KR20240004860A - 디엘엘3에 대한 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

디엘엘3에 대한 결합 분자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DLL3에 대한 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 이러한 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 유도체, 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 또한 암 치료 및 검출 및 진단에서의 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의 관련된 용도에 관한 것이다.

Description

디엘엘3에 대한 결합 분자 및 이의 용도
본 개시내용은 면역학 분야에 속하며, 특히, 본 개시내용은 DLL3에 대한 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 이러한 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 유도체 및 약학 조성물, 및 암 치료에 있어서 이의 관련 용도에 관한 것이다.
폐암은 이환율과 사망률이 가장 빠르게 증가하는 악성 종양 중 하나이며, 인간의 건강과 생명에 가장 큰 위협을 가하고 있다. 병리학적 특성에 따라 소세포 폐암과 비소세포 폐암으로 구분된다.
비소세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer)은 폐암의 가장 중요한 형태이며, 폐암 환자의 80% 이상이 이 유형에 속한다. 요즘에는 폐암의 표적 치료법, PD-1 면역약물, 및 유전자 서열분석이 주목받고 있으며, 수반되는 획기적인 진전은 주로 비소세포 폐암에 초점이 맞춰지는데, 이는 폐암의 이러한 하위군에 대한 이용 가능하고 효과적인 치료를 크게 증가시키며, 비소세포 폐암 환자의 5년 생존율을 대폭 향상시킨다.
소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer)은 매우 공격적이고 치명적이며 광범위하게 전이되는 폐암으로 전체 폐암의 약 15%를 차지하며, 병리학, 분자생물학, 생물학 및 임상학에 있어서 다른 폐암과 매우 다르다. 매년 234,000명 이상의 SCLC 환자가 진단되고, 그 결과 매년 전 세계적으로 약 250,000명이 사망하는 것으로 추산된다. SCLC는 빠른 종양 성장, 높은 혈관분포, 불안정한 게놈 및 초기 전이성 확산이 특징이다. 지난 30년 동안 SCLC의 검출, 치료 또는 생존율이 약간만 개선되어 SCLC가 난치성 암으로 분류되었다. 수술이나 방사선 요법, 또는 이 두 가지를 병용하는 등의 국소 치료로는 완전히 치료하는 것이 거의 불가능하다. 백금 기반 병용 화학요법은 치료의 초석으로 남아 있다. 제1선의 표준 치료계획은 백금[카보플라틴(carboplatin) 또는 시스플라틴(cisplatin)]과 다른 세포독성 약물[예: 에토포시드(etoposide)]을 병용하는 것으로 이루어진다. 소세포 폐암에 대한 화학요법의 반응률은 매우 높지만, 특히 광범위 병기의 환자에서는 재발을 동반하는 경우가 종종 있다. 제한된 병기 환자의 경우 생존 기간 중간값은 14 내지 20개월인 반면, 광범위 병기 환자의 경우 이는 9 내지 11개월에 불과하다. 재발 환자의 경우 생존 기간이 더 짧고 치료 선택지도 거의 없다. FDA가 권장하는 유일한 제제인 토포테칸(topotecan)은 혈액학적 독성으로 인해 한계가 있고, 치료 반응률도 5 내지 24%에 불과해 만족스럽지 못하다. 생존 기간 중간값은 25주 미만이다. 현재로서는 구체적인 제3선의 치료 권장사항이 없어 새로운 효과적인 치료 약물이 시급히 필요하다.
DLL3으로도 알려진 델타-유사 3은 DLL3 유전자에 의해 인코딩된 단백질이며 노치(Notch) 계열의 리간드 중 하나이다. DLL3은 DLL1과 단지 36%의 상동성을 가지며 DLL1 및 DLL4 등의 다른 델타 유형 dsl(delta/serate/lag-2) 단백질과 달리 DLL3은 태아 뇌의 정상 조직에서 가장 높은 발현을 가지며 근축(近軸) 중배엽의 성장과 발달에 중요한 역할을 한다. 이는 소세포 폐암과 대세포 신경내분비암 환자의 약 85%에서 종양세포 표면에 발현되고, 다형 교모세포종, 흑색종, 췌장암, 및 직장암에서도 높게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 그러나 이는 건강한 조직과 비신경내분비 종양에서는 발현되지 않는다. 이 단백질은 노치 경로의 신호전달이 궁극적으로 암의 무제한 성장을 촉진하도록 노치 조절 신호전달 경로에 영향을 미치는 데 관여한다. 정상 조직에서 DLL3의 mRNA 발현은 뇌, 식도 및 췌장으로 제한된다.
연구에 따르면, 종양 조직 및 정상 조직 표본 분석에서 원발성 SCLC 생검, SCLC 세포주 및 정상 폐 생검의 전체 전사체 서열분석 데이터에서 DLL3의 발현을 검출함으로써 SCLC에서 DLL3의 mRNA가 정상 폐에 비해 약 35배 증가한 것으로 나타났다. 이러한 SCLC 종양 샘플을 암 게놈에서 정상 조직 및 기타 종양 유형의 전사체 데이터와 비교하여, 원발성 SCLC 종양 샘플 및 저등급 신경아교종(LGG), 교모세포종(GBM) 및 흑색종(SKCM)에서 DLL3 발현이 증가됨을 추가로 확인하였다. 임상 폐암 게놈 프로젝트의 일루미나 비이드칩(Illumina BeadChip) 데이터에서도 NSCLC에 비해 원발성 SCLC 종양 표본에서 DLL3가 상승한 것으로 나타났다.
암 세포주 백과사전(Cancer Cell Line Encyclopedia)에서 수득된 데이터는 DLL3 mRNA의 발현이 SCLC 세포주에서 특히 증가한다는 것을 추가로 확인시켜 주었다. 종합적으로, 여러 기술 플랫폼 및 샘플을 통한 이러한 발현 데이터는 DLL3 mRNA가 원발성 SCLC 종양, SCLC PDX, 전통적인 SCLC 세포주 및 LCNEC PDX에서 과발현되는 반면, 정상 조직에서의 mRNA 발현은 주로 뇌로 제한된다는 것을 시사한다.
본 개시내용의 목적은 계열 단백질 DLL1 및 DLL4에 비특이적으로 결합하지 않고 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있는, DLL3에 대한 결합 분자 및 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 개시내용의 제1 양태는:
i) 서열 번호 6, 9, 12, 15 또는 18로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1);
ii) 서열 번호 7, 10, 13, 16, 또는 19로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2); 및
iii) 서열 번호 8, 11, 14, 17, 20, 110, 또는 111로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3)을 포함하는 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 아미노산 서열은 각각 다음과 같다:
a) 서열 번호 6, 7, 및 8; 또는
b) 서열 번호 9, 10, 및 11; 또는
c) 서열 번호 12, 13, 및 14; 또는
d) 서열 번호 15, 16, 및 17; 또는
e) 서열 번호 18, 19, 및 20; 또는
f) 서열 번호 6, 7, 및 110; 또는
g) 서열 번호 6, 7, 및 111.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1 내지 5, 및 21 내지 29 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 1 내지 5, 및 21 내지 29 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 두 번째 양태는 다음을 포함하는 또 다른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
i) 서열 번호 57, 63, 69, 72, 78, 84, 93 또는 99로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1).
ii) 서열 번호 58, 64, 70, 73, 79, 85, 94, 또는 100으로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2).
iii) 서열 번호 59, 65, 71, 74, 80, 86, 95 또는 101로부터 선택된 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3).
iv) 서열 번호 60, 66, 75, 81, 87, 90, 96, 또는 102로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1).
v) 서열 번호 61, 67, 76, 82, 88, 91, 97, 또는 103으로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2); 및
vi) 서열 번호 62, 68, 77, 83, 89, 92, 98, 104, 112, 113 또는 114로부터 선택된 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3).
한 실시양태에서, DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 여기서 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 아미노산 서열은 각각 다음과 같다:
a) 서열 번호 57, 58, 59, 60, 61, 및 62; 또는
b) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67 및 68; 또는
c) 서열 번호 69, 70, 71, 66, 67 및 68; 또는
d) 서열 번호 72, 73, 74, 75, 76 및 77; 또는
e) 서열 번호 78, 79, 80, 81, 82 및 83; 또는
f) 서열 번호 84, 85, 86, 87, 88, 및 89; 또는
g) 서열 번호 84, 85, 86, 90, 91 및 92; 또는
h) 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97 및 98; 또는
i) 서열 번호 99, 100, 101, 75, 76 및 77; 또는
j) 서열 번호 72, 73, 74, 102, 103 및 104; 또는
k) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67 및 112; 또는
l) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67, 및 113; 또는
m) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67 및 114.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 30, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 또는 51 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 30, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 또는 51 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 31, 33, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 55, 또는 56 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 31, 33, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 55, 또는 56 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다:
1) 서열 번호 30 및 31; 또는
2) 서열 번호 32 및 33; 또는
3) 서열 번호 34 및 33; 또는
4) 서열 번호 35 및 36; 또는
5) 서열 번호 37 및 38; 또는
6) 서열 번호 39 및 40; 또는
7) 서열 번호 39 및 41; 또는
8) 서열 번호 42 및 43; 또는
9) 서열 번호 44 및 36; 또는
10) 서열 번호 35 및 45; 또는
11) 서열 번호 46 및 47; 또는
12) 서열 번호 46 및 48; 또는
13) 서열 번호 49 및 50; 또는
14) 서열 번호 51 및 52; 또는
15) 서열 번호 51 및 53; 또는
16) 서열 번호 46 및 54; 또는
17) 서열 번호 46 및 55; 또는
18) 서열 번호 46 및 56.
본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는 중쇄 불변 영역은 Fc를 포함하고; 더욱 바람직하게는 Fc는 뮤린 또는 인간으로부터 유래되고; 더욱 바람직하게는 Fc의 서열은 천연 서열이거나 변형된 서열이다.
본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론성 항체, 이중특이적 결합 분자, 다중특이적 결합 분자, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 항체, 완전 인간 항체, 전장 항체, 중쇄 항체, 나노바디, Fab, Fv, scFv, F(ab')2, 선형 항체 또는 단일 도메인 항체일 수 있다.
본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 형태일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 포획 표지 또는 검출 표지에 커플링시킴으로써 형성된 접합체를 제공하고; 바람직하게는, 검출 표지는 방사성 핵종, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소를 포함한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 또 다른 생물학적 활성 분자와 커플링시킴으로써 형성된 항체 약물 접합체(ADC: antibody drug conjugate)를 제공하고; 다른 생물학적 활성 분자는 소분자 약물이며; 바람직하게는 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통해 다른 생물학적 활성 분자에 연결된다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이러한 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 및 이러한 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli), 또는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 효모이고; 더욱 바람직하게는 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 HEK293 세포이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 적합한 조건하에 상기 기재된 숙주 세포를 배양하고 세포로부터 발현 생성물을 정제하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 또한 종양의 치료 또는 개선을 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 약제는 DLL3을 비정상적으로 발현하는 종양 세포를 표적으로 한다.
한 실시양태에서, 종양은 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암, 및 전술된 종양의 전이암으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 종양의 치료 또는 개선을 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
한 실시양태에서, 검출 시약은 DLL3의 발현을 검출하기 위해 사용되며; 진단 시약은 종양 진단에 사용되고; 바람직하게는 종양은 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암 및 전술된 종양의 전이암으로부터 선택된다.
본 개시내용은 또한 샘플에서 DLL3 발현을 검출하는 방법을 제공하며, 이 방법은:
(1) 샘플을 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(2) DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편과 DLL3의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하고; 선택적으로, DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편은 검출 가능하게 표지화된다.
본 개시내용은 또한 유효량의 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 유효량의 본 개시내용의 항체 약물 접합체, 또는 유효량의 본 개시내용의 핵산, 또는 유효량의 본 개시내용의 재조합 벡터, 또는 유효량의 본 개시내용의 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 용기 및 용기 내의 본 개시내용의 약학적 조성물을 포함하는 약물 상자 또는 키트를 제공한다.
본 개시내용은 또한 DLL3을 발현하는 세포의 사멸을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 세포를 본 개시내용의 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며, DLL3을 발현하는 세포는 종양 세포이다.
한 실시양태에서, 종양 세포는 다음 종양으로부터 선택된 세포이다: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암, 및 전술된 종양의 전이암.
본 개시내용은 또한 피험체에서 DLL3의 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 개시내용의 약학적 조성물, 또는 전술된 약물 상자 또는 키트를 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 질환은 종양이고; 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암, 및 전술된 종양의 전이암이다.
한 실시양태에서, 방법은 추가적인 치료제를 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 기술적 해결책은 다음과 같은 유리한 효과를 갖는다: 본 개시내용의 DLL3 결합 분자 및 이의 항원 결합 단편은 계열 단백질 DLL1 및 DLL4에 비특이적으로 결합하지 않고 DLL3에 특이적으로 결합할 수 있다.
도면은 본원에 개시된 신규 특징을 추가로 예시한다. 본 명세서에 개시된 특징 및 이점은 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이지만, 도면은 단지 본원에 개시된 원리의 특정 실시양태를 예시하기 위한 목적일 뿐이며 첨부된 청구범위의 범주를 제한하려는 의도는 없는 것으로 이해된다.
도 1a는 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합을 보여준다.
도 1b는 DLL3 발현 세포(HEK293-cyno DLL3)에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합을 보여준다.
도 2a는 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 2b는 DLL3 발현 세포(HEK293-cyno DLL3)에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 3a는 계열 단백질 DLL1에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 3b는 계열 단백질 DLL4에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 4는 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 낙타 유래 hDLL3-3-1 인간화 항체 변이체의 결합을 보여준다.
도 5a는 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합을 보여준다.
도 5b는 DLL3-발현 세포(HEK293-cyno DLL3)에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마-유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합을 보여준다.
도 6은 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 7a는 계열 단백질 DLL1에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 7b는 계열 단백질 DLL4에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합을 보여준다.
도 8은 DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 본 개시내용의 마우스 하이브리도마 유래 인간화 H2-39E2D11 항체 변이체의 결합을 보여준다.
용어
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 본워에 포함된다.
본 개시내용이 아래에 상세히 기재되기 전에, 본 개시내용은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약이 댜앙할 수 있으므로 이들에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것으로, 본 기재내용의 범주를 한정하려는 의도가 아닌 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 개시된 특정 실시양태는 수치 범위를 포괄하며, 본 개시내용의 특정 양태는 범위에 관해서 기재될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 수치 범위 또는 범위에 대한 기재는 단지 간결함과 편의를 위한 것이며 본 개시내용의 범주를 엄격하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위 접근법을 사용한 기재는 가능한 모든 하위 범위 및 해당 범위 내의 모든 가능한 특정 수치 포인트를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 하며, 이는 이러한 하위 범위 및 수치 포인트가 본원에 명확하게 언급되었기 때문이다. 위의 원칙은 인용된 수치의 폭에 관계없이 동일하게 적용된다. 범위가 기재되는 경우 범위에는 범위의 끝점이 포함된다.
"약"이라는 용어는 양, 일시적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 지정된 값의 ±20%, 일부 경우에 ±10%, 일부 경우에 ±5%, 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 아미노산의 3문자 코드와 1문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)]에 기재된 바와 같다.
본원에서 사용되는 경우, 용어 "항체"에는 온전한 항체(예: 전장 단일클론성 항체) 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, 항원 결합 부분) 또는 이의 단일 사슬, 뿐만 아니라 온전한 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 기반으로 조작된(예를 들어, 다른 펩타이드 분절, 재배열된 기능성 단위 등에 연결된) 항원 특이적 결합 능력을 갖는 생성물이 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 전형적으로 공유 이황화 결합 및 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된 2개의 폴리펩타이드 중쇄(H) 및 2개의 폴리펩타이드 경쇄(L)를 포함하는 Y형 사량체 단백질을 지칭한다. 천연 IgG 항체는 이러한 구조를 갖는다. 각 경쇄는 가변 도메인(VL)과 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각 중쇄는 가변 도메인(VH)과 불변 영역으로 구성된다.
당업계에 알려진 다음과 같은 항체의 5가지 주요 범주가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM(α,δ,ε,γ 및 μ라고 불리는 상응하는 중쇄 불변 도메인 포함); IgG와 IgA는 서로 다른 하위부류로 추가로 나뉠 수 있으며, 예를 들어 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4로 나뉠 수 있고, IgA는 IgA1과 IgA2로 나뉠 수 있다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 도메인 아미노산 서열을 기준으로 κ 및 λ라고 칭해지는 두 가지 별개의 유형 중 하나로 정해질 수 있다.
IgG, IgA 및 IgD 항체의 경우 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3으로 지정된 3개의 도메인을 포함한다(IgM 및 IgE는 네 번째 도메인 CH4를 가짐). IgG, IgA 및 IgD 부류에서 CH1 및 CH2 도메인은 가변 길이의 프롤린 및 시스테인이 풍부한 분절인 유연한 힌지 영역에 의해 분리된다. 각 부류의 항체는 쌍을 이루는 시스테인 잔기로부터 형성된 사슬간 및 사슬내 이황화 결합을 추가로 포함한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 한 항체에서 또 다른 항체로의 아미노산 조성에 있어서 중요한 변화를 나타내며 주로 항원 인식 및 결합을 담당한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 IgG 항체가 2개의 결합 부위를 갖도록(즉, 2가이도록) 항체 결합 부위를 형성한다. 중쇄의 가변 영역(VH)과 경쇄의 가변 영역(VL)은 각각 HVR로, 또는 보다 일반적으로는 상보적 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 극도의 가변성의 3개 영역을 포함하며, 각각의 VH 및 VL은 FR1, FR2, FR3, FR4로 각각 지정된 4개의 골격구조 영역 FR을 갖는다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 전형적으로 다음 서열의 중쇄 가변 도메인(또는 경쇄 가변 도메인)에 나타난다: FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4.
"Fc"라는 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역이 포함한다.
본원에서 사용되는 경우, "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 예를 들어 다중클론성 항체, 단일클론성 항체, 키메라 항체, 인간화 및 영장류화 항체, CDR-그래프트된(grafted) 항체, 인간 항체(재조합 인간 항체 포함), 재조합 항체, 세포내 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항-이디오타입(idiotypic) 항체, 합성 항체[뮤테인(mutein) 및 변이체 포함] 등을 포함할 수 있다.
"단일클론성 항체"(또는 "mAb")라는 용어는 실질적으로 동종성이고 특정 에피토프만 겨냥하는 단일 세포 클론에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 단일클론성 항체는 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 형질전환 동물, 합성 기술, 이들의 조합 등을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본 개시내용의 단일클론성 항체의 가변 영역에 대한 CDR 및 FR의 분할은 카밧(Kabat) 정의에 따라 결정된다는 점에 유의한다. 코티아(Chothia), IMGT 또는 AHo와 같은 다른 명명 및 넘버링 체계는 당업자에게 알려져 있다. 따라서, 본 개시내용의 단일클론성 항체의 서열에 기초한 임의의 명명법으로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하는 인간화 항체는 명백히 본 개시의 범주 내에 남아 있다.
"인간화 항체"라는 용어는 비인간 항체(예: 마우스 항체)의 CDR 이외의 아미노산의 전부 또는 일부가 인간 면역글로불린 유래의 상응하는 아미노산으로 대체된 항체를 지칭한다. 특정 항원에 결합하는 항체의 능력을 제거하지 않는 한 아미노산의 작은 부가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 허용된다. "인간화" 항체는 본래의 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다.
"키메라 항체"라는 용어는 가변 영역이 한 종에서 유래하고 불변 영역이 또 다른 종에서 유래하는 항체, 예를 들어 가변 영역이 마우스 항체에서 유래하고 불변 영역이 인간 항체에서 유래하는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"이라는 용어는 온전한 항체의 적어도 일부를 포괄한다. 본원에서 사용되는 경우, 항체 분자의 "단편"은 항체의 "항원 결합 단편"을 포함하고, "항원 결합 단편"이라는 용어는 선택된 항원 또는 이의 면역원성 결정 부분, 또는 단편으로부터 추가로 유래된 융합 단백질 생성물, 예를 들어 단일 사슬 항체, 키메라 항원 수용체의 세포외 결합 영역 등에 특이적으로 결합하거나 이와 반응하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩타이드 단편을 지칭한다. 예시적인 항체 단편 또는 이의 항원 결합 단편에는 가변 경쇄 단편, 가변 중쇄 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 선형 항체, 단일 사슬 항체(scFv), 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 또는 다중특이적 항체 등이 포함된다.
"항원"이라는 용어는 항체 또는 항체 결합 단편에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 물질을 지칭한다. 넓은 의미에서 항원은 단일 에피토프, 다중 에피토프, 단일 도메인, 다중 도메인, 완전한 세포외 ECD 또는 단백질을 포함하여, 선택된 표적의 임의의 면역원성 단편 또는 결정기를 포함할 수 있다. 펩타이드, 단백질, 당단백질, 다당류, 지질, 이들의 일부 및 이들의 조합은 항원을 구성할 수 있다. 비제한적인 예시적 항원에는 종양 항원 또는 병원체 항원 등이 포함된다. "항원"은 또한 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭할 수도 있다. 항원 결정기에 특이적인 항체를 생성하기 위해 임의의 형태의 항원, 또는 항원을 함유하는 세포 또는 제제를 사용할 수 있다. 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질(예: 표면에 항원의 적어도 일부를 발현하는 세포로 면역화됨) 또는 가용성 단백질(예: 단백질의 ECD 부분만으로 면역화됨), 또는 단백질 작성물(예: Fc 항원)일 수 있다. 항원은 유전적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 전술된 임의의 항원은 단독으로 사용될 수 있거나 당업계에 공지된 하나 이상의 면역원성 강화 보조제와 병용하여 사용될 수 있다. 항원을 인코딩하는 DNA는 게놈성 또는 비-게놈성(예: cDNA)일 수 있으며 면역원성 반응을 일으키기에 충분한 ECD의 적어도 일부를 인코딩할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드, 및 양이온성 지질과 같은 비-바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 벡터를 사용하여 항원이 발현되는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘을 통해 병치된 비인접 아미노산에 의해 형성될 수 있다. 인접한 아미노산에 의해 형성된 에피토프는 일반적으로 변성 용매에 노출된 후에도 유지되는 반면, 3차 접힘을 통해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리한 후에 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유의 공간 입체형태로 존재하며 적어도 3-15개의 아미노산을 포함한다. 주어진 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 무엇보다도 면역블로팅(immunoblotting) 및 면역침강 검정을 포함한다. 에피토프의 공간 입체형태를 결정하는 방법에는 X선 결정 분석 및 2차원 핵자기 공명과 같은 이 분야의 기술이 포함된다.
"이중특이적 결합 분자" 및 "다중특이적 결합 분자"라는 용어는 각각 2개 이상의 상이한 항원(또는 에피토프)에 대한 특이성을 갖는 결합 분자(예를 들어 항체 또는 항체 단편을 포함하는 분자), 바람직하게는 이중특이적 항체를 지칭한다.
본 개시내용에서 가변 영역을 사용하여 항체, 결합 분자, 이중특이적 결합 분자 또는 다중특이적 결합 분자를 생산하는 경우, 불변 영역은 특별히 제한되지 않는다. 당업자에 의해 공지된 불변 영역 또는 자체 수득된 불변 영역을 사용하고, 불변 영역 부분에 아미노산 변이(Fcγ 수용체 또는 FcRn과의 결합을 증가 또는 감소시키는 돌연변이 등)를 도입하는 것이 가능하다.
본 개시내용의 결합 분자, 항원 결합 단편, 항체, 이중특이적 결합 분자 또는 다중특이적 결합 분자를 수득하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 임의의 방법[Cold Spring Harbor's Using Antibodies: A Laboratory Manual, chapters 5-8 and 15]에 의해 수득될 수 있다. 발명된 결합 분자, 항원 결합 단편, 항체, 이중특이적 결합 분자 또는 다중특이적 결합 분자는 통상적인 방법을 사용하여 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA 서열은 클로닝되고 발현 벡터 내로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포 내로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 더욱 권장되는 통상적인 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 유도할 수 있다. 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시킴으로써 안정적인 클론이 수득된다. 양성 클론을 생물반응기의 무혈청 배지에서 확장시켜 항체를 생성하였다. 항체 분비 배지는 통상적인 기술을 사용하여 정제되고 수집될 수 있다. 항체는 통상적인 방법을 사용하여 여과에 의해 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체는 분자체 및 이온 교환과 같은 통상적인 방법에 의해 제거될 수도 있다.
"항체 약물 접합체"(ADC: antibody drug conjugate)라는 용어는 치료 활성 물질 또는 활성 약학 성분(API: active pharmaceutical ingredient)에 공유적으로 접합하여 치료 활성 물질 또는 활성 약학 성분(API)이 항체의 결합 표적을 표적으로 삼아 약리학적 기능을 나타내는 항체를 지칭한다. 치료 활성 물질 또는 활성 약학 성분은 ADC의 표적이 되는 세포, 바람직하게는 악성 세포 또는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독소일 수 있다. 치료 활성 물질, 활성 약학 성분 또는 세포독소의 공유 결합은 적재물을 라이신 또는 시스테인 잔기에 커플링시키는 표준 화학적 링커를 사용하는 비-부위-특이적 방식으로 수행될 수 있거나, 바람직하게는 접합은 부위-특이적 방식으로 수행되는데, 이는 접합 부위와 생성된 ADC에 대한 약물 특이적 항체의 비율을 완전히 제어할 수 있게 해준다.
"친화도" 또는 "결합 친화도"라는 용어는 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 모든 비공유 상호작용의 강도를 지칭한다. "KD"라는 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다. 결합 친화도는 무엇보다도 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭법, 이중 편광 간섭법, 정적 광산란, 동적 광산란, 등온 적정 열량법, ELISA, 분석용 초원심분리 및 유세포 분석법과 같은 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
"생물학적 활성"이라는 용어는 항원에 결합하여 시험관내 또는 생체내에서 측정할 수 있는 측정 가능한 생물학적 반응을 일으키는 항체의 능력을 지칭한다.
본 개시내용의 약학적 조성물은 원하는 경우 불활성인 적합한 약학적으로 허용되는 담체, 비히클 등과 혼합하여 제형화될 수 있으며, 예를 들어 생리 식염수, 멸균수, 부형제, 안정화제, 항산화제(예를 들어 아스코르브산 등), 완충제, 보존제, 계면활성제, 킬레이트제(예: EDTA 등) 또는 결합제 등이 있다. 또한, 기타 저분자량 폴리펩타이드, 혈청 알부민, 젤라틴, 면역글로불린 등의 단백질, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 글루탐산, 아스파르트산, 메티오닌, 아르기닌, 라이신 등의 아미노산, 다당류, 단당류, 탄수화물 등의 탄수화물류, 만니톨, 소르비톨 등의 당 알코올이 포함될 수 있다. 주사용 수용액, 예를 들어 생리식염수의 경우, 포도당 및 기타 보조제(예: D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨)를 함유한 등장성 용액이 알코올(에탄올 등), 폴리올(프로필렌 글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, HCO-50) 등과 같은 적합한 공용매와 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 제형에 히알루로니다아제를 혼합하여 더 많은 양의 수액을 피하 투여하는 것도 가능하다.
본 개시내용에 개시된 결합 분자 또는 항원-결합 단편은 다른 약물과 병용하여 사용될 수 있고, 활성 성분은 함께 혼합되어 단일 투여 단위를 형성할 수 있거나, 하나의 투여 단위로 별도로 사용될 수 있다.
"유효량"이라는 용어는 단일 또는 다중 투여량으로 투여된 후 치료되는 환자에서 기대되는 효과를 생성하는 본원에 개시된 항체 또는 단편의 약물 제형의 투여량을 지칭한다. 유효량은 인종 차이, 체중, 연령 및 건강 상태; 관련된 특정 질병; 질병의 중증도; 개별 환자 반응; 투여되는 특정 항체; 투여 방식; 투여되는 제형의 생체이용률 특성; 선택된 약제 투여계획; 임의의 동반 치료법의 사용과 같은 다양한 요소를 고려하여 해당 분야의 숙련된 주치의가 쉽게 결정할 수 있다.
"키트" 또는 "시약 키트"라는 용어는 단위 투여 형태의 본 개시내용의 하나 이상의 약학적 조성물의 유효량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약물 키트는 멸균 용기를 포함하고; 그러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 백, 블리스터 팩(blister pack), 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 합판지, 금속 호일 또는 약을 담는 데 적합한 기타 재료로 만들어질 수 있다. 또한, 약물 키트는 본 개시내용의 약학적 조성물을 개별체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다. 본 개시내용의 약학적 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 방법은 일반적으로 명세서에 포함된다.
본원에서 사용되는 경우, "개별체" 또는 "피험체"라는 용어는 포유동물 또는 유대동물과 같은 임의의 동물을 지칭한다. 본 개시내용의 개별체에는 인간, 비인간 영장류[예를 들어 시노몰구스(cynomolgus) 또는 붉은 털 원숭이 또는 다른 유형의 짧은꼬리 원숭이], 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 임의의 종의 가금류가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 경우, "질병", "증상" 또는 "질환"이라는 용어는 세포, 조직 또는 기관의 정상적인 기능을 손상시키거나 방해하는 임의의 변화 또는 장애를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 "질병"에는 종양, 병원체 감염, 자가면역 질환, T 세포 기능부전 질환 또는 면역 관용의 결함(예: 이식 거부)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 경우, "종양"이라는 용어는 세포 또는 조직의 병리학적 증식, 및 다른 조직 또는 기관의 후속적인 이동 또는 침윤을 특징으로 하는 질병을 지칭한다. 종양 성장은 일반적으로 제어되지 않고 점진적이며 정상적인 세포 증식을 유도하거나 억제하지 않는다.
본원에서 사용되는 경우, "치료"라는 용어는 예방적으로 또는 임상적으로 병리학적으로 개별체를 변경하거나 세포로 인한 질병 과정을 치료하려는 시도의 임상적 개입을 지칭한다. 치료 효과에는 질병의 발병 또는 재발의 예방, 증후의 완화, 질병의 임의의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행 지연, 질병 상태의 완화 또는 경감, 예후의 경감 또는 호전 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
실시예
본 개시내용은 다음의 특정 실시예에 의해 추가로 예시된다. 실시예는 단지 본 개시내용을 예시하기 위해 사용된 것이며 본 개시내용의 범주를 제한하기 위해 사용된 것이 아님이 이해되어야 한다. 하기 실시예에서 특정 조건이 지시되지 않은 실험 절차는 일반적으로 통상적인 조건[예를 들어 샘브룩(J. SAMBROOK) 등의 문헌 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. Science Press, 2002"에 기재된 조건]에 따라 또는 제조업체에서 권장하는 바와 같이 수행된다.
실시예 1. 인간 DLL3 및 시노몰구스 원숭이 DLL3 항원 정보
실시양태에서 사용된 인간 DLL3(서열 번호 105)[유니프롯 식별번호(Uniprot ID:): Q9 NYJ7]의 전장 아미노산 서열은 아래에 제시되며, 이는 칵투스 바이오시스템스(Kactus Biosystems)(카탈로그 번호: DLL-HM103)에서 구입하였다.
참고: 이중 밑줄 부분은 신호 펩타이드(1-26)를 나타내고; 밑줄 부분은 DLL3의 세포외 도메인(27-492)을 나타내며; 점선은 막횡단 영역(493-513)을 나타내고; 이탤릭체 부분은 세포내 영역(514-618)을 나타낸다.
실시양태에서 사용된 시노몰구스 원숭이 DLL3(cyno DLL3)의 전장 아미노산 서열(서열 번호 106)(유니프롯 식별번호: A0A2K5WSR4)은 아래에 제시되며, 이는 칵투스 바이오시스템스(카탈로그 번호: CM103)에서 구입하였다.
참고: 이중 밑줄 부분은 신호 펩타이드(1-26)를 나타내고; 밑줄 부분은 DLL3의 세포외 도메인(27-490)을 나타내며; 점선은 막횡단 영역(491-513)을 나타내고; 이탤릭체 부분은 세포내 영역(514-618)을 나타낸다.
실시예 2. 계열 구성원 DLL1 및 DLL4 항원 정보
실시양태에서 사용된 인간 DLL1의 전장 아미노산 서열(서열 번호 107)(유니프롯 식별번호: O00548)은 아래에 제시되며, 이는 시노 바이올로지칼(Sino Biological)(카탈로그 번호: 11635-H08H)에서 구입하였다.
Figure pct00003
참고: 이중 밑줄 부분은 신호 펩타이드(1-17)를 나타내고; 밑줄 부분은 DLL3의 세포외 도메인(18-545)을 나타내며; 점선은 막횡단 영역(546-568)을 나타내고; 이탤릭체 부분은 세포내 영역(569-723)을 나타낸다.
실시양태에서 인간 DLL4의 전장 아미노산 서열(서열 번호 108)(유니프롯 식별번호: Q9NR61)은 시노 바이올로지칼(카탈로그 번호: 10171-H08H)에서 구입한 것으로 아래에 표시된다.
참고: 이중 밑줄 부분은 신호 펩타이드(1-26)를 나타내고; 밑줄 부분은 DLL3의 세포외 도메인(27-529)을 나타내며; 점선은 막횡단 영역(530-550)을 나타내고; 이탤릭체 부분은 세포내 영역(551-685)을 나타낸다.
실시예 3. 낙타 면역성을 위한 중쇄 항체 면역 라이브러리 작성
낙타를 인간 DLL3 항원(실시예 1에 기재됨)으로 면역화시켰다. 면역접종일은 각각 0일, 21일, 35일, 및 49일로 총 4회 면역접종을 실시하였다. 혈액 샘플을 각각 28일, 42일, 및 73일에 수집하였으며 면역 반응을 ELISA로 검출하였다. 혈청 역가는 1:128000 이상으로 검출되었다. 면역접종 완료 후 면역된 낙타로부터 다시 혈액 샘플 100㎖를 채취하였고, 제조업체의 지침에 따라 솔라바이오(Solarbio)의 림프구 분리액을 이용하여 낙타의 PBMC를 분리하였다. 전체 RNA를 추출한 후[오메가(OMEGA) 세포 전체 RNA 추출 키트] 타카라 프라임스크립트(Takara PrimeScript)(상표명) II 역전사 키트를 주형으로 사용하여 cDNA를 합성하고, 고안된 특정 프라이머를 사용하여 둥지(Nested) PCR을 통해 VHH 유전자 단편을 증폭시켰다. VHH 단편을 회수한 후, 단편을 SfiI 분해에 의해 pADL-23c 파지미드 벡터에 결찰시키고, TG1 전기천공 컴피턴트(competent) 세포를 사용하여 DLL3 낙타의 면역 라이브러리를 작성하였다(수용력: 1.12E8).
실시예 4. 낙타 유래 항-DLL3 양성 클론의 스크리닝
인간 DLL3 및 시노몰구스 원숭이 DLL3에 교차 결합할 수 있는 양성 항체를 수득하기 위해, 상기 라이브러리를 증폭시키고 M13K07 헬퍼 파지에 첨가하여 파지를 조립하였다. 1×1012 pfu의 낙타 면역 라이브러리 파지를 첨가하고 자기 비드에 결합된 비오티닐화 인간 DLL3 단백질(8㎍/㎖)과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 0.05% PBST로 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거한 후, DLL3에 특이적으로 결합된 파지를 100mM 트리에틸아민으로 용출시켰다. 구배 희석 후, 이. 콜라이 SS320의 대수기 성장을 감염시키고 37℃에서 밤새 암피실린(ampicillin) 플레이트에 도말해 두었다. IPTG 유도된 발현을 위해 단일 클론을 선택하고, 상청액을 ELISA 검출에 사용하였다. ELISA 플레이트를 각각 2㎍/㎖의 인간 DLL3 또는 시노몰구스 원숭이 DLL3 항원으로 4℃에서 밤새 코팅해 두었다. 플레이트를 0.05% PBST로 3회 세척한 후, 5% 탈지유로 실온에서 1시간 동안 차단하고, 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 그 후, 각 웰에 30㎕의 유도된 상청액을 첨가하고, 음성 대조군 웰에는 배양 배지를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 마지막으로, 항-Myc HRP 검출을 수행하였다(IPTG 유도에 의해 발현된 VHH에는 his 및 c-Myc 표지가 있음). 음성 대조군 배지에 비해 1.0보다 큰 OD450 값 및 3보다 큰 ELISA OD450 비율을 갖고 인간 및 시노몰구스 원숭이 DLL3에 결합한 클론을 ELISA 검정으로부터 서열분석함으로써 본 개시내용의 5개의 중쇄 항체 가변 영역의 아미노산 서열을 수득하였고, 결과를 표 1에 제시한다.
5개의 낙타 유래 항-DLL3 중쇄 항체 가변 영역의 아미노산 서열
클론
번호		 서열
번호		 가변 중쇄 (VHH)
DLL3-3 1 DVQLVESGGGSVQAGGSLKLSCKSPTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISADNAEKTVYLQMNTLKPEDSAMYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTQVTVSS
DLL3-12 2 QVQLVESGGGLVQPGESLRLSCAGSGFAFSSYDMHWVRQAPGKDFEWVSSISRDGRGPRYADFVKGRFTISKDNGRNMLYLQLNSLEIEDTAMYYCSKGYPIMGGTTQGTQVTVSS
DLL3-26 3 QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGDIYSSSYVGWFRQAPGKEREGVAIIYTSGDSTYYANSVKGRFTISQDKAKKTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARFAIDNSNYWGQGTQVTVSS
DLL3-122 4 QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCTASGDTYRSYCMGWFRKAPGKEREGVADIVSDGSTSYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAVDRGGSGGYCYTGRYDYWGQGTQVTVSS
DLL3-276 5 QVQLVESGGGSVQAGGSLNLSCATSGSTASTTYMGWFRQAPGKGREGVAIIYTARDNPWYANSVKGRFIISQDNAKKTLYLQMNTLKPEDTATYYCAATLANPTRTAWGQGTLVTVSS
상기 아미노산 서열을 기초로 카밧 넘버링 규칙을 이용하여 항체 가변 영역의 CDR과 FR을 구분하였고, 각 항체의 3개의 CDR 서열의 조성을 하기 표 2에 제시한다.
5개의 낙타 유래 항-DLL3 중쇄 항체의 CDR 서열
클론
번호		 HCDR1 HCDR2 HCDR3
DLL3-3 서열 번호 6 7 8
아미노산 서열 SGYMG AAIYIGGSTTLYADSVKG QLRPNSAYHPLDGRKYNY
DLL3-12 서열 번호 9 10 11
아미노산 서열 SYDMH SSISRDGRGPRYADFVKG GYPIMGG
DLL3-26 서열 번호 12 13 14
아미노산 서열 SSYVG AIIYTSGDSTYYANSVKG RFAIDNSNY
DLL3-122 서열 번호 15 16 17
아미노산 서열 RSYCMG ADIVSDGSTSYADSVKG DRGGSGGYCYTGRYDY
DLL3-276 서열 번호 18 19 20
아미노산 서열 TTYMG IIYTARDNPWYANSVKG TLANPTRTA
실시예 5. 낙타 유래 항-DLL3 키메라 항체의 작성 및 진핵 세포에서의 이의 일시적 형질감염 발현
본 개시내용의 서열분석된 중쇄 항체 가변 영역을 인간 IgG1 불변 영역과 함께 스플라이싱(splicing)한 후 생성된 관심 유전자 단편을 pTT5 발현 벡터에 클로닝하여 형질감염 등급 발현 플라스미드를 제조하였다. 중쇄 항체 가변 영역은 짧은 연결 펩타이드에 의해 인간 IgG1 불변 영역에 연결될 수 있으며, 즉 중쇄 항체 가변 영역-짧은 연결 펩타이드-인간 IgG1 불변 영역을 형성할 수 있다. 본 실시예에 사용된 짧은 연결 펩타이드 서열은 GGGGS였다.
도입된 인간 IgG1 불변 영역 서열(서열 번호 109)은 다음과 같다:
Expi293F(상표명) 세포[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)]를 무혈청 배지에서 배양하고, 진탕 플라스크[코닝 인크.(Corning Inc.)]에 접종하고, 37℃, 8% CO2 진탕기에서 배양하였다. 세포 밀도를 조정한 후, 관심 유전자 단편이 포함된 재조합 발현 벡터와 PEI 형질감염 시약을 적절한 비율로 혼합하여 세포 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포 배양 6일 후, 발현 상청액을 수집하고, 고속 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 후, 단백질 A 컬럼을 이용하여 친화성 정제를 실시하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 관심 단백질을 pH 3.0-pH 3.5의 산성 용리액으로 용출시키고 1M 트리스(Tris)-HCl(pH 8.0-9.0)으로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절하게 농축한 후 용액을 PBS로 변경하고 분취하여 나중에 사용하였다. 최종 정제된 키메라 항체에 대해 SDS-PAGE, HPLC 순도 분석 및 A280 농도 측정을 실시하였다.
실시예 6. DLL3 발현 세포에 대한 낙타 유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합
HEK293 세포[중국 과학원(Chinese Academy of Sciences)으로부터]를 세포 배양 및 계대배양을 위해 cyno-DLL3 항원의 전장 유전자(서열에 대해서는 실시예 1 참조)로 형질감염시켰다. 단일클론 선택을 수행하였고, 단일클론성 세포 내 DLL3 단백질의 발현 수준을 유세포 분석법으로 확인하였다. 배양물을 확장시키고 나중에 사용하기 위해 저장소에 보관하였다.
SHP-77 및 HEK293-cyno DLL3 세포를 배양하였다. SHP-77 세포의 배양 배지는 RPMI1640+10% FBS였으며, HEK293 시노 DLL3 세포의 배양 배지는 DMEM+10% FBS+200㎍/㎖ 하이그로마이신(Hygromycin)이었다. 세포를 T75 세포 배양 플라스크에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 세포를 사용하는 경우 멸균 DPBS로 세척하고 0.25% 트립신 EDTA로 약 5분 동안 분해한 후 완전 배지로 정지시켰다.
분해된 세포를 실온에서 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 1E6/m의 세포 밀도로 조정하였다. 희석된 세포를 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트(코닝 3799)에 접종하고, 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 테스트할 항체 샘플을 100nM의 시작 농도에서 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 세포를 100㎕/웰로 희석된 항체로 재현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 2차 항체(염소 항 인간 IgG Fc PE)를 제조업체의 지침에 따라 1% BSA(PBS 중)로 1:200으로 희석하고 세포를 희석된 2차 항체(100㎕/웰)로 재현탁시키고 0.5시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시키고 300 메쉬 거즈를 통해 여과하였다. PE 채널의 평균 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정하였다.
FCS 파일을 유세포 분석기에서 내보내었다. 플로우조(Flowjo) 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 PE 채널의 평균 형광 강도[이하 MFI(mean fluorescence intensity)로 지칭됨]를 분석하였다. 분석된 평균 형광 강도를 그래프패드(Graphpad)로 불러와서 항체와 세포의 결합 농도 중간값(이하 EC50으로 지칭됨)과 최고 평균 형광 강도(Top MFI)를 분석하였다. 결과를 표 3 및 도 1에 제시한다.
DLL3 발현 세포에 대한 항-DLL3 키메라 항체의 결합
클론 번호 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI) EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI)
음성 대조군 항체 정합되지 않음 92 정합되지 않음 104
DLL3-3 0.047 874 0.025 438
DLL3-12 0.092 886 0.073 220
DLL3-26 0.519 821 0.439 450
DLL3-122 0.427 846 0.415 460
DLL3-276 0.374 763 0.897 175
실시예 7. 낙타 유래 항-DLL3 중쇄 항체의 인간화 고안
후보 중쇄 항체와 상동성이 높은 생식세포 유전자 서열을 서열 정렬을 통해 VHH 이식 골격구조 주형으로 선택하였다. 선택된 인간 항체의 가변 영역의 골격구조에 후보 항체의 CDR 영역을 그래프트시킨 후, 개별 아미노산의 역돌연변이를 수행하여 인간화 항체를 수득하였다. 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 표 4에 제시한다.
7개의 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 가변 영역의 아미노산 서열
클론 번호 서열 번호 가변 중쇄 (VHH)
hDLL3-3 -1 21 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-3 -2 22 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKSPTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-12 -1 23 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVSSISRDGRGPRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSKGYPIMGGTTQGTLVTVSS
hDLL3-12 -2 24 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYDMHWVRQAPGKDFEWVSSISRDGRGPRYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSKGYPIMGGTTQGTLVTVSS
hDLL3-26 25 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDIYSSSYVGWFRQAPGKEREGVAIIYTSGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAARFAIDNSNYWGQGTLVTVSS
hDLL3-122 26 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGDTYRSYCMGWFRQAPGKEREGVADIVSDGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAVDRGGSGGYCYTGRYDYWGQGTLVTVSS
hDLL3-276 27 QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGSTASTTYMGWFRQAPGKGREGVAIIYTARDNPWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATLANPTRTAWGQGTLVTVSS
실시예 8. 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체 제조
실시예 5에 기재된 바와 같이, 인간화 항체의 가변 영역과 인간 IgG1의 불변 영역을 스플라이싱한 후 생성된 관심 유전자 단편을 pTT5 발현 벡터에 클로닝하여 형질감염 등급의 발현 플라스미드를 제조하였다.
Expi293F(상표명) 세포(써모 피셔 사이언티픽)를 무혈청 배지에서 배양하고 진탕 플라스크(코닝 인크.)에 접종한 후 37℃, 8% CO2 진탕기에서 배양하였다. 세포 밀도를 조정한 후, 관심 유전자 단편이 포함된 재조합 발현 벡터와 PEI 형질감염 시약을 적절한 비율로 혼합하여 세포 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포 배양 6일 후, 발현 상청액을 수집하고, 고속 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 후, 단백질 A 컬럼을 이용하여 친화성 정제를 실시하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 관심 단백질을 pH 3.0-pH 3.5의 산성 용리액으로 용출시키고 1M 트리스-HCl(pH 8.0-9.0)으로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절하게 농축한 후 용액을 PBS로 변경하고 분취하여 나중에 사용하였다. 최종 정제된 인간화 항체에 대해 SDS-PAGE, HPLC 순도 분석 및 A280 농도 측정을 실시하였다.
실시예 9. 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 시험관내 세포 결합 검증
SHP-77 및 HEK293-cyno DLL3 세포를 배양하였다. SHP-77 세포의 배양 배지는 RPMI1640+10% FBS였으며, HEK293 시노 DLL3 세포의 배양 배지는 DMEM+10% FBS+200㎍/㎖ 하이그로마이신이었다. 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 T75 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포를 사용하는 경우 멸균 DPBS로 세척하고 0.25% 트립신 EDTA로 약 5분 동안 분해한 후 완전 배지로 정지시켰다.
분해된 세포를 실온에서 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 1E6/m의 세포 밀도로 조정하였다. 희석된 세포를 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트(코닝 3799)에 접종하고, 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 테스트할 항체 샘플을 100nM의 시작 농도에서 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 세포를 100㎕/웰로 희석된 항체로 재현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 2차 항체(염소 항 인간 IgG Fc PE)를 제조업체의 지침에 따라 1% BSA(PBS 중)로 1:200으로 희석하고 세포를 희석된 2차 항체(100㎕/웰)로 재현탁시키고 0.5시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시키고 300 메쉬 거즈를 통해 여과하였다. PE 채널의 평균 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정하였다.
FCS 파일을 유세포 분석기에서 내보내었다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 PE 채널의 평균 형광 강도(이하 MFI로 지칭됨)를 분석하였다. 분석된 평균 형광 강도를 그래프패드로 불러와서 항체와 세포의 결합 농도 중간값(이하 EC50으로 지칭됨)과 최고 평균 형광 강도(Top MFI)를 분석하였다. 결과를 표 5 및 도 2에 제시한다.
DLL3 발현 세포에 대한 인간화 항-DLL3 항체의 결합
클론 번호 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI) EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI)
DLL3-3 0.061 864 0.08 379
hDLL3-3 -1 0.086 702 0.22 346
hDLL3-3 -2 0.049 691 0.15 344
DLL3-12 0.114 935 1.38 232
hDLL3-12 -1 0.052 690 2.36 178
hDLL3-12 -2 0.081 804 1.35 190
DLL3-26 0.499 841 0.54 336
hDLL3-26 0.786 696 2.24 301
DLL3-122 0.478 877 0.58 351
hDLL3-122 0.589 778 0.99 351
DLL3-276 0.396 782 2.08 179
hDLL3-276 0.389 622 1.01 148
실시예 10. 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 비아코어(Biacore) 친화도 실험
인간 DLL3에 대한 인간화 항-DLL3 항체의 친화도 및 역학적 특성을 비아코어 8K 기기를 사용하여 분석하였다. CM5 칩을 EDC 및 NHS로 활성화한 후 항-인간 Fc 뮤린 mAb를 고정화하고 에탄올아민으로 차단하였다.
인간 DLL3에 대한 친화도 및 역학적 특성을 결정하기 위해, HBS-EP+(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20) 완충액을 사용하여 DLL3 인간화 항체를 0.2㎍/㎖로 희석하고 45초 동안 10㎕/분의 유속으로 포획하였다. 인간 DLL3을 연속 농도(100nM-0.39nM)로 2배 연속 희석하고 90초 동안 회합시키고 50㎕/분의 유속으로 600초 동안 해리하였다.
각 실험 주기가 완료된 후 3M MgCl2 용액으로 30㎕/분의 유속으로 30초 동안 세척함으로써 포획된 항체를 항원과 함께 제거하여 칩의 재생을 완료하였다. 비아코어 인사이트 이벨류에이션 소프트웨어(Biacore Insight Evaluation Software)(3.0.12.15655) 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석하고 (1:1) 랑뮤(Langmuir) 모델로 정합시켰다. 결과를 표 6에 제시한다.
인간 DLL3 항원성 단백질과 인간화 항-DLL3 항체의 친화도 테스트 결과
클론 번호 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
DLL3-3 2.15E+06 2.74E-04 1.27E-10
hDLL3-3 -1 1.91E+06 5.80E-04 3.04E-10
hDLL3-3 -2 1.95E+06 7.76E-04 3.99E-10
DLL3-26 3.82E+05 1.23E-05 3.22E-11
hDLL3-26 2.10E+05 3.55E-04 1.69E-09
DLL3-122 9.32E+04 3.92E-04 4.21E-09
hDLL3-122 9.85E+04 4.66E-04 4.73E-09
실시예 11. 계열 단백질 DLL1 및 DLL4에 대한 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합 실험
항원성 단백질 인간 DLL1(시노바이올로지칼, 카탈로그 번호 11635-H08H) 또는 인간 DLL4(시노바이올로지칼, 카탈로그 번호 10171-H08H)를 1㎍/㎖의 농도로 1×PBS에 용해시켰다. 그런 다음 항원을 고친화성 ELISA 플레이트[바이오레전드(Biolegend), 카탈로그 번호 423501]에 100㎕/웰로 첨가하고 4℃에서 밤새 놓아 두었다. 항원을 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 항원을 200㎕/웰의 1% BSA(PBST 중)로 차단하고 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다.
테스트할 항체를 100nM의 시작 농도로 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 희석된 항체를 ELISA 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 항체를 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체[DLL4에 대한 염소 항-인간 IgG Fc(HRP), 1:20000 희석; DLL1에 대한 HRP 염소 항-마우스 IgG(H+L), 1:10000 희석]를 PBST 중 1% BSA로 희석하였다. 희석된 2차 항체를 ELISA 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 PBST로 6회 세척하였다. 전개액(TMA와 TMB의 1:1 혼합)을 제조하였다. 전개액을 100㎕/웰로 플레이트에 첨가하고 암실에서 5분 동안 항온처리하였다. 50㎕의 ELISA 정지 용액을 플레이트에 첨가하고 잘 흔들어주었다.
OD450은 계획에 따라 판독되었으며 EC50 값에 대해 그래프패드에 표시되었다. 결과는 도 3에 제시되고, 이는 시험된 항체가 계열 단백질 DLL1 및 DLL4 중 어느 하나에도 비특이적으로 결합하지 않았음을 보준다.
실시예 12. 낙타 유래 인간화 항-DLL3 항체 변이체 제조
본 개시내용의 중쇄 항체의 번역 후 변형(PTM: post-translational modification) 분석 이후 hDLL3-3-1의 가변 영역에 하나의 탈아미드화 부위가 있음이 밝혀졌고; 단일 부위에 대한 부위 지정 돌연변이를 아미노산 103에서 수행하여 hDLL3-3-1의 2개의 돌연변이체, 즉 hDLL3-3-1-NA 및 hDLL3-3-1-QS를 각각 제조하였다. 두 변이체의 가변 영역 아미노산 서열을 표 7에 제시한다.
hDLL3-3-1 인간화 항체 변이체의 아미노산 서열
클론 번호 서열
번호		 가변 중쇄 (VHH) 서열
번호		 중쇄 CDR3
hDLL3-3-1-NA 28 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPNAAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS 110 QLRPNAAYHPLDGRKYNY
hDLL3-3-1-QS 29 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTYTISSGYMGWFRQAPGKEREGVAAIYIGGSTTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAQLRPQSAYHPLDGRKYNYWGQGTLVTVSS 111 QLRPQSAYHPLDGRKYNY
실시예 5에 기재된 바와 같이 2개의 변이체를 제조하였다. 포유동물 세포주에서 일시적 발현 후, SHP-77 세포를 사용하여 친화도 검정을 수행하였다. 표 8 및 도 4에 제시된 결과는 두 변이체가 세포 수준에서 결합에 유의미한 변화 없이 번역 후 변형의 위험을 제거할 수 있었음을 보여준다. 인간 DLL3 항원성 단백질을 사용한 친화도 검정 결과에 대해서는 표 9를 참조한다.
DLL3-발현 세포(SHP-77)에 대한 hDLL3-3-1 인간화 항체 변이체의 결합
클론 번호 SHP-77
EC50 (nM) 최고 평균 형광 강도
(Top MFI)
hDLL3-3 -1 0.068 1076
hDLL3-3-1-NA 0.104 1271
hDLL3-3-1-QS 0.055 1009
인간 DLL3 항원성 단백질과 hDLL3-3-1 인간화 항체 변이체의 친화도 테스트 결과
클론 번호 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
hDLL3-3 -1 1.36E+06 6.14E-04 4.50E-10
hDLL3-3-1-NA 1.29E+06 1.35E-04 1.05E-10
hDLL3-3-1-QS 1.22E+06 6.11E-03 5.02E-09
실시예 13. 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 항체 수득
항-DLL3 단일클론성 항체는 마우스를 면역화하여 생성되었다. 본 실험에서는 6주령의 암컷 스위스 웹스터(Swiss Webster) 흰색 마우스[찰스 리버(Charles River)]를 사용하였다. 하우징: SPF 등급. 마우스를 구입한 후 1주일 동안 실험실 환경에 두었다. 명암 주기는 12/12시간이었고 온도는 20 내지 25℃였으며, 습도는 40 내지 60%였다. 면역화 항원은 His 태그가 붙은 인간 DLL3 재조합 단백질(huDLL3-His)이었다. 타이터맥스(Titermax)[시그마(Sigma) 로트 번호: T2684]는 보조제였다. 항원 대 보조제(타이터맥스) 비율은 1:1이었고, 항원을 유화시키고 0일, 14일, 35일 및 56일에 접종하고, 비장세포 융합 3일 전에 추가접종하였다. 이 기간 동안 ELISA 및 FACS 방법을 사용하여 마우스 혈청을 검출하고 마우스 혈청에서 항체 역가를 결정하였다. 5차 면역화 후, 혈청 내 항체 역가가 높고 안정적인 마우스를 비장세포 융합을 위해 선택하였다. 하이브리도마 세포를 수득하기 위해 최적화된 전기융합 절차를 사용하여 비장 림프구를 골수종 세포인 Sp2/0 세포[ATCC(등록상표) CRL-8287(상표명)]와 융합시켰다.
융합된 하이브리도마 세포를 7 내지 14일 동안 배양한 후, 배양 배지 상청액을 취하였다. 하이브리도마 상청액에 DLL3 재조합 단백질을 이용한 항체 스크리닝과 ELISA 실험을 실시하였다. 수득된 양성 항체 균주를 안정적으로 형질감염된 DLL3 발현 CHO-K1 세포로 추가로 스크리닝하여 블랭크 CHO-K1 세포와 비교하여 비특이적 항체 결합 하이브리도마 균주를 배제하고, 플로우 분류법을 이용하여 스크리닝함으로써 재조합 단백질에 결합하고 세포에 의해 발현된 항원에도 결합하는 하이브리도마를 선별하였다. 하이브리도마 세포를 대수기에서 수확하고 RNA를 트리졸(Trizol)[인비트로겐(Invitrogen), 15596-018]로 추출하고 역전사시켰다[프라임스크립트(PrimeScript: 상표명) 역전사 효소, 타카라(Takara) #2680A]. 역전사된 cDNA를 마우스 Ig-프라이머 세트(Primer Set)[노바겐(Novagen), TB326 Rev. B 0503]에 의해 PCR 증폭하고, 서열분석하여 본 개시내용의 10개의 단일클론성 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 수득하였으며, 이는 표 10A에 제시된 바와 같다.
[표 10A]
10개의 마우스 하이브리도마 유래 항-dll3 단일클론성 항체 가변 영역의 아미노산 서열
상기 아미노산 서열을 기초로 카밧 넘버링 규칙을 이용하여 항체 가변 영역의 CDR과 FR을 구분하였고, 각 항체의 6개의 CDR 서열의 조성을 하기 표 10B에 제시한다.
[표 10B]
10개의 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 단일클론성 항체의 CDR 서열
실시예 14. 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 키메라 항체의 작성 및 진핵 세포에서의 이의 일시적인 형질감염 발현
본 개시내용의 단일클론성 항체의 서열분석된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 IgG1 중쇄 불변 영역 및 카파 경쇄 불변 영역과 스플라이싱한 후 생성된 관심 유전자 단편을 pTT5 발현 벡터에 클로닝하여 형질감염 등급의 발현 플라스미드를 제조하였다.
Expi293F(상표명) 세포(써모 피셔 사이언티픽)를 무혈청 배지에서 배양하고 진탕 플라스크(코닝 인크.)에 접종한 후 37℃, 8% CO2 진탕기에서 배양하였다. 세포 밀도를 조정한 후, 관심 유전자 단편이 포함된 재조합 발현 벡터와 PEI 형질감염 시약을 적절한 비율로 혼합하여 세포 배양 플라스크에 첨가하였다. 세포 배양 6일 후, 발현 상청액을 수집하고, 고속 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거한 후, 단백질 A 컬럼을 이용하여 친화성 정제를 실시하였다. A280 판독값이 기준선으로 떨어질 때까지 컬럼을 PBS로 헹구었다. 관심 단백질을 pH 3.0-pH 3.5의 산성 용리액으로 용출시키고 1M 트리스-HCl(pH 8.0-9.0)으로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절하게 농축한 후 용액을 PBS로 변경하고 분취하여 나중에 사용하였다. 최종 정제된 키메라 항체에 대해 SDS-PAGE, HPLC 순도 분석 및 A280 농도 측정을 실시하였다.
실시예 15. 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 키메라 항체의 시험관내 세포 결합 검증
SHP-77 및 HEK293-cyno DLL3 세포를 배양하였다. SHP-77 세포의 배양 배지는 RPMI1640+10% FBS였으며, HEK293 시노 DLL3 세포의 배양 배지는 DMEM+10% FBS+200㎍/㎖ 하이그로마이신이었다. 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 T75 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포를 사용하는 경우 멸균 DPBS로 세척하고 0.25% 트립신 EDTA로 약 5분 동안 분해한 후 완전 배지로 정지시켰다.
분해된 세포를 실온에서 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 1E6/m의 세포 밀도로 조정하였다. 희석된 세포를 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트(코닝 3799)에 접종하고, 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 테스트할 항체 샘플을 100nM의 시작 농도에서 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 세포를 100㎕/웰로 희석된 항체로 재현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 2차 항체(염소 항 인간 IgG Fc PE)를 제조업체의 지침에 따라 1% BSA(PBS 중)로 1:200으로 희석하고 세포를 희석된 2차 항체(100㎕/웰)로 재현탁시키고 0.5시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시키고 300 메쉬 거즈를 통해 여과하였다. PE 채널의 평균 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정하였다.
FCS 파일을 유세포 분석기에서 내보내었다. 각 샘플의 PE 채널의 평균 형광 강도(이하 MFI로 지칭됨)를 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 분석된 평균 형광 강도를 그래프패드로 불러와서 항체와 세포의 결합 농도 중간값(이하 EC50으로 지칭됨)과 최고 평균 형광 강도(Top MFI)를 분석하였다. 결과를 표 11 및 도 5에 제시한다.
DLL3 발현 세포에 대한 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 키메라 항체의 결합
클론 번호 SHP-77 HEK293 - cyno DLL3
EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI) EC50
(nM)		 최고 평균 형광 강도 (Top MFI)
26C4D2 0.60 1053 0.43 421
39E2D11-1 0.85 999 1.03 445
39E2D11-2 8.63 193 검출되지 않음 검출되지 않음
40G3D1 정합되지 않음 369 검출되지 않음 검출되지 않음
46A5A4 1.18 1013 0.67 475
47E12D12-1 1.45 178 검출되지 않음 검출되지 않음
47E12D12-2 69.28 455 검출되지 않음 검출되지 않음
48B6D7 0.65 990 0.53 480
45E4D7 0.68 965 0.71 454
27E10C5 1.20 813 1.39 396
실시예 16. 마우스 하이브리도마 유래 항-DLL3 항체의 인간화
10개의 키메라 항체에 발현 정제 시험 및 세포 수준 결합 시험을 실시하고, 인간화 고안을 위해 3개의 클론을 추가로 선택하였다.
뮤린 항-인간 DLL3 단일클론성 항체의 인간화는 당업계의 많은 참고문헌에 개시된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 인간 불변 도메인을 모(뮤린 항체) 불변 도메인 대신에 사용하였고, 인간 항체 서열을 뮤린 항체와 인간 항체 사이의 상동성에 기초하여 선택하였다. 수득된 뮤린 항체의 VH/VL CDR 전형적인 구조에 기초하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 인간 항체 생식세포 데이터베이스와 비교하여 상동성이 높은 인간 생식세포 주형을 수득하였다.
뮤린 항체의 CDR 영역을 선택된 상응하는 인간화 주형에 그래프트하여 인간화 가변 영역을 대체하고 IgG 불변 영역(바람직하게는 중쇄의 경우 IgG1, 경쇄의 경우 카파)과 재조합하였다. 그런 다음, 마우스 유래 항체의 3차원 구조를 기반으로, 매립된 잔기, CDR 영역과 직접 상호작용하는 잔기, 및 VL 및 VH의 입체형태에 중요한 영향을 미치는 잔기에 대해 역돌연변이를 수행하였다. 표 12에 제시된 바와 같이, 하기 인간화 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열을 조합하여 항체를 고안하였다.
3개의 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항체 가변 영역의 아미노산 서열
클론 번호 가변 중쇄 (VH) 가변 경쇄 (VL)
H1-39E2D11 서열 번호 46 47
아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNSWPLTFGGGTKLEIK
H2-39E2D11 서열 번호 46 48
아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNSWPLTFGGGTKLEIK
H-46A5A4 서열 번호 49 50
아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHTIHWVRQAPGQGLEWMGYIYPRDGYTMYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAFHALDYWGQGTLVTVSS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIK
H1-45E4D7 서열 번호 51 52
아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPISGSTNNNEKFRNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKIITVGGAYVMDYWGQGTLVTVSS EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRNNLHWYQQKPGQAPRLLIYYVSQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKLEIK
H2-45E4D7 서열 번호 51 53
아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPISGSTNNNEKFRNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKIITVGGAYVMDYWGQGTLVTVSS EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSNSWPLTFGGGTKLEIK
실시예 17. 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 시험관내 세포 결합 검증
SHP-77 세포를 배양하였다. SHP-77 세포의 배양 배지는 RPMI1640+10% FBS였다. 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 T75 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포를 사용하는 경우 멸균 DPBS로 세척하고 0.25% 트립신 EDTA로 약 5분 동안 분해한 후 완전 배지로 정지시켰다.
분해된 세포를 실온에서 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 1E6/m의 세포 밀도로 조정하였다. 희석된 세포를 96웰 둥근 바닥 배양 플레이트(코닝 3799)에 넣고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고 세포를 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다. 테스트할 항체 샘플을 100nM의 시작 농도에서 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 세포를 100㎕/웰로 희석된 항체로 재현탁시키고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 2차 항체(염소 항 인간 IgG Fc PE)를 제조업체의 지침에 따라 1% BSA(PBS 중)로 1:200으로 희석하고 세포를 희석된 2차 항체(100㎕/웰)로 재현탁시키고 0.5시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하고 상청액을 폐기하였다. 세포를 재현탁시키고 160㎕의 1% BSA(PBS 중)로 세척하고 4℃에서 5분 동안 1500rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세포를 100㎕의 1% BSA(PBS 중)에 재현탁시키고 300 메쉬 거즈를 통해 여과하였다. PE 채널의 평균 형광 강도를 유세포 분석법으로 측정하였다.
FCS 파일을 유세포 분석기에서 내보내었다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 각 샘플의 PE 채널의 평균 형광 강도(이하 MFI로 지칭됨)를 분석하였다. 분석된 평균 형광 강도를 그래프패드로 불러와서 항체와 세포의 결합 농도 중간값(이하 EC50으로 지칭됨)과 최고 평균 형광 강도(Top MFI)를 분석하였다. 결과를 표 13 및 도 6에 제시한다.
DLL3 발현 세포(SHP-77)에 대한 마우스 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 결합
클론 번호 SHP-77
EC50 (nM) 최고 평균 형광 강도 (Top MFI)
39E2D11-1 1.491 1647
H1-39E2D11 2.128 1426
H2-39E2D11 1.125 1574
46A5A4 1.204 1574
H-46A5A4 1.348 1525
45E4D7 0.894 1561
H1-45E4D7 5.163 1588
H2-45E4D7 2.228 1614
실시예 18. 하이브리도마 유래 인간화 항-dll3 항체의 비아코어 친화도 실험
인간 DLL3에 대한 인간화 항-DLL3 항체의 친화도 및 역학적 특성을 비아코어 8K 기기를 사용하여 분석하였다. CM5 칩을 EDC 및 NHS로 활성화한 후 항-인간 Fc 뮤린 mAb를 고정화하고 에탄올아민으로 차단하였다.
인간 DLL3에 대한 친화도 및 역학적 특성을 결정하기 위해, HBS-EP+(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20) 완충액을 사용하여 DLL3 인간화 항체를 0.2㎍/㎖로 희석하고 45초 동안 10㎕/분의 유속으로 포획하였다. 인간 DLL3을 연속 농도(100nM-0.39nM)로 2배 연속 희석하고 90초 동안 회합시키고 50㎕/분의 유속으로 600초 동안 해리하였다.
각 라운드의 실험이 완료된 후 3M MgCl2 용액으로 30㎕/분의 유속으로 30초 동안 세척함으로써 포획된 항체를 항원과 함께 제거하여 칩의 재생을 완료하였다. 비아코어 인사이트 이벨류에이션 소프트웨어(3.0.12.15655) 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 분석하고 (1:1) 랑뮤 모델로 정합시켰다. 결과를 표 14에 제시한다.
인간 DLL3 항원성 단백질과 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체의 친화도 테스트 결과
클론 번호 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
H2-39E2D11 3.13E+05 1.80E-04 5.76E-10
H-46A5A4 2.19E+05 1.78E-04 8.11E-10
H2-45E4D7 2.35E+05 5.78E-05 2.46E-10
실시예 19. 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체와 계열 단백질 DLL1 및 DLL4의 결합 실험
항원성 단백질 인간 DLL1(시노바이올로지칼, 카탈로그 번호 11635-H08H) 또는 인간 DLL4(시노바이올로지칼, 카탈로그 번호 10171-H08H)를 1㎍/㎖의 농도로 1×PBS에 용해시켰다. 그런 다음 항원을 고친화성 ELISA 플레이트(바이오레전드, 카탈로그 번호 423501)에 100㎕/웰로 첨가하고 4℃에서 밤새 놓아 두었다. 항원을 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 항원을 200㎕/웰의 1% BSA(PBST 중)로 차단하고 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다.
테스트할 항체를 100nM의 시작 농도에서 1% BSA(PBS 중)로 7개 농도에 대해 10배 구배로 하향 희석하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 희석된 항체를 ELISA 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 항체를 300㎕/웰의 PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체[DLL4에 대한 염소 항-인간 IgG Fc(HRP), 1:20000 희석; DLL1에 대한 HRP 염소 항-마우스 IgG(H+L), 1:10000 희석]를 PBST 중 1% BSA로 희석하였다. 희석된 2차 항체를 ELISA 플레이트에 100㎕/웰로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 300㎕/웰의 PBST 6회 세척하였다. 전개액(TMA와 TMB의 1:1 혼합)을 제조하였다. 전개액을 100㎕/웰로 플레이트에 첨가하고 암실에서 5분 동안 항온처리하였다. 50㎕의 ELISA 정지 용액을 플레이트에 첨가하고 잘 흔들어주었다.
OD450은 계획에 따라 판독되었으며 EC50 값에 대해 그래프패드에 표시되었다. 결과는 도 7에 제시하였고, 이는 시험된 항체가 계열 단백질 DLL1 및 DLL4 중 어느 하나에도 비특이적으로 결합하지 않았음을 보여준다.
실시예 20. 하이브리도마 유래 인간화 항-DLL3 항체 변이체의 제조
본 개시내용의 항체에 대한 번역 후 변형(PTM) 분석 이후 H2-39E2D11의 경쇄 가변 영역에 탈아미드화 부위가 1개 존재함이 밝혀졌고, 단일 부위에 대한 부위 지정 돌연변이를 아미노산에서 수행하여 H2-39E2D11의 3개의 돌연변이체인 H2-39E2D11-NA, H2-39E2D11-QS 및 H2-39E2D11-AS를 각각 제조하였다. 3개의 변이체의 가변 영역 아미노산 서열을 표 15에 제시한다.
H2-39E2D11 인간화 항체의 아미노산 서열
클론 번호 가변 중쇄 (VH) 가변 경쇄 (VL) LCDR3
H2-39E2D11-NA 서열 번호 46 54 112
아미노산
서열		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNAWPLTFGGGTKLEIK QQTNAWPLT
H2-39E2D11-QS 서열 번호 46 55 113
아미노산
서열		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTQSWPLTFGGGTKLEIK QQTQSWPLT
H2-39E2D11-AS 서열 번호 46 56 114
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서열		 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYWITWVRQAPGQGLEWMGDIYPGSGSTTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETTVGGAYAMDYWGQGTLVTVSS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSINNNLHWYQQKPGQAPRLLIKYVSQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTASWPLTFGGGTKLEIK QQTASWPLT
3개의 변이체를 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조하였다. 포유동물 세포주에서 일시적 발현 후, SHP-77 세포를 사용하여 친화도 검정을 수행하였다. 표 8에 제시된 결과는 변이체가 세포 수준에서 결합에 유의미한 변화 없이 번역 후 변형의 위험을 제거할 수 있었음을 보여준다. 인간 DLL3 항원성 단백질을 이용한 친화도 검정 결과를 표 16에 제시한다.
[표 16A]
인간 DLL3 항원성 단백질과 H2-39E2D11 인간화 항체 변이체의 친화도 테스트 결과
[표 16B]
시노몰구스 원숭이 DLL3 항원성 단백질과 H2-39E2D11 인간화 항체 변이체의 친화도 테스트 결과
앞서 기재된 본 개시내용의 실시양태는 단지 예시적일 뿐이며, 당업자라면 기존에 없는 실험을 할 필요 없이 수많은 특정 화합물, 재료 및 작업의 등가물을 인식하거나 결정할 수 있을 것이다. 이들 등가물 모두는 본 개시내용의 범주 내에 있고 청구범위에 포함된다.
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Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160 Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala 165 170 175 Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg 180 185 190 Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala 195 200 205 Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys 210 215 220 Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser 245 250 255 Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val 260 265 270 Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser 275 280 285 Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe 290 295 300 Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro 305 310 315 320 Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala 325 330 335 Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys 340 345 350 Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys 355 360 365 Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala 370 375 380 Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys 385 390 395 400 Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser 405 410 415 Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro 420 425 430 Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe 435 440 445 Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys 450 455 460 Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro 465 470 475 480 Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 485 490 495 Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525 Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540 Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser 545 550 555 560 Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val 565 570 575 Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe 580 585 590 Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe 595 600 605 Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys 610 615 <210> 106 <211> 618 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> synthetically generated protein <400> 106 Met Val Ser Pro Arg Met Ser Arg Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ile Phe Ile Pro Gln Ala Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu 20 25 30 Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser 35 40 45 Pro Cys Ser Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Glu Ala 85 90 95 Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asn Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe 100 105 110 Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Thr Trp Arg 115 120 125 Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala 130 135 140 Arg Val Thr Arg Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160 Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala 165 170 175 Arg Cys Glu Leu Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg 180 185 190 Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala 195 200 205 Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys 210 215 220 Ser Leu Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Met Val Pro Val Ser Thr Ser Ser 245 250 255 Cys Leu Gly Leu Arg Gly Pro Ser Ser Thr Thr Thr Gly Cys Leu Val 260 265 270 Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser 275 280 285 Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe 290 295 300 Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro 305 310 315 320 Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala 325 330 335 Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys 340 345 350 Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys 355 360 365 Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala 370 375 380 Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys 385 390 395 400 Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser 405 410 415 Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asn Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro 420 425 430 Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe 435 440 445 Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys 450 455 460 Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Val Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro 465 470 475 480 Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 485 490 495 Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ala Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525 Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540 Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Pro Gly Asp Val Pro Ser Ser Ser 545 550 555 560 Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Ser Arg Gly Ile Tyr Val 565 570 575 Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Met Pro Leu Phe 580 585 590 Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln Asn Leu Leu Phe 595 600 605 Pro Phe Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys 610 615 <210> 107 <211> 723 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetically generated protein <400> 107 Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe 20 25 30 Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly 35 40 45 Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu 50 55 60 Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe 100 105 110 Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His 115 120 125 Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser 145 150 155 160 Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg 165 170 175 Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys 180 185 190 Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly 195 200 205 Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro 210 215 220 Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro 225 230 235 240 Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu 245 250 255 Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp 260 265 270 Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp 275 280 285 Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys 290 295 300 Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro 325 330 335 Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys 340 345 350 Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met 355 360 365 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser 370 375 380 Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe 385 390 395 400 Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn 405 410 415 Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln 420 425 430 Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala 435 440 445 Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp 450 455 460 Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala 465 470 475 480 Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys 485 490 495 His Glu Arg Gly His Arg Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly 500 505 510 Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala 515 520 525 Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro 530 535 540 Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu 545 550 555 560 Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His 565 570 575 Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn 580 585 590 Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly 595 600 605 Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp 610 615 620 His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp 625 630 635 640 Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp 645 650 655 Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly 660 665 670 Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu 675 680 685 Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr 690 695 700 Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala 705 710 715 720 Thr Glu Val <210> 108 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetically generated protein <400> 108 Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg 35 40 45 Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His 50 55 60 Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser 85 90 95 Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro 100 105 110 Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp 115 120 125 Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala 130 135 140 Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser 165 170 175 Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn 180 185 190 Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys 195 200 205 Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser 210 215 220 Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu 225 230 235 240 Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His 245 250 255 Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys 260 265 270 Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys 275 280 285 Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp 305 310 315 320 Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly 325 330 335 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro 340 345 350 Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp 355 360 365 Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala 370 375 380 Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu 385 390 395 400 Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln 405 410 415 Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe 420 425 430 Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro 435 440 445 Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys 450 455 460 Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser 465 470 475 480 Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr 485 490 495 Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe 500 505 510 Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Phe Pro 515 520 525 Trp Val Ala Val Ser Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Leu Leu Val Leu 530 535 540 Leu Gly Met Val Ala Val Ala Val Arg Gln Leu Arg Leu Arg Arg Pro 545 550 555 560 Asp Asp Gly Ser Arg Glu Ala Met Asn Asn Leu Ser Asp Phe Gln Lys 565 570 575 Asp Asn Leu Ile Pro Ala Ala Gln Leu Lys Asn Thr Asn Gln Lys Lys 580 585 590 Glu Leu Glu Val Asp Cys Gly Leu Asp Lys Ser Asn Cys Gly Lys Gln 595 600 605 Gln Asn His Thr Leu Asp Tyr Asn Leu Ala Pro Gly Pro Leu Gly Arg 610 615 620 Gly Thr Met Pro Gly Lys Phe Pro His Ser Asp Lys Ser Leu Gly Glu 625 630 635 640 Lys Ala Pro Leu Arg Leu His Ser Glu Lys Pro Glu Cys Arg Ile Ser 645 650 655 Ala Ile Cys Ser Pro Arg Asp Ser Met Tyr Gln Ser Val Cys Leu Ile 660 665 670 Ser Glu Glu Arg Asn Glu Cys Val Ile Ala Thr Glu Val 675 680 685 <210> 109 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> synthetically generated protein <400> 109 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 110 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated protein <400> 110 Gln Leu Arg Pro Asn Ala Ala Tyr His Pro Leu Asp Gly Arg Lys Tyr 1 5 10 15 Asn Tyr <210> 111 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated protein <400> 111 Gln Leu Arg Pro Gln Ser Ala Tyr His Pro Leu Asp Gly Arg Lys Tyr 1 5 10 15 Asn Tyr <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated protein <400> 112 Gln Gln Thr Asn Ala Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated protein <400> 113 Gln Gln Thr Gln Ser Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetically generated protein <400> 114 Gln Gln Thr Ala Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

Claims (14)

  1. 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 중쇄 가변 영역이 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며,
    HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 아미노산 서열이 각각 다음과 같고:
    a) 서열 번호 6, 7, 및 8; 또는
    b) 서열 번호 9, 10, 및 11; 또는
    c) 서열 번호 12, 13, 및 14; 또는
    d) 서열 번호 15, 16, 및 17; 또는
    e) 서열 번호 18, 19, 및 20; 또는
    f) 서열 번호 6, 7, 및 110; 또는
    g) 서열 번호 6, 7, 및 111;
    바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 1 내지 5, 및 21 내지 29 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 1 내지 5, 및 21 내지 29 중 어느 하나와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는,
    DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3의 아미노산 서열이 각각 다음과 같고:
    a) 서열 번호 57, 58, 59, 60, 61, 및 62; 또는
    b) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67, 및 68; 또는
    c) 서열 번호 69, 70, 71, 66, 67 및 68; 또는
    d) 서열 번호 72, 73, 74, 75, 76 및 77; 또는
    e) 서열 번호 78, 79, 80, 81, 82 및 83; 또는
    f) 서열 번호 84, 85, 86, 87, 88, 및 89; 또는
    g) 서열 번호 84, 85, 86, 90, 91 및 92; 또는
    h) 서열 번호 93, 94, 95, 96, 97 및 98; 또는
    i) 서열 번호 99, 100, 101, 75, 76 및 77; 또는
    j) 서열 번호 72, 73, 74, 102, 103 및 104; 또는
    k) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67 및 112; 또는
    l) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67, 및 113; 또는
    m) 서열 번호 63, 64, 65, 66, 67 및 114;
    바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 번호 30, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 또는 51 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열 번호 30, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 44, 46, 49 또는 51 중 어느 하나와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    상기 경쇄 가변 영역이 서열 번호 31, 33, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 55 또는 56 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 31, 33, 36, 38, 40, 41, 43, 45, 47, 48, 50, 52, 53, 54, 55 또는 56 중 어느 하나와 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
    더욱 바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역 및 상기 경쇄 가변 영역이 각각
    1) 서열 번호 30 및 31; 또는
    2) 서열 번호 32 및 33; 또는
    3) 서열 번호 34 및 33; 또는
    4) 서열 번호 35 및 36; 또는
    5) 서열 번호 37 및 38; 또는
    6) 서열 번호 39 및 40; 또는
    7) 서열 번호 39 및 41; 또는
    8) 서열 번호 42 및 43; 또는
    9) 서열 번호 44 및 36; 또는
    10) 서열 번호 35 및 45; 또는
    11) 서열 번호 46 및 47; 또는
    12) 서열 번호 46 및 48; 또는
    13) 서열 번호 49 및 50; 또는
    14) 서열 번호 51 및 52; 또는
    15) 서열 번호 51 및 53; 또는
    16) 서열 번호 46 및 54; 또는
    17) 서열 번호 46 및 55; 또는
    18) 서열 번호 46 및 56
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는, DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하기 특징 중 하나 이상을 추가로 갖는 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편:
    i) 상기 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는 상기 중쇄 불변 영역이 Fc를 포함하고; 더욱 바람직하게는 Fc가 뮤린 또는 인간으로부터 유래되고; 더욱 바람직하게는 Fc의 서열이 천연적이거나 변형됨;
    ii) 상기 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 단일클론성 항체, 이중특이적 결합 분자, 다중특이적 결합 분자, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형 항체, 완전 인간 항체, 전장 항체, 중쇄 항체, 나노바디(nanobody), Fab, Fv, scFv, F(ab')2, 선형 항체 또는 단일 도메인 항체임; 및/또는
    iii) 상기 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 형태임.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 포획 표지 또는 검출 표지에 커플링시킴으로써 형성되는 접합체로서,
    바람직하게는 상기 검출 표지가 방사성 핵종, 발광 물질, 착색 물질 또는 효소를 포함하는, 접합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 또 다른 생물학적 활성 분자와 커플링시킴으로써 형성되는 항체 약물 접합체로서,
    바람직하게는 상기 다른 생물학적 활성 분자가 소분자 약물이며;
    바람직하게는 상기 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편이 링커를 통해 이러한 다른 생물학적 활성 분자에 연결되는, 항체 약물 접합체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산; 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터; 또는 상기 핵산 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는 상기 숙주 세포가 원핵 세포, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli), 또는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 효모이고, 추가로 바람직하게는 상기 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 HEK293 세포인, 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서,
    제6항에 따른 숙주 세포를 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및
    상기 세포로부터 발현 생성물을 정제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의, 종양의 치료 또는 개선을 위한 약제를 제조하기 위한 용도로서,
    바람직하게는 약물이 DLL3을 비정상적으로 발현하는 종양 세포를 표적으로 삼고; 바람직하게는 상기 종양이 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암 및 전술된 종양의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편의, 검출 시약 또는 진단 시약을 제조하기 위한 용도로서,
    바람직하게는 상기 검출 시약이 DLL3의 발현을 검출하기 위해 사용되고; 진단 시약이 종양을 진단하기 위해 사용되며; 바람직하게는 상기 종양이 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암 및 전술된 종양의 전이암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  10. 샘플에서 DLL3 발현을 검출하는 방법으로서,
    (1) 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    (2) DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편과 DLL3의 복합체 형성을 검출하는 단계; 및
    선택적으로, DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 검출 가능하게 표지화하는 단계
    를 포함하는 방법.
  11. 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 DLL3 결합 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 유효량의 제5항에 따른 항체 약물 접합체, 또는 유효량의 제6항에 따른 핵산, 재조합 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물로서,
    바람직하게는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하며; 바람직하게는 1종 이상의 추가적인 치료제를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  12. 용기, 및
    상기 용기 내의 제11항에 따른 약학적 조성물
    을 포함하는 약물 상자 또는 키트.
  13. DLL3 발현 세포의 사멸을 유도하는 방법으로서,
    상기 세포를 제11항에 따른 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 DLL3을 발현하는 세포가 종양 세포이고; 바람직하게는 상기 종양 세포가 하기 종양: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암 및 전술된 종양의 전이암으로 이루어진 군으부터 선택된 세포인, 방법.
  14. 피험체에서 DLL3 발현과 관련된 질병을 치료하는 방법으로서,
    제11항에 따른 약학적 조성물 및/또는 제12항에 따른 약물 상자 또는 키트를 필요한 피험체에게 투여하는 단계로서, 바람직하게는 상기 질병이 하기 종양: 소세포 폐암, 교모세포종, 신경내분비암, 흑색종, 췌장암, 직장암 및 전술된 종양의 전이암인, 단계
    를 포함하고; 더욱 바람직하게는, 추가적인 치료제를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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