CN116478288A - 红细胞弱结合型人源化cd47抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种红细胞弱结合型人源化CD47抗体及其应用。本发明的抗人CD47抗体可高效结合肿瘤细胞表面的CD47，但与红细胞表面的CD47结合能力很弱，不引起红细胞的凝集和溶血，因而能够在有效介导肿瘤细胞的杀伤的情况下不发生血液毒性。本发明的抗CD47抗体具有良好的安全性和药效，有望成为一种应用于临床的新型红细胞弱结合型阻断抗体。

Description

红细胞弱结合型人源化CD47抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种红细胞弱结合型人源化CD47抗体及其应用。
背景技术
CD47也称为整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP)，是免疫球蛋白超家族成员。几乎表达于所有正常细胞表面，比如造血干细胞、白细胞(巨噬细胞和树突状细胞之类的吞噬细胞、粒细胞、T细胞、B细胞)、血管内皮细胞、神经细胞、肠粘膜细胞和睾丸细胞、视网膜细胞等均有高表达，甚至包括红细胞和血小板。在红细胞中，CD47的表达量随发育时期而改变，新生红细胞表达量高而衰老红细胞几乎不表达。
CD47同时参与细胞粘附、迁移、吞噬以及维持机体免疫稳态等生理活动。特别是CD47-SIRPa轴参与了“敌”“我”识别，当CD47与巨噬细胞表面的SIRPa结合时，巨噬细胞的吞噬作用的被抑制。癌细胞正是利用了这一点，逃避了巨噬细胞免疫监视。所以利用抗体阻断CD47与SIRPa结合，恢复巨噬细胞对癌细胞吞噬就成为癌症治疗的有效手段。但因正常细胞普遍表达CD47以免被自己的巨噬细胞吞噬，如何避免产生毒副作用就成为CD47阻断抗体应用的痛点。
就CD47单特异抗体而言，Gilead/Forty-seven的抗CD47单克隆抗体Hu5F9-G4研发最快，而天境生物的抗CD47单克隆抗体TJC4安全性更好。
Hu5F9-G4已完成临床二期实验，但临床三期实验尚未开始入组病人的招募。2020年9月15日，magrolimab即Hu5F9-G4获得FDA授予的突破性疗法认定，用于新确诊的骨髓增生异常综合征(MDS)。在此之前，美国FDA还授予了magrolimab快速通道资格，用于治疗MDS、急性髓系白血病(AML)、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)。与此同时，magrolimab还被FDA授予治疗MDS和AML孤儿药资格，以及被欧洲药品管理局(EMA)授予了治疗AML的孤儿药资格。Hu5F9-G4在治疗血液瘤方面显示出很好的效果。但Hu5F9-G4本身仍可以较强的结合红细胞，甚至造成血液毒性，一度引起全球CD47靶点抗体研发的普遍暂停。直至Gilead/Forty-seven找到启动剂量给药以暂时性、可逆性消除红细胞，然后再以维持剂量给药这一给药方式。在此情况下Hu5F9-G4依然具有贫血、高胆红素血症、头痛、恶心和视网膜毒性等典型不良反应，尽管这些事件通常是可逆、很少严重的。基于此，CD47抗体的血液毒性成为该靶点抗体代次划分的依据，受到极大的关注。TJC4在抗体发现阶段早期即引入红细胞结合问题，因而TJC4与红细胞结合较弱而与癌细胞结合不受影响，较好的平衡了药效与安全性，但TJC4的研发尚处于临床一期阶段，药效与安全性仍有待进一步证实。
综上，本领域急需开发一种红细胞弱结合型人源化CD47抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红细胞弱结合型人源化CD47抗体及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗人CD47抗体，所述抗体包含：
(1)重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
(2)轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的抗体包含重链和轻链，其中所述的抗体的重链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区，和所述的抗体的轻链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。
在另一优选例中，所述的重链可变区序列如SEQ ID NO.7或23所示。
在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为IgG型，较佳地为IgG4型。
在另一优选例中，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO.9、24、25或26所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的轻链恒定区为轻链kappa恒定区。
在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。
在另一优选例中，所述的抗体为人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区还包括人源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区，和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
在另一优选例中，所述的抗体选自下组：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗体与人CD47蛋白结合的KD≤7.9E-9M，较佳地，≤1.0E-9M；更佳地≤6.5E-10M。
在另一优选例中，所述的抗体特异性结合CD47。
在另一优选例中，所述的CD47来自人或食蟹猴。
在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体(scFv)。
在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体，其中所述单链抗体包括：
(1)重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
(2)轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
在另一优选例中，所述的单链抗体依次包括轻链可变区、接头和重链可变区，或依次包括重链可变区、接头和轻链可变区。
在另一优选例中，所述的接头为(G4S)n，其中n为1-5的整数，优选接头为(G4S)3。
在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区含有SEQ ID NO.7或23所示的氨基酸序列；和/或所述的抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.9、24、25或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体包括选自下组的重链可变区和轻链可变区：
(1)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(2)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(3)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(4)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一优选例中，所述的抗体包括选自下组的重链和轻链：
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列的轻链；
如SEQ ID NO.15所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.17所示氨基酸序列的轻链；
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的轻链；
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.21所示氨基酸序列的轻链。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD47结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO.7或23所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO.9、24、25或26所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性。
在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中，所述抗体具有选自下组的一个或多个特性：
(a)结合人源CD47；
(b)结合食蟹猴CD47；
(c)阻断CD47与SIRPα的结合；
(d)促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞；
(e)不与红细胞发生凝集反应。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述元件(i)融合在一起的额外的融合元件(或融合多肽片段)。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括：
(i)抗体，其包含SEQ ID NO.7或23所示的氨基酸序列的重链可变区；和SEQ IDNO.9、24、25或26所示的氨基酸序列的轻链可变区；
以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述重组蛋白包括含有选自下组的重链可变区和轻链可变区的抗体：
如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的轻链可变区，或
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区；
在本发明的第三方面，提供了一种CAR构建物，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv区段为特异性结合于CD47的结合区，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
在本发明的第四方面，提供了一种重组的免疫细胞，所述的免疫细胞表达外源的如本发明的第三方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞、T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第五方面，提供了一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体、或本发明的第二方面所述的重组蛋白、如本发明的第三方面所述的CAR构建物、如本发明的第四方面所述的免疫细胞、或其组合，所述活性成分用于：
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗CD47相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗CD47相关癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、间皮瘤、胃癌、肺鳞癌、肾透明细胞腺癌、结肠癌、结直肠腺癌、星形胶质母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、肝癌细胞、黑色素瘤。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，如本发明的第一方面所述的抗体、或本发明的第二方面所述的重组蛋白、如本发明的第三方面所述的CAR构建物、如本发明的第四方面所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗CD47相关癌症或肿瘤的药物，所述的CD47相关癌症或肿瘤选自下组：肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、间皮瘤、胃癌、肺鳞癌、肾透明细胞腺癌、结肠癌、结直肠腺癌、星形胶质母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、肝癌细胞、黑色素瘤。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的抗体；
(2)如本发明的第二方面所述的重组蛋白；或
(3)如本发明的第三方面所述的CAR构建物。
在另一优选例中，编码所述抗体的重链的多核苷酸和编码所述轻链序列的多核苷酸选自下组：
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。
在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有如本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞、或原核细胞。
在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在另一优选例中，所述的原核细胞为大肠杆菌。
在本发明的第十方面，提供了一种体外非诊断的检测样品中CD47蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面的所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD47蛋白。
在本发明的第十一方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的抗体。
在本发明的第十二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明的第一方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有针对如本发明的第一方面所述的抗体的二抗；
或者，所述试剂盒含有如本发明的第十一方面所述的检测板。
在本发明的第十三方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了一种治疗与CD47分子相关的病症的方法，包括步骤：给需要抑制或需要治疗的对象施用如本发明的第一方面所述的抗体或如本发明的第二方面所述的重组蛋白或如本发明的第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物(包括人)。
本发明的技术方案：本发明所述的红细胞弱结合型人源化CD47抗体，是提供一种靶向人源及食蟹猴CD47的抗体的氨基酸序列及核酸序列。
进一步的，通过重组人CD47生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始材料，获得单克隆菌落，
即将可结合CD47的噬菌体抗体进行单克隆化。
进一步的，将信号肽、抗CD47抗体可变区、人源抗体恒定区的编码序列连接，同框阅读，从而构建哺乳动物的表达载体。
本发明中抗CD47抗体包含选自下组的重链和轻链：
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的轻链(ID2)；
如SEQ ID NO.15所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.17所示氨基酸序列的轻链(ID3)；
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.19所示氨基酸序列的轻链(ID4)；
如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的重链；和如SEQ ID NO.21所示氨基酸序列的轻链(ID5)。
本发明中抗CD47抗体包含选自下组的重链和轻链：
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.20所示；
编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；和编码轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.22所示。
进一步的，红细胞弱结合型人源化CD47抗体在抗体阻断CD47与SIRPα的结合中的应用。
进一步的，红细胞弱结合型人源化CD47抗体在促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的作用。
本发明目的之一是提供一种靶向人源CD47分子的抗体。
本发明目的之二是提供一种靶向人源CD47分子的人源化抗体。
本发明目的之三是提供人源化后的抗体阻断CD47与SIRPα结合的效应。
本发明目的之四是提供人源化后的抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的效应。
本发明目的之五是提供人源化后的抗体具有不引起红细胞凝集的安全性。
本发明目的之六是提供靶向人源及食蟹猴CD47的抗体的制备方法。
本发明目的之七是提供靶向人源及食蟹猴CD47的抗体的氨基酸序列及核酸序列。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明成功制备了可结合人源、食蟹猴CD47分子的抗体，该抗体特异性好，亲合力高，可结合细胞表面表达的CD47。特别是该抗体对红细胞无凝集效应，解决了CD47靶点抗体具有血液毒性、难以应用于临床这一痛点。另外该抗体做了人源化，应用于临床后，其免疫源性低，安全性好，具有潜在较低的抗体清除从而延长药效。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明实施例中ID 1的phage粗培液与人源CD47结合ELISA检测示意图；
图2显示了本发明实施例中CD47抗体表达载体结构示意图；
图3显示了本发明实施例中纯化抗体SDS-PAGE电泳示意图；
图4显示了本发明实施例中不同分子构型的抗体与人源CD47结合的亲和力测定示意图；
图5显示了本发明实施例中phage粗培液与人源及食蟹猴CD47结合FACS检测结果示意图；
图6显示了本发明实施例中纯化抗体与人源及食蟹猴CD47超表达细胞结合FACS检测结果示意图；
图7显示了本发明实施例中不同分子构型的抗体与超表达细胞表面人源、食蟹猴CD47结合的FACS检测示意图；
图8显示了本发明实施例中不同分子构型的抗体与癌细胞表面CD47结合的FACS检测示意图；
图9显示了本发明实施例中纯化抗体阻断CD47与SIRPα结合的FACS检测结果示意图；
图10显示了本发明实施例中纯化抗体对红细胞凝集效应检测示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，首次获得一种具有高特异性和高亲和力的红细胞弱结合型抗人CD47的单克隆抗体。具体地，本发明的抗体可高效结合肿瘤细胞表面的CD47；并且与红细胞表面的CD47结合能力很弱，不引起红细胞的凝集和溶血，因而能够在有效介导肿瘤细胞的杀伤的情况下不具有血液毒性。本发明的抗体同时能够结合食蟹猴CD47。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括CD47抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种CD47抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有，可以是1个、2个或3个。
抗体
如本文所用，术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的不同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。IgG代表免疫球蛋白中最重要的一类，由于化学结构和生物功能差异，它又可以分为4个子类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ或λ链。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的FR区(FR)。4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区，即轻链高变区(LCDR),指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区，即重链高变区(HCDR),指HCDR1、HCDR2和HCDR3。发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。天然重链和轻链可变区中的四个FR区大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)scFv分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，独立的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体，单结构域抗体，结构域缺失抗体，嵌合抗体，CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米体(例如单价纳米体、双价纳米体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR域。
如本文所用，术语“抗原决定簇”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指得自单个细胞来源的克隆分泌的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原表位。所述的细胞可能是真核的、原核的或噬菌体的克隆细胞株。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染宿主细胞表达的抗体分子。既保留了亲本鼠抗体的高特异性和亲和力，又使其人源Fc段能有效介导生物学效应功能。
如本文所用，术语“人源化抗体”，是本发明鼠抗的一种可变区改造形式，具有源自(或基本上源自)非人类抗体(优选小鼠单克隆抗体)的CDR区，和基本源自人源抗体序列的FR区和恒定区；即将鼠抗的CDR区序列嫁接到不同类型的人种系抗体构架序列上。因为CDR序列负责大部分的抗体-抗原相互作用，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体性质的重组抗体。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
抗CD47抗体
CD47也称为整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP)，是免疫球蛋白超家族成员。几乎表达于所有正常细胞表面，比如造血干细胞、白细胞(巨噬细胞和树突状细胞之类的吞噬细胞、粒细胞、T细胞、B细胞)、血管内皮细胞、神经细胞、肠粘膜细胞和睾丸细胞、视网膜细胞等均有高表达，甚至包括红细胞和血小板。在红细胞中，CD47的表达量随发育时期而改变，新生红细胞表达量高而衰老红细胞几乎不表达。
如本文所用，术语“CD47”一般是指天然的或重组的人CD47，以及人CD47的非人同源物。因此，除非明确地指出是来自非人类物种，例如“小鼠CD47”、“猴CD47”等，否则“CD47”一词指人类CD47。
本发明还提供一种针对CD47的高特异性的抗体，其包括重链和轻链，所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列，所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
优选地，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
优选地，所述的重链可变区的序列包括如SEQ ID NO.7或23所示的氨基酸序列；
所述的轻链可变区的序列包括如SEQ ID NO.9、24、25或26所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，本发明的抗CD47抗体包含选自下组的重链可变区和轻链可变区：
如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的轻链可变区(ID1)；
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的轻链可变区(ID2)；
如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的轻链可变区(ID3)；
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的轻链可变区(ID4)；和
如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和如SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区(ID5)；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-5、1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸的具有CD47结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性为至少80％，较佳地至少85％，更佳地至少为90％，最佳地至少95％的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是双链或单链抗体，并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体，更优选为全人源化抗体。
如本文所用，术语“scFv”为单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，由抗体重链可变区和轻链可变区通常通过15～25个氨基酸的接头(linker)连接而成。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的接头是指接头连接单链抗体(scFv)的VH和VL，或用于将scFv与另一抗体的重链进行连接。
合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)、或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。例如，(G4S)n，其中n为1-5的整数。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或该领域内其他已知的抗体衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中，所述动物优选为哺乳动物，如鼠。
本发明抗体可以是靶向人CD47的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列，位于重链可变区(VH)的CDR区。
在本发明的一种优选实施例中，上述SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中任意一种或几种序列、或它们经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的具有CD47结合亲和力的序列，位于轻链可变区(VL)的CDR区。
本发明上述内容中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的抗CD47抗体。例如，可以用连接或天然存在的CD47同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的CD47都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对CD47特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人CD47，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。
生产本发明的抗人CD47抗体的示例性方法描述于实施例1。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本发明中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体易于实现必需恒定结构域序列的最优化，以产生所需生物学活性。
同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本发明的化合物和方法中是可以用的。
人源化本发明的抗人CD47抗体的示例性方法描述于实施例2。
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。
本发明中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。
通常，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
应用
本发明提供了本发明抗体的用途，例如用于制备诊断制剂、或制备用于预防和/或治疗CD47相关疾病的药物。所述CD47相关疾病包括肺癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、间皮瘤、胃癌、肺鳞癌、肾透明细胞腺癌、结肠癌、结直肠腺癌、星形胶质母细胞瘤、神经胶质细胞瘤、肝癌细胞、黑色素瘤。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本发明的药物组合物可直接用于结合CD47蛋白分子，因而可用于预防和治疗IL-36相关疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的药物组合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
本发明中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中，本发明的抗体可以固定于检测板。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的抗CD47抗体特异性好，亲合力高，可结合细胞表面表达的CD47。
(2)本发明的抗CD47抗体对红细胞无凝集效应，无血液毒性，其人源化抗体免疫源性低，安全性好。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明人源化抗体的制备方法
本发明以商品化的重组人CD47生物素标签蛋白和噬菌体展示抗体库为起始材料；将CD47生物素标签蛋白与链霉亲和素包被磁珠共孵育，通过链霉亲和素与生物素之间的互作将CD47固定在磁珠上，用抗体库与其孵育，洗去未结合/结合弱的噬菌体，将与CD47蛋白结合的噬菌体洗脱下来；如此反复3次，每次改变CD47生物素标签蛋白的使用量和洗涤条件，逐次淘汰掉结合弱的噬菌体并尽可能保留更多的结合强的噬菌体；用强结合的噬菌体侵染宿主菌，涂板并过夜培养，获得单克隆菌落，即将可结合CD47的噬菌体抗体进行单克隆化；利用单克隆培养上清进行ELISA筛选，并对单克隆进行核酸序列测定。
将信号肽、抗CD47抗体可变区、人源抗体恒定区(重链用IgG4类型)的编码序列连接，同框阅读，构建哺乳动物表达载体；转染293F细胞，振荡培养5天后收获上清，利用蛋白A磁珠亲和层析从上清中纯化获得融合蛋白，SDS-PAGE电泳，观察带谱，并检测其纯度。
将phage粗培液与超表达人源、食蟹猴CD47的CHO-K1细胞共孵育，洗涤后加入抗phage抗体(即一抗)孵育，孵育结束后用荧光二抗与其共孵育，流式细胞术检测phage表面展示的抗体与细胞表面CD47蛋白的结合特性；将纯化抗体与超表达人源、食蟹猴CD47的CHO-K1细胞共孵育，洗涤后用荧光二抗与其共孵育，流式细胞术检测与抗体与细胞表面CD47蛋白的结合特性；或与癌细胞系共孵育，流式细胞术检测其与癌细胞表面天然存在的CD47的结合特性；或者在与癌细胞共孵育的同时，加入CD47的天然配体SIRPα，抗体与SIRPα竞争结合癌细胞表面的CD47，以检测抗体的阻断功能。
纯化抗体按浓度梯度稀释，与红细胞共孵育，观察红细胞是否破裂，检测抗体对红细胞的凝集效应。
将浓度梯度稀释的分析物(本案中的CD47蛋白)与氨基偶联固化在芯片表面的抗体在流动状态下结合，检测其结合随时间变化的过程获得结合常数kd，然后用加入稀释液则抗体解离，检测其解离随时间变化的过程获得解离常数ka；以kd值除ka值即获得亲和力KD值。
将种子序列(ID 1)的重、轻链可变区保留，与人源IgG4的重、轻链恒定区分别融合，则获得嵌合抗体(ID 3)；深度人源化用到CDR区移植和分子建模与回复突变三个技术，先将种子序列(ID 1)的FR区替换为人源抗体的FR区，再利用分子建模软件DiscoveryStudio对获得的可变区进行碱基替换获得一系列新的可变区，最后将这些抗体FR区中与ID1FR区中碱基不一致的重要碱基重新替换回原ID 1中的碱基，即获得一系列新的人源化的重、轻链可变区。
实施例1：噬菌体展示全人源抗体文库淘选
1)、宿主菌TG1活化：制备mini agar培养基平板[1×M9盐，2％葡萄糖，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，1mM维生素B1]，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱；
2)、磁珠洗涤及封闭：吸取50ul磁珠(购自Invitrogen)，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1ml PBS重悬、洗涤两次，用1ml 1.5％脱脂奶粉+1.5％BSA的封闭剂(第二轮、第三轮淘选时封闭剂浓度逐渐增加)封闭1小时，去除液体；
3)、抗原结合：按16ug/ml的浓度将生物素化人源CD47蛋白(购自Acro Biosystem，以后各轮淘选时抗原浓度逐渐降低)用PBS中(pH7.2-7.4)稀释至1ml，重悬磁珠，旋转孵育1小时；
4)、库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒(来自于原始抗体库或淘选扩增产物)，用1ml 1.0％脱脂奶粉+1.0％BSA的封闭剂旋转孵育1小时；
5)、噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体。将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体；
6)、洗涤：用1ml PBST[0.01M PBS(pH7.4),0.1％Tween-20(第二、三轮Tween-20浓度分别用0.2％、0.3％)]洗涤，再用0.01M PBS(pH7.4)洗涤；
7)、洗脱：吸去液体，用300ul 0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱10分钟，加入20ul中和液[1M Tris-Cl(pH9.0)]混匀，暂时保存于4℃；
8)、测滴度：取2ul、0.2ul(原液用2×YT培养基稀释10倍后取2ul)、0.02ul(原液用2×YT培养基稀释100倍后取2ul)洗脱液，与0.2ml对数中期(OD600＝0.5)的TG1混匀，室温孵育30分钟，均匀涂于2×YT-GA100[含2％葡萄糖，100ug/ml氨苄青霉素]平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度；
9)、噬菌体扩增：在淘选进行的同时，挑取mini agar平板上的TG1单克隆，接种于10ml 2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期(OD600＝0.5)；加入200ul淘选获得的洗脱产物，37℃孵育30分钟；加入辅助噬菌体M13KO7，37℃再孵育30分钟，37℃下，250rpm振荡培养1小时；离心去上清，用20ml含工作浓度100ug/ml氨苄青霉素和工作浓度50ug/ml卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜；
10)、噬菌体沉淀：10000rpm离心15分钟去除菌体，上清中加入1/5体积的2.5MNaCl/20％PEG8000，冰浴2小时；10000rpm离心10分钟得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2ml 0.01M PBS(pH7.4)液重悬沉淀，如上文测滴度；
11)、重复步骤2)-10)两或三次，获得结合力强的噬菌体展示抗体。
实施例2：单克隆ELISA以及抗体人源化
2.1单克隆ELISA
1)、3ug/ml链霉亲和素4℃过夜包被酶标板，2％BSA/PBS封闭液处理2h，并用PBS洗涤3次；
2)、从2×YT-GA100平板上挑取单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃孵育30分钟；37℃，220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心15分钟；用400ul含工作浓度100ug/ml氨苄青霉素和工作浓度50ug/ml卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜；4000rpm离心15分钟，沉淀菌体；
3)、按100ul每孔加入1ug/ml生物素化抗原，37℃下100rpm振荡孵育1h，并用PBS洗涤3次；
4)、取50ul 4％BSA/PBS加入到酶标板中，同时取50ul噬菌体上清，混匀，30℃下100rpm振荡孵育1h；
5)、去除液体，0.1％PBST洗5次，PBS洗3次，去除液体；
6)、将HRP标记抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)用2％BSA稀释3000倍，取100ul加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，0.1％PBST洗3次，拍干残液；
7)、加入100ul TMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100ul1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450。数据见图1和表1。
表1：phage粗培液与人源CD47结合ELISA检测
单克隆抗体ID 对照 实验 实验/对照
ID 1 0.056 2.836 50.6429
8)、挑选阳性单克隆测序，对单克隆抗体ID 1的可变区(V区)基因进行核酸序列测定；
单克隆抗体ID 1的重链可变区和轻链可变区的序列如下：
ID 1重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.7
QVQLQQPGAELVKPGAPVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGRGLEWIGRIDSSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCARQGEGLRRSWFPYWGQGTLVIVSA
ID 1重链可变区核苷酸序列：SEQ ID NO.8
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGTTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTCGAGTGGATTGGAAGGATTGATTCTTCCGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATCCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGGGGAAGGATTACGACGGTCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCATTGTCTCTGCA
ID 1轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.9
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYVASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPWTFGGGTKLEIK
ID 1轻链可变区核苷酸序列：SEQ ID NO.10
GATATTGTTTTAACTCAATCTCCTGCTTCCTTGGCCGTCTCACTTGGTCAGCGTGCAACCATCTCGTGTCGCGCGAGTAAAAGCGTATCTACATCCGGCTATTCATACATACATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAACCACCGAAACTCCTAATTTACGTGGCTTCGAATCTGCAGAGTGGGGTTCCTGCCCGATTTAGCGGTTCTGGCTCCGGAACGGACTTCACTTTAAACATCCACCCCGTCGAAGAGGAAGATGCAGCGACCTATTACTGCCAACATATACGGGAGTTGCCATGGACATTTGGGGGTGGCACGAAGCTTGAAATTAAA
2.2抗体人源化
将ID 1重、轻链可变区与人源抗体基因数据库中序列进行比对，获得序列最相近的人源抗体序列；找出ID 1的重、轻链CDR区，用其替换人源最相近序列的重、轻链的CDR区，构建成新的重、轻链可变区；将该序列加载到Discovery Studio软件中，运行分子建模，获得有碱基替换的一系列新序列，保留CDR区未替换的多个序列；将该新序列与ID 1比对，选择出FR区中对抗体结构有重要作用的位点仍未被替换即该位点与ID 1一致的序列，做为候选的人源化后的重、轻链可变区；将该候选重链可变区与人源IgG4的恒定区融合，同时将该轻链可变区与人源轻链恒定区融合，获得人源化的重、轻链；在制备抗体的细胞转染步骤时，将重链质粒与轻链质粒随机混合，表达出不同重、轻链搭配的人源化抗体；最终获得人源化后的重链1与轻链1、2、3搭配的人源化抗体，即ID4、ID5、ID2；若将ID 1的重链可变区与人源IgG4的Fc区融合、同时ID 1的轻链可变区与人源轻链恒定区融合，搭配为新的抗体，则获得人源化程度较弱的嵌合抗体ID 3。
ID 2重链氨基酸序列：SEQ ID NO.11
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDSSDSETHYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARQGEGLRRSWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
ID 2重链核苷酸序列：SEQ ID NO.12
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACATCTTATTGGATGAACTGGGTGAGGCAGGCACCTGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGCAGAATCGACAGCTCCGATTCCGAGACACACTACAATCAGAAGTTTAAGGACAGGGTGACCATGACACGCGATACCAGCACATCCACCGTGTATATGGAGCTGTCTAGCCTGCGGTCTGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCAAGACAGGGAGAGGGACTGCGGAGAAGCTGGTTCCCCTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGTCCTCTGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACATATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCAAGCAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCATGTCCTGCTCCAGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCTCTAGAACACCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTTAACTCTACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCTATCGAGAAGACAATCTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCAAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAAAGTCTGTCACTGTCACTGGGAAAGTGA
ID 2轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.13
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYVASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQHIRELPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ID 2轻链核苷酸序列：SEQ ID NO.14
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGAGAGAGGGCAACCATCAACTGCAGAGCCTCTAAGAGCGTGTCCACATCTGGCTACTCTTATATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATGTGGCCTCTAATCTGCAGAGCGGAGTGCCAGACAGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGCACATCAGGGAGCTGCCATGGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGCTGGAGATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGA
ID 3重链氨基酸序列：SEQ ID NO.15
QVQLQQPGAELVKPGAPVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGRGLEWIGRIDSSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCARQGEGLRRSWFPYWGQGTLVIVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKY GPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
ID 3重链核苷酸序列：SEQ ID NO.16
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTCCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGTTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACGAGGCCTCGAGTGGATTGGAAGGATTGATTCTTCCGATAGTGAAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATCCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGGGGAAGGATTACGACGGTCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCATTGTCTCTGCAGCCAGCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACATCTGAGAGCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACAAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCTAGCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCTAGCCTGGGCACCAAGACATATACCTGTAACGTGGACCACAAGCCAAGCAATACCAAGGTGGATAAGCGGGTGGAGTCTAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCATGTCCTGCTCCAGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAACCAAAGGACACACTGATGATCTCTAGAACACCAGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTTAACTCTACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCTATCGAGAAGACAATCTCTAAGGCTAAGGGCCAGCCAAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCAAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCTGTGATGCACGAAGCCCTGCATAATCACTATACTCAGAAAAGTCTGTCACTGTCACTGGGAAAGTGA
ID 3轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.17
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYVASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ID 3轻链核苷酸序列：SEQ ID NO.18
GATATTGTTTTAACTCAATCTCCTGCTTCCTTGGCCGTCTCACTTGGTCAGCGTGCAACCATCTCGTGTCGCGCGAGTAAAAGCGTATCTACATCCGGCTATTCATACATACATTGGTATCAACAGAAGCCCGGACAACCACCGAAACTCCTAATTTACGTGGCTTCGAATCTGCAGAGTGGGGTTCCTGCCCGATTTAGCGGTTCTGGCTCCGGAACGGACTTCACTTTAAACATCCACCCCGTCGAAGAGGAAGATGCAGCGACCTATTACTGCCAACATATACGGGAGTTGCCATGGACATTTGGGGGTGGCACGAAGCTTGAAATTAAAAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGA
ID 4、5重链氨基酸、核苷酸序列同ID 2。
ID 4轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.19
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYVASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ID 4轻链核苷酸序列：SEQ ID NO.20
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGAGAGAGGGCAACCATCAACTGCAGAGCCTCTAAGAGCGTGTCCACATCTGGCTACTCTTATATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATGTGGCCTCTAATCTGCAGAGCGGAGTGCCAGACAGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGCACATCAGGGAGCTGCCATGGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGA
ID 5轻链氨基酸序列：SEQ ID NO.21
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYVASNLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQHIRELPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ID 5轻链核苷酸序列：SEQ ID NO.22
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCTGATTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGAGAGAGGGCAACCATCAACTGCAGAGCCTCTAAGAGCGTGTCCACATCTGGCTACTCTTATATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATGTGGCCTCTAATCTGCAGAGCGGAGTGCCAGACAGGTTCAGCGGATCCGGATCTGGCACAGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGCACATCAGGGAGCTGCCATGGACCTTCGGCCAGGGCACAAAGGTGGAGATCAAGAGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCTGGCAATAGCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCTAAGGATAGCACATATTCCCTGTCTAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAAGTCACCCATCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACTAAGTCATTCAATCGCGGAGAATGCTGA
本发明中抗体的重链CDR区和轻链CDR区如下所示：
实施例3：人源CD47单抗制备
1)、从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，液体振荡培养过夜，按质粒提取法提取噬菌粒(phagemid)；
2)、化学合成抗体全基因；
3)、将以上核酸片段按序插入到真核表达载体Abexp-2020的MCS区(所述CD47抗体表达载体结构示意图如图2所示；其中，MCS为多克隆位点，重链或轻链全长基因插入此位置)，以编码N端为信号肽、中段为抗体可变区、C端为Fc标签的融合蛋白，或C端为轻链CL区的融合蛋白；
4)、振荡培养15ml菌液，使用质粒提取试剂盒(购自康为世纪)制备无菌无内毒素的质粒；
5)、转染复合物制备：取16ug抗体轻链质粒与相应的8ug抗体重链质粒混合，用0.75mL的稀释液(如OPM-293CD05培养基)稀释，同时取70μL的转染试剂(如PEI溶液)加入到0.75mL的稀释液中(如OPM-293CD05培养基)轻柔混匀；将PEI稀释液加入质粒稀释液中，立即用枪轻柔混匀，室温静置15min，避免扰动；
6)、加入到25ml 293F细胞及其培养液中，80rpm，37℃，5％CO2条件下培养24小时，再加入25mL新鲜生长培养基(如OPM-293CD05)，80rpm，37℃，5％CO2继续培养72小时；
7)、10000rpm离心10分钟，取上清；与平衡后的proteinA亲和磁珠旋转孵育1小时，置于磁力架上，去除上清；
8)、用30ml PBS洗杂3次，加入5ml 0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱10分钟，置于磁力架上，吸取上清立即用1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)调至中性，透析即获得纯化的抗体；
9)、SDS-PAGE检测纯化抗体，同时进行浓度测定。采用还原电泳，ID 1抗体及人源化后的抗体ID 2分子中的二硫键被打开，分子以伸展的单肽链状态进行电泳迁移，同时重链与轻链在电场中独立自由泳动。
图3是纯化抗体SDS-PAGE电泳示意图；其中，A图(ID 1)为人源化前抗体电泳结果，B图(ID 2)为人源化后的抗体电泳结果。
实施例4：表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)测抗体亲和力
1)、安装Series S Sensor Chip CM5芯片，Biacore 8K开机预热；
2)、25℃下，以10μL/min流速，用50mmol/L N-Hydroxysuccinimide(NHS)、200mmol/L 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)激活检测芯片420s；
3)、注入抗体，在Human Antibody capture kit(GE Healthcare)介入下，抗体通过氨基基团被偶联到芯片表面；
4)、用1M乙醇胺盐酸盐流动封闭残余偶联位点420s；
5)、将(融合小鼠Fc的)CD47用流动相HBS-EP液稀释为3.125,6.25,12.5,25,50,100nM，注入芯片中，于25℃下结合180s，立即注入流动相解离600s，流速均为30ul/min；
6)、Biacore 8K Evaluation software软件分析数据；
图4是不同分子构型的抗体与人源CD47结合的亲和力测定示意图，图中曲线为结合和解离曲线；保留ID1的重、轻链可变区，其余部分分别与人源抗体重、轻链的恒定区融合，构建为嵌合抗体ID3。将ID3重链的CDR区保留，FR区做回复突变，获得VH1；ID3轻链的CDR区保留，FR区做回复突变，获得VL1、VL2、VL3；将VH1分别与VL1、VL2、VL3搭配，构建出3种抗体，依次命名为ID4、ID5、ID2；如此共获得4种抗体，通过氨基基团固定于介质表面，与流动相中的人源CD47蛋白结合，表面等离子共振测定亲和力；图中不同组曲线表示不同的CD47浓度，同一组曲线中一条代表实测值，一条代表按1:1比例进行拟合的曲线；对这一过程中的数据进行计算，获得如表2所示结合常数(kd)、解离常数(ka)及亲和力(KD)。其中亲和力值越低表明结合越强。
表2：不同分子构型的抗体与人源CD47结合的亲和力测定
构型 配体 Chi2(RU2) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) Rmax(RU)
ID 4 CD47-mFC 3.08E-01 4.82E+05 3.80E-04 7.90E-10 58.6
ID 5 CD47-mFC 2.89E-01 4.86E+05 3.03E-04 6.23E-10 56
ID 2 CD47-mFC 2.43E-01 4.54E+05 2.83E-04 6.23E-10 53.6
ID 3 CD47-mFC 3.47E-01 3.97E+05 2.65E-04 6.68E-10 61.9
实施例5：phage或纯化抗体细胞结合能力的流式检测(FACS)
1)、将CD47表达(细胞结合检测，如BxPC3、超表达人源或食蟹猴CD47的CHOK1)或不表达(脱靶检测，如超表达Huh7、HEK293)用0.25％的胰酶充分消化(不包括Raji细胞)，血清终止消化，离心收集细胞，PBS轻轻吹打制备单细胞悬液；
2)、10ml PBS洗涤细胞1次，1000rpm离心5min，再用1ml PBS悬浮细胞，细胞计数；
3)、取2.5×105个细胞于96孔细胞培养板中，离心收集细胞；
4)、加入100μl实施例2步骤2)中的phage上清或100ul 10ug/ml实施例3步骤8)中的纯化抗体，混匀，室温孵育30分钟至1小时；
5)、离心收集细胞，用300ul PBS洗涤细胞1次；
6)、若为phage检测，加入100μl用PBS稀释1000倍的抗M13噬菌体抗体(购自北京义翘神州)，孵育30min，PBS洗一次，加入100μl用PBS稀释100倍的荧光标记(如FITC、APC)抗体，室温下避光反应20min，流式细胞仪检测。
结果数据如表3和图5所述；图中左侧、中、右侧柱形图分别代表与野生型CHO-K1、食蟹猴CD47超表达CHO-K1细胞株(c-CHOK1)及人源CD47超表达CHO-K1细胞株(h-CHOK1)结合信号；其原始数据如表3所示，其中数值为荧光强度中值(MFI)及其及与野生型CHO-K1结合MFI的比值。
表3：phage粗培液与人源及食蟹猴CD47结合FACS检测结果
No ID CHOK1 h-CHOK1 c-CHOK1 h-CHOK1/CHOK1 c-CHOK1/CHOK1
1 1368.2 18283.6 14612.8 13.36 10.68
若为纯化抗体检测，加入100μl用PBS稀释200倍的荧光标记(如FITC、APC)抗体，室温下避光反应20min，流式细胞仪检测。
图6是纯化抗体与人源及食蟹猴CD47超表达细胞结合的FACS检测结果示意图；图中左侧、中、右侧柱形图分别代表与野生型CHO-K1、食蟹猴CD47超表达CHO-K1细胞株(c-CHOK1)及人源CD47超表达CHO-K1细胞株(h-CHOK1)结合信号；其原始数据如表4所示，其中数值为荧光强度中值(MFI)及其及与野生型CHO-K1结合MFI的比值。
表4：纯化抗体与人源及食蟹猴CD47超表达细胞结合FACS检测结果
图7是不同分子构型的抗体与超表达在细胞表面人源、食蟹猴CD47结合的FACS检测示意图，MFI值如表5所示，结果显示人源化后所检测的四种构型对CD47靶点的结合仍很强，与食蟹猴中该同源靶点的结合能力依然存在。
表5.不同分子构型的抗体与超表达在细胞表面人源、食蟹猴CD47结合的FACS检测MFI值
MFI值 cCD47-CHOK1 hCD47-CHOK1 CHOK1
ID4 786.0 2044.0 78.7
ID5 1455.0 2139.0 122.0
ID2 2420.0 1743.0 114.0
ID3 2046.0 2168.0 113.0
human IgG 71.0 101.0 64.4
PBS 92.8 139.0 88.8
图8和表6显示了运用流式细胞术检测不同分子构型的人源化抗体以及Hu5F9-G4与癌细胞Raji表面的CD47的结合，其中Blank为不加任何一抗只加荧光抗体的对照；人源化后不同构型的分子与癌细胞表面的CD47结合与Hu5F9-G4抗体相比，结合能力依然很高；其原始数据如表6所示，其中数值为荧光强度中值(MFI)。
表6：不同分子构型的抗体与Raji表面CD47结合的FACS检测。
构型 Blank Hu5F9-G4 ID 3 ID 4 ID 5 ID 2
MFI 58.3 13483.3 15851.6 14174.8 12327.5 14638.4
实施例6：纯化抗体阻断CD47与SIRPα结合的FACS检测
1)、取表达人源CD47的Raji细胞2.5×105个细胞于2ml离心管中，分三管，其中一管不加任何蛋白、一管加入0.05ug/ml抗体ID 2，另一管加入0.05ug/ml抗体ID 2同时加入5ug/ml SIRPα。细胞总体积100ul，溶液用PBS；
2)、室温孵育1h，PBS洗涤一次；
3)、100ul PBS重悬，加入APC标记抗人Fc荧光二抗(购自JacksonImmunoresearch，109-136-098，1:200稀释)；
4)、室温孵育30min，PBS洗涤一次，100ul PBS重悬，流式细胞仪检测；
图9和表7展示运用流式细胞术检测人源化后获得的ID2阻断SIRPα与Raji细胞表面的CD47的结合,若抗体与SIRPα有竞争则结合于细胞表面的抗体量减少；图中左、中、右侧柱形图分别代表不加CD47抗体的Raji细胞、CD47抗体与SIRPα同时加入以及只加CD47抗体的Raji细胞上抗体的结合信号；其原始数据如表4所示，其中数值为荧光强度中值(MFI)。
表7：纯化抗体阻断CD47与SIRPα结合的FACS检测结果
处理 Raji ID 2+Raji ID 2+SIRPα+Raji
MFI 1329.3 262083.5 159599.7
实施例7：纯化抗体对红细胞凝集效应检测
1)、O型血用肝素钠抗凝，2000rpm离心5min，吸去白细胞层及血浆层；
2)、加入2～3倍的氯化钠注射液轻柔吹吸混匀，洗涤2-3次，直至上清液透明无色；
3)、离心，弃上清液，将红细胞用氯化钠注射液悬浮为1％(体积浓度)红细胞悬液；
4)、按15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.235、0.128ug/ml梯度稀释抗体，100ul加入到96孔板中；
5)、取50ul红细胞悬液加入到抗体中，37℃孵育1h，观察拍照；
图10展示纯化抗体对红细胞凝集效应的检测结果，图中浓度为反应体系中抗体的工作浓度；若抗体无红细胞凝集效应，则红细胞因为沉淀而聚扰在一起；若有凝集效应，则红细胞发生溶血，溶液变红同时无红细胞沉淀。Hu5F9-G4为对照抗体。
结果显示在浓度高于0.62ug/ml的情况下，Hu5F9-G4抗体表现出红细胞的凝集；淘选获得的ID 1在检测的10-0.09ug/ml浓度范围内，未发现红细胞的凝集反应；人源化后的抗体ID 2、ID4、ID5以及嵌合抗体ID 3在检测的10-0.09ug/ml浓度范围内亦未发现红细胞凝集反应。
本发明的相关序列如表8所示。
表8.本发明的相关序列
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江蓝盾药业有限公司
<120> 红细胞弱结合型人源化CD47抗体及其应用
<130> P2021-2919
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Arg Gln Gly Glu Gly Leu Arg Arg Ser Trp Phe Pro Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Ala Ser
1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Trp Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Glu Gly Leu Arg Arg Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Ala
115 120
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggctcc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agttactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacgag gcctcgagtg gattggaagg attgattctt ccgatagtga aactcactac 180
aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atccaactca gcagcctgac atctgaggat tctgcggtct attactgtgc aagacagggg 300
gaaggattac gacggtcctg gtttccttac tggggccaag ggactctggt cattgtctct 360
gca 363
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatattgttt taactcaatc tcctgcttcc ttggccgtct cacttggtca gcgtgcaacc 60
atctcgtgtc gcgcgagtaa aagcgtatct acatccggct attcatacat acattggtat 120
caacagaagc ccggacaacc accgaaactc ctaatttacg tggcttcgaa tctgcagagt 180
ggggttcctg cccgatttag cggttctggc tccggaacgg acttcacttt aaacatccac 240
cccgtcgaag aggaagatgc agcgacctat tactgccaac atatacggga gttgccatgg 300
acatttgggg gtggcacgaa gcttgaaatt aaa 333
<210> 11
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Glu Gly Leu Arg Arg Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 12
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tggtgcagtc cggagcagag gtgaagaagc caggagcctc tgtgaaggtg 60
agctgcaagg cctccggcta caccttcaca tcttattgga tgaactgggt gaggcaggca 120
cctggacagg gactggagtg gatgggcaga atcgacagct ccgattccga gacacactac 180
aatcagaagt ttaaggacag ggtgaccatg acacgcgata ccagcacatc caccgtgtat 240
atggagctgt ctagcctgcg gtctgaggac accgccgtgt actattgtgc aagacaggga 300
gagggactgc ggagaagctg gttcccctac tggggccagg gcacactggt gaccgtgtcc 360
tctgccagca ccaagggccc ttccgtgttt cccctggccc cttgctcccg gtccacatct 420
gagagcaccg ccgccctggg ctgtctggtg aaggactact tcccagagcc cgtgaccgtg 480
agctggaaca gcggcgccct gacaagcggc gtgcacacat ttcccgccgt gctgcagagc 540
tccggcctgt actccctgtc tagcgtggtg acagtgcctt cctctagcct gggcaccaag 600
acatatacct gtaacgtgga ccacaagcca agcaatacca aggtggataa gcgggtggag 660
tctaagtacg gccctccttg ccctccatgt cctgctccag agtttctggg cggcccttcc 720
gtgttcctgt ttccacccaa accaaaggac acactgatga tctctagaac accagaggtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg 840
gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagccaagag aggagcagtt taactctaca 900
tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctcaacgg caaggagtat 960
aagtgcaagg tgtccaataa gggcctgccc tcctctatcg agaagacaat ctctaaggct 1020
aagggccagc caagagagcc tcaggtgtac accctgcctc caagccagga ggagatgaca 1080
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtg aagggcttct atccctccga catcgccgtg 1140
gagtgggagt ctaatggcca gcctgagaac aattacaaga ccacaccccc tgtgctggac 1200
tctgatggca gcttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataagtctcg gtggcaggag 1260
ggcaacgtgt tcagctgctc tgtgatgcac gaagccctgc ataatcacta tactcagaaa 1320
agtctgtcac tgtcactggg aaagtga 1347
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gacatcgtga tgacccagag ccctgattcc ctggccgtgt ccctgggaga gagggcaacc 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
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Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
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acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggag gatcccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg 840
gatggcgtgg aggtgcacaa tgccaagacc aagccaagag aggagcagtt taactctaca 900
tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggatt ggctcaacgg caaggagtat 960
aagtgcaagg tgtccaataa gggcctgccc tcctctatcg agaagacaat ctctaaggct 1020
aagggccagc caagagagcc tcaggtgtac accctgcctc caagccagga ggagatgaca 1080
aagaaccagg tgtccctgac atgtctggtg aagggcttct atccctccga catcgccgtg 1140
gagtgggagt ctaatggcca gcctgagaac aattacaaga ccacaccccc tgtgctggac 1200
tctgatggca gcttctttct gtattccagg ctgaccgtgg ataagtctcg gtggcaggag 1260
ggcaacgtgt tcagctgctc tgtgatgcac gaagccctgc ataatcacta tactcagaaa 1320
agtctgtcac tgtcactggg aaagtga 1347
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatattgttt taactcaatc tcctgcttcc ttggccgtct cacttggtca gcgtgcaacc 60
atctcgtgtc gcgcgagtaa aagcgtatct acatccggct attcatacat acattggtat 120
caacagaagc ccggacaacc accgaaactc ctaatttacg tggcttcgaa tctgcagagt 180
ggggttcctg cccgatttag cggttctggc tccggaacgg acttcacttt aaacatccac 240
cccgtcgaag aggaagatgc agcgacctat tactgccaac atatacggga gttgccatgg 300
acatttgggg gtggcacgaa gcttgaaatt aaaaggacag tggccgcccc aagcgtgttc 360
atctttcccc cttccgacga gcagctgaag tctggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 420
aacaacttct accctcggga ggccaaggtc cagtggaagg tggataacgc cctgcagtct 480
ggcaatagcc aggagtccgt gaccgagcag gactctaagg atagcacata ttccctgtct 540
agcaccctga cactgagcaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtatgc ctgtgaagtc 600
acccatcagg ggctgtcatc acccgtcact aagtcattca atcgcggaga atgctga 657
<210> 19
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gacatcgtga tgacccagag ccctgattcc ctggccgtgt ccctgggaga gagggcaacc 60
atcaactgca gagcctctaa gagcgtgtcc acatctggct actcttatat ccactggtac 120
cagcagaagc caggccagcc ccctaagctg ctgatctatg tggcctctaa tctgcagagc 180
ggagtgccag acaggttcag cggatccgga tctggcacag acttcaccct gacaatcagc 240
tccctgcagg cagaggacgt ggccgtgtac tattgtcagc acatcaggga gctgccatgg 300
accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aagaggacag tggccgcccc aagcgtgttc 360
atctttcccc cttccgacga gcagctgaag tctggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 420
aacaacttct accctcggga ggccaaggtc cagtggaagg tggataacgc cctgcagtct 480
ggcaatagcc aggagtccgt gaccgagcag gactctaagg atagcacata ttccctgtct 540
agcaccctga cactgagcaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtatgc ctgtgaagtc 600
acccatcagg ggctgtcatc acccgtcact aagtcattca atcgcggaga atgctga 657
<210> 21
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gacatcgtga tgacccagag ccctgattcc ctggccgtgt ccctgggaga gagggcaacc 60
atcaactgca gagcctctaa gagcgtgtcc acatctggct actcttatat ccactggtac 120
cagcagaagc caggccagcc ccctaagctg ctgatctatg tggcctctaa tctgcagagc 180
ggagtgccag acaggttcag cggatccgga tctggcacag acttcaccct gacaatcagc 240
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accttcggcc agggcacaaa ggtggagatc aagaggacag tggccgcccc aagcgtgttc 360
atctttcccc cttccgacga gcagctgaag tctggcaccg ccagcgtggt gtgcctgctg 420
aacaacttct accctcggga ggccaaggtc cagtggaagg tggataacgc cctgcagtct 480
ggcaatagcc aggagtccgt gaccgagcag gactctaagg atagcacata ttccctgtct 540
agcaccctga cactgagcaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtatgc ctgtgaagtc 600
acccatcagg ggctgtcatc acccgtcact aagtcattca atcgcggaga atgctga 657
<210> 23
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Ser Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Glu Gly Leu Arg Arg Ser Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (14)

1.一种抗人CD47抗体，其特征在于，所述抗体包含：
(1)重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
(2)轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包含重链和轻链，其中所述的抗体的重链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区，和所述的抗体的轻链包括所述的三个互补决定区CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区序列如SEQ ID NO.9、24、25或26所示的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括选自下组的重链可变区和轻链可变区：
(1)如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(2)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(3)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的轻链可变区；或
(4)如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列的重链可变区；和
如SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列的轻链可变区。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种CAR构建物，其特征在于，所述的CAR构建物的抗原结合区域的scFv区段为特异性结合于CD47的结合区，并且所述scFv区段具有重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
7.一种重组的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达外源的如权利要求6所述的CAR构建物。
8.如权利要求7所述的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞选自下组：NK细胞或T细胞。
9.一种活性成分的用途，其特征在于，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、或权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的CAR构建物、如权利要求7所述的免疫细胞、或其组合，所述活性成分用于：
(a)制备检测试剂或试剂盒；
(b)制备预防和/或治疗CD47相关疾病的药物或制剂；和/或
(c)制备预防和/或治疗CD47相关癌症或肿瘤的药物或制剂。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如权利要求1所述的抗体、或权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的CAR构建物、如权利要求7所述的免疫细胞、或其组合；以及
(ii)药学上可接受的载体。
11.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；
(2)如权利要求5所述的重组蛋白；或
(3)如权利要求6所述的CAR构建物。
12.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求12所述的载体或基因组中整合有如权利要求11所述的多核苷酸。
14.一种体外非诊断的检测样品中CD47蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如权利要求1所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CD47蛋白。
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