KR20170080705A - 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170080705A
KR20170080705A KR1020177017649A KR20177017649A KR20170080705A KR 20170080705 A KR20170080705 A KR 20170080705A KR 1020177017649 A KR1020177017649 A KR 1020177017649A KR 20177017649 A KR20177017649 A KR 20177017649A KR 20170080705 A KR20170080705 A KR 20170080705A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
binding
mab
antibodies
antigen
Prior art date
Application number
KR1020177017649A
Other languages
English (en)
Inventor
어니스트 에스 스미스
테렌스 리 피셔
Original Assignee
백시넥스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 백시넥스 인코포레이티드 filed Critical 백시넥스 인코포레이티드
Publication of KR20170080705A publication Critical patent/KR20170080705A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0001—Archaeal antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

일정 자가면역성 질환, 염증성 질환 및 암을 포함하여, CD100과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, CD100을 중화시키기 위한 항-CD100 단일클론 항체를 개발하였다.

Description

항-ＣＤ100 항체 및 이의 사용 방법{ANTI-CD100 ANTIBODIES AND METHODS FOR USING THE SAME}
본 발명은 CD100 중화 항체, 예를 들어 인간화 단일클론 항체, 이러한 항체의 사용 방법, 및 CD100 발현 세포와 연관된 병태 및 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
CD100은 세마포린 4D(SEMA4D)라고도 알려져 있는, 세마포린 유전자 패밀리에 속하는 경막 단백질(예를 들어, 서열번호 1(인간); 서열번호 2(쥐))이다. CD100은 동종이량체로서 세포 표면 상에 발현되지만, 세포 활성화시 CD100은 단백질가수분해 절단에 의해 세포 표면으로부터 방출되어 이 단백질의 가용성 형태인, 활성 sCD100이 생성될 수 있다. 예를 들어, [Suzuki et al., Nature Rev. Immunol . 3:159-167 (2003); Kukutani et al., Nature Immunol . 9:17-23 (2008)]를 참조한다.
CD100은 처음에 활성화된 인간 T 세포 클론에 대한 2종의 마우스 단일클론 항체, BD16 및 BB18을 생성시킴으로써 동정되었다(Herold et al., Int . Immunol . 7:1-8 (1994)). CD100은 면역계에서 발현되는 세마포린의 최초 예였다. CD100은 휴지 T 세포의 표면 상에서 풍부하게 발현되고, 휴지 B 세포, 단핵구, 및 전문 항원-제시 세포, 예컨대 수지상 세포(DC)의 표면에서는 약하게 발현된다. 세포 활성화는 B 세포 및 DC에서 CD100의 표면 발현의 상향조절과, sCD100 생성의 상향조절을 자극할 수 있다. CD100은 그의 세포질 도메인을 통해 신호를 전달하는 수용체로서, 그리고 리간드로서의 양쪽 기능을 수행하는 것으로 여겨진다(Hall et al., PNAS 93:11780-11785 (1996)). CD100에 대해 동정된 수용체 중 하나가 플렉신-B1이다. 플렉신-B1은 비림프계 조직에서 발현되는 CD100에 대한 높은 친화도(1 nM) 수용체이다(Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)).
CD100은 T 세포 및 B 세포 활성화의 중요한 매개인자이다. CD100 넉아웃(CD100-/-) 마우스는 T-의존성 항원에 대한 항체 반응이 감소되었고 T 세포 프라이밍이 손상되었다. 이들 2가지 기능은 sCD100의 투여시 회복되었다(Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000)).
면역 세포 상에서 CD100의 검증된 효과 이외에도, CD100은 또한 신경염증성 질환에서 확인된 축삭변성 및 탈수초에서 직접적인 역할을 하는 것으로 보인다. 염증성 탈수초성 질환, 예컨대 MS의 발병과정에는 면역 세포가 관여하는 염증기와 선별적 탈수초 및 신경변성기 둘 모두가 포함된다. CD100은 중추 신경계(CNS) 희소돌기아교세포에서 발현되고 축삭 재생의 억제제이다. CD100 발현은 척수 병변의 주변부에 있는 희소돌기아교세포에서 상향조절된다(Moreau-Fauvarque et al., J. Neuroscience 23:9229-9239 (2003)). 인간 다능성 신경 전구체 또는 래트의 뇌유래 1차 희소돌기아교세포와 함께 sCD100을 발현하는 만성 활성화 T 세포를 배양하면 아폽토시스 및 프로세스 확대 붕괴가 유도된다(Giraudon et al., J. Immunol . 172:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med . 7:207-216 (2005)). 신경 전구체의 CD100 유도된 아폽토시스는 BD16 항-CD100 항체에 의해 억제될 수 있다.
CD100 넉아웃 마우스는 인간 다발성 경화증(MS)의 마우스 모델인, 실험적 알레르기성 뇌수막염(EAE)의 발생에 내성이다(Kumanogoh et al., J. Immulol . 169:1175-1181 (2002)).
많은 다른 연구들은 CD100이 뉴론에서 성장 원추 붕괴를 유도한다는 것을 보여주었고, 신경염증에서 CD100의 기능적 관련성을 추가로 뒷받침하는, HTLV-1 연관 척수병증/열대 강직성 불완전하반신마비(HAM/TSP) 환자의 뇌척수액(CSF)에서 sCD100의 수준이 고도로 상승되어 있음이 보고된바 있다. 따라서, 희소돌기아교세포 및 신경 전구체 온전성에 대한 sCD100의 직접적인 유해 영향이 존재하고 CD100이 탈수초에서 병인 역할을 할 수 있다. 염증 반응과 직접 탈수초 둘 모두에서의 중요한 매개인자이므로, 당분야에서는 염증 및 탈수초 질환의 치료를 위한, CD100 중화 분자, 예를 들어, 항-CD100 항체가 요구된다.
CD100은 또한 강력한 프로혈관생성 분자이다. CD100 결합을 통한 플렉시-B1의 활성화는 c-Met을 트랜스활성화시키고 종양 세포의 침습능을 촉진시키며 시험관 내 및 생체내에서 혈관생성을 촉진시킨다. 대량의 종양 샘플 컬렉션에서의 CD100의 면역조직화학 분석 결과는 CD100 과발현이 머리와 목, 전립선, 결장, 유방 및 폐 암에서 매우 빈번한 사건임을 밝혀주었다.
100/플렉신 B1 신호전달은 또한 내피 세포의 이동을 유도하고 종양 세포의 이동을 촉진시키는 것으로 확인되었다(Conrotto et al., Blood 105:4321-4329 (2005); Giordano et al., Nature Cell Biology 4:720-724 (2002)). CD100 유도된 내피 세포 이동은 CD100-블로킹 항체 및 CD100 넉다운에 의해 저해된다. 누드 마우스로 이식전에 CD100 단 헤어핀 RNA(shRNA)를 이용한 두경부 편평 세포 암종(HNSCC0) 세포에서의 CD100 발현 넉다운은 종양 혈관분포 및 종양 성장을 급격하게 감소시켰다(Basile et al., PNAS 103:9017-9022 (2006)). 최근에 보고서들은 종양 기질의 염증 침윤과 높은 혈관 정도 간에 밀접한 관련성이 있음을 지적하고 있다. CD100은 종양 미세환경에 존재하는 염증성 세포에 의해 생성된다. CD100이 없는 환경에서, 종양 덩어리와 전이를 유래시키는 마우스 유방암 세포의 능력이 심각하게 손상되었고, CD100의 공급원은 종양 연관된 마크로파지였다(Sierra et al., JEM 205:1673-1685 (2008)). 따라서, 당분야에서는 CD100 암의 치료를 위한, CD100 중화 분자, 예를 들어 항-CD100 항체가 더욱 요구된다.
예컨대 일정 유형의 자가면역성 질환, 염증성 질환, 암 및 침입성 혈관생성을 포함하여, CD100과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 구체적으로, CD100을 중화시키기 위한 항-CD100 단일클론을 개발하였다. 마우스 MAb 67은 시험관 내에서 CD100 활성을 블로킹하는 능력, 및 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 콜라겐-유도성 관절염(CIA) 및 마우스 모델 암의 임상 징후의 중증도를 감소시키는 능력이 검증되었다. MAb 2503은 인간 및 쥐 CD100에 대한 개선된 친화도 및 MAb 67과 유사한 CD100 블로킹 활성이 검증된 MAb67의 인간화형 버전이다.
일 구체예에서, 본 발명은 2503, 67 또는 76로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체와 동일한 CD100 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자를 제공하고, 상기 결합 분자는 2503, 67 또는 76으로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체가 CD100에 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 그의 단편은 단일클론 항체 2503, 67 또는 76이다.
일정 구체예에서, CD100에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 25와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기 항체 또는 그의 단편의 VH는, 20개 또는 그 이하의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 25와 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 항체 또는 그의 단편의 VH는 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일정 구체예에서, CD100에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 29와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 상기 항체 또는 그의 단편의 VL은 20개 또는 그 이하의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 29와 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 항체 또는 그의 단편의 VL은 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 VH는 이하의 CDR 중 1 이상을 포함한다: 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외한, 서열번호 6과 동일한 코티아-카밧 중쇄 상보성 결정 영역-1(VH-CDR1) 아미노산 서열, 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 7과 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-2(VH-CDR2) 아미노산 서열, 또는 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 8과 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-3(VH-CDR3) 아미노산 서열.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 VL은 이하의 CDR 중 1 이상을 포함한다: 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 14와 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-1(VL-CDR1) 아미노산 서열, 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 15와 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-2(VL-CDR2) 아미노산 서열, 또는 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 16과 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-3(VL-CDR3) 아미노산 서열.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 VH는 그 VH-CDR 중 1 이상에 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 각각 서열번호 6, 7 및 8을 포함하는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 6, 7 및 8이다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 VL은 그 VL-CDR의 1 이상에 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 각각 서열번호 14, 15 및 16을 포함하는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 14, 15 및 16이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 VH는 하기 CDR 중 1 이상을 포함한다: 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 26과 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-1(VH-CDR1) 아미노산 서열, 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 27과 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-2(VH-CDR2) 아미노산 서열, 또는 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 28과 동일한 카밧 중쇄 상보성 결정 영역-3(VH-CDR3) 아미노산 서열.
다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 항체 또는 그의 단편의 VL은 하기 CDR 중 1 이상을 포함한다: 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 30과 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-1(VL-CDR1) 아미노산 서열, 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 31과 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-2(VL-CDR2) 아미노산 서열, 또는 2개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 32와 동일한 카밧 경쇄 상보성 결정 영역-3(VL-CDR3) 아미노산 서열.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 VH는 그 VH-CDR 중 1 이상의 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 각각 서열번호 26, 27 및 28을 포함하는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 26, 27 및 28이다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 VL은 그 VL-CDR의 1 이상에 4개 또는 그 이하의 아미노산 치환을 제외하고, 각각 서열번호 30, 31 및 32를 포함하는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다. 추가 측면에서, VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열은 각각 서열번호 30, 31 및 32이다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 인간 및 쥐 CD100에 결합한다. 다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 5.7 x 10-12 M, 8.4 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M을 넘지 않는 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 친화도로 CD100 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 CD100 변이체 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 일정 측면에서, CD100 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 CD100 변이체 폴리펩티드는 인간 또는 쥐 유래이다. 추가 측면에서, CD100 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 CD100 변이체 폴리펩티드는 인간이고 상기 KD는 약 5 x 10-9 M 내지 약 6 x 10-9 M이다. 또 다른 측면에서, CD100 폴리펩티드 또는 그의 단편, 또는 CD100 변이체 폴리펩티드는 쥐이고 상기 KD는 약 1 x 10-9 M 내지 약 2 x 10-9 M이다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 인간화되거나, 영장류화되거나 또는 키메라이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 VH 또는 VL 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 치료를 필요로하는 동물에서 자가면역성 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 동물에게 단리된 본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 자가면역성 질환 또는 염증성 질환은 다발성 경화증 또는 관절염이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 치료를 필요로하는 동물에서 암을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 동물에게 단리된 본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 암 치료를 필요로하는 동물에서 혈관생성을 억제하는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 동물에게 단리된 본 발명의 항체 또는 그의 단편 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 CD100이 CD100 수용체에 결합하는 것을 억제한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, CD100 수용체는 플렉신-B1이다.
도 1. CD100 블로킹 분석의 다이아그램이다. 플렉신 B1을 발현하는 안정한 세포주(293/플렉신)의 세포 표면 상의 플렉신 B1에 결합된 CD100-His를 도시함. 플렉신 B1에 결합된 CD100-His는 비오틴 접합된 항-His 태그 특이적 단일클론 항체 및 스트렙타비딘-APC를 이용해 검출된다. 플렉신 B1에 대한 CD100-His의 결합을 블로킹할 수 있는 항-CD100 MAb는 유세포측정법으로 측정시 293/플렉신 세포와 연관된 형광발광을 감소시킨다.
도 2. 도 1에 도시한 CD100 블로킹 분석에서 테스트한 토끼 항-His + 스트렙타비딘-APC(Rb 항-his +sAPC), 마우스 CD100(muCD100 단독), 마우스 CD100 + 0.625 ㎍/㎖ MAb(MAb 67, MAb 76 및 mIgG 이소타입) 및 마우스 CD100 + 0.156 ㎍/㎖ MAb(MAb 67, MAb 76 및 mIgG 이소타입)에 대한 유세포측정 결과를 도시하였다. 단일클론 항체 67 및 76은 마우스 CD100이 플렉신 B1 수용체에 결합하는 것을 블로킹한다.
도 3. 이소타입 대조군과 비교하여 MAb 67(67-2) 및 76(76-1) 둘 모두에 대한 흡광도 증가를 통해 확인된 바와 같이, 단일클론 항체 67 및 76은 피브로넥틴 코팅된 플레이트로부터 293/플렉신 B 세포의 마우스 CD100 매개 탈착을 블로킹한다.
도 4. 임상 스코어 감소를 통해 확인되는 바와 같이 마우스 IgG 대조군으로 처리한 것과 비교하여 30 mg/kg 항-CD100 MAb 76(1X/1주 또는 2X/1주) 또는 MAb 67(1X/1주 또는 2X/1주)를 처리한 것은 SJL 마우스에서 재발성 완화(relapsing remitting) EAE를 약화시킨다(4A). 결과는 21일 내지 실험 종료일 간의 각 MAb 처리에 대한 그룹 평균 스코어(GMS)의 감소율을 비교하여 더욱 예증하였다(4B).
도 5. 임상 스코어 감소를 통해 확인되는 바와 같이 마우스 IgG 대조군으로 처리한 것과 비교하여 30 mg/kg 항-CD100 MAb 76(1X/1주) 또는 MAb 67(1X/1주)를 처리한 것은 SJL 마우스에서 재발성 완화 EAE를 약화시킨다(5A). 이 결과는 18일 내지 실험 종료일 사이에 2종의 MAb에 대한 그룹 평균 스코어(GMS)의 감소율을 비교하여 더욱 예증하였다(5B).
도 6. 임상 스코어 감소를 통해 확인되는 바와 같이 마우스 IgG 대조군을 처리한 것과 비교하여 면역화후 7일에 시작하여 30 mg/kg 항-CD100 MAb 67(1X/1주)을 처리한 것은 SJL 마우스에서 재발성 완화 EAE를 완화시킨다.
도 7. MAb 2503, MAb 67 또는 IgG 대조군의 경쟁적 결합에 기인하는 인간 CD100(7A) 또는 마우스 CD100(7B)과 비오틴화 67의 결합에 대한 블로킹 비율(%)을 도시한 ELISA 결과이다.
도 8. 도 1에 도시된 CD100 블로킹 분석에서 테스트한 스트렙타비딘-APC(sAPC 단독), 인간 CD100(huCD100), 마모셋 CD100(marmCD100), 마우스 CD100(muCD100), 1.0 ㎍ 이소타입 및 1.0 ㎍ MAb(67 또는 2503)에 대한 유세포측정결과를 도시한 도면이다. MAb 67 및 MAb 2503은 인간 CD100(8A), 마모셋(8B) 또는 마우스(8C) CD100이 플렉신 B1 수용체에 결합하는 것을 블로킹한다.
도 9. MAb 67, MAb 2503 및 IgG 대조군에 의한 CD100의 중화에 기인하여 CD100에 의해 발생되는 흡광도 감소가 블로킹됨을 도시한 도면이다. 항-CD100 MAb 67 및 MAb 2503은 피브로넥틴 코팅된 플레이트로부터 인간 CD100(9A) 및 마모셋 CD100(9B) 매개된 293/플렉신 세포의 탈착을 블로킹한다.
도 10. 50,000 CT26 결장 종양 세포를 마우스의 다리 근육에 주사한 후 야생형 Balb/c 마우스 및 CD100-/- 마우스에 대한 종양 부피(㎣) 변화를 도시한 도면이다.
도 11. 50,000 CT26 종양 세포를 마우스의 다리 근육에 주사한 후 1 mg MAb 67 또는 1 mg 대조군 마우스 IgG를 처리한 야생형 Balb/c 마우스, 및 CD100-/- 마우스("KO")에 대한 평균 다리 부피(㎣)를 도시한 도면이다.
도 12. 콜라겐 유도된 관절염(CIA)에 대한 전반적인 치료 전략을 도시한 개략도이다.
도 13. 600 ㎍ MAb 67로 처리한 그룹에 CIA 모델에서 관절염 질환 발생 감소를 보여주는 도면이다. 600 ㎍ MAb 67로 처리한 마우스의 관절염 지수(AI) 를 20일에 치료가 개시되었을 때 600 ㎍ 양성 대조군 에타너셉트(Enbrel®) 및 600 ㎍ 음성 대조군(IgG1)으로 처리한 마우스의 AI와 비교하였다(13A). 치료가 20일에 개시되었거나 또는 AI가 ≥3이었을 때 MAb 67을 처리한 경우의 관절염 지수(AI) 결과를 음성 대조군(IgG1) 및 양성 대조군 에타너셉트(Embrel®)를 처리한 경우와 비교하였다(13B).
도 14. Alum(수산화알루미늄/수산화마그네슘)으로 침전시킨 (4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸 접합된 닭 감마 글로불린으로 면역화시킨 Balb/c 마우스("NP-CGG")에서, 600 ㎍ MAb 67 처리가 1차 면역화(14A) 및 2차 면역화(14B) 이후 비장(S) 및 림프절(LN)의 배중심(GC) B 세포("B220+CD38lowPNA+")의 수를 감소시킨다. NP-CGG 면역화한 경우 및 하지 않은 경우의 CD100 -/- 마우스 및 Balb/c 마우스에 대한 결과도 도시하였다.
도 15. 50,000 CT26 결장 종양 세포를 마우스의 다리 근육에 주사한 후 야생형 Balb/c 마우스에 대한 종양 부피(㎣) 변화를 도시한 도면이다. IgG 대조군을 주사한 마우스와 비교하여 1일에 개시하여 주 단위로 1 mg MAb 67을 주사한 마우스의 결과를 나타내었다. 실험은 종양 성장 지연의 종료점까지 수행하였다.
도 16. 50,000 BCA34 섬유모세포 종양 세포를 마우스의 복부 영역에 s.c. 주사한 후 야생형 Balb/c 마우스 및 CD100-/- 마우스("SEMA4D-/-")의 종양 부피(㎣) 변화를 도시한 도면이다(16A). 50,000 BCA34 섬유모세포 종양 세포를 마우스의 다리 근육에 주사한 후 1 mg MAb 67 또는 1 mg 대조군 마우스 IgG를 처리한 야생형 Balb/c 마우스의 평균 넓적다리 부피(㎣) 변화를 도시한 도면이다(16B).
도 17. 50,000 EMT6 마우스 유선 암종 종양 세포를 마우스의 다리 근육에 주사한 후 야생형 Balb/c 마우스 및 CD100-/- 마우스("SEMA4D-/-")의 종양 부피(㎣) 변화를 도시한 도면이다.
도 18. 2종의 HN12 두경부 종양/마우스를 마우스의 옆구리 근육에 s.c. 주사한 후 무흉선 누드 마우스의 종양 부피(㎣)를 도시한 도면이다. IgG4 대조군을 주사한 마우스와 비교하여 이식 1일 후 개시하여 1 mg MAb 2503을 주당 주사한 마우스에서의 결과를 도시하였다.
도 19. 2종의 HN6 HIF1a mODD 두경부 종양을 마우스의 다리 근육에 s.c. 주사한 후 무흉선 누드 마우스의 종양 부피(㎣)를 도시한 도면이다. IgG4 대조군을 주사한 마우스와 비교하여 이식 1일 후 주당 1 mg MAb 2503을 주사한 마우스의 결과를 도시한 것이다(19A). IgG4 대조군 및 MAb 2503 처리한 마우스로부터의 대표적인 종양 사진을 도시한 것이다(19B).
도 20. 래트에서 MAb 2503의 단일 정맥 주사 포화 분석의 포화율 결과를 도시한 것이다. 스프라그-다우리 래트를 0, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 mg/kg의 용량으로 MAb 2503을 단일 정맥 주사로 투여하였다. 유세포측정-기반 포화 분석을 다양한 시점에서 용해된 전혈에서 수행하여 숫컷(20A) 및 암컷(20B)에서 MAb 2503으로 포화된 세포 표적(SEMA4D)의 비율을 결정하였다.
도 21. 사이노몰거스 원숭이에서 MAb 2503의 단일 정맥내 주사 포화 분석한 포화율 결과를 도시한 것이다. 사이노몰거스 원숭이를 0, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 mg/kg의 용량으로 MAb 2503을 단일 정맥 내 주사로 투여하였다. 유세포측정-기반 포화 분석을 다양한 시점에서 용해된 전혈에서 수행하여 MAb 2503으로 포화된 세포 표적(SEMA4D)의 비율을 결정하였다(숫컷과 암컷 데이타를 조합함).
I. 정의
용어 "하나" 또는 "한" 독립체는 1 이상의 그 독립체를 의미하는 것으로 이해한다: 예를 들어, "항-CD100 항체"는 1 이상의 항-CD100 항체를 의미하는 것으로 이해한다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "하나"), "1 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 악성 또는 양성과 무관하게, 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 암성 및 전암성 세포 및 조직을 의미한다.
"침습성 혈관생성"은 황반 변성에서 새로운 혈관의 비정상적인 형성과 악성 및 비악성 종양을 포함하여, 병적 상태를 지원하기 위한 혈관 형성을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비제어적인 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 의미하거나 또는 기술하는 것이다. 암의 예에는 암종, 림프종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되는 것인 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 하나의 "폴리펩티드"와 다수의 "폴리펩티드"를 포함시키는 것이고, 아미드 결합(펩티드 결합이라고도 함)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)으로 구성된 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 2 이상의 아미노산의 임의 사슬 또는 사슬들을 의미하며, 특정 길이의 생성물을 의미하는 것이 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 언급하는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의에 속하고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신, 또는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 제한없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/치환기에 의한 유도체화, 단백질가수분해적 절단, 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는, 폴리펩티드의 발현후 변형 산물을 의미하는 것이기도 하다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원에서 유도되거나 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 화학 합성을 포함하는, 임의의 방식으로 생성될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 약 3 이상, 5 이상, 10 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상, 75 이상, 100 이상, 200 이상, 500 이상, 1,000 이상, 또는 2,000 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 반드시 그러한 구조를 갖는 것은 아니더라고, 정해진 3차 구조를 가질 수 있다. 정해진 3차 구조를 갖는 폴리펩티드는 폴딩된 것이라 하고, 정해진 3차 구조를 보유하지 않지만, 많은 수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있는 것들은 언폴딩된 것이라 한다. 본원에서 사용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예를 들어 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 1 이상의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 의미한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그의 천연 환경에 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 어떠한 특정 수준의 정제도 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 또는 자연 환경으로부터 분리될 수 있다. 숙주 세포에서 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질은, 임의의 적절한 기술에 의해 분리, 분획화, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드이므로, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주한다.
본 발명의 폴리펩티드로서 또한 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체, 및 이의 임의 조합도 포함된다. 본 발명의 항-CD100 항체 또는 항체 폴리펩티드를 언급시 용어 "단편", "변이체", "유도체", 및 "유사체"는 본 발명의 상응하는 항체 또는 항체 폴리펩티드의 항원 결합 특성의 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드의 단편은 본원의 다른 곳에서 기술하는 특이적 항체 단편이외에도, 결실 단편과 단백질가수분해 단편을 포함한다. 본 발명의 항-CD100 항체 및 항체 폴리펩티드의 변이체는 상기 기술된 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연적으로 발생되거나 또는 비천연적으로 발생될 수 있다. 비천연 발생 변이체는 당분야에 공지된 돌연변이유발법을 이용해 생성될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실, 또는 부가를 포함할 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"라고도 할 수 있다. 본원에서 사용되는 항-CD100 항체 또는 항체 폴리펩티드의 "유도체"는 작용성 측면 기의 반응에 의해 화학적으로 유도화된 1 이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩티드를 의미한다. 또한 "유도체"는 20개 표준 아미노산의 1 이상의 천연 발생 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드이다. 예를 들어, 프롤린을 4-히드록시프롤린으로 대체할 수 있으며: 라이신을 5-히드록시라이신으로 대체할 수 있고; 히스티딘을 3-메틸히스티딘으로 대체할 수 있으며; 세린은 호모세린으로 대체할 수 있고; 라이신은 오르니틴으로 대체할 수 있다. 본 발명의 항-CD100 항체 및 항체 폴리펩티드의 유도체는 본 발명의 기준 항체 또는 항체 폴리펩티드에서는 발견되지 않는 부가 특징을 나타내도록 변경된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일 핵산 및 다수 핵산을 포함하려는 것이고, 단리된 핵산 핵산 또는 컨스트럭트, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 통상의 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적 결합(예를 들어, 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산(PNA)에 존재하는 것)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1 이상의 핵산 절편, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 의미한다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그 천연 환경에서 분리된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도하는 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유되는 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적에서 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가 예는 이종성 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 내 (부분 또는 실질적으로)정제된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성하여 생성된 이러한 분자를 더 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 성분 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결인자이거나 또는 이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)이 아미노산으로 번역되지는 않지만, 코딩 영역의 일부로서 간주되나, 임의의 측접 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 2 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트, 예를 들어, 단일 벡터 상에 존재하거나, 또는 개별 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트, 예를 들어, 개별(다른) 벡터에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유하거나, 또는 2 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단일 벡터는 개별적으로 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 항-CD100 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 핵산에 융합되거나 또는 융합되지 않은, 이종성 코딩 영역을 코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역은 제한없이 특수 성분 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다.
일정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 보통은 1 이상의 코딩 영역과 작동적으로 연결된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 성분을 포함할 수 있다. 작동적 회합은 유전자 생성물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역이, 그 유전자 생성물의 발현이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 존재하도록 회합되었을 때이다. 2개 DNA 단편(예컨대 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 회합된 프로모터)는 프로모터 기능 유도가 목적 유전자 생성물을 코딩하는 mRNA의 전사를 일으키는 경우라면 그리고 2 DNA 단편간 결합 성질이 유전자 생성물의 발현을 지정하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는다면 "작동적으로 연결"된 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있다면 그 핵산과 작동적으로 연결된 것이다. 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지정하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에, 다른 전사 제어 성분들, 예를 들면 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호들도 세포-특이적 전사를 지정하도록 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역을 본원에 개시한다.
다양한 전사 제어 영역이 당분야의 숙련가들에게 알려져 있다. 이에는, 제한없이, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스 유래 프로모터 및 인핸서 절편(인트론-A, 최초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 루이스 사르코마 바이러스)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 전사 제어 영역은 척추동물 유전자에서 유래된 것들, 예컨대 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로불린과 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직-특이적 프로모터와 인핸서 그리고 림포카인-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도될 수 있는 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 성분은 당분야의 숙련가에게 공지이다. 이들에는, 제한없이, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코톤, 및 피코르나바이러스 유래 성분(특히 CITE 서열으로도 알려진, 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES)을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA) 형태의, RNA이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지정하는, 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 부가의 코딩 영역과 회합될 수 있다. 신호 가설에 따라서, 포유동물 세포에 의해 분배되는 단백질은 조면소포체를 가로질러 성장하는 단백질쇄의 이출이 시작되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당분야의 숙련가는 대체로 척추동물 세포로부터 분비되는 폴리펩티드가 분비형 또는 "성숙"형 폴리펩티드가 생성되도록 완전 또는 "전체 길이" 폴리펩티드로부터 절단되는, 폴리펩티드의 N 말단에 융합된 신호 펩티드를 갖는다는 것을 알고 있다. 일정 구체예에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드되거나 또는 폴리펩티드와 작동적으로 연결된 폴리펩티드의 분비를 지정하는 능력을 보유하는 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 다르게, 이종성 포유동물 신호 펩티드, 또는 그의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
본 발명의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 최대로 넓은 의미로서 항원성 결합부에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 일 구체예에서, 결합 분자는 CD100, 예를 들어, 약 150 kDa의 경막 CD100 폴리펩티드 또는 약 120 kDa의 가용성 CD100 폴리펩티드(통상 sCD100이라고 함)에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자의 1 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자에서 유래하는 2 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자에서 유래하는 3 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자로부터 유래하는 4 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자로부터 유래하는 5 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 1 이상의 항체 분자로부터 유래하는 6 이상의 CDR을 포함한다.
본 발명은 일정 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에 대한 것이다. 예컨대 천연 발생 항체 등과 같은 전체 크기 항체를 특히 언급하지 않으면, 용어 "항-CD100 항체"는 전체 크기 항체와 그러한 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 유도체, 예를 들어 천연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작 항체 분자 또는 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 이하에, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호(Kucherlapati et al)에 기술된 바와 같이, 내생성 면역글로불린을 발현하지 않고, 1 이상의 인간 면역글로불린으로 형질전환된 동물 또는 인간 면역글로불린 라이브러리에서 단리된 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 적어도 중쇄의 가변 도메인, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함하고, 여기서 가변 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 갖는다.
"인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 본원에 기술된 항체 분자(예를 들어, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체(유도체 포함)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는, 상기 기술된 바와 같은 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체를 포함하고, 이러한 항체 또는 그의 단편은 면역특이적으로 CD100 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체에 결합한다. 당분야의 숙련가에게 공지된 표준 기술을 이용해 인간 항-CD100 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입시킬 수 있으며, 제한없이, 아미노산 치환을 일으키는 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법을 포함한다. 바람직하게, 변이체(유도체 포함)는 기준 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2, 또는 VLCDR3과 비교하여 50개 미만의 아미노산 치환, 40개 미만의 아미노산 치환, 30개 미만의 아미노산 치환, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 코딩한다.
일정 구체예에서, 아미노산 치환은 이하에 더욱 기술하는, 보존적 아미노산 치환이다. 다르게, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이유발법에 의해 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위적으로 도입될 수 있고, 얻어지는 돌연변이체는 활성(예를 들어, CD100 폴리펩티드, 예를 들어, 인간, 쥐, 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100에 결합하는 능력)을 포유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체의 변이체(또는 이의 유도체)는 "최적화" 또는 "항원 결합에 대해 최적화"되고 항원에 대한 친화도가 개선된 항체를 포함하는 인간 또는 완전한 인간 항체를 의미할 수도 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다. 예를 들어, [Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]를 참조한다.
이하에 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별할 수 있는 광범위한 폴리펩티드 클래스를 포함한다. 당분야의 숙련가는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ,μ,α,δ,ε)으로서 분류되고, 이들 중 일부는 하위클래스(예를 들어, γ1-γ4)로 분류된다는 것을 알고 있다. 항체의 "클래스"가 각각 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로서 결정되는 것은 그 사슬의 성질에 의한다. 면역글로불린 하위클래스(이소타입) 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 충분히 특징규명되어 있고, 기능적 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 각 클래스의 개질형 및 이소타입은 본원의 개시 내용의 견지에서 당분야의 숙련가가 쉽게 이해할 수 있으며, 따라서, 본 발명의 범주에 속한다. 모든 면역글로불린 클래스는 명백하게 본 발명의 범주에 속하고, 이하 설명은 대체로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것이다. IgG는, 표준 면역글로불린 분자로서, 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 분자량이 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 4개 사슬이 대체로 "Y" 입체구조로 이황화 결합에 의해 결합되며, 여기서 경쇄가 "Y"의 입구부에서 출발하여 가변 영역을 통해 연속되는 중쇄를 잡고 있다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ,λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 대체로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 2개 중쇄의 "꼬리" 부분은, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작 숙주 세포에 의해 생성될 때 비공유 결합 또는 공유 이황화 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 입체구조의 양갈래 말단에 N 말단에서 각 사슬의 하부에 C 말단으로 이어진다.
경쇄와 중쇄 둘 모두는 구조 및 기능 상동 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이러한 점에서, 경쇄(VL 또는 VK) 및 중쇄(VH) 부분 둘모두의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 이해된다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 영역은 중요한 생물학적 특성 예컨대, 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관습적으로 불변 영역 도메인의 넘버링은 그들이 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더 멀어질수록 증가된다. N-말단부는 가변 영역이고 C 말단이 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선별적으로 인식하여 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 다시 말해, 항체의, VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인 내 상보성 결정 영역(CDR)의 서브셋은 조합되어 3차원 항원 결합부를 한정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차원 항체 구조는 Y의 각 팔 말단에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VL 사슬의 각각에서 3개 CDR에 의해 규정된다. 일례에서, 카멜리드 종에서 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린을 기초로 조작된 일정 면역글로불린 분자에서, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄없이, 오직 중쇄만으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]를 참조한다.
천연 발생 항체에서, 각 항원 결합 도메인에 존재하는 6개 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 수성 환경에서 항체가 그의 3차원 입체구조를 나타내듯이 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치되는 짧은, 인접하지 않은 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역이라고 하는, 항원 결합 도메인 내 나머지 아미노산은 분자간 가변성을 덜 보인다. 프레임워크 영역은 대개는 β-시트 입체구조를 채택하고 CDR은 연결된 루프를 형성하며, 일부 경우에는, β-시트 구조의 일부를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 사슬간, 비공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 위치시키기 위해 제공되는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다. 위치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 규정한다. 이러한 상보성 표면은 그 동족 에피토프와 항체의 비공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역에 포함되는 아미노산은, 이들이 상세하게 정의되어 있기 때문에, 당분야의 숙련가가 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 쉽게 동정할 수 있다(이하 참조).
당분야에서 사용 및/또는 인정되는 용어에 대한 정의가 2 이상으로 존재하는 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 반대적으로 분명하게 언급하지 않으면 그러한 모든 의미를 포함하고자 한다. 특정 예로는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역에 존재하는 비인접한 항원 결합 부위를 설명하기 위한 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 참조하여 본원에 포함시키는 문헌 [Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" and by Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)]에 기술되어 있는데, 여기서 정의는 상호 비교시 중복되는 아미노산 잔기 또는 그 서브셋을 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하는 이들 정의의 적용은 본원에서 정의하고 사용하는 용어의 범주에 포함시키고자 한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에서 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기를 비교를 위해 하기 표 1에 기술한다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 크기와 서열에 따라 다양할 수 있다. 당분야의 숙련가는 어떠한 잔기가 특정 CDR에 포함되어 항체의 가변 영역 아미노산 서열로 주어지는지 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
카밧 코티아
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1의 모든 CDR 정의의 번호는 [Kabat et al.]에 기술된 넘버링 협의에 따른다.
[Kaba et al.]은 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 체계를 정의하고 있다. 당분야의 숙련가는 서열 그 자체를 벗어나는 임의의 실험 데이타에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 "카밧 넘버링" 체계를 대입할 수 있다. 본원에서 사용되는 "카밧 넘버링"은 [Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"]에 기술된 넘버링 체계를 의미한다. 달리 특정하지 않으면, 본 발명의 항-CD100 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체 내 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 기준은 카밧 넘버링 체계에 따른다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 제한없이, 다클론, 단일클론, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs(scFv), 이황화 결합된 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메일을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본원에 개시된 항-CD100 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함한다. ScFv 분자는 당분야에서 공지이고 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기술되어 있다. 본원의 면역글로불린 또는 항체 분자는 임의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 등), 또는 하위클래스의 면역글로불린 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄에서 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩티드는 CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간부, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 1 이상을 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬; CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬, 또는 CH1 도메인, 적어도 힌지 도메인의 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또한, 본 발명에서 사용하기 위한 결합 폴리펩티드는 적어도 CH2 도메인의 일부(예를 들어, CH2 도메인의 전체 또는 일부)가 결여될 수 있다. 상기 기술된 바과 같이, 이들 도메인(예를 들어, 중쇄 부분)은 그들이 천연 발생 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 다양하도록 개질될 수 있음을 당분야의 숙련가들은 이해할 수 있다.
본원에 개시된 일정 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 한 폴리펩티드 사슬의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩티드 사슬 상의 것과 동일하다. 다르게, 본 발명의 중쇄 부분 함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각 단량체는 상이한 표적 결합 부위를 포함하여, 예를 들어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.
본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로, IgG1 분자에서 유래되고, 부분적으로 IgG3 분자에서 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서 유래되고, 부분적으로, IgG4 분자에서 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄, 예를 들어 카파 또는 람다 경쇄에서 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 1 이상을 포함한다.
본원에 기술된 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는, 그들이 인식하거나 또는 특이적으로 결합하는, 항원의 일부분(들) 또는 에피토프, 예를 들어 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, CD100)의 견지에서 기술되거나 또는 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 폴리펩티드의 부분이 "에피토프" 또는 "항원 결정부"이다. 표적 폴리펩티드는 단일 에피토프를 포함할 수 있지만, 대체로 2 이상의 에피토프를 포함할 수 있고, 항원의 크기, 입체구조, 및 유형에 따라 임의 갯수의 에피토프를 포함할 수 있다. 또한, 표적 폴리펩티드 상의 "에피토프"는 비폴리펩티드 성분이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다는 것을 주의한다.
항체에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개 아미노산으로 생각된다. 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 바람직하게 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30개 아미노산을 함유한다. CDR은 그 3차 형태로 항원성 펩티드 또는 폴리펩티드를 인식할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 인접할 필요는 없으며, 일부 경우에서는, 동일 펩티드 사슬 상에 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명의 항-CD100 항체가 인식하는 펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프는 CD100의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 인접 또는 비인접 아미노산 서열을 함유할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는, 대체로 항체가 그 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프간의 일부 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 이 정의에 따라, 항체는 무작위, 비관련 에피토프에 결합하는 것보다 더 수월하게 그 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 할 수 있다. 본원에서 용어 "특이성"은 일정 항체가 일정 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 한정하기 위해 사용된다. 예를 들면, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 소정 에피토프에 대해 보다 높은 특이성을 갖는다고 여겨지거나 또는 항체 "A"는 관련 에피토프 "D"에 대한 특이성보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
"우선적으로 결합한다"는, 항체가 관련있거나, 유사하거나, 상동성이거나, 유사한 에피토프에 결합하는 것보다 더 수월하게 에피토프에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 소정 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는, 이러한 항체가 관련 에피토프와 교차 반응할지라도, 그러한 관련 에피토프보다 상기 소정 에피토프에 보다 더 결합할 것이다.
비제한적인 예로서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(KD) 보다 낮은 해리 상수(KD)로 제1 에피토프에 결합할 경우 그러한 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(KD) 보다 적어도 한자릿수 낮은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 그러한 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 해리 상수(KD) 보다 적어도 2자릿수 낮은 친화도로 제2 항체에 결합하는 경우 그러한 제1 항체에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
다른 비제한 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 오프 속도(k(off))보다 낮은 오프 속도(k(off))로 제1 에피토프에 결합하는 경우 그러한 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 오프 속도(k(off))보다 적어도 한 자릿수 낮은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 그러한 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 다른 비제한 예에서, 항체는 제2 에피토프에 대한 항체의 오프 속도(k(off)) 보다 적어도 2 자릿수 낮은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우 그러한 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 본원에 개시된 항체 또는 그 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, CD100, 예를 들면, 인간, 쥐, 또는 인간 및 쥐 둘모두의 CD100) 또는 그 단편 또는 변이체에 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1 또는 l0-3 sec-1 이하의 오프 속도(k(off))로 결합한다고 할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, CD100, 예를 들면, 인간, 쥐 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100) 또는 그 단편 또는 변이체에 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 또는 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프 속도(k(off))로 결합한다고 할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, CD100, 예를 들면, 인간, 쥐 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100) 또는 그의 단편 또는 변이체에 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1 또는 5 X 104 M-1 sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 결합한다고 할 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명의 항체는 본원에 개시된 표적 폴리펩티드(예를 들어, CD100, 예를 들면, 인간, 쥐 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100) 또는 이의 단편 또는 변이체에 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 또는 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1 이상의 온 속도(k(on))로 결합한다고 할 수 있다.
항체는, 소정 에피토프에 기준 항체가 결합하는 것을 어느 정도는 블로킹하는 정도로 그 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우 소정 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 할 수 있다. 경쟁적 억제는 당분야에 공지된 임의 방법, 예를 들면, 경쟁 ELISA 분석법을 통해 측정할 수 있다. 항체는 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50% 만큼 소정 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 면역글로불린 분자의 CDR과 개별 에피토프의 결합 강도의 측정치를 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28]을 참조한다. 본원에서 사용되는 용어 "결합력(avidity)"은 면역글로불린 개체군과 항원간 복합체의 전체적인 안정성, 즉 항원과 면역글로불린 혼합물의 기능적 조합 강도를 의미한다. 예를 들어, 문헌 [Harlow at pages 29-34]을 참조한다. 결합력은 특이적 에피토프와 개체군 내 개별 면역글로불린의 친화도와, 또한 항원과 면역글로불린의 원자가와 관련있다. 예를 들면, 고도로 반복되는 에피토프 구조의 항원, 예컨대 중합체와 2가 단일클론 항체간 상호작용은 높은 결합력 중 하나일 수 있다.
본원의 항-CD100 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 그들의 교차 반응성 면에서 기술하거나 또는 특정할 수 있다. 본원에서 사용되는 "교차 반응성"은 한 항원에 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력; 2종의 상이한 항원성 물질간 관련성의 측정치를 의미한다. 따라서, 항체는 그 형성을 유도한 것 이외의 다른 에피토프에 결합할 경우 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 대체로 유도성 에피토프와 동일한 수많은 상보성 구조 특징을 포함하며, 일부 경우, 실제로 원래 것보다 더 양호하게 적합할 수 있다.
예를 들면, 일정 항체는 어느 정도로 교차 반응성을 가지며, 다시 말해 이들은 관련있지만, 동일하지는 않은 에피토프, 예를 들어 기준 에피토프와 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용해 산출)이 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 및 적어도 50%인 에피토프에 결합한다. 항체는 기준 에피토프와의 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기술된 방법을 이용해 산출)이 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만인 에피토프에 결합하지 않으면 교차 반응성이 없거나 거의 없다고 할 수 있다. 항체는 일정 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르쏘로그 또는 상동체에 결합하지 않으면, 그러한 일정 에피토프에 "고도로 특이적"이라고 여겨진다.
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 또한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, CD100, 예를 들어 인간, 쥐 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100에 대한 그들의 결합 친화도 면에서 기술되거나 또는 특정될 수 있다. 바람직한 결합 친화도는 해리 상수 또는 Kd가 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만인 것들을 포함한다. 일정 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 CD100에 약 5 x 10-9 내지 약 6 x 10-9의 Kd로 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 쥐 CD100에 약 1 x 10-9 내지 약 2 x 10-9의 Kd로 결합한다.
본 발명의 항-CD100 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 "다중특이적"일 수 있는데, 예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적이거나 또는 보다 큰 다중특이성일 수 있으며, 이는 동시에 1 이상의 상이한 항원(예를 들어, 단백질) 상에 존재하는 2 이상의 상이한 에피토프를 인식하여 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 항-CD100 항체가 "단일특이적"이거나 "다중특이적", 예를 들어 "이중특이적"인지 여부는 결합하는 폴리펩티드와 반응하는 상이한 에피토프의 갯수를 의미한다. 다중특이적 항체는 본원에 기술된 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 대해 특이적이거나 또는 표적 폴리펩티드와 이종성 에피토프, 예컨대 이종성 폴리펩티드 또는 고체 지지 물질에 대해 특이적일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원자가"는 잠재적인 결합 도메인, 예를 들어 결합 폴리펩티드 또는 CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 존재하는 항원 결합 도메인의 갯수를 의미한다. 각각의 결합 도메인은 특이적으로 하나의 에피토프에 결합한다. 결합 폴리펩티드 또는 CD100 결합 분자가 1개가 넘는 결합 도메인을 포함하는 경우, 각 결합 도메인은 특이적으로, 2개의 결합 도메인을 갖는 항체에 대해, 동일 에피토프에 특이적으로 결합하여, "2가 단일특이적"이라고 하거나, 또는 2개의 결합 도메인을 갖는 항체에 대해, 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하여, "2가 이중특이적"이라고 할 수 있다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 각 특이성에 대하 이중특이적이고 2가일 수 있다("이중특이적 4가 항체"). 다른 구체예에서, 4가 미니바디 또는 도메인 결실 항체를 제조할 수 있다.
이중특이적 2가 항체, 및 그들의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 제5,821,333호; 및 미국 특허 출원 제2003/020734호 및 제2002/0155537호에 기술되어 있고, 이들 전체를 참조하여 본원에 포함시킨다. 이중특이적 4가 항체, 및 그들의 제조 방법은 예를 들어, WO 02/096948 및 WO 00/44788에 기술되어 있고, 이들의 내용을 참조하여 본원에 포함시키다. 대체로, PCT 공개특허출원 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J. Immunol . 147:60-69 (1991); 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 제5,601,819호; Kostelny et al., J. Immunol . 148: 1547-1553 (1992)를 참조한다.
이전에 기술한 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 입체구조는 잘 알려져 있다. 본원에서 사용되는 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫번째(대부분 아미노 말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 아미노 말단이다.
본원에서 사용되는 용어 "CH2 도메인"은 예를 들어, 통상의 넘버링 체계를 이용해 항체의 대략 잔기 244에서 잔기 360으로 연장되는 중쇄 분자의 일부분을 포함한다(잔기 244 내지 360, 카밧 넘버링 체계; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 체계; [Kaba EA et al.] 참조). CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 고유하다. 다시 말해, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 2 CH2 도메인 사이에 개입된다. CH3 도메인이 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C 말단으로 연장되고 대략 108개 잔기를 포함한다는 것이 또한 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "힌지 영역"은 CH2 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 중쇄 분자의 일부분을 포함한다. 이러한 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하고, 가요성이라서, 2개의 N 말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직일 수 있게 한다. 힌지 영역은 3개의 개별 도메인; 상부, 중간부 및 하부 힌지 도메인으로 세분될 수 있다(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본원에서 사용하는 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자간에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 제2 티올 기와 이황화 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 이황화 결합에 의해 연결되고 2개의 중쇄는 카밧 넘버링 체계를 이용하여 239 및 242에 해당되는 위치(위치 226 또는 229, EU 넘버링 체계)에서 이황화 결합에 의해 연결된다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위는 제1 종에서 얻거나 또는 유래된 것이고 불변 영역(본 발명에 따라 온전하거나, 일부이거나 또는 개질될 수 있음)은 제2 종에서 얻어진 것인 임의의 항체를 의미하는 것이다. 바람직한 구체예예서, 표적 결합 영역 또는 부위는 인간 이외의 공급원(예를 들어, 마우스 또는 영장류)에서 유래된 것이고 불변 영역은 인간 유래된 것일 수 있다(예를 들면, 본원에 기술된 단일클론 항체(MAb) 2368).
본원에서 사용되는 용어 "조작된 항체"는 중쇄 또는 경쇄 또는 둘 모두의 가변 도메인이 기지 특이성의 항체에서 유래하는 1 이상의 CDR로 적어도 부분적으로 치환되고, 필요한 경우, 프레임워크 영역의 부분 치환 및 서열 변화에 의해 변경된 항체를 의미한다. CDR이 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 클래스 또는 하위클래스의 항체에서 유래된 것일수 있지만, CDR은 상이한 클래스의 항체로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 다른 종 기원의 항체로부터 유래된 것일 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 기지 특이성의 비인간 항체에서 유래하는 1 이상의 "도너" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄 프레임워크 영역에 융합되는 조작된 항체를 본원에서는 "인간화 항체"라고 한다. 한 가변 도메인의 항원 결합능을 다른 것으로 전환하기 위해 도너의 완전한 CDR로 모든 CDR을 치환시킬 필요는 없다. 다시 말해, 표적 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기들을 전달하는 것만이 필요하다.
인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 가변 도메인 내 프레임워크 영역은 오직 인간 기원의 잔기만을 함유한다는 것을 더욱 인식할 수 있으며, 이러한 경우, 인간화 항체의 이들 프레임워크 영역은 "완전한 인간 프레임워크 영역"(예를 들어, MAb 2503)이라고 한다. 다르게, 도너 가변 도메인의 프레임워크 영역(들)의 1 이상의 잔기는 필요하다면 CD100 항원에 대한 결합을 향상시키거나 또는 적절한 결합을 유지하기 위해 인간화 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 둘 모두의 가변 도메인의 인간 프레임워크 영역(들)의 해당 위치 내에서 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 조작된 인간 프레임워크 영역은 따라서 인간과 도너 프레임워크 잔기의 혼합을 포함하고, 본원에서는 "부분적 인간 프레임워크 영역"이라고 한다.
예를 들면, 항-CD100 항체의 인간화는 필수적으로 [Winter and co-workers (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))]에 따라, 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-CD100 항체의 상응하는 서열로 치환하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조하며, 이들을 참조하여 본원에 포함시킨다. 얻어진 인간화 항-CD100 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 완전한 인간 프레임워크 영역 내에 적어도 하나의 설치류 또는 돌연변이체 설치류 CDR을 포함하게 된다. 일례에서, 인간화 항-CD100 항체의 1 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 내 잔기는 상응하는 비인간(예를 들면, 설치류) 잔기로 치환되고(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 제6,180,370호 참조), 이러한 경우 얻어진 인간화 항-CD100 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내 부분적 인간 프레임워크 영역을 포함한다.
또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도너 항체에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 개선하기 위해(예를 들어, 원하는 친화도를 얻기위해) 실시된다. 대체로, 인간화 항체는 실질적으로, 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인 전부를 포함하게 되고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비인간 면역글로불린의 그것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역이다. 인간화 항체는 경우에 따라 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 포함하게 된다. 추가 설명은 예를 들어, [Jones et al., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]를 참조하며, 이를 참조하여 본원에 포함시킨다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인보다 적게 비인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 항체를 포함할 수 있다. 실제로, 인간화 항체는 대체로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체의 유사 부위에서 유래하는 잔기로 치환된 인간 항체이다. 예를 들면, 미국 특허 제5,225,539호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제5,859,205호를 참조한다. 또한, 미국 특허 제6,180,370호, 및 국제 공개 특허 출원 WO 01/27160을 참조할 수 있는데, 여기에는 인간화 항체 및 에정 항원에 대한 친화도가 개선된 인간화 항체의 제조 기술이 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 어떠한 수단에 의해, 2 이상의 성분들 또는 구성물을 함께 결합시키는 것을 의미한다. "인프레임 융합"은 원래 오픈 리딩 프레임(ORF)의 올바른 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로, 연속되는 보다긴 ORF를 형성하기 위해 2 이상의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임을 결합시키는 것을 의미한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 상응하는 2 이상의 절편(자연적으로는 정상적으로 연결되지 않은 절편)을 함유하는 단일 단백질이다. 리딩 프레임이 융합된 절편 전반에서 연속되지만, 이들 절편은 예를 들어, 인프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 떨어져 있을 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인프레임으로 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속 폴리펩티드의 일부로서 공동번역되는 한, 1 이상의 면역글로불린 프레임워크 영역 또는 추가 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 떨어져 있을 수 있다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 그 서열에서 서로 이웃하는 잔기들이 폴리펩티드의 1차 구조에서 인접해 있는, 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로의 아미노산 순서이다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학물, 예를 들면, 폴리펩티드를 생성하는 프로세스를 의미한다. 이러한 프로세스는 제한없이 유전자 넉다운 및 일시적 발현과 안정한 발현 둘 모두를 포함하여 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의 징후를 포함한다. 여기에는 제한없이 메신저 RNA(mRNA)로의 유전자 전사, 및 폴리펩티드(들)로의 그러한 mRNA의 번역이 포함된다. 최종 목적 생성물이 생화학물인 경우, 발현은 그러한 생화합물 및 임의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 생성물"을 만든다. 본원에서 사용되는 유전자 생성물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 변역된 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 기술한 유전자 생성물은 전사후 변형, 예를 들어, 폴리아데닐화된 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합, 단백질가수분해 절단 등이 된 폴리펩티드를 더 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 조치를 의미하며, 목적은 원치않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 다발성 경화증, 관절염 또는 암의 진행을 예방하거나 또는 완화(경감)시키는 것이다. 이롭거나 또는 바람직한 임상 결과는, 제한없이, 검출가능 여부와 무관하게, 증상의 완화, 질환 정도 경감, 질환의 안정된(즉, 악화되지 않음) 상태, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 완화 또는 일시적완화, 및 진정(부분적이거나 또는 전체적으로)을 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존이 연장됨을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 것은 이미 병태나 질환이 있는 것과 병태나 질병 소인이 있는 것 또는 병태나 질병을 예방해야하는 것을 포함한다.
"피험체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 요법이 요구되는, 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체이다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 예컨대 "항-Cd100 항체"의 투여로 혜택을 얻는 피험체" 및 "치료가 필요한 동물"은, 예를 들어 항-CD100 폴리펩티드의 검출(예를 들어, 진단 절차 동안)을 위해, 사용된 항-CD100 항체의 투여로부터 및/또는 항-CD100 항체를 이용한, 치료, 즉 질환의 진정 또는 예방으로부터 혜택을 얻을 수 있는 피험체, 예컨대 포유동물 피험체를 포함한다. 본원에서 상세히 기술하는 바와 같이, 항-CD100 항체는 비접합형으로 사용되거나 또는 예를 들어 약물, 프로드러그 또는 동위원소에 접합될 수 있다.
II. 표적 폴리펩티드 설명
본원에서 사용되는 용어 "CD100" 및 "CD100 폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용된다. 일정 구체예에서, CD100은 세포 표면 상에 발현되거나 또는 세포에 의해 분비된다. 다른 구체예에서, CD100은 막결합된다. 다른 구체예에서, CD100은 가용성, 예를 들어, sCD100이다. 다른 구체예에서, CD100은 전체 크기 CD100 또는 그의 단편, 또는 CD100 변이체 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 CD100 또는 CD100 변이체 폴리펩티드의 단편은 전체 크기 CD100의 일부 또는 모든 기능 특성을 보유한다.
전체 크기 인간 CD100 단백질은 150 kDa의 2개 폴리펩티드 사슬로 이루어진 동종이량체 경막 단백질이다. CD100은 세포 표면 수용체의 세마포린 패밀리에 속하고 또한 SEMA4D라고도 한다. 인간과 마우스 둘모두의 Sema4D/CD100은 그들의 경막 형태로부터 단백질가수분해적으로 절단되어 120-kDa 가용성 형태를 형성하여, 2개의 Sema4D 이소폼 존재를 보여준다(Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). 세마포린은 뉴런과 그의 적절한 표적간에 정확한 연결부를 확립하는데서 중요한 역할을 하는 축삭 유도 인자로서 원래는 정의된 가용성 및 막결합 단백질로 이루어진다. 구조적으로 클래스 IV 세마포린으로 여겨지는, CD100은 17개 보존성 시스테인 잔기, Ig-유사 도메인, 라이신 풍부 스트렛치, 소수성 경막 영역, 및 세포질 꼬리부를 함유하는, 특징적인 '세마' 도메인이 후속되는 아미노 말단 신호 서열로 이루어진다.
CD100의 각 폴리펩티드 사슬은 약 13개 아미노산의 신호 서열과 후속되는 약 512개 아미노산의 세마포린 도메인, 약 65개 아미노산의 면역글로불린-유사(Ig-유사) 도메인, 104개 아미노산의 라이신 풍부 스트렛치, 약 19개 아미노산의 소수성 경막 도메인, 및 110개 아미노산의 세포질 꼬리부를 포함한다. 세포질 꼬리부에 타이로신 인산화를 위한 공통 부위는 타이로신 키나아제와 CD100의 예측되는 회합을 지원한다(Schlossman, et al., Eds. (1995) Leucocyte Typing V(Oxford University Press, Oxford).
2가지 유형의 수용체가 CD100에 대해 동정되었다. 그 수용체 중 하나는 플렉신-B1으로서, 비림프양 조직에서 발현되고 CD100 수용체에 대해 높은 친화도(1 nM)를 보인다(Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)). 플렉신 B1 신호전달의 CD100 자극은 뉴런의 성장 원추 붕괴를 유도하고, 희소돌기아교세포의 프로세스 확장 붕괴 및 아폽토시스를 유도하는 것으로 확인되었다(Giraudon et al., J. Immunol . 172:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med . 7:207-216 (2005)). CD100에 결합 후, 플렉신 B1 신호전달은 R-Ras의 불활성화를 매개하여, 세포외 매트릭스에 대한 인테그린 매개 부착을 감소시키고, 또한 Rho의 활성화를 일으켜서, 세포골격의 재조직화에 의한 세포 붕괴를 야기한다. 예를 들어, [Kruger et al., Nature Rev. Mol . Cell Biol . 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005))]를 참조한다.
림프양 조직에서, CD72는 저친화도(300 nM) CD100 수용체로서 이용된다(Kumanogoh et al., Immunity 13:621-631 (2000)). B 세포 및 APC는 CD72를 발현하고, 항-CD72 항체는 sCD100과 동일한 많은 효과, 예컨대 CD23의 B 세포 쉐딩(shedding) 및 CD40-유도된 B 세포 반응의 향상 등의 효과를 갖는다. CD72는 많은 억제성 수용체와 회합될 수 있는 타이로신 포스파타아제 SHP-1을 동원하여 B 세포 반응의 음성 조절인자로 작용하는 것으로 여겨진다. CD72와 CD100의 상호작용은 SHP-1의 해리, 및 이러한 음성 활성화 신호의 손실을 일으킨다. CD100은 시험관 내에서 T 세포 자극 및 B 세포 응집과 생존을 촉진하는 것으로 확인되었다. CD100-발현 세포 또는 sCD100의 부가는 시험관 내에서 CD40-유도 B 세포 증식 및 면역글로불린 생성을 증강시키고, 생체 내 항체 반응을 가속화시킨다(Ishida et al., Inter. Immunol . 15:1027-1034 (2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). sCD100은 공동자극성 분자의 상향 조절을 포함하여, Dc의 CD40 유도 성숙화를 증강시키고 IL-12의 분비를 증가시킨다. 또한, sCD100은 블로킹 항-CD100 마우스 항체의 부가에 의해 역전될 수 있는, 면역세포 이동성을 억제할 수 있다(Elhabazi et al., J. Immunol . 166:4341-4347 (2001); Delaire et al., J. Immunol . 166:4348-4354 (2001)).
Sema4D는 비장, 흉선, 및 림프절을 포함하는, 림프양 장기, 및 비림프양 장기, 예컨대 뇌, 심장 및 신장에서 높은 수준으로 발현된다. 림프양 장기에서, Sema4D는 휴지 T 세포 상에서 풍부하게 발현되지만, 휴지 B 세포 및 항원 제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(DC)에서는 약하게만 발현된다.
세포 활성화는 CD100의 표면 발현과 가용성 CD100(sCD100)의 생성을 증가시킨다. CD100의 발현 패턴은 이것이 생리적으로 중요한 역할을 하고 또한 면역계에서 병리적 역할을 한다는 것을 시사한다. CD100은 B 세포 활성화, 응집 및 생존을 촉진하고; CD40-유도 증식 및 항체 생성을 증강하며; T 세포 의존적 항원에 대한 항체 반응을 증강하고; T 세포 증식을 증가시키고; 수지상 세포 성숙화 및 T 세포 자극능을 증강시키는 것으로 확인되었고, 탈수초 및 축삭 변성에 직접적으로 연루된다(Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); and Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001)).
CD100 넉아웃(CD100-/-) 마우스는 CD100이 체액성 및 세포성 면역 반응에서 중요한 역할을 한다는 부가 증거를 제공한다. CD100-/- 마우스에서 비림프양 조직의 비정상성은 알려진 것이 없다. CD100-/- 마우스 유래의 수지상 세포(DC)는 불충분한 알로자극(allostimulatory)능을 가지며, 공동자극성 분자의 발현에서 결함을 보이고, 이는 sCD100의 부가에 의해 구제될 수 있다. CD100 결핍 마우스(CD100-/-)는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩티드에 의해 유도되는 실험적 자가면역 뇌척수염을 발병시키는데 실패하였는데, 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질-특이적 T 세포는 CD100 부재하에서는 생성되지 않기 때문이다(Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002)). 유의한 양의 가용성 CD100이 또한 자가면역성 경향의 MRL/lpr 마우스(전신 자가면역성 질환 예컨대 SLE 모델)의 혈청과, 정상 마우스 혈청에서도 검출된다. 또한, sCD100의 수준은 자가 항체의 수준과 상관있고 연령에 따라 증가된다(Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)). 가용성 CD100은 또한 탈수초성 질환이 있는 환자의 뇌척수액과 혈청에 축적되는 것으로 확인되었고, sCD100은 인간 만능성 신경 전구체(Dev 세포)의 아폽토시스를 유도하고, 프로세스 확장을 억제하고 또한 시험관 내에서 래트 희소돌기아교세포의 아폽토시스를 유도한다(Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)). 이러한 아폽토시스는 항-CD100 MAb에 의해 블로킹된다.
III. 항-CD100 항체
CD100에 결합하는 항체는 당분야에서 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 2008/0219971 A1, 국제 공개 특허 출원 WO 93/14125 및 문헌 [Herold et al., Int . Immunol . 7(1): 1-8 (1995)]을 참조하며, 이들 각각은 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다.
본원의 항체는 CD100에 결합하는 항-CD100 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 예를 들어 MAb 2503, MAb 67, 및 MAb 76을 포함한다. 일정 구체예에서, 항-CD100 항체는 인간, 쥐, 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100에 결합한다. 다른 구체예에서, 항-CD100 항체는 CD100이 그 수용체, 예를 들어 플렉신-B에 결합하는 것을 블로킹한다.
일 구체예에서, 본 발명은 단일클론 항체 2503, 67 또는 76과 동일한 CD100 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 CD100에 특이적으로 결합하고, CD100, 예를 들어, 인간, 쥐 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100에 단일클론 항체 2503, 67 또는 76이 특이적으로 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 단리된 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
일정 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 기준 항-CD100 항체 분자에 대한 아미노산 서열과의 서열 동일성이 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95%인 아미노산 서열을 갖는다. 추가 구체예에서, 결합 분자는 기준 항체와 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 공유한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 1 이상은 서열번호 9 또는 10의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VH 도메인의 CDR의 1 이상은 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 1 이상은, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기 코딩되는 VH 도메인을 포함하는 항-CD100 항체는 CD100에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 1 이상은 서열번호 17 또는 서열번호 18의 CDR1, CDR2 또는 CDR3과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VL 도메인의 CDR의 1 이상은 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서 VL 도메인의 CDR의 1 이상은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 아미노산 치환을 제외하고, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16과 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
추가 구체예에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어지는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서 코딩되는 VL 도메인을 포함하는 항-CD100 항체는 CD100에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다.
본 발명의 항-CD100 항체의 적합한 생물학적 활성 변이체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 변이체는 모 항-CD100 항체의 목적 결합 특성을 보유하게 된다. 항체 변이체의 제조 방법은 대체로 당분야에서 이용가능하다.
돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 당분야에 공지이다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조할 수 있고, 여기서 인용된 문헌들을 참조하여 본원에 포함시킨다: Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol . 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); 미국 특허 제4,873,192호. 목적 폴리펩티드의 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 [Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352]의 모델에서 확인할 수 있고, 이 문헌을 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다. [Dayhoff et al.]의 모델은 PAM(Point Accepted Mutation) 아미노산 유사도 매트릭스(PAM 250 matrix)를 이용해 적절한 보존적 아미노산 치환을 결정한다. 보존적 치환, 예컨대 한 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. [Dayhoff et al.] 모델의 PAM 250 매트릭스에 교시된 보존적 아미노산 치환의 예에는, 제한없이, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln, 및 Phe↔Trp↔Tyr를 포함한다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 목적하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 폴리펩티드의 변이체 제작에서, 변이체가 목적 특성, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 세포에 의해 표면 상에 발현되거나 또는 분비되는, CD100, 예를 들어, 인간, 쥐, 또는 인간과 쥐 둘 모두의 CD100에 특이적으로 결합할 수 있고 CD100 블로킹 활성을 갖는, 특성을 계속 보유하도록 변형을 가할 수 있다. 명백하게, 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 가해진 임의의 돌연변이는 리딩 프레임 밖의 서열에 위치해서는 않되고, 바람직하게는 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 생성하지 않는다. 예를 들어, EP 공개 특허 출원 75,444를 참조한다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 결합 특이성을 측정하는 방법은 제한없이, 표준 경쟁 결합 분석, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비를 모니터링하는 분석법, T 세포 증식 분석법, 아폽토시스 분석법, ELISA 분석법 등을 포함한다. 예를 들어, 이하 문헌들에 개시된 분석법을 참조할 수 있고, 이들 문헌 전체를 참조하여 본원에 포함시킨다: WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); 및 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004).
본원에 개시된 불변 영역, CDR, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 포함하여, 임의의 특정 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100% 동일한지 여부를 본원에서 기술하는 경우, 동일도(%)는 당분야에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어, 예컨대 제한없이 BESTFIT 프로그램(Wisconsin 서열 Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)을 이용해 결정할 수 있다. BESTFIT는 2개 서열간 최고 상동성 절편을 찾기 위해, [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]의 국지 상동성 알고리즘을 이용한다. 특정 서열이, 본 발명에 따른 기준 서열과 예를 들어, 95% 동일한지 여부를 결정하기 위해 BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용할 경우, 그 매개변수는, 물론, 동일성 비율이 기준 폴리펩티드 서열의 전체 길이에 대해 산출되도록 그리고 기준 서열 내 아미노산의 전체 갯수 중 최대 5%의 상동성 갭이 허용되도록 설정된다.
본 발명의 목적을 위해, 서열 동일성 비율은 갭 오픈 패널티가 12이고 갭 확장 패널티가 2이고, BLOSUM 매트릭스가 62인 아핀 갭 서치를 이용하는 Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘을 사용해 결정할 수 있다. Smith-Waterman 상동성 조사 알고리즘은 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489]에 교시되어 있다. 변이체는 예를 들면, 1 내지 15개 아미노산 잔기, 1 내지 10개 아미노산 잔기, 예컨대 6 내지 10개, 5개, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산 잔기정도로, 기준 항-CD100 항체(예를 들어, MAb 2503, 67 또는 76)와 다를 수 있다.
CD100에 특이적으로 결합하고 목적하는 CD100 블로킹 활성을 보유할 수 있는 폴리펩티드의 상세한 화학 구조는 다수의 인자에 따라 좌우된다. 이온화가능한 아미노 및 카르복실 기가 분자에 존재하므로, 특정 폴리펩티드는 산성 또는 염기성 염, 또는 중성 형태로서 얻어질 수 있다. 적절한 환경 조건하에 존재 시 그 생물학적 활성을 보유하는 모든 이러한 조제물이 본원에서 사용되는 항-CD100 항체의 정의에 포함된다. 또한, 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열은 당 모이어티를 이용한 유도체화(글리코실화)에 의해 또는 다른 보충 분아 예컨대 지질, 포스페이트, 아세틸 기 등에 의해 증가될 수 있다. 또한 사카라이드와의 접합에 의해 증가될 수도 있다. 이러한 증가의 일 측면은 생성 숙주의 번역후 프로세싱 시스템을 통해 수행되고, 다른 이러한 변형이 시험관 내에서 도입될 수 있다. 임의 이벤트에서, 이러한 변형은 항-CD100 항체의 목적 특성을 파괴하지 않는한 본원의 항-CD100 항체의 정의에 포함된다. 이러한 변형은 다양한 분석에서, 폴리펩티드의 활성을 증강 또는 감소시켜서, 양적으로 또는 질적으로 활성에 영향을 줄 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 사슬 내 개별 아미노산 잔기는 산화, 환원, 또는 다른 유도체화에 의해 개질될 수 있고, 폴리펩티드는 절단되어 활성을 보유한 단편이 얻어질 수 있다. 목적 특성(예를 들어, CD100에 대한 결합 특이성, 결합 친화성, 및 CD100 블로킹 활성)을 파괴하지 않는 이러한 변경은 본원에서 사용되는 관심 항-CD100 항체의 정의에서 그 폴리펩티드 서열을 없애지 않는다.
본 발명은 폴리펩티드 변이체의 제조 및 용도에 대한 실질적인 지침을 제공한다. 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조에서, 당분야의 숙련가는 처연 단백질의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 어떠한 변형이 본 발명의 방법에서 사용되는 약학 조성물의 치료적 활성 성분으로 사용되기 적합한 변이체를 생성시키는지 쉽게 결정할 수 있다.
항-CD100 항체의 불변 영역은 수많은 방식으로 돌연변이되어 이펙터 기능이 변경될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이를 개시하고 있는, 미국 특허 제6,737,056B1호 및 미국 공개 특허 출원 2004/0132101A1을 참조한다.
일정 항-CD100 항체에서, Fc 부분은 당분야에 공지된 기술을 이용해 이펙터 기능이 감소되도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점돌연변이 또는 다른 수단에 의함)은 순환하는 개질 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 국재화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에서, 본 발명과 일관되는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시키고 그에 따라 접합된 세포독소의 혈청 반감기와 비특이적 회합성을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또 다른 변형을 이용하여 이황화 결합 또는 올리고사카라이드 모이어티를 개질시켜 항원 특이성 또는 항체 가요성 증가에 의한 국재화 증가가 가능해질 수 있다. 개질에 의해 최종 생리적 프로파일, 생체이용성 및 다른 생화학적 효과, 예컨대 종양 국재화, 생체분포성 및 혈청 반감기는 과도한 실험없이 공지된 면역학적 기술을 이용해 측정하고 정량할 수 있다.
본 발명의 항-CD100 항체는 예를 들어, 공유 부착이 동족 에피토프에 항체가 특이적으로 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 임의 유형의 분자를 공유 부착시켜 개질된 유도체를 포함한다. 예를 들면, 제한없이, 항체 유도체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/블로킹 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 결합에 의해 개질된 항체를 포함한다. 임의의 수많은 화학적 개질이 제한없이, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포밀화 등을 포함하는, 공지 기술에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 1 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 유사 전하의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이서류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타분지형 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 다르게, 돌연변이를, 예컨대 포화 돌연변이유발법을 통해 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위적으로 도입시킬 수 있고, 얻어진 돌연변이체는 활성(예를 들어, 항-CD100 폴리펩티드에 결합하는 능력)을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
예를 들면, 항체 분자의 프레임워크 영역에만 또는 CDR 영역에만 돌연변이를 도입시키는 것이 가능하다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중화 미스센스 돌연변이일 수 있으며, 다시 말해, 항원에 결합하는 항체의 능력에 영향이 거의 없거나 또는 전혀 없을 수 있다. 이러한 유형의 돌연변이는 코돈 용법을 최적화시키는데 유용하거나, 또는 하이브리도마 항체 생성을 개성시키는데 유용할 수 있다. 다르게, 비중화 미스센스 돌연변이는 항원에 결합하는 항체 능력을 변화시킬 수 있다. 대부분의 침묵 및 중화 미스센스 돌연변이의 위치는 프레임워크 영역에 존재하는 경향이 있고, 반면 대부분의 비중화 미스센스 돌연변이의 위치는 CDR에 존재할 수 있지만, 절대적인 요건은 아니다. 당분야의 숙련가는 예컨대 항원 결합 활성의 무변경 또는 결합 활성의 변경(예를 들어, 항원 결합 활성의 개선 또는 항체 특이성 변화 등) 등과 같이 원하는 특성을 갖는 돌연변이체 분자를 디자인하고 테스트할 수 있다. 돌연변이유발 이후, 코딩된 단백질은 통상적으로 발현될 수 있고 코딩된 단백질의 기능 및/또는 생물학적 활성(예를 들어, CD100 폴리펩티드의 1 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)은 본원에 기술된 기술을 이용해 또는 당분야에 공지된 기술을 통상적으로 변형하여 확인할 수 있다.
일정 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 항체는 1 이상의 최적화된 상보성-결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화 CDR"은 CDR이, 최적화된 CDR을 포함하는 항-CD100 항체에 부여되는 항-CD100 활성 및/또는 유지 또는 개선된 결합 친화도를 기초로 선별된 서열이 개질되고 최적화되는 것을 의미하는 것이다. "항-CD100 활성" 또는 "CD100 블로킹 활성"은 CD100과 관련되 하기 활성 중 1 이상을 조정한 활성을 포함할 수 있다: B 세포 활성화, 응집 및 생존; CD40-유도된 증식 및 항체 생성; T 세포 의존적 항원에 대한 항체 반응; T 세포 또는 다른 면역 세포 증식; 수지상 세포 성숙화; 탈수초 및 축삭 변성; 만능성 신경 전구체 및/또는 희소돌기아교세포의 아폽토시스; 내피 세포 이동성 유도; 자발적 단핵구 이동 억제; 세포 표면 플렉신 B1과의 결합; 또는 CD100+ 세포의 표면 상에 발현되는 CD100 또는 가용성 CD100과 관련된 임의의 다른 활성. 항-CD100 활성은 또한 제한없이, 임의 유형의 림프종, 자가면역성 질환, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계(PNS) 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환, 이식 거부, 및 침습성 혈관생성을 포함하여, CD100 발현과 연관된 질환의 중증도 또는 발병도를 감소시키는데 기여할 수 있다. 쥐 항-CD100 MAbs BD16 및 BB18을 기초로하는 최적화 항체의 예가 미국 공개 특허 출원 2008/0219971 A1, 국제 공개 특허 출원 WO 93/14125 및 [Herold et al., Int . Immunol . 7(1): 1-8 (1995)]에 기술되어 있으며, 이들을 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다. 개질은 항-CD100 항체가 CD100 항원에 대한 특이성을 보유하고, 항체 친화도가 개선되고/되거나 항-CD100 활성이 개선되도록 CDR 내 아미노산 잔기를 치환시키는 것을 포함할 수 있다.
IV. 항-CD100 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 1 이상은 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 VH 도메인의 CDR 중 1 이상은 (a) 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3으로 이루어진 군에서 선택된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 서열번호 9 또는 서열번호 10을 포함하는 기준 VH 도메인 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CD100 항체는 특이적으로 또는 우선적으로 CD100에 결합한다.
일 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 1 이상은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역글로불린 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 VL 도메인의 CDR 중 1 이상은 (a) 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3로 이루어진 군에서 선택된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 서열번호 17 또는 서열번호 18을 포함하는 기준 VL 도메인 폴레핍티드와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어지는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-CD100 항체는 특이적으로 또는 우선적으로 CD100에 결합한다.
상기 기술된 임의의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 분비를 지정하는 신호 펩티드, 본원에 기술된 바와 같은 항체 불변 영역, 또는 본원에 기술된 바와 같은 다른 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 추가 핵산을 더 포함할 수 있다. 본원의 다른 부분에서 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오티드 중 1 이상을 포함하는 조성물을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 포함하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술한 바와 같은 VH 도메인을 코딩하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 VL 도메인을 코딩한다. 구체적으로, 서열번호 19 또는 서열번호 20에 기재된 바와 같은, VH 도메인 코딩 폴리뉴클레오티드, 및 VL 도메인 코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 서열번호 21 또는 서열번호 22에 기재된 바와 같은 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함한다. 부가적으로, 본원에 기술된 바와 같은 융합 폴리뉴클레오티드, Fab 단편, 및 다른 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 본 발명에포함시킨다.
폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지인 임의의 방법으로 생성 또는 제작될 수 있다. 예를 들면, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지이면, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 어셈블리할 수 있는데(예를 들어, [Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242 (1994)] 참조), 간략하게, 항체를 코딩하는 서열 부분을 포함하는 중첩된 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이들 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 결찰한 후 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR을 통해 증폭시키는 것을 포함한다.
다르게, 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 공급원 유래의 핵산으로부터 생성시킬 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산 함유 클론이 입수가능하지 않지만, 항체 분자의 서열이 알려져 있으면, 항체 코딩 핵산은 화학적으로 합성하거나 또는 적절한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체 또는 항-CD100 항체를 발현하는 임의 조직 또는 세포, 예컨대 항체 발현에 대해 선별된 하이브리도마로부터 생성된, cDNA 라이브러리, 또는 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용해 PCR을 통해 증폭시키거나 또는 예를 들어 항체 또는 다른 항-CD100 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리 유래 cDNA 클론을 찾기 위한 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 클로닝함으로써 얻어질 수 있다. PCR로 생성된 증폭 핵산을 이후 당분야에 공지된 임의 방법을 이용해 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝시킬 수 있다.
항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 뉴클레오티드 서열 및 해당 아미노산 서열이 결정되면, 그 뉴클레오티드 서열은 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하도록, 예를 들면, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성하도록, 뉴클레오티드 서열의 조작에 대해 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발법, PCR 등(예를 들면, 이하 문헌에 기술된 기술들: Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, NY), 이들 문헌을 전체로 참조하여 본원에 포함시킴)을 사용해 조작될 수 있다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 미개질 RNA 또는 DAN 또는 개질 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항-CD100 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일가닥 및 이중가닥 DNA, 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 RNA, 및 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일가닥 또는 보다 전형적으로, 이중가닥이거나 또는 단일가닥과 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자을 포함할 수 있다. 또한, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 포함하는 삼중가닥 영역을 포함할 수 있다. 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 1 이상의 개질된 염기 또는 안정성이나 다른 이유로 개질된 DNA 또는 RNA 백본을 포함할 수 있다. "개질된" 염기는, 예를 들면 트리틸화된 염기 및 흔치않은 염기 예컨대 이노신을 포함한다. 다양한 개질을 DNA 및 RNA에 가할 수 있고; 따라서, "폴리뉴클레오티드"는 화학적, 효소적 또는 물질대사적 개질 형태를 포함한다.
면역글로불린(예를 들어, 면역글로불린 중쇄부 또는 경쇄부)에서 유래된 폴리펩티드의 비천연 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질에 도입되도록 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열에 1 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입하여 생성시킬 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개 돌연변이유발법을 통해 도입될 수 있다. 바람직하게, 보존적 아미노산 치환은 1 이상의 불필수 아미노산 잔기에 실시된다.
V. 융합 단백질 및 항체 접합체
본원에서 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 추가로 N 또는 C 말단에서 이종성 폴리펩티드에 재조합적으로 융합되거나 또는 폴리펩티드 또는 다른 조성물에 화학적으로 추가로 접합(공유 및 비공유 접합 포함)될 수 있다. 예를 들면, 항-CD100 항체는 검출 분석에서 표지로 유용한 분자 및 이펙터 분자 예컨대 이종성 폴리펩티드, 약물, 방사성핵종 또는 독소에 재조합적으로 융합되거나 또는 접합될 수 있다. 예를 들어, PCT 공개특허출원 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 396,387를 참조한다.
본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 즉, 공유 결합이 항-CD100에 항체 결합을 저해하지 않도록 항체에 임의 유형의 분자를 공유 결합시켜 개질된 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제한없이, 항체 유도체는 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/블로킹 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등에 의해 개질된 항체를 포함한다. 임의의 수많은 화학적 개질이 공지의 기술에 의해 수행될 수 있는데, 제한없이, 특이적 화학 절단, 아세틸화, 포밀화 등이 포함된다. 추가적으로, 유도체는 1 이상의 비고전적 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합, 즉 펩티드 이소스테르에 의해 서로 연결된 아미노산을 포함할 수 있고, 20개 유전자 코딩 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 항-CD100 항체는 천연 프로세스, 예컨대 번역후 프로세스에 의해, 또는 당분야에 공지된 화학적 개질법에 의해 개질될 수 있다. 이러한 개질은 교과서에 잘 기술되어 있고, 보다 상세한 논문과 방대한 연구 문헌에 기술되어 있다. 개질은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단, 또는 탄수화물 등의 모이어티를 포함하여, 항-CD100 결합 분자의 어디에서는 존재할 수 있다. 동일 유형의 개질이 동일하거나 또는 다양한 정도로 주어진 항-CD100 결합 분자의 몇몇 부위에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 소정 항-CD100 결합 분자는 많은 유형의 개질을 함유할 수 있다. 항-CD100 결합 분자는 유비퀴틴화 결과로서, 분지형이 될 수도 있고, 분지가 있거나 또는 없이 환형일 수도 있다. 환형, 분지형, 및 분지 환형 항-CD100 결합 분자는 번역후 천연 프로세스에 의해 생성되거나 또는 합성법에 의해 생성될 수 있다. 개질은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 가교결합, 고리화, 이황화결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포밀화, 감마카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, PEG화, 단백질가수분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 tRNA 매개 아미노산 부가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화를 포함한다(예를 들어, Proteins--Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins(Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al., Meth . Enzymol . 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NY Acad . Sci . 663:48-62 (1992)를 참조한다).
본 발명은 또한, 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체, 및 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 항체가 융합되는 이종성 폴리펩티드는 기능에 유용하거나 또는 항-CD100 폴리펩티드 발현 세포를 표적화하는데 유용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 본 발명의 항체의 VH 도메인의 어느 1 이상의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 VL 도메인의 어느 1 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나 또는 이루어진다.
다른 구체예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질은 항-CD100 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 VH 도메인의 CDR 중 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열, 또는 항-CD100 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 VL 도메인의 CDR 중 어느 1, 2, 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함하거나, 그로 실질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다. 일 구체예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항-CD100 항체의 1 이상의 VH 도메인의 아미노산 서열 및 본 발명의 항-CD100 항체 또는 그의 단편, 유도체 또는 변이체의 1 이상의 VL 도메인의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 융합 단백질의 VH 및 VL 도메인은 CD100의 1 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항-CD100 항체의 VH 도메인의 CDR 중 어느 1, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 서열 및 항-CD100 항체, 또는 그의 단편 또는 변이체의 VL 도메인의 CDR 중 어느 1, 2, 3 또는 그 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 이종성 폴리펩티드 서열을 포함한다. 바람직하게, VH 도메인 또는 VL 도메인의 CDR(들) 중 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상은 본 발명의 단일 공급원 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 상응한다. 이들 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자들도 역시 본원에 포함된다.
문헌에 보고된 예시적인 융합 단백질은 T 세포 수용체(Gascoigne et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol . USA 9:347-353 (1990); 및 Byrn et al., Nature 344:667-670(1990)); L-셀렉틴(호밍 수용체)(Watson et al., J. Cell. Biol . 110:2221-2229 (1990); and Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 및 B7(Linsley et al., J. Exp . Med . 173:721-730 (1991)); CTLA-4(Lisley et al., J. Exp . Med . 174:561-569 (1991)); CD22(Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); TNF 수용체(Ashkenazi et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur . J. Immunol . 27:2883-2886 (1991); 및 Peppel et al., J. Exp . Med . 174:1483-1489 (1991)); 및 IgE 수용체(Ridgway and Gorman, J. 세포. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))의 융합체를 포함한다.
본원 기술한 바와 같이, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 당분야에 공지된 방법을 이용해 면역분석에 사용하기 위해 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기를 증가시키기 위해 이종성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, PEG를 본 발명의 항-CD100 항체에 접합시켜 그 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, [Leong et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); 또는 Weir et al., Biochem . Soc . Transactions 30:512 (2002)]를 참조한다.
또한, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 이들의 정제 또는 검출이 용이하도록 마커 서열, 예컨대 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 많은 시판물 중에서, pQE 벡터에 제공되는 태그(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)이다. [Gentz et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:821-824 (1989)]에 기술된 바와 같이, 예를 들여, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 위해 제공된다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) 및 "flag" 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
융합 단백질은 당분야에 공지된 방법을 이용해 제조할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,116,964호 및 제5,225,538호 참조). 융합이 이루어지는 상세한 부위는 융합 단백질의 결합 특징이나 분비를 최적화하기 위해 실증적으로 선택될 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 이후 발현용 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다.
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 비접합 형태로 사용되거나 또는 예를 들어 분자의 치료 특성을 개선시키거나, 표적 검출을 용이하게 하거나 또는 영상화 또는 환자의 치료를 위해 다양한 분자 중 1 이상에 접합될 수 있다. 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 정제 전이나 후에, 또는 정제 수행시에 표지되거나 접합될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료제, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약학 제제(agent), 또는 PEG에 접합될 수 있다.
당분야의 숙련가는 접합체가 또한 접합하려고 선택된 제제에 따라 다양한 기술을 이용해 어셈블리될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 비오틴과의 접합체는 예를 들어, 결합 폴리펩티드를 비오틴의 활성화된 에스테르, 예컨대 비오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시켜 제조된다. 유사하게, 형광발광 마커와의 접합체는 커플링제, 예를 들어 본원에 열거된 것들 존재 하에, 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네이트를 반응시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 접합체는 유사한 방식으로 제조된다.
본 발명은 또한 진단제 또는 치료제에 접합된, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 그의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체를 포함하여, 항-CD100 항체는 예를 들어, 소정 치료 및/또는 예방 계획의 효능을 결정하기 위한, 예를 들면 임상 검사 절차의 일부로서 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 검출은 검출가능한 물질에 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 커플링시켜 용이해 질 수 있다. 검출가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결분자단, 형광발광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 포지트론 방출 단층촬영을 이용하는 포지트론 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온이 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 진단제로서 사용하기 위한 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온에 대해 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적절한 효소의 예에는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아체, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 포함된다; 보결분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함된다; 적절한 형광발광 물질의 예에는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린이 포함된다; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함된다; 생물발광 물질의 예에는 루시페라아제, 루시페린, 및 애쿠오린이 포함된다; 적절한 방사성 물질의 예에는 125I, 131I, 111In, 90Y, 또는 99Tc가 포함된다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료 모이어티 예컨대 세포독소, 치료제 또는 방사능 금속 이온에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 유해한 임의 제제를 포함한다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 이를 화학발광 화합물에 커플링시켜 검출가능하게 표지시킬 수 있다. 화학발광-태깅된 항-CD100 결합 분자의 존재는 화학 반응 동안 발생하는 발광 존재를 검출하여 확인된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예에는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 포함된다.
항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 검출가능하게 표지시킬 수 있는 방법 중 하나는 이들을 효소에 연결시키고 효소 면역분석(EIA) 중 연결 생성물을 이용하는 것에 의한다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978); Voller et al., J. Clin . Pathol . 31:507-520 (1978); Butler, Meth . Enzymol . 73:482-523 (1981); Maggio, ed. (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay (Kgaku Shoin, Tokyo). 항-CD100 항체에 결합된 효소는 예를 들면, 분광측색법, 형광측정법 또는 육안 수단에 의해 검출할 수 있는 화학 모이어티가 생성되는 방식으로, 적절한 기질, 바람직하게는 발색 기질과 반응하게 된다. 항체를 검출가능하게 표지하는데 사용할 수 있는 효소는 말레이트 데히드로게나아제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알콜 데히드로게나아제, 알파-글리세로포스페이트, 데히드로게나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아네, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 부가적으로, 검출은 효소에 대한 발색 기질을 적용하는 비색분석법을 통해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준물과 비교하여 기질의 효소 반응 정도의 육안 비교를 통해 수행될 수도 있다.
검출은 또한 임의의 다양한 다른 면역분석법을 이용해 수행될 수 있다. 예를 들면, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 방사능 표지하여, 방사성면역분석(RIA)을 사용하여 결합 분자를 검출하는 것이 가능하다(예를 들면, [Weintraub(March, 1986) Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques(The Endocrine Society)]를 참조하며, 본원에 참조하여 이를 포함시킴). 방사성 동위원소는, 감마 계측기, 섬광계측기, 또는 오토래디오그래피를 포함하는 수단으로 검출할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 또한 형광발광 금속 예컨대 152Eu, 또는 다른 란탄계열의 것들을 이용해 검출가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 이러한 금속 킬레이팅 기 예컨대 디에틸렌트리아민페나아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)를 이용해 결합 분자에 부착시킬 수 있다.
항체(예를 들어, 항-CD100 항체), 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 접합시키는 기술은 당분야에 공지이며, 예를 들어 이하 문헌들을 참조한다: Amon et al. (1985) "Monoclonal for Immunotargeting of Drugs in 암 Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antobodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antobody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985); and Thorpe et al. (1982) "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibodies-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:119-58.
VI. 항체 폴리펩티드의 발현
항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열은 공지 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 이용해, 동시에 또는 개별적으로 제조될 수 있다. PCR은 공통 불변 영역 프라이머 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기초로하는 보다 특이적인 프라이머를 통해 개시될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 경우에서 라이브러리는 공통 프라이머 또는 보다 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다.
DNA, 대체로 플라스미드 DNA는 당분야 공지된 기술을 이용해 세포로부터 단리되고, 예를 들어, 재조합 DNA 기술과 관련된 상기 참조문헌 들에 상세히 기술된 바와 같은 공지의 표준 방법에 따라 제한효소 지도화하고 서열분석될 수 있다. 물론, DNA는 단리 과정이나 후속 분석 동안 임의 시점에 본 발명에 따라 합성될 수도 있다.
본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제공하기 위해 단리된 유전 물질을 조작한 후, 항-CD100 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 대체로 원하는 양의 항-CD100 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포에 도입시키기 위한 발현 벡터에 삽입된다.
항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체, 예를 들어 본원에 기술된 표적 분자, 예를 들어 CD100에 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 제작을 필요로 한다. 본 발명의 항체 분자 또는 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 일부(바람직하게 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인을 포함함)가 얻어지면, 항체 분자의 생산을 위한 벡터는 당분야에 공지된 기술을 이용해 재조합 DNA 기술을 통해 생성될 수 있다. 따라서, 항체 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것에 의한 단백질의 제조 방법을 본원에 기술한다. 당분야의 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사와 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성법, 및 생체 내 유전자 재조합법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 프로모터에 작동적으로 연결된, 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어, PCT 공개 특허 출원 WO 86/05807; PCT 공개특허 출원 WO 89/01036; 미국 특허 제5,122,464호 참조) 항체의 가변 도메인이 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위해 그러한 벡터에 클로닝될 수 있다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포에 원하는 유전자를 도입하고 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에 따라 사용되는 벡터를 의미하기 위해 사용된다. 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군에서 쉽게 선택할 수 있다. 대체로, 본 발명에 적합한 벡터는 선별 마커, 목적 유전자의 클로닝을 용이하도록 적절한 제한효소 부위 및 진핵생물 또는 원핵생물 세포로의 진입능 및/또는 복제능을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 수많은 발현 벡터 시스템이 적용될 수 있다. 예를 들면, 벡터 클래스 중 하나는 동물 바이러스 예컨대 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스에서 유래된 DNA 성분을 활용한다. 다른 것든 내부 리보솜 결합 부위가 있는 폴리시스트론 시스템을 이용하는 것을 포함한다. 부가적으로, DNA를 그들 염색체에 통합시키는 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 1 이상의 마커를 도입시켜 선별될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 독립영양성, 생명파괴제 내성(예를 들어, 항생제) 또는 중금속 예컨대 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현하려는 DNA 서열에 직접 연결시키거나 또는 공동형질전환에 의해 동일 세포에 도입시킬 수 있다. 부가적인 성분들이 또한 mRNA의 최적 합성을 위해 필요할 수 있다. 이들 성분들은 신호 서열, 스플라이싱 신호와 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 구체예예서, 크로닝된 가변 영역 유전자는 상기 기술된 바와 같이 합성된 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게, 인간)과 함께 발현 벡터에 삽입된다. 물론, 진핵생물 세포에서 발현을 유발할 수 있는 임의의 발현 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 적절한 벡터의 예로는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF 1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen에서 판매, 캘리포니아주, 샌프란시스코 소재), 및 플라스미드 pCI(Promega에서 판매, 위스콘신주, 매디슨 소재)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 대체로,면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 적절하게 고수준으로 발현하는 대량의 형질전환 세포를 스크리닝하는 것은, 예를 들어 로봇식 시스템에 의해 수행할 수 있는 일상적 실험이다.
보다 일반적으로, 항-CD100 항체의 단량체 서브유닛을 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 준비되면, 그 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 숙주 세포로 플라스미드의 도입은 당분야의 숙련가에게 공지인 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 이들에는 형질감염법(전기영동 및 전기천공), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로핑된 DNA와 세포 융합, 미세주입법, 온전한 바이러스를 이용한 감염법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, [Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vectors" in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt(Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472]를 참조한다. 대체로, 숙주 세포로 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 실시된다. 발현 컨스트럭트를 보유하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 생성에 적절한 조건 하에 성장시키고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석법은 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA), 방사성면역분석법(RIA), 또는 형광발광-활성화 세포 분류 분석법(FACS), 면역조직화학분석법 등을 포함한다.
발현 벡터는 통상의 기술에 의해 숙주 세포에 전달되고, 형질감염된 세포는 이후 통상의 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생성한다. 따라서, 본 발명은 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된, 본 발명의 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다. 이중쇄 항체의 발현에 바람직한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 둘 모두를 코딩하는 벡터가, 이하 기술되는 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위한 숙주 세포에서 공동발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 이용해 제작되고 1 이상의 이종성 유전자를 코딩하는 벡터를 보유하는 세포를 의미한다. 재조합 숙주로부터 항체를 단리하는 방법에 대한 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명백하게 한정하지 않으면 항체 공급원을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 다른 말로, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 원심분리한 전체 세포, 또는 배지 및 부유 세포 둘 모두를 포함하는 세포 배양물에서를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현하는데 이용할 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 목적 코딩 서열을 생성하고 이후 정제하는 비히클을 의미할 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염시, 본 발명의 항체 분자를 인 시츄 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 이들에는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물 예컨대 박테리아(예를 들어, 이.콜라이(E. coli), 비.서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈에서 유래하는 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 벡터 컨스트럭트를 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게, 박테리아 세포 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 및 보다 바람직하게는, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 진핵생물 세포가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들면, 포유동물 세포 예컨대 중국 햄스터 난소 세포(CHO)와, 벡터 예컨대 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 주요 최초기 유전자 프로모터 성분이 효과적인 항체 발현 시스템이다(Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 흔히 포유동물 기원이다; 당분야의 숙련가는 발현시키려는 목적 유전자 생성물에 최고로 적합한 특정 숙주 세포를 우선적으로 결정할 수 있는 능력이 있다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR minus), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), VERY, BHK(어린 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 숙주 세포주는 대체로 상업적 서비스, 미국 균주 보관소 또는 공개 문헌에서 입수가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 개질 및 프로세싱하는 숙주 세포 세포종이 선택될 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 개질(예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 단백질 및 유전자 생성물의 번역후 프로세싱 및 개질에 대해 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 올바른 개질 및 프로세싱이 보장되는 것을 선택할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유전자 산물의 1차 전사체, 글리코실화 및 인산화의 적절한 프로세싱을 위한 세포 기전을 보유한 진핵생물 숙주 세포를 사용할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간, 고수율로 생성하기 위해, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기 원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 성분(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어되는 DNA, 및 선별 마커에 의해 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 농축 배지에서 1-2일간 성장시킨 후, 선별 배지로 전환시킬 수 있다. 재조합 플라스미드 내 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고 세포가 그들의 염색체에 플라스미드를 안정하게 통합시키도록 하고 이후에 클로닝할 수 있고 세포주로 증식시킬 수 있는 세포물(foci)을 형성하도록 성장할 수 있게 한다. 이러한 방법은 항체 분자를 안정한 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다.
각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에 적용할 수 있는 유전자인, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타이미딘 키나아제(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Szybalska and Szybalski, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Lowy et al., Cell 22:817 (1980))를 포함하는, 많은 선별 시스템을 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 항대사물질 내성을 이하 유전자에 대한 선별 기반으로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., Natl . Acad . Sci . USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan and Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem . 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993); 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., Gene 30:147 (1984). M사용할 수 있는 재조합 DNA 방법에 대해 당분야에서 통용되는 방법은 이하 문헌을 참조하며, 이들 문헌을 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다: Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다(예를 들어, 이하 문헌 참조: Bebbington and Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) Vol. 3). 항체 발현 벡터 시스템의 마커가 증폭가능할 때, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킨다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련있으므로, 항체의 생성이 또한 증가한다(Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
시험관 내 생성은 목적 폴리펩티드을 대량으로 제공하도록 규모를 증가시킬 수 있다. 조직 배양 조건 하의 포유동물 세포 배양법은 당분야에 공지이고, 예를 들어, 에어리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁 배양법, 또는 예를 들어 중공 섬유, 미세캡슐에, 아가로스 미세비드 또는 세라믹 카트리지 상에서, 고정 또는 포획 세포 배양법을 포함한다. 필요하고/하거나 바람직한 경우, 폴리펩티드 용액은, 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선 생합성 후, 또는 본원에 기술된 HIC 크로마토그래피 단계 이후에, 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀루로스 상의 크로마토그래피 또는 (면역)친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 유전자는 또한 비포유동물 세포 예컨대 곤충, 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 흡수하는 박테리아는 엔테로박테리아과(enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella); 바실러스과(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 종들의 구성원을 포함한다. 박테리아에서 발현시, 이종성 폴리펩티드대체로 봉입체이 일부가 될 수 있다는 것을 더욱 이해한다. 이종성 폴리펩티드는 단리되고, 정제된 후 기능성 분자로 어셈블리되어야만한다. 4가형 항체가 바람직한 경우, 서브유닛은 이후 4가 항체로 자가 어셈블리된다(WO 02/096948A2).
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자에 의도하는 용도에 따라 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 항체 분자의 약학 조성물 생성을 위해, 이러한 단백질이 대량 생산되어야 하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물을 고수준으로 발현하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는, 융합 단백질이 생성되도록 항체 코딩 서열이 lacZ 코딩 영역과 인프레임으로 벡터에 개별적으로 결찰되될 수 있는, 이.콜라이 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)); pIN 벡터(Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol . Chem . 24:5503-5509 (1989)) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. pGEX 벡터를 또한 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 대체로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고 매트릭스 글루타티온-아가로스 비스에 흡착 및 결합시킨 후 유리 글루타티온 존재하에서 용리하는 것에 의해 용균 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출되도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하게 디자인된다.
원핵생물 이외에도, 진핵생물 미생물도 사용할 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 베이커 효모가 진핵생물 미생물 중에서 가장 통용되지만, 다수의 다른 종, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)도 이용할 수 있다.
사카로마이세스에서 발현을 위한, 플라스미드 예를 들면 YRp7(Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980))이 통용된다. 이 플라스미드는 이미 TRP1 유전자를 함유하여, 트립토판에서의 성장능이 결여된 돌연변이체 효모종, 예를 들면 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones, Genetics 85:12 (1977))에 대한 선별 마커를 제공한다. 효소 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 영역의 존재는 트립토판 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하는 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자 발현용 벡터로서 전형적으로 사용된다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 이 바이러스의 불필수 영역(예를 들면, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되어 AcNPV 프로모터(예를 들면, 폴리헤드린 프로모터) 제어 하에 위치할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합적으로 발현되면, 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당분야에 공지된 임의 방법, 예를 들어 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특이적 항원에 대한 친화도에 의한 것, 및 크기화 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 가용성에 의해, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준법에 의해 정제될 수 있다. 다르게, 본 발명의 항체의 친화도를 증가시키는 바람직한 방법이 미국 공개 특허 출원 제2002 0123057 A1호에 개시되어 있다.
VII. 치료적 항-CD100 항체를 이용한 치료 방법
본 발명의 방법은 CD100 발현 세포 상에 발현되거나 또는 그로부터 분비되는 가용성 CD100과 연관된 질환을 갖는 환자를 치료하기 위한, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 그 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체를 포함하는, 항체의 용도에 관한 것이다. "CD100-발현 세포"는 CD100 항원을 발현하는 정상 및 악성 세포를 의미한다. 세포에서 CD100 발현을 검출하는 방법은 당분야에 공지이고, PCR 방법, 면역조직화학법, 유세포측정법, 웨스턴 블랏법, ELISA 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 설명이 본 발명의 항-CD100 항체를 이용하여 다양한 질환 및 질병을 진단하고 치료하는 방법에 관한 것이지만, 본원에 기술된 방법은 또한 본 발명의 항-CD100 항체의 목적 특성, 예를 들어, 특이적으로 CD100, 예를 들어, 인간, 마우스, 또는 인간과 마우스 CD100에 특이적으로 결합할 수 있고, CD100 중화 활성을 갖는 등의 특성을 보유한 이들 항-CD100 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체에도 적용된다.
일 구체예에서, 치료는 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 환자에게 적용 또는 투여하는 것, 또는 항-CD100 결합 분자를 환자에서 단리된 조직 또는 세포주에 적용 또는 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 대한 소인이 있다. 다른 구체예에서, 치료는 또한 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 환자에게 적용 또는 투여하는 것, 또는 환자에서 단리된 조직 또는 세포주에 항-CD100 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 포함하고, 상기 환자는 질환, 질환 증상, 또는 질환에 대한 소인을 갖는다.
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편은 다양한 악성 및 비악성 종양의 치료에 유용하다. "항-종양 활성"은 약성 CD100-발현 세포의 증식이나 축적 속도가 저하되어서, 그러한 이유로 요법 동안 발생되는 종양에서의 또는 현존 종양의 성장률 감소, 및/또는 현존 신생물(종양) 세포 또는 새롭게 형성된 신생물 세포가 파괴되어, 그에 따라 요법 동안 종양의 전체 크기가 감소되는 것을 의미한다. 예를 들면, 1 이상의 항-CD100 항체를 이용한 요법은, 인간에서 CD100 발현 세포와 연관된 질환 상태의 치료에 유리한, 생리적 반응, 예를 들면 혈관생성 감소를 일으킨다.
일 구체예에서, 본 발명은 약물로서의 사용, 구체적으로 암의 치료 또는 예방에서의 사용 또는 전암성 병태 또는 병변에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이다. 일정 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 결합 그의 단편은 CD100 과발현 암의 치료에 사용된다. 일정 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 결합 그의 단편은 CD100 과발현 두경부 또는 결장 암의 치료에 사용된다.
또한, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 결합 단편은 또한 종양 발생 또는 황반 변성을 포함하는, 신생 혈관 형성에 의존적인 병리학적 병태의 치료를 위해 혈관생성을 억제하는데 사용될 수 있다. 혈관생성은 혈관 리모델링의 주요 결정인자에 의해 자극된, 내피 세포가 그들의 세포 대 세포 및 세포 대 매트릭스 접촉을 역동적으로 변형시키고 성숙한 혈관 트리로 재조직화되도록 방향있게 이동하는 동안의 복합 다단계적인 형태발생적 사건이다(Bussolino et al., Trends Biochem Sci . 22:251-256 (1997); Risau, Nature 386:671-674 (1997); Jain, Nat. Med . 9:685-693 (2003)). 새로운 혈관의 형성은 배아 발생 동안의 핵심 단계이지만, 또한 성인에서도 망막증, 류마티즘성 관절염, 허혈증, 특히 종양 성장과 전이 등과 같은 생리적 상태 및 병적 상태에서 발생된다(Carmeliet, Nat. Med . 9:653-660 (2003)). 이러한 신생 혈관의 병적 형성을 "침습성 혈관생성"이라고 한다. [Basile et al., PNAS 103(24):9017-9022 (2006))]에서는 HNSCC 세포로부터 쉐딩될 때, CD100가 내피 세포 이동을 자극하며, 이는 C100-블로킹 항체 및 CD100 넉다운에 의해 저해되었음을 보여주고 있다. CD100 과발현이 또한 전립선, 결장, 유방, 및 폐암에서 확인되었고, 이러한 결과는 CD100 발현은 다양한 암종이 혈관생성을 촉진할 수 있는 전략에 빈번하게 이용됨을 시사한다.
본 발명의 방법에 따라, 본원에서 정의된 바와 같은, 1 이상의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 악성 인간 세포에 대해 긍정적 치료 반응을 촉진시키는데 사용된다. 암치료에서의 "긍정적 치료 반응"은 이들 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 단편의 항종양 활성화 연관된 질환의 호전, 및/또는 질환과 연관된 증상의 호전을 의미하는 것이다. 즉, 항증식 효능, 추가적인 종양 과성장 저해, 종양 크기 감소, 종양 혈관구조 감소, 암세포수 감소, 및/또는 질환과 연관된 1 이상의 증상 감소가 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 질환의 호전은 완전한 반응으로서 특징될 수 있다. "완전한 반응"은 이전의 임의의 비정상적 방사선 투과 실험, 골수, 및 뇌척수액(CSF)이 정상화되고, 임상적으로 검출되는 질환이 없는 것이다. 이러한 반응은 본 발명의 방법에 따른 치료 후 1개월 동안 지속되어야 한다. 다르게, 질환의 호전은 부분 반응으로 분류될 수 있다. "부분 반응"은 1 개월 이상 동안 지속되고 새로운 병변 없이 모든 측정가능한 종양 존재량(즉, 피험체에 존재하는 종양 세포의 수)이 적어도 50% 감소한 것이다. 이러한 반응은 측정가능한 종양에만 적용된다.
종양 반응은 스크리닝 방법 예컨대 생물발광 영상법, 예를 들면, 루시페라아제 영상법, 뼈 스캔 영상법, 골수천자(BMA)를 포함한 종양 생검 샘플링법을 이용하여 종양 형태(즉, 전체적인 종양 존재량, 종양 세포 계측 등) 변화에 대해 평가될 수 있다. 이들 긍정적 치료 반응이외에도, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 요법을 겪은 피험체는 질환과 연관된 증상이 호전되는 이로운 효과를 경험할 수 있다. 예를 들면, 피험체는 소위 B 증상, 예를 들어, 도한, 발열, 체중 감량 및/또는 두드러기 등이 줄어드는 경험을 할 수 있다.
본원에 기술된, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 CD100 발현 세포와 연관된 염증성 질환 및 면역계 결핍증 또는 장애를 치료하는데서 그 용도를 확인할 수 있다. 염증성 질환은 염증 및 조직 파괴, 또는 이의 조합을 특징으로 한다. "항염증 활성"은 염증의 감소 또는 예방을 의미한다. "염증성 질환"은 면역 반응의 개시 사건 또는 표적이 예를 들면, 동종 항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 미지 항원, 또는 알레르겐을 포함하는, 비자가 항원(들)이 관여되는 임의의 염증성 면역 매개 프로세스를 포함한다. 일 구체예에서, 염증성 질환은 말초 또는 중추 신경계의 염증성 질환이다. 다른 구체예에서, 염증성 질환은 관절의 염증성 질환이다.
또한, 본 발명의 목적을 위해, 용어 "염증성 질환(들)"은 "자가면역성 질환(들)"을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "자가면역"은 "자가" 항원이 관여하는 염증성 면역 매개 프로세서를 포함하는 것으로 이해된다. 자가면역성 질환에서, 자가 항원(들)은 숙주 면역 반응을 촉발시킨다. 자가면역성 질환은 자가 내성의 정상 상태에서 탈선된, 자가 항원(자기항원)에 대해 유도된 부적절한 면역 반응에 의해 발병될 수 있다. 대체로, 세포독성 분자 또는 면역 복합체로서 작용하는, 항체(특히, 제한없이, IgG 항체)는, 대부분 쇠약하게 하거나 또는 생명에 위협이 될 수 있는, 수많은 자가면역성 질환의 주요 매개인자이다.
일 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 다발성 경화증(MS)을 치료하는데 사용된다. 산재성 경화증 또는 뇌척추염 디세미나타(encephalomyelitis disseminata)라고도 알려진 MS는 면역계가 중추신경계를 공격하여, 탈수초를 초래하는 자가면역성 병태이다. 명칭 다발성 경화증은 신경계에 형성된 흉터(경화증은 플라크 또는 병변을 의미함)를 의미한다. MS 병변은 통상 소뇌, 뇌간, 기저핵, 및 척수의 뇌실, 및 시신경에 가까운 백질 영역을 포함한다. MS는 미엘린 시트의 생성 및 유지를 담당하는 세포인 희소돌기아교세포의 파괴를 야기시킨다. MS는 미엘린의 박화 또는 완전 손실을 야기하고, 이 질환이 진행됨에 따라, 절개 축삭이 야기된다.
신경학적 증상은 MS에 따라 다양할 수 있고, 이 질환은 흔히 신체 및 인지 장애로 진행된다. MS는 몇가지 형태를 취하는데, 새로운 증상이 개별적으로 발병(재발형)되거나 또는 시간 경과에 따라 느리게 축적(진행형)되면서 일어날 수 있다. 발병 사이에, 증상이 완전하게 없어질 수 있지만, 특히 질환 진행에 따라 영구적 신경 손상이 초래된다.
본 발명의 항-CD100 단일클론 항체, 예를 들어, MAb 2503, MAb 67 또는 MAb 76을 이용한 CD100의 중화는 몇몇 상이한 기전을 통해 MS의 중증도를 감소시키는데 사용될 수 있는데, 예를 들어 항-CD100 단일클론 항체는 CNS 항원에 대한 2차 면역 반응을 감소시킴으로써 재발률이 감소되도록 CD100에 의한 면역 성숙화 및 활성화를 블로킹할 수 있고, 항-CD100 단일클론 항체는 CNS 내 희소돌기아교세포의 아폽토시스를 매개하는 가용성 C100의 영향을 차단할 수 있고 탈수초를 감소시켜 질환 중증도를 감소시킬 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 관절염을 치료하는데 사용된다. 관절염은 면역계가 관절을 공격하는 자가면역 병태에 의해 초래될 수 있는 관절의 염증성 질환이다. 일정 구체예에서, 관절염은 골관절염, 통풍성 관절염, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 류마티즘성 관절염, 청소년 발병 류마티즘성 관절염, 감염성 관절염, 염증성 관절염, 패혈성 관절염, 퇴행성 관절염, 단절성 관절염, 및 라임 관절염으로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 관절염은 류마티즘성 관절염(RA)이다.
본 발명은 피험체에 항-CD100 본 발명의 결합 분자, 예를 들어, MAb 2503, MAb 67 또는 MAb 76을 피험체에 투여하여 관절염을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 관절염, 예를 들어 류마티즘성 관절염과 연관된 통증, 부종 또는 강직성을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 또한 관절 성능, 기능, 및 건강을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 치료는 관절염 중증도 스코어를 감소시키거나, 관절염 중증도/곡선하 면적을 감소시키거나, 관절염과 연관된 조직병리학적 변수(염증, 판누스, 연골 손상, 및 골손상)를 감소시키거나, 혈청 아라키돈산 수준을 감소시키거나, 또는 항콜라겐 항체를 감소시킨다. 일정 구체예에서, 유리하거나 바람직한 임상 결과는 관절염과 연관된 증상의 완화; 관절염 예방; 관절염 발병 지연; 개체군에서 관절염 발병빈도 감소; 관절염과 연관된 병태 정도 감소; 관절염과 연관된 병태, 질환 또는 질병의 안정화(즉, 악화되지 않음); 관절염과 연관된 질병, 질환 또는 병태의 개시 지연 또는 완화; 검출가능 유무와 무관하게, 관절염과 연관된 병태, 질병 또는 질환의 차도(부분 또는 전체), 질병, 질환 또는 병태의 완화; 또는 관절염과 연관된 병태, 질병 또는 질환의 호전 또는 향상 등의 결과를 이끈다.
본 발명의 방법은 관절염이 있는 개체 또는 관절염 발병 위험성이 잇는 개체에게 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 정상 관절, 경계선상 관절염성 관절, 또는 상당한 관절염성 관절을 갖는 피험체를 치료하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 항-CD100 본 발명의 결합 분자, 예를 들어, MAb 2503, MAb 67 또는 MAb 76을 피험체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 피험체의 남은 생애 동안 만성 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 본원에서 정의된 1 이상의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 자가면역성 질환 및/또는 염증성 질환의 치료 또는 예방에 대한 긍정적 치료 반응을 촉진하는데 사용된다. 자가면역성 질환 및/또는 염증성 질환에 대한 "긍정적 치료 반응"은 이들 항체의 항염증성 활성, 항혈관생성 활성, 항아폽토시스 활성 등과 연관된 질환의 호전, 및/또는 질환과 연관된 증상의 호전을 의미한다. 즉, 항-증식 효과, CD100 발현 세포의 추가적 증식의 예방, 염증성 사이토카인, 부착 분자, 프로테아제, 면역글로불린(예를 들어 CD100 보유 세포가 B 세포인 경우), 이의 조합 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 염증성 반응의 감소, 항염증성 단백질의 생성 증가, 자가반응성 세포수 감소, 면역 내성 증가, 자가반응성 세포 생존 억제, 아폽토시스 감소, 내피 세포 이동 감소, 자발적 단핵구 이동 증가, sCD100 또는 CD100 발현 세포의 자극에 의해 매개되는 1 이상의 증상 감소가 관찰될 수 있다. 이러한 긍정적 치료 반응은 투여 경로에 제한되지않고, 도너, 도너 조직(예컨대 장기 관류), 숙주, 이의 임의 조합 등에의 투여를 포함할 수 있다.
임상 반응은 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출가능한 변화를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 자기공명 영상법(MRI) 스캔, x-방사선촬영 영상법, 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔, 유세포측정 또는 형광발광-활성화 분류(FACS) 분석법, 조직화학법, 육안 병리학, 혈액 화학 등의 스크리닝 방법을 이용해 평가될 수 있다. 이들 긍정적 치료 반응이외에도, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 요법을 겪은 피험체는 질환 연관된 증상이 호전되는 유리한 효과를 경험할 수 있다.
항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 제한없이, 수술 또는 외과적 시술(예를 들어, 비장절제술, 간절제술, 림프절절제술, 류코포레시스 골수 이식 등); 방사선 요법; 자가 골수 이식과 경우에 따라 병용하는 화학요법을 포함하는 1 이상의 다른 암 요법과 병용될 수 있으며; 여기서 부가적인 암 요법제가 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편 요법 전에, 이 동안 또는 이후에 투여된다. 따라서, 병용 요법은 화학요법, 방사선요법, 다른 항암 항체 요법, 소형 분자 기반 암 요법 또는 백신/면역요법 기반 암 요법과 같은 다른 치료제의 투여와 병용하여 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하고, 본 발명의 방법은 개별 제형 또는 단일 약학 제형을 이용한 공동투여, 또는 및 순서대로 연속 투여를 포함한다.
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 결합 단편은 유용하다고 알려지거나, 또는 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 사용되었거나 또는 현재 사용되는 임의 제제 또는 제제의 조합을 포함하는, 자가면역 및 염증성 질환에 대해 알려진 임의 요법과 병용하여 사용될 수 있다. 따라서, 병용 요법은 다른 치료제와의 투여와 병용하여 항-CD100 결합 분자를 투여하는 것을 포함하고, 본 발명의 방법은 개별 제형 또는 단일 약학 제형을 이용한, 공동 투여, 및 임의 순서대로 연속되는 투여를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 항-CD100 항체는 면역억제 약물 또는 항염증 약물과 병용하여 투여되고, 여기서 항체 및 치료제(들)은 임의 순서로, 순차적으로, 또는 동시에(즉, 동시발생적 또는 동일 기간 내) 투여될 수 있다.
일부 다른 구체예예서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 단독으로 또는 면역억제 약물과 병용하여, 류마티즘성 관절염을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD100 항체를 류마티즘성 관절염을 치료하는데 사용하는 일부 구체예에서, 항체는 적절한 면역억제 약물과 병용하여 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 치료 효능은 임의 수단을 이용해 평가할 수 있고 [American College of Rheumatology criteria, the European League of Rheumatism criteria], 또는 임의의 다른 지침에서 정의된 바와 같은 임상 반응의 측정에 따른 효능을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, [Felson et al., Arthritis. Rheum. 38:727-35 (1995) and van Gestel et al., Arthritis Rheum. 39:34-40 (1996)]를 참조한다.
또 다른 구체예예서, 본 발명의 항-CD100 항체는 단독으로 또는 면역억제 약물과 병용하여, 다발성 경화증을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD100 항체가 다발성 경화증을 치료하는데 사용되는 일 구체예에서, 항체는 적절한 면역억제 약물과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 구체예는, 예를 들어, 소정 치료 계획의 효능을 측정하기 위해, 임상 검사 절차의 일부로서 조직에서 단백질 수준을 진단적으로 모니터링하기 위한, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편의 용도이다. 예를 들면, 검출은 검출가능한 물질에 항체를 커플링시켜 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결분자단, 형광발광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적절한 효소의 효소에는 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 포함된다; 적절한 보결분자단 복합체는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함한다; 적절한 형광발광 물질의 예에는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린이 포함된다; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함된다; 생물발광 물질의 예에는 루시페라아제, 루시페린, 및 애쿠오린이 포함된다; 적절한 방사능 물질의 예에는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 포함된다.
VIII. 약학 조성물 및 투여 방법
본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 제조하는 방법 및 이를 필요로하는 피험체에게 투여하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지이고 이들이 쉽게 결정할 수 있다. 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 투여 경로는 예를 들면, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피사, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 이러한 모든 투여의 형태가 명백하게 본 발명의 범주로서 고려되지만, 투여용 형태의 예는 주사, 특히 정맥내 주사용 또는 동맥내 주사용 용액 또는 드립이다. 일반적으로, 주사용으로 적절한 약학 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리솔베이트), 경우에 따라 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 교시된 바와 상용되는 다른 방법에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 부정적인 세포 개체군 부위에 직접 전달되어 치료제에 대한 질환 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
본원에서 기술되는, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 CD100-발현 세포-매개 질환 예컨대 일정 유형의 암, 자가면역성 질환, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계(PNS) 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환, 및 침습성 혈관생성의 생체 내 치료를 위한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이러한 점에서, 본원에 개시된 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하도록 제제화될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는, 무독성, 멸균 담체 예컨대 생리적 염수, 무독성 완충액, 보존제 등을 포함할 수 있다. 본 출원의 목적을 위해, 접합되거나 또는 비접합된, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 약학적 유효량은 표적과의 유효한 결합을 이루기에 충분하며, 또한 예를 들어, 질환 또는 질병의 증상을 완화시키거나 또는 물질이나 세포를 검출하는 혜택을 얻기에 충분한 양을 의미하는 것으로 이해한다.
본 발명에서 사용되는 약학 조성물은 예를 들어, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질 예컨대 포스페이트, 글리신, 솔브산, 칼륨 솔베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌글리콜, 및 양모지를 포함하는, 약학적 허용 담체를 포함한다.
비경구 투여용 조제물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 기름 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 예를 들어, 염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알콜계/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 본 발명에서, 약학적 허용 담체는 0.01-0.1 M, 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충제 또는 0.8% 염수를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 통상의 비경구 비히클은 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링커액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 공급제, 전해질 공급제, 예컨대 링커 덱스트로스를 기반으로 하는 것들 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있는데, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 가스 등이다.
보다 구체적으로, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 주사액 또는 분산액을 즉석에서 준비하기 위한 멸균 용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우, 조성물은 멸균되어야 하고 시린지이용이 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고 바람직하게는 미생물, 예컨대 박테리아와 진균의 오염 작용에 대해 보호된다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면 레시틴 등과 같은 코팅의 이용, 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에 사용하기 적합한 제형은 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)]에 기술되어 있다.
미생물 작용 저해는 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등에 의해 수행될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 솔비톨, 또는 염화 나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 이룰 수 있다.
임의 경우에서, 멸균 주사액은 필요량의 활성 화합물(예를 들어, 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체 자체 또는 다른 활성제와 병용하여)을 본원에 열거된 한 성분 또는 성분의 조합과 적합한 용매에 유입시키고, 필요하다면, 이후 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 대체로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 유입시켜 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균 여과된 그 용액으로부터의 임의의 부가적인 바람직한 성분과 함께 활성 성분의 분말을 산출하는, 진공 건조 및 동결 건조법이다. 주사 조제물은 용기 예컨대 앰풀, 백, 보틀, 시린지 또는 바이알에 충전되어 당분야의 공지 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉된다. 또한, 조제물은 포장되어 예컨대 미국 특허 출원 제09/259,337호 등에 기술된 것과 같은 키트의 형태로 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 바람직하게 관련 조성물이 질환 또는 질병을 앓거나 또는 그에 대한 소인이 있는 피험체를 치료하는데 유용함을 표시한 라벨 또는 포장 삽입물을 구비한다.
비경구 제형은 단일 볼러스 용량, 주입 또는 로딩 볼러스 용량 후 유지 용량일 수 있다. 이들 조성물은 특별하게 고정된 간격 또는 가변 간격, 예를 들어 1일 1회, 또는 "필요에 따른" 기준으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 일정 약학 조성물은 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성현탁액 또는 용액을 포함하는, 허용되는 용량형으로 경구 투여될 수 있다. 일정 약학 조성물은 또한 비내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 조성물은 벤질 알콜 또는 다른 적절한 보존제, 생체이용률 증강을 위한 흡수 촉진제, 및/또는 다른 통상의 가용화제 또는 분산제를 적용하여, 염수 중 용액으로서 제조될 수 있다.
단일 용량형을 제조하기 위해 담체 재료와 배합될 수 있는, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 치료하려는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 수 있다. 조성물은 단일 용량으로서, 복수 용량으로서 또는 확정된 기간 동안 주입법으로 투여될 수 있다. 투약 계획은 또한 최적의 목적 반응(예를 들어, 치료 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 발명의 범주를 유지하면서, 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 치료 효능을 생성하는데 충분한 향으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 공지의 방법에 따라 통상의 약학적 허용 담체 또는 희석제와 본 발명의 항체를 조합하여 제조된 통상의 제형으로 그러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 약학적 허용 담체 또는 희석제의 특징 및 형태는 그와 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 공지의 변수들에 의해 좌우됨을 당분야의 숙련가는 인식할 수 있다. 당분야의 숙련가는 또한 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 1 이상의 종을 포함하는 칵테일이 특히 효과적임을 입증할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"치료 유효 용량 또는 양" 또는 "유효량"은 투여시 치료하려는 질환이 있는 환자의 치료에 대해 긍정적 치료 반응을 일으키는, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 양을 의미한다.
CD100-발현 세포-매개 질환 예컨대 임의 유형의 암, 예를 들면 두경부, 전립선, 결장, 유방 및 폐 암; 자가면역성 질환, 예를 들면 관절염, 다발성 경화증, 중추신경계(CNS) 및 말초 신경계(PNS) 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환; 및 침습성 혈관생성의 치료를 위한, 본 발명의 조성물의 치료 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지 여부, 다른 투여 약물, 및 치료가 예방 또는 치료 목적인지 여부를 포함하는, 다양한 많은 인자에 따라 다양하다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유동물을 포함하여 인간이외의 포유동물도 치료될 수 있다. 치료 용량은 안정성 및 효능을 최적화하는 당분야의 숙련가에게 공지된 통상의 방법을 이용해 적정될 수 있다.
투여되는 1 이상의 항-CD100 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 결합 그의 단편의 양은 본 발명의 개시에 따라 과도한 실험없이 당분야 숙련가가 쉽게 결정한다. 1 이상의 항-CD100 결합 분자, 예를 들면, 항체, 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 개별 양 및 투여 방식에 영향을 주는 인자는 요법을 겪게되는 개체의 질환 중증도, 병력, 및 연령, 신장, 체중, 건강 및 신체 상태를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 유사하게, 투여되는 항-CD100 결합 분자, 예를 들면 항체, 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체의 양은 투여 방식 및 피험체가 이 제제를 단일 용량 또는 복수 용량으로 섭취하는지 여부에 따라 좌우된다.
본 발명은 또한 자가면역성 질환 및/또는 예를 들어 관절염, 다발성 경화증, CNS 및 PNS 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환, 또는 암을 치료하기 위한 약물의 제조에서, 항-CD100 결합 분자, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 자가면역성 질환 및/또는 염증성 질환의 치료, 또는 암의 치료를 위해 피험체를 치료하기 위한 약물의 제조에서, 본 발명의 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 용도를 제공하고, 여기서 약물은 1 이상의 다른 요법으로 사전치료받은 피험체에서 사용된다. "사전치료받은" 또는 "사전치료"는 피험체가 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 투약받기 전에 1 이상의 다른 요법제를 투약받은(예를 들어 1 이상의 다른 암 요법으로 치료받음) 것을 의미한다. "사전치료받은" 또는 "사전치료" 는 항-CD100 결합 분자, 예를 들면, 본원에 개시된 단일클론 항체 2503, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물의 치료를 개시하기 전에, 2년 내, 18개월 이내, 1년 이내, 6개월 이내, 2개월 이내, 6주 이내, 1 개월 이내, 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내, 1주 이내, 6일 이내, 5일 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내, 또는 1일 내에 1 이상의 다른 요법으로 치료된 피험체를 포함한다. 피험체가 사전 요법 또는 요법들로의 사전치료에 대한 반응자였는지가 필수적이지는 않다. 따라서, 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 투약받는 피험체는 이전 요법으로의 사전치료에, 또는 사전치료가 복수 요법제를 포함하는 1 이상의 이전 요법들에 대해 반응했을 수도 있거나, 또는 반응에 실패(예를 들어, 암이 난치성)했을 수도 있다. 항-CD100 결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 포함하는 약물을 투약받기 전에 피험체가 사전치료로 받을 수 있는 다른 암 요법의 예에는 수술; 방사선요법; 자가 골수 이식과 경우에 따라 병용하는, 화학요법(적절한 화학요법제는 본원에서 상기 열거된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않음; 다른 항암 단일클론 항체 요법; 상기 본원에서 열거한 소형 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 소형 분자-기반 암요법; 백신/면역요법-기반 암요법' 스테로이드 요법; 다른 암 요법; 또는 이의 임의 조합이 포함된다.
IX. 진단법
본 발명은 일정 유형의 암, 자가면역성 질환, 예를 들어, 관절염, 다발성 경화증, 중추신경계(CNS) 및 말초신경계(PNS) 염증성 질환을 포함하는 염증성 질환, 및 침습성 혈관생성 등과 같은 CD100-발현 세포-매개 질환의 진단 동안 유용한 진단 방법을 더욱 제공하고, 이 방법은 개체 유래의 조직 또는 다른 세포 또는 체액에서 CD100 단백질 또는 전사체의 발현 수준을 측정하는 단계 및 측정된 발현 수준을 정상 조직 또는 체액의 표준 CD100 발현 수준과 비교하여서, 표준물과 비교시 발현 수준의 증가는 질환을 의미하는 것인 단계를 포함한다.
본 발명의 항-CD100 항체 및 그의 항원-결합 단편, 변이체, 및 유도체는 당분야에 공지된 고전적인 면역조직화학 방법을 이용해 생물학적 샘플 내 CD100 단백질 수준을 분석하는데 사용될 수 있다(예를 들면, [Jalkanen, et al., J. 세포. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)] 참조). CD100 단백질 발현을 검출하는데 유용한 다른 항체 기반 방법들에는 면역분석법, 예컨대 효소 면역흡착 분석법(ELISA), 면역침강법 또는 웨스턴 블랏팅이 포함된다. 적절한 분석법은 본원의 다른 부분에 상세히 기술되어 있다.
"CD100 폴리펩티드의 발현 수준 분석"은 직접적으로(예를 들어, 절대 단백질 수준을 측정 또는 추정하여) 또는 상대적으로(예를 들어, 제2 생물학적 샘플 내 질환 연관된 폴리펩티드 수준을 비교하여) 제1 생물학적 샘플에서 CD100 폴리펩티드의 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정 또는 추정하는 것을 의미한다. 바람직하게, 제1 생물학적 샘플 내 CD100 폴리펩티드 발현 수준을 측정 또는 추정하고 표준 CD100 폴리펩티드 수준과 비교하는데, 표준물은 질환이 없는 개체로부터 얻은 제2 생물학적 샘플에서 얻거나 또는 질환이 없는 개체군 유래의 수준들을 평내어 결정된다. 당분야에서 인식하고 있는 바와 같이, "표준" CD100 폴리펩티드 수준이 기지이면, 비교용 표준으로서 반복적으로 이용될 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체, 세포주, 조직 배양물, 또는 아마도 CD100을 발현하는 다른 세포 공급원에서 얻은 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 포유동물로부터 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당분야에 공지이다.
X. 면역분석법
본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 당분야에 공지된 임의 방법을 통해 면역특이적 결합에 대해 분석될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석법은 예컨대 몇가지 예를 들면, 웨스턴 블랏, 방사성 면역분석법, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석법, 면역침강분석법, 침강 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사계측법, 형광발광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법 등과 같은 기술을 이용하는 경쟁 및 비경쟁 분석법을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 분석법은 통상적이며 당분야에서 공지이다([Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1]를 참조하며 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다). 예시적인 면역분석법은 이하에 간략히 기술한다(제한하려는 의도는 없음).
면역침강 프로토콜은 대체로 단백질 포스파타아제 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)가 보충된, RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨, pH 7.2, 1% 트라실롤)등과 같은 용해 완충액에서 세포 개체군을 용해시키는 단계, 관심 항체를 세포 용해물에 부가하고, 일정 기간(예를 들어, 1 내지 4시간) 동안 4℃에서 항온반응시키는 단계, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 세포 용해물에 부가하고, 약 1시간 이상 동안 4℃에서 항온반응시키는 단계, 용해 완충액에서 비드를 세척하고 SDS/샘플 완충액에 비드를 재현탁하는 단계를 포함한다. 관심 항체가 특정 항원을 면역침강시키는 능력은, 예를 들어 웨스턴 블랏법에 의해 확인할 수 있다. 당분야의 숙련가는 항원에 대한 항체의 결합을 증가시키고 배경값을 감소시키기 위해 변경시킬 수 있는 변수들에 대해 잘 알고 있다(예를 들어, 세파로스 비드를 이용해 세포 용해물을 사전에 클리어링 함). 면역침강 프로토콜에 대한 추가 설명은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10.16.1]을 참조한다.
웨스턴 블랏법은 대체로 단백질 샘플을 준비하는 단계, 폴리아크릴아미드 겔(예를 들어, 항원의 분자량에 따라 8%-20% SDS-PAGE)에서 단백질 샘플을 전기영동하는 단계, 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에서 막 예컨대 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론으로 전달하는 단계, 블로킹 용액(3% BSA 또는 탈지유를 포함하는 PBS)에서 막을 블로킹하는 단계, 막을 세척 완충액(예를 들어, PBS-Tween 20)에서 세척하는 단계, 블로킹 완충액에 희석된 1차 항체(관심 항체)로 막을 블로킹하는 단계, 막을 세척 완충액에서 세척하는 단계, 블로킹 완충액에 희석된, 효소 기질(예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼리 프로파타아제) 또는 방사능 분자(예를 들어, 32P 또는 125I)에 접합된 2차 항체(1차 항체, 예를 들어, 항인간 항체를 인식하는 것)로 막을 블로킹하는 단계, 막을 세척 완충액에서 세척하는 단계, 및 항원 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당분야이 숙련가는 검출되는 신호를 증가시키고 배경 노이즈를 줄이기 위해 변경할 수 있는 변수에 대해 잘 알고 있다. 웨스턴 블랏 프로토콜에 대한 추가 설명은 예를 들어, [Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10.8.1]를 참조한다.
ELISA는 항원을 준비하고, 이 항원으로 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅하고, 검출가능한 화합물 예컨대 효소 기질(예를 들면, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 또는 알칼리 포스파타아제)에 접합된 관심 항체를 웰에 부가한 후 일정 기간 동안 항온반응시키고나서, 항원 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서, 관심 항체는 검출가능한 화합물에 접합될 필요는 없고; 대신, 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체(관심 항체를 인식하는 것)를 웰에 부가할 수 있다. 또한, 웰을 항원으로 코딩하는 대신, 항체를 웰에 코팅할 수 있다. 이러한 경우, 코팅된 웰에 관심 항원을 부가한 후 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체를 부가한다. 당분야의 숙련가는 검출 신호를 증가시키기 위해 변형시킬 수 있는 변수와 당분야에 공지된 ELISA의 다른 변수들에 대해 잘 알고 있다. ELISA에 대한 추가 설명은 예를 들어, [Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 11.2.1]를 참조한다.
항원에 대한 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프 속도는 경쟁 결합 분석으로 측정할 수 있다. 경쟁 결합 분석의 일례는 방사성면역분석법으로서, 이는 많은 양의 미표지 항원 존재 하에 관심 항체와 표지된 항원(예를 들어, 3H 또는 125I)을 항원반응시키고, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함한다. 특정 항원에 대한 관심 항체의 친화도 및 결합 오프 속도는 스캣차드 플랏 분석에 의한 데이타로부터 결정할 수 있다. 제2 항체와이 경쟁도 또한 방사성면역분석을 이용해 확인할 수 있다. 이 경우, 항원은 많은 양의 미표지된 제2 항체의 존재 하에 표지된 화합물(예를 들어, 3H 또는 125I)에 접합된 관심 항체와 항온반응된다.
부가적으로, 본 발명의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 조직학적으로, 면역형광발광법, 면역전자 현미경 또는 비면역학적 분석법으로서, CD100 단백질 또는 그의 보존적 변이체 또는 펩티드 단편을 인시츄 검출하는데 적용될 수 있다. 인시츄 검출은 환자로부터 조직 표본을 제거해 내고, 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 표지 항체(또는 단편)를 중첩시켜 적용되는, 표지된 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체를 조직 표본 상에 적용하여 수행될 수 있다. 이러한 절차를 이용하여, CD100 단백질, 또는 보존적 변이체 또는 펩티드 단편의 존재뿐만 아니라 검사 조직에서 그 분포도를 확인하는 것이 가능하다. 본 발명을 이용할 경우, 당분야의 숙련가는 임의의 광범위한 조직학적 방법(예컨대 염색 절차)이 인시츄 검출을 수행하기 위해 변형될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
CD100 유전자 생성물 또는 그의 보존적 변이체 또는 펩티드 단편에 대한 면역분석법 및 비면역분석법은 대체로 샘플, 예컨대 생물학적 유체, 조직 추출물, 신선하게 회수된 세포, 또는 세포 배양물에 항온반응된 세포의 용해물을 CD100 또는 그의 보존적 변이체 또는 펩티드 단편에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 항체의 존재 하에 항온반응시키고 당분야에 공지된 많은 방법 중 임의 방법을 통해 결합 항체를 검출하는 것을 포함한다.
생물학적 샘플은 고체상 지지체 또는 담체 예컨대 니트로셀룰로스, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 다른 고체 지지체와 접촉되어 고정될 수 있다. 이어서 지지체를 적절한 완충액으로 세척한 후 검출가능하게 표지된 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체로 처리할 수 있다. 고체상 지지체를 이후 2회 완충액으로 세척하여 미결합 항체를 제거시킨다. 경우에 따라, 항체는 후속적으로 표지된다. 고체 지지체 상에 결합된 표지의 양은 통상의 방법으로 검출될 수 있다.
"고체상 지지체 또는 담체"는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 의미한다. 공지의 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀레이즈, 천연 및 개질 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 가브로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 어느정도 가용성이거나 또는 본 발명의 목적을 위해 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 실제로 임의의 가능한 구조적 입체형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드처럼 구형이거나, 시험관 내면이나 로드 외면처럼 원통형일 수 있다. 다르게, 표면은 평면일 수 있는데 예컨대 시트, 테스트 스트립 등일 수 있다. 바람직한 지지체는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당분야의 숙련가는 항체 또는 항원 결합에 적합한 다른 적절한 많은 담체를 알고 있거나, 또는 통상의 실험을 이용해 그러한 것을 알아낼 수 있다.
주어진 다량의 항-CD100 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체의 결합 활성은 당분야에 공지된 방법에 따라 측정할 수 있다. 당분야의 숙련가는 통상의 실험을 통해 각 측정시 작동 및 최적 분석 조건을 결정할 수 있다.
항체-항원 상호작용의 친화성을 측정하는데 이용할 수 있는 방법은 다양하지만, 속도 상수를 결정하는데 이용할 수 있는 방법은 상대적으로 적다. 대부분의 방법은 항체 또는 항원의 표지화에 의존적이어서, 명백하게 통상의 측정을 복잡하게 하고 측정치가 불명확할 수 있다.
BIACORE®에서 수행되는 표면 플라스몬 공명(SPR)은 항체-항원 상호작용의 친화도를 측정하는 통상의 방법보다 다음과 같이 많은 장점을 제공한다: (i) 항체 또는 항원의 표지화가 필요없다; (ii) 항체를 미리 정제할 필요없이, 세포 배양 상등액을 직접 사용할 수 있다; (iii) 상이한 단일클론 항체 상호작용의 신속한 반정량 비교를 가능하게 하는 실시간 측정이 가능하고 많은 평가 목적에 충분하다; (iv) 생물특이적 표면을 재생하여 일련의 상한 단일클론 항체를 동일 조건 하에서 쉽게 비교할 수 있다; (v) 분석 절차가 완전 자동화되어 있고, 광범위한 일련의 측정을 사용자 중재없이 수행할 수 있다(BIAapplications Handbook, version AB(reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-84. SPR 기반 결합 실험은 결합쌍의 한 구성원이 센서 표면에 고정되는 것이 필요하다. 고정되는 결합 파트너를 리간드라고 한다. 용액내 결합 파트너를 분석물이라고 한다. 일부 경우에서, 리간드는 포획 분자라고 하는, 다른 고정 분자와의 결합을 통해 표면에 간접적으로 부착된다. SPR 반응은 분석물이 결합 또는 해리됨에 따른 검출기 표면에서의 질량 농도 변화를 반영한다.
SPR를 기초로, 실시간 BIACORE® 측정은 발생되면 직접 그 상호작용을 모니터링한다. 이 기술은 동역학 변수들을 결정하는데 적합하다. 경쟁 친화도 랭킹은 수행이 간단하고, 동역학 및 친화도 상소는 센소그램 데이타로부터 추론할 수 있다.
분석물을 리간드 표면 상에 개별 펄스로 주입하면, 생성되는 센소그램은 다음의 3개 필수 시기(phase)로 나눌 수 있다: (i) 샘플 주입 동안 분석물과 리간드의 회합기; (ii) 샘플 주입 동안 평행기 또는 정상 상태기로서, 분석물 결합 속도는 복합체로부터의 해리에 의해 균형이 맞춰진다; (iii) 완충액 흐름 동안 표면으로부터 분석물 해리기.
회합 및 해리 단계는 분석물-리간드 상호작용의 동역학에 대한 정보를 제공한다((ka 및 kd, 복합물 형성 및 해리 속도, kd/ka=KD). 평행 단계는 분석물-리간드 상호작용의 친화도에 대한 정보를 제공한다(KD).
BIAevaluation 소프트웨어는 수치적분 및 글로벌 핏팅 알고리즘 둘 모두를 이용하는 곡선 적합화를 위한 종합 설비를 제공한다. 데이타의 적합한 분석으로, 상호작용에 대한 개별 속도 및 친화도 상수를 단순 BIACORE® 조사로 얻을 수 있다. 이러한 기술로 측정가능한 친화도 범위는 mM 내지 pM 범위로 매우 광범위하다.
에피토프 특이성은 단일클론 항체의 중요한 특징이다. 방사성면역분석법, ELISA 또는 다른 표면 흡착법을 이용하는 통상의 기술과 대조적으로, BIACORE®를 이용한 에피토프 맵핑은 표지화나 정제된 항체를 요구하지 않고, 일련의 몇몇 단일클론 항체를 이용하여 복수 부위 특이성 테스트를 가능하게 한다. 부가적으로, 다수의 분석물을 자동적으로 프로세싱할 수 있다.
쌍 방식(Pair-wise) 결합 실험은 동일 항원에 동시에 결합하는 2개 MAb의 능력을 테스트한다. 개별 에피토프에 대한 MAb는 독립적으로 결합하지만, 동일하거나 또는 밀접하게 관련있는 에피토프에 대한 MAb는 서로의 결합을 방해한다. BIACORE®를 이용한 이들 결합 실험은 수행이 간단하다.
예를 들면, 제1 Mab를 결합시키기 위한 포획 분자를 이용하고, 이후 항원과 제2 MAb를 순차적으로 부가할 수 있다. 센소그램은 (1) 얼마나 많은 항원이 제1 Mab에 결합하는지, (2) 어느 정도로 제2 MAb가 표면 부착된 항원에결합하는지, (3) 제2 MAb가 결합하지 않으면, 쌍방식 테스트의 순서 반전이 결과를 변화시키는지 여부를 밝혀준다.
펩티드 억제는 에피토프 맵핑에 사용되는 다른 기술이다. 이러한 방법은 쌍방식 항체 결합 실험을 보완할 수 있고, 항원의 1차 서열이 기지인 경우 구조적 특징과 기능적 에피토프를 관련지을 수 있다. 펩티드 또는 항원 단편은 고정된 항원과 다양한 MAb의 결합을 억제하는 것에 대해 테스트된다. 소정 MAb의 결합을 방해하는 펩티드는 그 MAb에 의해 규정되는 에피토프와 구조적으로 관련있다고 간주할 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 표시하지 않으면, 다분야의 기술에 속하는, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 면역학의 통상적인 기술을 적용한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있고, 예를 들어, 이하의 문헌들을 참조한다: Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed.(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
항체 조작법에 대한 일반 원리는 [Borrebaeck, ed. (1995) 항체 Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 설명되어 있다. 단백질 조작법에 대한 일반 원리는 [Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 설명되어 있다. 항체 및 항체-햅텐 결합에 대한 일반 원리는 [Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 설명되어 있다. 부가적으로, 당분야에 공지이고 구체적으로 설명하지 않은 면역학의 표준 방법들은 대체로 이하 문헌들에 기술된 바에 따른다: Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) and Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
면역학의 일반 원리를 설명하는 표준 참고 연구들에는 이하의 문헌들이 포함된다: Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
상기 인용된 모든 참조문헌과 본원에 인용된 모든 참조문헌은 전체로 참조하여 본원에 포함시킨다.
이하 실시예들은 예시를 위해 제공되는 것이며 한정하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
CD100에 특이적인 항체의 선별 및 특징규명
인간, 원숭이 및 쥐 CD100을 인식하는 마우스 항-CD100 항체를 이하 기술된 방법을 이용해 생성시켰다.
"Line 1" 세포주는 BALB/c 마우스의 자발적 폐 종양으로부터 유도되었다. 본 발명자들은 이전에 외래 cDNA로 형질감염시킨 생 Line 1 세포를 BALB/c 마우스에 주사한 것이 면역 반응을 유도하는데 효과적인 방식임을 확인한 바 있다(미공개 데이타). Line 1 세포주는 전체 길이 인간 CD100 cDNA(서열번호 23)를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 인간 CD100을 발현하는 안정한 세포주를 형질감염 세포주로부터 단리하였다(Line1.CD100). CD100 결핍 마우스(BALB/c 배경, 이하 문헌 참조: Kumanogoh et al., J. Immunol . 169:1175-1181 (2002))는 완전 프로인트 보강제(CFA)에 유화시킨 정제된 마우스 CD100-His(정제용 C 말단 6X his 태그를 갖는 마우스 CD100의 세포외 도메인)로 면역화시켜 프라이밍하였다. 이러한 면역화 후 1주 후에, 마우스에게 200,000 생 Line1.CD100 세포를 근육내(i.m.) 주사하였다. Line1.CD100 주사 후 19일에, 마우스를 희생시키고 비장을 회수하여 하이브리도마 생성을 위한 표준 절차에 따라 P3X63Ag8.653 융합 파트너(ATCC# CRL-1580)와 융합시켰다. 하이브리도마 클론은 인간 및 마우스 CD100에 결합하는 것에 대해 ELISA를 통해 스크리닝하였다. 구체적으로, MAb 67에 특이적인, 하이브리도마 세포주는 하이브리도마 기술을 이용해 제조되었다(Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur . J. Immunol . 6:511 (1976); Kohler et al., Eur . J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 571-681 (1981)). 마우스 CD100 특이적 항체의 거대 패널을 생성시켰다. 이들 항체 대부분은 또한 높은 친화도로 인간 CD100에 결합하였다. 2종의 하이브리도마, 클론 67-2 및 76-1이 마우스 및 인간 CD100 둘 모두에 높은 친화도를 나타내는 단일클론 항체(각각 MAb 67 및 MAb 76)를 생성하였다(표 2 참조).
마우스 항-CD100 MAb에 대한 친화도 측정값
MAb 이소타입 마우스 CD100에 대한 친화도 (nM)* 인간 CD100에 대한 친화도 (nM)*
67 IgG1 1.00 5.7
76 IgG2b 0.33 0.12
*친화도는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 기술을 이용해 측정되었다.
항체 교차-블로킹 ELISA는 MAb 67 및 MAb 76이 CD100 상의 별개 에피토프를 인식함을 보여주었다. 또한, MAb 67 및 76은 독립적으로 유도된 쥐 항-인간 CD100 BD16(2008/0219971 A1)에 의해 인식되는 것과 별개의 에피토프를 인식한다. 따라서, 2종의 독립적인 마우스 항-CD100 항체, MAb 76(서열번호 25-40 참조) 및 MAb 67(서열번호 3-8; 10; 11-16; 18; 20 및 22 참조)이 생성되었다.
실시예 2
MAb 67 및 76은 마우스 및 인간 CD100의 활성을 시험관 내에서 블로킹한다
CD100 특이적 항체는 형광발광 블로킹 분석에서 CD100 결합을 억제하는 그 능력에 대해 스크리닝되었다. CD100 특이적 항체가 플렉신 B1에 대한 CD100의 결합을 블로킹하는지 여부를 테스트하기 위해 사용된 방법의 예를 도 1에 도시하였다. 인간 293 세포를 CD100 수용체: 플렉신 B1를 코딩하는 cDNA로 형질감염시켰다. 플렉신 B1를 발현하는 안정한 세포주를 선별하였다(293/플렉신). 세포 표면 상의 플렉신 B1에 결합한 CD100-His는 비오틴 접합된 His 태그 특이적 단일클론 항체 및 스트렙타비딘-APC를 이용하여 유세포측정법에 의해 검출하였다. 테스트한 항-CD100 MAb가 플렉신 B1에 대한 CD100의 결합을 블로킹할 수 있는 경우, 세포 상에서 CD100-His가 덜 검출되고, 결과적으로 형광발광도가 낮았다.
40 나노그램(ng)의 인간 또는 마우스 CD100-His(C-말단 His 태그)를 단독으로 또는 다양한 농도의 항-CD100 MAb와 밤새 4℃에서 항온반응시켰다. 다음날 아침, (1) CD100 단독 또는 (2) 항-CD100 MAb(67 또는 76)와 사전항온반응시킨 CD100을 293/플렉신 세포와 배합하고 얼음 상에서 30분간 항온반응시켰다. 플렉신 B1을 통해 세포에 결합된 CD100은 비오틴화된 다클론 토끼 항-His MAb와 이후 스트렙타비딘-APC를 이용해 검출하였고, 세포는 유세포측정법으로 분석하였다. 결과는 CD100의 중화에 의해 형광발광도가 낮아졌음을 보여주었다. 구체적으로, MAb 67 또는 MAb 76과 CD100을 사전항온반응시킨 결과는 CD100 단독과 비교하여 형광발광도가 저하되었다(도 2). 항-CD100 MAb 67 또는 76의 농도를 0.156 ㎍/㎖에서 0.625 ㎍/㎖로 증가시킨 결과 형광발광도가 더욱 감소되었다. 인간 CD100의 유사한 블로킹이 또한 관찰되었다(데이타 도시하지 않음). 따라서, 이러한 결과들은 MAb 67 및 MAb 76이 인간 및 마우스 CD100이 플렉신 B1에 결합하는 것을 차단할 수 있음을 보여주는 것이다.
CD100/플렉신 B1 신호전달은 액틴 필라멘트의 재조직화를 유도하여 세포 붕괴 및 세포외 매트릭스로부터의 탈착을 유도하는 것으로 확인되었다(Kruger et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 6:789-800 (2005)). 세포외 메트릭스에 결합 후 세포 탈착을 확인하기 위한 이종성 분석법을 이용해 항-CD100 항체가 피브로넥틴 코팅된 플레이트로부터 293/플렉신 세포의 CD100 유도된 탈착을 블로킹할 수 있는지 여부를 확인하였다.
세포 탈착 분석을 위해, 293/플렉신 세포(정상적으로 현탁 세포주로서 성장됨)를 40,000 세포/웰의 밀도로 피브로넥틴 코팅된 96웰 플레이트에 파종하고 밤새 부착되도록 하였다. 2 ㎍/㎖의 마우스 CD100-His(C-말단 His 태그)를 단독으로 또는 다양한 농도의 항-CD100 MAb(67 또는 76)와 6시간 동안 4℃에서 항온반응시켰다. CD100 샘플을 이어서 실온으로 옮기고 293/플렉신 세포을 부가하였다. 세포를 CD100 또는 항체와 항온반응된 CD100로 30분간 37℃에서 항온반응시키고, 2회 PBS로 세척한 후, 크리스탈 바이올렛으로 15분간 염색하였다. 이어서, 세포를 2회 PBS로 세척하고 건조하였다. 영상을 서류용 스캐너로 찍었다. 이어서 크리스탈 바이올렛을 15분간 RT에서 100 ㎕의 33% 빙초산으로 가용화시키고, 세로운 플레이트로 파이펫팅하였다. 흡광도를 570 nm에서 판독했다. CD100은 플레이트에 부착된 세포수를 감소시켰고, 따라서 흡광도가 떨어졌으며, 한편 CD100 중화 결과 흡광도가 증가되었다.
도 3에 도시된 바와 같이, MAb 67 및 MAb 76 둘 모두는 마우스 CD100 매개 세포 탈착을 블로킹하였고 이소타입 대조군과 비교하여 흡광도가 증가되었다. 유사하게, 이들 2 MAb는 또한 인간 CD100에 의해 매개된 세포 탈착을 블로킹하였다(데이타 도시하지 않음).
MAb 67 및 76은 세포 표면 플렉신 B1에 대한 CD100의 결합을 블로킹하였고 피브로넥틴 코팅된 플레이트로부터 293/플렉신 세포의 탈착을 유도하였다. 상기 기술된 시험관 내 기능 분석 결과는 MAb 67 및 MAb 76이 마우스 및 인간 CD100의 기능을 시험관 내에서 블로킹할 수 있음을 보여주었다.
실시예 3
마우스 질환 모델에서 항-CD100 단일클론 항체의 평가
항-CD100 중화 단일클론 항체(76 및 67)는 SJL EAE 동물 모델에서 생체내 테스트하였다. 재발성 실험적 자가면역 뇌척수염(R-EAE)은 중추신경계 내 염증 및 탈수초를 특징으로 하는 CD4+ T 세포-매개 질환이다. SJL 마우스에서, R-EAE는 단백지질 단백질의 펩티드 에피토프(PLP139-151)(HSLGKWLGHPDKF; 서열번호 24)로 면역화시켜 유도시킬 수 있다. 이러한 모델은 중간 내지 중증 급성 마비기 후 진정되고 이후 재발되는 것을 특징으로 한다. 질환 중증도는 표 3에 도시한 등급을 이용해 채점했다.
EAE 임상 징후 평가
스코어 징후 설명
0 정상 행동 신경학적 징후 없음
1 원위 파행성 꼬리 꼬리의 원위부가 축처지고 늘어짐
1.5 완전한 파행성 꼬리 전체 꼬리가 처지고 늘어짐
2 정위 반사 동물이 그 등으로 누웠을때 다리로 구르는 것에 어려움이 있음
3 운동실조 불안정한 걸음걸이 - 마우스가 뒷다리로 걷는 것이 불안정함
4 초기 마비 마우스가 그 뒷다리로 서있는데 어려움이 있지만 여전히 운동성은 남아있음
5 완전한 마비 마우스가 그 다리로 전혀 이동할 수 없고, 점점 마르고 쇠약해짐
6 빈사상태/폐사 폐사
SJL 마우스는 CFA 중 100 ㎍ PLP139 -151로 면역화시켰다. 백일해 독소를 0일 및 48시간 후에 투여하였다. 마우스는 30 mg/kg MAb 76, 67 또는 이소타입 대조군 항체로, 0일에 시작하여 1주 2회, 또는 7일에 시작하여 1주 1회 처리하였다. EAE 징후의 채점은 EAE 유도후 10일째 부터 나타나기 시작했다.
도 4A에 도시한 바와 같이, MAb 76 또는 MAb 67의 처리는 마우스 IgG 대조군과 비교하여 SJL 마우스의 EAE 중증도를 감소시켰다. 각각 1X/1주 밑 2X/1주의 MAb 76 및 67에 대한 21일 내지 실험 종료일 사이의 그룹 평균 스코어(GMS)의 감소율을 도 4B에 도시하였다. 도 4B에 도시한 바와 같이, MAb 76(1X/1주)는 GMS의 억제율이 35-40%였고; MAb 67(1X/1주)은 GMS의 억제율이 65-70%였으며; MAb 76(2X/1주)은 GMS의 억제율이 40-50%였고; MAb 67(2X/1주)은 GMS의 억제율이 45-50%였다. 이러한 결과는 MAb 67 및 MAb 76 둘 모두가 SJL 마우스의 재발성 완화(relapsing remitting) EAE를 약화시킴을 보여주는 것이다.
SJL EAE 실험은 30mg/kg 용량 및 1X/1주 투약으로 MAb 76을 사용해 반복하였다. 이러한 결과는 MAb 76이 마우스 IgG와 비교하여 SJL 마우스에서 EAE 중증도를 감소시킬 수 있음을 더욱 확인시켜주었다(데이타 도시하지 않음). 21일 내지 실험 종료일 사이의 그룹 평균 스코어(GMS)의 감소율은 50-60%였다. 또한, SJL EAE 실험은 MAb 76 또는 MAb 67을 30 mg/kg 투약 1X/1주로 사용하여 반복하였다. MAb 67 또는 MAb 76 처리 결과 10일 내지 실험 종료일 사이에 GMS의 감소율이 30-40%였다. 도 5A 및 5B의 결과는 MAb 76 및 MAb 67가 SJL 마우스에서 EAE의 중증도를 감소시킬 수 있음을 더욱 확인시켜주었다.
SJL EAE 실험은 면역화 7일 후 처리를 시작하여 MAb 67을 30 mg/kg으로 투약 1X/1주로 하여 반복하였다. 7일에 시작된 MAb 67 처리 결과 12일 내지 실험 종료일 사이에 GMS의 감소율이 약 50%였다. 결과는 도 6에 나타냈다.
이러한 생체 내 실험 결과는 MAb 76 또는 MAb 67을 이용한 CD100의 중화가 상이한 쥐 EAE 실험에서 EAE의 임상 징후를 감소시킴을 보여주었다. MAb 76 및 MAb 67에 대한 결과는 이들 실험에서 서로 비슷하였다.
이들 결과는 MAb 76 및 MAb 67이 시험관 내에서 CD100 활성을 블로킹하는 능력이 있고, 중요하게는, 마우스 EAE 모델에서의 상이한 투약 실험에서 EAE의 중증도를 감소시키는 능력이 있음을 보여주었다.
실시예 4
키메라 및 인간화 항-CD100 단일클론 항체의 제조
상기 기술된 쥐 단일클론 항체 클론 67은 시험관 내에서 인간과 마우스 둘 모두의 CD100을 중화시키고 쥐 모델에서 생체내 EAE를 완화시킬 수 있는 능력이 있음을 보여주었다.
가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK) 유전자를 클론 67 하이브리도마로부터 클로닝하고 그들 서열을 확인하였다. MAb 67 VH 및 VK 유전자의 아미노산 서열은 아래에 밑줄친 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역과 함께 나타내었다.
MAb 67 VH:
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKQSPENSLEWIGQINPTTGGASYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEESAVYYCTRYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS
(서열번호 10)
MAb 67 VK:
DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK
(서열번호 18)
MAb 67 VH 유전자는 인간 감마 4 중쇄 불변 영역 코딩 서열을 함유하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝하여, 전체 길이 키메라 중쇄를 생성시킨다. MAb 67 VK는 인간 카파 불변 영역 코딩 서열을 갖는 포유동물 박현 벡터에 클로닝하여, 전체 길이 키메라 경쇄를 생성시켰다. 키메라 항체를 제조하기 위해, 키메라 중쇄 및 키메라 경쇄를 포함하는 발현 벡터를 CHO-S 세포에 공동형질감염시켰다. 생성된 단일클론 항체는 3-6일 발현 기간 후 세포로부터 분비되어 회수하였다. 얻어진 MAb를 단백질 A 크로마토그래피를 이용해 정제하고 특징규명하였다. 얻어진 키메라 MAb(MAb 2368)는 유세포측정법 및 ELISA에 의해 CD100에 특이적인 것으로 확인되었고, CD100과의 결합에 대해 쥐 MAb 67과 경쟁할 수 있는 것으로 확인되었다. 종합적으로, 이들 데이타는 67 MAb를 코딩하는 올바른 VH 및 VK 유전자가 단리되었음을 보여주는 것이다.
MAb 67 가변 CDR 영역을 이용해 인간화 단일클론 항체를 생성시켰다. 인간화 VH 및 VK 유전자는 인간 감마 4 및 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 벡터들에 각각 클로닝하였다. 인간화 VH 및 인간화 VK의 쌍은 IgG4/카파 MAb 2503을 생성시켰다. 인간화 MAb 67 VH(H2160) 및 VK(L553)의 아미노산 서열은 이하에 밑줄친 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역과 함께 나타내었다.
H2160의 서열:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVRQAPGQGLEWMGQINPTTGGASYNQKFKGKATITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYGRHFDVWGQGTTVTVSS
(서열번호 9)
L553의 서열:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
(서열번호 17)
MAb 2503 항체의 VH(인간 감마를 갖는인간 면역글로불린 유전자; H2160) 및 VK(인간 카파를 갖는 인간 면역글로불린 유전자; L553) 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 pCMV-Script(Stratagene) 벡터에 클로닝하여 2009년 5월 7일자로 미국 균주 보관소("ATCC")에 기탁하였고, 각각 ATCC 기탁번호는 PTA-10004 및 PTA-10005이다. ATCC는 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불르바드 10801에 소재한다. ATCC 기탁은 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 인식에 의한 부다페스트 조약에 따른 것이다.
실시예 5
인간화 항-CD100 단일클론 항체 2503의 특징규명
MAb 2503의 특이성을 ELISA 및 유세포측정법으로 특징규명하였다. MAb 2503은 MAb67과의 에피토프 경쟁 분석 및 BIACORE® 표면 플라스몬 공명법을 이용하는 친화도 측정법에서 테스트하였다.
MAb 2503 및 MAb 67의 에피토프 특이성은 경쟁 ELISA로 측정하였다. ELISA 프로토콜에 따라, ELISA 플레이트를 CD100-Fc로 코팅하였다. 마우스 67 또는 인간화 2503 MAb를 적정하였다. 항체가 CD100에 결합하도록 하고 미결합 항체를 세척해냈다. 비오틴화 MAb 67을 부가하였다. 항체가 CD100에 결합하게 하고 미결합 항체를 세척해 냈다. CD100에 결합된 비오틴화 MAb 67는 스트렙타비딘-HRP를 이용해 검출하였다. 인간 CD100(도 7A에 도시) 및 마우스 CD100(도 7B에 도시)에 대한 비오틴화 67의 결합을 블로킹하는 MAb 2503 또는 MAb 67의 능력은 ELISA로 분석하였다.
항-CD100 MAb의 결합 친화도는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 기술을 이용해 측정하였다. MAb 2503은 오직 CD100(인간, 마우스 및 마모셋) 및 CD100 발현 세포주에만 결합하여, MAb 2503이 CD100에 특이적임을 시사한다. MAb 2503은 MAb 67과 비교하여 인간 및 마우스 CD100에 대해 높은 친화도를 보였다. MAb 2503 및 MAb 67의 친화도 특징을 하기 표 4에 요약하였다.
인간, 마모셋 및 마우스 CD100에 대한 항-CD100 MAb의 친화도
MAb 인간 CD100에 대한 친화도 (nM)* 마모셋 CD100에 대한 친화도 (nM)* 마우스 CD100에 대한 친화도 (nM)*
67
5.1 2.7 1.3
2503
 5.4 2.4 1.5
* 친화도는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 기술을 이용해 측정함
이들 분석 결과는 MAb 2503이 CD100 특이적이고 마우스 MAb 67과 동일한 에피토프에 결합함을 보여준다. MAb 2503은 마우스와 인간 둘 모두의 CD100에 결합하는 것으로 확인되었고, 따라서, MAb 2503의 장점은 마우스와 또한 인간에서 그 안정성과 효능을 테스트할 수 있다는 것이다. 또한, MAb 2305는 인간, 원숭이 및 마우스 CD100에 결합하는 것으로 확인되었다.
실시예 6
MAb 2503은 마우스 및 인간 CD100의 활성을 시험관내에서 블로킹한다
MAb 2503은 (1) 유세포측정 블로킹 분석법 및 (2) 세포 탈착 분석법을 포함하는, 상기 실시예 2에서 기술된 분석법을 이용해 CD100의 기능을 블로킹하는 능력에 대해 테스트하였다.
CD100 특이적 항체, MAb 67 및 MAb 2503는 형광발광 블로킹 분석에서 플렉신 B1에 대한 CD100의 결합을 억제하는 능력에 대해 스크리닝하였다. CD100 특이적 항체가 플렉신 B1에 CD100이 결합하는 것을 차단하는지 여부를 테스트하는데 사용된 방법은 도 1에 도시하였다(실시예 2). MAb 67 또는 MAb 2503과 CD100을 사전항온반응시킨 결과 CD100 단독과 비교하여 형광발광도가 낮아졌다. MAb 2503은 시험관 내에서 인간(도 8A), 마모셋(도 8B) 및 마우스(도 8C) CD100의 결합을 블로킹할 수 있었다. 따라서, 이들 결과는 MAb 67 및 MAb 2503은 인간, 원숭이 및 마우스 CD100이 플렉신 B1에 결합하는 것을 블로킹할 수 있음을 보여주었다.
피브로넥틴 코팅된 플레이트로부터 293/플렉신 세포의 인간 및 원숭이 CD100 매개 탈착을 항-CD100 MAb가 블로킹하는 능력은 실시예 2에 기술된 세포 탈착 분석법을 이용해 측정하였다. CD100은 플레이트에 부착된 세포수를 감소시켰고, 따라서 흡광도는 떨어졌다. 인간 CD100 및 마모셋 CD100을 MAb2503 또는 MAb 67로 중화시킨 결과 각각 도 9A 및 9B에 도시한 바와 같이 흡광도가 증가되었다. MAb 2503 및 MAb 67은 또한 이 분석에서 CD100을 중화시켰다(데이타 도시하지 않음).
MAb 2503은 세포 표면 플렉신 B1에 인간, 마우스 및 원숭이 CD100의 결합, 및 피프로넥틴 코팅된 플레이트로부터 293/플렉신 세포의 유도된 탈착을 블로킹하였다. 따라서, 이들 결과는 MAb 2503이 인간, 마우스 및 원숭이 CD100을 기능적으로 중화시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 7
항-CD100 항체는 생체내 혈관생성을 억제한다.
CD100은 강한 프로혈관생성 분자이고 CD100 결합을 통한 플렉신 B1의 활성화는 c-Met를 전사촉진시키고 종양세포의 침습능을 촉진하여 혈관생성을 촉진시킨다.
CD100이 없는 것이 종양 생성에 미치는 영향을 생체내에서 검증하기 위해, CT26 종양 세포를 야생형 Balb/c 또는 CD100-/- 마우스의 다리 근육에 주사하고 생성된 종양 성장을 측정하였다. 도 10에 도시한 바와 같이, 이 실험에서 CD100-/- 마우스의 종양 부피는 야생형 Balb/c 마우스와 비교하여 감소되었다. 이러한 결과는 마우스 결장 암 세포주(CT26)가 CD100 결여 환경에서 성장이 손상된다는 것을 보여주는 것이다.
다음으로, 야생형 Balb/c 마우스에서 CT26 종양 세포의 성장을 감소시키는 MAb 67의 능력을 테스트하였다. CT26 종양 세포를 야생형 Balb/c(n=48) 또는 CD100-/-(n=9) 마우스의 다리 근육에 주사하였다. 주사후, 야생형 마우스는 각각 24마리 마우스의 2개 그룹으로 나누었다. 한 그룹은 1일에 출발하여 1 mg MAb 67을 i.p. 주사하여 치료하였고, 다른 그룹은 1 mg 마우스 IgG를 i.p. 주사로 치료하였다. 이러한 치료는 7일마다 반복하였다. 마우스는 종양 성장에 대해 분석하였다. 도 11에 도시한 바와 같이, MAb 67을 이용한 치료는 마우스 IgG 대조군 그룹과 비교하여 Balb/c 마우스에서 CT26 종양 성장을 감소시켰다.
따라서, 이러간 결과들은 MAb 67의 구조적 기능적 특징을 갖는 항체가 생체 내에서 중양 성장을 감소시킴을 보여주었다.
실시예 8
항-CD100 항체는 생체 내에서 콜라겐 유도성 관절염을 억제한다.
MAb 67은 콜라겐 유도성 관절염(CIA) 마우스 모델에서 관절염을 감소시키는 능력에 대해 테스트하였다. 콜라겐 유도성 관절염(CIA) 모델은 질환 발병을 설명하고 치료 RA 표적을 검증하는데 널리 사용되는 류마티즘성 관절염(RA)의 전임상 동물 염증 모델이다(Brand et al., Nat. Protoc . 2(5):1269-75 (2007)). 일반적인 CIA 절차를 도 12에 도시하였다(이러한 일반 절차에 대한 임의 별법을 이하에 기술함). 간략하게, 관절염은 콜라겐 및 완전 프로인트 보강제(CFA)를 포함하는 에멀션을 피하 꼬리에 주사하여 0일에 유도시켰다. 이후, 대조군 및 테스트 치료제를 20일에 시작하여 주당 2회 피하(s.c.) 또는 복강내(i.p.) 투여하였다. 실험 1에 대한 테스트군은 이하 표 5에 나타내었다.
콜라겐 유도성 관절염(CIA) 실험 1 테스트군
테스트 군# 동물# 치료 용량 치료일수
1 10 마우스 IgG 이소타입 대조군 600㎍ i.p. 20일에 개시 2X/1주
2 10 MAb 67 600㎍ i.p. 20일에 개시 2X/1주
3 10 에타너셉트 600㎍ s.c. 20일에 개시 2X/1주
질환 중증도는 표 6에 도시한 등급을 이용해 채점하였다. 각 마우스 발을 채점했다(관절염의 미세 징후를 주당 3회 평가함). 관절염 지수(AI)는 개별 발 스코어를 더해 산출하였다(최대 AI = 16). 대체로, 처음 관절염 징후는 면역화 이후 21-28일에 CIA 모델에서 출현하였다.
CIA 채점법
스코어 설명
0 관절염의 육안적 영향은 없음
1 1 digit의 부종 및/또는 홍반
2 2 digit의 부종 및/또는 홍반
3 2 digit이 넘는 부종 및/또는 홍반
4 전체 발 및 digits의 중증 관절염
실험 1의 결과는 600 ㎍ MAb 67로 치료된 군의 CIA 모델에서 관절염 질환 발병이 감소됨을 보여주었다. 600 ㎍ MAb 67로 치료된 마우스의 관절염 지수(AI)는 600 ㎍ 음성 대조군(IgG1) 및 600 ㎍ 양성 대조군(에타너셉트)으로 치료된 마우스의 AI와 비교하였고, 여기서 치료는 20일에 시작하였다. 결과는 도 13A에 도시하였다. 이들 결과는 MAb 67이 CIA 모델에서 관절염 발병을 감소시키는데 있어 에타너셉트 만큼 우수하거나 또는 보다 양호한 것을 보여주었다.
제2 실험(실험 2)는 MAb 67 및 양성 대조군 치료를 포함하고 이 경우 치료는 지연되었는데, 즉 관절염 지수 ≥3일 때 시작하였다. 실험 2의 테스트군에 대해서는 이하 표 7에 나타내었다.
콜라겐 유도성 관절염(CIA) 실험 2 테스트군
테스트군 # 동물# 치료 용량 치료일수
1 10 마우스 IgG 이소타입 대조군 600㎍ i.p. 20일에 개시 2X/1주
2 10 MAb 67 600㎍ i.p. 20일에 개시 2X/1주
3 10 MAb 67 600㎍ i.p. 관절염 지수 ≥3일때 개시 2X/1주
4 10 에타너셉트 600㎍ s.c. 관절염 지수 ≥3일때 개시 2X/1주
실험 2의 경우, MAb 67을 이용한 치료에 대한 AI 결과(치료는 20일에 또는 AI ≥3일 때 시작함)는 음성 대조군(IgG1) 및 양성 대조군(에타너셉트; AI ≥3일 때 치료 시작함)을 치료한 것과 비교하였다. 결과는 도 13B에 도시하였다. 이들 결과는 MAb 67이 치료를 30일에 시작하거나 AI≥3까지 지연시킨 경우 CIA 모델에서 관절염 발병을 감소시키는데 있어 에타너셉트 만큼 우수하거나 또는 더 양호함을 보여주었다. 따라서, MAb 67은 CIA 모델에서 AI ≥3일 때 투여시 관절염을 치료할 뿐만 아니라, 관절염 발병을 예방하는 것으로 확인되었다.
실시예 9
항-CD100 항체는 1차 및 메모리 B 세포 반응을 생체내에서 블로킹한다
Balb/c 및 CD100-/- 마우스는 Alum(수산화알루미늄/수산화마그네슘)("NP-CGG")으로 침강시킨 (4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸 접합된 닭 감마 글로불린으로 면역화시킨 후 대조군 IgG1(Balb/c 및 CD100-/-) 또는 MAb 67(Balb/c 단독)을 처리하였다. 테스트군은 이하 표 8에 나타내었다.
테스트군 종 동물# 접종 Ab 치료 용량 Ab 주사
1 CD100 -/- 6 N/A N/A N/A N/A
2 CD100 -/- 6 NP-CGG/Alum 대조군 IgG1 N/A 일 (-7), 0, 7, 14, 21, 28
3 Balb/c 6 N/A N/A N/A N/A
4 Balb/c 6 NP-CGG/Alum 대조군 IgG1 600㎍ 일 (-7), 0, 7, 14, 21, 28
5 Balb/c 6 NP-CGG/Alum MAb 67 600㎍ 일 (-7), 0, 7, 14, 21, 28
마우스는 -7일에 출발하여 표 8에 상기 기술된 대로 치료하였고 0일에 NP-CGG로 면역화하였다. 군 당 3마리 마우스를 10일에 안락사시키고, 비장과 림프절을 배중심(GC) B 세포("B220+CD38lowPNA+")에 대해 분석하였다. 각 비장은 개별적으로 분석하였고, 모든 3마리 마우스 유래 림프절을 분석용 한 샘플로 배합하였다. 나머지 마우스의 치료는 표 8에 나타낸 바대로 계속하였다. 21일에 마우스를 Alum 중 동일 NP-CGG로 추가접종하였다. 31일에, 나머지 마우스를 안락사시키고 비장과 림프절을 배중심(GC) B 세포("B220+CD38lowPNA+")에 대해 분석하였다. 각 비장을 개별 분석하고, 3마리 모든 마우스 유래 림프절을 분석용 한 샘플로 배합하였다. 도 14A 및 B의 결과는 600 ㎍ MAb 67로 치료한 결과 각각 1차 면역(14A) 및 2차 면역(14B) 이후 비장(SP) 및 림프절(LN)의 GC B 세포 수가 감소되었음을 보여준다. 따라서, MAb 67은 1차 및 메모리 B 세포 반응을 생체 내에서 블로킹함이 확인되었다.
실시예 10
항-CD100 항체는 생체 내 종양 성장을 지연시킨다.
MAb 67에 의한 종양 성장 감소는 CT26 및 BCA34 마우스 이종이식 종양 모델에서 테스트하였다. 이들 실험을 위해, 종양 세포를 Balb/c 마우스의 다리에 근육내 주사하였다. 이식 후 1일에 시작하여, 마우스는 0.2 mL 부피로 1 mg MAb 67 항체 또는 음성 대조군(IgG)를 1주에 1X로 복강내(i.p.) 주사 치료하였다. 종양 부피(㎣) 및/또는 넓적다리 부피(㎣) 변화를 측정하여 종양 성장률을 확인하였다. 음성 대조군 마우스의 종양 성장률과 비교한 MAb 67 치료된 마우스의 종양 성장률을 이용해 종양 성장 지연도(TGD)를 산출하였다.
CD100 결여 환경에서 성장하는 BCA34 및 EMT6 종양 세포의 능력을 또한 테스트하였다. 이들 실험을 위해, 종양 세포를 Balb/c 및 CD100-/-(SEMA4D-/-) 마우스의 다리에 주사하였고 종양 성장을 측정하였다.
CT26 결장 종양 세포
CT26 종양 세포는 쥐 결장 종양에서 유래된 것이고 매우 낮은 수준으로 CD100을 발현한다. 50,000 CT26 결장 종양 세포를 야생형 Balb /c 마우스(20 마우스/치료군)에 s.c. 주사하였다. 종양 부피(㎣) 변화를 IgG 대조군 주사한 마우스와 비교하여 이식 후 1일에 출발하여 주당 1 mg MAb 67로 치료된 마우스에서 측정하였다. 결과(시간에 따른 평균 종양 부피)는 도 15에 도시하였다. MAb67 치료된 마우스의 TGD는 17%(p=0.0317)였다. 이러한 결과는 CT26 종양 성장이 MAb 67 치료된 마우스에서는 감소되었음을 보여주는 것이다.
BCA34 섬유모세포 종양 세포
BCA34 종양 세포는 CD100을 낮은 수준으로 발현한다. 먼저, 50,000 BCA34 종양 세포를 야생형 Balb/c 마우스 또는 CD100-/-("SEMA4D-/-") 마우스의 복부에 s.c. 주사하였다. 종양 부피(㎣) 변화를 이들 마우스에서 측정하여, 그 결과를 도 16A에 도시하였다. 이들 결과는 BCA34 종양 세포가 CD100 결여 환경에서 성장이 손상됨을 보여준다.
개별 실험에서, 50,000 BCA34 종양 세포를 야생형 Balb/c 마우스(21 마우스/치료군)의 다리 근육에 주사하였다. 종양 부피(㎣) 변화는 IgG 대조군을 주사한 마우스와 비교하여 이식 후 1일에 출발해 1 mg MAb 67을 주당 치료한 마우스에서 측정하였다. 결과(시간 경과에 따른 평균 넓적다리 부피)는 도 16B에 도시하였다. MAb 67로 치료된 마우스의 TGD는 18%(p=0.009)였다. 이들 결과는 BCA34 종양 성장이 MAb 67-치료된 마우스에서 감소됨을 보여주었다.
EMT6 유선 암종 종양 세포
EMT6 종양 세포는 쥐 유선 암종 종양에서 유래된 것이고 CD100을 중간 정도로 발현한다. 50,000 EMT6 종양 세포를 야생형 Balb/c 마우스 또는 CD100-/-("SEMA4D-/-") 마우스의 다리 근육에 주사하였다. 이들 마우스에서 종양 부피(㎣) 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 17에 도시하였다. 종양 부피(㎣) 변화는 야생형 Balb/c 마우스 및 CD100-/- 마우스("SEMA4D-/-")에 대해 도시하였다. 이들 결과는 EMT6 종양 세포가 CD100 결여 환경에서 성장이 손상됨을 보여주었다.
실시예 11
항-CD100 항체는 인간 종양 성장을 생체 내에서 지연시킨다
MAb 2503에 의한 종양 성장 감소는 HN12 및 HN6 HIF1a mODD 인간 이종이식 종양 모델에서 테스트하였다. HN12 및 HN6 HIF1a mODD는 인간 두경부 종양에서 유래된 것이고, 이들 2 이종이식물은 HIF1a 및 CD100을 높은 수준으로 발현한다. HN6 HIF-1a mODD 이종이식 모델은 [Sun et al., J Biol Chem 284(46):32066-74 (2009)]에 설명되어 있다. 이들 실험을 위해, 2 종양/마우스를 무흉선 누드 마우스(10마리 마우스/치료군)에 s.c. 주사하였다. 이식 후 1일에 출발하여, 마우스를 0.2 mL 부피의 1 mg MAb 2503 항체 또는 음성 대조군(IgG4)을 주당 1X i.p. 주사하여 치료하였다. 종양 부피(㎣) 변화를 측정하였다. 음성 대조군 마우스의 성장률과 비교한 MAb 2503-치료된 HN6 HIF-1a mODD 마우스의 종양 성장률을 이용해 종양 성장 지연도(TGD)를 산출하였다.
이 실험에 대한 종료점은 TGD였다. HN12 및 HN6 HIF-1a mODD 이종이식 모델에서 MAb 2503 치료에 대한 종양 성장 결과는 각각 도 18 및 19A에 도시하였다. MAb 2503으로 치료된 HN6 HIF-1a mODD 이종이식 마우스의 TGD는 13%(p=0.0008)였다. IgG4 대조군 및 MAb 2505로 치료된 HN6 HIF-1a mODD 이종이식 마우스에서 유래된 대표적인 종양 사진을 도 19B에 도시하였다. 이 결과는 MAb 2503 치료가 인간 두경부 종양 성장을 생체내에서 감소시킴을 보여주었다.
실시예 12
고역가의 MAb 2503을 발현하는 안정한 CHO-S 세포주
안정한 CHO-S 세포주를 고역가의 MAb 2503을 발현시키기 위해 유도시켰다. 인간화 항-CD100 단일클론 항체 2503의 중쇄 및 경쇄에 대한 상보성 DNA(cDNA)를 사용해 GPEx™ 기술(Catalent Pharma Solutions, Madison, Wisconsin) 및 전구체 CHO-S 세포(Bleck et al., "An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable, High-Expressing Mammalian Cell Lines," BioProcessing Journal (September/October 2005))를 이용해 제작된 몇몇 중국 햄스터 난소(CHO-S) 발현 세포주를 제조하였다.
단일 세포 클로닝 후, 하나의 발현 클론을 배양물에서의 성장 및 항체 생성을 기초로 선별하고, 연구용 바이알 뱅크로 보관한 발현 세포를 만들었다. 이들 클론에 의해 생성되는 발현 항체는 시험관 내 및 생체 내 기능 분석법(예를 들어, 흐름 블로킹 및 탈착 분석법)을 이용해 효능 및 특이성에 대해 특징규명하였다. 후속하여, 선별된 CHO 발현 클론 유래 세포를 배양 증식시키고 제2(모 씨드 스톡) 뱅크를 만들어 냉동시켰다. 모 씨드 스톡 뱅크의 한 바이알 유래 세포를 이후 배양 증식시키고 마스터 세포 뱅크(MCB)의 cGMP 생성에 사용하였다.
실시예 13
래트와 사이노몰거스 원숭이에서의 항-CD100 항체 용량 및 PK 실험
래트 및 사이노몰거스 원숭이에서 MAb 2503의 단일 정맥내 주사 포화 분석을 수행하였다.
래트 실험: 36마리 스프라그-다우리 래트(3/sex/group)에 0.1 내지 100 mg/kg 범위의 MAb 2503을 단회 정맥내 주사로 투여하였다. 유세포측정 기반 포화 분석을 각 시점에서 용해된 전혈에 대해 수행하여 MAb 2503으로 포화된 세포 표적(SEMA4D) 비율을 측정하였다. 혈청에서 검출된 MAb의 양과의 우수한 데이타 상관관계가 존재하였는데, 여기서 포화는 혈청 내 유리(free)-약물의 양에 의존적이었으며, 세포는 대략 1 내지 5 ㎕/㎖의 유리 약물이 혈청에서 검출될 때 포화되는 것으로 나타났다. 숫컷 및 암컷 래트에서 0, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 mg/kg의 MAb 2503 용량에서의 SEMA4D의 포화율은 각각 도 20A 및 20B에 도시하였다.
영장류 실험: 28마리 사이노몰거스 원숭이(2/sex/group; 4/sex/control group)에게 0.01 내지 100 mg/kg 범위의 MAb 2503을 단회 정맥내 주사로 투여하였다. 유세포측정 기반 포화 분석을 다양한 시점에서 용해 전혈에 대해 수행하여 MAb 2503으로 포화된 세포 표적(SEMA4D)의 비율을 측정하였다. 혈청에서 검출되는 MAb 양과의 우수한 데이타 상관관계가 존재하였는데, 포화는 혈청 내 유리-약물의 양에 의존적이었고, 세포는 대략 1 내지 5 ㎕/㎖의 유리 약물이 혈청에서 검출될 때 포화되는 것으로 나타났다. 암컷 및 숫컷 래트(조합)에서 0, 0.01, 0.1, 1.0, 10 및 100 mg/kg의 MAb 2503 용량에서의 SEMA4D의 포화율은 도 21에 도시하였다. 래트와 영장류 포화 결과는 매우 유사하였다.
래트 및 영장류에서 0.01, 0.1, 1.0, 10, 또는 100 mg/kg MAb 2503의 단회 정맥내 주사에 대한 생물학적 반감기(시간(일수)), 주사 후 0에 항체 농도(C0), 및 0 내지 t 시간의 혈장 농도 곡선 하 면적(AUC0 -t)을 포함하는 약물동태학(PK) 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
래트 및 영장류(사이노몰거스 원숭이)에서 2503 항체에 대한 PK
용량
(mg/kg)		 반감기(시간(일수)) C0 (㎍/mL) AUC0-t
Cyno 래트 Cyno 래트 Cyno 래트
0.01 0.1051 데이타
없음		 0.3573 데이타
없음
A기 0.1649 (0.01) 데이타
없음
B기 43.21 (1.80) 데이타
없음
0.1 3.356 1.99 23.09 11.40
A기 0.1659 (0.01) 3.47 (0.14)
B기 6.829 (0.28) 데이타
없음
1.0 39.35 34.14 1,974 834.7
A기 3.175 (0.13) 0.636 (0.026)
B기 43.69 (1.82) 27.77 (1.2)
10 327.1 317.7 38,741 27,431
A기 3.075 (0.13) 5.85 (0.24)
B기 109.4 (4.56) 105.7 (4.4)
100 3,681 3,305 477,154 488,194
A기 6.978 (0.29) 9.20 (0.38)
B기 239.8 (9.99) 246.2 (10.3)
MAb 2503 제거기 반감기는 래트와 사이노콜거스 원숭이 간에 유사한 것으로 확인되었고, 용량 의존적 방식으로 약 6시간 내지 약 10일 범위였다. 포화와 PK 결과 둘 모두는 용량 의존적인 것으로 나타났고 래트와 사이노몰거스 원숭이 간에 두드러지게 유사한 프로파일을 보였다. 또한, 0.01 내지 100 mg/kg 범위의 용량에서 MAb 2503에 대해 유의한 독성이 래트나 사이노몰거스 원숭이에서 관찰되지 않았다.
상기 특정 구체예의 설명은 당분야의 기술에 속하는 지식을 적용하여, 다른 숙련가들이 과도한 실험없이, 본 발명의 일반 개념을 벗어나지 않으면서, 이러한 특정 구체예들을 다양한 적용분야에 맞게 변형 및/또는 적합화시킬 수 있는 본 발명의 일반적 성질을 명백하게 제시한다. 따라서, 이러한 적합화 및 변형은 본원에 개시된 교시 및 지침을 기초로, 개시된 구체예의 균등물 범위 및 의미 내에 포함시키고자 한다. 본원의 어법 또는 용어는 설명을 목적으로 하며 제한하려는 의도는 없고, 따라서 본 명세서의 어법이나 용어는 교시내용과 지침의 관점에서 당분야의 숙련가가 해석해야 한다는 것을 이해한다.
본 발명의 범주와 범위는 상기 기술된 임의의 예시적인 구체예에 의해 한정해서는 않되며, 오직 이하의 청구항과 그 균등물에 따라 정의되어야 한다.
ATCC PTA-10004 20090507 ATCC PTA-10005 20090507
SEQUENCE LISTING <110> Smith, Ernest S. Fisher, Terrence Lee <120> Anti-CD100 Antibodies and Methods for Using the Same <130> 1843.060PC02/EJH/BNC <140> To be assigned <141> Herewith <150> 61/325,213 <151> 2010-04-16 <150> 61/176,826 <151> 2009-05-08 <160> 40 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 862 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Met Cys Thr Pro Ile Arg Gly Leu Leu Met Ala Leu Ala Val 1 5 10 15 Met Phe Gly Thr Ala Met Ala Phe Ala Pro Ile Pro Arg Ile Thr Trp 20 25 30 Glu His Arg Glu Val His Leu Val Gln Phe His Glu Pro Asp Ile Tyr 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Leu Ser Glu Asp Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 50 55 60 Gly Ala Arg Glu Ala Val Phe Ala Val Asn Ala Leu Asn Ile Ser Glu 65 70 75 80 Lys Gln His Glu Val Tyr Trp Lys Val Ser Glu Asp Lys Lys Ala Lys 85 90 95 Cys Ala Glu Lys Gly Lys Ser Lys Gln Thr Glu Cys Leu Asn Tyr Ile 100 105 110 Arg Val Leu Gln Pro Leu Ser Ala Thr Ser Leu Tyr Val Cys Gly Thr 115 120 125 Asn Ala Phe Gln Pro Ala Cys Asp His Leu Asn Leu Thr Ser Phe Lys 130 135 140 Phe Leu Gly Lys Asn Glu Asp Gly Lys Gly Arg Cys Pro Phe Asp Pro 145 150 155 160 Ala His Ser Tyr Thr Ser Val Met Val Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly 165 170 175 Thr Ser Tyr Asn Phe Leu Gly Ser Glu Pro Ile Ile Ser Arg Asn Ser 180 185 190 Ser His Ser Pro Leu Arg Thr Glu Tyr Ala Ile Pro Trp Leu Asn Glu 195 200 205 Pro Ser Phe Val Phe Ala Asp Val Ile Arg Lys Ser Pro Asp Ser Pro 210 215 220 Asp Gly Glu Asp Asp Arg Val Tyr Phe Phe Phe Thr Glu Val Ser Val 225 230 235 240 Glu Tyr Glu Phe Val Phe Arg Val Leu Ile Pro Arg Ile Ala Arg Val 245 250 255 Cys Lys Gly Asp Gln Gly Gly Leu Arg Thr Leu Gln Lys Lys Trp Thr 260 265 270 Ser Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile Cys Ser Arg Pro Asp Ser Gly Leu 275 280 285 Val Phe Asn Val Leu Arg Asp Val Phe Val Leu Arg Ser Pro Gly Leu 290 295 300 Lys Val Pro Val Phe Tyr Ala Leu Phe Thr Pro Gln Leu Asn Asn Val 305 310 315 320 Gly Leu Ser Ala Val Cys Ala Tyr Asn Leu Ser Thr Ala Glu Glu Val 325 330 335 Phe Ser His Gly Lys Tyr Met Gln Ser Thr Thr Val Glu Gln Ser His 340 345 350 Thr Lys Trp Val Arg Tyr Asn Gly Pro Val Pro Lys Pro Arg Pro Gly 355 360 365 Ala Cys Ile Asp Ser Glu Ala Arg Ala Ala Asn Tyr Thr Ser Ser Leu 370 375 380 Asn Leu Pro Asp Lys Thr Leu Gln Phe Val Lys Asp His Pro Leu Met 385 390 395 400 Asp Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Asn Arg Pro Arg Leu Ile Lys Lys 405 410 415 Asp Val Asn Tyr Thr Gln Ile Val Val Asp Arg Thr Gln Ala Leu Asp 420 425 430 Gly Thr Val Tyr Asp Val Met Phe Val Ser Thr Asp Arg Gly Ala Leu 435 440 445 His Lys Ala Ile Ser Leu Glu His Ala Val His Ile Ile Glu Glu Thr 450 455 460 Gln Leu Phe Gln Asp Phe Glu Pro Val Gln Thr Leu Leu Leu Ser Ser 465 470 475 480 Lys Lys Gly Asn Arg Phe Val Tyr Ala Gly Ser Asn Ser Gly Val Val 485 490 495 Gln Ala Pro Leu Ala Phe Cys Gly Lys His Gly Thr Cys Glu Asp Cys 500 505 510 Val Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Ser Pro Pro Thr Ala Thr 515 520 525 Cys Val Ala Leu His Gln Thr Glu Ser Pro Ser Arg Gly Leu Ile Gln 530 535 540 Glu Met Ser Gly Asp Ala Ser Val Cys Pro Asp Lys Ser Lys Gly Ser 545 550 555 560 Tyr Arg Gln His Phe Phe Lys His Gly Gly Thr Ala Glu Leu Lys Cys 565 570 575 Ser Gln Lys Ser Asn Leu Ala Arg Val Phe Trp Lys Phe Gln Asn Gly 580 585 590 Val Leu Lys Ala Glu Ser Pro Lys Tyr Gly Leu Met Gly Arg Lys Asn 595 600 605 Leu Leu Ile Phe Asn Leu Ser Glu Gly Asp Ser Gly Val Tyr Gln Cys 610 615 620 Leu Ser Glu Glu Arg Val Lys Asn Lys Thr Val Phe Gln Val Val Ala 625 630 635 640 Lys His Val Leu Glu Val Lys Val Val Pro Lys Pro Val Val Ala Pro 645 650 655 Thr Leu Ser Val Val Gln Thr Glu Gly Ser Arg Ile Ala Thr Lys Val 660 665 670 Leu Val Ala Ser Thr Gln Gly Ser Ser Pro Pro Thr Pro Ala Val Gln 675 680 685 Ala Thr Ser Ser Gly Ala Ile Thr Leu Pro Pro Lys Pro Ala Pro Thr 690 695 700 Gly Thr Ser Cys Glu Pro Lys Ile Val Ile Asn Thr Val Pro Gln Leu 705 710 715 720 His Ser Glu Lys Thr Met Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Asn Arg Leu Leu 725 730 735 Met Ser Leu Phe Leu Phe Phe Phe Val Leu Phe Leu Cys Leu Phe Phe 740 745 750 Tyr Asn Cys Tyr Lys Gly Tyr Leu Pro Arg Gln Cys Leu Lys Phe Arg 755 760 765 Ser Ala Leu Leu Ile Gly Lys Lys Lys Pro Lys Ser Asp Phe Cys Asp 770 775 780 Arg Glu Gln Ser Leu Lys Glu Thr Leu Val Glu Pro Gly Ser Phe Ser 785 790 795 800 Gln Gln Asn Gly Glu His Pro Lys Pro Ala Leu Asp Thr Gly Tyr Glu 805 810 815 Thr Glu Gln Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Pro Thr Asp Arg Glu Asp 820 825 830 Ser Gln Arg Ile Asp Asp Leu Ser Ala Arg Asp Lys Pro Phe Asp Val 835 840 845 Lys Cys Glu Leu Lys Phe Ala Asp Ser Asp Ala Asp Gly Asp 850 855 860 <210> 2 <211> 861 <212> PRT <213> Murine sp. <400> 2 Met Arg Met Cys Ala Pro Val Arg Gly Leu Phe Leu Ala Leu Val Val 1 5 10 15 Val Leu Arg Thr Ala Val Ala Phe Ala Pro Val Pro Arg Leu Thr Trp 20 25 30 Glu His Gly Glu Val Gly Leu Val Gln Phe His Lys Pro Gly Ile Phe 35 40 45 Asn Tyr Ser Ala Leu Leu Met Ser Glu Asp Lys Asp Thr Leu Tyr Val 50 55 60 Gly Ala Arg Glu Ala Val Phe Ala Val Asn Ala Leu Asn Ile Ser Glu 65 70 75 80 Lys Gln His Glu Val Tyr Trp Lys Val Ser Glu Asp Lys Lys Ser Lys 85 90 95 Cys Ala Glu Lys Gly Lys Ser Lys Gln Thr Glu Cys Leu Asn Tyr Ile 100 105 110 Arg Val Leu Gln Pro Leu Ser Ser Thr Ser Leu Tyr Val Cys Gly Thr 115 120 125 Asn Ala Phe Gln Pro Thr Cys Asp His Leu Asn Leu Thr Ser Phe Lys 130 135 140 Phe Leu Gly Lys Ser Glu Asp Gly Lys Gly Arg Cys Pro Phe Asp Pro 145 150 155 160 Ala His Ser Tyr Thr Ser Val Met Val Gly Gly Glu Leu Tyr Ser Gly 165 170 175 Thr Ser Tyr Asn Phe Leu Gly Ser Glu Pro Ile Ile Ser Arg Asn Ser 180 185 190 Ser His Ser Pro Leu Arg Thr Glu Tyr Ala Ile Pro Trp Leu Asn Glu 195 200 205 Pro Ser Phe Val Phe Ala Asp Val Ile Gln Lys Ser Pro Asp Gly Pro 210 215 220 Glu Gly Glu Asp Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Thr Glu Val Ser Val 225 230 235 240 Glu Tyr Glu Phe Val Phe Lys Leu Met Ile Pro Arg Val Ala Arg Val 245 250 255 Cys Lys Gly Asp Gln Gly Gly Leu Arg Thr Leu Gln Lys Lys Trp Thr 260 265 270 Ser Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile Cys Ser Lys Pro Asp Ser Gly Leu 275 280 285 Val Phe Asn Ile Leu Gln Asp Val Phe Val Leu Arg Ala Pro Gly Leu 290 295 300 Lys Glu Pro Val Phe Tyr Ala Val Phe Thr Pro Gln Leu Asn Asn Val 305 310 315 320 Gly Leu Ser Ala Val Cys Ala Tyr Thr Leu Ala Thr Val Glu Ala Val 325 330 335 Phe Ser Arg Gly Lys Tyr Met Gln Ser Ala Thr Val Glu Gln Ser His 340 345 350 Thr Lys Trp Val Arg Tyr Asn Gly Pro Val Pro Thr Pro Arg Pro Gly 355 360 365 Ala Cys Ile Asp Ser Glu Ala Arg Ala Ala Asn Tyr Thr Ser Ser Leu 370 375 380 Asn Leu Pro Asp Lys Thr Leu Gln Phe Val Lys Asp His Pro Leu Met 385 390 395 400 Asp Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Asn Arg Pro Lys Leu Ile Lys Lys 405 410 415 Asp Val Asn Tyr Thr Gln Ile Val Val Asp Arg Thr Gln Ala Leu Asp 420 425 430 Gly Thr Phe Tyr Asp Val Met Phe Ile Ser Thr Asp Arg Gly Ala Leu 435 440 445 His Lys Ala Val Ile Leu Thr Lys Glu Val His Val Ile Glu Glu Thr 450 455 460 Gln Leu Phe Arg Asp Ser Glu Pro Val Leu Thr Leu Leu Leu Ser Ser 465 470 475 480 Lys Lys Gly Arg Lys Phe Val Tyr Ala Gly Ser Asn Ser Gly Val Val 485 490 495 Gln Ala Pro Leu Ala Phe Cys Glu Lys His Gly Ser Cys Glu Asp Cys 500 505 510 Val Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Ser Pro Ala Ile Lys Ala 515 520 525 Cys Val Thr Leu His Gln Glu Glu Ala Ser Ser Arg Gly Trp Ile Gln 530 535 540 Asp Met Ser Gly Asp Thr Ser Ser Cys Leu Asp Lys Ser Lys Glu Ser 545 550 555 560 Phe Asn Gln His Phe Phe Lys His Gly Gly Thr Ala Glu Leu Lys Cys 565 570 575 Phe Gln Lys Ser Asn Leu Ala Arg Val Val Trp Lys Phe Gln Asn Gly 580 585 590 Glu Leu Lys Ala Ala Ser Pro Lys Tyr Gly Phe Val Gly Arg Lys His 595 600 605 Leu Leu Ile Phe Asn Leu Ser Asp Gly Asp Ser Gly Val Tyr Gln Cys 610 615 620 Leu Ser Glu Glu Arg Val Arg Asn Lys Thr Val Ser Gln Leu Leu Ala 625 630 635 640 Lys His Val Leu Glu Val Lys Met Val Pro Arg Thr Pro Pro Ser Pro 645 650 655 Thr Ser Glu Asp Ala Gln Thr Glu Gly Ser Lys Ile Thr Ser Lys Met 660 665 670 Pro Val Ala Ser Thr Gln Gly Ser Ser Pro Pro Thr Pro Ala Leu Trp 675 680 685 Ala Thr Ser Pro Arg Ala Ala Thr Leu Pro Pro Lys Ser Ser Ser Gly 690 695 700 Thr Ser Cys Glu Pro Lys Met Val Ile Asn Thr Val Pro Gln Leu His 705 710 715 720 Ser Glu Lys Thr Val Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Asn Arg Leu Leu Met 725 730 735 Ser Leu Leu Leu Phe Ile Phe Val Leu Phe Leu Cys Leu Phe Ser Tyr 740 745 750 Asn Cys Tyr Lys Gly Tyr Leu Pro Gly Gln Cys Leu Lys Phe Arg Ser 755 760 765 Ala Leu Leu Leu Gly Lys Lys Thr Pro Lys Ser Asp Phe Ser Asp Leu 770 775 780 Glu Gln Ser Val Lys Glu Thr Leu Val Glu Pro Gly Ser Phe Ser Gln 785 790 795 800 Gln Asn Gly Asp His Pro Lys Pro Ala Leu Asp Thr Gly Tyr Glu Thr 805 810 815 Glu Gln Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Pro Thr Asp Arg Glu Asp Ser 820 825 830 Gln Arg Ile Asp Glu Leu Ser Ala Arg Asp Lys Pro Phe Asp Val Lys 835 840 845 Cys Glu Leu Lys Phe Ala Asp Ser Asp Ala Asp Gly Asp 850 855 860 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH CDR1 <400> 3 ggctacagct tcagcgacta ctacatgcac 30 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH CDR2 <400> 4 cagattaatc ctaccactgg cggcgctagc tacaaccaga agttcaaggg c 51 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH CDR3 <400> 5 tattactacg gcagacactt cgatgtc 27 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR1 <400> 6 Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Tyr Met His 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR2 <400> 7 Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH CDR3 <400> 8 Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val 1 5 <210> 9 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 2503 <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 67 <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL CDR1 <400> 11 aaggccagcc aaagcgtgga ttatgatggc gatagctata tgaac 45 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL CDR2 <400> 12 gctgcatcca atctggaaag c 21 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL CDR3 <400> 13 cagcaaagca atgaggatcc ctacacc 27 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR1 <400> 14 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR2 <400> 15 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL CDR3 <400> 16 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 2503 <400> 17 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 67 <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 2503 <400> 19 caggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggcagcag cgtgaaggtc 60 tcctgcaagg ctagcggcta cagcttcagc gactactaca tgcactgggt gagacaggcc 120 cctggccaag gcctggagtg gatgggccag attaatccta ccactggcgg cgctagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccatt accgtggaca aaagcaccag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt attactgtgc cagatattac 300 tacggcagac acttcgatgt ctggggccaa ggcaccacgg tcaccgtctc ttca 354 <210> 20 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 67 <400> 20 caggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcagt gactactaca tgcactgggt gaagcaaagt 120 cctgaaaata gtcttgagtg gattggacag attaatccta ccactggggg tgctagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacatta actgtagata aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca agagcctgac atctgaagag tctgcagtct attactgtac aagatattac 300 tacggtagac acttcgatgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtttc ctca 354 <210> 21 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 2503 <400> 21 gacatcgtga tgacccagag cccagacagc ctggctgtga gcctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca aggccagcca aagcgtggat tatgatggcg atagctatat gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctgatttacg ctgcatccaa tctggaaagc 180 ggcgtgcctg acagattcag cggcagcggc agcggcacag atttcactct gaccatcagc 240 agcctgcagg ctgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc aaagcaatga ggatccctac 300 accttcggcc aagggaccaa gctcgagatc aaa 333 <210> 22 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 67 <400> 22 gacattgtga tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180 gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctcgagatc aaa 333 <210> 23 <211> 2586 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 atgaggatgt gcacccccat tagggggctg ctcatggccc ttgcagtgat gtttgggaca 60 gcgatggcat ttgcacccat accccggatc acctgggagc acagagaggt gcacctggtg 120 cagtttcatg agccagacat ctacaactac tcagccttgc tgctgagcga ggacaaggac 180 accttgtaca taggtgcccg ggaggcggtc ttcgctgtga acgcactcaa catctccgag 240 aagcagcatg aggtgtattg gaaggtctca gaagacaaaa aagcaaaatg tgcagaaaag 300 gggaaatcaa aacagacaga gtgcctcaac tacatccggg tgctgcagcc actcagcgcc 360 acttcccttt acgtgtgtgg gaccaacgca ttccagccgg cctgtgacca cctgaactta 420 acatccttta agtttctggg gaaaaatgaa gatggcaaag gaagatgtcc ctttgaccca 480 gcacacagct acacatccgt catggttgat ggagaacttt attcggggac gtcgtataat 540 tttttgggaa gtgaacccat catctcccga aattcttccc acagtcctct gaggacagaa 600 tatgcaatcc cttggctgaa cgagcctagt ttcgtgtttg ctgacgtgat ccgaaaaagc 660 ccagacagcc ccgacggcga ggatgacagg gtctacttct tcttcacgga ggtgtctgtg 720 gagtatgagt ttgtgttcag ggtgctgatc ccacggatag caagagtgtg caagggggac 780 cagggcggcc tgaggacctt gcagaagaaa tggacctcct tcctgaaagc ccgactcatc 840 tgctcccggc cagacagcgg cttggtcttc aatgtgctgc gggatgtctt cgtgctcagg 900 tccccgggcc tgaaggtgcc tgtgttctat gcactcttca ccccacagct gaacaacgtg 960 gggctgtcgg cagtgtgcgc ctacaacctg tccacagccg aggaggtctt ctcccacggg 1020 aagtacatgc agagcaccac agtggagcag tcccacacca agtgggtgcg ctataatggc 1080 ccggtaccca agccgcggcc tggagcgtgc atcgacagcg aggcacgggc cgccaactac 1140 accagctcct tgaatttgcc agacaagacg ctgcagttcg ttaaagacca ccctttgatg 1200 gatgactcgg taaccccaat agacaacagg cccaggttaa tcaagaaaga tgtgaactac 1260 acccagatcg tggtggaccg gacccaggcc ctggatggga ctgtctatga tgtcatgttt 1320 gtcagcacag accggggagc tctgcacaaa gccatcagcc tcgagcacgc tgttcacatc 1380 atcgaggaga cccagctctt ccaggacttt gagccagtcc agaccctgct gctgtcttca 1440 aagaagggca acaggtttgt ctatgctggc tctaactcgg gcgtggtcca ggccccgctg 1500 gccttctgtg ggaagcacgg cacctgcgag gactgtgtgc tggcgcggga cccctactgc 1560 gcctggagcc cgcccacagc gacctgcgtg gctctgcacc agaccgagag ccccagcagg 1620 ggtttgattc aggagatgag cggcgatgct tctgtgtgcc cggataaaag taaaggaagt 1680 taccggcagc attttttcaa gcacggtggc acagcggaac tgaaatgctc ccaaaaatcc 1740 aacctggccc gggtcttttg gaagttccag aatggcgtgt tgaaggccga gagccccaag 1800 tacggtctta tgggcagaaa aaacttgctc atcttcaact tgtcagaagg agacagtggg 1860 gtgtaccagt gcctgtcaga ggagagggtt aagaacaaaa cggtcttcca agtggtcgcc 1920 aagcacgtcc tggaagtgaa ggtggttcca aagcccgtag tggcccccac cttgtcagtt 1980 gttcagacag aaggtagtag gattgccacc aaagtgttgg tggcatccac ccaagggtct 2040 tctcccccaa ccccagccgt gcaggccacc tcctccgggg ccatcaccct tcctcccaag 2100 cctgcgccca ccggcacatc ctgcgaacca aagatcgtca tcaacacggt cccccagctc 2160 cactcggaga aaaccatgta tcttaagtcc agcgacaacc gcctcctcat gtccctcttc 2220 ctcttcttct ttgttctctt cctctgcctc tttttctaca actgctataa gggatacctg 2280 cccagacagt gcttgaaatt ccgctcggcc ctactaattg ggaagaagaa gcccaagtca 2340 gatttctgtg accgtgagca gagcctgaag gagacgttag tagagccagg gagcttctcc 2400 cagcagaatg gggagcaccc caagccagcc ctggacaccg gctatgagac cgagcaagac 2460 accatcacca gcaaagtccc cacggatagg gaggactcac agaggatcga cgacctttct 2520 gccagggaca agccctttga cgtcaagtgt gagctgaagt tcgctgactc agacgcagat 2580 ggagac 2586 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide epitope of proteolipid protein PLP(139-151) <400> 24 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR1 <400> 26 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR2 <400> 27 Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ser Asp Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VH 76 CDR3 <400> 28 Asp Pro Tyr Gly Trp Thr Met Asp Ser 1 5 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR1 <400> 30 His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp Leu Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR2 <400> 31 Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polypeptide anti-CD100 VL 76 CDR3 <400> 32 Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 33 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 <400> 33 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgaa ctggcaaaac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcactggtta ttctgattac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagacccc 300 tacggctgga ctatggactc ctggggccaa gggactctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR1 <400> 34 ggctacacct ttactaggta ctggatgcac 30 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR2 <400> 35 tacattaatc ctagcactgg ttattctgat tacaatcaga agttcaagga c 51 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VH 76 CDR3 <400> 36 gacccctacg gctggactat ggactcc 27 <210> 37 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 <400> 37 gacatccaga tgacccagtc tccatccagt ctgtctgcat cccttggaga cacaattacc 60 atcacttgcc atgccagtca gaacattaat gtttggttaa gctggtacca gcagaaacca 120 ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 180 aggtttagtg gcagtggatc tggaacaggt ttcacattaa ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagacattg ccacttacta ctgtcaacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tcgagatcaa a 321 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR1 <400> 38 catgccagtc agaacattaa tgtttggtta agc 33 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR2 <400> 39 aaggcttcca acttgcacac a 21 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide anti-CD100 VL 76 CDR3 <400> 40 caacagggtc aaagttatcc gtacacg 27

Claims (1)

  1. 2503 또는 67로 이루어진 군에서 선택된 기준 단일클론 항체와 동일한 CD100 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 결합 분자.
KR1020177017649A 2009-05-08 2010-05-07 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법 KR20170080705A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17682609P 2009-05-08 2009-05-08
US61/176,826 2009-05-08
US32521310P 2010-04-16 2010-04-16
US61/325,213 2010-04-16
PCT/US2010/034116 WO2010129917A2 (en) 2009-05-08 2010-05-07 Anti-cd100 antibodies and methods for using the same

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117029324A Division KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2010-05-07 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170080705A true KR20170080705A (ko) 2017-07-10

Family

ID=43050912

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117029324A KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2010-05-07 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법
KR1020177017649A KR20170080705A (ko) 2009-05-08 2010-05-07 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117029324A KR101754433B1 (ko) 2009-05-08 2010-05-07 항-ｃｄ100 항체 및 이의 사용 방법

Country Status (19)

Country Link
US (6) US8496938B2 (ko)
EP (2) EP3320920A1 (ko)
JP (3) JP6059013B2 (ko)
KR (2) KR101754433B1 (ko)
CN (2) CN102458468B (ko)
AU (2) AU2010245668B2 (ko)
CA (1) CA2760890C (ko)
DK (1) DK2427212T3 (ko)
EA (1) EA025245B1 (ko)
ES (1) ES2647823T3 (ko)
IL (3) IL216002A (ko)
MX (2) MX2011011718A (ko)
NO (1) NO2427212T3 (ko)
NZ (2) NZ618067A (ko)
PL (1) PL2427212T3 (ko)
PT (1) PT2427212T (ko)
SG (1) SG175417A1 (ko)
WO (1) WO2010129917A2 (ko)
ZA (1) ZA201108162B (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG175417A1 (en) 2009-05-08 2011-12-29 Vaccinex Inc Anti-cd100 antibodies and methods for using the same
EP2487242A1 (en) 2011-02-09 2012-08-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg B-type plexin antagonists and uses thereof
ES2640567T3 (es) 2011-05-13 2017-11-03 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Promotor de la osteogénesis
JP6395606B2 (ja) * 2011-10-11 2018-09-26 バクシネックス インコーポレーティッド 血液脳関門透過性の調節のためのセマフォリン−４ｄ結合分子の使用
US8790652B2 (en) 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
AT512165B1 (de) * 2011-12-27 2013-06-15 Blum Gmbh Julius Antriebsvorrichtung für ein bewegbares möbelteil
US9090709B2 (en) 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
US10494440B2 (en) * 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
US10626163B2 (en) 2013-01-25 2020-04-21 Brandeis University Methods of modulating GABAergic inhibitory synapse formation and function
MD20180107A2 (ro) 2013-03-18 2019-06-30 Biocerox Products B.V. Anticorpi anti-CD134 (OX40) umanizaţi şi utilizarea acestora
DK3013350T3 (da) * 2013-06-25 2020-04-14 Vaccinex Inc Anvendelse af semaphorin-4D-hæmmende molekyler i kombination med en immunmodulerende terapi for at hæmme tumorvækst og metastaser
NZ630881A (en) * 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
WO2017184951A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
MX2019001453A (es) 2016-08-02 2019-06-20 Vaccinex Inc Metodos mejorados para producir genotecas de polinucleotidos en virus vacuna/ celulas eucariotas.
ES2912269T3 (es) 2016-09-27 2022-05-25 Cero Therapeutics Inc Moléculas de receptor de engullimiento quimérico
MX2019011130A (es) 2017-03-20 2019-11-05 Vaccinex Inc Tratamiento del cancer con un anticuerpo semaforina-4d en combinacion con un agente de modulacion epigenetica.
EP3600421A4 (en) 2017-03-23 2021-01-06 The Trustees of The University of Pennsylvania ANTI-C5A ANTIBODIES AND USES THEREOF
JP7246320B2 (ja) 2017-05-05 2023-03-27 バクシネックス インコーポレーティッド ヒト抗セマフォリン４ｄ抗体
CN111386284A (zh) 2017-09-26 2020-07-07 森罗治疗公司 嵌合吞噬受体分子和使用方法
WO2019191332A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Cero Therapeutics, Inc. Chimeric engulfment receptors and uses thereof for neurodegenerative diseases
CN110713537B (zh) * 2018-07-13 2023-04-21 江苏怀瑜药业有限公司 一种sema4d抗体及其制备方法和应用
CN109125731B (zh) * 2018-10-22 2019-10-25 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Sema4D/PlexinB1抑制剂在制备治疗及预防眼底血管疾病药物中的应用
US20200317788A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-08 Vaccinex, Inc. Semaphorin-4d antagonists for use in cancer therapy
MX2021015970A (es) * 2019-06-21 2022-04-06 Vaccinex Inc Terapia de combinacion con bloqueo de semaforina-4d (sema4d) y terapia de dc1.
CN114341170B (zh) * 2019-07-19 2023-09-01 神州细胞工程有限公司 一种人源化抗vegfr2抗体及其应用
US20210032322A1 (en) * 2019-08-01 2021-02-04 Vaccinex, Inc. Combined inhibition of semaphorin-4d and tgf-beta and compositions therefor
CA3181833A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4d binding molecules for the treatment of rett syndrome
CN113583122B (zh) * 2021-07-29 2023-08-29 武汉华美生物工程有限公司 抗人sema4d抗体及其制备方法和应用
KR20240063995A (ko) 2021-09-27 2024-05-10 백시넥스 인코포레이티드 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 항-세마포린-4d 결합 분자의 사용을 위한 예측 결과 프로파일링
WO2023081766A2 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Antibody-drug conjugates against the receptor tyrosine kinase epha5
WO2023154906A1 (en) 2022-02-13 2023-08-17 Vaccinex, Inc. Combination therapy with semaphorin-4d blockade and htt-lowering agent for treatment of huntington's disease
CN117866091A (zh) * 2022-10-12 2024-04-12 三优生物医药(上海)有限公司 抗cd100抗体及其用途
CN118108841A (zh) * 2022-11-30 2024-05-31 三优生物医药(上海)有限公司 抗cd100抗体及其用途

Family Cites Families (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5070192A (en) * 1988-03-23 1991-12-03 The Johns Hopkins University Cloned human topoisomerase i: cdna expression, and use for autoantibody detection
AU631802B2 (en) 1988-06-14 1992-12-10 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
EP0479909B1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
WO1991014438A1 (en) 1990-03-20 1991-10-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
AU8727291A (en) 1990-10-29 1992-06-11 Cetus Oncology Corporation Bispecific antibodies, method of production, and uses thereof
ATE218889T1 (de) 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
EP0511011B1 (en) 1991-04-26 1996-10-23 Surface Active Limited Novel antibodies and methods for their use
US6497872B1 (en) 1991-07-08 2002-12-24 Neurospheres Holdings Ltd. Neural transplantation using proliferated multipotent neural stem cells and their progeny
FR2686087A1 (fr) 1992-01-13 1993-07-16 Inst Nat Sante Rech Med Nouvel antigene lymphocytaire, anticorps correspondant et leurs applications.
EP1306095A3 (en) 1992-03-05 2003-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
ES2229206T3 (es) * 1993-01-14 2005-04-16 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Anticuerpo anti-vih recombinante y su preparacion.
US5639856A (en) 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6576754B2 (en) 1995-11-09 2003-06-10 Dana-Farber Cancer Institute CD100 antigen and uses therefor
SI1325932T1 (ko) 1997-04-07 2005-08-31 Genentech Inc
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
AU6897998A (en) 1997-04-11 1998-11-11 Dendreon Corporation Composition and method for inducing an immune response against tumour-rela ted antigens
EP0892047A3 (de) 1997-07-09 2000-03-08 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Humanes und murines Semaphorin L
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US6638501B1 (en) 1997-09-29 2003-10-28 Neurospheres Holdings Ltd. Use of multipotent neural stem cell progeny to augment non-neural tissues
US5958767A (en) 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
WO2000028016A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 University Of Rochester T cells specific for target antigens and methods and vaccines based thereon
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
JP3787473B2 (ja) 1999-11-30 2006-06-21 独立行政法人科学技術振興機構 セマフォリン受容体
AU2913801A (en) 1999-12-23 2001-07-03 Cornell Research Foundation Inc. A method for isolating and purifying multipotential neural progenitor cells and multipotential neural progenitor cells
US6635742B1 (en) 2000-01-25 2003-10-21 Nuvelo, Inc. Antibodies specific for semaphorin-like polypeptides
CN1329060A (zh) * 2000-06-19 2002-01-02 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人semaphorin蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
AU2001297872B2 (en) 2000-11-17 2006-11-09 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
ATE440869T1 (de) * 2001-06-20 2009-09-15 Fibron Ltd Fgfr3 blockierende antikírper, verfahren zum screening darauf und verwendungen davon
US20030020733A1 (en) 2001-07-24 2003-01-30 Yin Memphis Zhihong Computer display having selective area magnification
ITTO20010128U1 (it) 2001-07-25 2003-01-25 Aris Spa Struttura ausiliaria particolarmente per l'incremento della capacita'di trasporto dei veicoli cingolati polivalenti tipo m 113 e derivati.
US6905856B2 (en) * 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
US20080219974A1 (en) * 2002-03-01 2008-09-11 Bernett Matthew J Optimized antibodies that target hm1.24
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1365018A1 (en) 2002-05-23 2003-11-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) CD100 semaphorin in myelination
DE60334453D1 (de) * 2002-05-30 2010-11-18 Macrogenics Inc Cd16a bindungsproteine und verwendung zur behandlung von immunkrankheiten
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
EP1442749A1 (en) 2003-01-31 2004-08-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of anti-CD100 antibodies for the treatment and the diagnosis of inflammatory disorder affecting the central nervous system
KR20060006975A (ko) 2003-05-30 2006-01-20 제넨테크, 인크. 항-ｖｅｇｆ 항체를 사용한 치료
AU2004272607B2 (en) * 2003-09-11 2008-11-06 Cornerstone Therapeutics Inc. Monoclonal antibodies against HMGB1
JP5042631B2 (ja) 2003-12-04 2012-10-03 バクシネックス インコーポレーティッド アポトーシス腫瘍細胞上に露出した細胞内抗原をターゲッティングすることによって腫瘍細胞を死滅させる方法
EP2336178A1 (en) 2003-12-11 2011-06-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting C-Met dimerization and activation
CN104804095A (zh) 2004-08-05 2015-07-29 健泰科生物技术公司 人源化抗c-met 拮抗剂
US20060147449A1 (en) 2004-11-15 2006-07-06 Brass Lawrence F Method of using CD100 (or Sema4D) to mediate platelet activation and inflammatory responses
JP2008535856A (ja) * 2005-04-07 2008-09-04 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド 癌の診断、検出および治療におけるｓｅｍａ４ｄ
MX2008006355A (es) * 2005-11-16 2008-10-17 Novartis Ag Biomarcadores para tratamiento con anticuerpo anti-nogo-a en lesion de la medula espinal.
JP2007308465A (ja) 2006-05-15 2007-11-29 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh 炎症性疾患、自己免疫疾患又は骨吸収異常の治療方法
US7657639B2 (en) * 2006-07-21 2010-02-02 International Business Machines Corporation Method and system for identity provider migration using federated single-sign-on operation
WO2008025020A2 (en) * 2006-08-25 2008-02-28 Seattle Genetics, Inc. Cd30 binding agents and uses thereof
US9382327B2 (en) 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
US7919594B2 (en) * 2007-02-14 2011-04-05 Vaccinex, Inc. Human anti-CD100 antibodies
JP5357782B2 (ja) 2007-02-21 2013-12-04 バクシネックス インコーポレーティッド 抗原負荷ＣＤ１ｄ分子によるＮＫＴ細胞活性の調節
US8637026B2 (en) 2007-12-26 2014-01-28 Vaccinex, Inc. Anti-C35 antibody combination therapies and methods
PE20091378A1 (es) 2008-01-10 2009-10-14 Genentech Inc Polipeptidos agonistas plexind1
SG175417A1 (en) 2009-05-08 2011-12-29 Vaccinex Inc Anti-cd100 antibodies and methods for using the same
DK2429585T3 (en) 2009-05-15 2018-07-30 Irx Therapeutics Inc VACCINE IMMUNOTHERAPY
NZ604464A (en) 2010-06-14 2014-03-28 Vaccinex Inc Anti-vegf antibodies and uses thereof
WO2012031099A2 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Vaccinex, Inc. Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same
ES2640567T3 (es) 2011-05-13 2017-11-03 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Promotor de la osteogénesis
SG11201401294WA (en) 2011-10-06 2014-09-26 Univ Texas Anti-human sema4a antibodies useful to treat disease
JP6395606B2 (ja) 2011-10-11 2018-09-26 バクシネックス インコーポレーティッド 血液脳関門透過性の調節のためのセマフォリン−４ｄ結合分子の使用
US8790652B2 (en) 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
WO2013130959A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Vaccinex, Inc. Methods for the treatment of b cell-mediated inflammatory diseases
US9375282B2 (en) 2012-03-26 2016-06-28 Covidien Lp Light energy sealing, cutting and sensing surgical device
US9090709B2 (en) 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
EP2951204B1 (en) 2013-01-31 2019-05-22 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin a levels
US9371352B2 (en) 2013-02-08 2016-06-21 Vaccinex, Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
DK3013350T3 (da) 2013-06-25 2020-04-14 Vaccinex Inc Anvendelse af semaphorin-4D-hæmmende molekyler i kombination med en immunmodulerende terapi for at hæmme tumorvækst og metastaser
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
WO2017184951A1 (en) 2016-04-22 2017-10-26 Vaccinex, Inc. Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions
MX2019001453A (es) 2016-08-02 2019-06-20 Vaccinex Inc Metodos mejorados para producir genotecas de polinucleotidos en virus vacuna/ celulas eucariotas.
RU2766341C2 (ru) 2017-02-22 2022-03-15 Вакцинекс, Инк. Раннее обнаружение активации глиальных клеток при нейродегенеративных или нейровоспалительных заболеваниях

Also Published As

Publication number Publication date
EP2427212A2 (en) 2012-03-14
EP3320920A1 (en) 2018-05-16
EA025245B1 (ru) 2016-12-30
IL216002A (en) 2016-07-31
US8816058B2 (en) 2014-08-26
JP6096946B2 (ja) 2017-03-15
CN102458468B (zh) 2018-05-18
DK2427212T3 (en) 2017-12-04
EP2427212B1 (en) 2017-08-23
AU2010245668A1 (en) 2011-11-24
US9676840B2 (en) 2017-06-13
ZA201108162B (en) 2012-07-25
NZ596136A (en) 2013-12-20
CA2760890A1 (en) 2010-11-11
CN102458468A (zh) 2012-05-16
MX353352B (es) 2018-01-10
IL244197A0 (en) 2016-04-21
JP6059013B2 (ja) 2017-01-11
US8496938B2 (en) 2013-07-30
US12006364B2 (en) 2024-06-11
AU2016247068A1 (en) 2016-11-03
NZ618067A (en) 2015-07-31
CN108912228A (zh) 2018-11-30
ES2647823T3 (es) 2017-12-26
AU2010245668B2 (en) 2016-07-14
US20140072578A1 (en) 2014-03-13
US11274149B2 (en) 2022-03-15
KR20120044300A (ko) 2012-05-07
MX2011011718A (es) 2012-01-27
US20220185884A1 (en) 2022-06-16
EP2427212A4 (en) 2012-11-14
CA2760890C (en) 2019-08-20
JP2012525854A (ja) 2012-10-25
SG175417A1 (en) 2011-12-29
PL2427212T3 (pl) 2018-02-28
IL216002A0 (en) 2012-01-31
WO2010129917A3 (en) 2011-01-06
PT2427212T (pt) 2017-11-20
WO2010129917A2 (en) 2010-11-11
NO2427212T3 (ko) 2018-01-20
JP2016128474A (ja) 2016-07-14
JP2017113017A (ja) 2017-06-29
US9605055B2 (en) 2017-03-28
US20100285036A1 (en) 2010-11-11
EA201171374A1 (ru) 2012-06-29
US20130274449A1 (en) 2013-10-17
US20170306017A1 (en) 2017-10-26
KR101754433B1 (ko) 2017-07-05
IL261348A (en) 2018-10-31
CN108912228B (zh) 2022-03-15
US20120270268A1 (en) 2012-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12006364B2 (en) Anti-CD100 antibodies and methods for using the same
US11981730B2 (en) Anti-CXCL13 antibodies and methods of using the same
US12006365B2 (en) Human anti-semaphorin 4D antibody
RU2776443C2 (ru) Антитела человека против семафорина 4d
SMITH et al. Patent 2760890 Summary
BRPI1012216B1 (pt) Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao cd100, composições que compreendem os mesmos, polinucleotídeo e uso do dito anticorpo ou fragmento para tratar uma doença autoimune,doença inflamatória ou câncer

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application