ES2229206T3 - Anticuerpo anti-vih recombinante y su preparacion. - Google Patents
Anticuerpo anti-vih recombinante y su preparacion.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN FRAGMENTO DE UN GEN QUE CODIFICA LAS REGIONES VARIABLES DE UN ANTICUERPO QUE POSEE UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH), A UN NUEVO ANTICUERPO RECOMBINANTE ANTI-VIH EXPRESADO MEDIANTE LA UTILIZACION DEL GEN ANTEDICHO Y A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DEL MISMO. UN ANTICUERPO QUIMERICO DE RATON-HUMANO Y UN ANTICUERPO DE RATON-HUMANO MODIFICAD, QUE POSEEN UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIH, SE OBTIENEN DETERMINANDO UNA SECUENCIA DE ACIDOS NUCLEICOS ESPECIFICA DE UN FRAGMENTO DE UN GEN QUE CODICIA LAS REGIONES VARIABLES DE LAS CADENAS H Y L DE UN ANTICUERPO QUE POSEE UNA ACTIVIDAD PARA NEUTRALIZAR EL VIH Y FUSIONANDO ARTIFICIALMENTE SINTETIZADO EN BASE A LA SECUENCIA DETERMINADA CON UN GEN QUE CODIFICA LA INMUNOGLOBULINA HUMANA. EL NUEVO ANTICUERPO ANTI-VIH ES UTIL PARA EL TRATAMIENTO Y LA PREVENCION DEL SIDA.
Description
Anticuerpo anti-VIH recombinante
y su preparación.
La presente invención se refiere a un nuevo
anticuerpo anti-VIH recombinante que puede esperarse
que sea utilizado para el tratamiento y la prevención del SIDA
provocado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Más
específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo
anti-VIH recombinante (un anticuerpo remodelado) que
tiene actividad neutralizante frente al VIH, siendo expresado dicho
anticuerpo utilizando una técnica de recombinación genética a partir
de un gen de inmunoglobulina de ratón y un gen de inmunoglobulina
humana, y a un nuevo proceso para la preparación del mismo. La
presente invención se refiere además a fragmentos de ADN que
codifican la región variable de la cadena H y de la cadena L que
pueden ser utilizados eficazmente para la expresión de tal
anticuerpo recombinante útil.
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)
es una enfermedad vírica causada por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) perteneciente a los retrovirus. Esta
enfermedad, desde su descubrimiento en los Estados Unidos en 1981,
se ha extendido rápidamente por todo el mundo, pero no se ha
establecido todavía una vacuna eficaz ni un método eficaz para
tratar dicha enfermedad.
Bajo tales circunstancias, existen informes sobre
la relevancia entre la clínica y un anticuerpo neutralizante en un
grupo de pacientes talasémicos que presentaban VIH positivo después
de una transfusión y en un grupo de niños con SIDA o con ARC
(síndrome relacionado con el SIDA) [R. Guroff y col., J. Immunol.,
138, p. 3731 (1987); R. Guroff y col., Pediatric Research, en
prensa]. En ambos informes se menciona que el síntoma clínico era
leve y benigno en aquellos casos en los que era detectable un
anticuerpo neutralizante, mientras que resultó maligno en aquellos
casos en los que no pudo detectarse anticuerpo neutralizante. Estos
hechos sugieren la eficacia in vivo de un anticuerpo
neutralizante. Por tanto, se espera que un anticuerpo
anti-VIH neutralizante sea utilizable para la
prevención de la expansión de la infección o para la exclusión de
células infectadas, y que muestre un efecto más elevado cuando se
utilice en combinación con agentes antivíricos, etc., utilizados en
la clínica actualmente.
Aunque es posible que el anticuerpo neutralizante
anti-VIH según se mencionó anteriormente sea
obtenido directamente o preparado a partir de pacientes con SIDA, se
espera que este método conlleve varias dificultades tales como un
problema ético, la disponibilidad de materiales o un problema de
biopeligrosidad. A este respecto, como alternativa a tal suero con
título elevado, se considera la utilización de un anticuerpo
monoclonal que tenga actividad neutralizante frente al virus VIH.
Aunque se ha establecido ya una técnica básica para la preparación
de un anticuerpo monoclonal en un anticuerpo monoclonal de tipo
ratón, un anticuerpo de ratón es muy poco utilizable en aplicaciones
clínicas a la vista de sus efectos colaterales (se considera que un
anticuerpo monoclonal de ratón, cuando es administrado a humanos,
causa efectos colaterales tales como choque anafiláctico o
enfermedad sérica al ser una proteína heterogénea) etc., y por
tanto, la utilización de un anticuerpo monoclonal humano es
finalmente preferible.
Sin embargo, la preparación de un anticuerpo
monoclonal humano provoca muchos problemas que han de ser resueltos
para preparar un anticuerpo que tenga una especificidad deseada, y
es realmente bastante difícil en comparación con la preparación de
un anticuerpo monoclonal de tipo ratón. Para resolver tales
problemas, se ha descrito recientemente un método para preparar un
anticuerpo monoclonal quimérico utilizando una técnica de
recombinación genética en la que la región variable, que caracteriza
la especificidad de un anticuerpo, tiene una secuencia de
aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón y la región constante
tiene una secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo
humano.
Tal anticuerpo monoclonal quimérico se obtiene
mediante la expresión de un gen del anticuerpo quimérico
ratón(V)-humano(C), que comprende un
gen variable (V) como material para la región V que es clonado a
partir de un hibridoma de ratón que produce un anticuerpo monoclonal
de ratón, y un gen constante (C) como material para la región C que
es clonado a partir de una célula humana tal como una célula humana
productora de anticuerpos, en una célula animal o en una célula de
un microorganismo, etc., estando presente el anticuerpo monoclonal
quimérico deseado en el sobrenadante de un cultivo. Ha habido varios
informes sobre anticuerpos quiméricos [Primera Publicación de
Patente Japonesa Nº 60-155132, Primera Publicación
de Patente Japonesa Nº 61-47500] y los presentes
inventores han preparado ya con éxito un anticuerpo quimérico
[Primera Publicación de Patente Japonesa Nº 2-2352].
La técnica anterior describe además un anticuerpo monoclonal
anti-VIH, 0.5\beta, y su anticuerpo de tipo
quimérico, C\beta1, que puede neutralizar
HTLV-IIIB (Solicitud de Patente Europea Nº 0327000).
Además, para fomentar esta idea de un anticuerpo quimérico, se ha
descrito también la preparación de un anticuerpo remodelado [Primera
Publicación de Patente Japonesa Nº 62-296890].
Además, la Solicitud de Patente Europea Nº 239400 describe la
producción de un anticuerpo remodelado (mencionado en la misma como
"anticuerpo alterado") mediante la sustitución de porciones de
la CDR de una región variable de un anticuerpo por otras procedentes
de un anticuerpo diferente utilizando una técnica de ADN
recombinante.
El análisis del gen de las inmunoglobulinas ha
experimentado un progreso rápido en nuestros días con el avance
rápido de las técnicas de manipulación genética. Es bien conocido
que un gen de inmunoglobulina consta de un gen de la región variable
(región V) implicada en la unión al antígeno y un gen de la región
constante (región C) que tiene una actividad fisiológica relacionada
con interacciones con el complemento o con células específicas, etc.
Un gen de la región V está formado por un gen seleccionado de un
grupo de varios fragmentos del gen V, un grupo de fragmentos del gen
D (no encontrado en una cadena L) y un grupo de fragmentos del gen
J, estando unidos los genes seleccionados en este orden. Además, el
fragmento génico unido (gen de la región V) está alterado además por
una pequeña modificación con una mutación somática. Esto es, la
especificidad de un anticuerpo está determinada por una combinación
de cada uno de los fragmentos génicos del gen de la región V de la
cadena H y de la cadena L y una mutación somática [cf. Susumu
Tonegawa, Nature, 307, p. 575 (1983); Tasuku Honjo, Annual
Rev. Immunol. 1, p. 499 (1983)]. Por consiguiente, se considera que
para un antígeno específico debe haber una combinación de un
fragmento génico VDJ específico de la cadena H y un fragmento génico
VJ específico de la cadena L y una mutación somática específica.
Además, una combinación de estos fragmentos génicos o de la
secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de los mismos puede
difícilmente ser deducida de una estructura, de una secuencia de
nucleótidos o de aminoácidos, etc., de un antígeno, sino que puede
ser determinada solamente mediante el aislamiento de un gen del
anticuerpo o de una proteína anticuerpo a partir de células que
produzcan realmente el anticuerpo. De esta forma, una región
variable de una molécula de anticuerpo tiene una secuencia de
aminoácidos que varía con cada determinante antigénico, y una región
variable tiene una secuencia de aminoácidos que varía completamente
con cada antígeno.
En cuanto al anticuerpo anti-VIH
recombinante objetivo de la presente invención, los presentes
inventores han publicado ya el anticuerpo recombinante 0.5\beta
como un anticuerpo neutralizante anti-VIH [Primera
Publicación de Patente Japonesa Nº 2-2352], pero
dicho anticuerpo recombinante puede neutralizar específicamente
HTLV-IIIB pero no HTLV-IIIMN que es
frecuente desde el punto de vista epidémico. Además, la Solicitud de
Patente Europea Nº 465979 describe los anticuerpos monoclonales
anti-VIH \mu5.5 y \mu39.1, que pueden
neutralizar HTLV-IIIMN. Sin embargo, el anticuerpo
descrito en la misma es un anticuerpo monoclonal de ratón, pero no
un anticuerpo recombinante. Según se mencionó anteriormente, para la
preparación de un anticuerpo recombinante, es muy importante
encontrar un gen que codifique una secuencia de aminoácidos de una
región variable de una molécula de anticuerpo que tenga capacidad de
unión a un antígeno deseado. Debido a la dificultad de encontrar un
gen que codifique una secuencia de aminoácidos de una región
variable de un anticuerpo que tenga actividad neutralizante frente
al VIH, especialmente frente al HTLV-IIIMN, objetivo
de la presente invención, no hay ningún informe de la obtención de
un anticuerpo recombinante que se una a, y neutralice
sustancialmente, HTLV-IIIMN.
Bajo tales circunstancias, los presentes
inventores han aislado con éxito un gen que codifica una región
variable de un anticuerpo monoclonal que tiene actividad
neutralizante frente al VIH (HTLV-IIIMN) a partir de
células (hibridomas) que producen dicho anticuerpo. Los presentes
inventores han intentado además producir la expresión de un
anticuerpo recombinante de ratón-humano utilizando
dicho gen, y como resultado han preparado con éxito un anticuerpo
recombinante que tiene actividad neutralizante frente al VIH
(HTLV-IIIMN) y de este modo se ha completado la
presente invención. Esto es, la presente invención proporciona un
gen que codifica una región variable de un anticuerpo neutralizante
anti-VIH que no había sido descrito nunca hasta
ahora, y proporciona un anticuerpo anti-VIH
recombinante expresado en una célula transformada mediante la
utilización de dicho gen. Un objeto de la presente invención es
hacer posible el desarrollo de agentes para diagnóstico, tratamiento
y prevención del SIDA con efectos colaterales disminuidos, que
comprendan dicho nuevo anticuerpo recombinante
anti-VIH.
Con fines ilustrativos, la Fig. 1 muestra una
secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente
invención que codifica la región variable de la cadena H del
anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu39.1 mostrado
en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la
misma.
Con fines ilustrativos, la Fig. 2 muestra una
secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN de la presente
invención que codifica la región variable de la cadena L del
anticuerpo neutralizante anti-VIH \mu39.1 mostrado
en el Ejemplo (3) y una secuencia de aminoácidos deducida de la
misma.
La Fig. 3 muestra una secuencia de nucleótidos de
un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región
variable de la cadena H del anticuerpo neutralizante
anti-VIH \mu5.5 mostrado en el Ejemplo (3) y una
secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
La Fig. 4 muestra una secuencia de nucleótidos de
un fragmento de ADN de la presente invención que codifica la región
variable de la cadena L del anticuerpo neutralizante
anti-VIH \mu5.5 mostrado en el Ejemplo (3) y una
secuencia de aminoácidos deducida de la misma.
La Fig. 5 muestra con fines ilustrativos la
estructura de los plásmidos de expresión de la cadena H del
anticuerpo quimérico anti-VIH, CH\mu39.1 y
CH\mu5.5, construidos en el Ejemplo (4).
La Fig. 6 muestra con fines ilustrativos la
estructura de los plásmidos de expresión de la cadena L del
anticuerpo quimérico anti-VIH, CL\mu39.1 y
CL\mu5.5, construidos en el Ejemplo (4).
\newpage
Con fines ilustrativos, la Fig. 7 muestra las
actividades anti-VIH del anticuerpo quimérico
anti-VIH \mu39.1 medidas en el Ejemplo (5) y del
anticuerpo remodelado anti-VIH \mu39.1 medidas en
el Ejemplo (7).
Con fines ilustrativos, la Fig. 8 muestra las
actividades anti-VIH del anticuerpo quimérico
anti-VIH \mu5.5 medidas en el Ejemplo (5) y del
anticuerpo remodelado anti-VIH \mu5.5 medidas en
el Ejemplo (7).
Con fines ilustrativos, la Fig. 9 muestra la
secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una
región variable de la cadena H del anticuerpo
anti-VIH remodelado \mu39.1 preparado en el
Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la
secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de
un anticuerpo de ratón).
Con fines ilustrativos, la Fig. 10 muestra la
secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN que codifica una
región variable de la cadena L del anticuerpo
anti-VIH remodelado \mu39.1 preparado en el
Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma (la
secuencia subrayada muestra una secuencia de aminoácidos derivada de
un anticuerpo de ratón).
La Fig. 11 muestra la secuencia de nucleótidos de
un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena H
del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu5.5
preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida
de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de
aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
La Fig. 12 muestra la secuencia de nucleótidos de
un fragmento de ADN que codifica una región variable de la cadena L
del anticuerpo anti-VIH remodelado \mu5.5
preparado en el Ejemplo (6) y la secuencia de aminoácidos deducida
de la misma (la secuencia subrayada muestra una secuencia de
aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón).
Las células productoras del anticuerpo monoclonal
de ratón anti-VIH (HTLV-IIIMN)
utilizadas en la presente invención son preparadas mediante la
técnica hasta ahora establecida para preparar un anticuerpo
monoclonal de ratón. Por ejemplo, puede prepararse mediante la
inmunización de ratones con un inmunógeno apropiado, por ejemplo una
partícula vírica obtenida de células productoras de VIH
(HTLV-IIIMN), o con la glicoproteína de la envoltura
gp120 purificada, o con un péptido recombinante preparado mediante
la utilización de una técnica de recombinación genética,
preferiblemente un péptido recombinante correspondiente a la
secuencia de aminoácidos de gp120 N^{os} 247-370,
o con un péptido sintético adecuado preparado sobre la base de una
secuencia de aminoácidos de dicha proteína vírica, preferiblemente
un péptido sintético correspondiente a la secuencia de aminoácidos
de gp120 N^{os} 203-325, etc., la fusión de las
células esplénicas obtenidas con células de mieloma de ratón, la
selección a partir de los hibridomas obtenidos de las células que
reaccionan con la glicoproteína de la envoltura gp120 purificada o
con el péptido recombinante anterior o con el péptido sintético
anterior, y el cultivo de dichas células. Además, se seleccionan las
células que producen un anticuerpo monoclonal que tiene actividad
neutralizante frente al VIH a partir de las células productoras de
anticuerpos monoclonales de ratón anti-VIH así
obtenidas. En el caso del VIH, no es fácil obtener un anticuerpo
monoclonal que tenga tal actividad neutralizante debido a sus
propias características, pero como tal línea celular los presentes
inventores han establecido ya con éxito células hibridomas \mu5.5
que producen un anticuerpo que tiene actividad neutralizante frente
al VIH (HTLV-IIIMN) [Solicitud de Patente Japonesa
Nº 2-188300], siendo utilizadas muy preferiblemente
estas líneas celulares para la presente invención.
El fragmento génico que codifica una
regiónvariable de la presente invención es aislado de las células
productoras de anticuerpos monoclonales neutralizantes
anti-VIH anteriormente mencionadas y se analiza una
secuencia génica del mismo. Sin embargo, según se mencionó
anteriormente, tales células contienen un gran número de genes que
constan de la región V además de un gen que codifica una región V
específica para un anticuerpo anti-VIH deseado (por
ejemplo, un grupo de genes V solos de la cadena VH que determina la
especificidad de un anticuerpo de ratón incluye más de 100 genes
diferentes, un grupo de genes D incluye más de 11 genes y un grupo
de genes J incluye 4 genes. De manera similar, un grupo de genes V
de la cadena V\kappa incluye más de 300 genes aproximadamente y un
grupo genes J incluye 4 genes) y, por tanto, es necesario aislar un
gen que codifique una región V específica para un anticuerpo
anti-VIH deseado. Un gen de la región V puede ser
aislado mediante la técnica convencional de manipulación génica,
incluyendo, por ejemplo, un método de clonaje de un gen de la región
V procedente de un ADN cromosómico de la célula mediante la
utilización del método convencional [cf. por ejemplo, T.
Maniatis, "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Lab.
(1982)] o un método para sintetizar ADNc a partir del ARNm de las
células utilizando el método convencional [por ejemplo, D.M. Glover
ed., "DNA cloning Vol. I" IRL press (1985)] y clonando el gen
de la región V. En cualquiera de los métodos, puede utilizarse como
sonda para el clonaje de un gen de la región V una sonda de ADN,
etc., sintetizada por referencia a la secuencia de nucleótidos de un
gen de inmunoglobulina de ratón que haya sido ya descrito [por
ejemplo, Sakano y col., Nature, 286, p. 676 (1980); E.E. Max
y col., J. Biol. Chem., 256, p. 5116 (1981)]. Puede llevarse a cabo
también un clonaje con PCR (reacción en cadena de la polimerasa) [R.
Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833 (1989); W.D.
Huse y col., Science, 246, 1275 (1989)].
El gen de la región V así clonado fue analizado
genéticamente por varios métodos tal como el método para preparar un
anticuerpo quimérico [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº
2-2352] o un método para preparar un anticuerpo
remodelado [Primera Publicación de Patente Japonesa Nº
62-296890]. Como resultado, se encontró que el
fragmento génico de la presente invención que codifica una región V
de un anticuerpo anti-VIH se caracteriza porque
contiene, como secuencia génica específica, un gen que codifica un
aminoácido de:
(H-b):
(a)
Glu-Tyr-Thr-Met-His
(b)
Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
(c)
Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser
dentro de un gen que codifica la cadena H como
una parte, y un secuencia génica que codifica un aminoácido de
(L-b):
(a)
Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
(b)
Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
(c)
Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr
dentro de un gen que codifica la cadena L como
una parte. Cada grupo de estas tres secuencias de aminoácidos
contenidas en la cadena H y en la cadena L, respectivamente, es
considerado como una secuencia de aminoácidos importante que
determina la capacidad de unión de una molécula de anticuerpo, y
tales secuencias de aminoácidos eran consideradas como estrechamente
relacionadas con una función de una molécula de anticuerpo que tenía
actividad neutralizante frente al VIH. Esto es, mediante referencia
a los resultados del análisis general de un gen de un anticuerpo
descrito por Kabat y col. [Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 4ª ed., U.S. Department of Health and Human Services
(1987)], se encontró que las secuencias de aminoácidos anteriores
eran una secuencia de las regiones determinantes de la
complementariedad (CDR1 a CDR3) de una región variable que determina
la actividad como anticuerpo del anticuerpo anti-VIH
de la presente invención. Un gen que codifica tal región variable de
una molécula de anticuerpo que tiene actividad neutralizante
anti-VIH incluye, a manera de ejemplo preferible,
fragmentos génicos que codifican las secuencias de aminoácidos
mostradas en la Fig. 3 o las secuencias de aminoácidos mostradas en
la Fig. 4 para la cadena H o para cadena L, respectivamente. Una
secuencia de nucleótidos específica de tales genes incluye, por
ejemplo, las secuencias de nucleótidos mostradas en la Fig. 3 o en
la Fig. 4 para la cadena H o para la cadena L, respectivamente.
Sobre la base de las secuencias de nucleótidos
anteriores proporcionadas por la presente invención, puede
prepararse un anticuerpo recombinante que tenga actividad
neutralizante frente al VIH. Esto es, puede prepararse un anticuerpo
anti-VIH recombinante deseado, un anticuerpo
anti-VIH remodelado, mediante la preparación, como
gen que codifica una región variable de tal anticuerpo recombinante,
de ADNs sintéticos, etc., que son fragmentos de ADN que codifican
las secuencias de aminoácidos anteriores como región determinante de
la complementariedad, y la fusión de dichos ADNs con un gen que
codifique una inmunoglobulina humana. El anticuerpo
anti-VIH recombinante de la presente invención así
preparado se caracteriza porque contiene, como región determinante
de la complementariedad de la región variable de la cadena H, las
secuencias siguientes (CDR1 a CDR3):
(H-B):
CDR1:
Glu-Tyr-Thr-Met-His
CDR2:
Gly-Ile-Asn-Pro-Asn-Asn-Gly-Asp-Thr-Ser-Tyr-Thr-Gln-Lys-Phe-Lys-Gly
CDR3:
Pro-Tyr-Tyr-Ala-Tyr-Ala-Ile-Asp-Ser.
El anticuerpo anti-VIH
recombinante de la presente invención se caracteriza también porque
contiene, como región determinante de la complementariedad de la
región variable de la cadena L, las secuencias siguientes (CDR1 a
CDR3):
(L-B):
CDR1:
Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Asp-Tyr-Asp-Gly-Asp-Ser-Tyr-Met-Asn
CDR2:
Ala-Ala-Ser-Asn-Leu-Glu-Ser
CDR3:
Gln-Gln-Ser-Asn-Glu-Asp-Pro-Trp-Thr.
Además, los presentes inventores han encontrado
también que, al preparar un anticuerpo remodelado, puede obtenerse
un anticuerpo recombinante que retiene más totalmente la actividad
del anticuerpo original mediante la sustitución de, además de las
regiones determinantes de la complementariedad, una porción de la
región de entramado (FR) adyacente a dichas regiones determinantes
de la complementariedad por una secuencia derivada de ratón en lugar
de por la sustitución de las regiones determinantes de la
complementariedad solas por una secuencia derivada de ratón según se
ha descrito hasta ahora.
Cuando se utilizan las secuencias de las regiones
determinantes de la complementariedad (H-B) como gen
de la región variable de la cadena H, puede prepararse un anticuerpo
anti-VIH remodelado que tiene una actividad más
excelente mediante la preparación de un gen de la región variable de
la cadena H en el que un aminoácido en el extremo C de la FR1
adyacente a la región determinante de la complementariedad CDR1 de
una región variable es treonina (Thr), una secuencia de dos
aminoácidos en el extremo C de la FR2 adyacente a CDR2 es
Ile-Gly, una secuencia de seis aminoácidos en el
extremo N de la FR3 adyacente a CDR2 es
Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val
y un aminoácido en el extremo C de la FR3 adyacente a CDR3 es
treonina (Thr).
Una secuencia de nucleótidos del gen así
preparado que codifica una región variable de la cadena H del
anticuerpo anti-VIH remodelado de la presente
invención, y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma,
incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la
Fig. 11 (en las que la porción subrayada muestra una secuencia de
aminoácidos derivada de ratones). Por otra parte, una secuencia de
nucleótidos del gen que codifica una región variable de la cadena L
del anticuerpo anti-VIH remodelado de la presente
invención, y una secuencia de aminoácidos deducida de la misma,
incluye, como ejemplo preferible, las secuencias mostradas en la
Fig. 12 (en las que la porción subrayada muestra una secuencia de
aminoácidos derivada de ratones).
Por otra parte, en la preparación de un
anticuerpo quimérico anti-VIH de acuerdo con la
presente invención, una secuencia de nucleótidos del gen que
codifica una región variable de la cadena H y una secuencia de
aminoácidos deducida de la misma, incluye, como ejemplo preferible,
las secuencias mostradas en la Fig. 3. Una secuencia de nucleótidos
del gen que codifica una región variable de la cadena L y una
secuencia de aminoácidos deducida de la misma incluye, como ejemplo
preferible, las secuencias mostradas en la Fig. 4.
Por otra parte, un gen de la región constante (C)
de la cadena H y de la cadena L de la inmunoglobulina humana
utilizado para preparar el anticuerpo recombinante
anti-VIH puede ser aislado de la misma manera, por
ejemplo, de una célula productora de anticuerpos humanos. Como en un
gen de la región C no tiene lugar una reordenación, una célula
productora de anticuerpos humanos no es necesariamente utilizada
para aislar un gen de una región C humana. El aislamiento puede ser
realizado de la misma manera que el aislamiento del gen de la región
V de ratón, según se mencionó anteriormente. Un gen de la región C
no se limita a la cadena \gamma1 ni a la cadena \kappa, sino que
puede utilizarse cualquier tipo de gen de la región C tal como el de
la cadena \mu, la cadena \alpha, la cadena \gamma2, la cadena
\gamma3, la cadena \gamma4, la cadena \varepsilon o la cadena
\lambda. Sin embargo, si se desea una capacidad activadora del
complemento o una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos,
es preferible la cadena \gamma1.
El gen del anticuerpo recombinante
anti-VIH, un gen de la cadena H y un gen de la
cadena L, puede ser construido básicamente combinando los dos
fragmentos génicos anteriormente mencionados (gen de la región V y
gen de la región C). Por ejemplo, la construcción puede llevarse a
cabo de acuerdo con el método mostrado previamente por Watanabe y
col. [Watanabe y col., Cancer Research, 47, p.
999-1005 (1987)] o con los métodos descritos por M.
Bruggemann [Waldmann H. (ed) Monoclonal Antibody Therapy. Prog.
Allergy. Basel, Karger, 1988, vol. 45, pp. 91] o por S.L. Morrison
[Advances in Immunology, 44, 65 (1989)]. Un sistema de vectores
varía dependiendo del huésped utilizado para la expresión tal como
un sistema de expresión de células animales, un sistema de expresión
de E. coli o un sistema de expresión de levaduras, pero el
gen de la presente invención puede ser expresado en cualquiera de
estos sistemas de expresión. Además, puede utilizarse también un
sistema de amplificación génica tal como DHFR.
Se confirmó que el anticuerpo recombinante de la
presente invención así preparado tenía actividad neutralizante
frente al VIH y, por tanto, la presente invención permite la
preparación de un anticuerpo recombinante anti-VIH
que hasta ahora no había sido nunca preparado. Tal anticuerpo
anti-VIH recombinante, en la clínica del SIDA, puede
ser un agente de tratamiento del SIDA sustancialmente eficaz.
Además, los fragmentos génicos que codifican la región variable del
anticuerpo anti-VIH proporcionados por la presente
invención describen una secuencia de aminoácidos o una secuencia de
nucleótidos específicas de una región variable de un anticuerpo que
tiene actividad neutralizante frente al VIH y permiten el desarrollo
de una molécula de anticuerpo recombinante anti-VIH
más excelente mediante la modificación o la sustitución parcial de
una molécula de anticuerpo deseada mediante el empleo de una técnica
de recombinación genética más avanzada.
La presente invención es explicada con más
detalle por los Ejemplos, pero no debe interpretarse como que está
limitada a los mismos.
Con fines ilustrativos los ejemplos siguientes se
refieren también al anticuerpo \mu39.1
A continuación se muestra en la presente un
método para preparar un hibridoma productor de un anticuerpo
monoclonal de ratón anti-VIH. El antígeno para
inmunización incluía un péptido sintético correspondiente a la
secuencia de aminoácidos N^{os} 303 a 325 de la glicoproteína
gp120 de la envoltura de la cepa HTLV-IIIMN
(SP-1: YNKRKRIHIGPGRAFYTTKNIIG) y un conjugado
péptido-KLH (hemocianina de la lapa ojo de
cerradura) que comprendía dicho péptido sintético unido a KLH, o una
partícula vírica obtenida del sobrenadante de un cultivo de células
productoras de HTLV-IIIMN
(H9/HTLV-IIIMN) mediante centrifugación en un
gradiente de densidad de sacarosa, o gp120 obtenida mediante la
lisis de células procedentes del cultivo de
H9/HTLV-IIIMN con Triton X-100 al 1%
y la purificación posterior mediante cromatografía de afinidad a
través de una columna de ConA-Sepharose 4B y una
columna de anticuerpo hacia el VIH (IgG)-Sepharose
4B, o una proteína fusionada dominio V3 de gp120 de
HTLV-IIIMN (aminoácidos
247-370)-\beta-galactosidasa
que es preparada mediante el aislamiento y la amplificación por el
método de PCR [G.I. LaRosa y col., Science, Vol. 249, p. 932 (1990)]
de un fragmento de ADN que codifica el dominio V3 de gp120 de
HTLV-IIIMN (aminoácidos 247-370)
procedente de un ADN de alto peso molecular (ADN genómico) de
células H9/HTLV-IIIMN y la expresión de dicho
fragmento de ADN en E. coli utilizando el vector de expresión
pUEX2 (fabricado por Amersham), o una combinación de estos
antígenos. Después de la inmunización de ratones Balb/c 4 veces con
estos inmunógenos, se extrajeron las células esplénicas y se realizó
la fusión de las células con células de mieloma de ratón
P3X63Ag8-U1X63 [ATCC CRL 1597] utilizando polietilén
glicol (Sigma) y se llevó a cabo el clonaje. La actividad de unión a
los inmunógenos anteriores de los anticuerpos del sobrenadante del
cultivo de los clones obtenidos fue medida mediante inmunoensayo
enzimático. Para los clones considerados positivos, los resultados
fueron confirmados posteriormente mediante un método de
transferencia Western y un método de fluorescencia indirecta con el
fin de establecer los hibridomas que producían los anticuerpos
monoclonales anti-VIH, \mu39.1 o \mu5.5
[Solicitud de Patente Japonesa Nº 2-188300, número
de depósito; \mu39.1 (P-11472), \mu5.5
(BP-3402)]. Estos anticuerpos se unen al péptido
SP-1 e inhiben la formación del sincitio entre las
células infectadas con VIH y las células CD4 positivas no
infectadas. Además, se confirmó también la actividad neutralizante
de estos anticuerpos en un ensayo de neutralización del virus en el
que estos anticuerpos son mezclados con el virus VIH y las células
(H9) son infectadas con esta mezcla.
Para preparar un gen de la región V del
anticuerpo recombinante anti-VIH de la presente
invención según se menciona en la presente a continuación, se
utilizaron las células productoras de estos anticuerpos monoclonales
anti-VIH de ratón que tenían dicha actividad
neutralizante (células \mu39.1, \mu5.5).
El aislamiento del gen de la región variable (V)
de inmunoglobulina de ratón se llevó a cabo de la siguiente
manera.
Se extrajeron los ARNs totales de células
\mu39.1 y \mu5.5 de acuerdo con el método convencional [D.M.
Glover ed. "DNA cloning Vol. I" IRL press (1985)] y se
sintetizó un ADNc de hebra sencilla utilizando el sintetizador de
ADNc System Plus (Amersham). Utilizando como molde este ADNc de
hebra sencilla, se llevó a cabo una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) utilizando cebadores de ADN que fueron sintetizados
sobre la base de las secuencias de nucleótidos de la región V y de
la región J según la clasificación de Kabat y col. [Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., Public Health Service,
NIH, Washington DC, 1987]. Se introdujeron un sitio de HindIII y un
sitio de BamHI en el cebador de la región V y en el cebador de la
región J, respectivamente. La PCR se llevó a cabo de acuerdo con el
protocolo de CETUS. Esto es, se emplearon 100 pmoles de cada uno de
estos cebadores y los reactivos para la PCR fueron los de un kit
fabricado por CETUS. La PCR se llevó a cabo durante 25 ciclos,
comprendiendo cada ciclo 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1
minuto y 72ºC durante 1 minuto. Después de la PCR, los fragmentos de
ADN obtenidos fueron clonados en el sitio de HincII de pUC18
(producido por Takara Shuzo; los reactivos utilizados en los
Ejemplos fueron los fabricados por Takara Shuzo o Toyobo, a no ser
que se indique de otro modo).
Utilizando el kit de Sequenase Ver. 2 fabricado
por Toyobo, se secuenció el gen de la región V incorporado en pUC18.
Las secuencias de nucleótidos de \mu39.1 y \mu5.5 obtenidas de
este modo están mostradas en las Figs. 1 a 4. Las secuencias de
aminoácidos deducidas de las secuencias de nucleótidos están también
mostradas en las Figs. 1 a 4. Las secuencias de nucleótidos de
\mu39.1 y \mu5.5 mostraban ambas una reordenación específica
para el gen de la región V y presentaban un marco de lectura abierto
(ORF) que permitía la expresión.
Con el fin de confirmar que los genes de la
región V \mu39.1 y \mu5.5 aislados en el punto (2) anterior son
realmente genes que codifican una región V responsable de la
actividad anti-VIH, se preparó un anticuerpo
quimérico ratón-humano. Para la expresión del
anticuerpo quimérico se utilizaron, respectivamente, los vectores
de expresión HCMV-\kappa y
HCMV-\gamma1 que llevaban un intensificador y un
promotor de citomegalovirus humano (HCMV) [N. Whittle y col.,
Protein Engineering, 1, 409 (1987)]. El
HCMV-\kappa contiene un gen de la región constante
de la cadena \kappa humana y elHCMV-\gamma1
contiene un gen de la región constante de la cadena \gamma1
humana. El gen de la región V \mu39.1 preparado en el
procedimiento (2) anterior, fue digerido con los enzimas de
restricción HindIII y BamHI y los fragmentos VH y VL fueron
incorporados al sitio de HindIII-BamHI de
HCMV-\gamma1 y HCMV-\kappa,
respectivamente. Las Figs. 5 y 6 muestran la estructura de los
vectores de expresión del gen del anticuerpo quimérico \mu39.1
(CH\mu39.1 y CL\mu39.1, respectivamente). De manera similar, los
genes de las regiones VH y VL de \mu5.5 fueron incorporados a
HCMV-\gamma1 y HCMV-\kappa
(CH\mu5.5 y CL\mu5.5, respectivamente; cf. Figs. 5 y 6).
Se examinó la actividad de un anticuerpo
presentada por el gen del anticuerpo quimérico \mu39.1 o \mu5.5,
construido según se mencionó anteriormente, en un sistema de
expresión transitoria utilizando células COS7 [ATCC CRL 1651].
Utilizando un dispositivo de electroporación fabricado por
Bio-Rad, se introdujo una mezcla de ADNs de los
plásmidos CH\mu39.1 y CL\mu39.1 o una mezcla de ADNs de los
plásmidos CH\mu5.5 y CL\mu5.5 en células COS7 de acuerdo con el
protocolo de Bio-Rad, y las células fueron
cultivadas en medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de suero
de ternera fetal (GIBCO). Después de tres días, se recogió el
sobrenadante del cultivo y se midió la actividad de los anticuerpos
presentes en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA empleando
una anti-IgG humana o el péptido antigénico
SP-1. Como resultado, según se muestra en la Fig. 7,
ambos productos de expresión procedentes de una mezcla de ADNs de
los plásmidos CH\mu39.1 y CL\mu39.1 y de una mezcla de ADNs de
los plásmidos CH\mu5.5 y CL\mu5.5, se unían al péptido
SP-1. Por consiguiente, se confirmó que los genes de
la región V \mu39.1 y \mu5.5 aislados en el procedimiento (2),
son realmente genes que codifican una región V de un anticuerpo que
tiene actividad anti-VIH.
Con fin de estudiar qué porción de la región VH o
VL de los \mu39.1 o \mu5.5 clonados es importante para la unión
al antígeno, las regiones CDR (determinantes de la
complementariedad) de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a
regiones V humanas. Esto se llevó a cabo de acuerdo con el método
para preparar anticuerpos remodelados [Primera Publicación de
Patente Japonesa Nº 62-296890]. Regiones CDR de la
región VH de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a la región
VH que tenía una región de entramado (FR) del subgrupo I humano
[SGI: donada por el Dr. Bendig del MRC Collaborative Center,
Inglaterra] (Figs. 8 y 10), mientras que regiones CDR de la región
VL de \mu39.1 y \mu5.5 fueron trasplantadas a la región VL que
tenía una región FR de la cadena \kappa humana [REI: W. Palm y N.
Hilscmann Z. Physiol. Chem., 356, 167 (1975)] (Figs. 9 y 11).
Específicamente, se preparó un anticuerpo remodelado mediante un
método de PCR de Amersham que combina un kit de Amersham (sistema de
mutagénesis in vitro dirigida por oligonucleótidos, versión
2, código RPN. 1523) con PCR [Saiki, R.G. y col., Science, 239, 487
(1988)]. Un nucleótido de cadena larga que codificaba la porción que
iba a ser trasplantada de la región VH o VL de \mu39.1 o \mu5.5,
fue hibridado a ADN de M13 en el que se había incorporado el gen de
la región V de SGI o REI, y posteriormente se llevó a cabo la
elongación y la unión del ADN en una solución que contenía
dCTP\alphaS. El ADN de M13 molde fue cortado con NciI y el ADN
molde fue digerido con Exonucleasa III para dar solamente el ADN de
M13 mutado (este procedimiento fue llevado a cabo de acuerdo con el
protocolo de Amersham). Posteriormente, utilizando el producto
procedente de la digestión con Exonucleasa III como molde, se llevó
a cabo una PCR utilizando un cebador universal (UP: este cebador
contiene una secuencia complementaria al sitio 5' de M13mp18) y un
cebador inverso (RSP: este cebador contiene la misma secuencia que
el sitio 3' de M13mp18). Se emplearon 20 pmoles de cada uno de estos
cebadores y los reactivos para la PCR fueron los de CETUS. La PCR se
llevó a cabo durante 25 ciclos, comprendiendo cada ciclo 94ºC
durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 74ºC durante 1 minuto.
Después de la finalización de la PCR, los productos fueron digeridos
con BamHI/HindIII y los productos digeridos fueron incorporados al
sitio de BamHI-HindIII de pUC18, que fue utilizado
para la transformación de DH5\alpha (BRL). Como proceso de
selección primario, se llevó a cabo una hibridación de colonias
utilizando los cebadores de CDR empleados en la mutagénesis de
acuerdo con el protocolo del kit de Amersham para seleccionar los
clones que tenían una mutagénesis con éxito en CDR. Posteriormente,
como proceso de selección secundario, se preparó un plásmido a
partir de los clones obtenidos en la selección primaria y se llevó a
cabo una secuenciación con el kit de Sequenase (Toyobo) para
confirmar el trasplante correcto de CDR. De esta forma, se
obtuvieron regiones V remodeladas de \mu39.1 o de \mu5.5
(RH\mu39.1, RL\mu39.1, RH\mu5.5, RL\mu5.5, respectivamente;
cf. Figs. 8 a 11). Igual que en la preparación de un anticuerpo
quimérico en el procedimiento (4), estos fragmentos de la región V
remodelada fueron digeridos con los enzimas de restricción HindIII y
BamHI y los fragmentos de VH y VL fueron incorporados en el sitio de
HindIII-BamHI de HCMV-\gamma1 o
HCMV-\kappa, respectivamente. Por tanto, se
prepararon vectores de expresión del gen del anticuerpo remodelado
\mu39.1 (RH\mu39.1 y RL\mu39.1, respectivamente) y vectores de
expresión del gen del anticuerpo remodelado \mu5.5 (RH\mu5.5 y
RL\mu5.5, respectivamente).
Se examinó la actividad de los anticuerpos
obtenidos a partir de estos genes de los anticuerpos remodelados
\mu39.1 y \mu5.5 en el sistema de expresión transitoria
anteriormente mencionado utilizando células COS7. Igual que en el
procedimiento (5), se recogió el sobrenadante del cultivo de las
células a las que se había incorporado el gen y se midió la
actividad de los anticuerpos presentes en el sobrenadante del
cultivo mediante ELISA, utilizando una anti-IgG
humana o el péptido SP-1. Como resultado, según se
muestra en la Fig. 7, los dos productos de expresión procedentes de
una mezcla de ADNs de los plásmidos RH\mu39.1 y RL\mu39.1 y de
una mezcla de ADNs de los plásmidos RH\mu5.5 y RL\mu5.5, se
unían al péptido SP-1. Por consiguiente, se confirmó
que, en las secuencias de aminoácidos de \mu39.1 y \mu5.5
mostradas en las Figs. 9 a 12, las regiones CDR trasplantadas eran
las regiones más importantes para ejercer la actividad
anti-VIH. A partir de este resultado se confirmó que
los genes que codificaban estas regiones eran genes bastante útiles
para preparar un anticuerpo anti-VIH
recombinante.
SEC ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 357
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
\newpage
SEC ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 321
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 354
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 333
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARN genómico
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 357
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido
nucleico sintético)
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón y humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 321
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip1.000000\baselineskip
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido
nucleico sintético)
\vskip1.000000\baselineskip
CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón y humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 354
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TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido
nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
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FUENTE ORIGINAL
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ORGANISMO: ratón y humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
SEC ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 333
\vskip1.000000\baselineskip
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
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TIPO DE HEBRA: doble
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TOPOLOGÍA: lineal
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TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (ácido
nucleico sintético)
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CARACTERÍSTICA
\vskip1.000000\baselineskip
FUENTE ORIGINAL
\vskip1.000000\baselineskip
ORGANISMO: ratón y humano
\vskip1.000000\baselineskip
SECUENCIA
Claims (10)
1. Una cadena de un anticuerpo recombinante
anti-VIH remodelado genéticamente que comprende una
secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón y una
secuencia de aminoácidos derivada de un anticuerpo humano, teniendo
dicha cadena de un anticuerpo recombinante anti-VIH
remodelado genéticamente actividad neutralizante frente al virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH), caracterizada porque las
regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDR3) tienen
las secuencias de aminoácidos siguientes:
donde dicha cadena de anticuerpo es
una cadena H, y en la que un aminoácido en el extremo C de la FR1
adyacente a la región determinante de la complementariedad CDR1 de
una región variable es treonina (Thr), una secuencia de dos
aminoácidos en el extremo C de la FR2 adyacente a CDR2 es
Ile-Gly, una secuencia de seis aminoácidos en el
extremo N de la FR3 adyacente a CDR2 es
Lys-Ala-Thr-Met-Thr-Val,
y un aminoácido en el extremo C de la FR3 adyacente a CDR3 es
treonina (Thr);
o
donde dicha cadena de anticuerpo es
una cadena
L.
2. La cadena H del anticuerpo
anti-VIH recombinante de la reivindicación
1(a), en la que una secuencia de aminoácidos completa de una
región variable es la secuencia de los aminoácidos N^{os} 1 a 118
de la SEC ID Nº:7 del Listado de Secuencias.
3. La cadena L del anticuerpo
anti-VIH recombinante de la reivindicación
1(b), en la que una secuencia de aminoácidos completa de una
región variable es la secuencia de los aminoácidos N^{os} 1 a 111
de la SEC ID Nº:8 del Listado de Secuencias.
4. Un anticuerpo anti-VIH
remodelado recombinante que comprende la cadena H del anticuerpo
anti-VIH remodelado recombinante de la
reivindicación 1(a) y la cadena L del anticuerpo
anti-VIH remodelado recombinante de la
reivindicación 1(b).
5. Un fragmento de ADN que codifica una región
variable de la cadena H o de la cadena L, o una porción de la misma,
donde dicha cadena H o L está definida adicionalmente en cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Un proceso para preparar un anticuerpo
anti-VIH remodelado recombinante, que comprende la
construcción de un vector de expresión mediante la utilización de un
fragmento de ADN que codifica la región variable de la cadena H de
la reivindicación 1(a) o 2 y de un fragmento de ADN que
codifica la región variable de la cadena L de la reivindicación
1(b) o 3 y fragmentos de ADN que codifican una
inmunoglobulina humana, permitiendo dicho vector de expresión la
expresión de un anticuerpo recombinante en el que al menos las
regiones determinantes de la complementariedad tienen una secuencia
de aminoácidos derivada de un anticuerpo de ratón; la expresión del
ADN recombinante en una célula animal y la recogida de dicho
anticuerpo.
7. Una composición farmacéutica que contiene al
menos una cadena de un anticuerpo anti-VIH
remodelado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o el
anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la
reivindicación 4.
8. Una composición para diagnóstico que comprende
al menos una cadena de un anticuerpo anti-VIH
remodelado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el
anticuerpo anti-VIH remodelado recombinante de la
reivindicación 4 o al menos un fragmento de ADN de acuerdo con la
reivindicación 5.
9. Un vector que contiene un fragmento de ADN de
acuerdo con la reivindicación 5.
10. Una célula huésped transformada con un vector
de la reivindicación 9.
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