JPH04141095A - 組換え抗ｈｉｖ改変抗体および改変抗体の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に起因するエ
イズ（ＡＩＤＳ）の治療および予防に期待できる新規な
組換え抗Ｈｒｖ改変抗体に関する。　さらに詳細には、
マウス免疫グロブリン遺伝子とヒト免疫グロブリン遺伝
子との融合遺伝子から遺伝子組換え技術を用いて発現さ
れ、ＨＩＶに対し中和抗体を有する抗層Ｖ改変抗体に関
する。さらには、このような有用な改変抗体の新規調製
方法に関する。

先五夏１遣 後天性免疫不全症候！＋￥（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍ
ｕｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：　
　ＡＩＤＳ）は、レトロウィルスに属するヒト免疫不全
ウィルス（ＨＩＶ）に起因するウィルス性疾患である。

この疾患は１９８１年にアメリカで発見されて以来また
たく間に世界中に広がり、世界保健機構（ＷＨＯ）の票
計によれば、１９８７年８月１２日時点においてすでに
１２２ケ国に発生が認められ、牢者総数は６万人を越し
ている。わが国においても１９８７年９月４日時点で５
０人の患者が確認され、そのうち２８人はすでに死亡し
ている。　　ＡＩＤＳはこのように急速に世界中に広が
りをみせている。

抗■ＩＶ治療剤として、現在アジドチミジン（＾ＺＴ）
がある［Ｎａｔｕｒｅ：　３２６．　ｐ４３０．　　（
１９８７）］が、生体の造血組織に対する強い毒性を有
するため多くの例で貧血をもたらすことがわかっている
。その他、多くの物質が抗ｌＶ剤の候補として研究が行
われているが、有効であり且つ安全な抗層■剤はまだ開
発されているとは言えない、また木柄予防のための実用
可能なワクチン開発に成功したというような報告もない
。

このような状況の中で、輸血によって旧■陽性となった
サラセミアの患者グループと小児のＡＩＤＳ及びＡＲＣ
（ＡＩＤＳ関連症候１！￥）のグループにおいて、その
臨床と中和抗体の関連についての報告がある［　Ｒ，Ｇ
ｕｒｏｆｆら、　　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　　１
３８．　　ｐ３７３１．　（１９８７）；　Ｒ，Ｇｕｒ
ｏｆｆら、　　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、　　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ］。

いずれの場合でも中和抗体の検出できる症例においては
臨床症状も軽く良好であるが、中和抗体が検出できない
症例においては臨床症状が悪化していることが報告され
ており、ｉｎ　ｖｉｖｏおける中和抗体の有効性を示唆
している。このように抗ＨＩＶ中和抗体はｉｎ　ｖｉｖ
ｏにおける感染の拡大防止や感染細胞の排除に役立つ可
能性があり、現在臨床で用いられている抗ウィルス剤等
との併用により更に高い効果が得られることが期待され
る。

【来並Ｉ 上記のような抗日Ｖ中和抗体としてＡＩＤＳの患者から
採取・調製するやり方もあるが、この方法は、倫理的な
問題や原材料入手の問題など数多い困難が予想される。

そこで、このような高力価血清の代替品としてＨＩＶウ
ィルス中和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考
えられる。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技
術は、これまでに主としてマウス型モノクローナル抗体
において確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産
生ずるモノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得ら
れ、原料不足の問題を解消できうる。しかし、ここにお
けるモノクローナル抗体は、副作用（マウスモノクロー
ナル抗体をヒトに使用した場合、異種タンパクとしてア
ナフィラキシ−ショックや血清病などの副作用を起こす
ことが考えられる）をなくす意味から、従来のマウスモ
ノクローナル抗体ではなくヒトモノクローナル抗体でな
ければならない。

このヒトモノクローナル抗体の作製法には次のようなも
のが考えられる。（１）ヒト×ヒトハイブリドーマを用
いる方法、（２）ある種のウィルス及び化学薬剤等でト
ランスフオームさせたヒトリンパ球を用いる方法、（３
）ヒト×マウスヘテロハイブリドーマを用いる方法、（
４）ヒト×マウスへテロハイブリドーマを親株としたヒ
ト×（ヒト×マウス）ハイブリドーマを用いる方法、（
５）キメラモノクローナル抗体［抗原と結合する可変（
Ｖ）領域はウィルス中和活性を有するマウスモノクロー
ナル抗体から、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に
関与する定常（Ｃ）領域はヒトモノクローナル抗体から
なる、マウス（Ｖ）−ヒト（Ｃ）キメラモノクローナル
抗体］を遺伝子組換えで作製する方法等であるが、これ
らの方法による成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がない、（２）についてはヒトの場合の
ＥＢウィルスで得られる抗体産生細胞は主として１ｇＭ
度生細胞が多く力価の低い場合が多く実用的でない、ま
たＥＢウィルス以外には適当なウィルスや化学薬剤がな
い、さらに、（３）（４）の方法ではこれまでの作製例
から考えて、目的のヒト型モノクローナル抗体を高効率
に得るまでには多くの困難が予想される（例えば、安定
性の問題等）、従って、（５）のキメラモノクローナル
抗体法がより実現性の高い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウスハ
イブリドーマからクローニングしたそのＶ遺伝子と、定
常（Ｃ）領域のＭ料となるヒト抗体産生細胞等のヒト細
胞からクローニングしたＣ遺伝子とを結合させたマウス
〈ｖ）−ヒト（Ｃ）キメラ抗体遺伝子を含むプラスミド
ベクターを、動物細胞（例えば、マウスミエローマ）宿
主中で発現させ、その培養上清中に得られるものである
。キメラ抗体に関するいくつかの報告がすでに見受けら
れる（特開昭６０−１５５１３２号、特開昭６１−４７
５θθ号）、この方法ではモノクローナル抗体作製のた
めのリンパ球の原資をヒトに求める必要はなく、旧■の
ような危険度の高い抗原に対する抗体を作製する場合、
特にバイオハザードの面から望ましい０本発明者らも既
に抗層Ｖキメラ抗体の作製に成功している［特願昭６３
−２０２５５１．　　Ｌかし、最近の報告［＾、Ｆ、　
ＬｏＢｕｇＪｉｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　８６４２２
０　（１９８９＞　３によればキメラ抗体であってもま
だマウスの抗原性が残っており、その副作用や血中半減
期はマウス抗体とヒト抗体のちょうど中間であるという
、このようにキメラ抗体にはまだマウスＶ領域に起因す
ると思われる抗原性が残っており、この抗原性をできる
だけ取り除くことが望ましい。

ところで、抗体の可変領域は抗原結合に強く関与してい
る３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とそれらの抗原結合
部位を支える抗体の構造に関与している４つの骨格（フ
レーム）部（ＦＲ）に分けることが出来る。そこで、Ｇ
、　ＷｉｎｔｅｒはこのマウスＶ領域の３つのＣＤＲを
ヒトシ領域の４つのＦＲに遺伝子工学的に移植すること
により、キメラ抗体よりさらに抗原性の少ない改変抗体
（リシエイプト抗体・ｒｅｓｈａｐｅｄ　Ａｂ）を作製
した（特開昭６２−２９６８９０号）。

しかし、単純にマウスＣＤＲ部分をヒトＦＲ部分に移植
しただけでは抗原結合活性を再現できない場合があり、
この技術が全ての抗体に適用できるとは言えない、すな
わち、改変抗体において抗原結合活性を普遍的に再現す
るためにはＧ、　Ｗｉｎｔｅｒのいう方法だけで不十分
であり、より普遍的な方法が必要とされている。

現在■でにＧ、　Ｗｉｎｔｅｒの技術を普遍的に使用で
きるように改良した例はなく、ましてや旧■に対して中
和活性を有する抗日■改変抗体の作製に成功した例はな
い。

」匪ムＩｌ このような状況において、本発明者らは先に作製した抗
ＨＩＶ中和マウス−ヒトキメラ抗体をＧ、　Ｗｉｎｔｅ
ｒの技術を用いて改変した。さらに本発明者らは、既に
Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒが述べた方法をさらに改良し、従来
の技術からできる改変抗体より抗体としての結合活性の
高い改変抗体を調製することに成功し、より一般的に、
どの抗体にも適用できると思われる改変の法則を発見し
た。

すなわち本発明は、これ跋でに一切報告されていない抗
層Ｖ中和活性を持つ改変抗体およびこのような改変抗体
の調製方法を提供するものであり、この新規抗層Ｖ改変
抗体からなる副作用の少ないＡＩＤＳ診断薬、治療薬・
予防薬の開発を可能にするものである。および、これを
通じて改変抗体の一般的な調製方法を確立することを目
的とする。

の　　　　ゝ 改変抗体の調製方法は既にＧ、　Ｗｉｎｔｅｒらが発表
しており、改変抗体の作製例がいくつかある６例えば、
マウス抗ハブテン抗体（Ｂｉ−８）のＶＨ領領域３つの
ＣＤＲをヒトミエローマ蛋白（ＮＥＷ）のＶＨ領領域Ｆ
Ｒに単純に組み込んだ結果、マウスＶＬ領域との組合せ
でハプテンに対する結合活性が得られた［Ｐ。

Ｔ、　Ｊｏｎｅｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、
３２１．５２２（１９８６）　］。

しかしハプテン抗原は分子サイズが小さく、これと結合
する抗体の抗原結合領域も限られている。

したがってＣＤＲを移植した結果抗原結合サイトが再構
築されたのか単に一部のＣＤＲポケットに結合している
だけなのか区別がつけ難い、そこで彼らは次にリゾチー
ムに対する抗体（Ｄｌ、　３＞を改変した。　　Ｂ１−
８抗体と同様にＶｉ（領域の３つのＣＤＦＩをヒトミエ
ローマ蛋白（ＮＥｌｌ）のＶＨ領領域ＦＲに単純に組み
込んだ結果、マウスＶＬ領域との組合せでリゾチームに
対する結合活性が得られた［　Ｍ、νｅｒｈｏｅｙｅｎ
、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．１５
３４　（１９８８）］、　　Ｌかしこの場合、ＨＩＭだ
けの改変にもかかわらず結合活性は１／１０に低下した
。続＜　ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原に対するラット抗体の
改変［Ｌ、　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、ａｔ　ａｌ、、　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　３３２．３２３（１９８８）］では、最
初にＨ鎖り鎖ともラット抗体のＣＤＲをヒト抗体（ＶＨ
は）ＩＥＷ、ＶＬはＲＥＴ）　ノＦＲにそれぞれ単純に
移植した結果、はとんど結合活性は得られなかった（１
／４０に低下）、その後ラットＶ）ＩのＦＲＩ領域の一
部をさらにヒトＶＨに移植することによって、１７３程
度まで回復させた。しかし、薬物投与における安全性あ
るいは製造コスト等を考えると、活性低下をより小さく
することが望まれる。

以上の結果は、Ｇ、　！Ｎｎｔｅｒらの改変抗体技術が
、実際に最も適用されるであろう分子量の大きな抗原に
対して、単純にＣＤＲをＦＲに移植するというだけでは
対応できないことを示唆している。すなわち、ハプテン
のようなサイズの小さい抗原の場合を除いて、通常の抗
原に対しては、この改変抗体の技術はまだ完成している
とは言えない。

本発明者等は前述の抗層■抗体の改変を行なった結果、
実用に耐える中和活性を持った抗層Ｖ改変抗体の作製に
成功し、さらにこの過程においてＧ。

Ｗｉｎｔｅｒらの改変抗体技術をさらに改良し一般的に
どの抗体にも適用できるような方法を発見し改変抗体技
術を完成させるに至った。

すなわち、相補性決定領域およびこれに隣接するフレー
ム領域の一部が目的の結合活性を有する特異的マウス抗
体由来のアミノ酸配列であり、残りのフレーム領域がヒ
ト抗体由来のアミノ酸配列になるよう遺伝子組換えが行
われた遺伝子であって、さらに該ヒト抗体が相補性決定
領域を提供するマウス抗体可変領域とアミノ酸配列にお
いて高いホモロジーがあるサブグループのヒト抗体から
選択されることを特徴とする改変抗体Ｈ鎖をコードする
組換え遺伝子を調製し、これを適当な発現ベクターを用
いて動物細胞中で発現させ回収することにより得られる
改変抗体Ｈ鎖を得た。このようにして得られた改変抗体
Ｈ鎖とＧ、　Ｗｉｎｔｅｒの方法に従って調製された改
変抗体り鎖とからなる改変抗体の特異的結合活性を分析
した結果、本発明の調製方法による改変抗体が、従来の
改変抗体と比較して特異性が高いことを確認した。さら
により好ましい改変抗体調製において、Ｈ鎖可変領域の
中でマウス由来のアミノ酸配列にする領域としては、少
なくともＣＤＲのアミノ酸配列、ＣＤＲＩに隣接するＦ
Ｒ２のＮ末側５個のアミノ酸配列およびＣＤＲ２に隣接
するＦＲＢのＮ末側６個のアミノ酸配列であることが見
いだされた０例えば、抗層Ｖ活性を有する改変抗体を調
製するような場合には、マウス抗体由来のアミノ酸配列
にする領域およびアミノ酸配列の好ましい一例としては
、下記が挙げられる。

ｘ　ｘｘｘｘｘｘ　ｘｘ　ＸＸＸＸＸＸＸ　Ｘ　Ｘ　Ｘ
ＸＸ　ＸＸＸＸ　Ｘ　Ｘ　Ｘ　ＸＴ−ＴＹＰ　ＩＥ−Ｗ
ＭＫＱＮｘｘｘｘｘｘｘ　ＩＧ−ＮＦ　ＨＰＹＳＤＤＴ
ＮＹＮＥＫＦＫＧ−ＫＡＸＬＴＶｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ
ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ　Ｉ−）ＩＹＧＳＡＹ
ＡＭＤＹ−ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ但し、ｘｘｘ、　、
　ｘはヒト抗体由来のアミノ酸配列、１豊−の部分はＣ
ＤＲのアミノ酸配列を示す。

そして、ヒト型抗体にする場合の改変抗体の可変領域全
体のアミノ酸配列としては、好ましい一例として下記の
アミノ酸配列が挙げられる。

ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶ■ＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧ
ＹＴＦＴ−ＴＹＰＩＥ−ＷＭＫ　ＮＰＧＳＬＲ５ＥＤＴ
ＡＶＹＹＣＡＩ−ＨＹＧＳＡＹＡＭＤＹ−１１１ＧＱＧ
ＴＬＶＴＶＳＳ但し、■二線一部分はマウス抗体由来の
アミノ酸配列を示す。

Ｌ鎖についても、Ｈ鎖と同様にフレーム領域の一部も含
めてマウス抗体由来の配列にすることで従来の改変抗体
り鎖と較べて活性を向上させることも可能であるが、従
来の改変抗体の調製方法で得られたし鎖と上記の本発明
により提供されるＨ鎖とからなる改変抗体でも十分な活
性を得ることが可能である。

抗８１ｖ活性を有する改変抗体り鎖を調製する上では、
マウス抗体由来のＣＤＲのアミノ酸配列の一例として下
記の配列を挙げることができる。

ＣＤＲＩ　：　　ＸＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＩＩＮＣ
ＤＲ２：　、ＡＡＳＮＩＪＳ ＣＤＲ３：　　ＱＱＳＮＥＤＰＦＴ さらにヒト型改変抗体にする場合にはＬ鎖可変領域のア
ミノ酸として下記のものが挙げられる。

Ｄ　Ｉ　Ｑ）４ＴＱＳＰＳＳＬＳＡ！３ＶＧＤＲＶＴ　
Ｉ　ＴＣ−ＫＡ　ＳＱＳｖＤＹＤＧＤＳＹＭＦＩ−１１
ＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬ　Ｉ　Ｙ−ＡＡＳＮＬＥＳ−
ＧＶＰＳＲＦ　５ＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴ　ＩＳＳＬＱ
ＰＥ　Ｄ　Ｉ　Ａ　Ｔ　Ｙ　Ｙ　Ｃ−［−Ｆ　Ｇ　Ｑ　
Ｇ　Ｔ　）［Ｖ　Ｅ　Ｉ　Ｋ　Ｂ（但し、ｌ二線−はＣ
ＤＲのアミノ酸配列）最も好ましい改変抗体を作製する
上で重要なポイントは、場合に応じて、ＣＤＲを提供す
るＶ領域からどの部分のアミノ酸をヒトＶ領域に移植す
るか決定することであり、移植すべきアミノ酸の決定方
法の要点が以下、本発明により開示される。

ｌ　　　　　　　　　　ｆ−ＦＲ 抗体遺伝子のＶ領域にはさまざまな種類のサブグループ
があることが知られており、例えば、Ｋａｂａｔら　［
５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　　ｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　
ｏｆ　　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ
　４ｔｈ　ｅｄ、、　ｒｕｂ目ｃ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｅ
ｒｖｉｃｅ、　ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，
１９８７］による分類によればヒトのＶＨ領領域場合３
種類、マウスＶＨ領域で基本的に４種類（詳しくは１１
種類）というように分類される。抗体蛋白の基本構造は
さまざまなサブグループ間で保たれているが、詳細には
各サブグループ間で異なる。したがって、最終的な結合
活性にはＦＲ領領域差異が大きく関与してくると予想さ
れる。そこで、ＦＲを提供するヒトＶ領域のサブグルー
プはＣＤＲを提供するＶ領域のサブグループとホモロジ
ーの高いものの中から選ぶべきである。このホモロジー
検索はコンピュータを使って行われる。

ＶＥｉＶＬ両ドメインは独立して抗原と結合するのでは
なく、お互いに密接に相互作用し合いながらＣＤＲによ
り抗原結合ポケットを構築している。このバッキングに
はＶ領域のいくつかのアミノ酸が重要である事が知られ
ている［Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１８６．６５１　（１
９８５）　］、　　ＣＤＲおよびＦＲの一部を移植する
際にはこれらのバッキングに関与したアミノ酸に注意す
る必要がある。

ＣＤＲ ■領域の個々のＣＤＲはそれぞれＣＤＲドメインを構築
するのにある決まった構造を取ることが知られている［
Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、
　　３４２．８７７　（１９８９）］、　　この構造は
Ｃａｎｏｎｉｃ１構造といわれており、この構造に関与
したアミノ酸がいくつか知られている。したがって、Ｃ
ＩＩＲ移植の際にはこの構造も移植できるように、ＦＲ
領域部分でこの構造に関与しているアミノ酸は移植する
必要がある。

ζ　　　　　　　　　　ゝ 抗体遺伝子持にＶ領域遺伝子は体細胞突然変異を受ける
ことが知られている。これらの突然変異によって、上記
の注目すべきアミノ酸以外にＣＤＲドメイン１１１′１
ｊｌＬに関与した特異的なアミノ酸がＦＲ領領域中に生
じる事がある。そのようなアミノ酸はアミノ酸の性質（
疏水性親水性、酸性塩基性、分子サイズ等）を比較すれ
ば見つけることができる。また、そのようなアミノ酸が
ＣＤＲドメイン構造に関与しているかどうかはコンピュ
ータを用いたモデリングにより容易に推定することがで
きる。

以上示したようにＣＤＲを提供する■領域からこれらの
条件を満足させるようにアミノ酸を決定し、これらのア
ミノ酸を受は入れ側のヒトＶ領域に移植すれば、どのよ
うな抗体でも改変することが可能である。

実際の改変はＶ領域をコードする遺伝子上で、長鎖オリ
ゴヌクレオチドを用いた特定部位突然変異誘発法により
行なうことができる。この方法には数多くのバリエーシ
ョンがありそのいずれも利用することが可能である［例
えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　Ｖｏｌ、　１５４等］。

最後に、本発明の改変抗体調製法で得られた改変された
■領域遺伝子はヒト抗体定常（Ｃ）領域遺伝子と結合さ
れ完全な改変抗体が構築される。改変されたＶ領域遺伝
子はその物理的な性質は何らマウス等のＶ領域遺伝子と
変わることはなく、既知のキメラ抗体作製法を利用して
ｔメラ抗体を作製する場合と全く同様に、改変されたＶ
領域遺伝子とＣ領域遺伝子を結合させることができる０
例えば、液通らによって既に示された方法［液通ら、Ｃ
ａｎｃｅ「Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４７．　ｐ９９９−１
００５．　＜１９８７）］やＭ、　Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ
ｎ　［Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｈ（ｅｄ）　Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ｐｒｏｇ
　Ａｌｌｅｒｇｙ、　Ｂａ５ｅｌ、　Ｋａｒｇｅｒ、　
１９８８．　ｖ。

＋　　４５．　　ｐｐ９１］や！Ｉｆ、　　Ｌ、　　Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ［＾ｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇＬ　４４．６５．　　（１９８９）］等の
総説に紹介されている方法に準じて行うことが出来る。

また、発現させる宿主によって動物細胞発現系、大腸菌
発現系、酵母細胞発現系などベクター系が異なるが、い
ずれの場合でも発現可能である。

次に抗日■改変抗体について説明する０本発明の抗ＨＩ
Ｖ改変抗体は上記に示した改変抗体調製法を用いて構築
されたものである。この抗ＨＴＶ改変抗体の構築には主
に４つの過程が必要である。初めに抗層■抗体を産生ず
る細胞の調製、その細胞がらの■領域遺伝子の単離、単
離されたＶ領域のアミノ酸配列をもとにした改変抗体の
作製、最後に得られた改変抗体遺伝子の宿主細胞におけ
る発現の４つの過程である。以下順を追って説明する。

本発明に用いる抗■ｖ抗体遺伝子は抗層Ｖ抗体を産生じ
ている細胞から調製できる。抗層■抗体産生細胞は、こ
れまでに確立されているマウスモノクローナル抗体の作
製技術を用いて調製される０例えば、Ｈ９／ＨＴＬｖ−
１１［Ｂで示されるウィルス感染細胞株（ＡＴＣＣＮｏ
、ＣＲＬ８５４３）や、　　Ｍｏ１ｔ３／ＨＴＬＶ−ｍ
　Ｂ　　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ８６０２）等の入手
可能なウィルス感染細胞より、ウィルス或はウィルス糖
蛋白分ｉｉｉ　（ｅｎｖ；　ｇｐ４１、ｇｐ１２０）を
精製し、これを免疫原として用い通常のハイブリドーマ
を作製する方法でハイブリドーマを作製すれば、抗層■
マウスモノクローナル抗体産生細胞を得ることが可能で
ある。更に、このようにして得られた抗Ｈｒｖマウスモ
ノクローナル抗体産生細胞の中から、ＨＩＶに対して中
和活性を有するモノクローナル抗体を産生じている細胞
を選択する。

旧■の場合、該ウィルス特有の性質から、このような中
和活性を有するモノクローナル抗体を得ることは容易な
ことではないが、そのような細胞株として本発明者らは
、ＨＩＶに対して中和活性を有する抗体を産生ずるハイ
ブリドーマ５４″ＣＢＩ細胞の確立に成功している［松
下修三ら、Ｍｅｄｉｃａｌ　ｒ麿ｍａｎｏｌ。

ｇｙ、　３．　ｐ１４．　　（１９８７）］。

このような抗抗層中和モノクローナル抗体産生細胞より
、抗原結合性を持った抗体遺伝子を通常の遺伝子操作技
術により単離することができる０例えば、その細胞の染
色体ＤＮＡから常法［例えば、Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ＆ｒｂｏｒ　Ｌａｂ
、　（１９８２Ｌｌ照コに従ってｖｌＩｌ遠域子をクロ
ーニングする方法であり、あるいは、その細胞のメツセ
ンジャーＲＮ＾を材料として常法［例えば、Ｄ、　Ｍ、
　Ｇｌｏｖｅｒ編集”　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏ
ｌ、Ｉ”　ｒＲＬｐｒｅｓｓ（１９８５）］によりｃＤ
Ｎ＾を合成しＶ領域遺伝子をクロニングする方法である
。いずれの方法も、■領域遺伝子クローニングの為のプ
ローブとして、すでに報告されているマウス免疫グロブ
リン遺伝子の核酸塩基配列［例えば、坂野ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２８６．　Ｐ６７６、（１９８０）；　　Ｅ、
Ｅ、Ｍａｘ　　ら、　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ
、、　　２５６゜Ｐ５１１６．　（２９８１）　］を参
照して合成したＤＮＡプローブ等を利用することが出来
る。また、ＰＣＲ（ポリメレース連鎖反応）を利用した
クローニングも可能である［Ｒ，０ｒｌａｎｄｉ、　ｅ
ｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８６．３８３３　（１９８９）；　Ｗ、　Ｄ
、　）ｆｕｓｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６．１２７５　（１９８９）　
］、　　本発明者は既にこのような方法により前述の５
４″ＣＢＩ細胞から抗Ｈ１■中和活性を持った■領域遺
伝子（０，５β■遺伝子）を単離し、マウス−ヒトキメ
ラ抗体の作製に成功している［特願昭６３−２０２５５
１　、　　これらが本発明の以下の改変抗体遺伝子調製
に用いる最も好ましい材料として挙げられる。

このようにして得られた０、５βＶ遺伝子から翻訳され
るアミノ酸配列を決定し、前述の改変抗体作製法の４つ
の条件を満足するようにヒト抗体Ｖ遺伝子への移植領域
を決定した。その結果、ＶＬ領領域場合ＲＬ０．５βが
、Ｖ■領領域場合ＲＨｅＯ，５βがそれぞれ最も望まし
い改変抗体として作られた（第１図参照）、このＶＨＶ
Ｌ遺伝子の組合せによりＣＯ５細胞で作られた抗体は０
５βエピトープであるＢＨＩＯペプチドに結合し、ＨＴ
ＬＶＴＫ　Ｂウィルスを中和した。

このようにして得られた本発明の抗日■改変抗体はＡＩ
ＤＳの臨床においてこれまでになかった実質的に有効な
ＡＩＤＳ治療および予防剤となりうるちのである。さら
に、本発明の改変抗体調製法は、あらゆる抗体に対して
改変抗体への適用を実質的に可能にするものである。

次に、その実施例を示すが、本発明はこれに限定される
ものではない。

実施例 ＋Ｖマ　ス　　　　ロー ］１ｕｔ１コＬ王 抗層Ｖマウスモノクローナル抗体を産生ずる細胞は、Ｈ
ＩＶウィルス（）ＩＴＬＶ−ｍ　Ｂ）粒子及び精製した
ウィルス糖蛋白分画を免疫原として用いて、ＢＡＬＢ／
ｃマウスを免疫後、その牌細胞とＸ６３マウスミエロー
マ細胞を常法により細胞取合して調製した。このハイブ
リドーマ、５４°ＣＢＩ細胞の産生ずる抗層Ｖモノクロ
ーナル抗体（０，５β抗体）はＯＮ’の外被蛋白ｇＰ１
２０を認識し、１１００ｎ／−という低濃度でＨＩＶ感
染を阻止する中和活性を持っている［松下修三ら、Ｍｅ
ｄ４ｃａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　３．　　ｐ
１４．（１９８７）　　コ。

この０．５β抗体のＶ領域遺伝子の調製は、５４’ＣＢ
１細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、そのＥｃｏＲＩ（宝
酒造製：以下本実施例で使用した試薬は、特に断わりの
ない限り宝酒造製あるいは東洋紡製を使用した）で切断
して構築した染色体ＤＮＡライブラリーがらマウスＪ領
域を含んだ［３２Ｆ］標識合成りＩＩＡプローブ［坂野
ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８６．　ｐ６７６（１９８０）
；　　Ｅ、　Ｅ、　Ｍａｘら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅｗ、、　２５６．　ｐ５１１６　（１９８１）］を
用いてクローニングした（特願昭６３−２０２５５　）
　。

この０．５β抗体のＶ領域遺伝子は、以下に示す本発明
の抗層Ｖ改変抗体調製の材料として使われた。

Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒの改変抗体作製方法にしたがって０
．５β抗体ＶＨ領域改変のための移植アミノ酸の選定を
行なった。すなわち、Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒらが用いてい
るヒトＶＬＦＲのアミノ酸配列［ＲＥＩ第２図参照：ｌ
ｌＰａ１ｍ　　ａｎｄ　　Ｎ、　　ｌ（ｉｌｓｃｍａｎ
ｎ　　Ｚ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　Ｃｈｅ＋＋、、　　３
５６゜１６７　（１９７５）］に移植する０、５β抗体
ＶＬ領域（７）７ミノ酸配列の決定を行なった。すなわ
ち、Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒの方法通りＣＤＲ領域のみをＲ
ＥＩへ移植するようデザインした（ＲＬ）、第２図にそ
のデザインされたＲＬのアミノ酸配列を示す。

”　　　ＲＬアブ−ミ　の 改変抗体ＲＬはアマジャムのキット（Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅ。

ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍｖｅｒｓｉｏｎ　２
　ｃｏｄｅ　ＲＰＮ、１５２３）とＰＣＲ［５ａｉｋｉ
、　Ｒ，Ｇｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９
．４８７　（１９８８）］を組み合わせたアマジャム−
ＰＣＲ法により行なった。アマジャムの長鎖ヌクレオチ
ド特定部位突然変異誘発性キットはＥｃｋｓｔｅｉｎら
の方法［Ｔａｙｌｏｒ、　Ｊ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．８７４９
　（１９８５）］をもとにしている、０．５βＶＬ領域
のＲＬに対する移植部位をコードする長鎖ヌクレオチド
をＲＥＩのＶ領域遺伝子を組み込んである鋳型１４１３
Ｄ？ｆＡにアニーリングさせた後にｄＣＴＰαＳを含む
溶液中でＤＮＡの伸長・結合を行い、適当な制限酵素（
ここではＮｃｉｌ）で鋳型１４１３ＤＮＡを切断、Ｅｘ
ｏｎｕｃｌｅａ＋ｓｅｍによる鋳型ＤＮＡの消化を行な
って突然変異したＭ１３ＤＦＩＡのみのストランドを得
た（ここまではアマジャムのキットのプロトコールに従
って行なった）、さらに本発明者等はさらにこの方法に
ＰＣＲ法を組み合わせて高効率で突然変異させたＤＮＡ
を得る方法へと改良した。すなわち、Ｅｘｏｎｕｃｌｅ
ムｓ−ｅ　ｍ消化産物を鋳型にユニバーサルプライマー
（ＵＰ：Ｍ］３■ｐ１８の５゛側に相補的な配列を持つ
）とリバースプライマー（Ｒ５Ｐ：Ｍ１３■Ｐ１８の３
°側と同じ配列を持つ〉を用いてＰＣＢを行なった。こ
れらのプライマーはともに２０Ｐ■ｏｌ使い、ＰＣＲの
試薬はＣＥＴＵＳ社のものを使用した。ＰＣＢの条件は
、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分で２５サイクル
行なった。

ＰＣＲ終了後、産物をＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ　１１で
消化し、アガロース電気泳動により目的のサイズを切り
だし、ｐＵｃ１８のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌｒ＋サイト
に組み込み、ＤＨ５ａ（ＢＲＬ社）に形質転換し、　１
次スクリーニングとして、突然変異に使用したＣＤＲプ
ライマーを用いてアマジャムキットのプロトコールにし
たがってコロニハイプリダイゼーションを行ない、ＣＤ
Ｒ突然変異に成功しているクローンを選んだ、その結果
ＲＬ２．４５゜７３の３クローンが３つのＣＤＲとも突
然変異していた。さらに、２次スクリーニングとして、
得られたクローンよりプラスミドを常法により調製しシ
ークナーゼキット（ＵＳＢ社）を用いてシーフェンスを
行なった。その結果ＲＬ鎖についてはクローン２．４５
が正確にＣＤＲ移植が出来ていることが判明した。

Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒの改変抗体作製方法にしたがって０
５β抗体ＶＨ領域改変のための移植アミノ酸の選定を行
なった、すなわち、Ｇ、−”１ｎｔｅｒらが用いている
ヒトＦＲのアミノ酸配列［ヒトＶ領域サブグループ２で
あるＮＥＷ図１参照：　　Ｊ、　Ｐｏ１ｊａｋ、　ｅｔ
　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７１．３４４０　（
１９７４）］に移植する０、５β抗体ＶＨ領域のアミノ
酸配列の決定を行なった。

移植する領域として、Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒの方法通りＣＤ
Ｒ領域のみ移植した場合（Ｖｅｒ、ａ：　ＲＨａ）と、
さらにＣａｎ。

ｎ１ｃａｌ構造（Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２．８７７　（１９８９）］を
満足するようにＦＢＩとＦＲ３領域の一部も合わせて移
植した場合（Ｖｅｒ、　ｂ：　ＲＨｂ）の２つのバージ
ョンをデザインした。第１図にそのデザインされたＲＨ
ａ、　ＲＨｂのアミノ酸配列を示す、実際の改変抗体Ｒ
Ｈａ、　ＲＨｂは以下の■に示す方法により作製した。

Ｒ１（ａ　ＲＲｂ　　−スζ 改変抗体ＲＨａ、　ＲＨｂの作製には初めアマジャム−
ＰＣＲ法を試みた。　　１ｉＥ−“のＶ領域遺伝子を組
み込んだＭ１３ＤＮＡを鋳型にして、第１図に示す０．
５βＶＨ領域のＲ）ＩＡ、Ｒ１１ｂに対する移植部位を
コードする長鎖ヌクレオチドをそれぞれ用いて前述のＲ
Ｌの場合と同様にアマジャム＝ＰＣＲ法を行なった。そ
の結果いずれの場合も３のＣＤＲがともに移植されたも
のは得られなかった。　　Ｒ［（Ａの場合、ＲＨａ７２
がＣＤＩと３を持っていたことが分かったので、これを
鋳型に１ｕｎｋｅｌ法［Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、＾、、　
１４ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｖｏｌｏｇｙ、　１
５４．３６７（１９８７）；　　Ｖｅｎｋｌｔａｒａ＋
＊ａｎ、　　＾、　　Ｒ，、Ｎｕｃ、　　Ａｃ１ｄｓ　
　Ｒｅｓ、１７．３３１４　（１９８９）］を用いた特
定部位突然変異誘発法により残りのＣＤＲ２部分を移植
した。　　Ｋｕｎｋｅｌ法は、ｄａｔ−、ｕｎｇ−の大
腸菌で作られたＭ１３ファージＩｌ？ｌ＾（デオキシウ
ラシル（ｄｔｌ）を含んでいるためｕｎｇ＋の大腸菌の
なかでは増殖できない）を鋳型にｉｎ　ｖｉｔｒ。

鳳ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを行ない、ｄＵを含まない目的
の変異Ｍ１３ＤＮＡを合成し、さらにこれらをｕｎｇ＋
の大腸菌にトランスフェクションすることによりｄＵを
含まないＭ１３のみを選択的に得るという方法である。

ＲＨａ７２のＶ領域遺伝子を持ったＭ１３ＤＮ＾をＢ１
３１３株（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）に感染させてｄＵ−Ｒ
ＦＩａ７２６５ｓＤＮ＾を調製した。この５ｓＤＮ＾に
ＣＤＲ２をコードしているオリゴマーをアニーリング後
、伸長と連結を行ない、７０１株（ｕｎｇ＋）にトラン
スフェクションした。得られたファージプラークの中か
ら任意に選んだプラークを別のプレートに移し直してＭ
１３感染細胞のコロニーを作らせ、ＣＤＲ２オリゴマー
を１０−ブにコロニーハイブリダイゼーション（前述）
を行なった。

そのＣＤＲ２陽性クローンについてＭ１３ＲＦＤＮＡを
調製してシーフェンス（前述）を行なった結果、ＲＨａ
７２６ｃｌｏｎｅｌｏ、１３９の２つが目的のＣＤＲ１
，２，３を持っていることが分かった。

Ｒ）［ｂの場合、ＣＤＩ’ｌｌのみを持つＲＨｂｌ、　
　ＣＤＲ３のみを持つＲＨｂ９６がアマジャム−ＰＣＲ
法で得られたので、ＣＤＲ２オリゴマーを組み合わせて
Ｋａｍｍａｎｎらが考案した２　５ｔｅｐ　ＰＣＲ法［
Ｎｕｃ、　　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１７．　５４０４
　　（１９８９）］を用いた特定部位突然変異誘発法を
用いることににした。　　２５ｔｅｐ　ＰＣＲ法はＰＣ
Ｂを２回繰り返すことにより目的のＤＮＡ断片の任意の
部分に突然変異を入れる方法である。

第１　ＰＣＢはＲ１（ｂ９６を鋳型にＲ８ＰとＣＤＲ２
オリゴマーをプライマーにして行なった。　　ＰＣＨの
条件は９４℃１分、　３７℃　１分、６８℃　３分、　
で３０サイクル行なった。プライマーはともに２０ｐ層
０１使い、ＰＣＨの試薬はＣ１７０３社のものを使用し
た。第１　ＰＣＢ終了後、アガロース電気泳動により目
的のサイズを切りだした。この第１　ＰＣＲａ物とＵＰ
をプライマーにＲＨｂｌを鋳型にして第１　ＰＣＢと同
じ条件で第２　ＰＣＢを行なった。　　ＰＣＲ終了後、
産物をＢａ５ＨＴ／Ｈｉｎｄｌ１１で消化し、アガロー
ス電気泳動により目的のサイズを切りだし、ｐａｃｔｓ
のＢａ＋＊ＨＩ−旧ｎ＋０１１サイトに組み込み、ＩＩ
Ｈ５α（ＢＲＬ社）に形質転換した。その後、コロニー
ハイブリダイゼーションとシーフェンス（前述）を行な
い、ＣＤＲＩ、　２．３をもつＲＨｂ−ＰＣＲ８２を得
た。

改変抗体のためのコントロールとして、■領域が全てマ
ウスであるキメラ抗体が作られた。０．５βのＶｌ（、
ＶＬ領領域両端にＰＣＲ法を用いて旧ｎｄｌｌｌとＢａ
飄旧（ＶＨ）あるいはＢｇｌ　Ｉ［（ＶＬ）サイトをそ
れぞれ付加し後述の発現ベクターに組み込んだ（以下こ
のキメラ抗体をそれぞれＣ）１．　ＣＬとする）、ＰＣ
Ｂの条件は、９４℃１分、５５℃　１分、７２℃　１分
で２５サイクル行ないった。これらのプライマーはとも
に２０ｐ■ｏ＋使い、ＰＣＨの試薬はＣ１７０３社のも
のを使用した。０．５βのＶ領域の核酸塩基配列とそれ
に対するＰＣＢブライマーは第３図および、第４図に示
す。

改変抗体およびキメラ抗体の発現のためにヒトサイトメ
ガロウィルス（ＨＣＭＶ）のエンハンサ−、プロモータ
ー［Ｎ、　ｌ１ｈｉｔｔｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　１．４９９　
（１９８７）１を持った発現ベクターＨＣＭＶ−に、　
ＨＣＭＶ−ｙ　１がそれぞれ使われた。　　ＨＣＭＶ−
に。

はヒトに鎖定常領域遺伝子を持ちＨＣＭＶ−γ１はヒト
γ１鎖定常領域遺伝子を持つ、キメラ抗体遺伝子発現用
のベクターの構造を第５図および第６図に示す、前述の
（４）で作られた０、５βのＶ領域ＣＨ，ＣＬをそれぞ
れＨＣｌ４Ｖ−７１、ＨＣｉ４Ｖ−にのＨｉｎｄｌｌｌ
−Ｂａｇ旧サイトに組み込んだものである。また、ＲＨ
ａ、ＲＨｂおよびＲＬ　Ｖ領域遺伝子も、ＣＨ，ＣＬの
場合と同様にして、ＨＣＭＶ−γ１．ＨＣＭＶ−ににそ
れぞれ組み込んだ。

上記のように構築したプラスミドの持つ抗体活性をＣ０
８７細胞［ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１１を用いた一時的
発現系で検討した。方法はＣＯ３７細胞にプラスミドＤ
Ｎ＾をＢｊｏ−Ｒａｄ社製のエレクトロポレーション装
置を用いて、Ｂｉｏ−Ｒ１６社のプロトコールにしたが
って導入し、３日間１０％牛脂児血清を含むＤＩ４ＥＭ
培地＜ＧＩＢＣＯ社）で培養し、その培養上清を回収、
抗ヒトＩｇＧあるいはＢＨＩＯペプチド（０，５β抗体
のエピトープ）を用いたＥＬＩＳＡ法（特願昭６３−２
０２５５号）によりその培養上清に存在する抗体の活性
を測定した。

結果を第７図に示す、抗体遺伝子発現に関しては全ての
組合せで蛋白として発現したく第７図ｂ）。

しかし、結合活性については、コントロールであるＣＨ
ｘＣＬの組合せではＢＨＩＯペプチドに結合する抗体が
得られたが、改変抗体であるＲＨａｘＲＬ、　Ｒ１（ｂ
ｘＲＬの組合せでは結合活性は得られなかった（第７図
ａ）。

このことは、Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒの方法にしたがって単純
にＣＤＲを移植するだけでは活性が得られない場合があ
ることを示している。また、マウス０．５βのＶＨと改
変抗体のＶＬの組合せであるＣＨＸＲＬでもキメラ抗体
ＣＨｘＣＬの組合せと同等の結合活性を示した。このこ
とは０．５βのｖＬ領領域関して改変がうまく行ってい
ることを示している。

ＶＬ　　　　　・　　　　　　　　　　　ヒ　　　■Ｈ
Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒの方法通りＣＤＲ領域のみ移植した場
合（Ｖｅｒ、　ＪＬ：　ＲＨａ　）および、これに加え
てＣａｎｏｎｉｃａｌ構造を満足するようにＦＢＩとＦ
Ｒ３領域の一部も合わせて移植した場合（Ｖｅｒ、　ｂ
：　Ｒｕｂ）でも結合活性が得られないことから、ヒト
ＦＲ領域とマウスＦＲ領域の関係を再検討した。過去に
）ＩＥＷを用いて改変化が成功した抗体のホモロジーを
調べてみると、Ｂ１８（５８，６駕＞、　Ｄｌ、３（６
５，５駕）、　ＣＡＭＰＡＴＨ（５２，９χ）となって
おり、０．５βの場合は４９．４％と低かった。０．５
β抗体と最もホモロジーの高いヒトのサブグループを検
索したところ、サブグループ１であることが分かった。

そこで、ヒトサブグループ１のＶＨ遺伝子（ＳＧｌ、第
１図参照）を以下の実験に使用した。ちなみにこのＳＧ
Ｉと０．５βののホモロジーは６４．４πであった。

このＳＧＩと０．５β遺伝子のアミノ酸配列を比較し、
ＣＤ１部分以外に、Ｃａｎｏｎｉｃａｌ構造、ＶＨＶＬ
バッキング［Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａ　　ｅｔ　　ａｌ、、
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　　１８６．６５１（１９８
５）］、を満足するように移植領域を選定した。

その配列を第１図のＲＨｃＯ，５βに示す。

ＲＨｃ　　−ス≧ ＲＨｃの作製は、　　ＳＧＩのＶ領域遺伝子を組み込ん
だ閾１３ＤＮＡを鋳型にして、第１図に示す０，５βＶ
Ｈ領域のＲＨｃに対する移植部位をコードする長鎖ヌク
レオチドをそれぞれ用いて前述のＲＬの場合と同様にア
マジャム−ＰＣＲ法を行なって作製した。その結果、Ｃ
ＤＲ１，２，３が完全に移植されたＲＨｃ７３を得た。

このＲＨｃ７３の旧ｎｄｌＯ−Ｂａｇ旧断片を前述のＨ
ＣＭＶ−７１ベクターの同サイトに組み込みＲＨｃＯ，
５βプラスミドを作製した。

このプラスミドと改変ＶＬの組合せ（ＲＨｃｘＲＬ　）
によって得られる抗体活性を前述のＣＯ５７細胞におけ
る一時的発現系で検討した。（５）の場合と同様にして
遺伝子導入細胞の培養上清を回収、抗ヒトＩｇＧあるい
はＢＨＩＯペプチド（０，５β抗体のエピトープ）を用
いたＥＬＩＳＡ法によりその培養上清に存在する抗体の
活性を測定した。その結果、第８図に示すようにＢＲＩ
Ｇペプチドに対する結合活性が得られた。

しかしコントロールであるＣＨｘＣＬの組合せに比べる
とかなり活性が低いように思われた。

ＳＧＩのＶＨ領領域用いた結果、改変抗体に結合活性が
得られたが、さらに高い活性を与えるためにＦＲ領域内
の特異アミノ酸について検討した。移植先のヒト遺伝子
をＮＥＷがらＳＧＩに変えることによって、０．５βに
対するＦＲ領領域ホモロジーは４９．４％がら６４．４
χに上昇したが、その大部分はＦＢＩ領域に寄与すると
ころが大きく、ＦＲ２，ＦＲ１にはほとんど変化がなか
った。したがって、この部分のアミノ酸を再検討しより
結合活性の強い改変抗体を作製しようと試みた。　　Ｆ
Ｒ１の３°と　ＦＲ３の３′の特異アミノ酸をさらにＲ
Ｈｃに移植した。　　ＦＲ２の３°とＦＲ３の３゛の特
異アミノ酸を持つもの（Ｒｕｅ）と、ＦＲ２の３゛の特
異アミノ酸のみを持つもの（Ｒ）Ｉｆ）をデザインした
０合わせて、同部分のＮＥＩＩをベースとしたＲＨｂへ
の移植も試みた（ＲＦＩｄ）、　　これらのアミノ酸配
列を第１図に示す。

これらの改変ＶＨ領域遺伝子は前述のアマジャムＰＣＲ
法、Ｋｕｎｋｅ　ｌ法、Ｚｓｔｅｐ　ＰＣＲ法を適時組
み合わせて構築した。構築した改変ｖＨ領域遺伝子は前
述のＨＣＭＶ−７１ベクターに組み込まれ、ＲＨｅｏ、
　５β、ＲＨｆＯ１５β、ＲＨｄｏ、　５βがそれぞれ
作られた。これらのプラスミドを前述のＣＯ３７細胞に
おける一時的発現系でその活性を検討した。

その結果、ＲＨｅｘＮ、、ＲＨｆｘＲＬの組合せの順で
強い結合活性が得られた（第８図）、この結果より、Ｆ
Ｒ２およびＦＲ３領域の特異アミノ酸が結合活性には必
要であることが示された。また、ＲＨｄｘＲＬの組合せ
でも結合活性は検出されなかった（第７図〉ことから、
０５β抗体の場合、ホモロジーの高いヒトサブグループ
を選ぶことがまず重要であると思われる。

（８）改変抗体の活性 の」［全１宣」１性 ０．５β抗体を改変化することに成功したが、このＲＨ
ｅｘＲＬの作る改変抗体がオリジナルのマウス０．５β
抗体に比べてどの程度の活性を持つのが、その能力を蒙
争阻害実験により検討した。　　ＢＨＩＯペプチドを固
定したプレートに、インデイケータ−としてのペルオキ
シダーゼ標識マウス０．５β抗体（マレイミド法にした
がって作製）と競合抗体としての各種抗体（ＣＨｘＣＬ
、　ＲＨｅｘＲＬ、　ＲＨｆｘＲＬ、　ＲＨｃｘＲＬ、
ヒトポリクローナル抗体）を混合して加え、３７℃２時
間反応させた後にＴＭＢＺ（３，３°、５．５°テトラ
メチルベンジジン二　同口化学）で発色させた。その結
果を第９０に示す、最終濃度０．０４μｇ／ｍｌのペル
オキシダーゼ標識マウス０，５β抗体に対して競合抗体
の抗体濃度を順次変えていったところ、ＣＨＸＣＬのキ
メラ抗体はマウス０．５β抗体とほぼ同じ軌跡を示した
。また、ＲＨｅｘＲＬおよびＲＨｆｘＲＬの作る抗体も
競合した。抗体濃度から計算してＲＨｅｘＲＬおよびＲ
ＨｆｘＲＬはオリジナルの０．５β抗体に比べてそれぞ
れ約１７２．１／４の活性を持っていることが示された
。　　ＲＨｅｘＲＬの約１／２は過去の改変抗体の成績
に比べると最もいい値といえる。

乱も艮皿１ ＣＥＭ／ＬＡＶの培養上清をウィルス原液（１０”がら
１０”ＴＣＩＤｓｓ）トシテ使用シタ。

先ず、１０ＴＣＩＤｓ＠１５０Δに調製したウィルス液
をアフィゲルプロティンＡ　ＭＡＰＳ−ｎキット（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ社）を用いてアフィニティ精製した改変抗体
、０．５βキメラ抗体、０．５β抗体各５０Δ（Ｎ々の
段階希釈したもの）とを９６穴の平底プレートにはん種
し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、　　
ＭＴ４細胞を１０′個／１００Ｊ　／穴（１０％ＦＣ３
，Ｌ−グルタミン３．５〜４．０ｇ／ｌ、ペニシリン５
０ｕ／■１及びストレプトマイシン５０μ９／麿１を含
むＲＰＭ１１６４０培地に浮遊したもの）で添加し、５
日間培養した。５日後、感染時にしょうじる合胞体形成
（シンシチウムフォーメーション）を抗体が阻害するか
否かで中和活性を判定した。また、中和活性は合胞体形
成を１００％阻害する抗体の最低有効濃度として表示し
た。その結果を下記表１に示す。

表 Ｈｅ × Ｌ ６．２ Ｈｆ Ｌ ５０．０ ＣＨＸ　　ＣＬ ３．１ オリジナルである０、５β抗体及び０，５βキメラ抗体
（ＣＨｘＣＬ）は、３．１刈／艷の濃度でウィルス感染
を１００×阻害するが、改変抗体については、ＲＨｅｘ
ＲＬ４こおいて６．３μ９／−の濃度でウィルス感染を
１００χ阻害していることが判る。この改変抗体ＲＨｅ
ＲＬの競合阻害活性は前述したように、０．５β抗体及
び０．５βキメラ抗体の約１７２の活性を示すが、中和
活性におり）でもオリジナル抗体の１７２活性を示すこ
とがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マウス０５β抗体、ヒト抗体ＮＥＷ、ＳＧ■
および、各種改変０．５β抗体のＨ鎖可変領域のアミノ
酸配列を示す。 第２図は、マウス０．５β抗体、ヒト抗体ＲＥＩおよび
改変０．５β抗体のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列を示す
。 第３図は、マウス０．５β抗体のＶＨ領域遺伝子のＤＫ
＾塩基配列およびキメラ抗体遺伝子作製のためのＰＣＢ
プライマーの配列とその位置を示したものである。 第４図は、マウス０．５β抗体の■に領域遺伝子の１１
ＮＡ塩基配列およびキメラ抗体遺伝子作製のためのＰＣ
Ｂプライマーの配列とその位置を示したものである。 第５図および第６図は、それぞれ０．５βキメラ抗体Ｈ
鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子を含む発現型プラスミドの一
例をを示したものである。 第７図および第８図は、それぞれ０．５βキメラ抗体お
よび各種改変抗体のＥＬＩＳ＾アッセイの結果の一例を
示したものである。 第９図は、０．５βキメラ抗体および各種改変抗体の競
合阻害実験結果の一例を示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）抗ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）活性を有する
   ヒト×マウス改変抗体Ｈ鎖であって、可変領域の相補性
   決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列とそれに隣接するフ
   レームワーク領域（ＦＲ）のＮ末端および／またはＣ末
   端の一部のアミノ酸とがマウスモノクローナル抗体由来
   の配列であり、これ以外のフレームワーク領域がヒト抗
   体由来のアミノ酸配列であることを特徴とする組換え抗
   ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖。 （２）該マウス抗体由来のアミノ酸配列の領域が、少な
   くともＣＤＲのアミノ酸配列、ＣＤＲ１に隣接するＦＲ
   ２のＮ末側５個のアミノ酸配列およびＣＤＲ２に隣接す
   るＦＲ３のＮ末側６個のアミノ酸配列である前記第（１
   ）項記載の組換え抗ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖。 （３）可変領域のマウス抗体由来のＣＤＲとその両端の
   アミノ酸配列が、下記のアミノ酸配列である前記第（２
   ）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖。 【遺伝子配列があります】 （ｘｘｘ．．ｘはヒト抗体由来のアミノ酸配列、￥下線
   ￥の部分はＣＤＲのアミノ酸配列） （４）該ヒト抗体由来のアミノ酸配列が、ヒト抗体サブ
   グループ I に属する抗体のアミノ酸配列である前記第
   （１）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖。 （５）可変領域が、下記のアミノ酸配列からなる前記第
   （１）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖。 【遺伝子配列があります】 （￥下線￥部分はマウス抗体由来のアミノ酸配列）（６
   ）抗ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）活性を有するヒト
   ×マウス改変抗体Ｌ鎖であって、相補性決定領域（ＣＤ
   Ｒ）のアミノ酸配列がマウスモノクローナル抗体由来の
   下記のアミノ酸配列であり、フレームワーク領域がヒト
   抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とする組換え
   抗ＨＩＶ改変抗体Ｌ鎖。 ＣＤＲ１：ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＭＮＣＤＲ２：
   ＡＡＳＮＬＥＳ ＣＤＲ３：ＱＱＳＮＥＤＰＦＴ （７）可変領域が、下記のアミノ酸配列からなる前記第
   （６）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｌ鎖。 （８）前記第（１）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｈ鎖と、
   前記第（６）項記載の抗ＨＩＶ改変抗体Ｌ鎖とからなる
   抗ＨＩＶ改変抗体。 （９）相補性決定領域およびこれに隣接するフレーム領
   域の一部が特異的マウス抗体由来のアミノ酸配列、残り
   のフレーム領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列になるよ
   う遺伝子組換えが行われた遺伝子であり、さらに該ヒト
   抗体が相補性決定領域を提供するマウス抗体可変領域と
   アミノ酸配列において高いホモロジーがあるサブグルー
   プのヒト抗体から選択されることを特徴とする改変抗体
   Ｈ鎖をコードする組換え遺伝子を調製し、これを適当な
   発現ベクターを用いて動物細胞中で発現・回収すること
   からなる改変抗体Ｈ鎖の調製方法。 （１０）該特異的マウス抗体由来のアミノ酸配列の領域
   が、少なくともＣＤＲのアミノ酸配列、ＣＤＲ１に隣接
   するＦＲ２のＮ末側５個のアミノ酸配列およびＣＤＲ２
   に隣接するＦＲ３のＮ末側６個のアミノ酸配列である前
   記第（９）項記載の調製方法。 （１１）相補性決定領域およびこれに隣接するフレーム
   領域の一部が特異的マウス抗体由来のアミノ酸配列、残
   りのフレーム領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列になる
   よう遺伝子組換えが行われた遺伝子であり、さらに該ヒ
   ト抗体が相補性決定領域を提供するマウス抗体可変領域
   とアミノ酸配列において高いホモロジーがあるサブグル
   ープのヒト抗体から選択されることを特徴とする改変抗
   体Ｈ鎖をコードする組換え遺伝子と、少なくとも相補性
   決定領域が特異的マウス抗体由来のアミノ酸配列であり
   残りのフレーム領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列とな
   るように遺伝子組換えが行われた改変抗体Ｌ鎖をコード
   する組換え遺伝子とを適当な発現ベクターを用いて動物
   細胞中で発現させこれを回収することからなる改変抗体
   の調製方法。 （１２）該Ｈ鎖の特異的マウス抗体由来のアミノ酸配列
   の領域が、少なくともＣＤＲのアミノ酸配列、ＣＤＲ１
   に隣接するＦＲ２のＮ末側５個のアミノ酸配列およびＣ
   ＤＲ２に隣接するＦＲ３のＮ末側６個のアミノ酸配列で
   ある前記第（１１）項記載の調製方法。 （１３）該特異的マウス抗体が、抗ヒト免疫不全ウィル
   ス（ＨＩＶ）活性を有する抗体である前記第（９）項ま
   たは（１１）項に記載の調製方法。 （１４）該改変抗体Ｈ鎖可変領域のマウス抗体由来のア
   ミノ酸配列が、下記のアミノ酸配列である前記第（１３
   ）項記載の調製方法。 【遺伝子配列があります】 （ｘｘｘ．．ｘはヒト抗体由来のアミノ酸配列、￥下線
   ￥の部分はＣＤＲのアミノ酸配列） （１５）該ヒト抗体由来のアミノ酸配列が、ヒト抗体サ
   ブグループ I に属する抗体のアミノ酸配列である前記
   第（１３）項記載の調製方法。 （１６）該改変抗体Ｈ鎖改変領域が下記のアミノ酸配列
   からなる前記第（１３）項記載の調製方法。 【遺伝子配列があります】 （￥下線￥部分はマウス抗体由来のアミノ酸配列）