ES2229206T3 - Anticuerpo anti-vih recombinante y su preparacion. - Google Patents

Anticuerpo anti-vih recombinante y su preparacion.

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ES2229206T3 ES93901547T ES93901547T ES2229206T3 ES 2229206 T3 ES2229206 T3 ES 2229206T3 ES 93901547 T ES93901547 T ES 93901547T ES 93901547 T ES93901547 T ES 93901547T ES 2229206 T3 ES2229206 T3 ES 2229206T3
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Kazuhiko Kimachi
Yasuyuki Eda
Kouichi Shiosaki
Kiyoshi Osatomi
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN FRAGMENTO DE UN GEN QUE CODIFICA LAS REGIONES VARIABLES DE UN ANTICUERPO QUE POSEE UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH), A UN NUEVO ANTICUERPO RECOMBINANTE ANTI-VIH EXPRESADO MEDIANTE LA UTILIZACION DEL GEN ANTEDICHO Y A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DEL MISMO. UN ANTICUERPO QUIMERICO DE RATON-HUMANO Y UN ANTICUERPO DE RATON-HUMANO MODIFICAD, QUE POSEEN UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIH, SE OBTIENEN DETERMINANDO UNA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS ESPECIFICA DE UN FRAGMENTO DE UN GEN QUE CODICIA LAS REGIONES VARIABLES DE LAS CADENAS H Y L DE UN ANTICUERPO QUE POSEE UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIH Y FUSIONANDO ARTIFICIALMENTE SINTETIZADO EN BASE A LA SECUENCIA DETERMINADA CON UN GEN QUE CODIFICA LA INMUNOGLOBULINA HUMANA. EL NUEVO ANTICUERPO ANTI-VIH ES UTIL PARA EL TRATAMIENTO Y LA PREVENCION DEL SIDA.

Description

Anticuerpo anti-VIH recombinante y su preparación.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo anti-VIH recombinante que puede esperarse que sea utilizado para el tratamiento y la prevención del SIDA provocado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-VIH recombinante (un anticuerpo remodelado) que tiene actividad neutralizante frente al VIH, siendo expresado dicho anticuerpo utilizando una técnica de recombinación genética a partir de un gen de inmunoglobulina de ratón y un gen de inmunoglobulina humana, y a un nuevo proceso para la preparación del mismo. La presente invención se refiere además a fragmentos de ADN que codifican la región variable de la cadena H y de la cadena L que pueden ser utilizados eficazmente para la expresión de tal anticuerpo recombinante útil.
Antecedentes
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad vírica causada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) perteneciente a los retrovirus. Esta enfermedad, desde su descubrimiento en los Estados Unidos en 1981, se ha extendido rápidamente por todo el mundo, pero no se ha establecido todavía una vacuna eficaz ni un método eficaz para tratar dicha enfermedad.
Bajo tales circunstancias, existen informes sobre la relevancia entre la clínica y un anticuerpo neutralizante en un grupo de pacientes talasémicos que presentaban VIH positivo después de una transfusión y en un grupo de niños con SIDA o con ARC (síndrome relacionado con el SIDA) [R. Guroff y col., J. Immunol., 138, p. 3731 (1987); R. Guroff y col., Pediatric Research, en prensa]. En ambos informes se menciona que el síntoma clínico era leve y benigno en aquellos casos en los que era detectable un anticuerpo neutralizante, mientras que resultó maligno en aquellos casos en los que no pudo detectarse anticuerpo neutralizante. Estos hechos sugieren la eficacia in vivo de un anticuerpo neutralizante. Por tanto, se espera que un anticuerpo anti-VIH neutralizante sea utilizable para la prevención de la expansión de la infección o para la exclusión de células infectadas, y que muestre un efecto más elevado cuando se utilice en combinación con agentes antivíricos, etc., utilizados en la clínica actualmente.
Aunque es posible que el anticuerpo neutralizante anti-VIH según se mencionó anteriormente sea obtenido directamente o preparado a partir de pacientes con SIDA, se espera que este método conlleve varias dificultades tales como un problema ético, la disponibilidad de materiales o un problema de biopeligrosidad. A este respecto, como alternativa a tal suero con título elevado, se considera la utilización de un anticuerpo monoclonal que tenga actividad neutralizante frente al virus VIH. Aunque se ha establecido ya una técnica básica para la preparación de un anticuerpo monoclonal en un anticuerpo monoclonal de tipo ratón, un anticuerpo de ratón es muy poco utilizable en aplicaciones clínicas a la vista de sus efectos colaterales (se considera que un anticuerpo monoclonal de ratón, cuando es administrado a humanos, causa efectos colaterales tales como choque anafiláctico o enfermedad sérica al ser una proteína heterogénea) etc., y por tanto, la utilización de un anticuerpo monoclonal humano es finalmente preferible.
Sin embargo, la preparación de un anticuerpo monoclonal humano provoca muchos problemas que han de ser resueltos para preparar un anticuerpo que tenga una especificidad deseada, y es realmente bastante difícil en comparación con la preparación de un anticuerpo monoclonal de tipo ratón. Para resolver tales problemas, se ha descrito recientemente un método para preparar un anticuerpo monoclonal quimérico utilizando una técnica de recombinación genética en la que la región variable, que caracteriza la especificidad de un anticuerpo, tiene una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón y la región constante tiene una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano.
Tal anticuerpo monoclonal quimérico se obtiene mediante la expresión de un gen del anticuerpo quimérico ratón(V)-humano(C), que comprende un gen variable (V) como material para la región V que es clonado a partir de un hibridoma de ratón que produce un anticuerpo monoclonal de ratón, y un gen constante (C) como material para la región C que es clonado a partir de una célula humana tal como una célula humana productora de anticuerpos, en una célula animal o en una célula de un microorganismo, etc., estando presente el anticuerpo monoclonal quimérico deseado en el sobrenadante de un cultivo. Ha habido varios informes sobre anticuerpos quiméricos [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 60-155132, Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 61-47500] y los presentes inventores han preparado ya con éxito un anticuerpo quimérico [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 2-2352]. La técnica anterior describe además un anticuerpo monoclonal anti-VIH, 0.5\beta, y su anticuerpo de tipo quimérico, C\beta1, que puede neutralizar HTLV-IIIB (Solicitud de Patente Europea Nº 0327000). Además, para fomentar esta idea de un anticuerpo quimérico, se ha descrito también la preparación de un anticuerpo remodelado [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 62-296890]. Además, la Solicitud de Patente Europea Nº 239400 describe la producción de un anticuerpo remodelado (mencionado en la misma como "anticuerpo alterado") mediante la sustitución de porciones de la CDR de una región variable de un anticuerpo por otras procedentes de un anticuerpo diferente utilizando una técnica de ADN recombinante.
El análisis del gen de las inmunoglobulinas ha experimentado un progreso rápido en nuestros días con el avance rápido de las técnicas de manipulación genética. Es bien conocido que un gen de inmunoglobulina consta de un gen de la región variable (región V) implicada en la unión al antígeno y un gen de la región constante (región C) que tiene una actividad fisiológica relacionada con interacciones con el complemento o con células específicas, etc. Un gen de la región V está formado por un gen seleccionado de un grupo de varios fragmentos del gen V, un grupo de fragmentos del gen D (no encontrado en una cadena L) y un grupo de fragmentos del gen J, estando unidos los genes seleccionados en este orden. Además, el fragmento génico unido (gen de la región V) está alterado además por una pequeña modificación con una mutación somática. Esto es, la especificidad de un anticuerpo está determinada por una combinación de cada uno de los fragmentos génicos del gen de la región V de la cadena H y de la cadena L y una mutación somática [cf. Susumu Tonegawa, Nature, 307, p. 575 (1983); Tasuku Honjo, Annual Rev. Immunol. 1, p. 499 (1983)]. Por consiguiente, se considera que para un antígeno específico debe haber una combinación de un fragmento génico VDJ específico de la cadena H y un fragmento génico VJ específico de la cadena L y una mutación somática específica. Además, una combinación de estos fragmentos génicos o de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de los mismos puede difícilmente ser deducida de una estructura, de una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, etc., de un antígeno, sino que puede ser determinada solamente mediante el aislamiento de un gen del anticuerpo o de una proteína anticuerpo a partir de células que produzcan realmente el anticuerpo. De esta forma, una región variable de una molécula de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que varía con cada determinante antigénico, y una región variable tiene una secuencia de aminoácidos que varía completamente con cada antígeno.
En cuanto al anticuerpo anti-VIH recombinante objetivo de la presente invención, los presentes inventores han publicado ya el anticuerpo recombinante 0.5\beta como un anticuerpo neutralizante anti-VIH [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 2-2352], pero dicho anticuerpo recombinante puede neutralizar específicamente HTLV-IIIB pero no HTLV-IIIMN que es frecuente desde el punto de vista epidémico. Además, la Solicitud de Patente Europea Nº 465979 describe los anticuerpos monoclonales anti-VIH \mu5.5 y \mu39.1, que pueden neutralizar HTLV-IIIMN. Sin embargo, el anticuerpo descrito en la misma es un anticuerpo monoclonal de ratón, pero no un anticuerpo recombinante. Según se mencionó anteriormente, para la preparación de un anticuerpo recombinante, es muy importante encontrar un gen que codifique una secuencia de aminoácidos de una región variable de una molécula de anticuerpo que tenga capacidad de unión a un antígeno deseado. Debido a la dificultad de encontrar un gen que codifique una secuencia de aminoácidos de una región variable de un anticuerpo que tenga actividad neutralizante frente al VIH, especialmente frente al HTLV-IIIMN, objetivo de la presente invención, no hay ningún informe de la obtención de un anticuerpo recombinante que se una a, y neutralice sustancialmente, HTLV-IIIMN.
Objeto de la invención
Bajo tales circunstancias, los presentes inventores han aislado con éxito un gen que codifica una región variable de un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante frente al VIH (HTLV-IIIMN) a partir de células (hibridomas) que producen dicho anticuerpo. Los presentes inventores han intentado además producir la expresión de un anticuerpo recombinante de ratón-humano utilizando dicho gen, y como resultado han preparado con éxito un anticuerpo recombinante que tiene actividad neutralizante frente al VIH (HTLV-IIIMN) y de este modo se ha completado la presente invención. Esto es, la presente invención proporciona un gen que codifica una región variable de un anticuerpo neutralizante anti-VIH que no había sido descrito nunca hasta ahora, y proporciona un anticuerpo anti-VIH recombinante expresado en una célula transformada mediante la utilización de dicho gen. Un objeto de la presente invención es hacer posible el desarrollo de agentes para diagnóstico, tratamiento y prevención del SIDA con efectos colaterales disminuidos, que comprendan dicho nuevo anticuerpo recombinante anti-VIH.
Breve explicación de las figuras
Con fines ilustrativos, la Fig. 1 muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región variable de la cadena H del anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu39.1 mostrado en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
Con fines ilustrativos, la Fig. 2 muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región variable de la cadena L del anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu39.1 mostrado en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
La Fig. 3 muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región variable de la cadena H del anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu5.5 mostrado en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
La Fig. 4 muestra una secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región variable de la cadena L del anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu5.5 mostrado en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
La Fig. 5 muestra con fines ilustrativos la estructura de los plásmidos de expresión de la cadena H del anticuerpo quimérico anti-VIH, CH\mu39.1 y CH\mu5.5, construidos en el Ejemplo (4).
La Fig. 6 muestra con fines ilustrativos la estructura de los plásmidos de expresión de la cadena L del anticuerpo quimérico anti-VIH, CL\mu39.1 y CL\mu5.5, construidos en el Ejemplo (4).
\newpage
Con fines ilustrativos, la Fig. 7 muestra las actividades anti-VIH del anticuerpo quimérico anti-VIH \mu39.1 medidas en el Ejemplo (5) y del anticuerpo remodelado anti-VIH \mu39.1 medidas en el Ejemplo (7).
Con fines ilustrativos, la Fig. 8 muestra las actividades anti-VIH del anticuerpo quimérico anti-VIH \mu5.5 medidas en el Ejemplo (5) y del anticuerpo remodelado anti-VIH \mu5.5 medidas en el Ejemplo (7).
Con fines ilustrativos, la Fig. 9 muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena H del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu39.1 preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
Con fines ilustrativos, la Fig. 10 muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena L del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu39.1 preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
La Fig. 11 muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena H del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu5.5 preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
La Fig. 12 muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena L del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu5.5 preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
Descripción de la invención
Las células productoras del anticuerpo monoclonal de ratón anti-VIH (HTLV-IIIMN) utilizadas en la presente invención son preparadas mediante la técnica hasta ahora establecida para preparar un anticuerpo monoclonal de ratón. Por ejemplo, puede prepararse mediante la inmunización de ratones con un inmunógeno apropiado, por ejemplo una partícula vírica obtenida de células productoras de VIH (HTLV-IIIMN), o con la glicoproteína de la envoltura gp120 purificada, o con un péptido recombinante preparado mediante la utilización de una técnica de recombinación genética, preferiblemente un péptido recombinante correspondiente a la secuencia de aminoácidos de gp120 N^{os} 247-370, o con un péptido sintético adecuado preparado sobre la base de una secuencia de aminoácidos de dicha proteína vírica, preferiblemente un péptido sintético correspondiente a la secuencia de aminoácidos de gp120 N^{os} 203-325, etc., la fusión de las células esplénicas obtenidas con células de mieloma de ratón, la selección a partir de los hibridomas obtenidos de las células que reaccionan con la glicoproteína de la envoltura gp120 purificada o con el péptido recombinante anterior o con el péptido sintético anterior, y el cultivo de dichas células. Además, se seleccionan las células que producen un anticuerpo monoclonal que tiene actividad neutralizante frente al VIH a partir de las células productoras de anticuerpos monoclonales de ratón anti-VIH así obtenidas. En el caso del VIH, no es fácil obtener un anticuerpo monoclonal que tenga tal actividad neutralizante debido a sus propias características, pero como tal línea celular los presentes inventores han establecido ya con éxito células hibridomas \mu5.5 que producen un anticuerpo que tiene actividad neutralizante frente al VIH (HTLV-IIIMN) [Solicitud de Patente Japonesa Nº 2-188300], siendo utilizadas muy preferiblemente estas líneas celulares para la presente invención.
El fragmento génico que codifica una regiónvariable de la presente invención es aislado de las células productoras de anticuerpos monoclonales neutralizantes anti-VIH anteriormente mencionadas y se analiza una secuencia génica del mismo. Sin embargo, según se mencionó anteriormente, tales células contienen un gran número de genes que constan de la región V además de un gen que codifica una región V específica para un anticuerpo anti-VIH deseado (por ejemplo, un grupo de genes V solos de la cadena VH que determina la especificidad de un anticuerpo de ratón incluye más de 100 genes diferentes, un grupo de genes D incluye más de 11 genes y un grupo de genes J incluye 4 genes. De manera similar, un grupo de genes V de la cadena V\kappa incluye más de 300 genes aproximadamente y un grupo genes J incluye 4 genes) y, por tanto, es necesario aislar un gen que codifique una región V específica para un anticuerpo anti-VIH deseado. Un gen de la región V puede ser aislado mediante la técnica convencional de manipulación génica, incluyendo, por ejemplo, un método de clonaje de un gen de la región V procedente de un ADN cromosómico de la célula mediante la utilización del método convencional [cf. por ejemplo, T. Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab. (1982)] o un método para sintetizar ADNc a partir del ARNm de las células utilizando el método convencional [por ejemplo, D.M. Glover ed., "DNA cloning Vol. I" IRL press (1985)] y clonando el gen de la región V. En cualquiera de los métodos, puede utilizarse como sonda para el clonaje de un gen de la región V una sonda de ADN, etc., sintetizada por referencia a la secuencia de nucleótidos de un gen de inmunoglobulina de ratón que haya sido ya descrito [por ejemplo, Sakano y col., Nature, 286, p. 676 (1980); E.E. Max y col., J. Biol. Chem., 256, p. 5116 (1981)]. Puede llevarse a cabo también un clonaje con PCR (reacción en cadena de la polimerasa) [R. Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 (1989); W.D. Huse y col., Science, 246, 1275 (1989)].
El gen de la región V así clonado fue analizado genéticamente por varios métodos tal como el método para preparar un anticuerpo quimérico [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 2-2352] o un método para preparar un anticuerpo remodelado [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 62-296890]. Como resultado, se encontró que el fragmento génico de la presente invención que codifica una región V de un anticuerpo anti-VIH se caracteriza porque contiene, como secuencia génica específica, un gen que codifica un aminoácido de:
(H-b):
(a) Glu-Tyr-Thr-Met-His
(b) Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
(c) Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser
dentro de un gen que codifica la cadena H como una parte, y un secuencia génica que codifica un aminoácido de
(L-b):
(a) Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
(b) Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
(c) Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr
dentro de un gen que codifica la cadena L como una parte. Cada grupo de estas tres secuencias de aminoácidos contenidas en la cadena H y en la cadena L, respectivamente, es considerado como una secuencia de aminoácidos importante que determina la capacidad de unión de una molécula de anticuerpo, y tales secuencias de aminoácidos eran consideradas como estrechamente relacionadas con una función de una molécula de anticuerpo que tenía actividad neutralizante frente al VIH. Esto es, mediante referencia a los resultados del análisis general de un gen de un anticuerpo descrito por Kabat y col. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., U.S. Department of Health and Human Services (1987)], se encontró que las secuencias de aminoácidos anteriores eran una secuencia de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3) de una región variable que determina la actividad como anticuerpo del anticuerpo anti-VIH de la presente invención. Un gen que codifica tal región variable de una molécula de anticuerpo que tiene actividad neutralizante anti-VIH incluye, a manera de ejemplo preferible, fragmentos génicos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en la Fig. 3 o las secuencias de aminoácidos mostradas en la Fig. 4 para la cadena H o para cadena L, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos específica de tales genes incluye, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos mostradas en la Fig. 3 o en la Fig. 4 para la cadena H o para la cadena L, respectivamente.
Sobre la base de las secuencias de nucleótidos anteriores proporcionadas por la presente invención, puede prepararse un anticuerpo recombinante que tenga actividad neutralizante frente al VIH. Esto es, puede prepararse un anticuerpo anti-VIH recombinante deseado, un anticuerpo anti-VIH remodelado, mediante la preparación, como gen que codifica una región variable de tal anticuerpo recombinante, de ADNs sintéticos, etc., que son fragmentos de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos anteriores como región determinante de la complementariedad, y la fusión de dichos ADNs con un gen que codifique una inmunoglobulina humana. El anticuerpo anti-VIH recombinante de la presente invención así preparado se caracteriza porque contiene, como región determinante de la complementariedad de la región variable de la cadena H, las secuencias siguientes (CDR1 a CDR3):
(H-B):
CDR1: Glu-Tyr-Thr-Met-His
CDR2: Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
CDR3: Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser.
El anticuerpo anti-VIH recombinante de la presente invención se caracteriza también porque contiene, como región determinante de la complementariedad de la región variable de la cadena L, las secuencias siguientes (CDR1 a CDR3):
(L-B):
CDR1: Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
CDR2: Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
CDR3: Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr.
Además, los presentes inventores han encontrado también que, al preparar un anticuerpo remodelado, puede obtenerse un anticuerpo recombinante que retiene más totalmente la actividad del anticuerpo original mediante la sustitución de, además de las regiones determinantes de la complementariedad, una porción de la región de entramado (FR) adyacente a dichas regiones determinantes de la complementariedad por una secuencia derivada de ratón en lugar de por la sustitución de las regiones determinantes de la complementariedad solas por una secuencia derivada de ratón según se ha descrito hasta ahora.
Cuando se utilizan las secuencias de las regiones determinantes de la complementariedad (H-B) como gen de la región variable de la cadena H, puede prepararse un anticuerpo anti-VIH remodelado que tiene una actividad más excelente mediante la preparación de un gen de la región variable de la cadena H en el que un aminoácido en el extremo C de la FR1 adyacente a la región determinante de la complementariedad CDR1 de una región variable es treonina (Thr), una secuencia de dos aminoácidos en el extremo C de la FR2 adyacente a CDR2 es Ile-Gly, una secuencia de seis aminoácidos en el extremo N de la FR3 adyacente a CDR2 es Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val y un aminoácido en el extremo C de la FR3 adyacente a CDR3 es treonina (Thr).
Una secuencia de nucleótidos del gen así preparado que codifica una región variable de la cadena H del anticuerpo anti-VIH remodelado de la presente invención, y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma, incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la Fig. 11 (en las que la porción subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de ratones). Por otra parte, una secuencia de nucleótidos del gen que codifica una región variable de la cadena L del anticuerpo anti-VIH remodelado de la presente invención, y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma, incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la Fig. 12 (en las que la porción subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de ratones).
Por otra parte, en la preparación de un anticuerpo quimérico anti-VIH de acuerdo con la presente invención, una secuencia de nucleótidos del gen que codifica una región variable de la cadena H y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma, incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la Fig. 3. Una secuencia de nucleótidos del gen que codifica una región variable de la cadena L y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la Fig. 4.
Por otra parte, un gen de la región constante (C) de la cadena H y de la cadena L de la inmunoglobulina humana utilizado para preparar el anticuerpo recombinante anti-VIH puede ser aislado de la misma manera, por ejemplo, de una célula productora de anticuerpos humanos. Como en un gen de la región C no tiene lugar una reordenación, una célula productora de anticuerpos humanos no es necesariamente utilizada para aislar un gen de una región C humana. El aislamiento puede ser realizado de la misma manera que el aislamiento del gen de la región V de ratón, según se mencionó anteriormente. Un gen de la región C no se limita a la cadena \gamma1 ni a la cadena \kappa, sino que puede utilizarse cualquier tipo de gen de la región C tal como el de la cadena \mu, la cadena \alpha, la cadena \gamma2, la cadena \gamma3, la cadena \gamma4, la cadena \varepsilon o la cadena \lambda. Sin embargo, si se desea una capacidad activadora del complemento o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, es preferible la cadena \gamma1.
El gen del anticuerpo recombinante anti-VIH, un gen de la cadena H y un gen de la cadena L, puede ser construido básicamente combinando los dos fragmentos génicos anteriormente mencionados (gen de la región V y gen de la región C). Por ejemplo, la construcción puede llevarse a cabo de acuerdo con el método mostrado previamente por Watanabe y col. [Watanabe y col., Cancer Research, 47, p. 999-1005 (1987)] o con los métodos descritos por M. Bruggemann [Waldmann H. (ed) Monoclonal Antibody Therapy. Prog. Allergy. Basel, Karger, 1988, vol. 45, pp. 91] o por S.L. Morrison [Advances in Immunology, 44, 65 (1989)]. Un sistema de vectores varía dependiendo del huésped utilizado para la expresión tal como un sistema de expresión de células animales, un sistema de expresión de E. coli o un sistema de expresión de levaduras, pero el gen de la presente invención puede ser expresado en cualquiera de estos sistemas de expresión. Además, puede utilizarse también un sistema de amplificación génica tal como DHFR.
Se confirmó que el anticuerpo recombinante de la presente invención así preparado tenía actividad neutralizante frente al VIH y, por tanto, la presente invención permite la preparación de un anticuerpo recombinante anti-VIH que hasta ahora no había sido nunca preparado. Tal anticuerpo anti-VIH recombinante, en la clínica del SIDA, puede ser un agente de tratamiento del SIDA sustancialmente eficaz. Además, los fragmentos génicos que codifican la región variable del anticuerpo anti-VIH proporcionados por la presente invención describen una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos específicas de una región variable de un anticuerpo que tiene actividad neutralizante frente al VIH y permiten el desarrollo de una molécula de anticuerpo recombinante anti-VIH más excelente mediante la modificación o la sustitución parcial de una molécula de anticuerpo deseada mediante el empleo de una técnica de recombinación genética más avanzada.
Modo mejor de llevar a cabo la invención
La presente invención es explicada con más detalle por los Ejemplos, pero no debe interpretarse como que está limitada a los mismos.
Con fines ilustrativos los ejemplos siguientes se refieren también al anticuerpo \mu39.1
Ejemplo (1) Preparación de células productoras de anticuerpos monoclonales de ratón anti-VIH
A continuación se muestra en la presente un método para preparar un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-VIH. El antígeno para inmunización incluía un péptido sintético correspondiente a la secuencia de aminoácidos N^{os} 303 a 325 de la glicoproteína gp120 de la envoltura de la cepa HTLV-IIIMN (SP-1: YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG) y un conjugado péptido-KLH (hemocianina de la lapa ojo de cerradura) que comprendía dicho péptido sintético unido a KLH, o una partícula vírica obtenida del sobrenadante de un cultivo de células productoras de HTLV-IIIMN (H9/HTLV-IIIMN) mediante centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa, o gp120 obtenida mediante la lisis de células procedentes del cultivo de H9/HTLV-IIIMN con Triton X-100 al 1% y la purificación posterior mediante cromatografía de afinidad a través de una columna de ConA-Sepharose 4B y una columna de anticuerpo hacia el VIH (IgG)-Sepharose 4B, o una proteína fusionada dominio V3 de gp120 de HTLV-IIIMN (aminoácidos 247-370)-\beta-galactosidasa que es preparada mediante el aislamiento y la amplificación por el método de PCR [G.I. LaRosa y col., Science, Vol. 249, p. 932 (1990)] de un fragmento de ADN que codifica el dominio V3 de gp120 de HTLV-IIIMN (aminoácidos 247-370) procedente de un ADN de alto peso molecular (ADN genómico) de células H9/HTLV-IIIMN y la expresión de dicho fragmento de ADN en E. coli utilizando el vector de expresión pUEX2 (fabricado por Amersham), o una combinación de estos antígenos. Después de la inmunización de ratones Balb/c 4 veces con estos inmunógenos, se extrajeron las células esplénicas y se realizó la fusión de las células con células de mieloma de ratón P3X63Ag8-U1X63 [ATCC CRL 1597] utilizando polietilén glicol (Sigma) y se llevó a cabo el clonaje. La actividad de unión a los inmunógenos anteriores de los anticuerpos del sobrenadante del cultivo de los clones obtenidos fue medida mediante inmunoensayo enzimático. Para los clones considerados positivos, los resultados fueron confirmados posteriormente mediante un método de transferencia Western y un método de fluorescencia indirecta con el fin de establecer los hibridomas que producían los anticuerpos monoclonales anti-VIH, \mu39.1 o \mu5.5 [Solicitud de Patente Japonesa Nº 2-188300, número de depósito; \mu39.1 (P-11472), \mu5.5 (BP-3402)]. Estos anticuerpos se unen al péptido SP-1 e inhiben la formación del sincitio entre las células infectadas con VIH y las células CD4 positivas no infectadas. Además, se confirmó también la actividad neutralizante de estos anticuerpos en un ensayo de neutralización del virus en el que estos anticuerpos son mezclados con el virus VIH y las células (H9) son infectadas con esta mezcla.
Para preparar un gen de la región V del anticuerpo recombinante anti-VIH de la presente invención según se menciona en la presente a continuación, se utilizaron las células productoras de estos anticuerpos monoclonales anti-VIH de ratón que tenían dicha actividad neutralizante (células \mu39.1, \mu5.5).
(2) Aislamiento del gen de la región V del anticuerpo anti-VIH de ratón
El aislamiento del gen de la región variable (V) de inmunoglobulina de ratón se llevó a cabo de la siguiente manera.
Se extrajeron los ARNs totales de células \mu39.1 y \mu5.5 de acuerdo con el método convencional [D.M. Glover ed. "DNA cloning Vol. I" IRL press (1985)] y se sintetizó un ADNc de hebra sencilla utilizando el sintetizador de ADNc System Plus (Amersham). Utilizando como molde este ADNc de hebra sencilla, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de ADN que fueron sintetizados sobre la base de las secuencias de nucleótidos de la región V y de la región J según la clasificación de Kabat y col. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., Public Health Service, NIH, Washington DC, 1987]. Se introdujeron un sitio de HindIII y un sitio de BamHI en el cebador de la región V y en el cebador de la región J, respectivamente. La PCR se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de CETUS. Esto es, se emplearon 100 pmoles de cada uno de estos cebadores y los reactivos para la PCR fueron los de un kit fabricado por CETUS. La PCR se llevó a cabo durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto. Después de la PCR, los fragmentos de ADN obtenidos fueron clonados en el sitio de HincII de pUC18 (producido por Takara Shuzo; los reactivos utilizados en los Ejemplos fueron los fabricados por Takara Shuzo o Toyobo, a no ser que se indique de otro modo).
(3) Secuencia de nucleótidos del gen de la región V del anticuerpo anti-VIH de ratón
Utilizando el kit de Sequenase Ver. 2 fabricado por Toyobo, se secuenció el gen de la región V incorporado en pUC18. Las secuencias de nucleótidos de \mu39.1 y \mu5.5 obtenidas de este modo están mostradas en las Figs. 1 a 4. Las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos están también mostradas en las Figs. 1 a 4. Las secuencias de nucleótidos de \mu39.1 y \mu5.5 mostraban ambas una reordenación específica para el gen de la región V y presentaban un marco de lectura abierto (ORF) que permitía la expresión.
(4) Preparación del anticuerpo quimérico anti-VIH
Con el fin de confirmar que los genes de la región V \mu39.1 y \mu5.5 aislados en el punto (2) anterior son realmente genes que codifican una región V responsable de la actividad anti-VIH, se preparó un anticuerpo quimérico ratón-humano. Para la expresión del anticuerpo quimérico se utilizaron, respectivamente, los vectores de expresión HCMV-\kappa y HCMV-\gamma1 que llevaban un intensificador y un promotor de citomegalovirus humano (HCMV) [N. Whittle y col., Protein Engineering, 1, 409 (1987)]. El HCMV-\kappa contiene un gen de la región constante de la cadena \kappa humana y elHCMV-\gamma1 contiene un gen de la región constante de la cadena \gamma1 humana. El gen de la región V \mu39.1 preparado en el procedimiento (2) anterior, fue digerido con los enzimas de restricción HindIII y BamHI y los fragmentos VH y VL fueron incorporados al sitio de HindIII-BamHI de HCMV-\gamma1 y HCMV-\kappa, respectivamente. Las Figs. 5 y 6 muestran la estructura de los vectores de expresión del gen del anticuerpo quimérico \mu39.1 (CH\mu39.1 y CL\mu39.1, respectivamente). De manera similar, los genes de las regiones VH y VL de \mu5.5 fueron incorporados a HCMV-\gamma1 y HCMV-\kappa (CH\mu5.5 y CL\mu5.5, respectivamente; cf. Figs. 5 y 6).
(5) Expresión del anticuerpo quimérico anti-VIH
Se examinó la actividad de un anticuerpo presentada por el gen del anticuerpo quimérico \mu39.1 o \mu5.5, construido según se mencionó anteriormente, en un sistema de expresión transitoria utilizando células COS7 [ATCC CRL 1651]. Utilizando un dispositivo de electroporación fabricado por Bio-Rad, se introdujo una mezcla de ADNs de los plásmidos CH\mu39.1 y CL\mu39.1 o una mezcla de ADNs de los plásmidos CH\mu5.5 y CL\mu5.5 en células COS7 de acuerdo con el protocolo de Bio-Rad, y las células fueron cultivadas en medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero de ternera fetal (GIBCO). Después de tres días, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de los anticuerpos presentes en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA empleando una anti-IgG humana o el péptido antigénico SP-1. Como resultado, según se muestra en la Fig. 7, ambos productos de expresión procedentes de una mezcla de ADNs de los plásmidos CH\mu39.1 y CL\mu39.1 y de una mezcla de ADNs de los plásmidos CH\mu5.5 y CL\mu5.5, se unían al péptido SP-1. Por consiguiente, se confirmó que los genes de la región V \mu39.1 y \mu5.5 aislados en el procedimiento (2), son realmente genes que codifican una región V de un anticuerpo que tiene actividad anti-VIH.
(6) Preparación de un anticuerpo anti-VIH remodelado
Con fin de estudiar qué porción de la región VH o VL de los \mu39.1 o \mu5.5 clonados es importante para la unión al antígeno, las regiones CDR (determinantes de la complementariedad) de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a regiones V humanas. Esto se llevó a cabo de acuerdo con el método para preparar anticuerpos remodelados [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 62-296890]. Regiones CDR de la región VH de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a la región VH que tenía una región de entramado (FR) del subgrupo I humano [SGI: donada por el Dr. Bendig del MRC Collaborative Center, Inglaterra] (Figs. 8 y 10), mientras que regiones CDR de la región VL de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a la región VL que tenía una región FR de la cadena \kappa humana [REI: W. Palm y N. Hilscmann Z. Physiol. Chem., 356, 167 (1975)] (Figs. 9 y 11). Específicamente, se preparó un anticuerpo remodelado mediante un método de PCR de Amersham que combina un kit de Amersham (sistema de mutagénesis in vitro dirigida por oligonucleótidos, versión 2, código RPN. 1523) con PCR [Saiki, R.G. y col., Science, 239, 487 (1988)]. Un nucleótido de cadena larga que codificaba la porción que iba a ser trasplantada de la región VH o VL de \mu39.1 o \mu5.5, fue hibridado a ADN de M13 en el que se había incorporado el gen de la región V de SGI o REI, y posteriormente se llevó a cabo la elongación y la unión del ADN en una solución que contenía dCTP\alphaS. El ADN de M13 molde fue cortado con NciI y el ADN molde fue digerido con Exonucleasa III para dar solamente el ADN de M13 mutado (este procedimiento fue llevado a cabo de acuerdo con el protocolo de Amersham). Posteriormente, utilizando el producto procedente de la digestión con Exonucleasa III como molde, se llevó a cabo una PCR utilizando un cebador universal (UP: este cebador contiene una secuencia complementaria al sitio 5' de M13mp18) y un cebador inverso (RSP: este cebador contiene la misma secuencia que el sitio 3' de M13mp18). Se emplearon 20 pmoles de cada uno de estos cebadores y los reactivos para la PCR fueron los de CETUS. La PCR se llevó a cabo durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 74ºC durante 1 minuto. Después de la finalización de la PCR, los productos fueron digeridos con BamHI/HindIII y los productos digeridos fueron incorporados al sitio de BamHI-HindIII de pUC18, que fue utilizado para la transformación de DH5\alpha (BRL). Como proceso de selección primario, se llevó a cabo una hibridación de colonias utilizando los cebadores de CDR empleados en la mutagénesis de acuerdo con el protocolo del kit de Amersham para seleccionar los clones que tenían una mutagénesis con éxito en CDR. Posteriormente, como proceso de selección secundario, se preparó un plásmido a partir de los clones obtenidos en la selección primaria y se llevó a cabo una secuenciación con el kit de Sequenase (Toyobo) para confirmar el trasplante correcto de CDR. De esta forma, se obtuvieron regiones V remodeladas de \mu39.1 o de \mu5.5 (RH\mu39.1, RL\mu39.1, RH\mu5.5, RL\mu5.5, respectivamente; cf. Figs. 8 a 11). Igual que en la preparación de un anticuerpo quimérico en el procedimiento (4), estos fragmentos de la región V remodelada fueron digeridos con los enzimas de restricción HindIII y BamHI y los fragmentos de VH y VL fueron incorporados en el sitio de HindIII-BamHI de HCMV-\gamma1 o HCMV-\kappa, respectivamente. Por tanto, se prepararon vectores de expresión del gen del anticuerpo remodelado \mu39.1 (RH\mu39.1 y RL\mu39.1, respectivamente) y vectores de expresión del gen del anticuerpo remodelado \mu5.5 (RH\mu5.5 y RL\mu5.5, respectivamente).
(7) Expresión del anticuerpo anti-VIH remodelado
Se examinó la actividad de los anticuerpos obtenidos a partir de estos genes de los anticuerpos remodelados \mu39.1 y \mu5.5 en el sistema de expresión transitoria anteriormente mencionado utilizando células COS7. Igual que en el procedimiento (5), se recogió el sobrenadante del cultivo de las células a las que se había incorporado el gen y se midió la actividad de los anticuerpos presentes en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA, utilizando una anti-IgG humana o el péptido SP-1. Como resultado, según se muestra en la Fig. 7, los dos productos de expresión procedentes de una mezcla de ADNs de los plásmidos RH\mu39.1 y RL\mu39.1 y de una mezcla de ADNs de los plásmidos RH\mu5.5 y RL\mu5.5, se unían al péptido SP-1. Por consiguiente, se confirmó que, en las secuencias de aminoácidos de \mu39.1 y \mu5.5 mostradas en las Figs. 9 a 12, las regiones CDR trasplantadas eran las regiones más importantes para ejercer la actividad anti-VIH. A partir de este resultado se confirmó que los genes que codificaban estas regiones eran genes bastante útiles para preparar un anticuerpo anti-VIH recombinante.
SEC ID Nº: 1
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 357
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón
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SECUENCIA
1 
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SEC ID Nº: 2
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 321
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón
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SECUENCIA
2
SEC ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 354
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón
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SECUENCIA
3
SEC ID Nº: 4
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 333
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón
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SECUENCIA
4
SEC ID Nº: 5
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 357
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón y humano
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SECUENCIA
5
SEC ID Nº: 6
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 321
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón y humano
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SECUENCIA
6
SEC ID Nº: 7
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 354
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón y humano
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SECUENCIA
7
SEC ID Nº: 8
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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 333
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón y humano
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SECUENCIA
8

Claims (10)

1. Una cadena de un anticuerpo recombinante anti-VIH remodelado genéticamente que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón y una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano, teniendo dicha cadena de un anticuerpo recombinante anti-VIH remodelado genéticamente actividad neutralizante frente al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), caracterizada porque las regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3) tienen las secuencias de aminoácidos siguientes:
(a) CDR1: Glu-Tyr-Thr-Met-His CDR2: Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly CDR3: Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser
donde dicha cadena de anticuerpo es una cadena H, y en la que un aminoácido en el extremo C de la FR1 adyacente a la región determinante de la complementariedad CDR1 de una región variable es treonina (Thr), una secuencia de dos aminoácidos en el extremo C de la FR2 adyacente a CDR2 es Ile-Gly, una secuencia de seis aminoácidos en el extremo N de la FR3 adyacente a CDR2 es Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val, y un aminoácido en el extremo C de la FR3 adyacente a CDR3 es treonina (Thr); o
(b) CDR1: Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn CDR2: Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser CDR3: Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr
donde dicha cadena de anticuerpo es una cadena L.
2. La cadena H del anticuerpo anti-VIH recombinante de la reivindicación 1(a), en la que una secuencia de aminoácidos completa de una región variable es la secuencia de los aminoácidos N^{os} 1 a 118 de la SEC ID Nº:7 del Listado de Secuencias.
3. La cadena L del anticuerpo anti-VIH recombinante de la reivindicación 1(b), en la que una secuencia de aminoácidos completa de una región variable es la secuencia de los aminoácidos N^{os} 1 a 111 de la SEC ID Nº:8 del Listado de Secuencias.
4. Un anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante que comprende la cadena H del anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la reivindicación 1(a) y la cadena L del anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la reivindicación 1(b).
5. Un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena H o de la cadena L, o una porción de la misma, donde dicha cadena H o L está definida adicionalmente en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Un proceso para preparar un anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante, que comprende la construcción de un vector de expresión mediante la utilización de un fragmento de ADN que codifica la región variable de la cadena H de la reivindicación 1(a) o 2 y de un fragmento de ADN que codifica la región variable de la cadena L de la reivindicación 1(b) o 3 y fragmentos de ADN que codifican una inmunoglobulina humana, permitiendo dicho vector de expresión la expresión de un anticuerpo recombinante en el que al menos las regiones determinantes de la complementariedad tienen una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón; la expresión del ADN recombinante en una célula animal y la recogida de dicho anticuerpo.
7. Una composición farmacéutica que contiene al menos una cadena de un anticuerpo anti-VIH remodelado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la reivindicación 4.
8. Una composición para diagnóstico que comprende al menos una cadena de un anticuerpo anti-VIH remodelado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la reivindicación 4 o al menos un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5.
9. Un vector que contiene un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5.
10. Una célula huésped transformada con un vector de la reivindicación 9.
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