваний и расстройств с помощью антитела против СЭ100 по изобретению, способы, описанные в
- 30 025245 настоящем документе, также применимы для антигенсвязывающих фрагментов, вариантов и производных этих антител против СГОКН), которые сохраняют желаемые свойства антител против СЭ100 по изобретению, например, способны специфично связывать 0Ό100, например, СЭ100 человека, мыши или человека и мыши, и обладают нейтрализующей активностью в отношении СГО100.
В одном варианте осуществления лечение включает применение или введение связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению пациенту, или применение или введение связывающей молекулы против СГО100 в выделенную ткань или клеточную линию от пациента, где пациент имеет заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию. В другом варианте осуществления лечение включает применение или введение фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу против СО 100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, пациенту, или применение или введение фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу против 0Ό100, в выделенную ткань или клеточную линию от пациента, который имеет заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию.
Связывающие молекулы против 0Ό100, например, антитела или их связывающие фрагменты по настоящему изобретению, пригодны для лечения различных злокачественных и незлокачественных опухолей. Под противоопухолевой активностью понимают снижение уровня пролиферации или накопления злокачественных экспрессирующих СГО100 клеток, и, таким образом, снижение скорости роста существующей опухоли или в опухоли, которое происходит в ходе терапии, и/или разрушение существующих неопластических (опухолевых) клеток или вновь образованных неопластических клеток, и, таким образом, снижение общего размера опухоли в ходе терапии. Например, терапия по меньшей мере одним антителом против СГО100 вызывает физиологический ответ, например, снижение ангиогенеза, который является благоприятным в отношении лечения болезненных состояний, ассоциированных с экспрессирующими СЭ100 клетками у человека.
В одном варианте осуществления изобретение относится к связывающим молекулам против СЭ100, например, антителам или их связывающим фрагментам, в соответствии с настоящим изобретением для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для применения в лечении или профилактики злокачественной опухоли или для применения при предзлокачественном состоянии или очаге повреждения. В определенных вариантах осуществления связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или его связывающий фрагмент, по изобретению используют для лечения злокачественной опухоли, сверхэкспрессирующей СЭ100. В определенных вариантах осуществления связывающую молекулу против ί.Ό100, например, антитело или его связывающий фрагмент, по изобретению используют для лечения рака головы и шеи или рака толстого кишечника, сверхэкспрессирующих СЭ100.
Кроме того, связывающие молекулы против ί.Ό100, например, антитела или их связывающие фрагменты, по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования ангиогенеза для лечения патологических состояний, зависящих от образования новых клеток крови, включая развитие опухоли и дегенерацию желтого пятна. Ангиогенез представляет собой комплексное многостадийное морфогенетическое событие, в ходе которого эндотелиальные клетки, стимулированные главными детерминантами ремоделирования сосудов, динамично модифицируют их контакты клетка-клетка и клетка-матрикс и направленно перемещаются для реорганизации в зрелое сосудистое дерево (ВиккоНпо е1 а1., Тгепйк ΒίοсПет 8с1. 22:251-256 (1997); Икай, ХаПие 386:671-674 (1997); ίοη, Ыа1. Мей. 9:685-693 (2003)). Образование новых кровеносных сосудов является ключевой стадией в ходе развития эмбриона, однако также оно происходит у взрослых при физиологических и патологических состояниях, таких как ретинопатия, ревматоидный артрит, ишемия и, особенно, рост и метастазирование опухоли (СагшеПеЕ №1 Мей. 9:653-660 (2003)). Это патологическое образование новых кровеносных сосудов называют в настоящем документе инвазивным ангиогенезом. ВакПе е1 а1., ΡNА8 703 (24):9017-9022 (2006)) продемонстрировали, что, после слущивания клеток Н№СС, СЭ100 стимулирует миграцию эндотелиальных клеток, которая предотвращается блокирующими СЭ100 антителами и нокдауном СЭ100. Сверхэкспрессия СЭ100 также выявлена при раке предстательной железы, толстого кишечника, молочной железы и легкого, указывая на то, что экспрессия СГО100 является часто используемой стратегией, посредством которой множество карцином могут стимулировать ангиогенез.
В соответствии со способами по настоящему изобретению, по меньшей мере одну связывающую молекулу против ί.Ό100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено в настоящем документе, используют для стимуляции положительного терапевтического ответа в отношении злокачественной клетки человека. Под положительным терапевтическим ответом в отношении лечения злокачественной опухоли понимают улучшение при заболевании, ассоциированное с противоопухолевой активностью этих связывающих молекул, например, антител или их фрагментов, и/или улучшение симптомов, ассоциированных с заболеванием. Таким образом, можно наблюдать антипролиферативный эффект, предупреждение дальнейшего роста опухоли, уменьшение размера опухоли, уменьшение сосудистой сети в опухоли, снижение количества злокачественных клеток и/или снижение одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием. Таким образом, например, улучшение при заболевании может быть охарактеризовано как полный ответ. Под полным ответом подра- 31 025245 зумевают отсутствие поддающегося клинической детекции заболевания с нормализацией любых ранее ненормальных данных радиографических исследований, костного мозга и цереброспинальной жидкости (С8Р). Такой ответ может сохраняться в течение по меньшей мере одного месяца после лечения способами по изобретению. Альтернативно улучшение заболевания может быть классифицировано как частичный ответ. Под частичным ответом подразумевают по меньшей мере приблизительно 50% снижение всей поддающейся измерению опухолевой массы (т.е. количества опухолевых клеток, присутствующих у индивидуума) в отсутствие новых очагов повреждения и сохраняющееся в течение по меньшей мере одного месяца. Такой ответ применим только к поддающимся измерению опухолям.
Ответ опухоли можно оценивать в отношении изменений морфологии опухоли (т.е. общей опухолевой массы, количества опухолевых клеток и т.п.) с использованием способов скрининга, таких как биолюминесцентная визуализация, например, визуализация с помощью люциферазы, визуализация сканированием костей, и биопсия опухоли, включая аспирирование костного мозга (ВМА). В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам индивидуум, подвергаемый лечению связывающей молекулой против СБ100, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, может испытывать благоприятный эффект в виде улучшения симптомов, ассоциированных с заболеванием. Например, индивидуум может испытывать снижение так называемых В-симптомов, например, ночной потливости, лихорадки, снижения массы тела и/или крапивницы.
Связывающие молекулы против СБ100, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, также могут быть применимы в лечении воспалительных заболеваний и дефицитов или нарушений иммунной системы, которые ассоциированы с экспрессирующими СБ100 клетками. Воспалительные заболевания характеризуются воспалением и разрушением ткани или их комбинацией. Под противовоспалительной активностью подразумевают снижение или предупреждение воспаления.
Воспалительное заболевание включает любой воспалительный опосредуемый иммунной системой процесс, где инициирующее событие или мишень иммунного ответа вовлекает несобственный антиген(ы), включая, например, аллоантигены, ксеноантигены, вирусные антигены, бактериальные антигены, неизвестные антигены или аллергены. В одном варианте осуществления воспалительное заболевание представляет собой воспалительное нарушение периферической или центральной нервной системы. В другом варианте осуществления воспалительное заболевание представляет собой воспалительное нарушение суставов.
Кроме того, для целей настоящего изобретения термин воспалительное заболевание(я) включает аутоиммунное заболевание(я). Как используют в настоящем документе, как правило, подразумевают, что термин аутоиммунитет охватывает воспалительные опосредуемые иммунной системой процессы, вовлекающие собственные антигены. При аутоиммунных заболеваниях собственный антиген(ы) запускает иммунные ответы хозяина. Аутоиммунное заболевание может быть результатом ненадлежащего иммунного ответа, направленного против собственного антигена (аутоантигена), который является отклонением от нормального состояния аутотолерантности. Как правило, антитела (в частности, но не исключительно, 1дО-антитела), действующие в качестве цитотоксических молекул или в качестве иммунных комплексов, являются основными медиаторами различных аутоиммунных заболеваний, многие из которых могут быть истощающими или угрожающими жизни.
В одном варианте осуществления связывающую молекулу против СБ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению применяют для лечения рассеянного склероза (М8). М8, также известный как диссеминированный склероз или диссеминированный энцефаломиелит, представляет собой аутоиммунное состояние, при котором иммунная система атакует центральную нервную систему, что ведет к демиелинизации. Название рассеянного склероза связано с рубцами (склероз, также называемыми бляшками или очагами повреждения), которые образуются в нервной системе. Очаги повреждения при М8 обычно вовлекают области белого вещества вблизи желудочков мозжечка, ствола головного мозга, базальных ганглиев и спинного мозга, и оптического нерва. М8 приводит к разрушению олигодендроцитов, клеток, ответственных за образование и поддержание миелиновой оболочки. М8 приводит к истончению и полной потере миелина и, по мере прогрессирования заболевания, пересечению аксонов.
Неврологические симптомы могут варьировать при М8, и заболевание часто прогрессирует в нарушение физических и когнитивных функций. М8 имеет несколько форм, причем новые симптомы возникают либо при разобщенных атаках (рецидивирующие формы), либо медленно накапливаются в течение времени (прогрессирующие формы). Между атаками симптомы могут полностью исчезать, однако они приводят к постоянному неврологическому повреждению, особенно по мере прогрессирования заболевания.
Нейтрализацию СБ100 с использованием моноклонального антитела против СБ100 по изобретению, например, МАЬ2503, МАЬ67 или МАЬ76, можно использовать для снижения тяжести М8 через несколько различных механизмов, например, моноклональные антитела против СБ100 могут блокировать созревание и активацию иммунной системы посредством СБ100 для снижения уровня рецидивов путем снижения вторичных иммунных ответов на антигены ЦНС, и моноклональные антитела против СБ100
- 32 025245 могут блокировать эффект растворимого СЭ100 в опосредовании апоптоза олигодендроцитов в ЦНС и могут снизить тяжесть заболевания путем снижения демиелинизации.
В одном варианте осуществления связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент, по изобретению используют для лечения артрита. Артрит, представляет собой воспалительное заболевание суставов, которое может быть вызвано аутоиммунным состоянием, при котором иммунная система атакует суставы. В определенных вариантах осуществления артрит выбран из группы, состоящей из остеоартрита, подагрического артрита, анкилозирующего спондилита, псориатического артрита, реактивного артрита, ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, инфекционного артрита, воспалительного артрита, септического артрита, дегенеративного артрита, деструктивного артрита и артрита Лайма. В одном варианте осуществления артрит представляет собой ревматоидный артрит (КА).
Настоящее изобретение включает способы лечения или предупреждения артрита путем введения индивидууму связывающей молекулы против ί'Ό100 по изобретению, например, МАЬ2503, МАЬ67 или МАЬ76. Способы по настоящему изобретению могут снизить боль, опухание или жесткость, ассоциированные с артритом, например ревматоидным артритом. Настоящее изобретение также относится к способам улучшения деятельности, функции и здоровья суставов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лечение приводит к снижению показателя тяжести артрита, снижению тяжести артрита/площади под кривой, снижению гистопатологических параметров, ассоциированных с артритом (воспаление, паннус, повреждение хряща и повреждение кости), снижению уровней арахидоновой кислоты в сыворотке или к снижению уровня антител против коллагена. В определенных вариантах осуществления благоприятные или желаемые клинические результаты включают, но не ограничиваются ими, смягчение симптомов, ассоциированных с артритом; предупреждение артрита; замедление возникновения артрита; снижение встречаемости артрита в популяции; уменьшение степени состояния, ассоциированного с артритом; стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния, нарушения или заболевания, ассоциированных с артритом; задержку возникновения или замедление состояния, нарушения или заболевания, ассоциированных с артритом; смягчение состояния, нарушения или болезненного состояния, ремиссию (частичную или полную) состояния, нарушения или заболевания, ассоциированных с артритом, как поддающуюся детекции, так и не поддающуюся детекции; или восстановление или улучшение состояния, нарушения или заболевания, ассоциированных с артритом.
Способ по настоящему изобретению можно проводить у индивидуумов, которые имеют артрит, или у индивидуумов, которые имеют риск развития артрита. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения индивидуума, имеющего нормальные суставы, пограничные артритические суставы или высокоартритические суставы, причем способ включает введение связывающей молекулы против ί'Ό100 по изобретению, например, МАЬ2503, МАЬ67 или МАЬ76, индивидууму, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению можно использовать для лечения хронического артрита в течение остальной жизни индивидуума.
Согласно способам по настоящему изобретению по меньшей мере одну связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как определено в настоящем документе, используют для стимуляции положительного терапевтического ответа в отношении лечения или предупреждения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания. Под положительным терапевтическим ответом в отношении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания понимают улучшение при заболевании, ассоциированное с противовоспалительной активностью, антиангиогенной активностью, антиапоптотической активностью или сходными с ними, этих антител и/или улучшение симптомов, ассоциированных с заболеванием. Таким образом, можно наблюдать антипролиферативный эффект, предупреждение дальнейшей пролиферации экспрессирующих ί'Ό100 клеток, снижение воспалительного ответа, включая, но не ограничиваясь ими, снижение секреции воспалительных цитокинов, молекул адгезии, протеаз, иммуноглобулинов (в случаях, когда несущая ί'Ό100 клетка представляет собой В-клетку), их комбинации и т.п., увеличенную продукцию противовоспалительных белков, снижение количества аутореактивных клеток, повышение иммунной толерантности, ингибирование выживания аутореактивных клеток, снижение апоптоза, снижение миграции эндотелиальных клеток, увеличение самопроизвольной миграции моноцитов, снижение и/или уменьшение одного или нескольких симптомов, опосредуемых стимуляцией экспрессирующих 5ί'Ό100 или СЭ100 клеток. Такие положительные терапевтические ответы не ограничиваются способом введения и могут включать введение донору, в ткань донора (например, перфузией органа), хозяину, любую их комбинацию и т.п.
Клинический ответ можно оценивать с использованием скрининговых способов, таких как сканирование магнитно-резонансной томографией (МК1), рентгеновскую радиографическую визуализацию, сканирование компьютерной томографией (СТ), проточную цитометрию или анализ активированной флуоресценцией сортировкой клеток (РАС8), гистологию, макроскопическое исследование патологии, и химию крови, включая, но не ограничиваясь ими, изменения, поддающиеся детекции посредством ЕЫ8А, К1А, хроматографии и т.п. В дополнение к этим положительным терапевтическим ответам, инди- 33 025245 видуум, подвергающийся лечению связывающей СЭ100 молекулой, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, может испытывать благоприятный эффект улучшения симптомов, ассоциированных с заболеванием.
Связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, можно использовать в комбинации по меньшей мере с одним другим способом терапии злокачественной опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, хирургическую операцию или хирургические процедуры (например, спленэктомию, гепатэктомию, лимфаденэктомию, лейкофорез, трансплантацию костного мозга и т.п.); лучевую терапию; химиотерапию, необязательно в комбинации с аутологичным трансплантатом костного мозга, или другую терапию злокачественной опухоли; где дополнительную терапию злокачественной опухоли проводят до, в ходе или после терапии связывающей молекулой против СЭ100, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Таким образом, когда комбинированная терапия включает введение связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, по изобретению в комбинации с введением другого лекарственного средства, с химиотерапией, лучевой терапией, терапией другим антителом против злокачественной опухоли, терапией злокачественной опухоли низкомолекулярным соединением или терапией злокачественной опухоли на основе вакцин/иммунотерапии, способы по изобретению охватывают совместное введение с использованием разделенных составов или единого фармацевтического состава или последовательное введение в любом порядке.
Связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела или их связывающие фрагменты, по изобретению, можно использовать в комбинации с любыми известными способами лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, включая любое средство или комбинацию средств, которые известны как пригодные, или которые использовали или в настоящее время используют для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Таким образом, когда комбинированная терапия включает введение связывающих молекул против СЭ100 в комбинации с введением другого лекарственного средства, способы по изобретению охватывают совместное введение с использованием разделенных составов или единого фармацевтического состава, и последовательное введение в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против СЭ100, описанные в настоящем документе, вводят в комбинации с иммунодепрессивными лекарственными средствами или противовоспалительными лекарственными средствами, где антитело и лекарственное средство(а) можно вводить последовательно, в любом порядке или одновременно (т.е. одновременно или в пределах тех же временных рамок).
В некоторых других вариантах осуществления связывающие молекулы против СЭ100, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с иммунодепрессивными лекарственными средствами для лечения и/или предупреждения ревматоидного артрита. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, где антитела против СЭ100 по изобретению применяют для лечения ревматоидного артрита, антитела можно использовать в комбинации с пригодными иммуносупрессивными лекарственными средствами. Как рассмотрено выше, эффективность лечения можно оценивать с использованием любых способов, и она включает, но не ограничивается ими, эффективность, измеренную по клиническим ответам, определяемым согласно критериям Атепсап Со11еде о£ КЬеита1о1оду, критериям Еигореап Ьеадие о£ КЬеитабкт или любым другим критериям. См., например, Рекоп е1 а1., АгФгйк. КНеит. 38:721-35 (1995) и уап ОеЫе1 е1 а1., АгФгйк КПеит. 39:34-40 (1996).
В других вариантах осуществления антитела против СЭ100 по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с иммунодепрессивными лекарственными средствами для лечения и/или профилактики рассеянного склероза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, где антитела против СЭ100 по изобретению используют для лечения рассеянного склероза, антитела можно использовать в комбинации с пригодными иммунодепрессивными лекарственными средствами.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающих фрагментов, для диагностического мониторинга уровней белков в ткани в качестве части процедуры клинического тестирования, например, для определения эффективности данного режима лечения. Например, детекцию можно упрощать связыванием антитела с поддающимся детекции веществом. Примеры поддающихся детекции веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры пригодного радиоактивного материала включают 125Ι, 131Ι, 35δ или 3Н.
- 34 025245
УШ. Фармацевтические композиции и способы введения.
Способы получения и введения связывающей молекулы против СГОКХ), например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, по изобретению индивидууму, нуждающемуся в этом, хорошо известны специалистам в данной области и они их легко определят. Способ введения связывающей молекулы против СЭ100, например антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, может быть, например, пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Термин парентеральный, как используют в настоящем документе, включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Хотя все эти формы введения явно рассматриваются как находящиеся в объеме изобретения, примером формы для введения может быть раствор для инъекции, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного вливания. Обычно пригодная фармацевтическая композиция для инъекции может включать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизатор (например, альбумин человека) и т.д. Однако в других способах, совместимых с указаниями в настоящем документе, связывающие молекулы против СГОКХ), например антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, по изобретению можно доставлять прямо в область нежелательной клеточной популяции, тем самым увеличивая воздействие на пораженную ткань лекарственного средства.
Как рассмотрено в настоящем документе, связывающие молекулы против СЭ100, например антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, по изобретению, можно вводить в фармацевтически эффективном количестве для лечения ίη νίνο опосредуемых экспрессирующими СГО100 клетками заболеваний, таких как определенные типы злокачественных опухолей, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, включая воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), и инвазивный ангиогенез. В связи с этим, понятно, что описанные связывающие молекулы по изобретению можно изготавливать так, чтобы упростить введение и обеспечить стабильность активного вещества. Предпочтительно фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением содержат фармацевтически приемлемый нетоксичный стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и т.п. Для целей настоящей заявки фармацевтически эффективное количество связывающей молекулы против СГОКХ), например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, конъюгированного или неконъюгированного, должно означать количество, достаточное для достижения эффективного связывания с мишенью и для достижения пользы, например, для смягчения симптомов заболевания или нарушения или детекции вещества или клетки.
Фармацевтические композиции, используемые для этого изобретения, включают фармацевтически приемлемые носители, включая, например, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блок-полимеры полиэтилен-полиоксипропилен, полиэтиленгликоль и ланолин.
Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают, например, воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные среды. В настоящем изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются ими, 0,01-0,1 М и предпочтительно 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствор. Другие распространенные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, раствор декстрозы Рингера, раствор декстрозы и хлорида натрия, лактатный раствор Рингера или жирные масла. Внутривенные носители включают жидкостные и питательные подкрепляющие добавки, электролитные подкрепляющие добавки, такие как добавки на основе раствора декстрозы Рингера и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, например, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы, и т.п.
Более конкретно, фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (где ингредиенты являются растворимыми в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсией перед инъекцией. В таких случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой в той степени, чтобы она могла легко заполнять шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и предпочтительно защищена от заражающего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и
- 35 025245 их пригодные смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Пригодные составы для применения в терапевтических способах, описанных в настоящем документе, описаны в Кеттд!оп'8 РЬагтасеи!1са1 8с1епсе8 (Маск РиЬНкЫпд Со.), 16ΐ1ι еб. (1980).
Предупреждение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях, было бы предпочтительно включать в композицию обеспечивающие изотоничность средства, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированного действия инъецируемых композиций можно достигать путем включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
В любом случае, стерильные инъецируемые растворы можно получать путем включения активного соединения (например, антитела против СГО100 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, самого по себе или в комбинации с другими активными средствами) в требуемом количестве в надлежащем растворителе с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных в настоящем документе, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которая приводит к порошку активного ингредиента вместе с любым дополнительным желаемым ингредиентом из их ранее стерилизованного фильтрацией раствора. Препараты для инъекций перерабатывают, заполняют в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутыли, шприцы и флаконы, и герметизируют в асептических условиях способами, известными в данной области. Кроме того, препараты можно упаковывать и продавать в форме набора, такого как наборы, описанные в патентной заявке США с серийным номером № 09/259337. Такие изделия предпочтительно имеют ярлыки или вкладыши в упаковку, указывающие на то, что соответствующие композиции пригодны для лечения индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением или предрасположенного к ним.
Парентеральные составы могут представлять собой однократную болюсную дозу, инфузию или нагрузочную дозу с последующей поддерживающей дозой. Эти композиции можно вводить через конкретные фиксированные или переменные интервалы, например, один раз с сутки или по необходимости.
Определенные фармацевтические композиции, используемые согласно этому изобретению, можно вводить перорально в приемлемой дозированной форме, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Определенные фармацевтические композиции также можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции можно приготавливать в качестве растворов в физиологическом растворе с использованием бензилового спирта или других пригодных консервантов, ускорителей всасывания для усиления биодоступности и/или других общепринятых солюбилизирующих или диспергирующих средств.
Количество связывающей молекулы против СГОКН), например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, которое можно комбинировать с материалами носителей для получения единичной дозированной формы, варьирует, в зависимости от подвергаемого лечению хозяина и конкретного способа введения. Композицию можно вводить в качестве однократной дозы, многократных доз или на протяжении установленного периода времени путем инфузии. Режимы дозирования также можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа).
При сохранении объема настоящего изобретения, антитела против СГО100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению можно вводить человеку или другому животному в соответствии с упомянутыми выше способами лечения в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического эффекта. Антитела против СЭ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению можно вводить такому человеку или другому животному в общепринятой дозированной форме, полученной путем комбинирования антитела по изобретению с общепринятым фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем согласно известным способам. Специалисту в данной области понятно, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя определяются количеством активного ингредиента, с которым его комбинируют, путем введения и другими хорошо известными переменными факторами. Специалистам в данной области, кроме того, понятно, что коктейль, содержащий один или несколько видов связывающих молекул против СЭ100, например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных, по изобретению может оказаться особенно эффективным.
Под терапевтически эффективной дозой или количеством или эффективным количеством подразумевают количество связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое при введении дает положительный терапевтический ответ в отношении лечения пациента с заболеванием, подлежащим лечению.
- 36 025245
Терапевтически эффективные дозы композиций по настоящему изобретению для лечения экспрессирующих СЭ100 клеточно-опосредуемых заболеваний, таких как определенные типы злокачественных опухолей, например, рака головы и шеи, предстательной железы, толстого кишечника, молочной железы и легкого; аутоиммунные заболевания, например, артрит, рассеянный склероз, воспалительные заболевания, включая воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС); и инвазивный ангиогенез, варьируют, в зависимости от многих различных факторов, включая способы введения, область-мишень, физиологическое состояние пациента, того, является ли пациент человеком или животным, других вводимых лекарственных средств и того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, однако также можно лечить не являющих человеком млекопитающих, включая трансгенных млекопитающих. Дозировки для лечения можно титровать с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, для оптимизации безопасности и эффективности.
Количество по меньшей мере одной связывающей молекулы против СЭ100, например антитела или его связывающего фрагмента, подлежащих введению, может легко определить специалист в данной области без излишнего экспериментирования с учетом описания настоящего изобретения. Факторы, влияющие на способ введения и соответствующее количество по меньшей мере одной связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела, его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, включают, но не ограничиваются ими, тяжесть заболевания, анамнез заболевания, и возраст, рост, массу тела, здоровье и физическое состояние индивидуума, подвергаемого терапии. Аналогично, количество связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, подлежащее введению, может зависеть от способа введения и того, будут ли индивидууму вводить одну или несколько доз этого средства.
Также настоящее изобретение относится к применению связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, включая, например, артрит, рассеянный склероз, воспалительные заболевания ЦНС и ПНС или злокачественную опухоль.
Также изобретение относится к применению связывающей молекулы против СЭ100, например, антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, для изготовления лекарственного средства для лечения у индивидуума аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или для лечения злокачественной опухоли, где лекарственное средство используют у индивидуума, которому предварительно проводили по меньшей мере одну терапию. Под предварительно проведенным лечением или предварительным лечением подразумевают, что индивидууму проводили одну или несколько других терапий (например, проводили лечение по меньшей мере одной другой терапией злокачественной опухоли) перед введением лекарственного средства, содержащего связывающую молекулу против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное.
Предварительно проведенное лечение или предварительное лечение включает индивидуумов, которых лечили по меньшей мере одной терапией в пределах 2 лет, в пределах 18 месяцев, в пределах 1 года, в пределах 6 месяцев, в пределах 2 месяцев, в пределах 6 недель, в пределах 1 месяца, в пределах 4 недель, в пределах 3 недель, в пределах 2 недель, в пределах 1 недели, в пределах 6 суток, в пределах 5 суток, в пределах 4 суток, в пределах 3 суток, в пределах 2 суток или даже в пределах 1 суток перед началом лечения лекарственным средством, содержащим связывающую молекулу против СЭ100, например моноклональное антитело 2503, описанное в настоящем документе, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное. Не является необходимым, чтобы индивидуум был отвечающим на предварительное лечение предшествующим способом лечения или способами лечения. Таким образом, индивидуум, которому вводят лекарственное средство, содержащее связывающее молекулу против СЭ100, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, мог быть отвечающим или мог быть не отвечающим (например, злокачественная опухоль была рефрактерной), на предварительное лечение предшествующей терапией, или на одну или нескольких предшествующих терапий, где предварительное лечение включало несколько терапий. Примеры других терапий злокачественной опухоли, в случае которых индивидуум мог получать предварительное лечение перед введением лекарственного средства, содержащего связывающую молекулу против СЭ100, например антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, включают, но не ограничиваются ими, хирургическую операцию; лучевую терапию; химиотерапию, необязательно в комбинации с аутологичным трансплантатом костного мозга, где пригодные химиотерапевтические средства включают, но не ограничиваются ими, средства, приведенные в настоящем документе выше; другую терапию моноклональным антителом против злокачественной опухоли; терапию злокачественной опухоли на основе низкомолекулярных соединений, включая, но не ограничиваясь ими, низкомолекулярные соединения, приведенные в настоящем документе выше; терапию злокачественной опухоли на основе вакцин/иммунотерапии; терапию стероидами, другую терапию злокачественной опухоли или любую их комбинацию.
- 37 025245
IX. Диагностика.
Кроме того, изобретение относится к диагностическому способу, пригодному в ходе диагностики экспрессирующих ί'.Ό100 клеточно-опосредуемых заболеваний, таких как определенные типы злокачественных опухолей, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, включая, например, артрит, рассеянный склероз, воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), и инвазивный ангиогенез, который вовлекает измерение уровня экспрессии белка или транскрипта СЭ100 в ткани или других клетках или в жидкости организма индивидуума и сравнение измеренного уровня экспрессии со стандартным уровнем экспрессии СО100 в нормальной ткани или жидкости организма, тем самым увеличение уровня экспрессии по сравнению со стандартом указывает на нарушение.
Антитела против СЭ100 по изобретению и их антигенсвязывающие фрагменты, варианты и производные можно использовать для анализа уровней белка ί'.Ό100 в биологическом образце с использованием классических иммуногистохимических способов, известных специалистам в данной области (например, см. Рккапеп, е! а1., I. Се11. Вю1. 101:976-985 (1985); Мкапеп е! а1., I. Се11 Вю1. 105:3087-3096 (1987)). Другие способы на основе антител, пригодные для детекции экспрессии белка СЭ100, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), иммунопреципитация или вестерн-блоттинг. Пригодные анализы описаны в настоящем документе более подробно.
Под анализом уровня экспрессии полипептида ί'.Ό100 подразумевают качественное или количественное измерение или оценку уровня полипептида СО100 в первом биологическом образце либо прямо (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка), либо относительно (например, путем сравнения с ассоциированным с заболеванием уровнем полипептида во втором биологическом образце). Предпочтительно уровень экспрессии полипептида СО100 в первом биологическом образце измеряют или оценивают и сравнивают со стандартным уровнем полипептида СЭ100, причем стандарт берут из второго биологического образца, полученного от индивидуума, не имеющего нарушения, или определяют по усредненным уровням для популяции индивидуумов, не имеющих нарушения. Как будет понятно в данной области, после того, как стандартный уровень полипептида СО100 известен, его можно повторно использовать в качестве стандарта для сравнения.
Под биологическим образцом понимают любой биологический образец, полученный от индивидуума, из клеточной линии, тканевой культуры или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих ί'.Ό100. Способы получения биоптатов тканей и жидкостей организма от млекопитающих хорошо известны в данной области.
X. Иммуноанализы.
Антитела против СИ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению можно анализировать в отношении иммуноспецифического связывания любым способом, известным в данной области. Иммуноанализы, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, системы конкурентного и неконкурентного анализа с использованием способов, таких как вестерн-блоттинг, радиоиммунные анализы, ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ), сэндвич-иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции с преципитином, реакции с преципитином с диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с белком А, помимо прочих. Такие анализы являются общепринятыми и хорошо известны специалисту в данной области (см., например, АикиЬе1 е! а1., ейк (1994), Сштей РгоЮсоР ш Мо1еси1аг Вю1о§у Цокп \УПеу & 8опк, Шс., ΝΥ), Уо1. 1, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме). Иллюстративные иммуноанализы кратко описаны ниже (но предоставлены не для ограничения).
Протоколы иммунопреципитации, как правило, включают лизис популяции клеток в лизирующем буфере, таком как буфер ЫРА (1% ΝΡ-40 или Тгкоп Х-100, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% 8Ό8, 0,15 М №С1, 0,01 М фосфат натрия при рН 7,2, 1% Тгаку1о1), дополненный ингибиторами фосфатаз и/или протеаз белков (например, ЭДТА, РМ8Р, апротинин, ванадат натрия), добавление представляющего интерес антитела к клеточному лизату, инкубацию в течение некоторого периода времени (например, 1-4 ч) при 4°С, добавление гранул сефарозы с белком А и/или белком С к клеточному лизату, инкубацию в течение приблизительно часа или более при 4°С, промывание гранул в лизирующем буфере и ресуспендирование гранул в 8И8/буфере для образца. Способность представляющего интерес антитела осуществлять иммунопреципитацию конкретного антигена можно оценивать, например, посредством вестерн-блот-анализа. Специалисту в данной области известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения связывания антитела с антигеном и снижения фонового связывания (например, до очищения клеточного лизата гранулами сефарозы). Для дальнейшего обсуждения в отношении протоколов иммунопреципитации см., например, АикиЬе1 е! а1., ейк (1994), Сштей РгоЮсоР ш Мо1еси1аг Вю1о§у Цокп \СПеу & 8опк, Шс., ΝΥ), Уо1. 1, 10.16.1.
Вестерн-блот-анализ, как правило, включает приготовление образцов белка, электрофорез образцов белка в полиакриламидном геле (например, 8-20% 808-РАСЕ, в зависимости от молекулярной массы антигена), перенос белкового образца из полиакриламидного геля на мембрану, такую как нитроцеллюлоза, РУОР или нейлон, блокирование мембраны в блокирующем растворе (например, РВ8 с 3% В8А
- 38 025245 или обезжиренным молоком), промывание мембраны в промывочном буфере (например, РВ8-Тетееп 20), блокирование мембраны первичным антителом (представляющим интерес антителом), разбавленным в блокирующем буфере, промывание мембраны промывочным буфером, блокирование мембраны вторичным антителом (которое распознает первичное антитело, например, антитело против антител человека), конъюгированным с ферментным субстратом (например, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой) или радиоактивной молекулой (например, 32Р или 1251), разбавленной в блокирующем буфере, промывание мембраны в промывочном буфере и детекцию присутствия антигена. Специалисту в данной области известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения детектируемого сигнала и для снижения фонового шума. Для дальнейшего обсуждения в отношении протоколов вестерн-блоттинга см., например, Аи8иЬе1 е! а1., ебз (1994), Сиггеп! Рго!осок ш Мо1еси1аг Вю1оду Сокп \УПеу & 8опз, 1пс., ΝΥ), Уо1. 1 а! 10.8.1.
ЕЫ8А включают получение антигена, нанесение на лунку 96-луночного микропланшета для титрования антигена, добавление представляющего интерес антитела, конъюгированного с поддающимся детекции соединением, таким как ферментный субстрат (например, пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) на лунку и инкубацию в течение периода времени, и детекцию присутствия антигена. В ЕЫ8А представляющее интерес антитело не должно быть конъюгировано с поддающимся детекции соединением; вместо этого в лунку можно добавлять второе антитело (которое распознает представляющее интерес антитело), конъюгированное с поддающимся детекции соединением. Кроме того, вместо нанесения на лунку антигена, на лунку можно наносить антитело. В этом случае после добавления представляющего интерес антигена в покрытую лунку можно добавлять второе антитело, конъюгированное с поддающимся детекции соединением. Специалисту в данной области известны параметры, которые можно модифицировать для увеличения детектируемого сигнала, а также другие варианты ЕЫ8А, известные в данной области. Для дальнейшего обсуждения, касающегося ЕЫ8А, см., например, Аи8иЬе1 е! а1., ебз (1994), Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду (.Токи \УПеу & 8опз, 1пс., ΝΥ), Уо1. 1, 11.2.1.
Аффинность связывания антитела с антигеном и константу диссоциации взаимодействия антителоантиген можно определять с помощью конкурентных анализов связывания. Одним примером конкурентного анализа связывания является радиоиммунный анализ, включающий инкубацию меченого антигена (например, Н или I) с представляющим интерес антителом в присутствии возрастающих количеств немеченого антигена, и детекцию антитела, связанного с меченым антигеном. Аффинность представляющего интерес антитела к конкретному антигену и константы диссоциации для связывания можно определять из данных с помощью анализа графика Скэтчарда. Конкуренцию со вторым антителом также можно определять с использованием радиоиммунных анализов. В этом случае антиген инкубируют с представляющим интерес антителом, конъюгированным с меченым соединением (например, 3Н или 1251) в присутствии возрастающих количеств немеченного второго антитела.
Антитела против СЭ100 или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные по изобретению, кроме того, можно использовать гистологически, как в иммунофлуоресценции и иммунной электронной микроскопии, или в неиммунологических анализах для детекции ш 81!и белка СЭ100 или его консервативных вариантов или пептидных фрагментов. Детекцию ш δίΐιι можно проводить путем извлечения гистологического образца из пациента и нанесения на него меченого антитела против СЭ100 или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, предпочтительно наносимых наслоением меченого антитела (или фрагмента) на биологический образец. С использованием такой процедуры можно определить не только присутствие белка СЭ100 или консервативных вариантов или пептидных фрагментов, но также его распределение в исследуемой ткани. С использованием настоящего изобретения специалист в данной области может легко понять, что любой из широкого множества гистологических способов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для осуществления такой детекции ш δίΐιι.
Иммуноанализы и неиммунные анализы продуктов гена СЭ100 или их консервативных вариантов или пептидных фрагментов, как правило, включают инкубацию образца, такого как биологическая жидкость, экстракт ткани, свежесобранные клетки или лизаты клеток, которые инкубировали в клеточной культуре, в присутствии меченого поддающейся детекции меткой антитела, способного связываться с СЭ100 или его консервативными вариантами или пептидными фрагментами, и детекцию связанного антитела любым количеством способов, хорошо известных в данной области.
Биологический образец можно приводить в контакт или иммобилизовывать на твердофазной подложке или носителе, таких как нитроцеллюлоза или другая твердая подложка, на которой можно иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем подложку можно промывать пригодными буферами с последующей обработкой меченным поддающейся детекции меткой антителом против СЭ100, или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным. Затем твердофазную подложку можно промывать буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Затем антитело необязательно метят. Затем можно проводить детекцию количества связанной метки на твердой подложке общепринятыми способами.
Под твердофазной подложкой или носителем подразумевают любую подложку, способную связывать антиген или антитело.
- 39 025245
Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, нейтральные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Для целей настоящего изобретения характер носителя может быть либо растворимым до некоторой степени, либо нерастворимым. Материал подложки может иметь практически любую возможную структурную конфигурацию, при условии, что связанная с ним молекула способна связываться с антигеном или антителом. Таким образом, конфигурация подложки может быть сферической, как в гранулах, или цилиндрической, как во внутренней поверхности тестовой пробирки или внешняя поверхность стержня. Альтернативно поверхность может быть плоской, такой как лист, тест-полоска и т.д. Предпочтительные подложки включают полистироловые гранулы. Специалистам в данной области известны многие другие пригодные носители для связывания антитела или антигена, или они способны определить их с использованием общепринятого экспериментирования.
Связывающую активность данной партии антител против СЭ100 или их антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, можно определять известными способами.
Специалисты в данной области способны определить действующие и оптимальные условия анализа для каждого определения с использованием общепринятого экспериментирования.
Доступно множество способов для измерения аффинности взаимодействия антитело-антиген, но относительно мало для определения констант скоростей. Большинство способов основаны на мечении либо антитела, либо антигена, что неизбежно осложняет повседневное измерение и вносит неточность в измеренные количества.
Поверхностный плазмонный резонанс (δΡР), проводимый на В1АС0РЕ®, обеспечивает ряд преимуществ над общепринятыми способами измерения аффинности взаимодействий антитело-антиген: (г) не требуется мечение ни антитела, ни антигена; (ίί) не требуется предварительная очистка антител, можно использовать непосредственно клеточную культуру; (ίίί) для многих целей оценки возможны и достаточны измерения в реальном времени, позволяющие быстрое полуколичественное сравнение различных взаимодействий моноклональных антител; (ίν) биоспецифическую поверхность можно регенерировать так, чтобы серии различных моноклональных антител можно было легко сравнивать в идентичных условиях; (ν) аналитические процедуры являются полностью автоматизированными и можно проводить обширные серии измерений без вмешательства пользователя. В1АаррНса!юп8 НапбЬоок, νе^8^оп АВ (новое издание в 1998 году), В1АС0РЕ® собе № ВР-1001-86; В1А!есЬпо1оду НапбЬоок, νе^8^оп АВ (герпп!еб 1998), В1АС0РЕ® собе № ВР-1001-84. Основанные на δΡΚ исследования связывания требуют, чтобы один представитель связывающей пары был иммобилизован на поверхности сенсора. Иммобилизованный связывающий партнер называют лигандом. Связывающий партнер в растворе называют анализируемым соединением. В некоторых случаях лиганд связан непрямо с поверхностью через связывание с другой иммобилизованной молекулой, которую называют улавливающей молекулой. Ответ δΡΚ отражает изменение в весовой концентрации на поверхности детектора по мере связывания или диссоциации анализируемых соединений.
На основе δΡΚ способы измерения В1АС0РЕ® в реальном времени осуществляют мониторинг взаимодействий, непосредственно когда они происходят. Этот способ хорошо подходит для определения кинетических параметров. Ранжирование сравнительной аффинности проводить просто, и из данных сенсограмм могут быть установлены как кинетические константы, так и константы аффинности.
Когда анализируемое соединение инъецируют отдельным импульсом над поверхностью лиганда, полученную сенсограмму можно подразделить на три существенных фазы: (ί) ассоциация анализируемого соединения с лигандом в процессе инжекции образца; (ίί) состояние равновесия или устойчивое состояние в процессе инжекции образца, где скорость связывания анализируемого соединения уравновешивается диссоциацией из комплекса; (ίίί) диссоциация анализируемого соединения с поверхности во время течения буфера. Фазы ассоциации и диссоциации обеспечивают информацию о кинетике взаимодействия анализируемое соединение-лиганд (к,, и к^ скорости образования комплекса и диссоциации кб/ка=Кс). Фаза равновесия обеспечивает информацию об аффинности взаимодействия анализируемое соединение-лиганд (Кс).
Программное обеспечение В1Ае\'а1иайоп обеспечивает обширные средства для аппроксимации кривых с использованием алгоритмов как численного интегрирования, так и глобальной аппроксимации. При подходящем анализе данных из простых исследований В1АС0РЕ® можно получать отдельные константы скорости и аффинности для взаимодействия. Диапазон аффинности, поддающейся измерению этим способом, является очень широким, от мМ до пМ.
Эпитопная специфичность является важной характеристикой моноклонального антитела. Картирование эпитопа с помощью В1АС0РЕ®, в противоположность общепринятым способам с использованием радиоиммунного анализа, ЕЬКА или других способов поверхностной адсорбции, не требует мечения или очистки антител, и позволяет тесты специфичности множества участков с использованием последовательности из нескольких моноклональных антител. Кроме того, большие количества анализов можно проводить автоматически.
Эксперименты попарного связывания тестируют способность двух МАЬ связываться одновременно
- 40 025245 с одним и тем же антигеном. МАЬ, направленные против отдельных эпитопов, связываются независимо, в то время как МАЬ, направленные против идентичных или высокосходных эпитопов, будут препятствовать связыванию друг друга. Эти эксперименты В1АСОКЕ® по связыванию просто осуществить.
Например, можно использовать улавливающую молекулу для связывания первого МаЬ, с последующим добавлением антигена и второго МАЬ последовательно. Сенсограммы выявляют: (1) сколько антигена связывается с первым МаЬ, (2) в какой степени второе МАЬ связывается со связанным с поверхностью антигеном, (3) если второе МАЬ не связывается, изменит ли результаты обратный порядок попарного теста.
Пептидное ингибирование является другим способом, используемым для картирования эпитопа. Этот способ может дополнять исследование попарного связывания антител, и может соотносить функциональные эпитопы со структурными признаками, когда первичная последовательность антигена известна. Пептиды или антигенные фрагменты тестируют в отношении ингибирования связывания различных МАЬ с иммобилизованным антигеном. Пептиды, которые могут препятствовать связыванию данного МАЬ, считают структурно родственными эпитопу, определенному с помощью этого МАЬ.
Для осуществления на практике этого изобретения можно использовать, если нет иных указаний, общепринятые способы клеточной биологии, клеточной культуры, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации в данной области. Такие способы подробно объяснены в литературе. См., например, ЗатЬгоок е1 а1., еб. (1989), Мо1еси1аг С1отпд А ЬаЬога1огу Мапиа1 (2пб еб.; Со1б Зргшд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88); ЗатЬгоок е1 а1., еб. (1992), Мо1еси1аг С1ойпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, (Со1б Зрпп§8 НагЬог ЬаЬога1огу, ΝΥ); Ό. Ν. О1оуег еб. (1985), ^NΑ С1отпд, Уо1ите8 I апб II; ОаЬ, еб. (1984), ОПдопис1еоПбе ЗупШе818; МиШ8 е1 а1. патент США № 4683195; Нате8 апб Шддш8, еб8. (1984), ШсШс Ас1б НуЬпб1/аПоп; Нате8 апб Шддш8, еб8. (1984), Тгаи8сг1рйоп Апб Тгаи81айоп; Рге8Ьпеу (1987), СиЬиге О£ Атта1 Се118 (А1ап К. Ы88, 1пс.); 1ттоЬШ/еб Се118 Апб Еп/уте8 (1КЬ Рге88) (1986); РегЬа1 (1984), А Ргасйса1 Ошбе То Мо1еси1аг С1отп§; Ше 1геаЙ8е, МеШоб8 1п Еп/уто1оду (Асабетю Рге88, 1пс., Ν.Υ.); МШег апб Са1о8 еб8. (1987), Оепе ТгапзЕег Уес1ог8 Рог МаттаПап Се118, (Со1б Зргтд НагЬог ЬаЬога1огу); ХУи е1 а1., еб8., МеШоб8 1п Еп/уто1оду, Уо1. 154 и 155; Мауег апб ХУа1кег, еб8. (1987), 1ттипосЬет1са1 МеШоб8 1п Се11 Апб Мо1еси1аг Вю1оду (Асабепис Рге88, Ьопбоп); ХУеЬ апб В1асктее11, еб8. (1986), НапбЬоок О£ Ехрептейа1 1ттипо1оду, Уо1ите8 I1У; Матри1аЬпд Ше Мои8е ЕтЬгуо, Со1б Зргтд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, Со1б Зргтд НагЬог, Ν.Υ., (1986); и Аи8иЬе1 е1 а1. (1989), Сиггей РгоШсок т Мо1еси1аг Вю1оду (ЛоПп ХУПеу апб Зоп8, ВаШтоге, Мб.).
Общие принципы конструирования антител указаны в ВоггеЬаеск, еб. (1995), АпЬЬобу Епдтеегшд (2пб еб.; Ох£огб Ийу. Рге88). Общие принципы инженерии белков указаны в Шсктеооб е1 а1., еб8. (1995), Рго1еш Епдтеегшд, А Ргасйса1 АрргоасЬ Рге88 а1 Ох£огб Ийу. Рге88, Ох£огб, Епд.). Общие принципы антител и связывания антитело-гептен указаны в: №8опо££ (1984), Мо1еси1аг ШипипоКду (2пб еб.; Зтаиег А88ос1а1е8, Зипбег1апб, Ма88.); и З1етеагб (1984), АпПЬоб1е8, ТПеп ЗйисШге апб РипсЬоп (СЬартап апб На11, №те Уогк, Ν.Υ.). Кроме того, стандартным способам в иммунологии, известные в данной области, и не описанные конкретно, главным образом, следуют как в Сиггей РгоШсой ш !ттипо1оду, 1оПп ХУПеу & Зоп8, №\у Уо^к; ЗШе8 е1 а1., еб8. (1994), Ва81с апб СЬйса1 ШипиЮоду (8Ш еб; Арр1е1оп & Ьапде, №г\уа1к, Сопп.) и М18Ье11 апб ЗПИщ (еб8) (1980), Зе1ес1еб МеШоб8 ш Се11и1аг ЕптипоКду (ХУ.Н. Ргеетап апб Со., ΝΥ).
Стандартные справочные издания, в которых указаны общие принципы иммунологии, включают Сиггей РгоШсой т ЬптипоКду, 1оПп ХУПеу & Зоп8, №\у Уо^к; К1еш (1982), 1., Штшпо1оду: ТЬе Заепсе о£ Зс1£-№п5с1£ О18спттаПоп ЦоПп ХУПеу & Зоп8, ΝΥ); КеппеЬ е1 а1., еб8. (1980), Мопос1опа1 АпЬЬоб1е8, НуЬпбота8: А №\у О1теп81оп ш Вю1одюа1 Апа1у8е8 (Р1епит Рге88, ΝΥ); СатрЬе11 (1984), Мопос1опа1 АпЬЬобу ТесЬпоШду, ЬаЬогаШгу ТесЬп1цие8 ш ВюсПепйЬу апб Мо1еси1аг Вю1оду, еб. Вигбеп е1 а1. (Е18еуеге, Ат81егбат); Оо1б8Ьу е1 а1., еб8. (2000), КиЬу Штшппо1оду (4Ш еб.; Н. Ргеетапб & Со.); КоЫ е1 а1. (2001), Штшпо1оду (6Ш еб.; Ьопбоп: Мо8Ьу); АЬЬа8 е1 а1. (2005), Се11и1аг апб Мо1еси1аг ШипиЮоду (5Ш еб.; Е18еу1ег Неа1Ш Зс1епсе8 О1У181оп); Койегтапп апб ЭиЬе1 (2001), АпЬЬобу Епдшеегтд (Зргтдег Уег1ап); ЗатЬгоок апб Ки88е11 (2001), Мо1еси1аг С1ойпд: А ЬаЬогаШгу Мапиа1 (Со1б Зргшд НагЬог Рге88); Ьетеш (2003), Оепе8 УШ (Ргепйсе На112003); Наг1оте апб Ьапе (1988), АпЬЬоб1е8: А ЬаЬогаШгу Мапиа1 (Со1б Зргшд НагЬог Рге88); О1е££епЬасЬ апб Оуек81ег (2003), РСК Рбтег (Со1б Зрппд НагЬог Рге88).
Все из цитированных выше ссылок, а также ссылки, цитированные в настоящем документе, включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.
Представленные ниже примеры предоставлены в качестве иллюстрации и не для ограничения. Примеры
Пример 1. Отбор и охарактеризация антител, специфичных к СЭ100.
Антитела мыши против СЭ100, распознающие СЭ100 человека, обезьяны и мыши, получали с использованием способов, описанных ниже.
Клеточная линия Ьше 1 была получена из спонтанной опухоли легкого у мыши ВАЬВ/с. Авторы изобретения ранее показали, что инъекция мышам ВАЬВ/с живых клеток Ьше 1, трансфицированных чужеродной кДНК, была эффективным способом индукции иммунных ответов (неопубликованные данные). Клеточную линию Ьше 1 трансфицировали экспрессирующей плазмидой, кодирующей полнораз- 41 025245 мерную кДНК СИ100 человека (8ЕЦ ГО N0: 23). Из трансфицированной клеточной линии выделяли стабильную клеточную линию, экспрессирующую СИ100 человека (Ьше 1.СИ100). Дефицитных по СИ100 мышей (фон ВЛЬВ/с, см. КитаподоН е! а1., 1. 1ттипо1. 7(59:1175-1181 (2002)) примировали путем иммунизации очищенным СИ100 мыши-Ηίβ (внеклеточный домен СИ100 мыши с С-концевой 6Х Ηίβ-меткой для очистки), эмульгированным в полном адъюванте Фрейнда (СРА). Через одну неделю после этой иммунизации мышам внутримышечно инъецировали (в/м) 200000 живых клеток Ьше 1.СИ100. Через девятнадцать суток после инъекции Ь1пе1.СИ100 мышей умерщвляли и селезенки собирали и подвергали слиянию с партнером по слиянию Р3Х63А§8.653 (АТСС# СКЬ-1580) в соответствии со стандартными процедурами получения гибридом. Клоны гибридом подвергали скринингу посредством ЕЫ8А в отношении связывания с СИ100 человека и мыши. В частности, гибридомную клеточную линию, специфичную к МАЬ67, получали с использованием технологии гибридом. (КоЫег е! а1., №1иге 256:495 (1975); КоЫег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 5:511 (1976); КоЫег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 6:292 (1976); ИаттегНпд е! а1., ίη: Мопос1опа1 АпРЬоЫев апб Т-Се11 ИуЬгЫотав. Е1веу1ег, КУ., р. 571-681 (1981)). Получали большую панель специфичных к СИ100 мыши антител. Большинство из этих антител также связывались с высокой аффинностью с СИ100 человека. Две гибридомы, клоны 67-2 и 76-1, продуцировали моноклональные антитела (называемые МАЬ67 и МАЬ76 соответственно), которые проявляли высокую аффинность в отношении СИ100 как мыши, так и человека (см. табл. 2).
Таблица 2
Измерение аффинности в отношении МАЬ мыши против СИ100
МаЬ Изотип Аффинность в отношении СБ100 мыши (нМ) * Аффинность в отношении СС100 человека (нМ) *
67 1д51 1,00 5,7
76 1д62Ь 0,33 0, 12
* Аффинность измеряли с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса В1АС0КЕ®.
ЕЫ8А с перекрестным блокированием антител продемонстрировал, что МАЬ67 и МАЬ76 распознают разные эпитопы на СИ100. Кроме того, МАЬ67 и 76 распознают эпитоп, который отличается от эпитопа, распознаваемого имеющим независимое происхождение антителом мыши против СИ100 человека ВИ16 (описанным в И8 2008/0219971 А1). Таким образом, получили два независимых антитела мыши против СИ100, МАЬ76 (см. 8ЕЦ ГО N0: 25-40) и МАЬ67 (см. 8ЕЦ ГО N0: 3-8; 10; 11-16; 18; 20 и 22).
Пример 2. МАЬ67 и 76 блокируют активность СИ100 мыши и человека ш νίΙΐΌ.
Специфичные к СИ100 антитела подвергали скринингу в отношении их способности ингибировать связывание СИ100 в анализе блокирования флуоресценции. Иллюстрация способа, используемого для тестирования того, блокируют ли специфичные к СИ100 антитела связывание СИ100 с плексином В1, представлена на фиг. 1. Клетки 293 человека трансфицировали кДНК, кодирующей рецептор СИ100: плексин В1. Была отобрана стабильная клеточная линия, экспессирующая плексин В1 (293/плексин). Детекцию СИ100-Шв, связанного с плексином В1 на клеточной поверхности, проводили проточной цитометрией с использованием конъюгированного с биотином специфичного к Шв-метке моноклонального антитела и стрептавидин-АРС. Когда тестируемое МАЬ против СИ100 было способно блокировать связывание СИ100 с плексином В1, тогда на клетке выявлялось меньшее количество СИ100-Шв, что приводило к более низкой флуоресценции.
нг СИ100-Шв человека или мыши (С-концевая Шв-метка) инкубировали отдельно или с различными концентрациями МАЬ против СИ100 в течение ночи при 4°С. На следующее утро либо (1) СИ100 отдельно, либо (2) СИ100, преинкубированный с МАЬ против СИ100 (67 или 76) объединяли с клетками 293/плексин и инкубировали в течение 30 мин на льду. Детекцию СИ100, который связывался с клеткой через плексин В1, проводили с использованием биотинилированного поликлонального МАЬ кролика против Шв, а затем стрептавидин-АРС, и клетки анализировали проточной цитометрией. Результаты показали, что нейтрализация СИ100 приводила к более низкой флуоресценции. В частности, преинкубация СИ100 с МАЬ67 или МАЬ76 приводила к более низкой флуоресценции по сравнению с СИ100 отдельно (фиг. 2). Увеличение концентрации МАЬ67 или 76 против СИ100 от 0,156 до 0,625 мкг/мл приводило к дальнейшему снижению флуоресценции. Также наблюдали сходное блокирование СИ100 человека (данные не представлены). Таким образом, эти результаты показали, что как МАЬ67, так и МАЬ76, были способны блокировать связывание СИ100 человека и мыши с плексином В1.
Было показано, что передача сигнала СИ100/плексин В1 индуцирует открепление от внеклеточного матрикса и коллапс клеток путем индукции реорганизации актиновых филаментов (См. Кгидег е! а1., №!иге Ке\ае\Ув Мо1еси1аг Се11 Вю1оду (5:789-800 (2005)). Гетерологичный анализ для определения открепления клеток после связывания с внеклеточным матриксом использовали для определения того, могут ли
- 42 025245 антитела против СЭ100 блокировать индуцируемое СЭ100 открепление клеток 293/плексин от покрытых фибронектином планшетов.
Для анализа открепления клеток клетки 293/плексин (обычно выращиваемые в качестве суспензионной клеточной линии) высевали с плотностью 40000 клеток/лунка на покрытый фибронектином 96луночный планшет и позволяли им прикрепляться в течение ночи. 2 мкг/мл СЭ100 мыши-НХ (Сконцевая НХ-метка) инкубировали отдельно или с различными концентрациями МАЬ против СЭ100 (67 или 76) в течение 6 ч при 4°С. Затем образцы СЭ100 доводили до комнатной температуры, а затем добавляли клетки 293/плексин. Клетки обрабатывали СЭ100 или СЭ100, преинкубированным с антителом в течение 30 мин при 37°С, промывали два раза посредством РВ8 и окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 15 мин. Затем клетки промывали два раза посредством РВ8 и сушили. Получали изображения на сканере для документации. Затем кристаллический фиолетовый солюбилизировали в течение 15 мин при КТ с помощью 100 мкл 33% ледяной уксусной кислоты, и пипетировали в новый планшет. Считывание поглощения проводили при 570 нм. ί'Ό100 вызывает снижение числа клеток, связанных с планшетом, и, таким образом, снижение поглощения, в то время как нейтрализация ί'Ό100 приводит к увеличению поглощения.
Как показано на фиг. 3, как МАЬ67, так и МАЬ76 были способны блокировать опосредуемое СЭ100 мыши открепление и увеличивать поглощение по сравнению с изотипическим контролем. Аналогично оба МАЬ также были способны блокировать открепление клеток, опосредуемое СЭ100 человека (данные не представлены).
МАЬ67 и 76 блокировали связывание СЭ100 с плексином В1 клеточной поверхности и индуцировали открепление клеток 293/плексин от покрытых фибронектином планшетов. Результаты функциональных анализов ίη νίίΓΟ, описанных выше, показали, что МАЬ67 и МАЬ76 были способны блокировать функцию СЭ100 мыши и человека ίη νίΐτο.
Пример 3. Оценка моноклональных антител против ί'Ό100 в моделях заболевания на мышах.
Нейтрализующие моноклональные антитела против ί'Ό100 (76 и 67) тестировали ίη νίνο в модели на животных 81Ь ЕАЕ.
Ремитирующий экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (К-ЕАЕ) представляет собой опосредуемое ί'Ό4+ Т-клетками заболевание, характеризующееся воспалением и демиелинизацией в центральной нервной системе. У мышей 81Ь К-ЕАЕ может быть индуцирован иммунизацией пептидным эпитопом протеолипидного белка (ΡΗΡ139-ΐ51) (НЗЕОК^ЬОНРОКЕ; 8ЕЦ ГО N0: 24). Эта модель характеризуется от умеренной до тяжелой острой паралитической фазой, а затем ремиссией и последующими рецидивами. Тяжесть заболевания оценивали с использованием шкалы, представленной в табл. 3.
Таблица 3
Оценка клинических признаков ЕАЕ
Показатель Признаки Описание
0 Нормальное поведение Нет неврологических признаков
1 Вялая дистальная Дистальная часть хвоста
часть хвоста является вялой и висячей
1,5 Полностью вялый Весь хвост является слабым и
хвост висячим
2 Рефлекс Животное имеет трудности в
выпрямления перекатывании на лапы когда оно лежит на спине
3 Атаксия Неустойчивая походка - когда мышь ходит, задние лапы являются неустойчивыми
4 Ранний паралич Мышь имеет затруднение стояния на задних лапах, однако все еще имеет остаточные движения
5 Полный паралич Мышь не может двигать лапами вообще, они выглядят худыми и истощенными
6 Умирание/смерть Гибель
Мышей §1Ъ иммунизировали 100 мкг ΡΤΡ139-151 в СТА. Коклюшный токсин вводили на сутки 0 и снова через 48 ч. Мышам вводили 30 мг/кг МАЬ 76, 67 или изотипического контрольного антитела два раза в неделю, начиная на сутки 0, или один раз в неделю, начиная на сутки 7. Оценку клинических признаков ЕАЕ начинали с 10 суток после индукции ЕАЕ.
- 43 025245
Как показано на фиг. 4А, введение МАЬ76 или МАЬ67 снижало тяжесть ЕАЕ у мышей ЗХЪ по сравнению с контрольным 1§О мыши. Процентное снижение среднего показателя для группы (СМЗ) между сутками 21 и концом исследования для МАЬ76 и 67 через 1Х/неделя и 2х/неделя для каждого случая показано на фиг. 4В. Как показано на фиг. 4В, МАЬ76 (1Х/неделя) имело процентное ингибирование СМЗ 35-40%; МАЬ67 (1Х/неделя) имело процентное ингибирование СМЗ 65-70%; МАЬ76 (2Х/неделя) имело процентное ингибирование СМЗ 40-50%; и МАЬ67 (2Х/неделя) имело процентное ингибирование СМЗ 45-50%. Эти результаты показывают, что как МАЬ67, так и МАЬ76 ослабляли ремитирующий ЕАЕ у мышей ЗХЪ.
Исследование З1Ь ЕАЕ повторяли с использованием МАЬ76 в дозе 30 мг/кг и при дозировании 1Х/неделя. Результаты, кроме того, продемонстрировали, что МАЬ76 было способно снижать тяжесть ЕАЕ у мышей ЗДЬ по сравнению с 1§С мыши (данные не представлены). Процентное снижение среднего показателя для группы (ОМ8) между сутками 21 и концом исследования составило 50-60%. Более того, исследование ЗДЬ ЕАЕ повторяли с использованием МАЬ76 или МАЬ67 при дозировании 30 мг/кг 1Х/неделя. Введение МАЬ67 или МАЬ76 приводило к процентному снижению ОМ8 30-40% между сутками 18 и концом исследования. Результаты на фиг. 5А и 5В далее демонстрируют, что МАЬ76 и МАЬ67 были способны снижать тяжесть ЕАЕ у мышей ЗГО.
Исследование ЗДЬ ЕАЕ повторяли с использованием МАЬ67 при дозировании 30 мг/кг 1Х/неделя, где введение начинали на 7 сутки после иммунизации. Введение МАЬ67, начиная на 7 сутки, приводило к процентному снижению ОМЗ приблизительно 50% между сутками 12 и концом исследования. Результаты представлены на фиг. 6.
Результаты этих исследований ίη νίνο демонстрируют, что нейтрализация СИ100 с использованием МАЬ76 или МАЬ67 снижала клинические признаки ЕАЕ в различных экспериментах ЕАЕ на мышах. Результаты для МАЬ76 и МАЬ67 в этих экспериментах были сходны между собой.
Эти результаты продемонстрировали, что МАЬ76 и МАЬ67 способны блокировать активность СИ100 ίη νίΐτο, и, важно, способность снижать тяжесть ЕАЕ в различных экспериментах по дозированию в модели ЕАЕ на мышах.
Пример 4. Получение химерных и гуманизированных моноклональных антител против СИ100.
Было показано, что моноклональное антитело мыши, клон 67, описанное выше, обладает способностью нейтрализовывать СИ100 как человека, так и мыши, ίη νίΐτο и смягчать ЕАЕ в моделях на мышах ίη νίνο.
Гены вариабельной области тяжелой цепи (УН) и вариабельной области легкой цепи (УК) клонировали из гибридомы клона 67 и их последовательность определяли. Аминокислотные последовательности генов УН и УК МАЬ67 представлены ниже с подчеркнутыми областями СИК1, СИК2 и СИК3:
νΗ МАР67:
ОУОЕОО5СРЕЕУКРСА8УК15СКА5С;У8Г8РУУМН1УУКОЗРЕ№ЕЕЦ'Ю(ЖРТТ ССА5УНОКГКОКАТЕТУРК558ТАУМ<ХК5ЕТ5ЕЕ5АУ¥УСТКУУУСРНГРУ7У ОООТТУТУ35 (8Εζ>ΙΡΝΟ: 10) νκ МАР67:
Р1УМТО8РА8ЕАУ$ЕООЕАТ15СКА5О5УРУРОР8УМК'\УУООКРООРРКЕЫУА Α5ΝΕΕ5ΟΙΡΑΕ.Ρ5α8α80ΤΡΕΤΕΝΙΗΡνΕΕΕΡΑΑΤΥΥ€005ΝΕΡΡΥΤΓΟ00ΤΚΕΕ1 К (8ΕΟ1ΡΝΟ. 18)
Ген УН МАЬ67 клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, который содержал кодирующую последовательность для константной области тяжелой гамма 4 человека, создавая полноразмерную химерную тяжелую цепь. УК МАЬ67 клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих, который имел кодирующую последовательность для константной области каппа, создавая полноразмерную химерную легкую цепь. Для получения химерного антитела экспрессирующие векторы, содержащие химерную тяжелую цепь и химерную легкую цепь, котрансфицировали в клетки СН0-З. Продуцируемое моноклональное антитело секретировалось из клеток и его собирали после периода экспрессии 3-6 суток. Полученное МАЬ очищали с использованием хроматографии с белком А и охарактеризовывали. С помощью проточной цитометрии и ЕЫЗА было показано, что полученное химерное МАЬ (МАЬ2368) является специфичным к СИ100, и было показано, что оно способно конкурировать с МАЬ67 мыши за связывание с СИ100. В совокупности эти данные демонстрируют, что были выделены правильные гены УН и УК, кодирующие МАЬ67.
Вариабельные области СГОК МАЬ67 использовали для создания гуманизированного моноклонального антитела. Гуманизированные гены УН и УК соответственно клонировали в векторы, содержащие константные домены гамма 4 человека и каппа человека. Объединение парами гуманизированной УН и гуманизированной УК приводило к 1§С4/каппа МАЬ 2503. Аминокислотные последовательности гуманизированных УН МАЬ67 (Н2160) и УК (Ь553) представлены ниже с подчеркнутыми областями СГОКЕ СГОК2 и СИК3.
- 44 025245
Последовательность Н2160:
ОУ0ЬУО5САЕУККРС55УКУ5СКА5ОУ8Г5РУУМНУ/УК0АР(ЗОСЬЕ\УМС;0^
ΡΤΤΟΟΑ8ΥΝΟΚΓΚΟΚΑΤΙΤνΡΚ5Τ5ΤΑΥΜΕΕ55ίΚ5ΕΡΤΑνΥΎΰΑΚΥΥΥΟΚΗΓΡ ν\νθ<3ΟΤΤντν88 (5Е<3 ΙΡ N0: 9)
Последовательность Ь553:
Р1УМТ08РР8ЕАУ8ЬОЕКАТ1НСКА505УРУРОР8УМКУ/УООКРООРРКШУА
А5НЬЕ5СУРРКР8С508ОТРРТЬТ158Ь0АЕРУАУУУС(Х>8КЕРРУТЕ000ТКЕЕ1
К№,>11> N0: 17)
Полинуклеотиды, кодирующие области УН (ген иммуноглобулина человека с гамма человека; Н2160) и УК (ген иммуноглобулина человека с каппа человека; Ь553) антитела МАЬ2503 клонировали в векторы рСМУ-§спр! (§1га!адепе) и они были депонированы в Атепсап Туре Си1!иге Со11есйоп (АТСС) 7 мая 2009 года и им были присвоены номера депонированных образцов АТСС РТА-10004 и РТА-10005 соответственно. АТСС находится по адресу 10801 Ипгуегкйу Вои1еуагй, Мапаккак, УА 20110-2209, И8А. Образцы депонировали АТСС согласно условиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Пример 5. Охарактеризация гуманизированного моноклонального антитела против СЭ100 2503.
Специфичность МАЬ2503 охарактеризовали с помощью ЕЫ8А и проточной цитометрии. МАЬ2503 тестировали в конкурентном анализе эпитопов с МАЬ67 и в анализе определения аффинности с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса В1АСОКЕ®.
Специфичность МАЬ2503 и МАЬ67 к эпитопу определяли с помощью конкурентного ЕЫ8А. Для протокола ЕЫ8А на планшет для ЕЫ8А наносили С0100-Ес. МАЬ67 мыши или гуманизированное МАЬ2503 титровали. Антителам позволяли связываться с СЭ100 и несвязанное антитело отмывали. Добавляли биотинилированное МАЬ67. Антителам позволяли связываться с СЭ100 и несвязанное антитело отмывали. Детекцию биотинилированного МАЬ67, связанного с СЭ100, проводили с использованием стрептавидин-НКР. Способность МАЬ2503 или МАЬ67 блокировать связывание биотинилированного 67 с СЭ100 человека (представленную на фиг. 7А) и СЭ100 мыши (представленную на фиг. 7В) анализировали с помощью ЕЫ8А.
Аффинность связывания МАЬ против СЭ100 определяли с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса В1АСОКЕ®. Было показано, что только МАЬ2503 связывало СЭ100 (человека, мыши и мартышки) и экспрессирующие СЭ100 клеточные линии, указывая на то, что МАЬ2503 является специфичным к СЭ100. МАЬ2503 показало увеличенную аффинность в отношении СЭ100 человека и мыши по сравнению с МАЬ67. Обобщение характеристик аффинности МАЬ2503 и МАЬ67 представлено ниже в табл. 4.
Таблица 4
Аффинность МАЬ против СЭ100 к СЭ100 человека, мартышки и мыши
МаЬ Аффинность к ΟΏ100 человека (нМ)* Аффинность к СОЮО мартышки (нМ)* Аффинность к СОЮО мыши (нМ)*
67 5,1 2,7 1,3
2503 5,4 2,4 1,5
* Аффинность измеряли с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса В1АСОКЕ®.
Эти анализы демонстрируют, что МАЬ2503 является специфичным к СЭ100 и связывается с тем же эпитопом, что и МАЬ67 мыши. Было показано, что МАЬ2503 связывает СЭ100 как мыши, так и человека, таким образом, преимущество МАЬ2503 состоит в том, что его можно тестировать в отношении безопасности и эффективности у мышей, а также у человека. Более того, было показано, что МАЬ2305 связывается с СЭ100 человека, обезьяны и мыши.
Пример 6. МАЬ2503 блокирует активность СЭ100 мыши и человека ш νίΙΐΌ.
МАЬ2503 тестировали в отношении способности блокировать функцию СЭ100 с использованием анализов, описанных выше в примере 2, включая (1) проточно-цитометрический анализ блокирования и (2) анализ открепления клеток.
Специфичные к СЭ100 антитела МАЬ67 и МАЬ2503 подвергали скринингу в отношении их способности ингибировать связывание СЭ100 с плексином В1 в флуоресцентном анализе блокирования. Способ, используемый для тестирования того, блокируют ли специфичные к СЭ100 антитела связывание СЭ100 с плексином В1, показан на фиг. 1 (пример 2). Предварительная инкубация СЭ100 с МАЬ67 или МАЬ2503 приводила к более низкой флуоресценции по сравнению с СЭ100 отдельно. МАЬ2503 было способно блокировать связывание СЭ100 человека (см. фиг. 8А), мартышки (см. фиг. 8В) и мыши (см. фиг. 8С) ш υϊΙιό. Таким образом, эти результаты показали, что как МАЬ67, так и МАЬ2503, способны блокировать связывание СЭ100 человека, обезьяны и мыши с плексином В1.
Способность МАЬ против СЭ100 блокировать опосредуемое СЭ100 человека и обезьяны открепление клеток 293/плексин от покрытого фибронектином планшета определяли с использованием анализа
- 45 025245 открепления клеток, описанного в примере 2. ί'.Ό100 вызывает снижение количества клеток, прикрепленных к планшету, и, таким образом, снижение поглощения. Нейтрализация ί'.Ό100 человека и СЭ100 мартышки с помощью МАЬ2503 или МАЬ67 приводила к увеличению поглощения, как показано на фиг. 9А и 9В соответственно. МАЬ2503 и МАЬ67 также нейтрализовывали СЭ100 мыши в этом анализе (данные не представлены).
МАЬ2503 блокировало связывание СЭ100 человека, мыши и обезьяны с плексином В1 клеточной поверхности и индуцировало открепление клеток 293/плексин от покрытых фибронектином планшетов. Таким образом, эти результаты показывают, что МАЬ2503 было способно функционально нейтрализовывать СЭ100 человека, мыши и обезьяны.
Пример 7. Антитело против ί'.Ό100 ингибирует ангиогенез ίη νίνο.
ί'.Ό100 является сильной проангиогенной молекулой и активация плексина В1 через связывание ί'.Ό100 приводит к трансактивации с-Ме1 и стимулирует инвазивную способность опухолевых клеток и способствует ангиогенезу.
Для демонстрации эффекта отсутствия ί'.Ό100 на рост опухоли ίη νίνο клетки опухоли СТ26 инъецировали в мышцу конечности мышей Ва1Ь/с дикого типа или СЭ100-/- и измеряли происходящий в результате этого рост опухоли. Как показано на фиг. 10, объем опухоли у мышей СО100-/- был снижен по сравнению с мышами Ва1Ь/с дикого типа в этом исследовании. Эти результаты продемонстрировали, что клеточная линия рака толстого кишечника мыши (СТ26) имеет ухудшенный рост в среде, лишенной СП100.
Далее тестировали способность МАЬ67 снижать рост опухолевых клеток СТ26 у мышей Ва1Ь/с дикого типа. Опухолевые клетки СТ26 инъецировали в мышцы задних конечностей мышей Ва1Ь/с дикого типа (η=48) или СЭ100-/- (η=9). После инъекции мышей дикого типа разделяли на 2 группы по 24 мыши в каждой. В одной группе проводили введение начиная на 1 сутки путем внутрибрюшинной инъекции 1 мг МАЬ67, а в другой группе вводили путем внутрибрюшинной инъекции 1 мг 1дС мыши. Введение повторяли каждые 7 суток. Мышей анализировали в отношении роста опухоли. Как показано на фиг. 11, введение МАЬ67 снижало рост опухолей СТ26 у мышей Ва1Ь/с по сравнению с группой контрольного 1дС мыши.
Таким образом, эти результаты показывают, что антитело, имеющее структурные и функциональные характеристики МАЬ67, снижало рост опухоли ίη νίνο.
Пример 8. Антитело против СЭ100 ингибирует индуцируемый коллагеном артрит ίη νίνο.
МАЬ67 тестировали в отношении его способности снижать артрит в модели индуцируемого коллагеном артрита (С1А) на мышах. Модель индуцируемого коллагеном артрита (С1А) является доклинической воспалительной моделью на животных для ревматоидного артрита (КА), которую широко используют для установления патогенеза заболевания и проверки терапевтических мишеней при КА (Вгапй е1 а1., №-И. РгоЮс. 2(5): 1269-75 (2007)). Общая процедура С1А проиллюстрирована на фиг. 12 (любые модификации этой процедуры описаны ниже). В кратком изложении, артрит индуцировали на сутки 0 путем внутрикожной инъекции в хвост эмульсии, содержащей коллаген и полный адъювант Фрейнда (СРА). Затем проводили контрольное и тестируемое введение путем подкожной (8.с.) или внутрибрюшинной (ΐ.ρ.) инъекции два раза в неделю, начиная на сутки 20.
Тестируемые группы для исследования 1 описаны ниже в табл. 5.
Таблица 5
Т естируемые группы в исследовании 1 индуцируемого коллагеном артрита (С1А)
Группа# #Животных Введение Доза Сутки введения
1 10 Изотипический контрольный 1дС мыши 600 мкг внутрибрюшинно 2Х/неделя, начиная на сутки 20
2 10 МаЬ67 600 мкг внутрибрюшинно 2Х/неделя, начиная на сутки 20
3 10 этанерцепт 600 мкг подкожно 2Х/неделя, начиная на сутки 20
Тяжесть заболевания оценивали с использованием шкалы, представленной в табл. 6. Показатель присваивали каждой лапе мыши (микроскопические признаки артрита оценивали 3 раза в неделю). Артритический индекс (А1) вычисляли путем суммирования показателей для отдельных лап (максимальный А1=16). Как правило, первые признаки артрита появляются в модели С1А через 21-28 суток после иммунизации.
- 46 025245
Таблица 6
Таблица оценки С1А
Показатель Описание
0 нет видимых признаков артрита
1 отек и/или эритема на 1 пальце
2 отек и/или эритема на 2 пальцах
3 отек и/или эритема более чем 2 пальцев
4 тяжелый артрит всей лапы и пальцев
Результаты исследования 1 показали снижение развития артрита в модели С1А в группах, в которых вводили 600 мкг МАЬ67. Артритический индекс (А1) у мышей, которым вводили 600 мкг МАЬ67, сравнивали с А1 у мышей, которым вводили 600 мкг отрицательного контроля (1дО1) и 600 мкг положительного контроля (этанерцепт), где введение начинали на сутки 20. Результаты представлены на фиг. 13А. Эти результаты показывают, что МАЬ67 было настолько же хорошим или лучшим, чем этанерцепт, в отношении развития артрита в модели С1А.
Второе исследование (исследование 2) включало введение МАЬ67 и положительного контроля, где введение было отсрочено, т.е. его начинали, когда артритический индекс составлял >3. Тестируемые группы для исследования 2 описаны ниже в табл. 7.
Таблица 7
Т естируемые группы в исследовании 2 индуцируемого коллагеном артрита (С1А)
Группа #Животных Введение Доза Сутки введения
1 10 Изотипический контрольный 1д6 мыши 600 мкг внутрибрю- шинно 2Х/неделя, начиная на сутки 20
2 10 МаЬ67 600 мкг внутрибрю- шинно 2Х/неделя, начиная на сутки 20
3 10 МаЬб7 600 мкг внутрибрю- шинно 2Х/неделя, начиная, когда артритический индекс составлял 23
4 10 этанерцепт 600 мкг подкожно 2Х/неделя, начиная, когда артритический индекс составлял 23
Для исследования 2 результаты А1 для введения МАЬ67 (введение начинали на сутки 20 или когда А1 составлял >3) сравнивали с введением отрицательного контроля (1дО1) и положительного контроля (этанерцепт; введение начинали, когда А1 составлял >3). Результаты представлены на фиг. 13В. Эти результаты показывают, что МАЬ67 было настолько же хорошим или лучшим, чем этанерцепт, в отношении снижения развития артрита в модели С1А, когда введение начинали на сутки 20 или отсрочивали до А1 >3. Таким образом, было показано, что МАЬ67 препятствует развитию артрита, а также осуществляет лечение артрита при введении после того, как А1 составлял >3, в модели С1А.
Пример 9. Антитело против СЭ100 блокирует ответы первичных В-клеток и В-клеток памяти ш νίуо.
Мышей Ва1Ь/с и СЭ100-/- иммунизировали (4-гидрокси-3-нитрофенил)ацетил-конъюгированным гамма-глобулином курицы, преципитированным с квасцами (гидроксид алюминия-магния) (№-СОО), а затем вводили контрольный 1дО1 (Ва1Ь/с и СЭ100-/-) или МАЬ67 (только Ва1Ь/с). Тестируемые группы представлены ниже в табл. 8.
- 47 025245
Таблица 8
Группы для тестирования ответа первичных В-клеток и В-клеток памяти
Группа Линия № животных Иммуни- зация Введение АЬ Доза Инъекция АЬ
1 союо -/- 6 Ν/Α Ν/Α Ν/Α Ν/Α
2 ΟΌΙΟΟ -/- 6 ΝΡ-сес/ квасцы Контрольный 1дб1 Ν/Α Сутки (-/), 0, 7, 14, 21, 28
3 Ва1Ь/с 6 Ν/Α Ν/Α Ν/Α Ν/Α
4 Ва1Ь/с 6 ЫР-ССС/ квасцы Контрольный 1д61 600 мкг Сутки (-7), 0, 7, 14, 21, 28
5 Ва1Ь/с 6 ЫР-ССС/ квасцы МаЬ 67 600 мкг Сутки (-7), 0, 7, 14, 21, 28
Мышам проводили введение, как описано выше в табл. 8, начиная на сутки -7, и их иммунизировали МР-СОО на сутки 0. Трех мышей на группу умерщвляли на сутки 10 и селезенку и лимфатические узлы анализировали в отношении В-клеток герминативного центра (ОС) (В220+СО381о^РНА+). Каждую селезенку анализировали отдельно и лимфатические узлы от всех трех мышей объединяли в один образец для анализа. Введение остальным мышам продолжали, как показано в табл. 8. На 21 сутки мышам проводили вспомогательную инъекцию того же МР-СОО в квасцах. На сутки 31 остальных мышей умерщвляли и селезенку и лимфатические узлы анализировали в отношении В-клеток герминативного центра (ОС) (В220+СО381о^РНА+). Каждую селезенку анализировали отдельно и лимфатические узлы от всех трех мышей объединяли в один образец для анализа. Результаты на фиг. 14А и 14В показывают, что введение 600 мкг МАЬ67 снижало количество В-клеток ОС в селезенке (8Р) и лимфатических узлах (ЬК) после первичной иммунизации (14А) и вторичной иммунизации (14В) соответственно. Таким образом, было показано, что МАЬ67 блокирует ответы первичных В-клеток и В-клеток памяти ίη νί\Ό.
Пример 10. Антитело против СЭ100 замедляет рост опухоли ίη νί\Ό.
Снижение роста опухоли с помощью МАЬ67 тестировали в моделях ксенотрансплантатов опухолей СТ26 и ВСА34. Для этих исследований опухолевые клетки инъецировали внутримышечно в конечности мышей Ва1Ь/с. Начиная на 1 сутки после трансплантации, мышам проводили внутрибрюшинную (ί.ρ.) инъекцию 1Х раз в неделю 1 мг антитела МАЬ67 или отрицательного контроля (1дО) в объеме 0,2 мл. Изменение объема опухоли (мм3) и/или объема бедра (мм3) измеряли для определения показателей роста опухоли. Скорость роста опухоли для мышей, которым вводили МАЬ67, по сравнению со скоростью роста опухоли для мышей, которым вводили отрицательный контроль, использовали для вычисления задержки роста опухоли (ΤΟΌ).
Также тестировали способность опухолевых клеток ВСА34 и ЕМТ6 расти в среде, лишенной СЭ100. Для этих исследований клетки опухоли инъецировали в конечности мышей Ва1Ь/с и СЭ100-/(8ЕМА4Э-/-) и измеряли рост опухоли.
Клетки опухоли толстого кишечника СТ26.
Клетки опухоли СТ26 происходят из опухолей толстого кишечника мыши и экспрессируют очень низкие уровни СЭ100. 50000 клеток опухоли толстого кишечника СТ26 инъецировали подкожно мышам Ва1Ь/с дикого типа (20 мышей/группа введения). Изменение объема опухоли (мм3) измеряли у мышей, которым вводили 1 мг МАЬ67 раз в неделю, начиная на 1 сутки после трансплантации, по сравнению с мышами, которым инъецировали контрольный 1§О. Результаты (средний объем опухоли с течением времени) представлены на фиг. 15. ΤΟΌ для мышей, которым вводили МАЬ67, составил 17% (р=0,0317). Эти результаты показывают, что рост опухоли СТ26 был снижен у мышей, которым вводили МАЬ67.
Фибробластные опухолевые клетки ВСА34.
Опухолевые клетки ВСА34 экспрессируют низкие уровни СЭ100. Прежде всего 50000 клеток опухоли ВСА34 подкожно инъецировали в область живота мышей Ва1Ь/с дикого типа или мышей СЭ100-/(8ЕМА4Э-/-). У этих мышей измеряли изменение объема опухоли (мм3), и результаты представлены на фиг. 16А. Эти результаты показали, что клетки опухоли ВСА34 имели сниженный рост в среде, лишенной СЭ100.
В отдельном эксперименте 50000 клеток опухоли ВСА34 инъецировали в мышцы конечности мышей Ва1Ь/с дикого типа (21 мышь/группа введения). Изменение объема опухоли (мм3) измеряли у мы- 48 025245 шей, которым вводили 1 мг МАЬ67 раз в неделю, начиная на сутки 1 после трансплантации, по сравнению с мышами, которым инъецировали контрольный 1дС. Результаты (средний объем бедра с течением времени) представлены на фиг. 16В. ТСЭ для мышей, которым вводили МАЬ67, составил 18% (р=0,009). Эти результаты показывают, что рост опухоли ВСА34 был снижен у мышей, которым вводили МАЬ67.
Клетки карциномы молочной железы ЕМТ6.
Клетки опухоли ЕМТ6 происходят из карцином молочной железы мыши и экспрессируют умеренные уровни СЭ100. 50000 клеток опухоли ЕМТ6 инъецировали в мышцы конечностей мышей Ва1Ь/с дикого типа или мышей ί'.Ό100-/- (8ЕМА4П-/-). У этих мышей измеряли изменение объема опухоли (мм3) и результаты представлены на фиг. 17. Изменение объема опухоли (мм3) представлено для мышей Ва1Ь/с дикого типа и мышей СП100-/-(8ЕМА40-/-). Эти результаты показали, что клетки опухоли ЕМТ6 имели сниженный рост в среде, лишенной ί'.Ό100.
Пример 11. Антитело против ί'.Ό100 замедляет рост опухоли человека ш У1уо.
Снижение роста опухоли посредством МАЬ2503 тестировали в моделях ксенотрансплантата опухоли человека НШ2 и Н№> Н1Р1а тОЭЭ. НШ2 и Н№> Н1Р1а тОЭЭ происходят из опухолей головы и шеи и оба ксенотрансплантата экспрессируют высокие уровни Н1Р1а и СЭ100. Модель ксенотрасплантата НЖ> Н1Р-1а тОЭЭ описана в 8ип е! а1., 1. Вю1 СИет 284(46):32066-74 (2009). Для этих экспериментов 2 опухоли/мышь подкожно инъецировали бестимусным мышам пибе (10 мышей/группа введения). Начиная на 1 сутки после трансплантации мышам проводили внутрибрюшинную инъекцию 1Х в неделю 1 мг антитела МАЬ2503 или отрицательного контроля (1дС4) в объеме 0,2 мл. Измеряли изменение объема опухоли (мм3). Скорость роста опухоли у мышей с НК6 Н1Р-1а тОЭЭ, которым вводили МАЬ2503, по сравнению со скоростью роста у мышей, которым вводили отрицательный контроль, использовали для вычисления задержки роста опухоли (ТСЭ).
Результатом этого эксперимента был ТСЭ. Результаты роста опухоли для введения МАЬ2503 в моделях ксенотрансплантатов НШ2 и Н№> Н1Р-1а тОЭЭ представлены на фиг. 18 и 19А соответственно. ТСЭ у мышей с ксенотрансплантатом Н№> Н1Р-1а тОЭЭ, которым вводили МАЬ2503, составил 13% (р=0,0008). Более того, изображения типичных опухолей от мышей с ксенотрансплантатом Н\6 Н1Р-1а тОЭЭ, которым вводили контрольный 1дС4 и МАЬ2505, представлены на фиг. 19В. Эти результаты показывают, что введение МАЬ2503 снижало рост опухоли головы и шеи ш У1уо.
Пример 12. Стабильная клеточная линия СНО-8 для экспрессии высоких титров МАЬ2503.
Была получена стабильная клеточная линия СНО-8 для экспрессии высоких титров МАЬ2503. Комплементарную ДНК (кДНК) для тяжелой и легкой цепей гуманизированного моноклонального антитела 2503 против ί'.Ό100 использовали для получения нескольких экспрессирующих клеточных линий яичника китайского хомячка (СНО-8), сконструированных с использованием технологии СРЕх™ (Са!а1еп! Рйагта 8о1ийопз, Маб1зоп, ^зсопзш) и клеток-предшественников СНО-8 (см. В1еск е! а1., Ап А1!егпайуе Ме!Иоб Гог !Ие Кар1б Сепегайоп оГ 8!аЬ1е, Шдй-Ехргеззшд Маттайап Се11 Ппез, ВюРгосеззшд 1оигпа1 (сентябрь/октябрь 2005 года)).
После клонирования отдельных клеток отбирали один экспрессирующий клон на основе роста в культуре и продукции антител, и получали банк для исследования экспрессирующих клеток во флаконах. Экспрессированное антитело, продуцированное этим клоном, охарактеризовывали в отношении эффективности и специфичности с использованием функциональных анализов ш уйго и ш У1уо (например, анализов блокирования в потоке и открепления). Затем клетки из выбранного клона СНО для экспрессии размножали в культуре и получали и замораживали второй (исходная культура для посева) банк. Затем клетки из одного флакона исходной культуры для посева размножали в культуре и использовали для продукции сСМР в банке главных клеток (МСВ).
Пример 13. Дозировка антитела против СЭ100 и исследования РК у крысы и яванского макака.
Проводили анализ насыщения с однократной внутривенной инъекцией МАЬ 2503 у крысы и яванского макака.
Исследование у крыс: 36 крысам 8ргадие-ОаМеу (3/пол/группа) проводили однократную внутривенную инъекцию МАЬ2503 в диапазоне от 0,01 до 100 мг/кг. Анализ насыщения на основе проточной цитометрии проводили на лизированной цельной крови в различные моменты времени для определения процента клеточной мишени (8ЕМА4П), которая была насыщена МАЬ2503. Существовала хорошая корреляция данных с количеством МАЬ, выявленным в сыворотке, что указывало на то, что насыщение зависит от количества свободного лекарственного средства в сыворотке, и что клетки были насыщенными, когда в сыворотке выявляли приблизительно от 1 до 5 мкг/мл свободного лекарственного средства. Процентное насыщение 8ЕМА4О в дозах МАЬ2503 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 100 мг/кг у самцов и самок крыс представлено на фиг. 20А и 20В соответственно.
Исследование у приматов: 28 яванским макакам (2/пол/группа; 4/пол/контрольная группа) проводили однократную внутривенную инъекцию МАЬ2503 в диапазоне от 0,01 до 100 мг/кг. Анализ насыщения на основе проточной цитометрии проводили на лизированной цельной крови в различные моменты времени для определения процента клеточной мишени (8ЕМΛ4^), которая была насыщена МАЬ2503. Существовала хорошая корреляция данных с количеством МАЬ, выявленным в сыворотке, что указывало на то, что насыщение зависит от количества свободного лекарственного средства в сыворотке, и что
- 49 025245 клетки были насыщенными, когда в сыворотке выявляли приблизительно от 1 до 5 мкг/мл свободного лекарственного средства. Процентное насыщение 8ΕΜΆ4Ό в дозах МАЬ2503 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 100 мг/кг у самцов и самок крыс (комбинированное) представлено на фиг. 21. Результаты насыщения у крыс и приматов были высокосходными.
Фармакокинетические (РК) результаты, включая биологическое время полужизни (часы (сутки)), концентрацию антитела в плазме в нулевой момент времени после инъекции (С0), и площадь под кривой концентрации в плазме с нулевого момента времени до момента времени ! (АИС0-!) для однократных внутривенных инъекций 0,01, 0,1, 1,0, 10 или 100 мг/кг МАЬ2503 у крысы и примата представлены в табл. 9.
Таблица 9
РК-величины для антитела 2503 у крысы и примата (яванский макак)
Было выявлено, что время полужизни фазы выведения МАЬ2503 является сходным для крысы и яванского макака и оно находилось в диапазоне от приблизительно 6 ч до приблизительно 10 суток и было дозозависимым. Результаты как насыщения, так и РК, оказались дозозависимыми и указывают на необыкновенно сходный профиль между крысой и яванским макаком. Более того, ни у крысы, ни у яванского макака, не наблюдали существенной токсичности для МАЬ2503 в дозах от 0,01 до 100 мг/кг.
Представленное выше описание конкретных вариантов осуществления настолько полностью раскрывает общий характер изобретения, что возможно, применяя знания, относящиеся к данной области, без излишнего экспериментирования легко модифицировать и/или адаптировать такие конкретные варианты осуществления для различных применений, без отклонения от общей идеи настоящего изобретения. Таким образом, подразумевают, что такие адаптации и модификации находятся в пределах значения и диапазона эквивалентов описанных вариантов осуществления, исходя из указаний и руководства, представленных в настоящем документе. Следует понимать, что фразеология и терминология в настоящем документе представлены для целей описания, а не ограничения, так что специалисту в данной области терминологию или фразеологию настоящего описания следует интерпретировать ввиду указаний и руководства.
Широта и объем настоящего изобретения не ограничиваются каким-либо из описанных выше иллюстративных вариантов осуществления, однако они должны определяться только в соответствии с представленными ниже пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.
- 50 025245
Список последовательностей <110> διτιίΗΗ, ЕгпезН 5.
ПзНег, Теггепсе Ьее
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ СЫ00 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 1843.060РС02/ЕПН/ВЫС
<14 0> Еще не присвоен
<141> Прилагается
<150> 61/325,213
<151> 2010-04-16
<150> 61/176,826
<151> 2009-05-08
<160> 40
<170> РаНепН1п νετείοη 3.3
<210> 1
<211> 862
<212> Белок
<213> Ното зарнепз
<400> 1
МеН Агд МеН Суз ТНг Рго Не Агд С1у Ьеи Ьеи МеН А1а Ьеи А1а Уа1
10 15
МеН РНе Е1у ТЬг А1а МеН А1а РНе А1а Рго Не Рго Агд 11е ТНг Тгр 20 25 30
61и Н1з Агд С1и \7а1 Шз Ней Уа1 С1п РНе Шз С1и Рго Азр Не Туг 35 40 45
Азп Туг Зег А1а Ьеи Ней Ней Зег С1и Азр Ьуз Азр ТНг Ьеи Туг 11е 50 55 60
61у А1а Агд С1и А1а Уа1 РЬе А1а Уа1 Азп А1а Ьеи Αεη 11е Зег С1и 65 70 75 30
Ьув С1п Ηίε С1и Уа1 Туг Тгр Ьуз Уа1 Зег 61и Азр Ьуз Ьуз А1а Ьуз 85 90 95
Суз А1а С1и Ьуз С1у Ьуз Зег Ьуз Е1п ТНг С1и Суз Ьеи Азп Туг Не 100 105 110
Агд Уа1 Ьеи С1п Рго Ьеи Зег А1а ТНг Зег Ьеи Туг Уа1 Суз С1у ТНг
- 51 025245
- 52 025245
- 53 025245
595 600
605
Ьеи Ьеи Не РЬе Азп Ьеи Зег СЬи 610 615
СЬу Азр Зег СЬу УаЬ Туг СЬп Суз 620
Ьеи Зег СЬи СЬи Агд УаЬ Ьуз Азп 625 630
Ьуз ТНг УаЬ РЬе СЬп УаЬ УаЬ АЬа 635 640
Ьуз НЬз УаЬ Ьеи СЬи УаЬ Ьуз УаЬ
645
УаЬ Рго Ьуз Рго УаЬ УаЬ АЬа Рго 650 655
ТЬг Ьеи Зег УаЬ УаЬ СЬп ТНг СЬи 660
СЬу Зег Агд 11е АЬа ТЬг Ьуз УаЬ 665 670
Ьеи УаЬ АЬа Зег ТЬг СЬп СЬу Зег 675 680
Зег Рго Рго ТЬг Рго АЬа УаЬ СЬп 685
АЬа ТЬг Зег Зег СЬу АЬа Не ТЬг 690 695
Ьеи Рго Рго Ьуз Рго АЬа Рго ТЬг 700
СЬу ТЬг Зег Суз СЬи Рго Ьуз Не 705 710
УаЬ Ые Азп ТЬг УаЬ Рго СЬп Ьеи 715 720
НЬз Зег СЬи Ьуз ТЬг МеЬ Туг Ьеи 725
Ьуз Зег Зег Азр Азп Агд Ьеи Ьеи 730 735
Меб Зег Ьеи РЬе Ьеи РЬе РЬе РЬе 740
УаЬ Ьеи РЬе Ьеи Суз Ьеи РЬе РЬе 745 750
Туг Азп Суз Туг Ьуз СЬу Туг Ьеи 755 760
Рго Агд СЬп Суз Ьеи Ьуз РЬе Агд 765
Зег АЬа Ьеи Ьеи 11е СЬу Ьуз Ьуз 770 775
Ьуз Рго Ьуз Зег Азр РЬе Суз Азр 780
Агд СЬи СЬп Зег Ьеи Ьуз СЬи ТЬг 785 790
Ьеи УаЬ СЬи Рго СЬу Зег РЬе Зег 795 800
СЬп СЬп Азп СЬу СЬи НЬз Рго Ьуз 805
Рго АЬа Ьеи Азр ТЬг СЬу Туг СЬи 810 815
ТЬг СЬи СЬп Азр ТЬг 11е ТЬг Зег 820
Ьуз УаЬ Рго ТЬг Азр Агд С1и Азр 825 830
Зег СЬп Агд Ые Азр Азр Ьеи Зег
АЬа Агд Азр Ьуз Рго РЬе Азр УаЬ
- 54 025245
835 840 845
Ъуз Суз С1и Ъеи Ъуз РЬе А1а 850 855 <210> 2 <211> 861 <212> Белок <213> МиШпе эр. <400> 2 Азр Зег Азр А1а Азр С1у Азр 860
НеЛ Агд 1 Мет. Суз А1а Рго Уа1 5 Агд С1у Ъеи РЬе Ъеи А1а Ъеи Уа1 Уа1 10 15
Уа1 Ъеи Агд ТЬг А1а Уа1 А1а 20 РЬе А1а 25 Рго Уа1 Рго Агд Ъеи ТЬг Тгр 30
61и Н1з 61у С1и Уа1 С1у Ъеи 35 Уа1 С1п 40 РЬе Шз Ъуз Рго 61у Не РЬе 45
Азп Туг 50 Зег А1а Ъеи Ъеи МеЬ 55 Зег С1и Азр Ъуз Азр ТЬг Ъеи Туг Уа1 60
С1у А1а 65 Агд С1и А1а Уа1 РЬе 70 А1а Уа1 Азп А1а Ъеи Азп 11е Зег С1и 75 80
Ъуз С1п Н1з С1и Уа1 Туг Тгр 85 Ъуз Уа1 Зег С1и Азр Ъуз Ъуз Зег Ъуз ЭО 95
Суз А1а С1и Ъуз С1у Ъуз Зег 100 Ъуз С1п 105 ТЬг С1и Суз Ъеи Азп Туг 11е 110
Агд Уа1 Ъеи С1п Рго Ъеи Зег 115 Зег ТЬг 120 Зег Ъеи Туг Уа1 Суз С1у ТЬг 125
Азп А1а 130 РЬе С1п Рго ТЬг Суз 135 Азр Шз Ъеи Азп Ъеи ТЬг Зег РЬе Ъуз 140
РЬе Ъеи 145 61у Ъуз Зег С1и Азр 150 С1у Ъуз 61у Агд Суз Рго РНе Азр Рго 155 160
А1а Н1з Зег Туг ТЬг Зег Уа1 165 МеЬ Уа1 61у С1у 61и Ъеи Туг Зег 61у 170 175
ТЬг Зег Туг Азп РЬе Ъеи С1у 180 Зег С1и 185 Рго 11е 11е Зег Агд Азп Зег 190
- 55 025245
- 56 025245
СЬу ТНг РЬе Туг Азр УаЬ МеЬ РЬе Ые Зег ТЬг Азр Агд СЬу АЬа Ьеи 435 440 445
НЬз Ьуз АЬа УаЬ ЬЬе Ьеи ТЬг Ьуз СЬи УаЬ НЬз УаЬ 11е СЬи СЬи ТЬг 450 455 460
СЬп Ьеи РЬе Агд Азр Зег СЬи Рго УаЬ Ьеи ТЬг Ьеи Ьеи Ьеи Зег Зег 465 470 475 480
Ьуз Ьуз СЬу Агд Ьуз РЬе УаЬ Туг АЬа СЬу Зег Азп Зег СЬу УаЬ УаЬ 485 490 495
СЬп АЬа Рго Ьеи АЬа РЬе Суз СЬи Ьуз НЬз СЬу Зег Суз СЬи Азр Суз 500 505 510
УаЬ Ьеи АЬа Агд Азр Рго Туг Суз АЬа Тгр Зег Рго АЬа Ые Ьуз АЬа 515 520 525
Суз УаЬ ТЬг Ьеи НЬз СЬп СЬи СЬи АЬа Зег Зег Агд СЬу Тгр Ые СЬп 530 535 540
Азр Меб Зег СЬу Азр ТНг Зег Зег Суз Ьеи Азр Ьуз Зег Ьуз СЬи Зег 545 550 555 560
РЬе Азп СЬп НЬз РЬе РЬе Ьуз НЬз СЬу СЬу ТЬг АЬа СЬи Ьеи Ьуз Суз 565 570 575
РЬе СЬп Ьуз Зег Азп Ьеи АЬа Агд УаЬ УаЬ Тгр Ьуз РЬе СЬп Азп СЬу 580 585 590
СЬи Ьеи Ьуз АЬа АЬа Зег Рго Ьуз Туг СЬу РЬе УаЬ СЬу Агд Ьуз НЬз 595 600 605
Ьеи Ьеи ЬЬе РЬе Азп Ьеи Зег Азр СЬу Азр Зег СЬу УаЬ Туг СЬп Суз 610 615 620
Ьеи Зег СЬи СЬи Агд УаЬ Агд Азп Ьуз ТЬг УаЬ Зег СЬп Ьеи Ьеи АЬа 625 630 635 640
Ьуз НЬз УаЬ Ьеи СЬи УаЬ Ьуз МеЬ УаЬ Рго Агд ТЬг Рго Рго Зег Рго 645 650 655
ТЬг Зег СЬи Азр АЬа СЬп ТЬг 660
СЬи СЬу 665
Зег Ьуз Ые ТЬг Зег Ьуз Меб 670
- 57 025245
Рго УаЬ АЬа 675 Зег ТЬг СЬп СЬу Зег 680 Зег Рго Рго ТЬг Рго 685 АЬа Ьеи Тгр
АЬа ТЬг Зег Рго Агд АЬа АЬа ТЬг Ьеи Рго Рго Ьуз Зег Зег Зег СЬу
690 695 700
ТЬг Зег Суз СЬи Рго Ьуз МеЬ УаЬ Т1е Азп ТЬг УаЬ Рго СЬп Ьеи НЬз
705 710 715 720
Зег СЬи Ьув ТЬг УаЬ Туг Ьеи Ьуз Зег Зег Авр Азп Агд Ьеи Ьеи МеЬ
725 730 735
Зег Ьеи Ьеи Ьеи РЬе Не РЬе УаЬ Ьеи РЬе Ьеи Суз Ьеи РЬе Зег Туг
740 745 750
Азп Суз Туг Ьуз СЬу Туг Ьеи Рго СЬу СЬп Суз Ьеи Ьуз РЬе Агд Зег
755 760 765
АЬа Ьеи Ьеи Ьеи СЬу Ьуз Ьуз ТЬг Рго Ьуз Зег Азр РЬе Зег Азр Ьеи
770 775 780
СЬи СЬп Зег УаЬ Ьуз СЬи ТЬг Ьеи УаЬ СЬи Рго СЬу Зег РЬе Зег СЬп
785 790 795 800
СЬп Азп СЬу Азр Ηΐε Рго Ьуз Рго АЬа Ьеи Азр ТЬг СЬу Туг СЬи ТЬг
805 810 815
СЬи СЬп Авр ТЬг Ые ТНг Зег Ьуз УаЬ Рго ТЬг Азр Агд СЬи Азр Зег
82 0 825 830
СЬп Агд Не Азр СЬи Ьеи Зег А1а Агд Азр Ьув Рго РЬе Азр УаЬ Ьуз
835 840 845
Сув С1и Ьеи Ьуз РЬе АЬа Авр Зег Азр А1а Авр СЬу Авр
850 855 860
<210> 3
<2ЬЬ> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Полинуклеотид УН- -СОБ.1 антитела против СО100
<400> 3 ддсЬасадсЬ ЬсадсдасЬа сЬасаЬдсас 30
- 58 025245 <210> 4 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид УН-СЬК2 антитела против СР100 <400> 4 садаЬЬааЬс сЬассасЬдд сддсдсЬадс Ьасаассада адЬЬсааддд с 51 <210> 5 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид УН-СБЕЗ антитела против СБ100 <400> 5 ьа^Ьасьасд дсадасасН сдаЬдЬс 27 <210> 6 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид УН-СРК1 антитела против СЫ00 <400> 6
СЬу Туг Зег РЬе Зег Азр Туг Туг МеЬ Н1з 15 10 <210> 7 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид УН-СРР2 антитела против СЫ00 <400> 7
С1п Не Азп Рго ТЬг ТЬг 61у 61у АЬа Зег Туг Азп 61п Ьуз РЬе Ьуз 15 10 15
СЬу <210> 8 <211> 9
- 59 025245 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид УН-СБКЗ антитела против СЭ100 <400> 8
Туг Туг Туг С1у Агд Ηΐ$ РЬе Азр Уа1
1 5
<210> 9 <211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид УН 2503 против СЫ00
<400> 9
Е1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а С1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у Зег
1 5 10 15
Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг Зег РЬе Зег Азр Туг
20 25 30
Туг НеЬ НЬз Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеЬ
35 40 45
С1у С1п Не Азп Рго ТЬг ТЬг С1у С1у А1а Зег Туг Азп 61п Ьуз РЬе
50 55 60
Ьув С1у Ьуз А1а ТЬг 11е ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег ТЬг Зег ТЬг А1а Туг
65 70 75 80
МеЬ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Туг Туг Туг С1у Агд Шз РЬе Азр Уа1 Тгр С1у 61п 61у ТЬг
100 105 110
ТНг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115
<210> 10
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид УН 67 против СЫ00
<400> 10
О1п УаЬ СЬп Пей СЬп СЬп 1 5 Зег С1у Рго С1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у АЬа 10 15
Зег УаЬ Ьуз Не Зег Суз 20 Ьуз АЬа Зег СЬу Туг Зег РЬе Зег Азр Туг 25 30
Туг МеЬ Шз Тгр Уа1 Ьуз 35 СЬп Зег Рго СЬи Азп Зег Ьеи СЬи Тгр 1Ье 40 45
СЬу С1п 11е Азп Рго ТЬг 50 ТЬг 61у СЬу АЬа Зег Туг Азп СЬп Ьуз РЬе 55 60
Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи 65 70 ТЬг УаЬ Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг АЬа Туг 75 80
МеЬ С1п Ьеи Ьуз Зег Ьеи 85 ТЬг Зег СЬи С1и Зег АЬа УаЬ Туг Туг Суз 90 95
ТЬг Агд Туг Туг Туг С1у 100 Агд Н1з РЬе Азр УаЬ Тгр СЬу С1п СЬу ТЬг 105 110
ТНг ν^Ι ТНг 7а1 5ег Зег 115 <210> 11 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид УЬ-СОК1 антитела против СБЮО <400> 11 ааддссадсс ааадсдНдда ЫгаГдаНддс даНадсНаГа Ндаас 45 <2Ю> 12 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид νΐι-0ϋΚ.2 антитела против СБ100 <400> 12 дс1;дсаНсса а^сНддааад с 21
- 61 025245
<210> <21Ь> <2Ь2> <213> 13 27 ДНК Искусственная
<220> <223> Полинуклеотид УЪ-СБЕЗ антитела против СБ100
<400> 13
садсааадса аЬдаддаЬсс сЬасасс 27
<210> <211> <212> <213> 14 15 Белок Искусственная
<220> <223> Полипептид УЬ-СБЕ1 антитела против СО100
<400> 14
Ьу® АЬа Зег СЬп Зег УаЬ Азр Туг Азр СЬу Азр Зег Туг МеЬ Азп
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 15 7 Белок Искусственная
<220> <223> Полипептид УБ-СБЕ2 антитела против СБ100
<400> 15
АЬа АЬа Зег Азп Ьеи СЬи Зег 1 5
<210> <211> <212> <213> 16 9 Белок Искусственная
<220> <223> Полипептид УЬ-СРКЗ антитела против СРЬОО
<400> 16
СЬп СЬп Зег Азп СЬи Азр Рго Туг ТЬг
1 5
<210> <211> <212> <213> 17 111 Белок Искусственная
<220>
- 62 025245 <223> Полипептид УЬ-2503 против СЫОО <400> 17
Азр Ые УаЬ Меб ТЬг СЬп Зег Рго Азр Зег Ьеи АЬа УаЬ Зег Ьеи СЬу 15 10 15
СЬи Агд АЬа ТНг Ые Азп Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Зег УаЬ Азр Туг Азр 20 25 30
СЬу Азр Зег Туг Меб Азп Тгр Туг СЬп С1п Ьуз Рго СЬу СЬп Рго Рго 35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Ые Туг АЬа АЬа Зег Азп Ьеи СЬи Зег СЬу Уа1 Рго Азр 50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Ые Зег 65 70 75 80
Зег Ьеи СЬп АЬа СЬи Азр УаЬ АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп Зег Азп 85 90 95
СЬи Азр Рго Туг ТНг РНе СЬу СЬп СЬу ТНг Ьуз Ьеи СЬи Ые Ьуз 100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид УЬ-67 против СО100
<400> 18
Азр Не νβΐ Ме1: Тпг С1п Зег Рго А1а Зег Ьеи АЬа УаЬ Зег Ьеи б1у
СЬп Агд АЬа ТНг Ые Зег Суз Ьуз АЬа Зег СЬп Зег УаЬ Азр Туг Азр 20 25 30
СЬу Азр Зег Туг Меб Азп Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп Рго Рго 35 40 45
Ьуз Ьеи Ьеи Ые Туг АЬа АЬа Зег Азп Ьеи СЬи Зег СЬу Ые Рго АЬа 50 55 60
Агд РЬе Зег С1у Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Азп Ые Н1з 65 70 75 80
- 63 025245
Рго Уа1 С1и С?1и С1и Азр А1а А1а ТЬг Туг 90 Туг Суз С1п С1п Зег Азп 95
85
С1и Аэр Рго Туг ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз
100 105 110
<2Ю> 19
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Полинуклеотид νΗ 2503 против союо
<400> 19
саддбдсадс СддЗдсадад сддсдсЗдад дбдаадаадс сбддсадсад сдбдааддбс 60
^ссбдсаадд сбадсддсба садсббсадс дас£ас£аса £дсасИддд£ дадасаддсс 120
ссЬддссаад дссбддадЬд даЬдддссад аЬЬаабссЬа ссасЬддсдд сдсЬадсЬас 180
аассадаадЪ Ъсаадддсаа ддссассаМ; ассд^ддаса ааадсассад сасадсс^ас 240
абддадсОда дсадссбдад аадсдаддас ассдссдбдЬ аб'ОасбдЬдс садабаббас 300
Фасддсадас асФФсдаЬдЬ сФддддссаа ддсассасдд ЪсассдбсФс ЪЬса 354
<210> 20 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид νΗ 67 против СР100 <400> 20
саддбссадс СдсадсадЬс ДддассЗдад сбддбдаадс сбддддсЫзс адбдаадаба 60
^ссЬдсаадд с£Лс1;ддТЛа с7саЫ;сад1; дас^ас^аса бдсасЪддд!: даадсааадб 120
ссбдааааба дбсЗЗдадЬд даббддасад аб'ОааЗссба ссасбддддд бдсбадсбас 180
аассадаадИ Исаадддсаа ддссасаМза асИд^адаЪа аа£сс1.ссад сасадсс^ас 240
абдсадс1:са ададссбдас а£с1.даадад бс^дсадбсб а1:1:ас1.дбас аада1:а££ас 300
басддЬадас асббсдаЬдЬ сбддддссаа дддассасдд ЬсассдЬЬбс сЬса 354
<210> 21 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
- 64 025245 <223> Полинуклеотид VI, 2503 против СР100 <400> 21
дасаЕсдЕда Едасссадад сссадасадс сЕддсЕдЕда дссЕдддсда дадддссасс 60
аЕсаасЕдса аддссадсса аадсдЕддаЕ ЕаЕдаЕддсд аЕадсЕаЕаЕ даасЕддЕас 120
садсадааас саддссадсс ЕссЕаадсЕд сЕдаЕЕЕасд сЕдсаЕссаа ЕсЕддааадс 180
ддсдЕдссЕд асадаЕЕсад сддсадсддс адсддсасад аЕЕЕсасЕсЕ дассаЕсадс 240
адссЕдсадд сЕдаадаЕдЕ ддсадЕдЕаЕ ЕасЕдЕсадс ааадсааЕда ддаЕсссЕас 300
ассЕЕсддсс аадддассаа дсЕсдадаЕс ааа 333
<210> 22 <211> 333 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид VI, 67 против СОЮО <400> 22
дасаЕЕдЕда ЕдасссадЕс ЕссадсЕЕсЕ ЕЕддсЕдЕдЕ сНсНадддса дадддссасс 60
аЕсЕссЕдса аддссадсса аадЕдЕЕдаЕ ЕаЕдаЕддЕд аНадННаНаН даасНддНао 120
саасадааас саддасадсс асссааасЕс сЕсаЕсЕаЕд сНдсаНссаа НсНадааНсН 180
дддаЕсссад ссаддЕЕЕад ЕддсадЕддд ЕсЕдддасад асННоасссН саасаНссаН 240
ссЕдЕддадд аддаддаЕдс ЕдсаассЕаЕ ЕасЕдЕсадс ааадНааНда ддаНссдНас 300
асдЕЕсддад дддддассаа дсЕсдадаЕс ааа 333
<210> 23 <211> 2586 <212> ДНК <213> Ното зараепз <400> 23
аЕдаддаЕдЕ дсасссссаЕ ЕадддддсЕд сЕсаЕддссс ЕЕдсадЕдаЕ дЕЕЕдддаса 60
дсдаЕддсаЕ ЕЕдсасссаЕ ассссддаЕс ассЕдддадс асадададдЕ дсассЕддЕд 120
садЕЕЕсаЕд адссадасаЕ сЕасаасЕас ЕсадссЕЕдс ЕдсЕдадсда ддасааддас 180
ассЕЕдЕаса ЕаддЕдсссд ддаддсддЕс ЕЕсдсЕдЕда асдсасЕсаа саЕсЕссдад 240
аадсадсаЕд аддЕдЕаЕЕд дааддЕсЕса даадасаааа аадсааааЕд Едсадаааад 300
дддаааЕсаа аасадасада дЕдссЕсаас ЕасаЕссддд ЕдсЕдсадсс асЕсадсдсс 360
асЕЕсссЕЕЕ асдЕдЕдЕдд дассаасдса ЕЕссадссдд ссЕдЕдасса ссЕдаасЕЕа 420
асаЕссЕЕЕа адЕЕЕсЕддд даааааЕдаа даЕддсааад даадаЕдЕсс сЕЕЕдассса 480
- 65 025245
дсасасадсО асаса^ссдГ саГддГСдаЦ ддадаасГОТ а^Цсддддас дГсдЦа^ааГ 540
^ГТЛГдддаа дГдаасссаГ саИсСсссда ааЧсМссс асадИссИс! даддасадаа 600
^абдсааУсс сб^ддсбдаа сдадсс^адУ ббсд^д'Ьббд с^дасдбда^ ссдааааадс 660
ссадасадсс ссдасддсда ддаидасадд дгсГасМсг. 1:сМ.сасдда ддид^с^дид 720
дадГа^дадГ. ГСд1:д5Ссад ддРдсГда^с ссасддаРад саададбдЪд саадддддас 780
садддсддсс ОдаддассОб дсадаадааа ОддассОссО СссОдааадс ссдасСсаОс 840
^дсПсссддс садасадсдд сЬ СддСсИс ааСд^дсСдс дддаСдТсИ сдГдсЪсадд 900
^ссссдддсс бдааддбдсс Ьдбдббс^аС дсас^сСбса ссссасадс^ даасаасд1:д 960
дддс1;д1;сдд сад!д5дсдс с+асаасс+д Сссасадссд аддаддбсИ сРсссасддд 1020
аадбасаОдс ададсассас адбддадсад Осссасасса адОдддОдсд сбаОааСддс 1080
ссддТассса адссдсддсс 1ддадсд1дс аТсдасадсд аддсасдддс сдссаас!ас 1140
ассадсЪссб бдагС^бдсс адасаадасд сбдсадСбсд ^^ааадасса сссТС^да'Ьд 1200
даСдасУсдд СаассссааС адасаасадд сссаддТСаа Ссаадааада ТдСдаасСас 1260
асссада!сд Тдд^ддассд дасссаддсс сГдда1;ддда с^дГсТаСда 1; дТсаЪдШ 1320
дОсадсасад ассддддадс ОсОдсасааа дссаСсадсс Ссдадсасдс СдООсасаОс 1380
аГсдаддада сссадсСсСС ссаддасССС дадссадСсс адасссТдсС дсСдСсССса 1440
аадаадддса асаддСССдС сСаСдсСддс СсСаасСсдд дсдТддТсса ддссссдсЬд 1500
дссТГс!д!д ддаадсасдд сассСдсдад дас1д1дг,дс Ъддсдсддда сссс!ас1дс 1560
дссбддадсс сдсссасадс дассбдсдУд дсбс^дсасс адассдадад ссссадсадд 1620
ддЪЪЪдаМзс аддадаСдад сддсда^дс! Ъс1д1:д1:дсс сддаРаааад баааддаадр 1680
Оассддсадс абСОССОсаа дсасддСддс асадсддаас СдаааОдсСс ссаааааОсс 1740
аассбддссс дддОсСОООд даадООссад аабддсдОдО Сдааддссда дадссссаад 1800
СасддСсбСа Тдддсадааа ааасглдсбс аСссссаасС СдСсадаадд адасадСддд 1860
дОдГассадО дссЬдосада ддададддЦ'Ь аадаасаааа сддТсОТсса адОддСсдсс 1920
аадсасд!сс СддаадСдаа ддСддШсса аадсссдСад Ъддсссссас сССд^садМ: 1980
дббсадасад ааддСадбад даббдссасс ааад^дСбдд ^ддсабссас ссаадддСсб 2040
5с£сссссаа ссссадссдС дсаддссасс Тсс1ссдддд ссаГсассс! 1;сс1;сссаад 2100
ссОдсдссса ссддсасабс сСдсдаасса аадаСсдбса СсаасасддС сссссадсОс 2160
сасбсддада ааассабдба Ьсббаад^сс адсдасаасс дссбссбса^ дбссс^сЫ:с 2220
системе! глдм:с1.с1л ссисидсс^с «ЛГГсГаса ас1дс1.а1аа ддда!асс1д 2280
- 66 025245
сссадасадЛ дсЛЛдаааЛЛ ссдсЛсддсс сЛасЛааЛЛд ддаадаадаа дсссаадЛса 2340
даЛЛЛсЛдЛд ассдЛдадса дадссЛдаад дадасдЛЛад Лададссадд дадсЛЛсЛсс 2400
садсадааЛд дддадсассс саадссадсс сЛддасассд дсЛаЛдадас сдадсаадас 2460
ассаЛсасса дсааадлссс сасддаЛадд даддасЛсас ададдалсда сдассЛЛЛсЛ 2520
дссадддаса адсссЛЛЛда сдЛсаадЛдЛ дадсЛдаадЛ ЛсдсЛдасЛс адасдсадал 2580
ддадас 2586
<210> 24 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Пептидный эпитоп протеолипидного белка РЬР(139-151) <400> 24
Н13 1 Зег Ъеи С1у Ьуз 5 Тгр Ьеи СЬу ΗΪ3 Рго 10 Азр Ъуз РНе
<210> 25
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид V? [ 76 против СЪЮО
<400> 25
С1п Уа1 С1п Ьеи Θΐη СЬп Зег СЬу А1а СЬи Ьеи А1а Ъуз Рго СЬу АЬа
1 5 10 15
Зег Уа1 Ъуз МеЛ Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТНг РНе ТНг Агд Туг
20 25 30
Тгр ИеЛ ΗΪ5 Тгр Уа1 Ъуз С1п Агд Рго СЬу СЬп СЬу Ъеи СЬи Тгр 11е
35 40 45
СЬу Туг Не Азп Рго Зег ТНг СЬу Туг Зег Азр Туг Азп СЬп Ьуз РНе
50 55 60
Луз Азр Ъуз А1а ТНг Ьеи ТЬг А1а Азр Ъуз Зег Зег Зег ТНг АЬа Туг
65 70 75 80
МеЛ С1п Ъеи Зег Зег Ьеи ТНг Зег СЬи Азр Зег АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
АЬа Агд Азр Рго Туг СЬу Тгр ТНг Не! Азр Зег Тгр СЬу СЬп СЬу ТНг 100 105 110
Ьеи УаЬ ТНг УаЬ Зег Зег
115 <210> 26 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид СБК.1 УН антитела против СБ100 76 <400> 26
СЬу Туг ТНг РНе ТНг Агд Туг Тгр Мер НЬз
10 <210> 27 <211> 17 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид СБК.2 УН антитела против СБ100 76 <400> 27
Туг Не Азп Рго Зег ТНг СЬу Туг Зег Азр Туг Азп СЬп Ьуз РНе Ьуз 15 10 15
Азр <210> 28 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид СБК.З УН антитела против СБ100 76 <400> 28
Азр Рго Туг СЬу Тгр ТНг Мер Азр Зег
5 <210> 29 <211> 107 <212> Белок <213> Искусственная
- 68 025245 <220>
<223> Полипептид УЬ 76 против СБ100 <400> 29
Азр Не СЬп Мои ТНг СЬп Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег АЬа Зег Ьеи 15 СЬу
1 5
Азр ТНг Ые ТНг Ые ТЬг Суз НЬз АЬа Зег СЬп Азп Ые Азп Уа1 Тгр
20 25 30
Ъеи Зег Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу Азп 11е Рго Ьуз Ъеи Ьеи Ые
35 40 45
Туг Ъуз АЬа Зег Азп Ъеи НЬз ТНг СЬу УаЬ Рго Зег Агд РНе Зег СЬу
50 55 60
Зег СЬу Зег СЬу ТЬг СЬу РНе ТНг Ьеи ТНг Ые Зег Зег Ъеи СЬп Рго
65 70 75 80
СЬи Азр 11е АЬа ТЬг Туг Туг Суз СЬп СЬп СЬу СЬп Зег Туг Рго Туг
85 90 95
ТНг РНе СЬу СЬу СЬу ТНг Ьуз Ьеи СЬи Не ъуз
100 105
<210> 30
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид СЭР! УЪ антитела ] против СШ00 76
<400> 30
Ηίδ АЬа Зег СЬп Азп Т1е Азп УаЬ Тгр Ьеи Зег
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Полипептид СБР2 УЪ антитела ι против СЫ00 76
<400> 31
Ьуз АЬа Зег Азп Ъеи Шз ТНг 1 5
- 69 025245 <210> 32 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная <220>
<223> Полипептид СРЕЗ УЪ антитела против СЪЮО 76 <400> 32
Θΐη 61п Е1у 61п Зег Туг Рго Туг ТЬг
5 <210> 33 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид УН 26 против СОЮО <400> 33
саддЛссадс ЛдсадсадЛс ЛддддсЛдаа сЕддсаааас сЕддддссЕс адЕдаадаЕд 60
ЛссЛдсаадд сЛЛсЛддсЛа сассЛЛЛасЛ аддЕасЕдда ЕдсасЕдддЕ аааасададд 120
ссЛддасадд дЛсЛддааЛд даЛЛддаЛас аЕЕааЕссЕа дсасЕддЕЕа ЕЕсЕдаЕЕас 180
ааЛсадаадЛ Лсааддасаа ддссасаЛЛд асЕдсадаса ааЕссЕссад сасадссЕас 240
аЛдсаасЛда дсадссЛдас аЛсЛдаддас ЕсЕдсадЕсЕ аЕЕасЕдЕдс аададасссс 300
ЛасддсЛдда сЛаЛддасЛс сЛддддссаа дддасЕсЕдд ЕсассдЕсЕс сЕса 354
<210> 34 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид СВР-1 УН антитела против СЪЮО 76 <400> 34 ддсЛасассЛ ЛЛасЛаддЛа сЛддаЛдсас 30 <210> 35 <211> 51 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид СВР:'· УН антитела против СЪЮО 76 <400> 35
ЛасаЛЛааЛс сЛадсасЛдд ЛЛаЛЛсЛдаЛ ЛасааЛсада адЛЛсаадда с 51
- 70 025245 <210> 36 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид СЬКЗ νΗ антитела против СЫОО 76 <400> 36 дассссбасд дсбддасбаб ддасбсс 27 <210> 37 <211> 321 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид УД 76 против СО100 <400> 37
дасабссада бдасссадбс бссабссадб сбдбсбдсаб сссббддада сасааббасс 60
абсасббдсс абдссадбса даасаббааб дбббддббаа дсбддбасса дсадааасса 120
ддааабаббс сбааасбабб дабсбабаад дсббссаасб бдсасасадд сдбсссабса 180
аддбббадбд дсадбддабс бддаасаддб ббсасаббаа ссабсадсад ссбдсадссб 240
даадасаббд ссасббасба сбдбсаасад ддбсааадбб абссдбасас дббеддаддд 300
дддассаадс бсдадабсаа а 321
<210> 38 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид ί.'ΠΡΊ УЬ антитела против СЫОО 76 <400> 38 сабдссадбс адаасаббаа бдбббддбба аде 33 <210> 39 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид СЭГ<2 УЬ антитела против СЫОО 7 6 <400> 39 ааддсббсса асббдсасас а 21 <210> 40 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Полинуклеотид СЬКЗ УЬ антитела против СЭ100 76 <400> 40 саасадддбс ааадббабсс дбасасд 27

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с СБ100, где УН указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотные последовательности УН-СБКЛ, УН-СВК2 и УН-СБК3, содержащие 8кС) ГО N0: 6, 7 и 8 соответственно, и Ук указанного антитела или его фрагмента содержит аминокислотные последовательности Ук-СГОГО, У1.-СГОК2 и УкСБК3, содержащие 8кС) ГО N0: 14, 15 и 16 соответственно.
  2. 2. Антитело или его фрагмент по п.1, которые ингибируют связывание СГО100 с рецептором СБ100.
  3. 3. Антитело или его фрагмент по п.1, где указанный рецептор СГО100 представляет собой плексин В1.
  4. 4. Антитело или его фрагмент по п.1, где указанное антитело или его фрагмент являются гуманизированными.
  5. 5. Композиция для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с СГОНЮ, содержащая (а) выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид УН антитела, где указанный полипептид УН содержит аминокислотные последовательности УН-СБКЛ, УН-СБК2 и УН-СБК3, содержащие 8кС) ГО N0: 6, 7 и 8 соответственно, функционально связанную с элементами контроля экспрессии; (Ь) выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид Ук антитела, где указанный полипептид Ук содержит аминокислотные последовательности УЬ-СОКЛ, УЬ-СВК2 и УЬ-СОКЗ, содержащие 8кС) ГО N0: 14, 15 и 16 соответственно, функционально связанную с элементами контроля экспрессии.
  6. 6. Способ нейтрализации СБ100 у животного, включающий введение указанному животному композиции, содержащей:
    a) выделенное антитело или его фрагмент по п.1;
    b) фармацевтически приемлемый носитель.
  7. 7. Способ лечения аутоиммунного заболевания или воспалительного заболевания у животного, нуждающегося в лечении, включающий введение указанному животному композиции, содержащей:
    a) выделенное антитело или его фрагмент по п.1;
    b) фармацевтически приемлемый носитель.
  8. 8. Способ по п.7, где указанное аутоиммунное заболевание или указанное воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из рассеянного склероза и артрита.
  9. 9. Способ по п.7, где указанный артрит выбран из группы, состоящей из ревматоидного артрита и остеоартрита.
  10. 10. Способ лечения злокачественной опухоли у животного, нуждающегося в лечении, включающий введение указанному животному композиции, содержащей:
    a) выделенное антитело или его фрагмент по п.1;
    b) фармацевтически приемлемый носитель.
  11. 11. Способ ингибирования ангиогенеза у животного, нуждающегося в лечении злокачественной опухоли, включающий введение указанному животному композиции, содержащей:
    a) выделенное антитело или его фрагмент по п.1;
    b) фармацевтически приемлемый носитель.
  12. 12. Способ по любому из пп.6-11, где указанное антитело или его фрагмент ингибируют связывание СГО100 с рецептором СБ100.
  13. 13. Способ по п.12, где указанный рецептор СБ100 представляет собой плексин-В1.
  14. 14. Клетка-хозяин для производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые специфично связываются с СБ100, содержащая композицию по п.5.
EA201171374A 2009-05-08 2010-05-07 Антитела против cd100 и способы их применения EA025245B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17682609P 2009-05-08 2009-05-08
US32521310P 2010-04-16 2010-04-16
PCT/US2010/034116 WO2010129917A2 (en) 2009-05-08 2010-05-07 Anti-cd100 antibodies and methods for using the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201171374A1 EA201171374A1 (ru) 2012-06-29
EA025245B1 true EA025245B1 (ru) 2016-12-30

Family

ID=43050912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201171374A EA025245B1 (ru) 2009-05-08 2010-05-07 Антитела против cd100 и способы их применения

Country Status (19)

Country Link
US (6) US8496938B2 (ru)
EP (2) EP2427212B1 (ru)
JP (3) JP6059013B2 (ru)
KR (2) KR101754433B1 (ru)
CN (2) CN108912228B (ru)
AU (2) AU2010245668B2 (ru)
CA (1) CA2760890C (ru)
DK (1) DK2427212T3 (ru)
EA (1) EA025245B1 (ru)
ES (1) ES2647823T3 (ru)
IL (3) IL216002A (ru)
MX (2) MX2011011718A (ru)
NO (1) NO2427212T3 (ru)
NZ (2) NZ618067A (ru)
PL (1) PL2427212T3 (ru)
PT (1) PT2427212T (ru)
SG (1) SG175417A1 (ru)
WO (1) WO2010129917A2 (ru)
ZA (1) ZA201108162B (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2017-07-05 백시넥스 인코포레이티드 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
EP2487242A1 (en) * 2011-02-09 2012-08-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg B-type plexin antagonists and uses thereof
EP2711023B1 (en) 2011-05-13 2017-07-12 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University Osteogenesis promoter
ES2669209T3 (es) * 2011-10-11 2018-05-24 Vaccinex, Inc. Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para la modulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
US8790652B2 (en) * 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
AT512165B1 (de) * 2011-12-27 2013-06-15 Blum Gmbh Julius Antriebsvorrichtung für ein bewegbares möbelteil
US9090709B2 (en) * 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
US10494440B2 (en) * 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
WO2014116982A2 (en) * 2013-01-25 2014-07-31 Brandeis University Methods of modulating gabaergic inhibitory synapse formation and function
MX2015013288A (es) 2013-03-18 2016-04-07 Biocerox Prod Bv Anticuerpos anti-cd134 (ox40) humanizados y usos de los mismos.
EP3656392A1 (en) * 2013-06-25 2020-05-27 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
NZ630881A (en) * 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
AU2017252427B2 (en) 2016-04-22 2023-07-13 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
EP3494131B1 (en) 2016-08-02 2024-09-18 Vaccinex, Inc. Improved methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus/eukaryotic cells
JP2019536471A (ja) 2016-09-27 2019-12-19 セロ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＣＥＲＯ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． キメラエンガルフメント受容体分子
CA3053649A1 (en) 2017-03-20 2018-09-27 Vaccinex, Inc. Treatment of cancer with a semaphorin-4d antibody in combination with an epigenetic modulating agent
EP3600421A4 (en) * 2017-03-23 2021-01-06 The Trustees of The University of Pennsylvania ANTI-C5A ANTIBODIES AND USES THEREOF
SG11201909466RA (en) * 2017-05-05 2019-11-28 Vaccinex Inc Human anti-semaphorin 4d antibody
AU2018341244A1 (en) 2017-09-26 2020-03-05 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptor molecules and methods of use
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
CN110713537B (zh) * 2018-07-13 2023-04-21 江苏怀瑜药业有限公司 一种sema4d抗体及其制备方法和应用
CN109125731B (zh) * 2018-10-22 2019-10-25 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Sema4D/PlexinB1抑制剂在制备治疗及预防眼底血管疾病药物中的应用
MX2021011799A (es) 2019-03-28 2021-10-26 Vaccinex Inc Antagonistas de semaforina 4d para usarlos en la terapia contra el cancer.
CA3142777A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vaccinex, Inc. Combination therapy with semaphorin-4d blockade (sema4d) and dc1 therapy
CN114341170B (zh) * 2019-07-19 2023-09-01 神州细胞工程有限公司 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用
AU2020322474A1 (en) 2019-08-01 2022-03-10 Vaccinex,Inc. Combined inhibition of semaphorin-4D and TGFβ and compositions therefor
AU2021297152A1 (en) 2020-06-25 2023-02-02 The Sydney Children's Hospitals Network Use of semaphorin-4D binding molecules for the treatment of Rett syndrome
CN113583122B (zh) * 2021-07-29 2023-08-29 武汉华美生物工程有限公司 抗人sema4d抗体及其制备方法和应用
AU2021465518A1 (en) 2021-09-27 2024-05-02 Vaccinex, Inc. Predictive outcome profiling for use of an anti-semaphorin-4d binding molecule to treat neurodegenerative disorders
CN118510806A (zh) * 2021-11-03 2024-08-16 罗特格斯新泽西州立大学 抗受体酪氨酸激酶EphA5的抗体-药物缀合物
US20230331863A1 (en) 2022-02-13 2023-10-19 Vaccinex, Inc. Combination therapy with semaphorin-4d blockade and htt-lowering agent for treatment of huntington's disease
CN117866091A (zh) * 2022-10-12 2024-04-12 三优生物医药(上海)有限公司 抗cd100抗体及其用途
CN118108841A (zh) * 2022-11-30 2024-05-31 三优生物医药(上海)有限公司 抗cd100抗体及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773247A (en) * 1993-01-14 1998-06-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Recombinant anti-HIV antibody and process for preparing the same
US20080219971A1 (en) * 2007-02-14 2008-09-11 Vaccinex, Inc. Human anti-cd100 antibodies
US20090104193A1 (en) * 2005-04-07 2009-04-23 Albert Lai SEMA4D in Cancer Diagnosis, Detection and Treatment

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5070192A (en) 1988-03-23 1991-12-03 The Johns Hopkins University Cloned human topoisomerase i: cdna expression, and use for autoantibody detection
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
ATE160379T1 (de) 1990-10-29 1997-12-15 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
EP1149913A1 (en) 1990-11-09 2001-10-31 GILLIES, Stephen D. Cytokine immunoconjugates
WO1992019973A1 (en) 1991-04-26 1992-11-12 Surface Active Limited Novel antibodies, and methods for their use
US6497872B1 (en) 1991-07-08 2002-12-24 Neurospheres Holdings Ltd. Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny
FR2686087A1 (fr) 1992-01-13 1993-07-16 Inst Nat Sante Rech Med Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications.
CA2452130A1 (en) 1992-03-05 1993-09-16 Francis J. Burrows Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US5639856A (en) 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6576754B2 (en) 1995-11-09 2003-06-10 Dana-Farber Cancer Institute CD100 antigen and uses therefor
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
DK0973804T3 (da) 1997-04-07 2007-05-07 Genentech Inc Anti-VEGF-antistoffer
EP0973916A1 (en) 1997-04-11 2000-01-26 Dendreon Corporation Composition and method for inducing an immune response against tumour-related antigens
EP0892047A3 (de) 1997-07-09 2000-03-08 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Humanes und murines Semaphorin L
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6638501B1 (en) 1997-09-29 2003-10-28 Neurospheres Holdings Ltd. Use of multipotent neural stem cell progeny to augment non-neural tissues
US5958767A (en) 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
WO2000028016A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 University Of Rochester T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
JP3787473B2 (ja) 1999-11-30 2006-06-21 独立行政法人科学技術振興機構 セマフォリン受容体
US6635742B1 (en) 2000-01-25 2003-10-21 Nuvelo, Inc. Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides
US7468277B2 (en) 1999-12-23 2008-12-23 Cornell Research Foundation, Inc. Enriched preparation of human fetal multipotential neural stem cells
CN1329060A (zh) * 2000-06-19 2002-01-02 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人semaphorin蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
WO2002102855A2 (en) 2000-11-17 2002-12-27 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
EP1423428B2 (en) 2001-06-20 2012-11-14 Fibron Ltd. Antibodies that block fgfr3 activation, methods of screening for and uses thereof
US20030020733A1 (en) 2001-07-24 2003-01-30 Yin Memphis Zhihong Computer display having selective area magnification
ITTO20010128U1 (it) 2001-07-25 2003-01-25 Aris Spa Struttura ausiliaria particolarmente per l'incremento della capacita'di trasporto dei veicoli cingolati polivalenti tipo m 113 e derivati.
US6905856B2 (en) * 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20080219974A1 (en) * 2002-03-01 2008-09-11 Bernett Matthew J Optimized antibodies that target hm1.24
EP1365018A1 (en) 2002-05-23 2003-11-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) CD100 semaphorin in myelination
US7351803B2 (en) * 2002-05-30 2008-04-01 Macrogenics, Inc. CD16A binding proteins and use for the treatment of immune disorders
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
EP1442749A1 (en) 2003-01-31 2004-08-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of anti-CD100 antibodies for the treatment and the diagnosis of inflammatory disorder affecting the central nervous system
MXPA05012723A (es) 2003-05-30 2006-02-08 Genentech Inc Tratamiento con anticuerpos anti-vgf.
JP4792392B2 (ja) * 2003-09-11 2011-10-12 コーナーストーン セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体
NZ547591A (en) 2003-12-04 2009-11-27 Vaccinex Inc Methods of killing tumor cells by targeting internal antigens exposed on apoptotic tumor cells
US20050233960A1 (en) 2003-12-11 2005-10-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting c-met dimerization and activation
RU2398777C2 (ru) 2004-08-05 2010-09-10 Дженентек, Инк. ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТАГОНИСТЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ c-met
US20060147449A1 (en) 2004-11-15 2006-07-06 Brass Lawrence F Method of using CD100 (or Sema4D) to mediate platelet activation and inflammatory responses
EP1952147A2 (en) * 2005-11-16 2008-08-06 Novartis AG Biomarkers for anti-nogo-a antibody treatment in spinal cord injury
JP2007308465A (ja) 2006-05-15 2007-11-29 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh 炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常の治療方法
US7657639B2 (en) * 2006-07-21 2010-02-02 International Business Machines Corporation Method and system for identity provider migration using federated single-sign-on operation
US8257706B2 (en) * 2006-08-25 2012-09-04 Seattle Genetics, Inc. CD30 binding agents and uses thereof
US9382327B2 (en) 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
CA2678618C (en) 2007-02-21 2019-03-12 Vaccinex, Inc. Modulation of nkt cell activity with antigen-loaded cd1d molecules
CN101932333A (zh) 2007-12-26 2010-12-29 瓦西尼斯公司 抗c35抗体联合疗法和方法
PE20091378A1 (es) 2008-01-10 2009-10-14 Genentech Inc Polipeptidos agonistas plexind1
KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2017-07-05 백시넥스 인코포레이티드 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
WO2010132867A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Irx Therapeutics, Inc. Vaccine immunotherapy
AU2011267869A1 (en) 2010-06-14 2013-01-10 Vaccinex, Inc. Anti-VEGF antibodies and uses thereof
CN103347896B (zh) 2010-09-02 2017-06-13 瓦西尼斯公司 抗cxcl13抗体和其使用方法
EP2711023B1 (en) 2011-05-13 2017-07-12 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University Osteogenesis promoter
CA2851244A1 (en) 2011-10-06 2013-04-11 The Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-human sema4a antibodies useful to treat disease
ES2669209T3 (es) 2011-10-11 2018-05-24 Vaccinex, Inc. Uso de moléculas de unión a semaforina-4D para la modulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
US8790652B2 (en) * 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
NZ629828A (en) 2012-03-02 2017-05-26 Vaccinex Inc Methods for the treatment of b cell-mediated inflammatory diseases
US9375282B2 (en) 2012-03-26 2016-06-28 Covidien Lp Light energy sealing, cutting and sensing surgical device
US9090709B2 (en) 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
CA2899344C (en) 2013-01-31 2022-11-08 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin a levels
US9371352B2 (en) 2013-02-08 2016-06-21 Vaccinex, Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
EP3656392A1 (en) 2013-06-25 2020-05-27 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
AU2017252427B2 (en) 2016-04-22 2023-07-13 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
EP3494131B1 (en) 2016-08-02 2024-09-18 Vaccinex, Inc. Improved methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus/eukaryotic cells
CN110325213A (zh) 2017-02-22 2019-10-11 瓦西尼斯公司 神经退行性或神经炎性疾病中胶质细胞活化的早期检测

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773247A (en) * 1993-01-14 1998-06-30 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Recombinant anti-HIV antibody and process for preparing the same
US20090104193A1 (en) * 2005-04-07 2009-04-23 Albert Lai SEMA4D in Cancer Diagnosis, Detection and Treatment
US20080219971A1 (en) * 2007-02-14 2008-09-11 Vaccinex, Inc. Human anti-cd100 antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE, Gen Bank: BAH48224.1, immunoglobulin heavy chain, partial [Mus musculus], 02.04.2009 [найдено 26.06.2012]. Найдено из Интернет: <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov> *

Also Published As

Publication number Publication date
PL2427212T3 (pl) 2018-02-28
CN102458468B (zh) 2018-05-18
CA2760890C (en) 2019-08-20
US20140072578A1 (en) 2014-03-13
JP6096946B2 (ja) 2017-03-15
ZA201108162B (en) 2012-07-25
NZ618067A (en) 2015-07-31
DK2427212T3 (en) 2017-12-04
KR20120044300A (ko) 2012-05-07
US8816058B2 (en) 2014-08-26
US20120270268A1 (en) 2012-10-25
CN108912228A (zh) 2018-11-30
EA201171374A1 (ru) 2012-06-29
KR101754433B1 (ko) 2017-07-05
AU2016247068A1 (en) 2016-11-03
NZ596136A (en) 2013-12-20
US12006364B2 (en) 2024-06-11
US9605055B2 (en) 2017-03-28
US20130274449A1 (en) 2013-10-17
US20170306017A1 (en) 2017-10-26
US11274149B2 (en) 2022-03-15
US20100285036A1 (en) 2010-11-11
EP2427212A4 (en) 2012-11-14
IL216002A (en) 2016-07-31
CN102458468A (zh) 2012-05-16
MX2011011718A (es) 2012-01-27
PT2427212T (pt) 2017-11-20
JP2016128474A (ja) 2016-07-14
IL261348A (en) 2018-10-31
JP2012525854A (ja) 2012-10-25
SG175417A1 (en) 2011-12-29
US20220185884A1 (en) 2022-06-16
US8496938B2 (en) 2013-07-30
EP2427212A2 (en) 2012-03-14
MX353352B (es) 2018-01-10
JP2017113017A (ja) 2017-06-29
NO2427212T3 (ru) 2018-01-20
WO2010129917A2 (en) 2010-11-11
ES2647823T3 (es) 2017-12-26
US9676840B2 (en) 2017-06-13
IL244197A0 (en) 2016-04-21
IL216002A0 (en) 2012-01-31
AU2010245668A1 (en) 2011-11-24
WO2010129917A3 (en) 2011-01-06
CN108912228B (zh) 2022-03-15
EP3320920A1 (en) 2018-05-16
CA2760890A1 (en) 2010-11-11
AU2010245668B2 (en) 2016-07-14
EP2427212B1 (en) 2017-08-23
JP6059013B2 (ja) 2017-01-11
KR20170080705A (ko) 2017-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025245B1 (ru) Антитела против cd100 и способы их применения
US20190389962A1 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
WO2020019135A1 (zh) 一种抗cd47抗体及其应用
BR112019014694A2 (pt) anticorpos anti-cd47 e usos dos mesmos
UA126657C2 (uk) ОДНОЛАНЦЮГОВА КОНСТРУКЦІЯ АНТИТІЛА ДО BCMA І CD3&lt;font face=&#34;Symbol&#34;&gt;e&lt;/font&gt;
ES2283013T3 (es) Utilizacion de antagonistas de factor de inhibicion de emigracion de macrofagos para terapia anti-cancer.
CN110520441A (zh) 抗TGF-β抗体及其用途
US20220396627A1 (en) Anti-siglec-9 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
EA022308B1 (ru) Антитела, направленные против ангиопоэтина-1 и ангиопоэтина-2, и их применение
US8753639B2 (en) Compositions and methods for modulating the activity of complement regulatory proteins on target cells
KR102701695B1 (ko) 항-dkk-1 항체를 사용하여 암을 치료하기 위한 바이오마커로서의 베타-카테닌의 용도
WO2019003164A1 (en) USE OF ANTI-FAM19A5 ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCERS
ES2768618T3 (es) Combinación de anticuerpo anti-FGFR2 y otro agente
KR20210005169A (ko) 최적화된 항tl1a 항체
KR20180093010A (ko) 새로운 암 치료용 항체
KR20140027051A (ko) 인간 프로스타글란딘 e2 수용체 ep4 에 대한 항체
CN103003309A (zh) Cd37抗体在cll血液样品中的优良效力
US20230348603A1 (en) Anti-vsig4 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
TW202126700A (zh) 一種融合蛋白及其應用
CN116323657B (zh) 同时靶向PD-L1和TGFβ的双功能分子及其医药用途
JP2014534965A (ja) コンパニオン診断を用いた乳癌の治療
JP7456584B2 (ja) 腫瘍標的化タンパク質又はその断片、それに結合する抗体及びその使用
US20220363752A1 (en) Anti-lrrc25 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
US20220251233A1 (en) Anti-cd53 compositions and methods for modulating myeloid cell inflammatory phenotypes and uses thereof
CN102177177A (zh) 包含结合于EBV(Epstein-Barr病毒)潜在性膜蛋白-1(LMP1)胞内域的抗体的药物组合物