CN111269315B - 针对bcma的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了针对人BCMA的单克隆抗体及其医学和生物学用途。

Description

针对BCMA的单克隆抗体
相关申请
本申请是中国专利申请第201910532734.7号的分案申请。
技术领域
本申请大体涉及抗体药物领域，具体而言，本申请提供了包含针对人BCMA的单克隆抗体及其医学和生物学用途。
背景技术
双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)是一类人工抗体，其包含两个不同的抗原结合位点。双特异性抗体在生物医药领域，尤其是肿瘤免疫治疗方面应用广泛。靶向CD3的双特异性抗体，一条臂能够结合T细胞表面TCR受体复合物中的CD3E亚基，提供激活T细胞的第一信号，另一条臂靶向肿瘤抗原。双特异性抗体可以将肿瘤细胞和T细胞拉近，激活T细胞的同时直接杀伤肿瘤细胞。
双特异性抗体的平台众多，结构复杂。以抗体结构区分可以分为有Fc段和无Fc段两大类。无Fc段的双特异性抗体由两个抗体的VH区及VL区组成或者由Fab片段组成，此类双特异性抗体的主要代表有BiTE、DART、TandAbs、bi-nanobody等。此类双特异性抗体的优势在于无轻重链错配，缺点在于半衰期短，临床应用不方便。有Fc段的双特异性抗体保留了传统单克隆抗体的结构，并可以介导Fc段的生物学功能。此类双特异性抗体的代表有KIHIgG、crossmab、DVD-Ig、Triomab等，体内半衰期长且可以具有ADCC、CDC活性(Hongyan Liu,Abhishek Saxena,Sachdev S.Sidhu,et al.Fc engineering for DevelopingTherapeutic Bispecifc Antibodies and Novel Scaffolds.Front.Immunol.2017；8:38)。
因此，鉴于双特异性抗体具有广泛的适用性，本领域需要开发新的双特异性抗体。
发明内容
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人CD3E的抗原结合部，所述针对人CD3E的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1(重链CDR1)，
如SEQ ID NO:2所示的HCDR2(重链CDR2)，
如SEQ ID NO:3所示的HCDR3(重链CDR3)，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1(轻链CDR1)，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2(轻链CDR2)，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3(轻链CDR3)；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
第二方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人BCMA的抗原结合部，所述针对人BCMA的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:7所示的HCDR1(重链CDR1)，
如SEQ ID NO:8所示的HCDR2(重链CDR2)，
如SEQ ID NO:9所示的HCDR3(重链CDR3)，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1(轻链CDR1)，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2(轻链CDR2)，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3(轻链CDR3)；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
第三方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人CD3E的抗原结合部和针对人BCMA的抗原结合部。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人BCMA的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:9所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部和所述针对人BCMA的抗原结合部包含相同的轻链可变区。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含两种具有相同铰链区的重链恒定区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中所述第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，所述第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中所述第一和第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第一方面和第三方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含如SEQ ID NO:12所示的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区。
在第二方面和第三方面的一些实施方案中，所述针对人BCMA的抗原结合部包含SEQ ID NO:10所示的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区。
在上述任一方面的一些实施方案中，其中所述针对人CD3E的抗原结合部包含单链抗体(scfv)或Fab片段。
在上述任一方面的一些实施方案中，其中所述针对人BCMA的抗原结合部包含单链抗体(scfv)或Fab片段。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述抗体具有第一臂和第二臂，其中所述第一臂包含针对人CD3E的抗原结合部，所述第二臂包含针对人BCMA的抗原结合部：
所述第一臂包含如SEQ ID NO:12所示的重链可变区氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的重链恒定区氨基酸序列、如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列和如SEQ IDNO:20所示的轻链恒定区氨基酸序列；
所述第二臂包含如SEQ ID NO:10所示的重链可变区氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区氨基酸序列、如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列和如SEQ IDNO:20所示的轻链恒定区氨基酸序列。
第四方面，本申请提供药物组合物，其包含第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体。
第五方面，本申请提供第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体或者第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途。
第六方面，本申请提供了预防或治疗多发性骨髓瘤的方法，包括向有需要的个体给予第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体或者第四方面所述的药物组合物。
附图说明
图1显示了采用ELISA方法检测双特异性抗体CD3ExBCMA同时结合CD3E和BCMA两种抗原的结果。
图2显示了利用流式细胞术分析双特异性抗体CD3ExBCMA与Jurkat人急性T淋巴细胞白血病细胞表面CD3E结合的结果。
图3显示了利用流式细胞术分析双特异性抗体CD3ExBCMA与NCI-H929人浆细胞白血病细胞表面BCMA结合的结果。
图4显示了双特异性抗体CD3ExBCMA介导BCMA阳性肿瘤细胞对jurkat-dual细胞的特异性激活。
图5显示了双特异性抗体CD3ExBCMA介导PBMC对BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤作用结果。
图6显示了双特异性抗体CD3ExBCMA在BCMA阳性肿瘤细胞存在时刺激T细胞表面CD69表达的结果。
图7显示了双特异性抗体CD3ExBCMA治疗的PBMC人源化NCI-H929人源骨髓瘤模型小鼠肿瘤体积的变化结果。
图8显示了双特异性抗体CD3ExBCMA治疗的PBMC人源化NCI-H929人源骨髓瘤模型小鼠体重的变化。
图9显示了双特异性抗体CD3ExBCMA治疗的hCD34+人源化RPMI-8226人源骨髓瘤模型小鼠体重的变化。
图10显示了双特异性抗体CD3ExBCMA治疗的hCD34+人源化RPMI-8226人源骨髓瘤模型小鼠肿瘤体积的变化。
序列说明
SEQ ID NO:1为抗人CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的重链可变区H10B7的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为抗人CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的重链可变区H10B7的HCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为抗人CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的重链可变区H10B7的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为轻链可变区L9B9的LCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5为轻链可变区L9B9的LCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为轻链可变区L9B9的LCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7为抗人BCMA单克隆抗体C4的重链可变区突变体H13F1的HCDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8为抗人BCMA单克隆抗体C4的重链可变区突变体H13F1的HCDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9为抗人BCMA单克隆抗体C4的重链可变区突变体H13F1的HCDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为抗人BCMA单克隆抗体C4的重链可变区突变体H13F1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11为抗人BCMA单克隆抗体C4的重链可变区C4VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为抗人CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的重链可变区H10B7的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13为抗人CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的轻链可变区L1G10的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14为轻链可变区L9B9的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15为铰链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16为抗人BCMA单克隆抗体C4的轻链可变区C4VK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17为人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18为人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-H的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19为人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1m3-K的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20为人κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21为人λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22为人CD3E胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23为人CD3D胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24为猴CD3E胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25为猴CD3D胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26为小鼠CD3E胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27为小鼠CD3D胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28为人BCMA胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29为猴BCMA胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30为小鼠BCMA胞外区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31为His标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32为小鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33为异源二聚体的人IgG1亚型的Fc突变体FcK的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34为异源二聚体的人IgG1亚型的Fc突变体FcH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35为人IgG1亚型抗体重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36为人IgG1亚型抗体重链恒定区突变体IgG1H的氨基酸序列。
发明详述
定义
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
在本文描述抗体结构时，涉及氨基酸位置编号的描述参照人IgG1抗体的EUnumbering定义，这是本领域技术人员公知且容易查询到的。此外，在本文结合EUnumbering位置描述突变时，是指相对于天然抗体序列产生的突变。
本文所用术语“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。参照人IgG1抗体的EUnumbering定义，Fc片段是抗体恒定区中第216-447位的氨基酸序列。
本文所用术语“Fab(fragment antigen binding)片段”、“Fab部分”或类似的术语是指完整的抗体用木瓜蛋白酶处理后产生的能够与抗原结合的抗体片段，包括完整的轻链(VL-CL)、重链可变区和CH1片段(VH-CH1)。
本文所用术语“单链抗体(scfv,single chain fragment variable)”是指一般利用基因工程技术构建的单链结构的抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的一条多肽链。在重链可变区和轻链可变区之间通常会设计一段柔性的连接肽(linker)以便重链可变区和轻链可变区可以折叠成为能够结合抗原的正确构象。
本文所用术语“抗原结合部”是指抗体结构中决定抗原结合能力的部分。本领域技术人员能够理解，抗体结构中决定抗原结合能力的主要部分是CDR，因此CDR也是抗原结合部的核心组成部分。在双特异性抗体构建中，“抗原结合部”的例子包括但不限于单链抗体(scfv)或Fab片段。
本文所用术语“双特异性抗体”是指具有结合两种不同抗原能力的抗体，其可以由两个Fc片段以及分别与其融合的两个抗原结合部组成。
在一些实施方案中，本文中的“双特异性抗体”是指基于人IgG1抗体的双特异性抗体，并且除了本文说明的改变结构之外，其具备人IgG1抗体的基本特征和功能。本领域技术人员公知本文中的“双特异性抗体”也可以基于其他免疫球蛋白亚型，例如人IgG2抗体。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即kabat定义和Chothia定义(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani etal.，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989))。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Kabat定义或者Chothia定义来确定VH和VL序列中CDR区序列。在本申请的实施方案中，利用Kabat定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列中CDR区序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，也是成熟T细胞的特征性标志。CD3由γ、δ、ε和δ四种链或γ、δ、ε、δ和ε(δ和ε为同源异构体)五种链组成，以CD3γε、CD3δε和CD3δδ(或CD3δε)3种二聚体组成并表达于T细胞膜上。CD3γ、δ和ε三条链中含有高度保守的酸性氨基酸残基(γ为谷氨酸，δ和ε为天冬氨酸)，可以与T细胞受体(TCR)α和β链上的碱性氨基酸残基通过盐桥以非共价键相连形成稳定的TCR-CD3复合物结构。该复合物可以传导T细胞激活信号并稳定TCR结构。CD3各链的胞内区中均含有ITAM(免疫受体酪氨酸活化基序)结构，该结构是CD3分子介导细胞内信号转导的基础。当TCR特异性识别并结合抗原(MHC分子提呈的抗原肽)后，T细胞内的酪氨酸蛋白激酶磷酸化ITAM上的酪氨酸残基，募集含有SH2结构域的酪氨酸蛋白激酶(ZAP-70)，将信号转导到T细胞胞浆内，启动细胞内活化机制，因此CD3有传导TCR识别抗原产生的激活信号的功能，是诱导T细胞活化的第一信号。
B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)是TNF受体超家族的第17号成员，作为一种非糖基化的III型跨膜蛋白受体，BCMA由184个氨基酸残基组成，其胞内区含80个氨基酸残基，胞外区只有一个糖类识别结构域。BCMA作为一种浆细胞表面特异抗原，参与B细胞成熟分化，并作为必需物质参与浆细胞长期存活。BCMA、TACI和BAFFR分别和诱导增殖配体(APRIL)、B细胞激活因子(BAFF)两种配体结合，通过NFκB通路参与激活p38、Elk、c-Jun等信号转导分子，影响B细胞成熟、生长和存活。但BCMA对B细胞存活并不是关键的，有资料显示BCMA敲除后小鼠浆细胞的短期免疫球蛋白的产生、早期体液免疫反应及B淋巴细胞的发育等并不受影响(Christine M.Coquery,Loren D.Erickson.Regulatory Roles ofthe Tumor Necrosis Factor Receptor BCMA.Crit Rev Immunol.2012；32(4):287–305)。BCMA的表达具有选择性，在幼稚B细胞、记忆B细胞、CD34+造血细胞及其他正常组织中均未表达，在浆细胞的分化过程中选择性诱导表达，主要表达于浆细胞样树突细胞和骨髓浆细胞上。多发性骨髓瘤是一种细胞恶性增殖、癌变引起的B细胞恶性肿瘤。其主要表现为浆细胞在骨髓中不受控制的扩增，产生大量的单克隆免疫球蛋白，导致骨破坏、血钙升高、贫血、肾损害、免疫下降等一系列症状。BCMA在骨髓瘤细胞上的表达量显著高于浆细胞及浆母细胞，从单克隆丙种球蛋白病到冒烟型骨髓瘤到多发性骨髓瘤，BCMA在整个浆细胞恶性疾病病程进程中都高度、广泛表达(Shih-Feng Cho,Kenneth C.Anderson,Yu-TzuTai.Targeting B Cell Maturation Antigen(BCMA)in Multiple Myeloma:PotentialUses of BCMA-Based immunotherapy.Front.Immunol.2018；9:1821)。
第一方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人CD3E的抗原结合部，所述针对人CD3E的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
第二方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人BCMA的抗原结合部，所述针对人BCMA的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:9所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
第三方面，本申请提供了双特异性抗体，其包含针对人CD3E的抗原结合部和针对人BCMA的抗原结合部。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人BCMA的抗原结合部包含：
如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:9所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
在第三方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部和所述针对人BCMA的抗原结合部包含相同的轻链可变区。
在第三方面的一些具体实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部和所述针对人BCMA的抗原结合部包含相同的轻链，该实施方案有利于轻链和重链的正确装配，也是优选的一种实施方案。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，包含两种具有相同铰链区的重链恒定区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，其替换天然人IgG1抗体恒定区的第216-230位序列，抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中第一重链恒定区的第354和366位的氨基酸分别为C和W，第二重链恒定区的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
当构建保留抗体Fc结构域的双特异性抗体时，可以从以下两个角度优化双特异性抗体的结构：一是重链异聚化，二是轻链和重链的正确装配。在一些实施方案中，两种Fc片段包含能够确保重链异聚化的突变。KIH技术(knob-in-hole，KIH)是解决重链异聚化的一种策略。通常，KIH技术是指通过改造CH3区的氨基酸序列，形成有利于异种半抗体相互配对的结构，可以在构成双特异性抗体的同时又尽可能地保持正常抗体的结构。在一些实施方案中，所利用的KIH技术包括，使一个Fc片段的第354和366位的氨基酸分别为C和W，另一个Fc片段的第349、366、368和407位的氨基酸分别为C、S、A和V。关于KIH技术的指导，例如可参见“An efficient route to human bispecific IgG”,A.Margaret Merchant et al.,Nature Biotechnology,Volume 16,1998，通过引用的方式将该文献全文并入本文。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体，其包含第一重链恒定区和第二重链恒定区，其中第一和第二重链恒定区的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S；抗体恒定区氨基酸位置按照EU numbering确定。
在第三方面的一些实施方案中，两种重链恒定区的CH2片段的第234、235和331位的氨基酸分别为F、E和S，其能够降低抗体Fc段介导的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)，从而可能减少双特异性抗体在体内导致的副作用。关于上述突变的指导，例如可参见“Thebinding affinity of human IgG for its high affinity Fc receptor is determinedby multiple amino acids in the CH2 domain and is modulated by the hingeregion”,Stephen M.Canfield et al.,J.Exp.Med.Volume 173,1991，通过引用的方式将该文献全文并入本文。
在第一和第三方面的一些实施方案中，针对人CD3E的抗原结合部包含如SEQ IDNO:12(包含如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3)所示的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区(包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3)。
在第二和第三方面的一些实施方案中，针对人BCMA的抗原结合部包含SEQ ID NO:10(包含如SEQ ID NO:7所示的HCDR1、如SEQ ID NO:8所示的HCDR2和如SEQ ID NO:9所示的HCDR3)所示的重链可变区和如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区(包含如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3)。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含单链抗体(scfv)或Fab片段。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述针对人BCMA的抗原结合部包含单链抗体(scfv)或Fab片段。
由于双特异性抗体具有针对两种不同抗原的两个不同抗原结合部，而抗原结合部可以包含单链抗体(scfv)或Fab片段两种形式，那么针对给定的两种抗原时，双特异性抗体的抗原结合部配置可以具有四种组合方式：Fab+Fab、Fab+scfv、scfv+Fab和scfv+scfv。
在上述任一方面的一些具体实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含Fab片段，所述针对人BCMA的抗原结合部包含Fab片段。
在上述任一方面的一些具体实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含Fab片段，所述针对人BCMA的抗原结合部包含单链抗体(scfv)。
在上述任一方面的一些具体实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含单链抗体(scfv)，所述针对人BCMA的抗原结合部包含Fab片段。
在上述任一方面的一些具体实施方案中，所述针对人CD3E的抗原结合部包含单链抗体(scfv)，所述针对人BCMA的抗原结合部包含单链抗体(scfv)。
在本文中，还将双特异性抗体描述为具有两个“臂”，以中间为界，可以将双特异性抗体分为两个臂。双特异性抗体的臂可以由Fc片段和抗原结合部(Fab片段或单链抗体)组成。对于由Fc片段和Fab片段组成的臂，其结构类似于通常的抗体，含有完整的重链和轻链，因此这样的臂的结构可以表示为Fc+Fab，也可以表示为重链(Fc+Fab中的重链可变区和CH1片段)+轻链(Fab中的轻链部分)。当两个臂都含有Fab片段形式的抗原结合部时，由此形成的双特异性抗体的结构接近于天然抗体，是优选的一种实施方案。
在第三方面的一些实施方案中，其中所述抗体具有第一臂和第二臂，其中第一臂包含针对人CD3E的抗原结合部，第二臂包含针对人BCMA的抗原结合部：
所述第一臂包含如SEQ ID NO:12所示的重链可变区氨基酸序列、如SEQ ID NO:19所示的重链恒定区氨基酸序列、如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列和如SEQ IDNO:20所示的轻链恒定区氨基酸序列；
所述第二臂包含如SEQ ID NO:10所示的重链可变区氨基酸序列、如SEQ ID NO:18所示的重链恒定区氨基酸序列、如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区氨基酸序列和如SEQ IDNO:20所示的轻链恒定区氨基酸序列。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体的重链恒定区是人IgG1亚型或者选定的人IgG1亚型的各种突变体，例如：IgG1H、IgG1K、IgG1m3-H或者IgG1m3-K。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述双特异性抗体的轻链恒定区是人κ亚型或人λ亚型，优选为人κ亚型。
第四方面，本申请提供药物组合物，其包含第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体。
在一些实施方案中，药物组合物还包含药学可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。
在一些实施方案中，药物组合物用于预防或治疗多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，药物组合物还可包含润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第五方面，本申请提供第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体或者第四方面所述的药物组合物在制备用于预防或治疗多发性骨髓瘤的药物中的用途。
第六方面，本申请提供了预防或治疗多发性骨髓瘤的方法，包括向有需要的个体给予第一至第三方面中任一方面所述的双特异性抗体或者第四方面所述的药物组合物。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例
实施例1重组蛋白的制备
制备和鉴定CD3ExBCMA双特异抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人CD3E胞外区(hCD3E，SEQ ID NO：22)、人CD3D胞外区(hCD3D，SEQ ID NO：23)、猴CD3E胞外区(mfCD3E，SEQ ID NO：24)、猴CD3D胞外区(mfCD3D，SEQ ID NO：25)、小鼠CD3E胞外区(mCD3E，SEQ ID NO：26)、小鼠CD3D胞外区(mCD3D，SEQ ID NO：27)以及人BCMA胞外区(hBCMA，SEQ ID NO：28)、猴BCMA胞外区(mfBCMA，SEQ ID NO：29)、小鼠BCMA胞外区(mBCMA，SEQ ID NO：30)。这些重组蛋白都有大量的翻译后修饰(如糖基化或二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为了方便纯化，非抗体类的重组蛋白在C端添加His标签(SEQ ID NO：31)，或者小鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ IDNO：32)，或者基于KIH(Knob-Into-Hole)技术形成异源二聚体的人IgG1亚型的Fc突变体(FcK，SEQ ID NO：33或者FcH，SEQ ID NO：34)。在制备重组抗体时，抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO：35)或者选定的人IgG1亚型的各种突变体，如：IgG1H(SEQ ID NO：36)、IgG1K(SEQ ID NO：17)、IgG1m3-H(SEQ ID NO：18)或者IgG1m3-K(SEQ ID NO：19)，轻链恒定区是人κ亚型(SEQ ID NO：20)或人λ亚型(SEQ ID NO：21)
根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签、mFc或者Fc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或其它转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。而mFc融合表达的重组蛋白和重组抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
实施例2共同轻链的筛选及鉴定
2.1共同轻链的筛选
H10B7+L1G10为利用人抗体库技术筛选获得的结合人CD3E的单克隆抗体，H10B7+L1G10的重链可变区H10B7氨基酸序列为SEQ ID NO：12，轻链可变区L1G10氨基酸序列为SEQID NO：13(参见中国专利申请第201910372193.6号中SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列)。
C4为靶向肿瘤抗原BCMA的单克隆抗体，重链可变区C4VH氨基酸序列为SEQ ID NO：11，轻链可变区C4VK氨基酸序列为SEQ ID NO：16(参见US9273141B2中单克隆抗体CA8-J7M0的序列)。
单克隆抗体C4和H10B7+L1G10各自的抗体功能和性质已经过实验确认。
基于已建立的双载体噬菌体呈现系统，采用轻链置换的策略(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例4)，以抗CD3E单克隆抗体H10B7+L1G10的重链可变区H10B7为基础，以CD3E/CD3D作为筛选抗原，对原始轻链库进行2轮的筛选和富集；然后以抗BCMA单克隆抗体C4的重链为基础，用BCMA作为抗原，对上述经CD3E/CD3D富集后的轻链库进行2轮筛选和富集，最后对获得的轻链进行鉴定，得到能够同时保持抗CD3E抗体和抗BCMA抗体活性的共同轻链可变区L9B9(SEQ ID NO：14)。
利用常规的分子生物学手段，将重链可变区H10B7、C4的重链可变区C4VH及轻链可变区L9B9分别克隆至融合有人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的真核表达载体，组合表达全抗体H10B7+L9B9和C4VH+L9B9。
2.2共同轻链BCMA抗体C4VH+L9B9结合人BCMA亲和力测定
利用Biacore X100通过表面等离子共振技术测定抗BCMA抗体(C4和C4VH+L9B9)的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、CM5芯片(BR100012)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠溶液稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约多至10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗BCMA抗体至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，保证400RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hBCMA-his设置一系列的浓度梯度(例如0.617nM、1.85nM、5.56nM、16.7nM、50nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为1800s，以10μL/min注射3M的MgCl2溶液30s对芯片表面进行再生。使用BiacoreX100评估软件2.0.1版本，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Kon)和解离速率(Koff)。以比率Koff/Kon计算解离平衡常数(KD)。拟合结果如表1所示。
表1.抗BCMA抗体结合人BCMA亲和力常数
Kon Koff KD
C4 4.333E+5 7.948E-5 1.834E-10
C4VH+L9B9 3.238E+5 9.554E-4 2.950E-9
实施例3 BCMA抗体亲和力成熟
3.1 C4重链突变库的筛选
利用常规分子生物学手段，通过在重链可变区C4VH的CDR3区引入突变，构建基于重链可变区C4VH的CDR3突变库，设计的突变方案如表2所示，构建库容1.2×10E8，正确率为86.7％。
表2.基于C4重链可变区C4VH的CDR3突变库的突变方案
Figure BDA0002428702740000181
Figure BDA0002428702740000191
基于双载体噬菌体展示系统(参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例5)，通过固相筛选的方法，利用hBCMA-His抗原对构建的C4VH-CDR3突变库共进行3轮筛选富集，最终得到亲和力提高的重链可变区突变体H13F1(SEQ ID NO:10)。
3.2 C4重链突变体亲和力测定
利用常规的分子生物学手段，将编码C4重链可变区突变体H13F1和轻链可变区L9B9的核苷酸序列分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区的核苷酸序列的真核表达载体，组合表达全抗体。参照实施例2.2，利用Biacore X100对C4突变体(IgG1亚型)进行亲和力分析，结果见表3。
表3.抗BCMA抗体结合人BCMA亲和力常数
Kon Koff KD
C4VH+L9B9 5.307E+5 8.156E-4 1.537E-9
H13F1+L9B9 7.85E+5 4.284E-4 5.429E-10
实施例4双特异性抗体的制备
分别将编码抗CD3E单克隆抗体的重链可变区H10B7和抗BCMA单克隆抗体的重链可变区H13F1的核苷酸序列克隆至合适的真核表达载体，构建基于共同轻链的异源二聚体。即将编码抗CD3E抗体的重链可变区的核苷酸序列克隆至融合有编码Knob突变的IgG1恒定区IgG1m3-K的核苷酸序列的真核表达载体，将编码抗BCMA抗体的重链可变区的核苷酸序列克隆至含有编码Hole突变的IgG1恒定区IgG1m3-H的核苷酸序列的真核表达载体，将编码共同轻链L9B9的可变区VK的核苷酸序列克隆至融合有编码人轻链恒定区CK的核苷酸序列真核表达载体。
将构建的表达H10B7-IgG1m3-K、表达H13F1-IgG1m3-H和表达L9B9VK-CK的3个真核表达载体利用脂质体共转染入HEK293F细胞，在无血清悬浮培养条件下培养3-5天，然后通过离心等方式收获培养上清。培养上清中双特异性抗体用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行纯化，然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其它合适的缓冲液。将脱盐后蛋白溶液通过尺寸排阻层析(SEC)使用Superdex200(GE)纯化得到目的蛋白。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃备用。
实施例5双特异性抗体的亲和力分析
参照实施例2.2，利用Biacore X100通过表面等离子共振技术对抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9、抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9和CD3ExBCMA双特异性抗体进行亲和力测定。
测定抗BCMA单克隆抗体和CD3ExBCMA双特异性抗体对BCMA抗原的亲和力时，将抗人IgG(Fc)抗体偶联至CM5芯片表面，稀释抗体蛋白至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，BCMA单克隆抗体保证400RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获，CD3ExBCMA双特异性抗体保证800RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将BCMA-his设置一系列的浓度梯度(例如0.617nM、1.85nM、5.56nM、16.7nM、50nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为1800s，以10μL/min注射3M的MgCl2溶液30s对芯片表面进行再生。亲和力拟合结果见表4和表5。
表4.抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9和CD3xBCMA双特异性抗体结合人BCMA的亲和力常数
Kon Koff KD
H13F1+L9B9 1.174E+6 4.161E-4 3.544E-10
CD3ExBCMA 1.063E+6 3.236E-4 3.045E-10
表5.抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9和CD3xBCMA双特异性抗体结合猴BCMA的亲和力常数
Kon Koff KD
H13F1+L9B9 6.63E+5 3.289E-3 4.961E-9
CD3ExBCMA 6.551E+5 3.26E-3 4.976E-9
测定抗CD3E单克隆抗体和CD3ExBCMA双特异性抗体对CD3E抗原的亲和力时，将抗人Fab抗体(人Fab捕获试剂盒，GE，28-9583-25)偶联至CM5芯片表面，稀释抗体蛋白至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，抗CD3E单克隆抗体保证70RU左右的抗体被抗人Fab的抗体捕获，CD3xBCMA双特异性抗体保证150RU左右的抗体被抗人Fab的抗体捕获。将人CD3E异源二聚体CD3E-FcK/CD3D-FcH设置一系列的浓度梯度(例如12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为600s，以10μL/min注射10mM、pH 2.1的甘氨酸-HCl 60s对芯片表面进行再生。亲和力拟合结果如表6所示。
表6.抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9和CD3ExBCMA双特异性抗体结合人CD3E亲和力常数
Kon Koff KD
H10B7+L9B9 1.750E+5 3.075E-3 1.757E-8
CD3ExBCMA 1.179E+5 2.838E-3 2.408E-8
实施例6双特异性抗体同时识别CD3E和BCMA两种抗原的能力鉴定
利用常规ELISA方法检测双特异性抗体CD3ExBCMA(CD3ExBCMA BsAb)对CD3E和BCMA两种抗原同时结合的能力。
用CD3E-FcK/CD3D-FcH抗原包被96孔ELISA板(3μg/mL、100μL/孔)，4℃冰箱包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％Tween20-3％牛奶在37℃封闭1小时后，分别加入抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9、抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9和CD3ExBCMA双特异性抗体(10μg/mL、100μL/孔)，各两个复孔，37℃孵育1小时。用PBS-0.1％Tween20洗涤ELISA板，然后加入BCMA-His抗原(1μg/mL、100μL/孔)，37℃孵育1小时。用PBS-0.1％Tween20洗涤ELISA板，然后加入HRP小鼠抗his IgG(康为世纪，cw0285M)，37℃孵育1小时。用PBS-0.1％Tween20洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，利用酶标仪测定492nm/630nm双波长处的光密度值。ELISA分析结果如图1所示，CD3ExBCMA双特异性抗体能够同时识别CD3E和BCMA两种抗原。
实施例7双特异性抗体识别细胞表面CD3E和BCMA的能力鉴定
取生长对数期的Jurkat人急性T淋巴细胞白血病细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，离心后用含1％BSA的PBS缓冲液重悬至2×106个/mL，100μL/孔铺于96孔V底板中。取抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9和双特异性抗体CD3ExBCMA进行梯度稀释，抗CD3E单克隆抗体3μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点；双特异性抗体6μg/mL，3倍梯度稀释，8个浓度点。取100μL抗CD3E单克隆抗体或100μL双特异性抗体，加入含细胞的孔中，4℃孵育1小时。然后用200μL PBS溶液洗3遍，孵育羊抗人IgG-FITC(中杉金桥，ZF-0308)100μL每孔，4℃避光30分钟。然后用200μL PBS溶液洗3遍，100μL PBS溶液重悬后用流式细胞仪(ACEA，Novocyte)检测FITC通道。结果显示CD3ExBCMA双特异性抗体能很好地结合CD3阳性细胞Jurkat(图2)。双特异性抗体CD3ExBCMA的KD值为16.79nM，抗CD3E单抗的KD值为1.43nM。
取生长对数期的NCI-H929人浆细胞白血病细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，离心后用含1％BSA的PBS缓冲液重悬至2×106个/mL，100μl/孔铺于96孔V底板中。取抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9和双特异性抗体CD3ExBCMA梯度稀释，抗BCMA单克隆抗体10μg/mL，3倍梯度，8个浓度点；双特异性抗体20μg/mL，3倍梯度，8个浓度点。取100μL抗BCMA单克隆抗体或100μL双特异性抗体，加入含细胞的孔中，4℃孵育1小时。然后用200μLPBS溶液洗3遍，孵育羊抗人IgG-FITC(中杉金桥，ZF-0308)100μL每孔，4℃避光30分钟。后用200μL PBS溶液洗3遍，100μL PBS溶液重悬后用流式细胞仪(ACEA，Novocyte)检测FITC通道。结果显示双特异性抗体CD3ExBCMA能很好的结合BCMA阳性细胞NCI-H929(图3)。双特异性抗体CD3ExBCMA的KD值为8.27nM，抗BCMA单克隆抗体的KD值为8.47nM。
实施例8双特异性抗体介导BCMA阳性肿瘤细胞对Jurkat-Dual细胞的特异性激活
收集生长对数期的NCI-H929人浆细胞白血病细胞(BCMA高表达，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。离心后用1640培养基重悬至4×105个/mL，50μL/孔铺于细胞板中。收集生长对数期的Jurkat-dual细胞(购自Invivogen)，离心后用1640培养基重悬至1×106个/mL，100μL/孔加入细胞板中以获得5：1的最终E:T比例。然后加入起始浓度为10μg/mL，3倍梯度稀释，10个浓度点的双特异性抗体CD3ExBCMA(50μL/孔)，或者起始浓度为5μg/mL，3倍梯度稀释，10个浓度点的抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9(50μL/孔)，或者抗CD3E单克隆抗体H10B7+L9B9和抗BCMA单克隆抗体H13F1+L9B9的联合，单克隆抗体均为起始浓度5μg/mL，3倍梯度稀释，10个浓度点。孵育20小时后，取上清，参照QUANTI-LucTM说明书(QUANTI-LucTM，Invivogen，rep-qlc2)检测和分析CD3ExBCMA双特异性抗体、抗CD3E单克隆抗体、抗CD3E单克隆抗体和抗BCMA单克隆抗体联合，这3种不同条件下介导的BCMA阳性肿瘤细胞对Jurkat-Dual细胞的特异性激活。结果显示，只有CD3ExBCMA双特异性抗体可以介导BCMA阳性肿瘤细胞激活Jurkat-Dual细胞，单独的抗CD3E单克隆抗体、或者抗CD3E单克隆抗体和抗BCMA单克隆抗体联合的时候，都不能介导BCMA阳性肿瘤细胞激活Jurkat-Dual细胞(图4)。
实施例9双特异性抗体介导T细胞对BCMA阳性肿瘤细胞的杀伤
9.1人外周血单核细胞(PBMC)的分离
采集正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：
1.年龄大于18周岁；
2.无HIV、HBV感染；
3.血常规检测正常；
4.非孕妇或哺乳期妇女。
利用Ficoll密度梯度离心法从志愿者全血中分离得到PBMC，并培养于1640培养基中。
9.2双特异性抗体介导PBMC杀伤BCMA阳性肿瘤细胞的检测
NCI-H929人浆细胞白血病细胞(BCMA高表达)、RPMI-8226人多发性骨髓瘤细胞(BCMA中度表达)、HL60人急性早幼粒白血病细胞(BCMA阴性)均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。收集生长对数期的细胞离心后用1640培养基重悬至4×105个/mL，50μL/孔铺于细胞板中。然后加入起始浓度为1μg/mL，4倍梯度稀释，10个浓度点的双特异性抗体CD3ExBCMA，50μL每孔，最后加入100μL/孔的PBMC(效应物)以获得5:1的最终E:T比例。同时设置单独靶细胞对照(NCI-H929细胞、RPMI-8226细胞或者HL60细胞)、单独效应细胞对照(PBMC)、单独培养基空白对照，并用培养基将体积补齐至200μL。孵育20小时后，取上清，参照
Figure BDA0002428702740000241
非放射性细胞毒性检测试剂说明书(
Figure BDA0002428702740000242
Non-RadioactiveCytotoxicity Assay，promega，G1780)检测和分析双特异性抗体介导的T细胞对肿瘤细胞的杀伤率。结果显示，在双特异性抗体CD3ExBCMA存在时效应细胞对高表达的NCI-H929细胞和中度表达的RPMI-8226细胞都有明显的杀伤，对阴性的HL60没有表现出杀伤作用(图5)，说明双特异性抗体CD3ExBCMA可以有效介导T细胞对BCMA阳性表达量不同细胞的杀伤，不能介导对BCMA阴性细胞的杀伤。
实施例10双特异性抗体特异刺激T细胞表面活化分子表达
收集生长对数期的NCI-H929人浆细胞白血病细胞(BCMA高表达)、RPMI-8226人多发性骨髓瘤细胞(BCMA中度表达)、HL60人急性早幼粒白血病细胞(BCMA阴性)。离心后用1640培养基重悬至4×105个/mL，50μL/孔铺于细胞板中。然后加入起始浓度为1μg/mL，4倍梯度稀释，10个浓度点的双特异性抗体CD3ExBCMA，50μL/孔，最后加入100μL/孔的PBMC(效应物)以获得5:1的最终E:T比例。孵育20小时后，350g离心5分钟并用PBS洗1遍，用抗人CD3(ebioscience,17-0037-42)和抗人CD69(ebioscience,11-0069-42)流式抗体4℃避光孵育30分钟，然后用200μL PBS溶液洗2遍，100μL PBS溶液重悬后上流式(ACEA，Novocyte)检测，比较用双特异性抗体CD3ExBCMA处理后CD3阳性细胞群中活化标志物CD69的表达差异。结果显示，双特异性抗体CD3ExBCMA在高表达BCMA的NCI-H929或中度表达BCMA的RPMI-8226存在的条件下对T细胞有特异性活化，双特异性抗体CD3ExBCMA在阴性的HL60存在条件下不能活化T细胞(图6)，说明双特异性抗体CD3ExBCMA在BCMA阳性表达量不同的细胞存在条件下可以有效活化T细胞，在BCMA阴性细胞存在的条件下无法活化T细胞。
实施例11双特异性抗体在PBMC免疫重建模型小鼠体内的抑瘤活性
采集正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由发明人及其同事作为志愿者提供，所有志愿者均已签署知情同意书。志愿者的纳入标准为：
1.年龄大于18周岁；
2.无HIV、HBV感染；
3.血常规检测正常；
4.非孕妇或哺乳期妇女。
使用Ficoll密度梯度离心法从健康人外周血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。选取25只7-8周龄雌性NPG小鼠(北京维通达生物技术有限公司)，在NPG小鼠右侧皮下接种5×106个NCI-H929细胞，接种当天定义为第0天。在肿瘤细胞接种2h后，每只小鼠腹腔接种5×106个人PBMC。待肿瘤平均体积95mm3时，根据肿瘤大小随机分组，试验分为双特异性抗体CD3ExBCMA 0.1mg/kg组(第2组)、双特异抗体CD3ExBCMA 0.02mg/kg组(第3组)及溶媒对照组(第1组)共3组，每组6只，尾静脉注射给药，给药一次。第一次给药4天后，第2组剂量更改为0.5mg/kg，第3组剂量更改为0.1mg/kg，按每周两次给药频率再给药三次。根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
结果显示双特异性抗体CD3ExBCMA在0.1/0.5mg/kg剂量下，具有显著抑制肿瘤生长的作用，相对肿瘤抑制率TGI(％)为95％，p<0.001(图7)。同时双特异性抗体CD3ExBCMA在0.02/0.1mg/kg和0.1/0.5mg/kg剂量下，各治疗组均无动物死亡，没有表现明显的药物毒性，治疗期间耐受良好(图8)。
实施例12双特异性抗体在hCD34+人源化模型小鼠体内的抑瘤活性
选取20只20-24周雌性hCD34+人源化小鼠(购自澎立生物)，将100μL 1ⅹ107个RPMI8226细胞和100μL Matrigel混匀后通过皮下注射接种于小鼠背部右侧，接种前用3-4％异氟烷将小鼠麻醉。当肿瘤生长到平均约50-80mm3左右时，16只荷瘤小鼠根据外周血中hCD34+的比例和肿瘤体积被随机分成2组，每组8只。分组给药当天定义为第0天。试验分为双特异性抗体CD3ExBCMA 0.01mg/kg给药组及阴性对照组(IgG1m3，0.01mg/kg)2组，每组8只，尾静脉注射给药，按每周一次给药频率共给药4次。根据相对肿瘤抑制率(TGI)进行疗效评价，根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价。
实验过程中动物精神状态普遍良好，体内实验结束时(第34天)，和阴性对照组(IgG1m3 i.v.0.01mg/kg剂量组，G1组)相比，给药组(G2组)动物体重无显著性差异(P>0.05)，各组动物在各个时间点体重变化趋势见图9。双特异性抗体CD3ExBCMA在0.01mg/kg剂量下，具有显著抑制肿瘤生长的作用，相对肿瘤抑制率TGI(％)为61.17％。肿瘤生长情况见图10。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京智仁美博生物科技有限公司
<120> 针对BCMA的单克隆抗体
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Gly Met His
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Met Gly Tyr Trp His Phe Gly Leu
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ala Ser Ser Arg Pro Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Arg Leu Pro Val Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Ala Val Tyr Ala Gly Tyr Asp Val Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Val Tyr Ala Gly Tyr Asp Val Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Met Gly Tyr Trp His Phe Gly Leu Trp Gly Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Ser
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Lys Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Leu Pro Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Arg Lys Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 18
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 19
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 22
<211> 105
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro
20 25 30
Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp
35 40 45
Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys
50 55 60
Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg
65 70 75 80
Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg
85 90 95
Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
100 105
<210> 23
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro
65 70 75 80
Ala Thr Val Ala
<210> 24
<211> 96
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 24
Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Gln
1 5 10 15
Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Ser Gln His Leu
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys Asn Lys Glu Asp Ser
35 40 45
Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu Met Glu Gln Ser Gly
50 55 60
Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro Glu Asp Ala Ser His
65 70 75 80
His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
85 90 95
<210> 25
<211> 84
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 25
Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Lys Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Thr
20 25 30
Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Ala
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Val Glu Leu Asp Pro
65 70 75 80
Ala Thr Leu Ala
<210> 26
<211> 87
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 26
Asp Asp Ala Glu Asn Ile Glu Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Ser
1 5 10 15
Val Glu Leu Thr Cys Pro Leu Asp Ser Asp Glu Asn Leu Lys Trp Glu
20 25 30
Lys Asn Gly Gln Glu Leu Pro Gln Lys His Asp Lys His Leu Val Leu
35 40 45
Gln Asp Phe Ser Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Thr
50 55 60
Pro Ala Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys
65 70 75 80
Glu Tyr Cys Val Glu Val Asp
85
<210> 27
<211> 84
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 27
Phe Lys Ile Gln Val Thr Glu Tyr Glu Asp Lys Val Phe Val Thr Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Val Met His Leu Asp Gly Thr Val Glu Gly Trp Phe Ala
20 25 30
Lys Asn Lys Thr Leu Asn Leu Gly Lys Gly Val Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Leu Cys Asn Gly Thr Glu Gln Leu Ala Lys Val Val Ser Ser
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Val Glu Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Thr Met Ala
<210> 28
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 29
<211> 52
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 29
Met Leu Gln Met Ala Arg Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Asp Cys Lys Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Thr Pro
20 25 30
Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Met Thr Asn Ser Val
35 40 45
Lys Gly Met Asn
50
<210> 30
<211> 49
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 30
Met Ala Gln Gln Cys Phe His Ser Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Cys Lys Pro Cys His Leu Arg Cys Ser Asn Pro Pro Ala Thr Cys
20 25 30
Gln Pro Tyr Cys Asp Pro Ser Val Thr Ser Ser Val Lys Gly Thr Tyr
35 40 45
Thr
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
His His His His His His
1 5
<210> 32
<211> 232
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 32
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
20 25 30
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
50 55 60
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
115 120 125
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
145 150 155 160
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
165 170 175
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
195 200 205
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 33
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 34
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 35
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330

Claims (9)

1.结合人BCMA的单克隆抗体，其包含：
如SEQ ID NO:7所示的HCDR1，
如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，
如SEQ ID NO:9所示的HCDR3，
如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，
如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和
如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；
其中HCDR和LCDR根据Kabat定义。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:10所示的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:14所示的轻链可变区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab')2片段或单链Fv片段(scFv)。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中所述抗体还包含所述IgG1亚型的重链恒定区。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的单克隆抗体，其中所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
8.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体。
9.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体。
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