JP2021532058A - 抗ｔｉｇｉｔ抗体及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＴＩＧＩＴと特異的に結合する新規な抗体、抗体断片、及び前記抗体又は抗体断片を含有する組成物に関する。また、本発明は、前記抗体又はその抗体断片をコードする核酸、前記核酸を含む宿主細胞、及び関連の使用に関する。また、本発明は、これらの抗体及び抗体断片の治療・診断のための用途に関する。

Description

本発明は、ＴＩＧＩＴと特異的に結合する新規な抗体、抗体断片、及び前記抗体又は抗体断片を含有する組成物に関する。また、本発明は、前記抗体又はその抗体断片をコードする核酸、前記核酸を含む宿主細胞、及び関連の使用に関する。また、本発明は、これらの抗体及び抗体断片の治療・診断のための使用に関する。

ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体、ＷＵＣＡＭ、Ｖｓｔｍ３又はＶｓｉｇ９とも呼ばれる）は、最初、バイオインフォマティクス照合を利用する方法で、ＣＤ２８ファミリーメンバーの１つとして見出された。ＴＩＧＩＴは、様々な免疫細胞（ナチュラルキラー細胞／活性化Ｔ細胞／記憶Ｔ細胞／制御性Ｔ細胞／濾胞性ヘルパーＴ細胞など）の膜表面に発現する共抑制性受容体であって、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの１つである。ＴＩＧＩＴ分子は、１）ＴＩＧＩＴが樹状細胞又はがん細胞の表面に発現している共有リガンドＣＤ１５５／ＣＤ１１２に共刺激受容体ＣＤ２２６と競合的に結合し、ＴＩＧＩＴを発現している細胞に抑制シグナルを伝達し、そのような細胞の活性化を抑制する、２）ＴＩＧＩＴが共刺激受容体ＣＤ２２６と直接相互作用し、ＣＤ２２６のホモ二量体化を破壊し、下流への活性化シグナルを遮断する、３）ＴＩＧＩＴが樹状細胞に発現しているＣＤ１５５と結合した後、細胞内ＩＴＩＭ配列が抑制シグナルを伝達し、免疫抑制サイトカインを発現して免疫系の活性化を抑制する、という３つのメカニズムによって免疫系に対する調節作用を発揮する可能性があると考えられている。ＴＩＧＩＴは、腫瘍微小環境における様々な細胞において役割を果たし得る。これらの細胞は、腫瘍浸潤ＣＤ８陽性Ｔ細胞である可能性があり、制御性Ｔ細胞である可能性があり、ＮＫ細胞である可能性もある。一般に、多くの研究は、第１のメカニズムが、ＴＩＧＩＴがその免疫抑制作用を発揮する最も重要なメカニズムである可能性があることを示唆している。

ヒトＴＩＧＩＴと結合する抗体ががんの治療に有用であることが証明されている。例えばＷＯ２００６／１２４６６７を参照する。マウスモデルでは、ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＧＩＴの両方の抗体遮断は、相乗的にＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性の腫瘍拒絶の増加をもたらし得る。Grogan et al. (2014) J. Immunol. 192(1) Suppl. 203.15; Johnston et al. (2014) Cancer Cell 26:1-15。同様の結果は、黒色腫の動物モデルにおいて得られた。Inozume et al. (2014) J. Invest. Dermatol. 134:S121 - Abstract 693。

免疫応答におけるＴＩＧＩＴの役割を考慮すると、ＴＩＧＩＴはがん免疫療法の魅力的な標的と考えられている。従って、本分野では、新規なＴＩＧＩＴ抗体、特にＴＩＧＩＴを標的とするＣＤ１５５／ＣＤ１１２遮断型抗体、特にヒト抗ＴＩＧＩＴ抗体の開発、並びに疾患治療、特にがん治療のためのそれらの組み合わせ療法が必要とされている。

本発明は、抗ＴＩＧＩＴ抗体及びそのコード遺伝子並びに応用を提供する。遺伝子工学手段と酵母表面ディスプレイ技術によって、本発明者は、酵母表面にディスプレイされたヒト抗体ライブラリーから抗ヒトＴＩＧＩＴの完全ヒト化抗体を選択し、それに基づいて親和力が成熟した高親和力抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体をさらに得る。本発明の完全ヒト化抗体分子は、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５との結合を効果的に遮断し、細胞に伝達される抑制性シグナルを減少又は排除し、ＩＬ−２産生を増加させ、インビボ投与時に腫瘍成長を抑制することができ、特に抗ＰＤ−１抗体との併用において腫瘍抑制効果が顕著である。従って、本発明の抗体は、免疫応答の増強、腫瘍成長の抑制、抗感染、及びＴＩＧＩＴタンパク質の検出を含むがこれらに限定されない、様々な用途に使用することができる。

従って、本発明は、ヒトＴＩＧＩＴと結合する新規な完全ヒト化抗体、及びその抗原結合断片を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体は、以下の１つ以上の特性を有する：
（ｉ）高親和力でヒトＴＩＧＩＴと結合する特性、
（ｉｉ）サル及び／又はマウスＴＩＧＩＴとの交差免疫反応をする特性、
（ｉｉｉ）細胞表面のＴＩＧＩＴと効果的に結合する特性、
（ｉｖ）ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５との結合を遮断する特性、
（ｖ）ＴＩＧＩＴ下流ＩＬ−２シグナル経路におけるＣＤ１５５とＴＩＧＩＴとの結合の抑制作用を解除する特性、
（ｖｉ）Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生を増加させる特性、
（ｖｉｉ）抗腫瘍活性、例えば腫瘍の成長を抑制する特性、
（ｖｉｉｉ）抗ＰＤ−１抗体との組み合わせによる、より良好な腫瘍抑制作用、例えば、腫瘍成長をより良好に抑制できる特性。

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号８４−１０３で表される重鎖可変領域の１つのＨＣＤＲ１、２、及び３配列、及び／又は配列番号１０４−１１０で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２、及び３配列、又は前記ＣＤＲ配列の組み合わせの変異体を含む、ＴＩＧＩＴと結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明はまた、本発明の例示的な抗体（例えば、表Ｂに示される抗体ＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを有する抗体）と同じ又は重複するエピトープと結合する、及び／又はＴＩＧＩＴと競合的に結合する、及び／又は本発明の例示的な抗体を抑制する（例えば、競合的に抑制する）抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体を含む免疫複合体、医薬組成物及び組み合わせた製品を提供する。

本発明はまた、本発明の抗体を用いて、対象におけるＣＤ１５５へのＴＩＧＩＴの結合（例えば、樹状細胞又はがん細胞の表面に発現されるＣＤ１５５）を遮断する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記方法によって、ＴＩＧＩＴを発現する細胞（特に、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞）において、ＴＩＧＩＴ媒介性の抑制シグナル伝達が低減又は排除され、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化が刺激される。いくつかの実施形態において、前記方法によって、Ｔ細胞におけるＩＬ−２の産生が増加される。いくつかの実施形態において、前記方法によって、ＣＤ１５５を発現する細胞（例えば、樹状細胞）において、ＣＤ１５５媒介性の抑制シグナル伝達が減少し、免疫抑制サイトカインの発現が減少する。いくつかの実施形態において、前記方法によって、免疫系の活性化が促進される。従って、本発明はまた、本発明の抗体を用いてがん又は感染を予防又は治療する方法を提供する。

本発明はまた、サンプル中のＴＩＧＩＴを検出する方法に関する。

以下、本発明を、図面及び実施形態を参照してさらに説明する。しかし、これらの図面及び実施形態は、本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではなく、当業者が容易に想到し得る変更は、本発明の精神及び添付の特許請求の範囲に含まれる。

図１Ａ−Ｆは、親和力成熟の前後で、酵母によって発現された抗体の、ＣＨＯ細胞の表面に発現されたヒトＴＩＧＩＴに対する結合を示す。 図２は、ＣＨＯ細胞の表面に発現されたヒトＴＩＧＩＴに対する、ＣＨＯ細胞によって発現された７つの候補抗体の結合を示す。 図３Ａ−Ｆは、親和力成熟の前後で、酵母によって発現された抗体の、ＣＤ１５５に対する遮断能力を示す。 図４は、ＣＨＯ細胞によって発現された７つの候補抗体の、ＣＤ１５５に対する遮断能力を示す。 図５Ａ−Ｅは、親和力成熟の前後で、酵母によって発現された抗体のＭＯＡ生物学的活性検出を示す。 図６は、ＣＨＯ細胞によって発現された７つの候補抗体のＭＯＡ生物学的活性検出を示す。 図７は、ヒトＴＩＧＩＴノックイン−ＭＣ３８マウスモデルにおける候補分子ＡＤＩ−３０２９３及びＡＤＩ−３０２７８の単独投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の薬力学的研究を示す。 図８Ａ−Ｂは、ヒトＴＩＧＩＴノックイン−ＭＣ３８マウスモデルにおける候補分子ＡＤＩ−３０２９３及びＡＤＩ−３０２７８と抗ＰＤ１抗体ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ（ＷＯ２０１７１３３５４０Ａ１）との併用投与（１０＋１ｍｇ／ｋｇ）の薬力学的研究を示す。 図９は、本発明の実施例において使用される例示的なヒトＴＩＧＩＴ配列を示す。

定義
別に定義しない限り、本明細書に用いられる全ての技術と科学用語はいずれも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。

用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲内の数値を含むことを意味する。

用語「及び／又は」は選択可能オプションのうちのいずれか一項又は選択可能オプションのいずれか２項又は複数項の組み合わせを指すと理解すべきである。

本明細書に用いられるように、用語「包含する」又は「含む」とは、前記要素、整数又はステップを含むが、任意の他の要素、整数又はステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「包含する」又は「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数又はステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことを言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことを指す。

本明細書において、用語「抗体」は、少なくとも軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドを指し、前記免疫グロブリン可変領域は、抗原を特異的に識別して結合する。当該用語は、様々な抗体構造を含むが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体又は複数重鎖抗体、単特異性又は多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全ヒト化抗体又はキメラ抗体又はヒト化抗体、全長抗体と抗体断片を含むが、これらに限定されず、所望の抗原結合活性を表現すればよい。

当業者は、「全抗体」（本明細書では、「全長抗体」、「完全抗体」、「完全な抗体」と切り替えて使用することができる）が少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を包含することが明らかにする。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。可変領域は、抗体の重鎖又は軽鎖における抗体とその抗原の結合に参与するドメインである。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示している。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２種類のタイプ（ｋａｐｐａ（κ）とｌａｍｂｄａ（λ）と称される）における１種類に入れることができる。抗体の重鎖は、その重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧとＩｇＭという５種類の異なるタイプに分けることができ、これらのタイプにおける数種類はさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラスに分けることができる。この５種類の異なる抗体タイプに対応する重鎖定常領域はそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと称される。用語「アイソタイプ」は、抗体の重鎖定常領域によって決定される抗体のタイプを指す。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐａｕｌ，Ｗ．，２ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（全ての目的で全体を参考としてここに引用される）。

用語抗体の「抗原結合部分」（本明細書では、「抗体断片」、「抗原結合断片」と切り替えて使用することができる）は、完全な抗体でない分子を指し、完全な抗体における当該完全な抗体に結合される抗原を結合するための部分を包含する。当業者には理解されるように、抗体の抗原結合部分は、通常、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基を包含する。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、又は酵素もしくは化学的手段により完全な抗体を切断することによって調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、二重鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三重鎖抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重鎖抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むが、これらに限定されない。抗体断片のより詳細な説明については、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）、（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ）邵栄光 ｅｔ ａｌ．，抗体薬物研究と応用，人民衛生出版社（２０１３）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。

用語「ヒト抗体」又は「完全ヒト化抗体」は本明細書において切り替えて使用することができ、そのうちのフレームワーク領域とＣＤＲ領域の２つがいずれもヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を含む抗体を指す。そして、抗体に定常領域が含まれば、定常領域も、ヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸配列（例えば、インビトロでランダムに又はスポットにおける特異的な変異誘発又はインビボの体細胞の突然変異による突然変異）を含むことができ、例えば、ＣＤＲ−特にＣＤＲ３にある。しかし、本明細書に用いられるように、用語「ヒト抗体」は、そのうちのＣＤＲ配列がその他の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系に由来してヒトフレームワーク配列に移植される抗体を含むことを意図しない。

本明細書に用いられるように、用語「組換えヒト抗体」は、組換え方式によって製造、発現、発生又は単離される全てのヒト抗体を含み、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子で遺伝子導入又は染色体導入する動物（例えば、マウス）又はそれによって製造されたハイブリドーマから単離された抗体と、（ｂ）ヒト抗体を発現する宿主細胞に自己転換し、例えば、遺伝子導入腫から単離された抗体と、（ｃ）酵母ディスプレイライブラリーのような組換えヒト抗体ライブラリー、組み合わせのヒト抗体ライブラリーから単離された抗体と、（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子をその他ＤＮＡ配列に接続することを含む任意のその他の方式によって製造、発現、発生又は単離された抗体とを含む。これらの組換えヒト抗体は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域のヒト生殖系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、一部の実施形態において、組換えヒト抗体をインビトロで変異誘発することができ（又は、ヒトＩｇ配列を用いて動物に遺伝子導入する時、体内における体細胞の変異誘発である）、それによって得られる組換え抗体のＶＨとＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系のＶＨとＶＬ配列に由来してそれに関連するにも関わらず、体内のヒト抗体生殖系のライブラリーに天然に存在しない。

用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの生物種に由来して、定常領域配列が別の生物種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウスの抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。

用語「ヒト化抗体」は、他の哺乳動物種、例えばマウスの生殖系に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に接続する抗体を指す。ヒトフレームワーク配列に余分なフレームワーク領域修飾を行うことができる。

「単離した」抗体は、既にその天然環境における成分と単離した抗体である。いくつかの実施形態において、抗体を９５％又は９９％より高い純度までに精製して、前記純度は、例えば電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって定められる。抗体の純度を評価する方法の概述について、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９−８７を参照する。

用語「エピトープ」は、抗体の結合する抗原領域である。エピトープは、連続的なアミノ酸から形成され又はタンパク質の３級フォールディングによって並列した非連続的なアミノ酸から形成される。

本明細書において、ＴＩＧＩＴは、「Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体」を指す。この表現には、ＴＩＧＩＴの変異体、アイソタイプ、ホモログ、及び種ホモログも含まれる。用語「ヒトＴＩＧＩＴ」は、ヒト配列ＴＩＧＩＴを指す。１つの特定のヒトＴＩＧＩＴ配列を配列番号２０８に示す。いくつかの実施形態において、ヒトＴＩＧＩＴ配列は、配列番号２０８のヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列と少なくとも９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＴＩＧＩＴタンパク質は、細胞外ドメインの断片のようなＴＩＧＩＴの断片を含むこともでき、例えば、本発明の如何なる抗体と結合する能力を保持する断片である。本明細書において、ＰＶＲ（ポリオウイルス受容体）、ＰＶＳ、ＨＶＥＤ、ＣＤ１５５、ＮＥＣＬ５、ＴＡＧＥ４、Ｎｅｃｌ−５とも称されるＣＤ１５５は、ＴＩＧＩＴと相互作用して免疫抑制シグナルを誘導する。

用語「特異的に結合する」は、抗体が抗原と選択的に又は優先して結合することを表示する。光干渉による生体測定において、抗体が約５×１０^−７Ｍ又はさらに低く、約１×１０^−７Ｍ又はさらに低く、約５×１０^−８Ｍ又はさらに低く、約１×１０^−８Ｍ又はさらに低く、約５×１０^−９Ｍ又はさらに低いＫ_Ｄで、ヒトＴＩＧＩＴと結合すれば、当該抗体は「ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合する」抗体である。しかし、ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合する抗体は、他の種由来のＴＩＧＩＴタンパク質と交差反応性を有し得る。例えば、ヒトＴＩＧＩＴに特異的な抗体は、いくつかの実施形態において、非ヒト種のＴＩＧＩＴタンパク質と交差反応し得る。他の一部の実施形態において、ヒトＴＩＧＩＴに特異的な抗体は、種又は他のタイプの交差反応性を示さずにヒトＴＩＧＩＴに完全に特異的であってもよく、又は特定の種のＴＩＧＩＴに対してのみ交差反応性を示してもよい。

本明細書に用いられるように、用語「交差反応」は、異なる種由来のＴＩＧＩＴに抗体が結合する能力を指す。例えば、本明細書に記載のヒトＴＩＧＩＴと結合する抗体は、他の種由来のＴＩＧＩＴ（例えば、サル及び／又はマウスＴＩＧＩＴ）と結合してもよい。交差反応性を測定する方法は、実施例に記載された方法と、例えば光干渉による生体測定法又はフローサイトメトリー技術の使用による、本分野の既知の標準的な測定手法とを含む。

「親和力」又は「結合親和力」は、結合対のメンバー同士間の相互作用を反映する固有結合の親和力を指す。分子Ｘのその配偶子Ｙに対する親和力は、通常、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって示され、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋ_ｄｉｓとｋ_ｏｎである）との比値である。親和力は、本分野で公知の通常の方法により測定できる。親和力を測定するための具体的な方法の１つは、本出願に記載のＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学的結合測定法である。

用語「高親和力」は、ＩｇＧ抗体に対して、当該抗体が１×１０^−７Ｍ又はさらに低く、好ましくは５×１０^−８Ｍ又はさらに低く、より好ましくは約１×１０^−８Ｍ又はさらに低く、ひいてはより好ましくは約５×１０^−９Ｍ又はさらに低いＫ_Ｄで、標的抗原と結合することを指す。しかし、「高親和力」結合は、抗体アイソタイプに依存して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対して、「高親和力」は、抗体が１×１０^−６Ｍ又はさらに低く、好ましくは１×１０^−７Ｍ又はさらに低く、より好ましくは約１×１０^−８Ｍ又はさらに低いＫ_Ｄを有することを指す。

ＴＩＧＩＴなどの抗原と結合する参照抗体「競合的に結合する抗体」とは、競合検定において、参照抗体が抗原（例えばＴＩＧＩＴ）と結合する５０％以上を遮断する抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合検定において、当該抗体が抗原（例えばＴＩＧＩＴ）と結合する５０％以上を遮断する。例示的な競合検定は「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に説明される。競合的に結合する抗体は、参照抗体と同じエピトープ領域、例えば、同じエピトープ、隣接するエピトープ又は重なるエピトープと結合することができる。

参照抗体とその抗原の結合を抑制（例えば、競合的抑制）する抗体とは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を抑制する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を抑制する。抗体とその抗原の結合は親和力（例えば、平衡解離定数）として計測できる。親和力の測定方法は、本分野で既知の内容である。

参照抗体と同じ又は類似の結合親和力及び／又は特異性を示す抗体とは、参照抗体の少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の結合親和力及び／又は特異性を有する抗体を指す。これに関しては、本分野の既知の任意の結合親和力及び／又は特異性の測定方法で測定できる。

本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、少なくとも一部の定常領域を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を定義するのに用いられる。当該用語は、天然配列Ｆｃ−領域と変異体Ｆｃ−領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ−領域は重鎖のＣｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端に延伸する。しかし、Ｆｃ−領域のＣ−末端のリシン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。本明細書では特記しない限り、Ｆｃ−領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵ索引とも呼ばれる。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２に記載される。

抗体に関連する用語「変異体」は、本明細書において、参照抗体と比べ、既に少なくとも１個、例えば、１〜３０、１〜２０又は１〜１０個、例えば、１又は２又は３又は４又は５個のアミノ酸の置換、欠如及び／又は挿入によってアミノ酸の変化が生じた目標抗体領域を含む抗体を指し、ここで、変異体は基本的に変化前の抗体分子の少なくとも１つの生物学的特性（例えば、抗原結合能力）を保持する。目標抗体領域は、抗体全長、又は重鎖可変領域又は軽鎖可変領域又はそれらの組み合わせ、又は（１つ又は複数の）重鎖ＣＤＲ領域又は（１つ又は複数の）軽鎖ＣＤＲ領域又はそれらの組み合わせであり得る。本明細書において、参照抗体領域に対してアミノ酸の変化が生じた抗体領域は、当該抗体領域の「変異体」とも呼ばれる。

本明細書において、「配列同一性」は、比較ウィンドウでヌクレオチド又はアミノ酸を１つずつ比較してその配列が同じであることの割合を指す。以下の方式によって「配列同一性パーセント」を計算することができ、２本の最適に照合する配列を比較ウィンドウで比較して、マーチング位置の数を得るように２本の配列における同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔ）の存在する位置の数を確定して、マーチング位置の数を比較ウィンドウにおける総位置数（即ち、ウィンドウの大きさ）で割り、その結果を１００に乗じて、配列同一性パーセントを生成する。配列同一性パーセントを確定するための最適な照合は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公開されているパソコンソフトウェアを使用するように本分野に既知の様々な方式に従って実現することができる。当業者は、比較している全長配列範囲内又は目標配列領域内の最大の照合に必要とする如何なるアルゴリズムを含む配列を照合するための適切なパラメータを確定することができる。

本発明において、抗体配列にとって、アミノ酸配列同一性パーセントは、候補抗体配列を参照抗体配列と最適に照合した後、好ましい案にＫａｂａｔ番号付け規則に従って最適な照合を行ってから定められる。本明細書において、比較ウィンドウ（即ち、比較対象の目標抗体領域）を指定しない場合、参照抗体配列の全長で照合することに適用される。いくつかの実施形態において、抗体にとって、配列同一性は重鎖可変領域全体及び／又は軽鎖可変領域全体に分布することができ、又は配列パーセント同一性はフレームワーク領域のみに限定され、ＣＤＲ領域に対応している配列は１００％同じであるように保持する。

同様に、抗体配列にとって、参照抗体に対して目標抗体領域でアミノ酸の変化が生じた候補抗体を照合に基づいて確定することができる。

本発明において、「保存的置換」は、あるアミノ酸を化学的に類似なアミノ酸に置換することを引き起こすアミノ酸変化を指す。部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような本分野に既知の標準的な方法によって、アミノ酸修飾、例えば、置換を本発明の抗体に導入することができる。

機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、本分野で公知の内容として提供される。好ましい一態様において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ａに由来し、好ましくは表Ａに示される好ましい保存的置換残基である。

本発明の種々の態様は、以下の各セクションにおいてさらに詳細に説明される。

Ｉ．本発明における抗ＴＩＧＩＴ抗体
本発明の一態様は、ＴＩＧＩＴ、好ましくはヒトＴＩＧＩＴタンパク質（例えば、配列番号２０８のヒトＴＩＧＩＴ配列）と特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、特に完全ヒト化抗体又はその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体、（Ｆａｂ’）_２断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体（ｄＡｂ）又は線形抗体から選択される抗体断片である。

抗体の有利な生物学的特性
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、高親和力でヒトＴＩＧＩＴと結合し、例えば、解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）が１００×１０^−９Ｍ未満、約５０×１０^−９Ｍ以下、より好ましくは約１−３０×１０^−９Ｍ、より好ましくは約１×１０^−９Ｍ以下、より好ましくは約１−１０×１０^−１０Ｍである。好ましくは、Ｋ_Ｄが光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定手法）の測定手法により測定される。いくつかの実施形態において、Ｋ_Ｄ値は、抗体Ｆａｂ形態（例えば、酵母によって発現されたＦａｂ）とヒトＴＩＧＩＴとの一価親和力を測定することによって決定され、好ましくは、単価Ｋ_Ｄ値は、１−１００×１０^−１０Ｍであり、より好ましくは１−５０×１０^−１０Ｍであり、より好ましくは１−１０×１０^−１０Ｍ又は２−５×１０^−１０Ｍである。他の一部の実施形態において、Ｋ_Ｄ値は、完全な抗体（例えば、ＣＨＯ細胞によって発現された完全な抗体）とヒトＴＩＧＩＴとの一価親和力を測定することによって決定され、好ましくは、単価Ｋ_Ｄ値は、１−５０×１０^−１０Ｍであり、より好ましくは１−３０×１０^−１０Ｍ又は１−１０×１０^−１０Ｍである。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、サルＴＩＧＩＴと交差反応する。いくつかの実施形態において、抗体は、高親和力でサルＴＩＧＩＴと結合し、ここで、Ｋ_Ｄ値（例えば、完全な抗体とサルＴＩＧＩＴとの一価親和力を測定することによって決定される）は、約０．１−１００×１０^−９Ｍであり、より好ましくは０．１−５０×１０^−９Ｍ又は１−３０×１０^−１０Ｍである。いくつかの実施形態において、抗体は、マウスＴＩＧＩＴと交差反応し、ここで、Ｋ_Ｄ値（例えば、完全な抗体とマウスＴＩＧＩＴとの一価親和力を測定することによって決定される）は、約１−１００×１０^−９Ｍであり、例えば、１−１０×１０^−７Ｍ又は１−１０×１０^−８Ｍ、又は１−１０×１０^−９Ｍである。他の一部の実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体はマウスＴＩＧＩＴと交差反応しない。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、細胞の表面に発現されるＴＩＧＩＴに高親和力で結合する。一実施形態において、ヒトＴＩＧＩＴを表面に発現する細胞はＣＨＯ細胞である。好ましくは、抗体がヒトＴＩＧＩＴを発現する細胞と結合するＥＣ５０値は、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）で測定される。いくつかの実施形態において、抗体は、酵母によって発現された完全な抗体であり、ＥＣ５０値は、約１０ｎＭ未満、例えば０．１−１ｎＭ、好ましくは、約１ｎＭ以下、より好ましくは約０．２−０．９ｎＭ、例えば０．９ｎＭ、０．６Ｍ又は０．４ｎＭである。他の一部の実施形態において、抗体は、ＣＨＯ細胞によって発現された完全な抗体形態であり、ＥＣ５０値は、約１０ｎＭ未満、例えば０．１−１ｎＭ、好ましくは、約０．１−０．３ｎＭ、例えば約０．３ｎＭ、０．２Ｍ又は０．１ｎＭである。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴの関連活性を抑制する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５との結合を遮断する。好ましくは、ヒトＴＩＧＩＴ（細胞で発現されたＴＩＧＩＴ）とヒトＣＤ１５５との結合を遮断する抗体の能力（例えば、ＩＣ５０値）は、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）で測定される。いくつかの実施形態において、抗体は、酵母によって発現された完全な抗体であり、ＩＣ５０値は、約１０ｎＭ未満、例えば０．１−２ｎＭ、好ましくは、約０．１−１．０ｎＭ、例えば０．８ｎＭ、０．６Ｍ、０．４ｎＭ又は０．２ｎＭである。他の一部の実施形態において、抗体は、ＣＨＯ細胞によって発現された完全な抗体形態であり、ＥＣ５０値は、約１ｎＭ未満、例えば０．１−０．５ｎＭ、好ましくは、約０．３ｎＭ、０．２Ｍ又は０．１ｎＭである。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合による抑制性シグナル伝達を減少又は排除する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は断片は、ＴＩＧＩＴを発現する細胞（特にＴ細胞）において、ＴＩＧＩＴ媒介性の抑制性シグナル伝達を減少又は排除する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、Ｔ細胞におけるＩＬ２プロモーター下流遺伝子の発現を誘導し、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＩＬ−２産生を増加させる。いくつかの実施形態において、蛍光レポーター遺伝子アッセイ（例えば、実施例５のＭＯＡアッセイ）により、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合による抑制性シグナル伝達を減少又は排除する抗体の能力（例えば、ＥＣ５０値）が検出される。いくつかの実施形態において、抗体は、酵母によって発現された完全な抗体であり、ＥＣ５０値は、好ましくは約１０ｎＭ未満、例えば０．１−５ｎＭ、好ましくは、約０．１−３．０ｎＭ、例えば約２．ｎＭ、１．５ｎＭ、１．０ｎＭ、又は０．５ｎＭである。他の一部の実施形態において、抗体は、ＣＨＯ細胞によって発現された完全な抗体であり、ＥＣ５０値は、好ましくは５ｎＭ未満、例えば約０．１−３．０ｎＭ、例えば約１．６ｎＭ、１．２ｎＭ、１．０ｎＭ、又は約０．１８−０．５ｎＭである。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＴＩＧＩＴを発現する浸潤リンパ球を含む腫瘍の成長を抑制する。一実施形態において、腫瘍細胞は、胃腸腫瘍、好ましくは結腸直腸がんである。例えば、インビボ腫瘍移植モデル、例えばＭＣ３８マウスにおいて、結腸がん細胞の増殖が抑制される。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて使用すると、抗体単独で投与した場合よりも有意に良好な抗腫瘍効果が得られる。

好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、上記の特性の少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、４つ、又は５つ、さらにより好ましくは上記の全ての特性を示す。

抗体のＣＤＲ領域
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」（本明細書において超可変領域「ＨVＲ」と切り替えて使用する）は、抗体可変領域において主に抗原エピトープと結合することを担当するアミノ酸領域である。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ−末端から順に番号付ける。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。

下記表Ｂに本発明のいくつかの例示的な抗体のＶＨ及びＶＬ配列の組み合わせを示す。

既定のＶＨ又はＶＬアミノ酸配列にそのＣＤＲ配列を定めるための複数の方案が本分野において周知される。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列変異性に基づいて定められるものであるとともに、最もよく用いられるものである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは構造リングの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造リングとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触性」（Ｃｏｎｔａｃｔ）ＨＶＲが、取得可能な複雑な結晶構造の分析に基づいたものである。異なるＣＤＲ確定案によって、これらのＨＶＲにおける各ＨＶＲ／ＣＤＲの残基は以下のとおりである。

ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列である。

ＶＬにおける位置２４−３６又は２４−３４（ＬＣＤＲ１）、位置４６−５６又は５０−５６（ＬＣＤＲ２）と位置８９−９７又は８９−９６位置（ＬＣＤＲ３）と、ＶＨにおける位置２６−３５又は２７−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０−６５又は４９−６５（ＨＣＤＲ２）と、位置９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（ＨＣＤＲ３）である。

一実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列である。

ＶＬにおける位置２４−３４（ＬＣＤＲ１）、位置５０−５６（ＬＣＤＲ２）と、位置８９−９７（ＬＣＤＲ３）及びＶＨにおける位置２７−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０−６５（ＨＣＤＲ２）と、位置９３−１０２（ＨＣＤＲ３）である。

一実施形態において、本発明の抗体のＨＶＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに基づいて以下のようなＫａｂａｔ残基位置に位置付けるＨＶＲ配列である。

ＶＬにおける位置２４−３４（ＬＣＤＲ１）、位置５０−５６（ＬＣＤＲ２）と、位置８９−９７（ＬＣＤＲ３）及びＶＨにおける位置２６−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１）、位置５０−６５（ＨＣＤＲ２）と、位置９５−１０２（ＨＣＤＲ３）である。

ＨＶＲは、参照ＣＤＲ配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて定めることができる。

特記しない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲ配列」又は「ＨＶＲ」又は「ＨＶＲ配列」は上記のいずれか１つの方式で定められるＨＶＲ又はＣＤＲ配列を含む。

特記しない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）を言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づいた番号付け位置を指す。

好ましい一実施形態において、本発明のＣＤＲ配列は表２に示されるようであり、ここで、ＨＣＤＲ１はＡｂＭ案に基づいて定められたＣＤＲ配列であるが、残りのＣＤＲはＫａｂａｔ案に基づいて定められたＣＤＲ配列である。

別の好ましい実施形態において、本発明のＣＤＲ配列は表１に示されるようである。

下記表Ｃに本発明のいくつかの例示的なＣＤＲ配列の組み合わせを示す。

異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、抗体と抗体との間にあるＣＤＲが異なるにもかかわらず、ＣＤＲには限られた数のアミノ酸位置のみを抗原との結合に直接参与する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭとＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも２つを使用することにより、最小の重なり領域を確定することができ、それによって抗原と結合するための「最小結合単位」を提供する。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であることができる。当業者が明らかにしたように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を確定することができる。従って、本発明は、本明細書に提供される如何なるＣＤＲの変異体も考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基はそのまま保持することができ、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は保存的アミノ酸残基で置換することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応するＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのＣＤＲ又はその変異体を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応する重鎖ＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つ又は３つのＨＣＤＲ又はその変異体を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の可変領域配列における対応する軽鎖ＣＤＲと同じである少なくとも１つ、２つ又は３つのＬＣＤＲ又はその変異体を含む。本明細書において、「対応するＣＤＲ」は、最適照合後、候補抗体の可変領域アミノ酸配列において、参照抗体のＣＤＲと最も類似した位置にあるＣＤＲを指す。本明細書において、ＣＤＲ変異体は、既に少なくとも１つ、例えば、１つ又は２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠如及び／又は挿入によって修飾されるＣＤＲであり、ＣＤＲ変異体を含む抗原結合分子は基本的に未修飾のＣＤＲの抗原結合分子の生物学的特性を保持し、例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の生物学的活性（例えば抗原結合能力）を保持する。各ＣＤＲが単独で修飾されても組み合わせて修飾されてもよいことを理解できる。好ましくは、アミノ酸修飾はアミノ酸置換であり、特に保存的アミノ酸置換であり、例えば、表Ａに示される好ましい保存的アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、好ましくは、本明細書に提供される共通のＣＤＲ配列（例えば、配列番号５、１０、１５、２１、２４、３０、３３、３７、４０、４７、５２、５６、６２、６５、６８、７４、７７、８０）のＸ残基に対応するアミノ酸位置で起こる。

また、ＣＤＲ３領域は、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域とは独立して、関連抗原に対する抗体の結合特異性を単独で決定できることが本分野で知られている。そして、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有する複数の他の抗体を生成することができる。例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔｓ Ｎｏｓ． ６，９５１，６４６； ６，９１４，１２８； ６，０９０，３８２； ６，８１８，２１６； ６，１５６，３１３； ６，８２７，９２５；５，８３３，９４３； ５，７６２，９０５及び５，７６０，１８５を参照する。これらの全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

従って、一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＩＧＩＴと特異的に結合できる表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列からのＣＤＲ３配列を含む。さらに別の実施形態において、前記抗体は、同じ抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域からのＣＤＲ２、又は異なるＴＩＧＩＴ抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域からのＣＤＲ２をさらに含むことができる。さらに別の実施形態において、前記抗体は、同じ抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、又は異なるＴＩＧＩＴ抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域からのＣＤＲ１をさらに含むことができる。ヒトＴＩＧＩＴへの結合活性、ＣＤ１５５分子へのＴＩＧＩＴの結合を遮断する活性、及び／又は腫瘍成長を抑制する活性を含む、これらの抗体の活性は、本明細書に記載の測定手法によって特徴付けることができる。

その他、抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、２と３領域から提供されることを考慮すると、いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴと結合する本発明のその他の分子を生じるように、ＶＨ ＣＤＲ１、２と３配列とＶＬ ＣＤＲ１、２と３配列を「混合とマッチングする」（即ち、同じＴＩＧＩＴ抗原と結合する異なる抗体に由来するＣＤＲを混合とマッチングすることができ、但し、各抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、２と３とＶＬ ＣＤＲ１、２と３を含有することが好ましい）ことができる。本分野に既知の結合測定手法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）と実施例に説明されたそれらの測定手法を使用し、これらの「混合とマッチングした」抗体とＴＩＧＩＴとの結合を測定することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合とマッチングする時、所定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造上に類似するＣＤＲ配列に切り替えることが好ましい。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合とマッチングする時、所定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造上に類似するＣＤＲ配列に切り替えることが好ましい。ＣＤＲの「混合とマッチング」は、本発明の表３に示される抗体間で行うことができる。また、当業者は、本発明のその他の抗体を生じるように、その他の異なる抗体に由来する１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ領域配列を本明細書に示される抗体の構造上に類似するＣＤＲ配列に置換することができることを明らかにする。

従って、いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ３は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域のＨＣＤＲ３と同じであり、
（ｉｉ）表Ｃ又は表Ｄに示されるいずれか１つのＨＣＤＲ３配列と同じであり、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のＨＣＤＲ３に対して、少なくとも１個（好ましくは１〜２個であり、又はより好ましくは１個である）のアミノ酸変化（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的置換である）を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、且つ前記抗体の重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）と軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖と軽鎖可変領域配列のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３と同じであり、
（ｉｉ）表Ｃ又は表Ｄに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３配列と同じであり、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）のＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３に対して、合計で少なくとも１個（好ましくは１〜２個であり、又はより好ましくは１個である）のアミノ酸変化（好ましくは置換であり、より好ましくは保存的置換である）を含む。

一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、前記ＶＨは、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＨ配列に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）表Ｃ又は表Ｄに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個、且つ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）が含まれた配列を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、前記ＶＬは、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＬ配列に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉ）表Ｃ又は表Ｄに示されるいずれか１つの組み合わせにおけるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個、且つ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）が含まれた配列を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、ここで、前記抗体は、
（ｉ）表Ｂに示されるいずれか１つの抗体のＶＨとＶＬ配列に含まれる６つのＣＤＲ配列、
（ｉｉ）表Ｃ又は表Ｄに示されるいずれか１つの組み合わせにおける６つのＣＤＲ配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の配列に対して、６つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個、且つ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）が含まれた配列を含む。

一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号８４、８５、８６又は８７で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０４で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
（ｉｉ）配列番号８８、８９又は９０で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０５又は１０６で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
（ｉｉｉ）配列番号９１、９２又は９３で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０７で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
（ｉｖ）配列番号９４、９５、９６又は９７で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０８で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
（ｖ）配列番号９８、９９又は１００で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０９で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
（ｖｉ）配列番号１０１、１０２又は１０３で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１１０で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列を含む。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、重鎖の３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と、軽鎖の３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含み、ここで、
（ｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１−５及び１７８−１８１から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号６−１０から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１−１５及び１８２−１８５から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号１９−２１及び１８６−１８７から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２−２４から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号２５及び１８８から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号２６のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号２７のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号２８−３０から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号３１−３３及び１８９−１９０から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号３４−３７から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号３８−４０及び１９１−１９２から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号４１のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号４２のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号４３のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号４４−４７及び１９３−１９５から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号４８−５２から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号５３−５６及び１９６−１９８から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号５７のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号５８のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号５９のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、
（ｖ）ＨＣＤＲ１は、配列番号６０−６２及び１９９−２００から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号６及び６３−６５から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号６６−６８及び２０１−２０２から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号６９のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号７０のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、
（ｖｉ）ＨＣＤＲ１は、配列番号７１−７４及び２０３−２０５から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ２は、配列番号２２及び７５−７７から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＨＣＤＲ３は、配列番号７８−８０及び２０６−２０７から選択されるアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ１は、配列番号８１のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、ＬＣＤＲ２は、配列番号８２のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成され、且つＬＣＤＲ３は、配列番号８３のアミノ酸配列を含み又はそれによって構成される。
好ましい一実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、表Ｃに示される組み合わせの１つである６つのＣＤＲ配列を含む。

別の好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、表Ｄに示される組み合わせの１つである６つのＣＤＲ配列を含む。

抗体の可変領域
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖における抗体とその抗原との結合に参与するドメインである。重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）は、さらに超可変領域（ＨＶＲ、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる）、その間に挿入されるより保存的領域（即ち、フレームワーク領域（ＦＲ））に分けられる。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端までは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。一部の状況において、単独のＶＨ又はＶＬドメインは抗原−結合特異性を十分に与える。その他、特定した抗原と結合する抗体は、前記抗原と結合する抗体に由来するＶＨ又はＶＬドメインを使用して相補ＶＬ又はＶＨドメインライブラリーを選別して単離する（例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０−８８７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４−６２８を参照する）。

２つの可変領域の一方又は両方（即ち、ＶＨ及び／又はＶＬ）における１つ又は複数の残基を修飾し、例えば、１つ又は複数のＣＤＲ領域及び／又は１つ又は複数のフレームワーク領域に対して残基改変、特に保存的残基置換を行うことができる一方で、修飾された抗体は、依然として、変化前の抗体分子の少なくとも１つの生物学的特性（例えば、抗原結合能力）を基本的に保持することが、本分野において知られている。例えば、ＣＤＲ領域の残基を突然変異させて、抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善することができる。突然変異後の抗体の抗体結合特性又は他の機能特性は、インビトロ又はインビボのアッセイにおいて評価することができる。好ましくは、保存的置換が導入される。好ましくは、ＣＤＲ領域に導入される残基の変化は、１個、２個、３個、４個又は５個を超えない。また、フレームワーク領域残基は、例えば、抗体の特性を改善するために突然変異させることができる。例えば、１つ又は複数のフレームワーク残基は、対応する生殖系配列残基に「復帰突然変異」され得る。

ＣＤＲ移植は、本分野で知られている別の抗体可変領域修飾方式である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用を担うので、既知の抗体の特性を模倣する組換え抗体変異体を構築することができる。当該抗体変異体では、既知の抗体由来のＣＤＲ配列が、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク領域に移植される。従って、一実施形態において、本発明は、表Ｂに示されるいずれかの抗体の重鎖及び軽鎖可変領域からのＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク領域配列を有する、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片に関する。切り替えのためのフレームワーク領域配列は、生殖系抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから、又は公開文献に報告されているＴＩＧＩＴ抗体配列から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子をコードする生殖系ＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得ることができる。抗体タンパク質配列は、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴなどの配列類似性検索ツールを用いてデータベース中のタンパク質配列と比較することができる。好ましくは、切り替えのためのフレームワーク配列は、変化のために選択された本発明の抗体のフレームワーク配列と構造的類似性を有し、例えば、配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のフレームワーク序列である。

さらに別の実施形態において、本発明の例示的な抗体（表Ｂに示されるいずれかの抗体）と他の異なる抗ＴＩＧＩＴ抗体（好ましくは、表Ｂに示される別の抗体）に由来するＶＨ及びＶＬ配列を「混合とマッチングする」ことができ、ＴＩＧＩＴと結合する本発明の他の抗体を産生する。これらの鎖を混合とマッチングする時、好ましくは、具体的なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を構造が類似するＶＨ配列に切り替える。同様に、所定のＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列は、構造上に類似するＶＬ配列に切り替えることが好ましい。本分野に既知の結合測定手法（例えば、ＥＬＩＳＡと実施例部分に記述された他の測定手法である）を使用してこのような「混合とマッチングした」抗体とＴＩＧＩＴとの結合を測定することができる。

従って、一実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域ＶＨ配列を含み、又は前記アミノ酸配列によって構成される。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、前記ＶＨ配列の変異体を含む。

別の実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の軽鎖可変領域ＶＬ配列を含み、又は前記アミノ酸配列によって構成される。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、前記ＶＬ配列の変異体を含む。

さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、
（ｉ）配列番号８４、８５、８６又は８７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体、
（ｉｉ）配列番号８８、８９又は９０で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１０５又は１０６で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体、
（ｉｉｉ）配列番号９１、９２又は９３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体、
（ｉｖ）配列番号９４、９５、９６又は９７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１０８で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体、
（ｖ）配列番号９８、９９又は１００で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体、
（ｖｉ）配列番号１０１、１０２又は１０３で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ配列又はその変異体、及び／又は配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含むＶＬ配列又はその変異体を含む。

一実施形態において、ＶＨ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨ配列と比べ、（好ましくは、全長で又はＣＤＲ１、２と３の３つの領域で）、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに高い同一性を有する。一実施形態において、ＶＨ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＨ配列と比べ、（好ましくは、全長で又はＣＤＲ１、２と３の３つの領域で）、少なくとも１個、且つ、３０個以下、１０個以下、又は５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下、０個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）を含む。配列の相違は、ＣＤＲ領域では生じないことが好ましい。

好ましい一実施形態において、ＶＬ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＬ配列と比べ、（好ましくは、全長で又はＣＤＲ１、２と３の３つの領域で）、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに高い同一性を有する。好ましい一実施形態において、ＶＬ配列の変異体は、アミノ酸配列において、参照ＶＬ配列と比べ、（好ましくは、全長で又はＣＤＲ１、２と３の３つの領域で）、少なくとも１個、且つ、３０個以下、１０個以下、又は５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下、０個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）を含む。配列の相違は、ＣＤＲ領域では生じないことが好ましい。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、表Ｂに示されるいずれか１つの抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域ＶＨ／ＶＬ配列対を含み、又は前記アミノ酸配列対によって構成される。本発明は当該抗体の変異体、例えば、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨとＶＬに少なくとも９５〜９９％の同一性を有し、又は１０個を超えないアミノ酸変化を含む変異体も提供する。

上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、参照抗体に対して、本発明の抗体変異体の重鎖可変領域は１つ又は複数のＣＤＲ（好ましくは全ての３つのＣＤＲである）領域に１０個を超えなく、好ましくは５個を超えない（例えば、３、２、１又は０個）アミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）を含む。

上記のいずれか１つの実施形態において、好ましくは、参照抗体に対して、本発明の抗体変異体の軽鎖可変領域ＶＬは１つ又は複数のＣＤＲ（好ましくは全ての３つのＣＤＲである）領域に１０個を超えなく、好ましくは５個を超えない（例えば、３、２、１又は０個）アミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換であり、好ましくは保存的置換である）を含む。

抗体の重鎖と軽鎖
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、重鎖Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプのＦｃ領域を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ４−Ｆｃ領域を含み、ここで、アミノ酸残基の２２８位置（ＥＵ番号付け）にセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ）がある。さらに別の好ましい実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧ４−ＰＡＡ Ｆｃ部分を含む。当該ＩｇＧ４−ＰＡＡ Ｆｃ部分は、位置２２８にセリンからプロリンへの突然変異（Ｓ２２８Ｐ）があり、位置２３４（ＥＵ番号付け）にフェニルアラニンからアラニンへの突然変異があり、位置２３５（ＥＵ番号付け）にロイシンからアラニンへの突然変異がある。Ｓ２２８Ｐ突然変異は、腫瘍定常領域のヒンジ領域の突然変異であり、重鎖間ジスルフィド架橋の異質性を減少又は排除することができる。Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異は、（既に低エフェクター機能を有する）ヒトＩｇＧ４アイソタイプのエフェクター機能をさらに低下させることができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、重鎖Ｃ末端リジン（ｄｅｓ−Ｌｙｓ）を除去したＩｇＧ４−ＰＡＡ Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、κ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域を含む。

さらに別の好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号１７７のアミノ酸配列、又は配列番号１７７のアミノ酸配列に対して少なくとも１個、２個又は３個であるが２０個以下、１０個以下又は５個以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、又は配列番号１７７のアミノ酸配列と少なくとも９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖定常領域を含む。好ましい一実施形態において、軽鎖定常領域は、ヒトκ軽鎖定常領域である。さらに別の好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、配列番号２０９のアミノ酸配列、又は配列番号２０９のアミノ酸配列に対して少なくとも１個、２個又は３個であるが２０個以下、１０個以下又は５個以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、又は配列番号２０９のアミノ酸配列と少なくとも９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、重鎖を含み、前記重鎖は、配列番号１１１−１３０から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも１個、２個又は３個であるが２０個以下、１０個以下又は５個以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは可変領域では起こらない。

いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、軽鎖を含み、前記軽鎖は、配列番号１３７−１４３から選択されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも１個、２個又は３個であるが２０個以下、１０個以下又は５個以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは可変領域では起こらない。

好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号１１１−１１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１３７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、
（ｂ）配列番号１１５−１１７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１３８又は１３９から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、
（ｃ）配列番号１１８−１２０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１４０から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、
（ｄ）配列番号１２１−１２４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１４１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、
（ｅ）配列番号１２５−１２７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１４２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、
（ｆ）配列番号１２８−１３０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖配列又はその変異体、及び／又は配列番号１４３から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖配列又はその変異体、から選択される重鎖配列及び／又は軽鎖配列を含み、
ここで、前記変異体は、対応する参照配列と比べ、少なくとも１個、２個又は３個であるが２０個以下、１０個以下又は５個以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列、又は少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに高い同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸変化はＣＤＲ領域では起こらず、より好ましくは可変領域では起こらない。

一実施形態において、残基修飾は、例えば、抗体の特性、例えばエフェクター機能を変化させるために、抗体の定常領域で行われる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片の重鎖及び／又は軽鎖は、シグナルペプチド配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧをさらに含む。

例示的な抗体配列
本発明は、実施例のように単離して特徴づけされる、ＴＩＧＩＴ（例えば、ヒトＴＩＧＩＴ）と特異的に結合する完全ヒト化抗体を提供する。下記表３に本発明のこれらの例示的な抗体の抗体可変領域ＶＨ及びＶＬ配列を示す。下記表１及び表２に抗体の例示的なＣＤＲ配列を示す。配列表は、本発明の例示的な抗体の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、ならびに本発明の例示的な抗体可変領域ＶＨ及びＶＬをコードするヌクレオチド配列を示す。

抗体変異体
一態様において、本発明は、本明細書に言及される如何なる抗体、特に表Ｂに示される例示的な抗体の変異体を提供する。一実施形態において、抗体の変異体は変化前の抗体の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の生物学的活性（例えば、抗原結合能力）を保持する。いくつかの実施形態において、前記変化は、抗体の変異体が抗原に対する結合を失うことを引き起こさないが、高くなる抗原親和力と異なるエフェクター機能などのような性質を任意に与えることができる。

理解すべきことは、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域、又は各ＣＤＲ領域は単独に変化し又は組み合わせて変化することができる。いくつかの実施形態において、１個又は複数個又は全ての３個の重鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の変化は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個を超えない。好ましくは、前記アミノ酸の変化はアミノ酸置換であり、保存的置換が好ましい。いくつかの実施形態において、１個又は複数個又は全ての３個の軽鎖ＣＤＲにおけるアミノ酸の変化は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個を超えない。いくつかの実施形態において、１個又は複数個又は全ての６個のＣＤＲにおけるアミノ酸の変化は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個を超えない。好ましくは、前記アミノ酸の変化はアミノ酸置換であり、保存的置換が好ましい。いくつかの実施形態において、抗体の変異体と参照抗体は目標抗体配列領域に少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％又は９９％又はさらに高いアミノ酸同一性を有する。例えば、一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、３つの重鎖ＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い同一性を有する。一実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、３つの軽鎖ＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い同一性を有する。別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、６つのＣＤＲ領域に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い同一性を有する。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、重鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い配列同一性を有する。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、軽鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い配列同一性を有する。さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、参照抗体（例えば、表３に示されるいずれかの抗体）と比べ、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％又はさらに高い配列同一性を有する。

また、抗体のＦｃ領域を変化させることができる。Ｆｃ領域の変化は、単独で、又は上記のフレームワーク及び／又はＣＤＲ領域の変化と組み合わせて行うことができる。Ｆｃ領域を変化させることで、例えば、抗体の１つ又は複数の機能、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存性細胞傷害を変化させることができる。また、本発明の抗体は、化学的に修飾され（例えば、ＰＥＧと結合され）、又はそのグリコシル化モードを変化させることができる。

一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、１つ又は複数のＡＤＣＣ活性を高めるアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ−領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換（残基のＥＵ番号付け）を有するＦｃ−領域を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ−領域を変化させることで、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（例えば、ＵＳ６，１９４，５５１、ＷＯ９９／５１６４２とＩｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８−４１８４を参照する）の変更（即ち、向上又は低減）を引き起こすことができる。

他の一部の実施形態において、そのグリコシル化程度を増加又は低減すること及び／又はそのグリコシル化モードを変えるようにＦｃを変化させることができる。Ｆｃのグリコシル化部位の追加又は欠如に対して、アミノ酸配列を変えて１つ又は複数のグリコシル化部位を生成又は除去することによって容易に実現することができる。例えば、１つ又は複数のグリコシル化部位を解消するために１つ又は複数のアミノ酸置換を行うことができ、これによって当該部位のグリコシル化を解消することができる。種類を変えたグリコシル化抗体、例えば、フコシル残基の量を減少した低い又は無フコシル化抗体又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を追加した抗体を製造することができる。このような変えたグリコシル化モデルは既に抗体のＡＤＣＣ能力の向上が示されている。本発明は、Ｆｃ領域に接続されるオリゴ糖に少なくとも１つの半乳糖残基を有する抗体変異体も考慮する。これらの抗体変異体は向上したＣＤＣ機能を有することができる。

一部の実施形態において、本発明は、全部でないが一部のエフェクター機能を有する抗体変異体も考慮し、それをある応用の望ましい候補物になり、前記応用において抗体のインビボ半減期が重要であるが、一部のエフェクター機能（例えば、補体とＡＤＣＣ）が必要ではなく又は有害である。例えば、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を解消又は軽減する突然変異、例えば、突然変異のＰ３２９Ｇ及び／又はＬ２３４ＡとＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域、又は、突然変異のＰ３２９Ｇ及び／又はＳ２２８ＰとＬ２３５Ｅを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含むことができる。

一部の実施形態において、システイン操作された抗体、例えば、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」の産生が望ましい場合がある。例えば、抗体のヒンジ領域におけるシステイン残基の数量を変更することによって、軽鎖及び重鎖の組み立てを促進し又は抗体の安定性を向上もしくは低減させることができる。例えば、米国特許番号５，６７７，４２５を参照する。

一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、非タンパク質の部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導に適する部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、例えば、抗体（例えば、血清）の半減期を延長するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これに限定されない。タンパク質のＰＥＧ化方法は本分野で公知するものであり、本発明の抗体に適用できる。例えば、ＥＰ ０１５４ ３１６及びＥＰ ０４０１３８４を参照する。

ＩＩ．ポリヌクレオチド、ベクターと宿主
本発明は、上記の任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。前記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。

一態様において、本発明は、上記の任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。前記核酸は、抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸、又は抗体の軽鎖及び／又は重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含むことができる。抗体の重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１５０−１６９から選択される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含み、又は配列番号１５０−１６９から選択される核酸配列を含む。抗体の軽鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１７０−１７６から選択される核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する核酸配列を含み、又は配列番号１７０−１７６から選択される核酸配列を含む。適切な発現ベクターが発現する時、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＴＩＧＩＴ抗原結合能力を示すことができる。

本発明において、上記記載されたＴＩＧＩＴに結合する抗体に由来する重鎖ＶＨ又は軽鎖ＶＬ配列の少なくとも１つのＣＤＲ領域と通常の全ての３つのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。さらなる一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、上記記載されたＴＩＧＩＴと結合する抗体の重鎖及び／又は軽鎖の完全又は基本的に完全な可変領域配列をコードする。

当業者に明らかになるように、遺伝暗号の退化性のため、各抗体又はポリペプチドアミノ酸配列は、複数の核酸配列によってコードすることができる。

好ましい一実施形態において、抗体をコードする本発明の核酸は、重鎖Ｆｃ領域をコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号１７７で表されるＦｃ領域配列又はそれと基本的に同じ配列をさらに含む。

好ましい一実施形態において、抗体をコードする本発明の核酸は、軽鎖定常領域配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、配列番号２０９で表される配列又はそれと基本的に同じ配列をさらに含む。

本分野でよく知られている方法を用いて、初めから固相化ＤＮＡを合成すること、又はＴＩＧＩＴと結合する抗体又はその抗原結合断片をコードする既存の配列（例えば、配列番号１５０−１６９で表されるＶＨ ＤＮＡ配列、配列番号１７０−１７６で表されるＶＬ ＤＮＡ配列）をＰＣＲ突然変異誘発することによって、これらのポリヌクレオチド配列を生成することができる。

一実施形態において、本発明の核酸を含む１つ又は複数のベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクターで、例えば、真核発現ベクターである。ベクターの非限定的な例は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＴＴ５発現ベクターである。

一実施形態において、前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。抗体をコードするベクターをクローニング又は発現するための適切な宿主細胞は、本出願で説明されている原核又は真核細胞を含む。例えば、抗体が細菌において生成され、特に、グリコシル化とＦｃエフェクター機能が不要な場合はそうである。細菌における抗体断片とポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、第５，８４０，５２３号、及びＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ２４８（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐ２４５−２５４，大腸菌における抗体断片の発現）が参照される。発現後、可溶性画分における抗体が細菌細胞のペースト状物から単離して、さらに精製することができる。

一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞又は抗体もしくはその抗原結合断片の製造に適する他の細胞から選択される。例えば、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに適するクローニング又は発現宿主である。例えば、グリコシル化経路が既に「ヒト化」された真菌と酵母菌株は、一部又は完全のヒトグリコシル化の形態を有する抗体の生成を引き起こす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）が参照される。グリコシル化抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物、脊椎動物）から誘導されてもよい。脊椎動物の細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁化成長に適するように改変された哺乳類由来の細胞株を使用できる。使用可能な哺乳類由来の宿主細胞株のいくつかの例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓由来ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）、ヒト胎児腎臓系（２９３ＨＥＫもしくは２９３細胞、例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）の説明）などが挙げられる。使用可能な他の哺乳類由来の宿主細胞株は、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞や、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体の生成に適する一部の哺乳類由来の宿主細胞株は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５−２６８（２００３）で概略的に説明されている。

ＩＩＩ．抗体の製造
一実施形態において、抗体の発現に適する条件において、前述したように、前記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、必要に応じて前記宿主細胞（又は宿主細胞培地）から前記抗体を回収することとを含む抗ＴＩＧＩＴ抗体の製造方法を提供する。組換えにより抗ＴＩＧＩＴ抗体を生成するために、抗体（例えば、上記の抗体）をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、それを１つ又は複数のベクターに挿入する。かかる核酸は、通常のプロセスにより単離しシークエンシングすることが容易である（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行う）。

ＩＶ．測定手法
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本出願の抗TIGIT抗体に対して同定、スクリーニング、又はその物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性の特性評価を行うことができる。

一態様において、本発明の抗体に対してその抗原結合活性を測定する。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような本分野において既知の方法、又は本出願の実施例に開示されている例示的な方法を利用して、ヒトＴＩＧＩＴとの結合を測定することができる。例えば、抗体が、ヒトＴＩＧＩＴを発現する細胞株、例えばトランスフェクトにより細胞表面上にヒトＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ細胞と反応する、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。天然ＴＩＧＩＴを発現するＴ細胞を含む他の細胞はフローサイトメトリーにも適している。あるいは、結合動力学（例えば、Ｋ_Ｄ値）を含む抗体の結合は、組換えＴＩＧＩＴタンパク質を使用して光干渉による生体測定法において測定することができる。いくつかの実施形態において、例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和性測定手法が利用される。

別の態様において、競合測定手法を利用して、本出願で開示されている任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体と競合的にＴＩＧＩＴと結合する抗体を同定することができる。一部の実施形態において、かかる競合的結合において抗体は、本出願で開示されている任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体が結合するエピトープと同じ又は重複するエピトープ（例えば、線形エピトープ又は立体配座エピトープ）と結合する。抗体が結合するエピトープの特定のための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）で詳細に記載されている。

本発明は、生物学的活性を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体を同定するための測定手法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、ＴＩＧＩＴ（例えば、ヒトＴＩＧＩＴ）との結合、ＴＩＧＩＴ（例えば、ヒトＴＩＧＩＴ）とＣＤ１５５分子との結合の遮断、ＴＩＧＩＴ媒介性の抑制性シグナル伝達の遮断、Ｔ細胞のＩＬ２産生の増加、及び／又は腫瘍成長の抑制を含んでもよい。例えば、インビボ腫瘍抑制モデル（例えば、実施例６参照）において、腫瘍成長を抑制する抗体の能力を測定する。本発明は、インビボ及び／又はインビトロにおいて、かかる生物学的活性を有する抗体も提供する。

なお、本発明の免疫複合体又は多重特異性抗体を利用して抗ＴＩＧＩＴ抗体を置き換え又はそれを補足して、任意の上記の測定を実現できる。

Ｖ．多重特異性抗体
さらに別の態様において、本発明は、ＴＩＧＩＴ（好ましくは、ヒトＴＩＧＩＴ）と特異的に結合する多重特異性（二重特異性を含む）抗体分子を提供する。一実施形態において、多重特異性抗体において、本発明の抗体（又はその抗原結合断片）は、ＴＩＧＩＴに対する第１の結合特異性を形成する。さらに別の実施形態において、前記多重特異性抗体は、第２の特異性をさらに有するか、又はさらに別の実施形態において、第２の結合特異性と第３の結合特異性をさらに含む。さらに別の実施形態において、前記多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

一実施形態において、結合特異性は、抗体の「結合部位」又は「抗原結合部位」（抗体分子において抗原と実際に結合する領域）によって提供される。好ましい一実施形態において、抗原結合部位は、抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対からなる。従って、一実施形態において、「多重特異性」抗体は、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体であり、前記少なくとも２つの抗原結合部位のうち、それぞれの抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープと結合することができる。

多重特異性抗体及びその製造については、例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２及びＷＯ２０１０／１４５７９３の説明を参照されたい。

ＶＩ．免疫複合体
さらに別の態様において、本発明は、本発明の抗体を異種分子に接合することによって生成した免疫複合体を提供する。一実施形態において、免疫複合体において、本発明の抗体（又はその抗原結合断片）は、治療剤又は診断剤と接合する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、全長抗体又は抗体断片の形式で異種分子と接合することができる。例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖ｓｃＦａｂ抗体、単鎖ｓｃＦｖなどの断片の形式で接合することができる。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、治療性分子と接合する。リンカーは、抗体を治療性分析に共有結合するために使用され得る。適切なリンカーは、化学リンカー又はペプチドリンカーを含む。

他の一部の実施形態において、本発明の抗体は、診断剤又は検出可能な試薬と接合することができる。このような複合体は、臨床検査方法の一部（例えば特定療法の効能を確認する）として、疾患又は病気の発作、形成、進行及び／又は重篤性を監視又は予測することができる。抗体を検出可能な試薬と結合させることによってこのような診断及び検出を達成することができる。

ＶＩＩ．医薬組成物と薬物製剤
本発明は、抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその免疫複合体又は多重特異性抗体を含む組成物（医薬組成物又は薬物製剤を含む）、抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその免疫複合体又は多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、本分野で既知の薬用ベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を必要に応じて含んでもよい。

一実施形態において、組成物は、第２の治療剤をさらに含む。前記第２の治療剤は、例えば、抗−ＰＤ−１抗体及び抗−ＰＤ−Ｌ１抗体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、第２の治療剤は、ＰＤ−１拮抗剤であり、特に抗ＰＤ−１抗体である。

本発明に適する薬用ベクターは、石油、動物もしくは植物に由来する又は合成された、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油など、水、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射溶液に用いることができる。適切な薬用賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用及びその用途に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ、Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏが参照される。必要があれば、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をさらに少量に含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用できる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的なベクターを含んでもよい。

所望の純度を有する本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体、免疫複合体又は多重特異性抗体を任意の１つ又は複数の医薬品添加物（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することによって、本発明を含む薬物製剤を製造し、好ましくは凍結乾燥製剤又は水溶液の形式で製造する。

例示的な凍結乾燥抗体製剤に関する説明は、米国特許第６，２６７，９５８号が参照される。水性抗体製剤に関しては、米国特許第６，１７１，５８６号、世界特許ＷＯ２００６／０４４９０８が参照され、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝剤を含む。

本発明の医薬組成物又は製剤は、１種以上の他の活性成分をさらに含んでもよく、前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いにマイナスの影響を与えない活性的に相補な活性成分を含む。例えば、ＰＤ−１結合拮抗剤又はＰＤ−Ｌ１結合拮抗剤などの他の抗がん活性成分、例えば抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体をさらに提供することが望ましい。前記活性成分は、目的用途において有効な量で適切に組み合わせた形で存在する。

持続性放出製剤として製造できる。持続性放出製剤の適切な例は、抗体を含有する疎水性固体ポリマーによる半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルム又はマイクロカプセルなどのように一定の形態を有する。

薬物製剤の他の成分については、ＷＯ２０１５／１５３５１３に開示されているものを参照することもできる。

ＶＩＩＩ．組み合わせ製品
一態様において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片、二重特異性抗体又は免疫複合体、及び１種以上の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法において使用できる。

いくつかの実施形態において、本発明は、組み合わせ製品を提供し、ここで、前記他の治療剤が、例えば、免疫応答を刺激して対象の免疫応答をさらに増強、刺激又は上方制御するのに有効な、抗体などの治療剤である。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。

いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、腫瘍の予防又は治療に用いられる。いくつかの実施形態において、腫瘍は、がん、例えば、胃がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸がんなどの胃腸管がん、又は悪性黒色腫などの皮膚がんである。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、例えば細菌感染、ウイルス感染、真菌感染、原生動物感染などの感染の予防又は治療に用いられる。

ＩＸ．治療方法と使用
本出願では、用語「個体」又は「対象」は、互いに切り替えて用いることができ、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜化された動物（例えば、乳牛、ヒツジ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトである。

本明細書では、用語「治療」は、治療を受けている個体における疾病の天然過程を変化させようとする臨床介入を指す。求められる治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の改善又は寛解、及び予後の緩和又は改善を含むが、これらに限定されない。

一態様において、本発明は、対象における機体の免疫応答の増強方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に係る任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその断片、又は前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、又は医薬組成物を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合部分を、抗腫瘍免疫応答を刺激するように、腫瘍を携帯する対象に投与する。別の一部の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分を、抗感染免疫応答を刺激するように、感染を携帯する対象に投与する。

別の態様において、本発明は、対象における腫瘍、例えばがんの治療方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に係る任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその断片、又は前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、又は医薬組成物を前記対象に投与することを含む。がんは、早期、中期又は末期にあるがん又は転移性がんであってもよい。

ＴＩＧＩＴはヒト腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞に高発現することが証明されている。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、がん、特にＴＩＧＩＴを発現する腫瘍浸潤性リンパ球浸潤の固形腫瘍を治療するために使用される。

一実施形態において、がんは、結腸がんなどの胃腸管がんである。

いくつかの実施形態において、腫瘍又は腫瘍細胞は、結腸直腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽腫及び頭頸部腫瘍から選択され得る。いくつかの実施形態において、がんは、結腸直腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頸がん、膀胱がん、神経膠芽腫及び頭頸部がんから選択され得る。

いくつかの実施形態において、本明細書は、本発明の抗−ＴＩＧＩＴ抗体及び拮抗性抗ＰＤ−１抗体を対象に投与することを含む、腫瘍（例えば、がん）を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＩＧＴＩとＰＤ−１を共発現する腫瘍、例えば、ＴＩＧＴＩとＰＤ−１を共発現する黒色腫（Ｃｈａｕｖｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２５：２０４６）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び腎細胞がん（ＲＣＣ）を治療するために用いられる。

別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患、例えば慢性感染の治療方法に関し、前記方法は、有効量の本明細書に係る任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体もしくはその断片、又は前記抗体もしくは断片を含む免疫複合体、多重特異性抗体、又は医薬組成物を前記対象に投与することを含む。一実施形態において、前記感染はウイルス感染である。

いくつかの実施形態において、前記感染性疾患は、ウイルス感染によって引き起こされる。病原性ウイルスのいくつかの例は、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎ウイルス、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス＋）、アデノウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、乳頭腫、伝染性軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルスを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に係る方法は、前記対象に１種以上の療法（例えば、治療法及び／又は他の治療剤）を組み合わせて適用することをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療法は、手術治療及び／又は放射線治療を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の抗−ＴＩＧＩＴ抗体と１種以上の治療剤との組み合わせによってＴ細胞応答を刺激することができる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を投与することに加えて、本発明の方法は、少なくとも１種の他の免疫刺激性抗体、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、を投与することをさらに含み、これらの抗体は、例えば、完全ヒト化抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であり得る。

別の一部の実施形態において、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る他の治療剤は、ＰＤ−１結合拮抗剤及びＰＤ−Ｌ１結合拮抗剤から選択される。「ＰＤ−１」の名称候補は、ＣＤ２７９、ＳＬＥＢ２を含む。「ＰＤ−Ｌ１」の名称候補は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈを含む。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１は、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１である。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合拮抗剤は、ＰＤ−１とそのリガンド結合対象の結合を抑制する分子である。１つの特定の態様において、ＰＤ−１のリガンド結合対象は、ＰＤ−Ｌ１である。別の実施形態において、ＰＤ−Ｌ１結合拮抗剤は、ＰＤ−Ｌ１とその結合対象の結合を抑制する分子である。１つの特定の態様において、ＰＤ−Ｌ１の結合対象はＰＤ−１である。拮抗剤は、抗体、抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質又はオリゴペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１結合拮抗剤は、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ＩＢＩ３０８（シンディリマブ、ＷＯ２０１７／０２５０１６Ａ１）、ＭＤＸ−１１０６（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ＯＰＤＩＶＯ）、Ｍｅｒｃｋ ３４７５（ＭＫ−３４７５、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ＣＴ−０１１（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）から選択される。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体はＭＤＸ−１１０６である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４−９４−４）である。好ましい実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ」である。

さらなるいくつかの実施形態において、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその断片は、単独で又はＰＤ−１結合拮抗剤又はＰＤ−Ｌ１結合拮抗剤との組み合わせとして、１種以上の他の療法、例えば、治療法及び／又は他の治療剤と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態において、治療法は、外科的手術（例えば、腫瘍切除）、放射線治療（例えば、照射領域が設定された三次元原体放射線療法などの外部粒子ビーム療法）、局所照射（例えば、所定の標的もしくは器官に対する照射）又は集中的照射などを含む。

いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、化学療法又は化学療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、放射線療法又は放射線療法剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、標的療法又は標的治療剤と併用して投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片は、免疫療法又は免疫治療剤、例えばモノクローナル抗体と併用して投与されてもよい。

本発明の抗体（及びそれを含む医薬組成物又は免疫複合体、任意の他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、且つ、局所治療の場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与を含む。なお、投与期間の長さによって、例えば、静脈内注射投与又は皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路にすることができる。本発明において、非限定的であるが、単回投与又は複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス療法などの様々な頻度の投与が含まれる。

本発明の抗体は、疾患の予防又は治療に用いられる場合、その適切な投与量（単独で投与される場合又は１種以上の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、前記抗体の投与が予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、又は一連の治療において患者に適切に投与される。

上記本発明の方法において、本発明の抗体又は抗原結合部分の代わりに、本発明の組成物、多重特異性抗体又は免疫複合体を投与することができる。あるいは、これらの方法において、本発明の抗体又は抗原結合部分に加えて、本発明の組成物、多重特異性抗体又は免疫複合体をさらに投与することができる。

さらに別の態様において、本発明は、上述の方法（例えば治療のため）の医薬の製造における、本発明の抗ＴＩＧＩＴ抗体、組成物、免疫複合体、多重特異性抗体の使用を提供する。

Ｘ．診断と検出のための方法と組成物
さらに別の態様において、本発明は、サンプルにおけるＴＩＧＩＴを検出する方法とキットに関し、前記方法は、（ａ）前記サンプルを本発明の抗体又はその抗原結合断片又は免疫複合体と接触することと、（ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片又は免疫複合体とＴＩＧＩＴタンパクとの間の複合物の形成を検出することとを含む。いくつかの実施形態において、サンプルは皮膚がん患者などのがん患者に由来する。前記検出は、インビトロでもインビボでもよい。

本明細書で使用される用語「検出」は、定量的検出又は定性的検出を含む。例示的な検出方法としては、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子複合磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定、ＰＣＲ−技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。一部の実施形態において、生体サンプルは血、血清又は生体に由来する他の液体サンプルである。一部の実施形態において、生体サンプルは細胞又は組織を含む。いくつかの実施形態において、生体サンプルは過剰増殖性の病巣又はがん性病巣に由来する。一部の実施形態において、検出対象のＴＩＧＩＴはヒトＴＩＧＩＴである。

一実施形態において、抗ＴＩＧＩＴ抗体が抗ＴＩＧＩＴ抗体による治療に適する対象の選択に用いられ、例えば、ＴＩＧＩＴは前記対象を選択するバイオマーカーである。一実施形態において、本発明の抗体を利用してがん又は腫瘍の診断を行い、例えば、対象における本明細書に記載の疾患（例えば、過剰増殖性の疾患又はがん性疾患）の治療又は進行、その診断及び／又は病期の評価（例えば、監視）を行うことができる。

一部の実施形態において、標識された抗ＴＩＧＩＴ抗体を提供する。標識の非限定的な例は、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識）と、酵素触媒反応又は分子間の相互作用などにより間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）とを含む。標識の非限定的な例は、放射性同位体、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど、フルオロフォア、例えば、希土類キレートもしくはフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタル由来ルシフェラーゼ、細菌由来ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、フルオレセイン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、炭水化物オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えば、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、過酸化水素染料前駆体からなる酵素、例えば、ＨＲ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、ファージ標識、安定的なフリーラジカルなどを含む。

次に、本発明に対する一層の理解のために、実施例を用いて説明する。これらの実施例は本発明の保護範囲を制限するものとは解釈されず、何らかの形でそのような示唆をするためのものでもない。

本発明の以下の実施例に係る２０個の例示的な抗体（ＡＤＩ−２７２３８、ＡＤＩ−３０２６３、ＡＤＩ−３０２６７、ＡＤＩ−３０２６８、ＡＤＩ−２７２４３、ＡＤＩ−３０３０２、ＡＤＩ−３０３３６、ＡＤＩ−２７２７８、ＡＤＩ−３０２９３、ＡＤＩ−３０２９６、ＡＤＩ−２７２９１、ＡＤＩ−３０２８３、ＡＤＩ−３０２８６、ＡＤＩ−３０２８８、ＡＤＩ−２７２９７、ＡＤＩ−３０２７２、ＡＤＩ−３０２７８、ＡＤＩ−２７３０１、ＡＤＩ−３０３０６、ＡＤＩ−３０３１１）、及びこれらの抗体のＣＤＲ領域、軽鎖可変領域と重鎖可変領域、軽鎖と重鎖のアミノ酸配列、並びに対応するヌクレオチド配列を、本出願の表１〜３及び配列表の部分に列挙し、それらの対応する配列番号を表４に要約する。

実施例１：抗体の製造
酵母ディスプレイ技術による抗ＴＩＧＩＴ完全ヒト化抗体のスクリーニング
従来の方法（世界特許ＷＯ２００９０３６３７９、ＷＯ２０１０１０５２５６、Ｗ０２０１２００９５６８）を用いて、酵母ベースの抗体ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ）に対して、各ライブラリーの多様性が１×１０^９になるよう増幅させた。簡単に説明すると、最初の２回のスクリーニングにおいて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社のＭＡＣＳシステムを利用して磁気ビーズ細胞選別を行った。最初に、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（リン酸塩緩衝液、０．１％ウシ血清アルブミン含有）において、ライブラリーの酵母細胞（最大１×１０^１０個の細胞／ライブラリー）をそれぞれ室温で１５ｍｉｎインキュベートし、緩衝液に１００ｎＭのビオチンで標識されたヒトＴＩＧＩＴ抗原（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＴＩＴ−Ｈ５２Ｈ３）を含有する。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液５０ｍｌで洗浄し、次に同洗浄緩衝液４０ｍｌで細胞を再懸濁し、ストレプトアビジンマイシンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳ）５００μｌを加えて４℃で１５ｍｉｎインキュベートした。１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して上清を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液５ｍｌで細胞を再懸濁し、細胞溶液をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムに加えた。サンプルをロードした後、カラムを３回洗浄し、各回にＦＡＣＳ洗浄緩衝液３ｍｌを使用した。磁気領域からＭｉｌｔｅｎｙｉ ＬＳカラムを取り外し、成長培地５ｍｌで溶出し、溶出された酵母細胞を回収し、３７℃で一晩成長させた。

フローサイトメーターを利用して、次回の選別を行った。具体的には、ＭＡＣＳシステムによってスクリーニングされた約１×１０^８の酵母細胞に対してＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、室温で低濃度のビオチン（１００−１ｎＭ）標識を含有するＴＩＧＩＴ抗原において培養した。培養液を捨て、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した後、細胞をＬＣ−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣによって標識された抗ヒト免疫グロブリンのｋａｐｐａ軽鎖抗体、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（１：１００希釈）と混合し、ＳＡ−６３３（ストレプトアビジン−６３３、Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（１：５００希釈）又はＳＡ−ＰＥ（ストレプトアビジン−ＰＥ、Ｓｉｇｍａ）（１：５０希釈）試薬と混合し、４℃で１５ｍｉｎ培養した。予め冷却されたＦＡＣＳ洗浄緩衝液で２回溶出し、緩衝液０．４ｍｌに再懸濁し、フィルターを備える分離管に細胞を移した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を選別した。

３０℃で、スクリーニングして得られた抗ＴＩＧＩＴ抗体を発現する酵母細胞を振とうし４８時間誘導することによって、抗ＴＩＧＩＴ抗体を発現させた。誘導完了後、１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して酵母細胞を除去し、上清液を得た。上清液における抗ＴＩＧＩＴ抗体に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いて精製し、ｐＨ２．０の酢酸溶液で溶出して、抗ＴＩＧＩＴ抗体を得たところ、抗体純度が＞９５％であった。パパイン消化及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ生命医療集団）による精製を用いて対応するＦａｂ断片を得ることができる。このスクリーニングでは、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＡＤＩ−２７３０１、ＡＤＩ−２７２３８、ＡＤＩ−２７２７８、ＡＤＩ−２７２４３、ＡＤＩ−２７２９７、ＡＤＩ−２７２９１が得られた。

抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の親和力の最適化
親和力がより高い抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を得るために、次の方法により抗体ＡＤＩ−２７３０１、ＡＤＩ−２７２３８、ＡＤＩ−２７２７８、ＡＤＩ−２７２４３、ＡＤＩ−２７２９７、ＡＤＩ−２７２９１に対し最適化を行った。

ＶＨｍｕｔスクリーニング
当該方法は、通常のミスマッチＰＣＲ方法により抗体重鎖領域に突然変異を導入することである。ＰＣＲを行った過程で、１μＭの高頻度突然変異の塩基類似体ｄＰＴＰと８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを利用して、塩基ミスマッチの概率を約０．０１ｂｐに上げた。

得られたミスマッチＰＣＲ生成物に対し、相同組換えの方法により重鎖定常領域を含有するベクターに導入した。当該方法により、ＴＩＧＩＴ抗原価を含み、非標識抗原による競合と親抗体競合を用いるスクリーニング条件において、ライブラリーの容量が１×１０^７の二次ライブラリーを得た。ＦＡＣＳ方法により３回のスクリーニングに成功している。

ＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２スクリーニング
ＶＨｍｕｔ方法により得られた子孫抗体のＣＤＲＨ３遺伝子を、多様性が１×１０^８のＣＤＲＨ１／ＣＤＲＨ２遺伝子ライブラリーに導入し、それに対し３回のスクリーニングを行った。１回目でＭＡＣＳ方法を用い、２回目、３回目でＦＡＣＳ方法を用いて、抗体抗原結合物に対して親和力加圧を行って、親和力が最大の抗体をスクリーニングした。

６株の親抗体に対する上記の親和力成熟過程を経て、１４株の親和力が向上した抗ヒトＴＩＧＩＴモノクローナル抗体ＡＤＩ−３０２６３／ＡＤＩ−３０２６７／ＡＤＩ−３０２６８（ＡＤＩ−２７２３８子孫）、ＡＤＩ−３０３０２／ＡＤＩ−３０３３６（ＡＤＩ−２７２４３子孫）、ＡＤＩ−３０２９３／ＡＤＩ−３０２９６（ＡＤＩ−２７２７８子孫）、ＡＤＩ−３０２８３／ＡＤＩ−３０２８６／ＡＤＩ−３０２８８（ＡＤＩ−２７２９１子孫）、ＡＤＩ−３０２７２／ＡＤＩ−３０２７８（ＡＤＩ−２７２９７子孫）、ＡＤＩ−３０３０６／ＡＤＩ−３０３１１（ＡＤＩ−２７３０１子孫）が得られた。

３０℃で、スクリーニングして得られた抗ＴＩＧＩＴ抗体を発現する酵母細胞を振とうし４８時間誘導することによって、抗ＴＩＧＩＴ抗体を発現させた。誘導完了後、１３００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して酵母細胞を除去し、上清液を得た。上清液における抗ＴＩＧＩＴ抗体に対して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いて精製し、ｐＨ２．０の酢酸溶液で溶出して、抗ＴＩＧＩＴ抗体を得たところ、抗体純度が＞９５％であった。パパイン消化及びＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ生命医療集団）による精製を用いて対応するＦａｂ断片を得ることができる。

抗体の発現及び精製
本出願に係る各抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体の配列情報及び番号付け情報を表１〜９に示し、親抗体及び親和力成熟後の子孫抗体の両方が、上記の方法で酵母発現から精製されている。

実施例で使用した下記対照抗体をＨＥＫ２９３細胞で発現し、精製した。２２Ｇ２は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現された百時美施貴宝会社からの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体であり、その軽重鎖可変領域配列は、特許出願ＷＯ２０１６／１０６３０２ Ａ１における抗体「２２Ｇ２」の配列と同じである。３１Ｃ６は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現されたＭＳＤからの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体であり、その軽重鎖可変領域配列は、特許出願ＷＯ２０１６／０２８６５６ Ａ１における抗体「３１Ｃ６」の配列と同じである。１０Ａ７と１Ｆ４は、いずれもＨＥＫ２９３細胞において一過性発現されたＧｅｎｅＴｅｃｈ社からの抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体であり、その軽重鎖可変領域配列は、特許出願ＷＯ２０１５００９８５６Ａ２における抗体「１０Ａ７」、「１Ｆ４」の配列とそれぞれ同じである。４つの対照抗体の定常領域は全て野生型ＩｇＧ４配列を用いた。

ＨＥＫ２９３細胞における抗体の一過性発現のために、ベクターｐＴＴ５を使用した。最初に、抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ単独のｐＴＴ５ベクターにクローニングした。抗体分子の重鎖及び軽鎖を有するｐＴＴ５ベクターを、化学トランスフェクション法を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。使用した化学トランスフェクション試薬はＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）であり、培養されたＨＥＫ２９３細胞を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って一過性トランスフェクションした。まず、クリーンベンチにプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬を準備し、Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）（体積はトランスフェクション体積の１／５）を半分ずつ５０ｍｌの遠心管に入れ、一方に濾過したプラスミド（１３０μｇ／１００ｍｌ）、もう一方に濾過したＰＥＩ（１ｇ／Ｌ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（質量比（プラスミド：ＰＥＩ）＝１：３）、５ｍｉｎ混合し、両者を２０回穏やかに混合し、１５〜３０ｍｉｎ静置し、３０ｍｉｎを超えないようにした。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注入して混合し、細胞を、４８時間ごとに新鮮な培地を流加して３７℃、８％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。７日後又は細胞生存率≦６０％まで連続培養した場合、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離した。上清液を採取し、抗体の純度が９５％を上回るように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで上清液を精製した。

また、完全な抗体ＡＤＩ−３０２６８、ＡＤＩ−３０２７８、ＡＤＩ−３０２８６、ＡＤＩ−３０２８８、ＡＤＩ−３０２９３、ＡＤＩ−３０３０６、ＡＤＩ−３０３３６をＣＨＯ細胞において発現し、精製した。

ＣＨＯ細胞における発現及び精製：ＨｏｒｉｚｏｎのＨＤ−ＢＩＯＰ１（ＧＳ Ｎｕｌｌ ＣＨＯ−Ｋ１）を使用して、製造者の指示に従い、抗体を発現するＣＨＯ細胞株を作製した。まず、抗体分子の重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列を、ＡＴＵＭ社からのｐＤ２５３１プラスミドにそれぞれ挿入した。その後、構築したプラスミドをエレクトロトランスフェクション法を用いてＣＨＯ細胞系に移し、２４時間トランスフェクションした後にＦｏｒｔｅＢｉｏを用いて抗体産生を検出し、トランスフェクション効率を判定した。トランスフェクション後の細胞を加圧スクリーニングして高発現抗体の細胞プール（ｐｏｏｌ）を得た。その後細胞プールを増幅し、抗体を大量に発現させ、細胞上清を集めて、抗体の純度が９５％を上回るようにＰｒｏｔｅｉｎ Ａ及びゲルで上清液を濾過、精製した。

実施例２ 抗体の親和力測定
光干渉による生体測定法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の測定手法を用いて、ヒトＴＩＧＩＴに対する本発明の上記２０個の例示的な抗体の結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。

ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定は従来の方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３．５（２）：ｐ．２７０−８）で行った。

候補抗体ＦａｂとＴＩＧＩＴ−ＦＣの単価親和力の測定：センサーを分析緩衝液の正中線の下で２０分間平衡を保ち、その後、正中線の上で１２０秒検出して基線を立てた。ヒトＴＩＧＩＴ−ＦＣをＡＨＱセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードして、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和性測定を行った。抗原がロードされたセンサーをプラトー期間まで１００ｎＭ Ｆａｂを含有する溶液に置き、その後センサーを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離させることで解離速度を測定した。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。

完全な候補抗体とヒト（ＡＣＲＯ、ＴＩＴ−Ｈ５２Ｈ３）、マウス（ＡＣＲＯ、ＴＩＴ−Ｍ５２Ｅ６）、サルＴＩＧＩＴ−ｈｉｓ（ＡＣＲＯ、ＴＩＴ−Ｃ５２２３）の単価親和力の測定：センサーを分析緩衝液の正中線の下で２０分間平衡を保ち、その後、正中線の上で１２０秒検出して基線を立て、精製した抗体を１ｎｍの厚さまでＡＨＱセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードして、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定を行った。抗体がロードされたセンサーを１００ｎＭのＴＩＧＩＴ−ｈｉｓ抗原に置いてプラトー期間まで作用させた後、センサーを分析緩衝液に移して少なくとも２ｍｉｎ解離させることで解離速度を測定した。１：１結合モデルを利用して動力学的分析を行った。

上記の測定手法に従って行った実験において、２０個の酵母によって発現された候補抗体（Ｆａｂ）のＫ_Ｄ値を表５に示す。

上記の測定手法に従って行った実験において、７個のＣＨＯによって発現された完全な抗体のヒト、マウス、サルＴＩＧＩＴの単価ＫＤを表６に示す。

以上のグラフの結果から、（１）親和力成熟後、各子孫抗体はその親抗体と比べて、ヒトＴＩＧＩＴとの親和力は全て著しく向上したこと、（２）親和力成熟後に選択した７株のＣＨＯ発現抗体とヒトＴＩＧＩＴの親和力は対照抗体と比べて類似又はより高いこと、７株の候補抗体は全てサルＴＩＧＩＴと交差反応できること、７株の候補抗体のうち４株（ＡＤＩ−３０２６８／ＡＤＩ−３０２８６／ＡＤＩ−３０２８８／ＡＤＩ−３０２９３）がマウスと交差反応できることが明らかになった。

実施例３ 抗ＴＩＧＩＴ抗体と細胞上で発現されたヒトＴＩＧＩＴとの結合
フローサイトメトリーに基づく測定手法で本発明の上記２０個の例示的な抗体とＣＨＯ細胞表面に発現されたヒトＴＩＧＩＴとの結合能力を測定した。その結合能力を、ＣＨＯ細胞表面に発現されたヒトＴＩＧＩＴに対する異なる抗体の結合曲線を比較することによって測定した。

具体的には、親和力成熟後、酵母を用いて親抗体及び子孫抗体を発現させた。抗体を得た後（純度が約７０％）、これらの抗体とＣＨＯ細胞表面に発現されたヒトＴＩＧＩＴとの結合実験を行った。具体的な実験過程は、（１）ｐＣＨＯ１．０で構築したヒトＴＩＧＩＴプラスミドを用いてＣＨＯＳ細胞をトランスフェクションし、トランスフェクション後の細胞をメトトレキサート及びピューロマイシンでスクリーニングして安定細胞ｐｏｏｌを得た。（２）異なる濃度の候補抗体を用いて安定細胞ｐｏｏｌと４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＥ標識のマウス抗ヒト二次抗体を用いて、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。ＰＢＳで再び３回洗浄した後、細胞を１００ｕｌのＰＢＳで再懸濁した。（３）フローサイトメトリーを用いてその２チャネルメディアン蛍光強度値を測定した。抗体濃度の１０を底とした対数を横軸、２チャネルメディアン蛍光強度値を縦軸としてプロットし、そのＥＣ５０及び曲線ピーク値を比較した。結果は下記表及び図１に示される（ＥＣ５０：ｎＭ）。

以上の実験結果から以下のことが分かった。（１）親和力成熟後、各子孫抗体はＣＨＯ細胞表面に発現しているヒトＴＩＧＩＴに対する結合能力がその親抗体よりも増強されている（結合曲線の上プラトーがより高いと表現される）。（２）ＣＨＯ細胞表面に発現しているヒトＴＩＧＩＴに対する親和力成熟後の子孫抗体の結合能力はいずれもＧｅｎｅＴｅｃｈ社からの２分子１０Ａ７、１Ｆ４よりも強く、百時美施貴宝会社からの分子２２Ｇ２及びＭＳＤからの分子３１Ｃ６の結合能力に相当する。

また、親和力成熟後、スクリーニングした７分子をＣＨＯ系で発現精製して高純度の抗体を得て、ＣＨＯ細胞表面に発現しているヒトＴＩＧＩＴとの結合実験を行った。上記の測定方法で行われた実験において、ＡＤＩ−３０２６８、ＡＤＩ−３０３３６、ＡＤＩ−３０２９３、ＡＤＩ−３０２８６、ＡＤＩ−３０２８８、ＡＤＩ−３０２７８及びＡＤＩ−３０３０６がＣＨＯ細胞で過発現されたヒトＴＩＧＩＴと結合し、ＥＣ５０値はそれぞれ０．１３９２ｎＭ、０．１３００ｎＭ、０．２２８８ｎＭ、０．１７５８ｎＭ、０．１８６０ｎＭ、０．１３２１ｎＭ及び０．１９９９ｎＭで、対照抗体２２Ｇ２、１Ｆ４とＣＨＯ細胞で過発現されたヒトＴＩＧＩＴとの結合能力よりも高く（対照抗体２２Ｇ２及び１Ｆ４のＥＣ５０値はそれぞれ０．７２４９ｎＭ及び０．６０７３ｎＭである）、対照抗体３１Ｃ６と類似する（ＥＣ５０値は０．１８４６ｎＭである）。対照抗体１０Ａ７は７個の候補抗体と類似のＥＣ５０値（０．１９４９ｎＭ）を有しているが、当該抗体の結合曲線を観察すると、他の７個の候補抗体と比べ、その曲線の上プラトーが低いことが分かった。これはその速い解離特性によると考えられている（図２参照）。従って、７個の候補抗体は、１０Ａ７よりもＣＨＯ細胞表面に発現しているヒトＴＩＧＩＴと結合する能力が高いとも考えられる。

実施例４ 抗ＴＩＧＩＴ抗体のそのリガンドであるＣＤ１５５に対する遮断
候補抗体のリガンド遮断能力を、フローサイトメトリーの方法を用いて測定した。具体的には、ヒトＴＩＧＩＴを安定的に過剰発現するＣＨＯＳ細胞ｐｏｏｌを構築し、マウスＩｇＧ２ａＦＣ断片を有する５０ｎＭのヒトＣＤ１５５タンパク質（ＡＣＲＯ、ＴＩＴ−Ｈ５２５３−１ＭＧ）及び異なる濃度の抗体と細胞を４℃で３０ｍｉｎ同時インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、１％濃度のヒツジ抗マウスＦＣ、ＡＰＣフルオレセイン標識二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０５３０８）を用いて、細胞上に残存するリガンドＣＤ１５５を染色した。ＰＢＳで再び３回洗浄した後、フローサイトメトリーを用いて対応するチャネル（Ｃ６、４チャネル）の蛍光強度中央値を検出した。抗体濃度（ｎＭ）の１０を底とした対数を横軸、各抗体濃度点に対応する蛍光強度中央値を縦軸としてプロットした。ＣＤ１５５に対する異なる抗体の遮断能力を、曲線のＩＣ５０を分析することによって区別した。

ＩｇＧ１を陰性対照抗体、１０Ａ７、２２Ｇ２、３１Ｃ６を陽性対照抗体とし、親和力成熟前後の候補分子のＣＤ１５５に対する遮断能力を検出した。図３及び下記表は、親和力成熟前後の酵母発現抗体のＣＤ１５５に対する遮断能力（ＩＣ５０：ｎＭ）を示す。

実験結果から、ほとんどの親和力成熟後の子孫抗体は、対照抗体２２Ｇ２及び３１Ｃ６と類似し、１０Ａ７よりも高く、その親よりもＣＤ１５５を遮断する能力が向上していることが分かった。

ＣＤ１５５とＴＩＧＩＴの遮断実験には、ＣＨＯで発現された高純度抗体７株を用いた。上記の測定方法で行われた実験において、ＩｇＧ４を陰性対照とし、２２Ｇ２、３１Ｃ６及び１０Ａ７を陽性対照とした。実験結果から、ＡＤＩ−３０２６８、ＡＤＩ−３０３３６、ＡＤＩ−３０２７８のＩＣ５０がそれぞれ０．１４０２ｎＭ、０．１２１９ｎＭ、０．１１６４ｎＭであり、２２Ｇ２（０．６０６９ｎＭ）、３１Ｃ６（０．１６５９ｎＭ）、１０Ａ７（０．３２５２ｎＭ）の３つの対照抗体よりも低いことから、これら３株の抗体が対照抗体よりも高いリガンド（ＣＤ１５５）遮断能力を有し、他の４つの候補抗体ＡＤＩ−３０２９３、ＡＤＩ−３０２８６、ＡＤＩ−３０２８８、ＡＤＩ−３０３０６のＩＣ５０がそれぞれ０．２５１０ｎＭ、０．１８９３ｎＭ、０．２２３８ｎＭ、０．２４２０ｎＭであり、それぞれ対照抗体２２Ｇ２及び１０Ａ７よりも小さいが３１Ｃ６よりも大きいことから、これら４株の抗体が２２Ｇ２及び１０Ａ７よりも強いが３１Ｃ６よりも弱いリガンド（ＣＤ１５５）遮断能力を有することが分かった。結果は下記表及び図４に示される（ＩＣ５０：ｎＭ）。

実施例５ ＭＯＡ方法による候補抗体の生物学的活性の検出
抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合を遮断することにより、ＣＤ１５５による下流ＩＬ２シグナル伝達経路の抑制を解除することができる。本実施例では、Ｐｒｏｍｅｇａ社から提供されるＭＯＡ検出細胞株（Ｊ２２０１）を用いて、蛍光レポーター遺伝子の発現を検出し、ＩＬ２シグナルの活性化状況を反映することにより、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合に対する抗体の抑制作用を検出した。Ｐｒｏｍｅｇａから提供される標準的な方法に従い、ヒトＴＩＧＩＴ及びＩＬ２プロモーター制御下のルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞、ヒトＣＤ１５５及びＴ細胞活性化エレメントを安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞、及び異なる濃度勾配の抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を、３７℃の二酸化炭素細胞培養器で同時インキュベートし、６時間後に蛍光シグナルを検出するという手順で当該検出を行った。

実験の結果から、親和力成熟後の子孫分子（酵母から直接発現し、純度は約７０％）は親分子よりもインビトロ生物学的活性が著しく向上し、ほとんどが２２Ｇ２及び３１Ｃ６の２つの対照抗体と類似するレベルに達したことが分かった。結果は下記表及び図5に示される（EC50：ｎＭ）。

ＭＯＡ生物学的活性実験には、ＣＨＯで発現された高純度抗体７株を用いた。上記の測定方法で行われた実験において、ＩｇＧ４を陰性対照とし、３１Ｃ６を陽性対照とした。実験結果から、当該実験における候補抗体ＡＤＩ−３０２７８のＥＣ５０が０．１８５６ｎＭであり、他の候補抗体及び対照抗体３１Ｃ６（０．３４２４ｎＭ）よりも小さく、そのより高いインビトロ生物学的活性を示し、ＡＤＩ−３０２６８、ＡＤＩ−３０２８６、ＡＤＩ−３０２８８、ＡＤＩ−３０３０６のＥＣ５０がそれぞれ０．５０６５ｎＭ、０．３９６３ｎＭ、０．３８４４ｎＭ、０．３９８４ｎＭであり、対照抗体３１Ｃ６と類似する生物学的活性を示し、ＡＤＩ−３０３３６及びＡＤＩ−３０２９３のＥＣ５０がそれぞれ１．２７４ｎＭ及び１．６２４ｎＭであり、その弱い生物学的活性を示すことが分かった。結果は下記表及び図６に示される（ＥＣ５０：ｎＭ）。

実施例６ 動物のインビボ薬効試験
本実験では、ヒトＴＩＧＩＴノックイン−ＭＣ３８マウス腫瘍モデルを用いて、抗ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍活性を研究した。

候補分子ＡＤＩ−３０２９３及びＡＤＩ−３０２７８の単独投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の、ヒトＴＩＧＩＴノックイン−ＭＣ３８マウスモデルにおける薬力学を研究した。マウス結腸がんＭＣ３８細胞（上海和元生物、ＨＹＣ０１１６）が雌のＴＩＧＩＴトランスジェニックマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）に移植された。細胞移植後６日目、１０日目、１３日目、１７日目に各群のマウスにそれぞれ抗体を皮下注射し、移植後６日目、１０日目、１３日目、１７日目、２１日目、２５日目に腫瘍体積を測定し、その後、マウスを安楽死させた。結果は図７に示される。

図７の実験結果を観察し、本出願の抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体ＡＤＩ−３０２９３及びＡＤＩ−３０２７８は、Ｉｇ４陰性対照抗体と比べ、単独で使用した場合に腫瘍の成長をある程度抑制することが見出された。両方の候補抗体を単独で使用した場合、腫瘍抑制作用は、３１Ｃ６陽性対照と比べ、３１Ｃ６と有意な差はなかった。

さらに、候補分子ＡＤＩ−３０２９３及びＡＤＩ−３０２７８と抗ＰＤ１抗体ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ（ＷＯ２０１７１３３５４０Ａ１）との併用投与（１０＋１ｍｇ／ｋｇ）の、ヒトＴＩＧＩＴノックイン−ＭＣ３８マウスモデルにおける薬力学を研究した。

マウス結腸がん細胞ＭＣ３８（上海和元生物、ＨＹＣ０１１６）をＤＭＥＭ培地で培養した。０．２ｍｌのＤＭＥＭ基礎培地懸濁液中の１×１０^６ＭＣ３８細胞を雌のＴＩＧＩＴトランスジェニックマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ）の右側に移植した。腫瘍の大きさと体重を研究サイクル全体で週２回測定し、腫瘍細胞移植８日後、ノギスを使って腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積を幅２×長さ／２（ｍｍ３）という式に従って計算し、腫瘍体積平均が約７１ｍｍ３のマウスを６匹ずつランダムに群分けし、腫瘍体積が検出の終点に達した場合、又はマウスの体重が２０％以上減少した場合、マウスを安楽死させた。細胞移植後８日目、１２日目、１５日目、１９日目に、各群のマウスにｈ−ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ）及び１０ｍｇ／ｋｇのａｎｔｉ−ＴＩＧＩＴ抗体又はそのアイソタイプ抗体をそれぞれ皮下注射した。終点の腫瘍の平均体積を、細胞移植後２９日目に測定し、その後、実験マウスを安楽死させた。結果は図8に示される。

図８の実験結果を観察すると、抗ＴＩＧＩＴ抗体ＡＤＩ−３０２９３と抗ＰＤ１抗体ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃを併用投与した場合、抗ＴＩＧＩＴ抗体又は抗ＰＤ１抗体の単独投与の場合よりも強い腫瘍抑制効果を示しており、かつＡＤＩ−３０２９３＋ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体の併用効果が３１Ｃ６＋ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体の併用効果よりも高いことが分かった。同様に、ＡＤＩ−３０２７８は、３１Ｃ６＋ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃとの併用効果よりも、ａｎｔｉ−ＰＤ１抗体との併用効果が高かった。

この研究における全ての群のマウスは、接種後２９日目に、マウスの体重に有意な変化はなかった。

Claims (19)

1. ＴＩＧＩＴと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
   （ｉ）配列番号８４、８５、８６又は８７で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０４で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
   （ｉｉ）配列番号８８、８９又は９０で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０５又は１０６で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２および３の配列、
   （ｉｉｉ）配列番号９１、９２又は９３で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０７で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
   （ｉｖ）配列番号９４、９５、９６又は９７で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０８で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、
   （ｖ）配列番号９８、９９又は１００で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１０９で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列、又は、
   （ｖｉ）配列番号１０１、１０２又は１０３で表される重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、２及び３の配列、並びに、配列番号１１０で表される軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、２及び３の配列
   を含む、前記抗体又はその抗原結合断片。
2. 重鎖の３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と、軽鎖の３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含む、ＴＩＧＩＴと結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
   （ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号１、２、３、４又は５で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６、７、８、９又は１０で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１１、１２、１３、１４又は１５で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｂ）ＨＣＤＲ１が配列番号１９、２０又は２１で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２２、２３又は２４で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号２８、２９又は３０で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｃ）ＨＣＤＲ１が配列番号３１、３２又は３３で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３４、３５、３６又は３７で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号３８、３９又は４０で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｄ）ＨＣＤＲ１が配列番号４４、４５、４６又は４７で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号４８、４９、５０、５１又は５２で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号５３、５４、５５又は５６で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｅ）ＨＣＤＲ１が配列番号６０、６１又は６２で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６、６３、６４又は６５で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号６６、６７又は６８で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｆ）ＨＣＤＲ１が配列番号７１、７２、７３又は７４で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２２、７５、７６又は７７で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号７８、７９又は８０で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｇ）ＨＣＤＲ１が配列番号１７８、１７９、１８０又は１８１で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６、７、８又は９で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１８２、１８３、１８４又は１８５で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｈ）ＨＣＤＲ１が配列番号１８６又は１８７で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２２又は２３で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１８８で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号２８又は２９で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号１８９又は１９０で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３４、３５又は３６で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１９１又は１９２で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号４１で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号４２で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号４３で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｊ）ＨＣＤＲ１が配列番号１９３、１９４又は１９５で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号４８、４９、５０又は５１で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１９６、１９７又は１９８で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、且ＬＣＤＲ３が配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含み、
   （ｋ）ＨＣＤＲ１が配列番号１９９又は２００で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６、６３又は６４で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号２０１又は２０２で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号６９で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号７０で表されるアミノ酸配列を含み、又は、
   （ｌ）ＨＣＤＲ１が配列番号２０３、２０４又は２０５で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２２、７５又は７６で表されるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号２０６又は２０７で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号８１で表されるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号８３で表されるアミノ酸配列を含む、
   前記抗体又はその抗原結合断片。
3. （ｉ）配列番号８４、８５、８６又は８７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１０４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｉ）配列番号８８、８９又は９０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１０５又は１０６で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｉｉ）配列番号９１、９２又は９３で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１０７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｖ）配列番号９４、９５、９６又は９７で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１０８で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｖ）配列番号９８、９９又は１００で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１０９で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
   （ｖｉ）配列番号１０１、１０２又は１０３で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１１０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％又は９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
   を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. （ｉ）配列番号８４、８５、８６又は８７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｉ）配列番号８８、８９又は９０で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５又は１０６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｉｉ）配列番号９１、９２又は９３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０７で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｉｖ）配列番号９４、９５、９６又は９７で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０８で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
   （ｖ）配列番号９８、９９又は１００で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０９で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
   （ｖｉ）配列番号１０１、１０２又は１０３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域
   から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. 前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の形態の抗体又はそれらの抗原結合断片であり、好ましくはＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ突然変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
6. 前記抗体が完全ヒト化抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
7. 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体、（Ｆａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体（ｄＡｂ）又は線形抗体から選択される抗体断片である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
8. 前記抗体が、下記特性の１つ以上を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片：
   （ｉ）高親和力でヒトＴＩＧＩＴと結合する特性、
   （ｉｉ）サル及び／又はマウスＴＩＧＩＴとの交差免疫反応をする特性、
   （ｉｉｉ）細胞表面のＴＩＧＩＴと効果的に結合する特性、
   （ｉｖ）ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＣＤ１５５との結合を遮断する特性、
   （ｖ）下流ＩＬ−２シグナル経路におけるＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合の抑制作用を解除する特性、
   （ｖｉ）Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生を増加させる特性、
   （ｖｉｉ）抗腫瘍活性、例えば腫瘍の成長を抑制する特性、
   （ｖｉｉｉ）抗ＰＤ−１抗体との組み合わせによる、より良好な腫瘍抑制作用、例えば、腫瘍成長をより良好に抑制できる特性。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離された核酸。
10. 請求項９に記載の核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターである、前記ベクター。
11. 請求項９に記載の核酸又は請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは原核又は真核であり、より好ましくは酵母細胞又は哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞又はＣＨＯ細胞）である、前記宿主細胞。
12. 抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片の製造方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸の発現に適する条件において、請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること、必要に応じて前記抗体又はその抗原結合断片を単離することを含み、必要に応じて前記宿主細胞から前記抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片を単離することをさらに含む、前記製造方法。
13. 治療剤又は診断剤と接合した請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、免疫複合体。
14. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む多重特異性抗体であって、好ましくは二重特異性抗体である、前記多重特異性抗体。
15. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、必要に応じて医薬品添加物とを含む、医薬組成物。
16. 第２の治療剤を含む請求項１５に記載の医薬組成物であって、好ましくは、前記第２の治療剤が抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体から選択される、前記医薬組成物。
17. 対象における腫瘍又は感染性疾患の予防又は治療方法であって、有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１５又は１６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記腫瘍が結腸がんなどの胃腸管がんである、前記方法。
18. 対象においてＴＩＧＩＴの免疫抑制作用を低減又は解消するようにＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との結合を遮断する方法であって、有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗ＴＩＧＩＴ抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１５又は１６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
19. サンプル中のＴＩＧＩＴの検出方法であって、
    （ａ）サンプルと請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とを接触させること、および
    （ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片とＴＩＧＩＴとによって形成された複合物を検出することとを含み、必要に応じて、前記抗体が検出可能に標識される方法。

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