TW202045547A - 靶向ｄｌｌ３的嵌合抗原受體和結合劑 - Google Patents

Abstract

本文提供了DLL3結合劑和包含與DLL3特異性結合的DLL3結合分子的嵌合抗原受體(CAR)；包含這些DLL3特異性CAR的免疫細胞，例如CAR-T細胞。還提供了製造和使用DLL3特異性CAR的方法，以及包含DLL3特異性CAR的免疫細胞。

Description

靶向ＤＬＬ３的嵌合抗原受體和結合劑

相關申請的交叉引用

本申請要求於2019年3月1日提交的美國臨時申請號62/812,585以及2020年2月4日提交的美國臨時申請號62/969,976的優先權權益，在此將其全部內容通過引用整體上併入本文。

本公開涉及包含與DLL3結合的抗原結合分子的DLL3結合劑和嵌合抗原受體(CARs)，編碼其的多核苷酸，以及使用其治療患者中的癌症的方法。 序列表

本申請正在通過EFS-Web電子提交，並且包括以.txt格式電子提交的序列表。.txt檔包含序列表，標題為“AT-019_03US_SL”，創建於2020年2月4日，大小為1,026,798位元組。該.txt檔中包含的序列表是說明書的一部分，通過引用整體上併入本文。

小細胞肺癌(SCLC)是肺癌的一種侵襲性形式，其預後較差且治療選擇有限。SCLC占所有新診斷的肺癌的約10-15%。美國癌症協會估計，2018年將診斷出約234,000例肺癌新病例。SCLC的5年相對存活率估計為31%(對於I期)，19%(對於II期)，8%(對於III期)和2%(對於IV階段)。幾十年來，SCLC的存活率一直很低，這在很大程度上是由於缺乏對抗這種形式的肺癌的新療法。癌症的常規治療方法包括化療和放療。患者通常對當前的一線療法(包括依託泊苷和順鉑)回應良好，但總是會因化學耐藥性疾病復發。復發性難治疾病的預後極差，疾病進展迅速，中位生存期短，小於六個月。因此，仍然非常需要開發針對增生性疾病的更有靶向性和更有效的療法。

經遺傳修飾以識別惡性腫瘤相關抗原的免疫細胞的過繼轉移顯示出有希望作為治療癌症的新方法(參見，例如Brenner等，Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg等，Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008))。可以對免疫細胞進行遺傳修飾，以表達嵌合抗原受體(CAR)，由DLL3抗原識別部分和T細胞啟動結構域組成的融合蛋白(參見，例如Eshhar等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)，和Sadelain等，Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009))。含有CAR的免疫細胞，例如CAR-T細胞(CAR-T)，進行工程化以賦予其抗原特異性，同時保留或增強其識別和殺死靶細胞的能力。

DLL3是非規範的Notch配體，其以細胞自主方式起作用以抑制Notch信號傳導，從而阻斷細胞與細胞的相互作用以及Notch在靶細胞中的內在化。δ樣配體3(DLL3)是SCLC腫瘤標誌物，已發現其與癌症幹細胞有關。涉及DLL3的其它適應症包括黑色素瘤、低級別神經膠質瘤、成膠質細胞瘤、甲狀腺髓樣癌、類癌、胰腺中的彌散性神經內分泌腫瘤、膀胱和前列腺癌、睪丸癌和具有神經內分泌特徵的肺腺癌。需要用於治療癌症特別是涉及DLL3異常表達的惡性腫瘤的治療。本文提供了解決該需求的方法和組合物。

本文提供了包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域的嵌合抗原受體(CAR)；以及包含這些DLL3特異性CAR的免疫細胞，例如CAR-T細胞。還提供了製造和使用這些DLL3特異性CAR以及包含這些DLL3特異性CAR的免疫細胞的方法。本文所述的靶向DLL-3的CAR T細胞表現出良好的轉導效率，體外表型以及強效的體外和體內抗腫瘤活性。

在一個方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含下述中的至少一種：(a) 可變重鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；(b) 可變重鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；(c) 可變重鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462；(d) 可變輕鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；(e) 可變輕鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及(f) 可變輕鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

在另一方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含：(a) 可變重鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；(b) 可變重鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、和695461；以及(c) 可變重鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462。

在一個方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含：(a) 可變輕鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；(b) 可變輕鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及(c) 可變輕鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

在另一方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含下述中的至少一種：(a) 可變重鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466；和(b) 可變輕鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，其中可變重鏈和可變輕鏈通過至少一個接頭連接。

在又一方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含：(a) 可變重鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457和466；以及(b) 可變輕鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，其中可變重鏈和可變輕鏈通過至少一個接頭連接。

在一個方面，本公開提供一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中所述胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中所述抗原結合結構域包含選自由表1d中列出的那些scFv組成的組中的序列。

在另一方面，本公開提供了與DLL3特異性結合的嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 482至533和SEQ ID NO: 632-683中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含SEQ ID NO: 482至533和632-683中任一個的氨基酸序列。

在一些實施方式中，本公開提供了與DLL3特異性結合的嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 482至533和SEQ ID NO: 632-683中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，並且帶有或不帶有信號序列。在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含SEQ ID NO: 482至533和632-683中任一個的氨基酸序列，並且帶有或不帶有信號序列。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含至少一個共刺激結構域。

在一些實施方式中，所述共刺激結構域是下述物質的信號傳導區：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1 (PD-1)、誘導型T細胞共刺激因數(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞因數受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞啟動分子(SLAM蛋白)、啟動NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α.、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，與CD83特異性結合的配體，或其任何組合。

在一些實施方式中，共刺激結構域包含CD28的信號傳導區。

在一些實施方式中，CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO: 550。

在一些實施方式中，共刺激域包括4-1BB/CD137的信號傳導區域。

在一些實施方式中，4-1BB/CD137共刺激結構域包含SEQ ID NO：480。

在一些實施方式中，胞內結構域包含至少一個啟動結構域。

在一些實施方式中，啟動結構域包含CD3。

在一些實施方式中，CD3包含CD3ζ。

在一些實施方式中，CD3ζ包含SEQ ID NO: 481。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體由SEQ ID NO: 571-621和631中任一個的多核苷酸序列編碼。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體還包含安全開關。

在一些實施方式中，安全開關包含CD20類比表位或QBEND-10表位。

在一些實施方式中，安全開關包含一個或多個CD20模擬表位或一個或多個QBEND-10表位元，或其組合。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含一個或多個為QR3、SR2、RSR或R2S形式的安全開關。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 622-628、474-476、565和684-694中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。

在一些實施方式中，嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 622-628、474-476、565和684-694中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，並且帶有或不帶有信號序列

在一些方面，本公開提供一種分離的多核苷酸，其編碼本文所述的嵌合抗原受體中的任一種。

在另一方面，本公開提供一種載體，其包含編碼本文所述的嵌合抗原受體中的任一種的多核苷酸。

在一些實施方式中，載體是逆轉錄病毒載體、DNA載體、質粒、RNA載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或其任何組合。

在另一方面，本公開提供一種工程化免疫細胞，其表達本文所述的嵌合抗原受體。

在一些方面，本公開提供一種工程化免疫細胞，其表達編碼本文所述的嵌合抗原受體中的任一種的多核苷酸或載體。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞是T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、表達TCR的細胞、樹突狀細胞或NK-T細胞。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞是自體T細胞。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞是同種異體T細胞。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞是敲除TCR (例如TCRα，TCRβ)的。

在一個方面，本公開提供一種藥物組合物，其包含表達本文所述的嵌合抗原受體的工程化免疫細胞。

在一些方面，本公開提供一種治療有需要的受試者中的疾病或病症的方法，該方法包括向受試者施用表達本文所述的嵌合抗原受體的工程化免疫細胞或包含工程化免疫細胞的藥物組合物。

在一些實施方式中，疾病或病症是癌症。

在一些實施方式中，疾病或病症是小細胞肺癌。

在一些方面，本公開提供一種製品，其包含表達本文所述的嵌合抗原受體的工程化免疫細胞或包含工程化免疫細胞的藥物組合物。

在一些方面，本公開提供本文所述的抗DLL3結合劑。

在一些實施方式中，抗DLL3結合劑是抗體、抗體綴合物或其抗原結合片段，任選地，F(ab’)₂ 片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段或dAb片段。

在一些實施方式中，結合劑是包含IgG恆定區的單克隆抗體。

在一些實施方式中，抗DLL3結合劑包含與表1b中提供的可變重鏈(VH)序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的VH序列。

在一些實施方式中，抗DLL3結合劑包含與表1c中提供的可變輕鏈(VL)序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的VL序列。

在一些實施方式中，抗DLL3結合劑包含與表1d中列出的scFv序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的序列。

在一些實施方式中，抗DLL3結合劑是包含與Fc恆定區融合的scFv片段的融合蛋白。

在一些方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含本文所述的抗DLL3結合劑和藥學上可接受的賦形劑。

在一些方面，本公開提供一種治療有需要的受試者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受試者施用本文所述的抗DLL3結合劑或者包含抗DLL3結合劑的藥物組合物。

在一些實施方式中，疾病或病症是癌症。

在一些實施方式中，疾病或病症是小細胞肺癌。

本文提供DLL3特異性抗體和嵌合抗原受體(CAR)。本文所述的DLL-3特異性CAR包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，以及編碼這些CAR的多核苷酸。還提供了包含這些DLL3特異性CAR的免疫細胞，例如CAR-T細胞，以及包含這些免疫細胞的藥物組合物。還公開了製造和使用這些DLL3特異性CAR和包含這些DLL3特異性CAR的免疫細胞的方法，例如用於治療癌症。 I. DLL-3 結合劑

本公開提供了DLL-3結合劑(例如，包含DLL3抗原結合結構域的分子、DLL-3抗體或其片段)，其與DLL-3特異性結合。如本文所用，術語“抗體”是指包括足以賦予與特定靶抗原(例如DLL-3)的特異性結合的規範性免疫球蛋白序列元件的多肽。如本領域中已知的，天然產生的完整抗體是約150kD的四聚體試劑，其由兩個相同的重鏈多肽(每個約50kD)和兩個相同的輕鏈多肽(每個約25kD)組成，它們彼此締合成通常稱為“Y形”結構的結構。每條重鏈均包含至少四個結構域(每個長約110個氨基酸)-氨基末端可變(VH)結構域(位於Y結構的尖端)，然後是三個恆定結構域：CHI、CH2和羧基末端的CH3(位於Y莖的基部)。短區域稱為“開關”，連接重鏈可變區和恆定區。“鉸鏈”將CH2和CH3結構域連接至抗體的其餘部分。該鉸鏈區中的兩個二硫鍵在完整抗體中將兩個重鏈多肽彼此連接。每條輕鏈由兩個結構域組成-氨基末端可變(VL)結構域，然後是羧基末端恆定(CL)結構域，通過另一個“開關”彼此隔開。本領域技術人員熟知抗體的結構和序列元件，識別所提供序列中的“可變”和“恆定”區，並理解在定義這些結構域之間的“邊界”方面可能有一定的靈活性，以致於相同抗體鏈序列的不同呈遞，可以例如指示相對於相同抗體鏈序列的不同呈遞移位一個或幾個殘基的位置處的這種邊界。

根據以下編號方案氨基酸分配給框架、CDR和可變結構域：Kabat編號(參見，例如Kabat等。in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. 1991), Chothia編號(參見，例如Chothia & Lesk, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani 等，(1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia等，(1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano等，(1990) J Mol Biol 215(1): 175-82；和美國專利號7,709,226)，contact編號，或AbM方案(Antibody Modeling program, Oxford Molecular)。

因此，在一些實施方式中，本文提出的DLL3結合劑的CDR根據Kabat編號方案編號。在其它實施方式中，本文提出的DLL3結合劑的CDR根據Chothia編號方案編號。在其它實施方式中，本文提出的DLL3結合劑的CDR根據contact編號方案編號。在其它實施方式中，本文提出的DLL3結合劑的CDR根據AbM編號方案編號。

完整的抗體四聚體由兩個重鏈-輕鏈二聚體組成，其中重鏈和輕鏈通過單個二硫鍵相互連接；另外兩個二硫鍵將重鏈鉸鏈區彼此連接，從而使二聚體彼此連接並形成四聚體。天然產生的抗體也被糖基化，通常在CH2結構域上。天然抗體中的每個結構域具有以“免疫球蛋白折疊”為特徵的結構，該“免疫球蛋白折疊”由彼此堆積在壓縮的反向平行β桶中的兩個β折疊(例如3、4或5條折疊)形成。每個可變結構域都包含三個被稱為“互補決定區”(CDR1、CDR2和CDR3)的高變環和四個有些不變的“框架”區(FR1、FR2、FR3和FR4)。當天然抗體折疊時，FR區形成提供結構域結構框架的β折疊，並且來自重鏈和輕鏈的CDR環區域都在三維空間中聚集在一起，從而它們形成位於Y結構的尖端的單個高變抗原結合位點。天然存在的抗體的Fc區與補體系統的元件結合，並且還與效應細胞(包括例如介導細胞毒性的效應細胞)上的受體結合。如本領域中已知的，可以通過糖基化或其它修飾來調節Fc區對Fc受體的親和力和/或其它結合屬性。在一些實施方式中，根據本發明產生和/或利用的抗體包括糖基化的Fc結構域，包括具有經修飾或工程化的此類糖基化的Fc結構域。

為了本發明的目的，在某些實施方式中，包括在天然抗體中發現的足夠的免疫球蛋白結構域序列的任何多肽或多肽複合物都可以被稱為和/或用作“抗體”，無論所述多肽是天然的(例如，由生物體與抗原反應產生)，或通過重組工程化、化學合成或其它人工系統或方法產生。在一些實施方式中，抗體是多克隆的。在一些實施方式中，抗體是單克隆的。在一些實施方式中，抗體具有恆定區序列，其是小鼠、兔、靈長類或人抗體的特徵。在一些實施方式中，如本領域已知的，抗體序列元件是人源化的、靈長類化的、嵌合的等。

此外，本文所用的術語“抗體”在適當的實施方式中可以指(除非另有說明或從上下文中可清楚看出)用於在替代呈遞中利用抗體的結構和功能特徵的任何本領域已知或開發的構建體或形式。例如，在一些實施方式中，根據本發明使用的抗體具有選自但不限於下述的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙或多特異性抗體(例如Zybodies®等)；抗體片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分離的CDR或其組；單鏈Fvs；多肽-Fc融合體；單結構域抗體(例如，鯊魚單結構域抗體，例如IgNAR或其片段)；駱駝抗體；掩蔽抗體(例如Probodies®)；小型模組化免疫藥物(SMIPs™)；單鏈或串聯雙抗體(TandAb®)；VHH；Anticalins®；Nanobodies®微型抗體；BiTE®；錨蛋白重複蛋白或DARPINs®；Avimers®；DART；TCR樣抗體；Adnectins®；Affilins®；Trans-bodies®；Affibodies®；TrimerX®；MicroProteins；Fynomers®，Centyrins®；和KALBITOR®s。在一些實施方式中，抗體可能缺乏如果天然產生的話其將具有的共價修飾(例如，聚糖的附著)。在一些實施方式中，抗體可以含有共價修飾(例如，聚糖的附著，有效載荷(例如，可檢測的部分、治療性部分、催化性部分等)或其它側基(例如，聚乙二醇等)。

抗體包括抗體片段。抗體還包括但不限於多克隆、單克隆、嵌合dAb(域抗體)、單鏈、F_ab 、F_a 、F_(ab )₂ 片段，scFv和F_ab 表達文庫。抗體可以是完整抗體，或免疫球蛋白，或抗體片段。

如上所述，完整抗體由兩對“輕鏈”(LC)和“重鏈”(HC)組成(此類輕鏈(LC)/重鏈對在本文中簡稱為LC/HC)。此類抗體的輕鏈和重鏈是由幾個結構域組成的多肽。在完整抗體中，每條重鏈均包含重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包含重鏈恆定結構域CH1、CH2和CH3(抗體類別IgA、IgD和IgG)和任選的重鏈恆定結構域CH4(抗體類別IgE和IgM)。每條輕鏈包含輕鏈可變結構域VL和輕鏈恆定結構域CL。可變結構域VH和VL可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從氨基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(Janeway, C. A., Jr, et al, (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing；和Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99)。這兩對重鏈和輕鏈(HC/LC)能夠特異性結合同一抗原。因此，所述完整抗體是二價單特異性抗體。此類“抗體”包括例如小鼠抗體、人抗體、嵌合抗體、人源化抗體和基因工程抗體(變異或突變抗體)，只要其特徵得以保留。在一些實施方式中，抗體或結合劑是人源化抗體，特別是作為重組人或人源化抗體。

在一些實施方式中，抗體或結合劑可以是“對稱的”。“對稱的”是指抗體或結合劑具有相同種類的Fv區(例如，抗體具有兩個Fab區)。在一些實施方式中，抗體或結合劑可以是“不對稱的”。“不對稱的”是指抗體或結合劑具有至少兩種不同類型的Fv區(例如，抗體具有：Fab和scFv區，Fab和scFv2區或Fab-VHH區)。各種不對稱抗體或結合劑結構在本領域中是已知的(Brinkman and Kontermann等. 2017 Mabs (9)(2): 182-212)。

如本文所用，術語“抗體試劑”是指與特定抗原特異性結合的試劑。在一些實施方式中，該術語涵蓋任何包括足以賦予特異性結合的免疫球蛋白結構元件的多肽或多肽複合物。示例性抗體試劑包括但不限於單克隆抗體或多克隆抗體。在一些實施方式中，抗體試劑可以包括一個或多個表徵小鼠、兔、靈長類或人抗體的恆定區序列。在一些實施方式中，抗體試劑可包括是人源化、靈長類化、嵌合等的一種或多種序列元件，如本領域已知的。在許多實施方式中，術語“抗體試劑”用於指一種或多種本領域已知或開發的構建體或形式，其用於在替代呈現中利用抗體的結構和功能特徵。例如，根據本發明使用的抗體試劑為選自但不限於下述的形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙或多特異性抗體(例如Zybodies®等)；抗體片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分離的CDR或其組；單鏈Fvs；多肽-Fc融合體；單結構域抗體(例如，鯊魚單結構域抗體，例如IgNAR或其片段)；駱駝抗體；掩蔽抗體(例如Probodies®)；小型模組化免疫藥物(SMIPs™)；單鏈或串聯雙抗體(TandAb®)；VHH；Anticalins®；Nanobodies®微型抗體；BiTE®；錨蛋白重複蛋白或DARPINs®；Avimers®；DART；TCR樣抗體；Adnectins®；Affilins®；Trans-bodies®；Affibodies®；TrimerX®；MicroProteins；Fynomers®，Centyrins®；和KALBITOR®。

在一些實施方式中，抗體可能缺乏如果天然產生的話其將具有的共價修飾(例如，聚糖的附著)。在一些實施方式中，抗體可含有共價修飾(例如，聚糖的附著，有效載荷(例如，可檢測的部分、治療性部分、催化性部分等)或其它側基(例如，聚乙二醇等)。在許多實施方式中，抗體試劑是多肽或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包含一個或多個本領域技術人員公認為互補決定區(CDR)的結構元件；在一些實施方式中，抗體試劑是多肽或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包含與參考抗體中發現的一個基本相同的至少一個CDR(例如，至少一個重鏈CDR和/或至少一個輕鏈CDR)。在一些實施方式中，抗體試劑是多肽或具有多肽，所述多肽的氨基酸序列包括本領域技術人員公認為免疫球蛋白可變結構域的結構元件。在一些實施方式中，抗體試劑是多肽蛋白，其具有與免疫球蛋白結合結構域同源或基本上同源的結合結構域。

本發明編碼的抗體或抗原結合分子可以是單鏈或雙鏈的。在一些實施方式中，抗體或抗原結合分子是單鏈的。在某些實施方式中，抗原結合分子選自由scFv、Fab、Fab’、Fv、F(ab’)₂ 、dAb及其任何組合組成的組。

在一些實施方式中，抗DLL-3抗體試劑是分離的。在一些實施方式中，抗體試劑可以純化至大於95%或99%的純度，如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)確定的(參見，例如Flatman等，J. Chromatogr., B 848:79-87 (2007))。在一些方面，本公開提供了包含DLL-3結合劑(例如，DLL3特異性抗體)和藥學上可接受的載體的組合物。

在一些實施方式中，抗DLL-3抗體試劑包含Fc。Fc結構域可與細胞表面受體相互作用，這能夠使抗體啟動免疫系統。在IgG、IgA和IgD抗體同種型中，Fc區由兩個相同的蛋白片段組成，所述蛋白片段分別源自抗體兩條重鏈的第二和第三恆定結構域；IgM和IgE Fc區在每個多肽鏈中均包含三個重鏈恆定結構域(C_H 域2-4)。IgG的Fc區可能帶有高度保守的N-糖基化位點(N297)。Fc片段的糖基化對於Fc受體介導的活性可能是必不可少的。附著於該位點的N-聚糖主要是複雜類型的核心-岩藻糖基化雙觸角結構。

雖然輕鏈和重鏈的恆定區可以不直接參與抗體與抗原的結合，但是恆定區可以影響可變區的取向。恆定區還可以表現出各種效應子功能，例如通過與效應子分子和細胞相互作用而參與抗體依賴性補體介導的裂解或抗體依賴性細胞毒性。

公開的抗DLL-3抗體試劑可以是任何同種型的抗體，包括同種型IgA、同種型IgD、同種型IgE、同種型IgG或同種型IgM。在一些實施方式中，抗DLL-3抗體包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定結構域。

本文提供了可以與DLL3靶標的各種區域或結構域結合的DLL3結合劑(例如抗體)。表位可以是例如DLL3靶標的連續氨基酸(線性或連續表位元)或來自DLL3靶標的兩個以上非連續區在一起(構象、非線性、不連續或非連續表位)。DLL3抗原結合結構域所結合的表位可以通過各種測定法確定，例如NMR光譜、X射線衍射晶體學研究、ELISA測定、氫/氘交換與質譜法(例如液相色譜電噴霧質譜法)、基於陣列的寡肽掃描測定、流式細胞術和/或誘變作圖(例如定點誘變作圖)。

代表性的DLL3區或結構域顯示在圖2中。本文描述的示例性DLL3抗體與表1a中提供的DLL3結構域結合。

在一些實施方式中，DLL3結合劑包含可變重鏈(VH)，其中VH的氨基酸序列選自表1b中列出的VH序列。在一些實施方式中，抗DLL-3結合劑包含與表1b中列出的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的免疫球蛋白重鏈。

在一些實施方式中，DLL3結合劑包含可變輕鏈(VL)，其中VL的氨基酸序列選自表1c中列出的VL序列。在一些實施方式中，抗DLL-3結合劑包含與表1c中列出的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的免疫球蛋白輕鏈。

本文提供了DLL3結合劑(例如抗體)，其中DLL3抗原結合結構域包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈，其中VH的氨基酸序列選自表1b中列出的VH序列；並且VL的氨基酸序列選自表1c中列出的VL序列。

在一些實施方式中，DLL-3結合劑包含重鏈CDR1、CDR2和CDR3。在一些實施方式中，重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列選自表1e中列出的重鏈CDR。

在一些實施方式中，DLL-3結合劑包含輕鏈CDR1、CDR2和CDR3。在一些實施方式中，輕鏈CDR1、CDR2和CDR3序列選自表1f中列出的輕鏈CDR。

本公開包括對包含表1b至1e中所示序列的DLL3抗體試劑的修飾，包括具有不顯著影響其性質的修飾的功能上等同的DLL3抗體試劑，以及具有增強或降低的活性和/或親和力的變體。例如，可以對氨基酸序列進行突變以獲得對DLL3具有期望的結合親和力的DLL3抗原結合劑。多肽的修飾是本領域的常規實踐，本文無需詳細描述。修飾的多肽的實例包括下述多肽，其具有氨基酸殘基的保守性置換，一個或多個不顯著有害地改變功能活性或使多肽對其配體的親和力成熟(增強)的氨基酸的缺失或添加，或者使用化學類似物。

氨基酸序列插入包括長度從一個殘基到包含100個以上殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有N末端甲硫醯基殘基的抗體或與表位標籤融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包括與酶抗體或增加抗體在血液迴圈中的半衰期的多肽的N-或C-末端融合。

置換變體在抗原結合結構域中去除了至少一個氨基酸殘基，並且在其位置插入了不同的殘基。在一些實施方式中，用於置換誘變的目的位元點包括高變區/CDR，但是也可以考慮FR改變。保守性置換在表2中顯示在“保守性置換”標題下。如果這種置換導致生物活性的改變，則可以引入更實質性的改變，在表2中命名為“示例性置換”，或者如以下參考氨基酸類別進一步描述的，並篩選產物。

i. 抗體片段

在一方面，根據任何上述實施方式的抗DLL-3抗體試劑可以是抗體片段。抗體片段包含完整抗體的一部分，例如完整抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂ 、Fv、雙抗體、線性抗體、由抗體片段抗體和scFv片段形成的多特異性抗體、以及以下描述的其它片段。在一些實施方式中，抗體是全長抗體，例如，完整的IgG1抗體或本文所述的其它抗體類型或同種型。(參見，例如Hudson等，Nat. Med., 9: 129-134 (2003); Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, pp. 269-315 (1994); Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444- 6448 (1993); WO93/01161；和U.S. Pat. Nos. 5,571,894, 5,869,046, 6,248,516和 5,587,458)。全長抗體、完整抗體或全抗體是具有與天然抗體結構基本相似的結構或具有包含本文定義的Fc區的重鏈的抗體。抗體片段可以通過多種技術製造，包括但不限於完整抗體的蛋白水解消化以及通過重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本領域已知的。

Fv抗體片段包含完整的抗原識別和抗原結合位點。該片段可以包含緊密、非共價締合的一個重鏈和一個輕鏈可變區結構域的二聚體。從這兩個結構域的折疊中，產生六個高變環(各自來自H和L鏈的三個環)，所述環為抗原結合貢獻了氨基酸殘基，並對抗體賦予抗原結合特異性。然而，即使單個可變區(或Fv的一半，其僅包含三個對抗原具有特異性的CDR)也具有識別和結合抗原的能力，儘管親和力低於整個結合位點。

雙抗體是通過構建在V_H 和V_L 結構域之間具有短接頭(例如，約5-10個殘基)的sFv片段而製備的小抗體片段，從而實現V結構域的鏈間配對而不是鏈內配對，產生二價片段。雙特異性雙抗體是兩個交叉的sFv片段的異二聚體，其中兩個抗體的V_H 和V_L 結構域存在於不同的多肽鏈上(參見，例如EP 404,097; WO 93/11161；和Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))。

可以以完全人形式產生的結構域抗體(dAb)是已知最小的抗體抗原結合片段，為約11kDa至約15kDa。DAb是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的穩健可變區(分別為V_H 和V_L )。它們在微生物細胞培養物中高表達，顯示出有利的生物物理學性質，包括例如但不限於溶解度和溫度穩定性，並且非常適合通過體外選擇系統例如噬菌體展示進行選擇和親和力成熟。dAb作為單體具有生物活性，由於其體積小和固有的穩定性，可以被製成更大的分子，從而形成具有延長的血清半衰期或其它藥理活性的藥物(參見，例如W09425591和US20030130496)。

Fv和scFv是具有缺乏恆定區的完整結合位點的物質。因此，它們可能適合於在體內使用期間減少非特異性結合。單鏈Fv(sFv或scFv)是抗體片段，其包含連接到一條多肽鏈中的V_H 和V_L 抗體結構域。sFv多肽可進一步在V_H 和V_L 結構域之間包含多肽接頭，其能夠使sFv形成抗原結合所需的結構(參見，例如Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995，下文。可以構建scFv融合蛋白，以在sFv的氨基或羧基末端產生效應蛋白的融合。線性抗體片段可以是“線性抗體(參見，例如，美國專利號5,641,870)。此類線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。在表1d中提供了示例性的DLL3特異性scFv。

在一些實施方式中，DLL3抗原結合結構域包含scFv，其包含通過柔性接頭連接的DLL3特異性單克隆抗體的輕鏈可變區(V_L )和重鏈可變區(V_H )。可以通過使用連接肽連接輕鏈可變區和/或重鏈可變區來製備單鏈可變區片段。連接肽的實例是具有氨基酸序列(GGGGS)_x 的GS接頭，其中x是1、2、3、4或5(SEQ ID NO：470)。在一些實施方式中，x為6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或小於約20的任何整數。在一些實施方式中，接頭為(GGGGS)₄ (SEQ ID NO: 478)。通常，接頭可以是短的柔性多肽，其在一些實施方式中由約20個以下氨基酸殘基組成。可以進而修飾接頭的其它功能，例如對藥物的附著或對固相支持物的附著。單鏈變體可以重組或合成產生。對於scFv的合成生產，可以使用自動合成儀。為了重組產生scFv，可以將合適的含有編碼scFv的多核苷酸的質粒引入合適的宿主細胞，所述宿主細胞是真核的，例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞；或原核的，例如大腸桿菌。編碼目的scFv的多核苷酸可以通過常規操作例如多核苷酸的連接來製備。可以使用本領域已知的標準蛋白質純化技術分離所得的scFv。

在示例性實施方式中，本文提供了DLL3抗原結合結構域，其包含：包含表1b中所示的VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH區和/或包含表1c中所示的VL序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL區。在一些實施方式中，VH和VL通過接頭連接在一起。在一些實施方式中，接頭包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 478)。在一些實施方式中，接頭可以由包含GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCC (SEQ ID NO: 564)的DNA序列編碼。在一些實施方式中，接頭可以由包含ggcggcggcggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctct (SEQ ID NO: 630)的DNA序列編碼。在一些實施方式中，接頭包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 534)。在一些實施方式中，接頭是scFv Whitlow接頭，其可以包含氨基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 535)。scFv Whitlow接頭可以由包含GGGTCTACATCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGTGGCGAAGGTAGTACAAAGGGG (SEQ ID NO: 566)的DNA序列編碼。在一些實施方式中，所公開的scFv的VH和VL序列可以被定向為VH序列位於scFv的N-末端，然後是接頭，接著是VL序列，而在其它實施方式中，scFv可以被定向為VL序列在N端，然後是接頭，接著是VH序列。 ii. 嵌合和人源化抗體

在一些實施方式中，抗DLL-3抗體試劑是單克隆抗體或包含單克隆抗體，包括嵌合、人源化或人抗體。

在一些實施方式中，本文提供的抗DLL-3抗體試劑可以是嵌合抗體(參見，例如美國專利號4,816,567；和Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。嵌合抗體可以是其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。在一個實例中，嵌合抗體可以包含非人可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠，兔或非人靈長類動物(例如猴)的可變區)和人恆定區。在另一個實例中，嵌合抗體可以是“類別轉換的”抗體，其中類別或亞類已經從親本抗體的類別或亞類發生改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在一些實施方式中，嵌合抗體可以是人源化抗體(參見，例如Almagro and Fransson, Front. Biosci., 13 : 1619-1633 (2008); Riechmann等，Nature, 332:323-329 (1988); Queen等，Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); U.S. Pat. Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321和7,087,409; Kashmiri等，Methods 36:25-34 (2005); Padlan, Mol. Immunol, 28:489-498 (1991); Dall’Acqua等，Methods, 36:43-60 (2005); Osbourn等，Methods, 36:61-68 (2005)；以及Klimka等，Br. J. Cancer, 83 :252-260 (2000))。人源化抗體是嵌合抗體，其包含來自非人高變區的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基。在某些實施方式中，人源化抗體將包含至少一個並且通常是兩個可變結構域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高變區(例如CDR)都對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR都對應於人抗體的那些。人源化抗體可任選地包含源自人抗體的抗體恆定區的至少一部分。

非人抗體可以被人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性和親和力。人源化抗體可包含一個或多個可變結構域，其包含源自非人抗體的一個或多個CDR或其部分。人源化抗體可包含一個或多個可變結構域，其包含源自人抗體序列的一個或多個FR或其部分。人源化抗體可以任選地包含人恆定區的至少一部分。在一些實施方式中，人源化抗體中的一個或多個FR殘基被來自非人抗體(例如，CDR殘基所源自的抗體)的相應殘基置換，以恢復或改善抗體特異性或親和力。

可用於人源化的人類框架區域包括但不限於：使用“最佳擬合”方法選擇的框架區；源自輕鏈可變區或重鏈可變區的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區；以及從篩選FR文庫衍生的框架區(參見，例如Sims等，J. Immunol, 151: 2296 (1993); Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta等，J. Immunol, 151: 2623 (1993); Baca等，J. Biol. Chem., 272: 10678-10684 (1997)；和Rosok等，J. Biol. Chem., 271: 22611-22618 (1996))。 iii. 人抗體

在一些實施方式中，本文提供的抗DLL-3抗體是人抗體。可以使用本領域已知的各種技術來產生人抗體(參見，例如van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)；和Lonberg, Curr. Opin. Immunol, 20:450-459 (2008))。人抗體可以是擁有下述氨基酸序列的抗體，該氨基酸序列對應於由人或人細胞產生的或源自利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。可以通過向轉基因動物施用免疫原(例如DLL-3蛋白)來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應抗原性激發而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體(參見，例如Lonberg, Nat. Biotech., 23 : 1117-1125 (2005); U.S. Pat. Nos. 6,075, 181, 6,150,584, 5,770,429和7,041,870；以及U.S. Pat. App. Pub. No. US 2007/0061900)。來自由這類動物產生的完整抗體的人可變區可以被進一步修飾，例如通過與不同的人恆定區結合而進一步修飾。

人抗體也可以通過基於雜交瘤的方法製備。例如，人抗體可以使用人B細胞雜交瘤技術和其它方法從人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系產生(參見，例如Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (1987); Boerner等，J. Immunol, 147: 86 (1991); Li等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :3557-3562 (2006)；美國專利號7,189,826; Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006); Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005)；和Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005))。人抗體也可以通過分離選自人源噬菌體展示文庫的Fv克隆可變結構域序列來產生。然後可以將此類可變結構域序列與所需的人恆定區組合。

可以對抗體中的寡糖進行修飾，例如以形成具有某些改善的性質的抗體變體。例如，抗體糖基化變體可以具有改善的CDC功能。在一些實施方式中，本公開可以考慮具有一些但不是全部效應子功能的抗體變體，這使其成為其中抗體的體內半衰期很重要但某些效應子功能(例如補體)是不必要的或有害的應用的理想候選物。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定，以確認CDC活性的降低/消耗。 iv. 抗體衍生物

在一些實施方式中，本文提供的抗體試劑可以被進一步修飾以含有本領域已知的並且容易獲得的另外的非蛋白質部分。適用於抗體的衍生化的部分可以包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例可以包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊環、聚-l,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規共聚物)和右旋糖酐或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性而在製造中可能具有優勢。

聚合物可以具有任何分子量，並且可以是支化或非支化的。連接至抗體的聚合物的數量可以變化，並且如果連接了兩種以上聚合物，則它們可以是相同或不同的分子。

在一些實施方式中，提供了可以通過暴露於輻射而選擇性加熱的抗體和非蛋白質部分的綴合物。在一些實施方式中，非蛋白質部分可以是碳納米管(參見，例如Kam等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 11600-11605 (2005))。輻射可以具有任何波長，並且可以包括但不限於，不損害普通細胞、但是將非蛋白質部分加熱至殺死鄰近抗體-非蛋白質部分的細胞的溫度的波長。

當解離常數(Kd)為約1nM時，DLL3結合劑(例如，包含抗原結合結構域的分子)稱為“特異性結合”其靶抗原(例如，人、食蟹猴或小鼠DLL3)。當Kd為1-5nM時，抗原結合結構域以“高親和力”特異性結合抗原，而當Kd為0.1-0.5nM時，抗原結合結構域以“非常高親和力”結合抗原。在一個實施方式中，抗原結合結構域具有約1nM的Kd。在一個實施方式中，解離速率為＜1×10^-5 。在其它實施方式中，抗原結合結構域與人DLL3結合的Kd為約1x10^-7 M至1x10^-12 M，而在又一個實施方式中，抗原結合結構域結合的Kd為約1x10^-5 M至1x10^-12 M。

如本文提供的，本公開的抗原結合結構域特異性結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)。在某些實施方式中，本公開的DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3的Kd小於1×10^-6 M，小於1×10^-7 M，小於1×10^-8 M或小於1×10^-9 M。在一個具體實施方式中，DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的Kd小於1×10^-7 M。在另一實施方式中，DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的Kd小於1×10^-8 M。在一些實施方式中，DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3)的Kd為約1×10^-7 M，約2×10^-7 M，約3×10^-7 M，約4× 10^-7 M，約5×10^-7 M，約6× 10^{‑ 7} M，約7×10^-7 M，約8×10^-7 M，約9×10^-7 M，約1x10^-8 M，約2×10^-8 M，約3×10^-8 M，約4×10^-8 M，約5×10^-8 M，約6×10^-8 M，約7×10^-8 M，約8×10^-8 M，約9×10^-8 M，約1×10^-9 M，約2×10^-9 M，約3×10^-9 M，約4×10^-9 M，約5×10^-9 M，約6×10^-9 M，約7×10^-9 M，約8×10^-9 M，約9×10^-9 M，約1×10^-10 M或約5×10^-10 M。在某些實施方式中，Kd計算為K_off /K_on 的商，並且K_on 和K_off 使用單價抗體(例如Fab片段)確定，如通過例如BIAcore^® 表面等離振子共振技術所測量的。在其它實施方式中，Kd計算為K_off /K_on 的商，並且K_on 和K_off 使用二價抗體(例如Fab片段)確定，如通過例如BIAcore®表面等離振子共振技術所測量的。

在一些實施方式中，DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的結合速率(k_on )小於1×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於2×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於3×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於4×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於5×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於7×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於8×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於9×10^-4 M^-1 s-¹ ，小於1×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於2×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於3×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於4×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於5×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於6×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於7×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於8×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於9×10^-5 M^-1 s-¹ ，小於1×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於2×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於3×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於4×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於5×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於6×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於7×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於8×10^-6 M^-1 s-¹ ，小於9×10^-6 M^-1 s-¹ 或小於1×10^-7 M^-1 s-¹ 。在某些實施方式中，k_on 使用單價抗體(例如Fab片段)確定，如通過例如BIAcore^® 表面等離振子共振技術所測量的。在其它實施方式中，K_on 使用二價抗體確定，如通過例如BIAcore®表面等離振子共振技術所測量的。

在一些實施方式中，DLL3抗原結合結構域結合哺乳動物DLL3(例如，人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的解離速率(k_off )小於1×10^-2 s^-1 ，小於2×10^-2 s^-1 ，小於3×10^-2 s^-1 ，小於4×10^-2 s^-1 ，小於5×10^-2 s^-1 ，小於6×10^-2 s^-1 ，小於7×10^-2 s^-1 ，小於8×10^-2 s^-1 ，小於9×10^-2 s^-1 ，小於1×10^-3 s^-1 ，小於2×10^-3 s^-1 ，小於3×10^-3 s^-1 ，小於4×10^-3 s^-1 ，小於5×10^-3 s^-1 ，小於6×10^-3 s^-1 ，小於7×10^-3 s^-1 ，小於8×10^-3 s^-1 ，小於9×10^-3 s^-1 ，小於1×10^-4 s^-1 ，小於2×10^-4 s^-1 ，小於3×10^-4 s^-1 ，小於4×10^-4 s^-1 ，小於5×10^-4 s^-1 ，小於6×10^-4 s^-1 ，小於7×10^-4 s^-1 ，小於8×10^-4 s^-1 ，小於9×10^-4 s^-1 ，小於1×10^-5 s^-1 或小於5×10^-4 s^-1 。在某些實施方式中，k_off 使用單價抗體(例如Fab片段)確定，如通過例如BIAcore^® 表面等離振子共振技術所測量的。在其它實施方式中，k_off 使用二價抗體確定，如通過例如BIAcore®表面等離振子共振技術所測量的。 II. 嵌合抗原受體

如本文所用，嵌合抗原受體(CAR)是特異性識別靶抗原(例如癌細胞上的靶抗原)的蛋白質。當與靶抗原結合時，CAR可以啟動免疫細胞攻擊並破壞帶有該抗原的細胞(例如癌細胞)。CAR還可以引入共刺激或信號傳導結構域，以增加其效力。參見Krause等，J. Exp. Med., Volume 188, No. 4, 1998 (619-626); Finney等，Journal of Immunology, 1998, 161: 2791-2797, Song等，Blood 119: 696-706 (2012); Kalos等，Sci. Transl. Med. 3:95 (2011); Porter等，N. Engl. J. Med. 365:725-33 (2011)，和Gross等，Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 56:59-83 (2016); U.S. Patent Nos. 7,741,465，和6,319,494。

本文所述的嵌合抗原受體包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域。在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR從5’至3’包含以下元件：信號序列，DLL3抗原結合結構域(例如，抗DLL3scFv)，鉸鏈和跨膜區，以及一個或多個連續的信號傳導結構域。在某些實施方式中，DLL-3特異性CAR從5’至3’包含以下元件：CD8α信號序列，包含本文所述的DLL3可變重鏈和/或可變輕鏈的DLL3 scFv，CD8α鉸鏈和跨膜區，41BB胞質信號傳導結構域，和CD3ζ胞質信號傳導結構域。(圖4，表7)。

在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR還包含安全開關和/或單克隆抗體特異性表位。 a. 抗原結合結構域

如上所述，本文所述的DLL3 CAR包含抗原結合結構域。如本文所用，“抗原結合結構域”是指結合指定靶抗原的任何多肽，例如指定靶抗原可以是DLL3(DLL-3)蛋白或其片段(在本文中可互換地稱為“DLL3抗原”/“DLL3靶抗原”或“DLL3靶標”)。在一些實施方式中，抗原結合結構域與腫瘤細胞上的DLL3抗原結合。在一些實施方式中，抗原結合結構域與參與過度增殖性疾病的細胞上的DLL3抗原結合。

在一些實施方式中，抗原結合結構域包含本文所述的可變重鏈、可變輕鏈和/或一個或多個CDR。在一些實施方式中，抗原結合結構域是單鏈可變片段(scFv)，其包含輕鏈CDR CDR1、CDR2和CDR3以及重鏈CDR CDR1、CDR2和CDR3。

在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR包含表1b中所示的VH。在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR包含表1c所示的VL。在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR包含表1e中所示的重鏈CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施方式中，DLL-3特異性CAR包含表1f中所示的輕鏈CDR1、CDR2、CDR3。

抗原結合結構域的變體(例如，CDR、VH和/或VL的變體)也在本公開的範圍內，例如，各自與本文所述的抗原結合結構域序列的氨基酸序列具有至少70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-99%、或高於99%同一性的可變輕鏈和/或可變重鏈。在一些情況下，此類分子包括至少一個重鏈和一個輕鏈，而在其它情況下，變體形式含有兩個可變輕鏈和兩個可變重鏈(或其子部分)。本領域技術人員將能夠使用公知的技術來確定本文所述的抗原結合結構域的合適變體。在某些實施方式中，本領域技術人員可以通過靶向認為對活性不重要的區域來鑒定可以進行改變而不會破壞活性的分子的合適區域。

在某些實施方式中，抗原結合結構域的多肽結構基於抗體，包括但不限於單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文有時稱為“抗體模擬物”)、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、抗體融合物(本文有時稱為“抗體綴合物”)及其片段。在一些實施方式中，抗原結合結構域包含高親和性多聚體(avimer)或由其組成。

當DLL3抗原結合結構域與一個靶標的結合比與第二靶標的結合更緊密時，它被認為是“選擇性的”。

在一些實施方式中，DLL3抗原結合結構域是scFv。在一些實施方式中，DLL3特異性CAR包含表1d中提供的scFv。

在一些實施方式中，DLL3特異性CAR包含前導肽或信號肽；在一些實施方式中，前導肽包含與氨基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 477)具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%，或100%同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中，前導肽包含SEQ ID NO：477的氨基酸序列。在一些實施方式中，前導肽由包含以下的核酸序列編碼：ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGCCCG (SEQ ID NO: 555)。

在其它實施方式中，本公開涉及分離的多核苷酸，其編碼本文所述的DLL3抗原結合結構域中的任一個。在一些實施方式中，本公開涉及編碼表10中描述的DLL3 CAR的分離的多核苷酸，本文還提供了包含所述多核苷酸的載體及其製造方法。

b. 安全開關和單克隆抗體特異性表位 安全開關

應當理解，可以通過用自殺基因轉導免疫細胞(包含一個或多個CAR)來使不良事件最小化。還可能需要將誘導型“開(on)”或“促進子(accelerator)”開關引入免疫細胞中。合適的技術包括在用本公開的CAR構建體轉導細胞之前、之後或同時使用誘導型半胱天冬酶9(美國專利申請2011/0286980)或胸苷激酶。引入自殺基因和/或“on”開關的其它方法包括TALENS、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術和本領域已知的其它技術。

根據本公開，可以在本文中引入另外的開關或其它類型的控制開關技術。這些技術可以使用二聚化結構域和此類結構域二聚化的任選啟動劑。這些技術包括，例如，Wu等，Science 2014 350 (6258)描述的那些技術，其在某些細胞中利用FKBP/Rapalog二聚化系統，其內容通過引用整體上併入本文。另外的二聚化技術描述於例如Fegan等，Chem. Rev. 2010, 110, 3315-3336以及U.S. Pat. Nos. 5,830,462；5,834,266；5,869,337；和6,165,787，其內容也通過引用整體上併入本文。另外的二聚化對可以包括環孢素-A/親環素受體、雌激素/雌激素受體(任選地使用他莫昔芬)、糖皮質激素/糖皮質激素受體、四環素/四環素受體、維生素D/維生素D受體。二聚化技術的其它實例可以見於例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US2015/0266973、US2016/0046700、美國專利號8,486,693、US 2014/0171649和US 2012/0130076，其內容通過引用整體上併入本文。

在一些實施方式中，本發明的CAR免疫細胞(例如，CAR-T細胞)包含編碼自殺多肽(例如RQR8)的多核苷酸。參見例如WO2013153391A，其通過引用整體上併入本文。在包含多核苷酸的CAR免疫細胞(例如CAR-T細胞)細胞中，自殺多肽在CAR免疫細胞(例如CAR-T細胞)的表面表達。在一些實施方式中，自殺多肽包含SEQ ID NO：552所示的氨基酸序列：CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 552)。

自殺多肽還可以在氨基末端包含信號肽，例如，MGTSLLCWMALCLLGADHADA(SEQ ID NO：553)。在一些實施方式中，自殺多肽包含SEQ ID NO：554所示的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：553的信號序列：MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 554)。

當自殺多肽在CAR免疫細胞(例如CAR-T細胞)的表面表達時，利妥昔單抗結合至該多肽的R表位引起細胞裂解。每個在細胞表面表達的多肽可以結合多於一個利妥昔單抗分子。多肽的每個R表位可以結合單獨的利妥昔單抗分子。DLL3特異性CAR-免疫細胞(例如，CAR-T細胞)的刪除可在體內發生，例如通過向患者施用利妥昔單抗。刪除轉移的細胞的決定可能源於在患者體內檢測到的歸因於轉移的細胞的不良影響，例如，當檢測到不可接受的毒性水準時。

在一些實施方式中，自殺多肽在細胞表面上表達。在一些實施方式中，自殺多肽包括在CAR構建體中。在一些實施方式中，自殺多肽不是DLL3 CAR構建體的一部分。

在一些實施方式中，本文公開的任一個DLL3特異性CAR的胞外結構域可以包含對單克隆抗體具有特異性(即，被單克隆抗體特異性識別)的一個或多個表位。這些表位在本文中也稱為mAb特異性表位。示例性mAb特異性表位在國際專利公開號WO 2016/120216中公開，其全部內容併入本文。在這些實施方式中，CAR的胞外結構域包含與DLL3特異性結合的抗原結合結構域和與一種或多種單克隆抗體(mAb) 結合的一個或多個表位。包含mAb特異性表位的CAR可以是單鏈或多鏈。

在本文描述的CAR的胞外結構域中包含對單克隆抗體具有特異性的表位，允許分類和消耗(depletion)表達CAR的工程化免疫細胞。在一些實施方式中，該特徵還促進內源性DLL3表達細胞的恢復，所述內源性DLL3表達細胞通過施用表達CAR的工程化免疫細胞而被消耗。在一些實施方式中，在例如對受試者施用時具有有害作用的情況下，允許消耗提供安全開關。

因此，在一些實施方式中，本公開涉及一種用於分選和/或消耗賦予了包含mAb特異性表位元的CAR的工程化免疫細胞的方法，以及一種促進內源性DLL3表達細胞恢復的方法。

數個表位-單克隆抗體對可以用於產生包含單克隆抗體特異性表位的CAR；具體而言，已經批准用於醫學用途的那些，例如作為非限制性實例的CD20表位元/利妥昔單抗。

本公開內容還包括用於對賦予表達mAb特異性表位的DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞進行分選的方法，和治療方法，所述治療方法中，通過使用靶向所述CAR的外部配體結合結構域的抗體來消耗細胞，而調節被賦予有這些CAR的工程化免疫細胞的啟動。表4提供了可插入本發明任何一種CAR的胞外結構域的示例性類比表位序列。

在一些實施方式中，CAR的胞外結合結構域包含以下序列： -     V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位1-(L)_x -； -     V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -； -     V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x -； -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ ； -     (L)_x -表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ ； -     表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ ； -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x ； -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x -； -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x -表位4-(L)_x -； -     (L)_x -表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位3-(L)_x -； -     (L)_x -表位1-(L)_x -表位2-(L)_x -V₁ -L₁ -V₂ -(L)_x -表位3-(L)_x -表位4-(L)_x -； -     V₁ -(L)_x -表位1-(L)_x -V₂ ； -     V₁ -(L)_x -表位1-(L)_x -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x ； -     V₁ -(L)_x -表位1-(L)_x -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x ； -     V₁ -(L)_x -表位1-(L)_x -V₂ -(L)_x -表位2-(L)_x -表位3-(L)_x -表位4-(L)_x ； -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -(L)_x -表位2-(L)_x -V₂ ；or， -     (L)_x -表位1-(L)_x -V₁ -(L)_x -表位2-(L)_x -V₂ -(L)_x -表位3-(L)_x ； -     其中， -     V₁ 是V_L 且V₂ 是V_H ，或者V₁ 是V_H 且V₂ 是V_L ； -     L₁ 是適合於將V_H 鏈連接到V_L 鏈的接頭； -     表位1、表位2、表位3和表位4是mAb特異性表位，並且可以相同或 c. 鉸鏈結構域

本公開的CAR的胞外結構域可包含“鉸鏈”結構域(或鉸鏈區)。該術語通常指功能是將CAR中的跨膜結構域連接至CAR中的胞外抗原結合結構域的任何多肽。特別地，鉸鏈結構域可用於為胞外抗原結合結構域提供更多的靈活性和可及性。

鉸鏈結構域可以包含至多300個氨基酸—在一些實施方式中為10至100個氨基酸，或在一些實施方式中為25至50個氨基酸。鉸鏈結構域可以源自全部或部分天然存在的分子，例如源自CD8、CD4、CD28、4-1BB或IgG的全部或部分胞外區域(特別是IgG的鉸鏈區；應當理解，鉸鏈區可以含有免疫球蛋白家族的一些或全部成員，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM或其片段)，或源自抗體重鏈恆定區的全部或部分。作為選擇，A結構域可以是對應於天然存在的A序列的合成序列，或者可以是完全合成的A序列。在一些實施方式中，所述A結構域是人CD8α鏈的一部分(例如，NP_001139345.1)。在另一個特定的實施方式中，所述鉸鏈和跨膜結構域包含人CD8α鏈的一部分。在一些實施方式中，本文所述的CAR的鉸鏈結構域包含CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα的子序列，特別是CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα中任一個的鉸鏈區。在一些實施方式中，鉸鏈結構域包含人CD8α鉸鏈、人IgG1鉸鏈、人IgG4、人PD-1或人FcγRIIIα鉸鏈。在一些實施方式中，本文公開的CAR包含scFv，CD8α人鉸鏈和跨膜結構域、CD3ζ信號傳導域和4-1BB信號傳導域。表5提供了本文提供的示例性鉸鏈的氨基酸序列。

在某些實施方式中，鉸鏈區包含與表5中本文提出的胞外結構域氨基酸序列具有至少約75%，至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，至少約96%，至少約97%，至少約98%，至少約99%或100%同一性的氨基酸序列。 d. 跨膜結構域

本公開的CAR設計為具有與CAR的胞外結構域融合的跨膜結構域。可以類似地將其融合至CAR的胞內結構域。在一些情況下，可以通過氨基酸置換來選擇或修飾跨膜結構域，以避免此類結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域結合，從而使其與受體複合物的其它成員的相互作用最小化。在一些實施方式中，短接頭可以在CAR的胞外、跨膜和胞內結構域的任何或一些之間形成連接。

本文公開的CAR的合適的跨膜結構域具有以下能力：(a)在表面表達免疫細胞，例如但不限於淋巴細胞，例如T輔助細胞(T_h )，細胞毒性T (T_c )細胞、T調節(T_reg )細胞或天然殺手(NK)細胞，和/或(b)與胞外抗原結合域和胞內信號傳導域相互作用，以指導免疫細胞對靶細胞的細胞應答。

跨膜結構域可以源自天然或合成來源。如果來源是天然的，則該結構域可以源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。

在本公開中特別使用的跨膜區可以源自(包括或對應於) CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡1(PD-1)、誘導型T細胞共刺激物(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1, CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα (CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、MHC 1類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白、細胞因數受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞啟動分子(SLAM蛋白)、啟動NK細胞受體，BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、與CD83特異性結合的配體，或其任何組合。

作為非限制性實例，跨膜區可以源自或為T細胞受體，例如α、β、γ或δ的一部分，構成CD3複合物的多肽、IL-2受體p55(鏈)、p75(β鏈)或γ鏈、Fc受體的亞基鏈(特別是Fcγ受體III)或CD蛋白。作為選擇，跨膜結構域可以是合成的，並且可以主要包含疏水性殘基，例如亮氨酸和纈氨酸。在一些實施方式中，所述跨膜結構域源自人CD8α鏈(例如，NP_001139345.1)。

在一些實施方式中，本公開的CAR中的跨膜結構域是CD8α跨膜結構域。在一些實施方式中，本公開的CAR中的跨膜結構域是包含氨基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT (SEQ ID NO: 549)的CD8α跨膜結構域。在一些實施方式中，CD8α跨膜結構域包含編碼SEQ ID NO: 549的跨膜氨基酸序列的核酸序列。在一些實施方式中，本公開的CAR中的鉸鏈和跨膜結構域是包含氨基酸序列SEQ ID NO: 479的CD8α鉸鏈和跨膜結構域。

在一些實施方式中，本公開的CAR中的跨膜結構域是CD28跨膜結構域。在一些實施方式中，本公開的CAR中的跨膜結構域是包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 550)的CD28跨膜結構域。在一些實施方式中，CD28跨膜結構域包含編碼SEQ ID NO: 550的跨膜氨基酸序列的核酸序列。 e. 胞內結構域

本公開的CAR的胞內(胞質)結構域可以提供包含CAR的免疫細胞的正常效應子功能的至少一種的啟動，例如信號1/啟動和/或信號2/共刺激。例如，T細胞的效應子功能可以指細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因數的分泌。 在一些實施方式中，用於CAR的啟動的胞內信號傳導結構域可以是例如但不限於協同作用以在抗原受體結合後啟動信號轉導的T細胞受體和共受體的細胞質序列，以及這些序列的任何衍生物或變體，以及具有相同功能能力的任何合成序列。

應當理解，合適的(例如，啟動的)胞內結構域包括但不限於源自(或對應於)下述的信號傳導結構域：CD3ζ、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡1(PD-1)、誘導型T細胞共刺激物(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1，CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα (CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、MHC 1類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白蛋白、細胞因數受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞啟動分子(SLAM蛋白)、啟動NK細胞受體，BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、與CD83特異性結合的配體，或其任何組合。

本公開內容的CAR的胞內結構域除了上述啟動結構域之外，還可引入共刺激信號傳導結構域(本文可互換地稱為共刺激分子)以增加其效力。除由本文所述的啟動分子提供的主要信號外，共刺激結構域也可以提供信號。

應當理解，本公開範圍內的合適的共刺激結構域可以源自(或對應於)例如：CD28、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3 (α、β、delta、epsilon,γ,ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD 33、CD37、CD40、CD 45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD1 1a/CD18)、CD247、CD276 (B7-H3)、LIGHT (腫瘤壞死因數超家族成員14；TNFSF14)、NKG2C、Ig α (CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、MHC I類分子、TNFR、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞啟動分子、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配體或其片段或組合。應當理解，以上未列出的其它共刺激分子或其片段在本公開的範圍內

在一些實施方式中，可以將CAR的胞內/胞質結構域設計成自身包含41BB/CD137結構域，或者將其與在本公開的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞內結構域組合。41BB/CD137的完整天然氨基酸序列描述於NCBB參考序列：NP_001552.2中。完整的天然41BB/CD137核酸序列描述於NCBI參考序列：NM_001561.5中。

在一些實施方式中，可以將CAR的胞內/胞質結構域設計成自身包含CD28結構域，或者將其與在本公開的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞內結構域組合。CD28的完整天然氨基酸序列描述於NCBI參考序列NP_006130.1中。完整的天然CD28核酸序列描述於NCBI參考序列：NM_006139.1中。

在一些實施方式中，可以將CAR的胞內/胞質結構域設計成自身包含CD3ζ結構域，或者將其與在本公開的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞內結構域組合。在一些實施方式中，CAR的胞內信號傳導結構域可以包含與表7中的SEQ ID NO: 481所示的氨基酸序列具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列的CD3ζ 信號傳導結構域。例如，CAR的胞內結構域可以包含CD3ζ鏈部分和共刺激信號傳導分子的一部分。本公開內容的CAR的胞內信號傳導部分內的胞內信號傳導序列可以以隨機或指定順序彼此連接。在一些實施方式中，將胞內結構域設計為包含CD3ζ的啟動結構域和CD28的信號傳導結構域。在一些實施方式中，將胞內結構域設計為包含CD3ζ的啟動結構域和4-1BB的共刺激/信號傳導結構域。

在一些實施方式中，4-1BB (胞內結構域)包含氨基酸序列KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCEL(SEQ ID NO: 480)。在一些實施方式中，4-1BB (胞內結構域)由下述核酸序列編碼： AAGCGCGGCAGGAAGAAGCTCCTCTACATTTTTAAGCAGCCTTTTATGAGGCCCGTACAGACAACACAGGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCAGATTTCCCGAGGAGGAGGAAGGTGGGTGCGAGCTG (SEQ ID NO: 568)。

在一些實施方式中，將CAR中的胞內結構域設計為包含CD28和CD3ζ的一部分，其中胞內CD28包含SEQ ID NO：567所示的核酸序列。 AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC (SEQ ID NO: 567)。

在一些實施方式中，將CAR中的胞內結構域設計為包含氨基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR KHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 551)。CD3ζ氨基酸序列可包含SEQ ID NO: 481或469，並且該核酸序列可包含SEQ ID NO: 569： AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG (SEQ ID NO: 569)。

在一些實施方式中，本發明的CAR的胞內信號傳導結構域包含共刺激分子的結構域。在一些實施方式中，本公開的CAR的胞內信號傳導域包含選自由4-1BB (GenBank: AAA53133.)和CD28 (NP_006130.1)的片段組成的組中的共刺激分子的一部分。在一些實施方式中，本公開的CAR的胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 480和SEQ ID NO: 551所示的氨基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方式中本公開的CAR的胞內信號傳導域包含與SEQ ID NO: 480所示的氨基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、95%、97%或99%序列同一性和/或與SEQ ID NO: 551所示的氨基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、95%、97%或99%序列同一性的氨基酸序列。

在示例性實施方式中，本發明的CAR從N端至C端包括：(可切割的)CD8α信號序列，DLL3 scFv，CD8α鉸鏈和跨膜區，4-1BB胞質(共刺激)信號傳導結構域和CD3ζ胞質(刺激性)信號傳導結構域。 III. 包含CAR的免疫細胞 a. 免疫細胞

本文提供了表達本公開的CAR的工程化免疫細胞(例如，CAR-T細胞)。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞包含CAR群，每種CAR包含不同的胞外抗原結合結構域。在一些實施方式中，免疫細胞包含CAR群，每種CAR包含相同的胞外抗原結合結構域。

工程化免疫細胞可以是同種異體的或自體的。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞是T細胞(例如，炎性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞(Treg)、輔助性T淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL))、天然殺手T細胞(NKT)、表達TCR的細胞、樹突狀細胞、殺傷性樹突狀細胞、肥大細胞或B細胞。在一些實施方式中，細胞可以源自由CD4+ T淋巴細胞和CD8+ T淋巴細胞組成的組。在一些示例性的實施方式中，工程化免疫細胞是T細胞。在一些示例性實施方式中，工程化免疫細胞是γδT細胞。在一些示例性的實施方式中，工程化免疫細胞是巨噬細胞。在一些示例性實施方式中，工程化免疫細胞是天然殺手(NK)細胞。

在一些實施方式中，工程化免疫細胞可以源自，例如但不限於，幹細胞。幹細胞可以是成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞、更特別地是非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導型多能幹細胞、全能幹細胞或造血幹細胞。

在一些實施方式中，細胞是從外周血獲得或製備的。在一些實施方式中，所述細胞是從外周血單個核細胞(PBMC)獲得或製備的。在一些實施方式中，細胞是從骨髓獲得或製備的。在一些實施方式中，細胞是從臍帶血獲得或製備的。在一些實施方式中，細胞是人細胞。

在一些實施方式中，使用選自由電穿孔、聲穿孔、生物彈射 (例如基因槍)、脂質轉染、聚合物轉染、納米顆粒、病毒轉染(例如例如逆轉錄病毒、慢病毒、AAV)或多鏈體組成的組中的方法，通過核酸載體轉染或轉導細胞。

在一些實施方式中，在其細胞表面膜上表達本公開的DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞包含的幹細胞記憶和中央記憶細胞的百分比，大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施方式中，在其細胞表面膜上表達本公開的DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞包含的幹細胞記憶和中央記憶細胞的百分比，為約10%至約100%，約10%至約90%，約10%至約80%，約10%至約70%，約10%至約60%，約10%至約50%，約10%至約40%，約10%至約30%，約10%至約20%，約15%至約100%，約15%至約90%，約15%至約80%，約15%至約70%，約15%至約60%，約15%至約50%，約15%至約40%，約15%至約30%，約20%至約100%，約20%至約90%，約20%至約80%，約20%至約70%，約20%至約60%，約20%至約50%，約20%至約40%，約20%至約30%，約30%至約100%，約30%至約90%，約30%至約80%，約30%至約70%，約30%至約60%，約30%至約50%，約30%至約40%，約40%至約100%，約40%至約90%，約40%至約80%，約40%至約70%，約40%至約60%，約40%至約50%，約50%至約100%，約50%至約90%，約50%至約80%，約50%至約70%，約50%至約60%，約60%至約100%，約60%至約90%，約60%至約80%，約60%至約70%，約70%至約90%，約70%至約80%，約80%至約100%，約80%至約90%，約90%至約100%，約25%至約50%，約75%至約100%或約50%至約75%。

在一些實施方式中，免疫細胞是表達本文所述的任一種CAR的炎性T淋巴細胞。在一些實施方式中，免疫細胞是表達本文所述的任一種CAR的細胞毒性T淋巴細胞。在一些實施方式中，免疫細胞是表達本文所述的任一種CAR的調節性T淋巴細胞。在一些實施方式中，免疫細胞是表達本文所述的任一種CAR的輔助T淋巴細胞。

在擴增和遺傳修飾之前，可以通過多種非限制性方法從受試者獲得細胞來源。細胞可以獲自許多非限制性來源，包括外周血單個核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在一些實施方式中，可以使用本領域技術人員可獲得和已知的任何數量的T細胞系。在一些實施方式中，細胞可以源自健康供體，源自診斷患有癌症的患者或源自診斷患有感染的患者。在一些實施方式中，細胞可以是呈現不同表型特徵的混合細胞群的一部分。

本文還提供根據任何上述方法從經轉化的免疫細胞(例如，T細胞)獲得的細胞系。本文還提供對免疫抑制治療有抗性的修飾細胞。在一些實施方式中，根據本發明的分離的細胞包含編碼CAR的多核苷酸。

使用公知的方法，可以在對免疫細胞進行遺傳修飾之前或之後啟動和擴增本發明的免疫細胞。通常，本公開的工程化免疫細胞可以例如通過與刺激CD3 TCR複合物的試劑和T細胞表面上的共刺激分子接觸以產生T細胞的啟動信號而擴增。例如，可以使用諸如鈣離子載體A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或像植物血凝素(PHA之類的促有絲凝集素等化學物質來產生T細胞的啟動信號。

在一些實施方式中，可以通過與固定在表面上的例如抗CD3抗體(例如OKT3抗體或其抗原結合片段)或者抗CD2抗體接觸，或通過與鈣離子載體結合的蛋白激酶C啟動劑(例如，苔蘚抑素)接觸，而在體外刺激T細胞群。為了共刺激T細胞表面上的輔助分子，使用結合輔助分子的配體。例如，可以在適於刺激T細胞增殖的條件下，使T細胞群與抗CD3抗體(例如，OKT3抗體)和抗CD28抗體接觸。可以將抗CD3抗體和抗CD28抗體置於珠(例如塑膠珠或磁珠)上，或板或其它基材上。適用於T細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，基本必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可能含有增殖和活力所需的因數，包括血清(例如胎牛或人)血清)、白介素2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF，或任何其它本領域技術人員已知的用於細胞生長的添加劑。用於細胞生長的其它添加劑包括但不限於表面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)和還原劑，例如N-乙醯基-半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，並添加有氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，其中不含血清或補充有適量的血清(或血漿)或一組確定的激素，和/或量足以使T細胞生長和擴增的細胞因數(例如IL-7和/或IL-15))。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅包括在實驗培養物中，而不包括在待輸注到受試者的細胞的培養物中。靶細胞保持在支持生長所必需的條件下，例如適當的溫度(例如37℃)和氣氛(例如空氣加5%CO₂ )。暴露於不同刺激時間的T細胞可能表現出不同的特徵。在一些實施方式中，可以通過與組織或細胞共培養來擴增本公開的細胞。將細胞施用於受試者後，細胞還可以在體內例如在受試者的血液中擴增。

在一些實施方式中，根據本公開的工程化免疫細胞可以包含一個或多個中斷或失活基因。在一些實施方式中，根據本公開的工程化免疫細胞包含選自由CD52、DLL3、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ組成的組中的一個中斷或失活基因，和/或表達CAR、多鏈CAR和/或pTα轉基因。在一些實施方式中，分離的細胞包含編碼包含多鏈CAR的多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，根據本公開的分離的細胞包含選自下述組成的組中的兩個中斷或失活基因：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、DLL3和CD52、DLL3和TCRα、DLL3和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、TIM3and TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ，和/或表達CAR、多鏈CAR和/或pTα轉基因。在一些實施方式中，該方法包括通過將能夠通過選擇性DNA切割而使基因選擇性地失活的內切核酸酶引入細胞中來中斷或失活一個或多個基因。在一些實施方式中，核酸內切酶可以是例如鋅指核酸酶(ZFN)、megaTAL核酸酶、大範圍核酸酶(meganuclease)、轉錄啟動子樣效應核酸酶(TALE-核酸酶/TALEN)或CRISPR(例如Cas9)核酸內切酶。

在一些實施方式中，通過中斷或失活TCRα基因和/或TCRβ基因，而使TCR在根據本公開的細胞中不起作用。在一些實施方式中，提供一種獲得源自個體的修飾細胞的方法，其中所述細胞可以獨立於主要組織相容性複合物(MHC)信號傳導途徑而增殖。易於通過該方法獲得的、可以獨立於MHC信號傳導途徑增殖的修飾細胞，包括在本公開的範圍內。本文公開的修飾細胞可以針對宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)來用於治療有需要的患者；因此，在本公開的範圍內，是一種針對宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)治療有需要的患者的方法，該方法包括通過向所述患者施用有效量的修飾細胞，所述細胞包含中斷或失活的TCRα和/或TCRβ基因。

在一些實施方式中，將免疫細胞工程化成對一種或多種化療藥物具有抗性。該化療藥物可以是例如嘌呤核苷酸類似物(PNA)，從而使免疫細胞適合於組合過繼免疫療法和化療的癌症治療。示例性的PNA包括例如單獨或組合使用的氯法拉濱、氟達拉濱、環磷醯胺和阿糖胞苷。PNA通過去氧胞苷激酶(dCK)代謝為單磷酸、二磷酸和三磷酸PNA。其三磷酸形式與ATP競爭DNA合成，充當促凋亡劑，並且是參與三核苷酸生產的核糖核苷酸還原酶(RNR)的有效抑制劑。本文提供包含中斷或失活的dCK基因的DLL3特異性CAR-T細胞。在一些實施方式中，通過例如mRNA的電穿孔，使用編碼針對dCK基因的特異性TAL核酸酶的多核苷酸，通過T細胞的轉染來製備dCK敲除細胞。dCK敲除的DLL3特異性CAR-T細胞對PNA(包括氯洛法濱和/或氟達拉濱)具有抗性，並保持T細胞對DLL3表達細胞的細胞毒性活性。

在一些實施方式中，本公開的分離的細胞或細胞系可包含pTα或其功能變體。在一些實施方式中，可以通過中斷或失活TCRα基因來進一步遺傳修飾分離的細胞或細胞系。

本公開還提供了工程化免疫細胞，其包含本文所述的任何CAR多核苷酸。在一些實施方式中，可以通過質粒載體將CAR作為轉基因引入免疫細胞。在一些實施方式中，質粒載體還可以含有例如選擇標誌物，其用於鑒定和/或選擇接受載體的細胞。

在將編碼CAR多肽的多核苷酸引入細胞後，可以在細胞中原位合成CAR多肽。作為選擇，可以在細胞外產生CAR多肽，然後將其引入細胞。將多核苷酸構建體引入細胞的方法是本領域已知的。在一些實施方式中，可以使用穩定的轉化方法(例如，使用慢病毒載體)將多核苷酸構建體整合到細胞的基因組中。在其它實施方式中，可以使用暫態轉化方法暫態表達多核苷酸構建體，並且該多核苷酸構建體不整合到細胞的基因組中。在其它實施方式中，可以使用病毒介導的方法。可以通過任何合適的方式，例如重組病毒載體(例如，逆轉錄病毒、腺病毒)、脂質體等，將多核苷酸引入細胞。暫態轉化方法包括例如但不限於顯微注射、電穿孔或顆粒轟擊。多核苷酸可以包含在載體，例如質粒載體或病毒載體中。

在一些實施方式中，提供了分離的核酸，其包含與編碼DLL3抗原結合結構域的第一多核苷酸可操作地連接的啟動子，至少一個共刺激分子和啟動結構域。在一些實施方式中，核酸構建體包含在病毒載體內。在一些實施方式中，病毒載體選自由逆轉錄病毒載體、鼠類白血病病毒載體、SFG載體、腺病毒載體、慢病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體和痘苗病毒載體組成的組。在一些實施方式中，核酸包含在質粒內。 b. 製造方法

本文提供了製造本公開的CAR和含CAR的免疫細胞的方法。

可以使用各種已知技術來製造根據本公開的多核苷酸、多肽、載體、抗原結合結構域、免疫細胞、組合物等。

在本文描述的免疫細胞的體外操作或遺傳修飾之前，可以從受試者獲得細胞。表達DLL3 CAR的細胞可以源自同種異體或自體方法。 i. 源材料

在一些實施方式中，免疫細胞包含T細胞。T細胞可獲自多種來源，包括外周血單個核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在某些實施方式中，可以使用本領域技術人員已知的多種技術，例如FICOLL™分離，從從受試者收集的單位血液中獲得T細胞。

細胞可以通過單采血液成分術從個體的迴圈血液中獲得。單采血液成分術產品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核白細胞、紅細胞和血小板。在某些實施方式中，通過單采血液成分術收集的細胞可以進行洗滌以除去血漿級分，並放置在適當的緩衝液或培養基中以用於後續處理。

在某些實施方式中，例如使用通過PERCOLL™梯度的離心，通過裂解紅細胞並消耗單核細胞而從PBMC中分離T細胞。T細胞的特定亞群(例如CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-、CD45RO+、CDS+、CD62-、CD95-、CD95+、IL2Rβ+、IL2Rβ-、CCR7+、CCR7-、CDL-、CD62L+及其組合)可以通過本領域已知的陽性或陰性選擇技術進一步分離。在一個實例中，T細胞的亞群是CD45RA+、CD95-、IL-2Rβ-、CCR7+、CD62L+。在一個實例中，T細胞的亞群是CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+。在一個實例中，T細胞的亞群是CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+。在一個實例中，T細胞的亞群是CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-。在一個實例中，T細胞的亞群是CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-。例如，通過陰性選擇富集T細胞群可以通過針對陰性選擇細胞特有的表面標誌物的抗體組合來完成。本文使用的一種方法是通過負磁性免疫粘附或流式細胞術進行的細胞分選和/或選擇，該方法使用針對存在於陰性選擇細胞上的細胞表面標誌物的單克隆抗體混合物。例如，為了通過陰性選擇富集CD4+細胞，單克隆抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。流式細胞術和細胞分選也可以用於分離感興趣的細胞群以用於本公開。

使用本文所述的方法，PBMC可與免疫細胞(例如CAR或TCR)一起直接用於遺傳修飾。在某些實施方式中，在分離PBMC之後，可以進一步分離T淋巴細胞，並且在遺傳修飾和/或擴增之前或之後，可以將細胞毒性和輔助T淋巴細胞分類為天然、記憶和效應T細胞亞群。

在一些實施方式中，通過鑒定與這些類型的CD8+細胞的每一種相關的特徵性細胞表面抗原，將CD8+細胞進一步分類為天然、幹細胞記憶、中樞記憶和效應細胞。在一些實施方式中，中央記憶T細胞的表型標誌物的表達包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，並且對顆粒酶B是陰性的。在一些實施方式中，幹細胞記憶T細胞是CD45RO-、CD62L+、CD8+ T細胞。在一些實施方式中，中央記憶T細胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+ T細胞。在一些實施方式中，效應T細胞對於CD62L、CCR7、CD28和CD127是陰性的，而對於顆粒酶B和穿孔素則是陽性的。

在某些實施方式中，將CD4+ T細胞進一步分類為亞群。例如，通過鑒定具有特徵性細胞表面抗原的細胞群，可以將CD4+ T輔助細胞分類為天然、中央記憶和效應細胞。 iii. 幹細胞衍生的免疫細胞

在一些實施方式中，免疫細胞可以衍生自幹細胞，例如祖細胞、骨髓幹細胞、誘導型多能幹細胞、iPSC、造血幹細胞和間充質幹細胞。iPS細胞和其它類型的幹細胞可以是培養的永生細胞系，或直接從患者分離。分離、開發和/或培養幹細胞的各種方法在本領域中是已知的，並且可以用於實施本發明。

在一些實施方式中，免疫細胞是衍生自重程式設計T細胞的誘導型多能幹細胞(iPSC)。在一些實施方式中，源材料可以是衍生自T細胞或非T細胞的誘導型多能幹細胞(iPSC)。作為選擇，源材料可以是B細胞，或來自外周血單個核細胞分離物、造血祖細胞、造血幹細胞、間充質幹細胞、脂肪幹細胞的任何其它細胞，或任何其它體細胞類型。 ii. 分離細胞的遺傳修飾

免疫細胞，例如T細胞，可以在使用已知方法分離後進行遺傳修飾，或者可以在進行遺傳修飾之前體外啟動和擴增免疫細胞(或在祖細胞的情況下進行分化)。在一些實施方式中，對分離的免疫細胞進行遺傳修飾以減少或消除內源性TCRα和/或CD52的表達。在一些實施方式中，使用基因編輯技術(例如，CRISPR/Cas9、CRISPR/CAS12、鋅指核酸酶(ZFN)、TALEN、MegaTAL、大範圍核酸酶)對細胞進行遺傳修飾以減少或消除內源性蛋白(例如TCRα和/或CD52)的表達。在另一個實施方式中，免疫細胞，例如T細胞，任選地用本文所述的嵌合抗原受體進一步遺傳修飾(例如，用包含一個或多個編碼CAR的核苷酸序列的病毒載體轉導)，然後啟動和/或體外擴增。

啟動和擴增T細胞的方法是本領域已知的，並且描述於例如美國專利號6,905,874；美國專利號6,867,041；美國專利號6,797,514；和PCT WO2012/079000，其內容通過引用整體上併入本文。通常，此類方法包括在具有適當細胞因數(例如IL-2)的培養基中，使PBMC或分離的T細胞與刺激分子和共刺激分子(例如抗CD3和抗CD28抗體)接觸，該分子通常附著於塑膠珠或磁珠或其它表面上。附著在同一珠上的抗CD3和抗CD28抗體充當“替代性”抗原呈遞細胞(APC)。一個實例是Dynabeads®系統，其是用於人類T細胞的生理啟動的CD3/CD28啟動/刺激系統。在其它實施方式中，可以使用諸如美國專利號6,040,177、美國專利號5,827,642和WO2012129514中所述的方法(其內容通過引用整體上併入本文)，用飼養細胞以及合適的抗體和細胞因數啟動和刺激T細胞增殖。

用於製造本公開的構建體和工程化免疫細胞的某些方法描述於PCT申請PCT/US15/14520中，其內容通過引用整體上併入本文。

應當理解，PBMC可以進一步包括其它細胞毒性淋巴細胞，例如NK細胞或NKT細胞。可以將帶有本文公開的嵌合受體的編碼序列的表達載體引入人供體T細胞、NK細胞或NKT細胞的群體。可以使用流式細胞術對帶有表達載體的成功轉導的T細胞進行分選，以分離CD3陽性T細胞，然後除了使用抗CD3抗體和IL-2或IL-2以及本文其它地方所述的本領域已知的其它方法進行細胞啟動外，進一步使其繁殖以增加這些表達CAR的T細胞的數量。使用標準程式對表達CAR的T細胞進行冷凍保存，以用於存儲和/或製備而用於人類受試者。在一個實施方式中，在不存在非人類動物來源的產物例如小牛血清和胎牛血清的情況下進行T細胞的體外轉導、培養和/或擴增。在一個實施方式中，冷凍保存可包括在合適的培養基例如CryoStor® CS10、CryoStor® CS2或CryoStor® CS5 (BioLife Solutions)中冷凍。

為了克隆多核苷酸，可以將載體引入宿主細胞(分離的宿主細胞)中以允許載體自身的複製，從而擴增其中包含的多核苷酸的拷貝。克隆載體可以含有序列成分，通常包括但不限於複製起點、啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列和選擇標誌物。這些元件可以由本領域普通技術人員適當地選擇。例如，可以選擇複製起點以促進載體在宿主細胞中的自主複製。

在某些實施方式中，本公開提供了包含本文提供的載體的分離的宿主細胞。包含載體的宿主細胞可用於表達或克隆包含在載體中的多核苷酸。合適的宿主細胞可包括但不限於原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或更高等的真核細胞，例如哺乳動物細胞，更具體地是人細胞。

可使用本領域已知的任何合適方法將載體引入宿主細胞，包括但不限於DEAE-葡聚糖介導的遞送，磷酸鈣沉澱法，陽離子脂質介導的遞送，脂質體介導的轉染，電穿孔，微粒轟擊，受體介導的基因遞送，由聚賴氨酸、組蛋白、殼聚糖和肽介導的傳遞。用於表達目的載體的病毒轉染和轉化細胞的標準方法是本領域公知的。在又一個實施方式中，可以將不同表達載體的混合物用於遺傳修飾免疫效應細胞的供體群體，其中每種載體編碼本文公開的不同CAR。所得的轉導的免疫效應細胞形成工程化細胞的混合群體，其中一部分工程化細胞表達多於一種的不同CAR。

在一個實施方式中，本公開提供了一種貯存表達靶向DLL3蛋白的CAR的遺傳工程化細胞的方法。在一個實施方式中，這涉及冷凍保存免疫細胞，使得細胞在解凍後保持活力。在一個實施方式中，冷凍保存可包括在合適的培養基例如CryoStor® CS10、CryoStor® CS2或CryoStor® CS5 (BioLife Solutions)中冷凍。可以通過本領域已知的方法將表達CAR的免疫細胞的一部分冷凍保存，從而提供此類細胞的永久來源，以用於將來治療患有惡性腫瘤的患者。需要時，可以將冷凍保存的轉化免疫細胞解凍、生長和擴增，以獲得更多此類細胞。

在一些實施方式中，通過首先從其培養基中收穫細胞，然後洗滌並在適合施用的介質和容器系統(“藥學上可接受的”載體)中以治療有效量濃縮細胞來配製細胞。合適的輸注介質可以是任何等滲介質製劑，通常是生理鹽水、Normosol™ R (Abbott)或Plasma-Lyte™ A (Baxter)，但也可以使用5%葡萄糖水溶液或林格氏乳酸鹽。輸注介質可以補充人血清白蛋白。 iv. 同種異體CAR T細胞

簡言之，用於製造同種異體CAR T療法的方法，或AlloCARs™，涉及從健康供體中收穫健康的、經過選擇、篩選和測試的T細胞。對同種異體T細胞進行基因編輯，以降低移植物抗宿主病(GvHD)的風險並防止同種異體排斥。敲除選定的T細胞受體基因(例如，TCRα、TCRβ)以避免GvHD。還可以敲除CD52基因，以使CAR T產品對抗CD52抗體治療具有抗性。因此，抗CD52抗體治療可用於使宿主免疫系統去除淋巴細胞，並使CAR T細胞保持移植狀態，以實現完全的治療效果。接下來，對T細胞工程化以表達CAR，CAR識別在血液或實體瘤中表達的某些細胞表面蛋白(例如DLL-3)。然後，工程化T細胞經過純化步驟，並最終冷凍保存在小瓶中，以向患者遞送。 v. 自體CAR T細胞

自體嵌合抗原受體(CAR)T細胞療法涉及收集患者自身的細胞(例如，包括T細胞在內的白細胞)，並對T細胞進行遺傳工程化以表達CAR，所述CAR識別在一種或多種特定癌細胞的細胞表面上表達的靶抗原並殺死癌細胞。然後將工程化細胞冷凍保存，隨後施用於從其取出細胞以進行工程化的患者。 IV. 治療方法

本公開包括用於治療或預防患者中與不期望的和/或升高的DLL3水準相關的病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的至少一種本文公開的CAR或包含CAR的免疫細胞。

提供了用於治療包括癌症在內的疾病或病症的方法。在一些實施方式中，本公開涉及在受試者中產生T細胞介導的免疫應答，其包括向受試者施用有效量的本申請的工程化免疫細胞。在一些實施方式中，T細胞介導的免疫反應針對靶細胞或細胞。在一些實施方式中，工程化免疫細胞包含嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施方式中，靶細胞是腫瘤細胞。在一些方面，本公開包括用於治療或預防惡性腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的至少一個本文所述的分離的抗原結合結構域。在一些方面，本公開包括用於治療或預防惡性腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用有效量的至少一種免疫細胞，其中所述免疫細胞包含至少一種本文所述的嵌合抗原受體，和/或分離的抗原結合結構域。本公開的包含CAR的免疫細胞可以用於治療涉及DLL3的異常表達的惡性腫瘤。在一些實施方式中，本公開的含有CAR的免疫細胞可以用於治療惡性腫瘤，例如小細胞肺癌、黑色素瘤、低級別神經膠質瘤、成膠質細胞瘤、甲狀腺髓樣癌、類癌、胰腺中的彌散性神經內分泌腫瘤、膀胱和前列腺癌、睪丸癌和具有神經內分泌特徵的肺腺癌。在示例性實施方式中，含CAR的免疫細胞，例如本公開的抗DLL3 CAR-T細胞，用於治療小細胞肺癌。

還提供了用於減少受試者中腫瘤大小的方法，其包括向受試者施用本公開的工程化細胞到受試者，其中所述細胞包含含有DLL3抗原結合結構域的嵌合抗原受體，並與腫瘤上的DLL3抗原結合。

在一些實施方式中，所述受試者患有實體瘤或血液惡性腫瘤，例如淋巴瘤或白血病。在一些實施方式中，將工程化細胞遞送至腫瘤床，例如在小細胞肺癌中發現的腫瘤床。在一些實施方式中，癌症存在於受試者的骨髓中。在一些實施方式中，工程化細胞是自體免疫細胞，例如自體T細胞。在一些實施方式中，工程化細胞是同種異體免疫細胞，例如同種異體T細胞。在一些實施方式中，工程化細胞是異源免疫細胞，例如異源T細胞。在一些實施方式中，將工程化細胞離體轉染或轉導。如本文所用，術語“體外細胞”是指離體培養的任何細胞。

治療劑例如工程化的CAR T細胞的“治療有效量”、“有效劑量”、“有效量”或“治療有效劑量”是當單獨使用或與另一種治療劑組合使用時的任何量，其保護受試者免於疾病的發作或促進疾病消退，所述疾病消退表現為疾病症狀的嚴重性降低，無症狀時期的頻率和持續時間的增加，或預防由疾病痛苦引起的損害或殘疾。可以使用熟練的從業者(例如，醫師或臨床醫生)已知的多種方法，例如在臨床試驗期間的人類受試者中，在預測人類中功效的動物模型系統中，或在體外分析中通過分析試劑的活性，來評估治療劑促進疾病消退的能力。

術語“患者”和“受試者”可互換使用，並且包括人類和非人動物受試者以及具有正式診斷的疾病的受試者，沒有正式識別的疾病的受試者，得到醫療護理的受試者，有風險發展疾病的受試者，等等。

術語“治療”和“療法”包括治療性治療、預防性治療以及其中可以降低受試者發展疾病或其它風險因素的風險的應用。治療不需要完全治癒疾病，並且涵蓋其中減輕症狀或潛在風險因素的實施方式。術語“預防”並不要求100%消除事件的可能性。相反，它表示在化合物或方法的存在下事件發生的可能性已經降低。

組合物中所需的細胞治療總量包括至少2個細胞(例如，至少一個CD8+ T細胞和至少一個CD4+ T細胞，或兩個CD8+ T細胞，或兩個CD4+ T細胞)，或者更通常大於10² 個細胞，至多10⁶ 個，至多且包括10⁸ 或10⁹ 個細胞，可以是10¹⁰ 或10¹² 個以上細胞。細胞的數量將取決於該組合物預期的用途以及其中所包含的細胞的類型。所需細胞的密度通常大於10⁶ 細胞/ ml，通常大於10⁷ 細胞/ml，通常為10⁸ 細胞/ ml以上。臨床相關數量的免疫細胞可以分配為多次輸注，這些輸注累計等於或超過10⁵ 、10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹ 、10¹⁰ 、10¹¹ 或10¹² 細胞。在本公開的一些方面，特別是由於所有輸注的細胞將被重定向至特定的靶抗原(例如DLL3)，因此可以施用在10⁶ /千克範圍內的更少數量的細胞(每位患者10⁶ -10¹¹ )。可以在這些範圍內的劑量多次施用CAR治療。對於正在接受治療的患者而言細胞可以是自體的、同種異體的或異源的。

在一些實施方式中，CAR T細胞的治療有效量為約1×10⁵ 細胞/kg、約2×10⁵ 細胞/kg、約3×10⁵ 細胞/kg、約4×10⁵ 細胞/kg、約5×10⁵ 細胞/kg、約6×10⁵ 細胞/kg、約7×10⁵ 細胞/kg、約8×10⁵ 細胞/kg、約9×10⁵ 細胞/kg、2×10⁶ 細胞/kg、約3×10⁶ 細胞/kg、約4×10⁶ 細胞/kg、約5×10⁶ 細胞/kg、約6×10⁶ 細胞/kg、約7×10⁶ 細胞/kg、約8×10⁶ 細胞/kg、約9×10⁶ 細胞/kg、約1×10⁷ 細胞/kg、約2×10⁷ 細胞/kg、約3×10⁷ 細胞/kg、約4×10⁷ 細胞/kg、約5×10⁷ 細胞/kg、約6×10⁷ 細胞/kg、約7×10⁷ 細胞/kg、約8×10⁷ 細胞/kg，或約9×10⁷ 細胞/kg。

在一些實施方式中，CAR+/CAR-T+細胞的靶劑量為約1×10⁶ 至約1×10¹⁰ 細胞/kg，例如約1×10⁶ 細胞/kg，約1×10⁷ 細胞/kg，約1×10⁸ 細胞/kg，約1×10⁹ 細胞/kg或約1×10¹⁰ 細胞/kg。應當理解，高於和低於該範圍的劑量對於某些受試者可能是適當的，並且可以由醫療提供者根據需要確定適當的劑量水準。另外，根據本公開可以提供多劑量的細胞。

在一些方面，本公開包括藥物組合物，其包含至少一個本文所述的抗原結合結構域和藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，藥物組合物還包含另外的活性劑。

本公開的表達CAR的細胞群可以單獨施用，或與稀釋劑和/或與其它成分例如IL-2或其它細胞因數或細胞群一起組合作為藥物組合物施用。本公開的藥物組合物可以包含與一種或多種藥學或生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合的表達CAR的細胞群，例如本文所述的T細胞。此類的組合物可以包含緩衝劑，例如中性緩衝鹽水，磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；和防腐劑。本公開的組合物優選配製用於靜脈內施用。

藥物組合物(溶液、懸浮液等)可以包括以下中的一種或多種：無菌稀釋劑，例如注射用水，鹽水溶液，優選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉，固定油，例如可以用作溶劑或懸浮介質的合成甘油單酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它溶劑；抗菌劑，例如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節張力的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外製劑可以封入由玻璃或塑膠製成的安瓿瓶、一次性注射器或多劑量小瓶中。對於治療應用，可注射藥物組合物優選是無菌的。

在一些實施方式中，在施用於患者時，在其細胞表面表達本文描述任一種DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞可以減少、殺死或裂解患者的內源性的DLL3表達細胞。在一個實施方式中，表達本文所述的任一種DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞，將表達DLL3的內源性細胞或表達DLL3的細胞系的細胞減少或裂解的百分比為至少約或大於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一個實施方式中，表達本文所述的任一種DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞，將表達DLL3的內源性細胞或表達DLL3的細胞系的細胞減少或裂解的百分比為約5%至約95%，約10%至約95%，約10%至約90%，約10%至約80%，約10%至約70%，約10%至約60%，約10%至約50%，約10%至約40%，約20%至約90%，約20%至約80%，約20%至約70%，約20%至約60%，約20%至約50%，約25%至約75%或約25%至約60%。在一個實施方式中，內源性的DLL3表達細胞是內源性的DLL3表達骨髓細胞。

在一個實施方式中，可以使用本文公開的測定法測量通過在其細胞表面膜上表達本公開的DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞對靶細胞(例如表達DLL3的細胞)的減少或裂解的百分比。

該方法可以進一步包括在施用本文提供的工程化細胞之前，向患者施用一種或多種化療劑。在某些實施方式中，化療劑是淋巴細胞清除(預處理)化療劑。例如，調理需要T細胞療法的患者的方法包括向該患者施用指定的有益劑量的環磷醯胺(200 mg/m² /天至2000 mg/m² /天，約100 mg/m² /天至約2000 mg/m² /天；例如約100 mg/m² /天，約200 mg/m² /天，約300 mg/m² /天，約400 mg/m² /天，約500 mg/m² /天，約600 mg/m² /天，約700 mg/m² /天，約800 mg/m² /天，約900 mg/m² /天，約1000 mg/m² /天，約1500 mg/m² /天或約2000 mg/m² /天)和指定劑量的氟達拉濱(20 mg/m² /天至900 mg/m² /天，約10 mg/m² /天至約900 mg/m² /天；例如約10 mg/m² /天，約20 mg/m² /天，約30 mg/m² /天，約40 mg/m² /天，約40 mg/m² /天，約50 mg/m² /天，約60 mg/m² /天，約70 mg/m² /天，約80 mg/m² /天，約90 mg/m² /天，約100 mg/m² /天，約500 mg/m² /天或約900 mg/m² /天)。示例性的給藥方案涉及治療患者，包括在向患者施用治療有效量的工程化T細胞之前，與每天向患者與施用約30 mg/m² /天氟達拉濱組合、在其之前或之後，施用約300 mg/m² /天的環磷醯胺3天。

在一些實施方式中，特別是在已經對本文提供的工程化細胞進行基因編輯以消除或最小化CD52的表面表達的情況下，淋巴細胞清除進一步包括施用抗CD52抗體，例如阿侖單抗。在一些實施方式中，以約1-20 mg/天 IV的劑量，例如約13mg /天IV的劑量施用1、2、3或更多天。抗體可以與淋巴細胞清除方案的其它要素(例如，環磷醯胺和/或氟達拉濱)組合、在其之前或之後施用。

在其它實施方式中，以治療受試者的疾病或病狀的有效量分別施用抗原結合結構域、轉導的(或以其它方式工程化的)細胞和化療劑。

在某些實施方式中，可以將本文公開的包含表達CAR的免疫效應細胞的組合物與任何數量的化療劑聯合施用。化療劑的實例包括烷化劑類(alkylating agents)，如塞替派(thiotepa)和環磷醯胺(cyclophosphamide) (CYTOXAN™)；磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，如苯並多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)和烏多巴(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥類(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C (cactinomycin)、加利車黴素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D (dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶醯三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素類，如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺類，如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布賽(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥氨酸(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呱達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環磷醯胺；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)( TAXOL™,Bristol-Myers Squibb)和多西他塞(doxetaxel)( TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春堿(vinblastine)；鉑；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑R FS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維A酸(retinoic acid)衍生物，如Targretin™ (貝沙羅汀(bexarotene))、Panretin™、(阿利維A酸(alitretinoin))；ONTAK™ (地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；和上述任何物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括抗激素藥，其作用是調節或抑制對腫瘤的激素作用，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。在適當的情況下也施用化療劑的組合，包括但不限於CHOP，即環磷醯胺(Cytoxan®)、多柔比星(羥基多柔比星)、長春新堿(Oncovin®)和潑尼松。

在一些實施方式中，在施用工程化細胞、多肽或核酸同時或之後一周內施用化療劑。在其他實施方式中，在施用工程化細胞、多肽或核酸後約1-7天，約1至約4周或約1周至約1個月，約1周至約2個月，約1周至約3個月，約1周至約6個月，約1周至約9個月，或約1周至約12個月施用化療劑。在一些實施方式中，在施用細胞、多肽或核酸之前至少1個月施用化療劑。在一些實施方式中，該方法進一步包括施用兩種或更多種化療劑。

多種另外的治療劑可以與本文所述的組合物聯合使用。例如，潛在有用的另外的治療劑包括PD-1抑制劑，例如納武單抗(nivolumab) (Opdivo®)、派姆單抗(pembrolizumab) (Keytruda®)、派姆單抗、匹地利珠單抗(pidilizumab)和阿特珠單抗(atezolizumab)。

適合於與本公開組合使用的另外的治療劑包括但不限於：伊布替尼(ibrutinib) (Imbruvica®)、奧法木單抗(ofatumumab) (Arzerra®)、利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®)、貝伐單抗(bevacizumab) (Avastin®)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (Herceptin®)、恩星曲妥珠單抗(trastuzumab emtansine) (KADCYLA®)、伊馬替尼(imatinib) (Gleevec®)、西妥昔單抗(cetuximab) (Erbitux®)、帕尼單抗(panitumumab) (Vectibix®)、卡妥索單抗(catumaxomab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、奧法木單抗、托西莫單抗(tositumomab)、本妥昔單抗(brentuximab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、馬賽替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、來他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司馬沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替瓦沙尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊馬替尼、達沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕納替尼(ponatinib)、雷多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、來他替尼、盧梭替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、必尼美替尼(binimetinib)、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿迪波太(adipotide)、地尼白介素(denileukin diftitox)、mTOR抑制劑如依維莫司(Everolimus)和西羅莫司(Temsirolimus)、刺蝟(hedgehog)抑制劑如索尼得吉(sonidegib)和維莫得告(vismodegib)、CDK抑制劑如CDK抑制劑(帕博西尼(palbociclib))。

在一些實施方式中，可以將包含含CAR的免疫細胞的組合物與治療方案一起施用，以預防或減少細胞因數釋放綜合征(CRS)或神經毒性。預防細胞因數釋放綜合征(CRS)或神經毒性的治療方案可以包括：侖茲魯單抗(lenzilumab)、托西珠單抗(tocilizumab)、心房利鈉肽(ANP)、阿那白滯素(anakinra)、iNOS抑制劑(例如L-NIL或1400W)。在另外的實施方式中，可以將包含含CAR的免疫細胞的組合物與抗炎劑一起施用。抗炎藥或藥物包括但不限於：類固醇和糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲潑尼龍(methylprednisolone)、潑尼松龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)和曲安西龍(triamcinolone))、非類固醇類消炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥物、環磷醯胺和麥考酚酯(mycophenolate)。示例性的NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑和唾液酸化物(sialylate)。示例性鎮痛劑包括乙醯氨基酚(acetaminophen)、羥考酮(oxycodone)和鹽酸丙氧芬的曲馬多(tramadol of proporxyphene hydrochloride)。示例性糖皮質激素包括可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍或潑尼松。示例性生物反應調節劑包括針對細胞表面標誌物(例如CD4、CD5等)的分子、細胞因數抑制劑如TNF拮抗劑，(例如依那西普(etanercept)(ENBREL®)、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)和英夫利昔單抗(infliximab) (REMICADE®)、趨化因數抑制劑和粘附分子抑制劑。生物反應調節劑包括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性的DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、環磷醯胺、環孢菌素、甲氨蝶呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥氯喹、Gold(口服(金諾芬(auranofin))和肌內)和米諾環素(minocycline)。

在某些實施方式中，本文所述的組合物與細胞因數聯合施用。細胞因數的實例是淋巴因數、單核因數和傳統的多肽激素。細胞因數中包括生長激素，如人生長激素，N-甲硫氨醯人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH)；肝生長因數(HGF)；成纖維細胞生長因數(FGF)；催乳素；胎盤催乳激素；繆勒管抑制物質(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；啟動素；血管內皮生長因數；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因數(NGF)如NGF-β；血小板生長因數；轉化生長因數(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因數-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因數；干擾素如干擾素-α、β和-γ；集落刺激因數(CSF)，如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-21，腫瘤壞死因數如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因數，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所用，術語細胞因數包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質，以及天然序列細胞因數的生物活性等同物。 V. 分選和消耗的方法

在一些實施方式中，提供了用於體外分選免疫細胞群的方法，其中所述免疫細胞群的子集包含工程化免疫細胞，其表達包含對單克隆抗體具有特異性的表位(例如示例性的模擬表位序列)的DLL3特異性CAR中的任一種。該方法包括使免疫細胞群與對表位具有特異性的單克隆抗體接觸，並選擇與單克隆抗體結合的免疫細胞，以獲得富含表達DLL3特異性CAR的工程化免疫細胞的細胞群。

在一些實施方式中，對所述表位具有特異性的所述單克隆抗體任選地綴合至螢光團。在該實施方式中，選擇與單克隆抗體結合的細胞的步驟可以通過螢光啟動細胞分選(FACS)來完成。

在一些實施方式中，對所述表位具有特異性的所述單克隆抗體任選地綴合至磁性顆粒。在該實施方式中，選擇與單克隆抗體結合的細胞的步驟可以通過磁啟動細胞分選(MACS)來完成。

在一些實施方式中，用於分選表達CAR的免疫細胞的方法中使用的mAb選自：阿侖單抗、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、莫洛單抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫單抗(tositumomab)、阿昔單抗(abciximab)、巴厘昔單抗(basiliximab)、本妥昔單抗(brentuximab vedotin)、西妥昔單抗、英夫利西單抗(infliximab)、利妥昔單抗、貝伐單抗(bevacizumab)、賽托珠單抗(certolizumab pegol)、達克珠單抗(daclizumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、依法珠單抗(efalizumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗、雷尼珠單抗(ranibizumab)、托西珠單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝利木單抗(belimumab)、卡那單抗(canakinumab)、地諾單抗(denosumab)、戈利木單抗(golimumab)、伊匹木單抗(ipilimumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、帕尼單抗(panitumumab)、QBEND-10和/或烏司奴單抗(ustekinumab)。在一些實施方式中，所述mAb是利妥昔單抗。在另一實施方式中，所述mAb是QBEND-10。

在一些實施方式中，在使用上述體外分選表達CAR的免疫細胞的方法時獲得的表達CAR的免疫細胞的群體，包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%的表達CAR的免疫細胞。在一些實施方式中，在使用用於體外分選表達CAR的免疫細胞的方法時獲得的表達CAR的免疫細胞的群體，包含至少85%的表達CAR的免疫細胞。

在一些實施方式中，在使用上述體外分選表達CAR的免疫細胞的方法時獲得的表達CAR的免疫細胞的群體，與初始(未分選的)細胞群相比顯示出增加的體外細胞毒性活性。在一些實施方式中，所述體外細胞毒性活性增加了10%、20%、30%或50%。在一些實施方式中，免疫細胞是T細胞。

在一些實施方式中，mAb預先結合在支持物或表面上。固體支援物的非限制性實例可包括珠、瓊脂糖珠、塑膠珠、磁珠、塑膠孔板、玻璃孔板、陶瓷孔板、柱或細胞培養袋。

待施用至接受者的表達CAR的免疫細胞可以從來源群體中體外富集。擴大來源群體的方法可包括使用密度離心、免疫磁珠純化、親和色譜和螢光啟動細胞分選的組合，選擇表達抗原(例如CD34抗原)的細胞。

流式細胞術可用於定量細胞群內的特定細胞類型。通常，流式細胞術是主要通過光學手段定量細胞成分或結構特徵的方法。由於可以通過定量結構特徵來區分不同的細胞類型，因此流式細胞術和細胞分選可用於對混合物中不同表型的細胞進行計數和分選。

流式細胞術分析涉及兩個主要步驟：1)用一種或多種標記的標誌物標記選擇的細胞類型，以及T)相對於群體中的細胞總數確定標記的細胞數。在一些實施方式中，標記細胞類型的方法包括使標記的抗體與由特定細胞類型表達的標記物結合。抗體可以直接用螢光化合物標記，或可以使用例如識別第一抗體的螢光標記第二抗體間接標記。

在一些實施方式中，用於分選表達CAR的T細胞的方法是磁啟動細胞分選(MACS)。磁啟動細胞分選(MACS)是一種通過使用超順磁性納米顆粒和柱根據細胞群體的表面抗原(CD分子)分離各種細胞群體的方法。MACS可用於獲得純細胞群。單細胞懸液中的細胞可以用微珠進行磁性標記。樣品被施加到由鐵磁性球體組成的柱上，其覆蓋有對細胞友好的塗層，允許快速、溫和地分離細胞。未標記的細胞通過，而磁性標記的細胞保留在柱內。可以將流通物收集為未標記的細胞級分。洗滌步驟後，將柱從分離器中移出，並將磁性標記的細胞從柱中洗脫。

純化特定細胞群例如T細胞的詳細方案可見於Basu S等。(2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546)。

在一些方面，本公開提供了一種通過體內消耗來消耗DLL3特異性CAR表達免疫細胞的方法。體內消耗可包括向哺乳動物生物體施加治療(例如，結合CAR上的表位的分子)，旨在通過抑制或消除來停止表達CAR的免疫細胞的增殖。

本發明的一個方面涉及一種體內消耗表達包含mAb特異性表位的DLL3 CAR的工程化免疫細胞的方法，該方法包括使所述工程化免疫細胞或所述表達CAR的免疫細胞與至少一個表位特異性mAb接觸。本發明的另一方面涉及通過使所述工程化免疫細胞與表位特異性抗體接觸而體內消耗表達CAR的免疫細胞的方法，所述表達CAR的免疫細胞包含嵌合scFv(例如，通過插入mAb特異性表位而形成)。在一些實施方式中，免疫細胞是T細胞和/或抗體是單克隆的。

根據一個實施方式，免疫工程化細胞的體內消耗是在先前已經使用本發明的體外方法分選過的工程化免疫細胞上進行的。在這種情況下，可以使用相同的輸注mAb。在一些實施方式中，mAb特異性抗原是CD20抗原，而表位特異性mAb是利妥昔單抗。在一些實施方式中，本發明涉及一種在患者中體內消耗表達包含mAb特異性表位元的CAR的工程化免疫細胞(表達CAR的免疫細胞)的方法，該方法包括使所述表達CAR的免疫細胞與至少一個表位特異性mAb接觸。

在一些實施方式中，使所述工程化免疫細胞或所述表達CAR的免疫細胞與至少一種表位特異性mAb接觸的步驟包括向患者輸注表位特異性mAb(例如利妥昔單抗)。在一些實施方式中，向患者施用的表位特異性mAb的量足以消除患者中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的表達CAR的免疫細胞。

在一些實施方式中，使所述工程化免疫細胞或所述表達CAR的免疫細胞與至少一種表位特異性mAb接觸的步驟包括向患者輸注約375 mg/m² 的利妥昔單抗一次或多次。在一些實施方式中，mAb(例如利妥昔單抗)每週施用一次。

在一些實施方式中，當使用表位特異性mAb在補體依賴性細胞毒性(CDC)測定中消耗表達包含mAb特異性表位的CAR的免疫細胞(表達CAR的免疫細胞)時，有活力的表達CAR的免疫細胞的量減少。在一些實施方式中，有活力的表達CAR的免疫細胞的量減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施方式中，所述mAb特異性表位是CD20表位或模擬表位和/或所述表位特異性mAb是利妥昔單抗。

在某些實施方式中，通過輸注雙特異性抗體來進行CAR工程化免疫細胞的體內消耗。根據定義，雙特異性單克隆抗體(BsAb)是一種人工蛋白質，其由兩種不同的單克隆抗體的片段組成，因此與兩種不同類型的抗原結合。這些BsAb及其在免疫治療中的用途已在Muller D and Kontermann R. E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98中進行了綜述。

根據另一特定的實施方式，輸注的雙特異性mAb能夠結合表達嵌合scFv的工程化免疫細胞上帶有的mAb特異性表位，並結合效應細胞和細胞毒性細胞(例如免疫細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、天然殺手細胞(NK細胞)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL))上的表面抗原。這樣，由BsAb觸發的工程化免疫細胞的消耗可以通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)發生。(Deo Y M, Sundarapandiyan K, Keler T, Wallace PK, and Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961])。

在一些實施方式中，將細胞毒性藥物與表位特異性mAb偶聯，其可用於消耗表達CAR的免疫細胞。通過將單克隆抗體的靶向能力與細胞毒性藥物的抗癌能力相結合，與單獨使用藥物相比，抗體-藥物綴合物(ADC)允許敏感地區分健康組織和患病組織。多個ADC獲得了市場批准；製備它們的技術，特別是關於接頭的技術描述於(Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail等 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172；美國專利號4,975,278)。

在一些實施方式中，待輸注的表位特異性mAb預先與能夠促進補體依賴性細胞毒性(CDC)的分子綴合。因此，補體系統有助於或補充抗體從生物體清除病原體的能力。當被刺激時，啟動級聯被觸發為應答的大量放大和殺手細胞的膜攻擊複合體的啟動。可以使用不同的分子來綴合mAb，例如聚糖(Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012)，治療性抗體片段的補體依賴性細胞毒性活性可通過免疫原性聚糖偶聯獲得，Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5)。 VI. 試劑盒和製品

本申請提供了包含本文所述的任一種含有CAR的DLL3或含有DLL3 CAR的免疫細胞的試劑盒，以及其藥物組合物。在試劑盒的一個實施方式中，將工程化CAR細胞冷凍在合適的培養基例如CryoStor® CS10、CryoStor® CS2或CryoStor® CS5 (BioLife Solutions)中。

在一些示例性實施方式中，本公開的試劑盒包含含有同種異體DLL3 CAR的T細胞和用於向受試者施用淋巴細胞清除方案和CAR-T方案的CD52抗體。

本申請還提供包含本文所述的任一種治療組合物或試劑盒的製品。製品的實例包括小瓶(例如，密封小瓶)。 實施例 實施例1：DLL3靶向抗體的產生和測試

根據本發明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler和Milstein，Nature 256:495，1975描述的雜交瘤方法來製備，或者可以通過例如美國專利號4,816,567中描述重組DNA方法來製備。首先在Flag-DLL3(脂肪原)ELISA中篩選抗DLL3抗體，然後在FACS中篩選以確定與具有或不具有人DLL3表達的HEK-293T細胞的結合。

為了測試DLL3特異性抗體是否可以識別表達內源性DLL3的細胞，將DMS 273(Sigma，目錄號95062830)、DMS 454(Sigma，目錄號95062832)和SHP-77 (ATCC，目錄號CRL-2195)細胞用在補充有1%BSA的PBS中的2ug/ml純化DLL3抗體染色，該DLL3抗體具有小鼠IgG2A主鏈(mIgG2a)或對照mIgG2a抗體。用PE標記的抗小鼠IgG抗體(Biolegend，目錄號405307)檢測到結合的DLL3抗體。通過流式細胞儀分術樣品。圖1中包括顯示DLL3抗體與DMS 273、DMS 454和SHP-77細胞結合的代表性圖像。 實施例2：抗DLL3抗體針對DLL3的動力學和親和力的測定

該實施例確定了在37℃下作為人、食蟹猴(cyno)和小鼠DLL3的全長單克隆抗體(IgG)和scFv的各種抗DLL3抗體的結合動力學和親和力。對於scFv，分別克隆源自其各自雜交瘤的抗DLL3抗體的可變區，其側接(GGGGS)₃ (SEQ ID NO: 472)或(GGGGS)₄ (SEQ ID NO: 478)，然後是來自修飾的人IgG2序列的鉸鏈和Fc，產生scFv-Fc融合體，其使用Expi293表達。將人、獼猴和小鼠DLL3的胞外結構域(ECD)與C端8×His表位標籤(SEQ ID NO：473)和Avi標籤融合，使用Expi293表達，然後通過固定金屬親和層析(IMAC)繼之以尺寸排阻色譜(SEC)進行純化。

通過表面等離振子共振(BiacoreTM表面等離振子共振(SPR)系統，GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburg PA)測定抗體結合動力學。在HBS-T +運行緩衝液(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% v/v Tween20, 1 mg/mL BSA)中稀釋的抗體被捕獲在固定有對DLL3抗體恆定結構域具有特異性的抗體的CM4晶片上。將純化的DLL3連續稀釋到HBS-T +中，以30 uL/min的速度注射2分鐘，解離時間為10分鐘，然後在注射之間用10 mM甘氨酸-HCl (pH 1.7)或磷酸使表面再生。通過使用BIAevaluation程式將資料全域擬合為1：1 Langmuir結合模型，可以同時獲得動力學結合速率(kon)和解離速率(koff) (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)。平衡解離常數(K_d )值計算為k_off /k_on 。

表8中顯示所測試的抗DLL3抗體的動力學和親和力參數。具體地，表8顯示抗DLL3抗體(作為IgG或scFv-Fc融合體)對人、食蟹猴和小鼠DLL3的親和力。最後一列顯示每種抗DLL3抗體識別的人DLL3的胞外結構域。

實施例3：表達全長和截短的DLL3的CHO細胞的生成

使用一組表達全長和各種截短的人DLL3的CHO細胞來確定每個DLL3靶向抗體識別的結構域。人DLL3的胞外結構域可以細分為不同的亞結構域，其由以下氨基酸位置定義：信號肽：1-26；N-末端(N-ter)：27-175；DSL：176-215；EGF1：215-249；EGF2:274-310；EGF3：312-351；EGF4:353-389；EGF5：391-427；和EGF6：429-465。

為了產生用於表位作圖的截短的DLL3蛋白，從N末端開始從抗原逐個刪除人DLL3的相應8個胞外結構域(信號肽加N末端，DSL、EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5和EGF6)的序列。表6顯示產生的截短的DLL3蛋白(也參見圖2A-2D)。

為了建立表達具有N末端HA標籤的全長和截短的人DLL3的CHO細胞，全長人DLL3的編碼序列(SEQ ID NO: 556; GeneBank記錄NM_016941)和7個帶有HA標籤的截短的人DLL3 (SEQ ID NO：557至563)被克隆到pLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3G載體(Clontech)中。通過將293T細胞與pLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3G載體以及psPAX2和pMD2G載體共轉染，生成編碼全長或截短的人DLL3的慢病毒。轉染兩天后，收集含有病毒顆粒的上清液，並與5ug/ml的聚凝胺一起轉導CHO細胞。

使用PE綴合的抗HA抗體(Biolegend，目錄號901518)在FACS測定中驗證全長和截短的DLL3的表達。作為陰性對照，將細胞與同型匹配和PE標記的抗體(Biolegend，目錄號400111)代替抗HA抗體進行溫育。圖2A的底部圖顯示全長和截短的DLL3在CHO細胞上的表達。 實施例4：DLL3靶向抗體的表位作圖

將表達全長和截短的DLL3的CHO細胞用雜交瘤上清液或純化的DLL3抗體在PBS+1%BSA中染色。用PE標記的抗小鼠IgG抗體(Biolegend，目錄號405307)檢測到結合的DLL3抗體。通過流式細胞術分析樣品。使用實施例2中所述的表達全長或截短的DLL3的CHO組確定每個集落的結合結構域。流式細胞術分析表明，例如，如果集落結合所有包括EGF3的截短的蛋白，但不結合任何不具有EGF3的截短的蛋白，則此類集落識別EGF3。如圖2D所示的代表性圖像所表示的，抗DLL3抗體分別識別DSL、EGF1和EGF3結構域。來自PE通道的信號顯示在x軸上，計數顯示在y軸上。 實施例5：DLL3特異性CAR-T細胞的產生

該實施例描述了抗DLL3嵌合抗原受體(CAR)的構建。

將表1a中列出的抗DLL3抗體重新格式化為CAR。使用這些抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列(表1b和表1c)來設計具有以下一般結構的單鏈可變片段(scFv)(表1d)：重鏈可變區--接頭--輕鏈可變區。接頭具有以下氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 478)。

編碼嵌合抗原受體的蛋白序列經設計為從5’至3’含有以下元件(圖3A，表7)：CD8α信號序列(SEQ ID NO：477)，抗DLL3 scFv，人CD8α分子的鉸鏈和跨膜區(SEQ ID NO：479)，41BB分子的胞質部分(SEQ ID NO：291)和CD3ζ分子的胞質部分(SEQ ID NO：292)。

CAR結構的示意圖在圖3A中給出。從抗DLL3克隆重新格式化的代表性CAR序列包含在SEQ ID NO 482至533中。合成密碼子優化的DLL3 CAR序列，並使用XmaI (5’)和MluI (3’)限制位點將其亞克隆到以下慢病毒載體pLVX-EF1a -DLL3 CAR (Clontech)中。

為了產生DLL3 CAR-T細胞，首先使用Ficoll梯度密度培養基(Ficoll Paque PLUS / GE Healthcare Life Sciences)從血沉棕黃層樣品中純化PBMC。使用市售的T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec, Cat# 130-096-535)從PBMC中純化T細胞。作為選擇，可以從LeukoPak (StemCell Technologies)直接純化原代人T細胞。

為了製造編碼DLL3 CAR的慢病毒，在第0天將HEK-293T細胞以每毫升40萬細胞接種於6孔板的每孔補充有10%FBS (Hyclone or JR Scientific)的2mL DMEM (Gibco)中。在第1天，在6孔板(“DNA mix”)的每個孔中，將慢病毒包裝載體1.5ug psPAX2、0.5ug pMD2G和0.5ug的適當轉移CAR載體混合在250uL Opti-MEM(Gibco)中，從而製備慢病毒。將在250μL Opti-MEM中的10μL Lipofectamine2000 (Invitrogen)在室溫下溫育5分鐘，然後加入到DNA混合物中。將混合物在室溫下溫育20分鐘，將500μL的總體積緩慢加入含有HEK-293T的孔的側面。在補充了100IU/mL人IL-2 (Miltenyi Biotec)、10% FBS (Hyclone)和人T Transact (Miltenyi Biotec，目錄號130-111-160，1:100稀釋度)的X-Vivo-15培養基(Lonza)中啟動純化的T細胞。在第2天，將6孔板每孔的培養基用每孔2mL的T細胞轉導培養基，即補充10% FBS的X-Vivo-15替換。在第3天，將T細胞以50萬細胞/mL重懸於Grex-24平板(Wilson Wolf，目錄號80192M)的每孔1 mL T細胞轉導培養基中。收穫來自HEK293T細胞的慢病毒上清液，並使其通過0.45微米篩檢程式(EMD Millipore)以去除細胞碎片，然後與100IU/mL人IL-2一起添加至T細胞。在第5天，將4.5mL的T細胞擴增培養基，即補充有5%人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15，添加到Grex-24板的每個孔中。在第9天和第13天，通過使用流式細胞術檢測識別重組DLL3(脂肪形成素)的T細胞的百分比來確定轉導效率。根據需要，使用T細胞擴增培養基將細胞擴增到更大的燒瓶或G-Rex容器(Wilson Wolf)中。在第14天，將DLL3 CAR-T細胞冷凍保存。在即將冷凍保存前，將用重組DLL3染色的細胞的百分比在集落上歸一化。

為了確定成功地轉導有DLL3 CAR的T細胞的百分比，首先將T細胞與在PBS+1%BSA中的1ug/ml帶有Flag標籤的重組DLL3(Adipogen)一起在4℃下溫育20分鐘。然後用PBS+1%BSA洗滌細胞，用PE標記的抗-Flag抗體(Biolegend，目錄號637310)染色，並使用流式細胞儀進行分析。

DLL3 CAR-T細胞的實例在圖3B中示出。圖3B顯示了實驗資料，表明抗DLL3 CAR在原代T細胞的表面上表達並且可以識別重組DLL3。該圖在活CD3 +細胞上門控。圖上的數字是表達每種抗DLL3 CAR的細胞的百分比。 實施例6：體外表徵

該實施例描述了用於確定CAR對DLL3的特異性和體外活性的實驗。

SHP-77、WM266.4、DMS 454和DMS 273是購自ATCC或Sigma的DLL3+細胞系。HEK-293T是DLL3陰性細胞系。為了在HEK-293T中表達人DLL3，使用編碼全長人DLL3的慢病毒來轉導HEK-293T細胞。

為了測試DLL3特異性殺死，然後將具有或不具有人DLL3表達的表達螢火蟲螢光素酶的HEK-293T細胞以每孔5,000個細胞的接種密度接種在96孔測定板(Costar)中。將DLL3 CAR-T細胞解凍，並在T細胞擴增培養基(即，補充了5%人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15)中，以1:9至9:1的效應子：靶標(E：T)比率添加至具有或不具有人DLL3表達的鋪板HEK-293T細胞。72小時後，使用one-glo測定試劑盒(Promega)測量細胞活力。代表性的DLL3 CAR-T細胞證明了對HEK-293T-DLL3細胞的有效殺死，但在HEK-293T親本細胞中未顯示可檢測的活性(圖4A)。

為了測試DLL3 CAR-T細胞對表達內源性DLL3的細胞系的細胞毒性活性，在T細胞擴增培養基(即補充有5%人AB血清的X-Vivo-15 (Gemini Bio))中將DLL3 CAR-T細胞與螢火蟲螢光素酶標記的DLL3 + SHP-77、WM266.4、DMS 454或DMS 273細胞以1:9至9:1的效應子：靶標(E：T)比率一起溫育。72小時後，使用one-glo測定試劑盒(Promega)測量細胞活力。每種條件進行3次重複測定。繪製出活細胞的平均百分比和標準差(圖4B和圖4C)。

圖4A顯示了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶標比率在3天細胞毒素測定中特異性殺死表達人DLL3的HEK-293T細胞而不是親本HEK-293T細胞。不表達抗DLL3 CAR的T細胞(標記為空載體)用作陰性對照。

圖4B顯示實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶標比率在3天細胞毒素測定中殺死表達內源性DLL3的SHP-77和WM266.4細胞。

圖4C顯示了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶標比率在3天細胞毒性測定中特異性殺死了表達內源性DLL3的DMS 454和DMS 273小細胞肺癌細胞。對於圖4C中的所有曲線圖，使用One-glo測定系統來評估靶細胞活力，n=3。

為了測量從DLL3 CAR-T細胞分泌的細胞因數，在T細胞擴增培養基(即補充有5%人AB血清的X-Vivo-15 (Gemini Bio))中將DLL3 CAR-T細胞與DLL3+ SHP-77細胞以1:9至9:1的效應子：靶標(E：T)比率一起溫育。24小時後，收集組織培養上清液，並使用人類促炎組織培養液9-plex assay (MSD)按照製造商的方案，測定上清液中3種細胞因數[干擾素γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因數α(TNF-α)和IL-2]的水準。圖5顯示在與表達DLL3的SHP-77細胞系共溫育後，抗DLL3 CAR-T細胞釋放細胞因數。CAR-T細胞和SHP-77細胞以1：1或1：9的效應子：靶比率溫育24小時，n=3。 實施例7：系列殺死測定

系列殺死測定涉及將CAR-T細胞重複暴露於其靶標，引起CAR-T細胞經歷增殖，並且在某些情況下，經歷分化和衰竭。在暴露於靶細胞數輪後，該測定法用於選擇具有高靶細胞裂解和增殖能力的最佳集落。

測定的第一天，在具有5%人血清的100ul X-Vivo-15培養基中將已知表達DLL3的5,000個螢火蟲螢光素酶標記的WM266.4、DMS 454或DMS 273細胞接種到96孔板中，該板具有白色的壁和平坦的透明底部。將靶細胞附著到板的底部後，將DLL3 CAR-T細胞解凍，並以1:1的效應子：靶標(E：T)比率添加至具有5%人血清的X-VIVO培養基中鋪板的靶細胞。此後每兩天，將100 µl含有DLL3 CAR-T細胞的培養基轉移到新鋪板的靶細胞中，並使用one-glo分析系統或CellTiter-glo系統(Promega)確定先前鋪板的靶細胞的裂解百分比。每種條件進行3到6次重複測定。繪製平均裂解百分比和標準差(圖6A-6C)。最佳集落是在第12天的整個分析過程中靶細胞裂解最高的集落。這些資料顯示了系列殺死試驗的實驗資料，從而顯示在將抗DLL3 CAR-T細胞反復暴露於DLL3 + WM266.4細胞後，一些集落保持活性。在每個指示的時間點使用One-glo測定系統或CellTiter-glo來評估靶細胞活力，n=3-6。 實施例8：體內活性

為了測試DLL3 CAR-T細胞的抗腫瘤活性，使用帶有SHP-77腫瘤的NSG小鼠。從冷凍原液小瓶中獲得SHP-77細胞，解凍並根據標準程式計數。在完全生長培養基(RPMI+10%FBS)中將細胞稀釋至50x10⁶ 個活細胞/mL。將細胞懸浮液保持在冰上直至植入。在即將植入之前，將細胞與BD Matrigel Matrix (目錄號354234)1：1混合，並且每只小鼠皮下注射200 µL包含5x10⁶ SHP-77細胞的細胞/基質膠懸浮液。從植入後第5天開始，使用數位卡尺通過卡尺測量來監測腫瘤的生長。使用公式腫瘤體積=(寬度^ 2 x長度/2)計算腫瘤大小。植入後約兩周，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為5組。每組的平均腫瘤體積為314 mm³ 或更小。小鼠隨機化後1天，將未轉導T細胞和DLL3 CAR-T細胞解凍並根據標準程式計數。將細胞重懸於RPMI+10% FBS中，並通過尾靜脈IV注射以200uL /小鼠的體積以2000000或5000000個CAR+細胞/小鼠的劑量注射。持續每3-4天監測一次腫瘤，直到研究結束。26C8和10G1-K DLL3 CAR-T細胞以劑量依賴性方式誘導腫瘤抑制(圖7A-7B)。圖7A-7B顯示了實驗資料，表明抗DLL3 CAR-T細胞可以以劑量依賴性方式消除小鼠中已建立的小細胞肺癌腫瘤。

為了在顯示出類似於人類疾病的轉移的模型中測試DLL3 CAR-T細胞的抗腫瘤活性，通過尾靜脈注射建立了SHP-77腫瘤。在肺、肝、腦、腎和脾中觀察到腫瘤。具體而言，將SHP-77細胞解凍，並在完全生長培養基(RPMI+10%FBS)中稀釋至40x10⁶ 個活細胞/mL。將細胞懸液保持在冰上直至植入，並通過尾靜脈IV向每只小鼠注射200uL細胞懸液。植入後第7天，注射200uL螢光素(15 mg/mL)，並通過IVIS成像監測腫瘤生長。基於植入後第11天的總通量，將小鼠隨機分為5組。在植入後第12天，將CAR-T解凍並根據標準程式計數。將細胞重懸於RPMI +10% FBS中，並通過尾靜脈IV注射以每只小鼠200 uL的體積注射每只小鼠2000000或7000000個CAR +細胞。持續每3-4天監測一次腫瘤，直到研究結束。如圖8所示，10G1-K抗DLL3 CAR-T細胞可以以劑量依賴性方式抑制小鼠中已建立的小細胞肺癌腫瘤。 實施例9：具有安全開關的抗DLL3 CAR構建體

該實施例描述了具有安全開關的抗DLL3 CAR的構建、表達和細胞毒性活性。將表6中的抗-DLL3 CAR重新格式化，以包括下面列出的不同安全開關結構(表8)。

編碼包括安全開關的抗DLL3 CAR構建體的蛋白質序列顯示在表9中。示例性安全開關構建體可以包含CD8α信號序列(SEQ ID NO：477)、本文所述的抗DLL3 scFv、CD20模擬表位( SEQ ID NO：536)，QBEND-10表位(SEQ ID NO：544)、人CD8α分子的鉸鏈和跨膜區域(SEQ ID NO：479)、4-1BB分子的胞質部分(SEQ ID NO：291)和CD3ζ分子的胞質部分(SEQ ID NO：292)。

使用實施例5中所述的方法產生CAR-T，並使用實施例7中所述的方法檢查其細胞毒性活性。圖9A是示出四個不同的安全開關的結構的圖。圖9B描繪了實驗流式細胞術資料，其顯示具有安全開關的抗DLL3 CAR 2G1、4H8和10G1-K在原代T細胞的表面上表達並且可以識別重組DLL3。該曲線圖在活CD3 +細胞上門控，圖上的數字是表達每種抗DLL3 CAR的細胞的百分比。圖9C描繪了實驗資料，其顯示具有安全開關的抗DLL3 CAR在DLL3+ WM266.4細胞系的系列殺死測定中具有活性。 實施例10：針對小細胞肺癌PDX模型的細胞毒性

小細胞肺癌PDX模型購自Crown Bioscience。為了檢查細胞表面的DLL3表達，將PDX模型的冷凍小瓶解凍，並且將200,000個細胞用於每個染色樣品。使用PE偶聯的抗DLL3抗體在FACS測定中驗證了DLL3的表達。將亮紫色421偶聯的抗人CD45和抗小鼠CD45抗體添加到同一染色樣品中，以排除人和小鼠淋巴細胞。

圖10A描繪了實驗資料，其顯示DLL3在兩個小細胞肺癌PDX模型的表面上表達。圖10B顯示了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞在3天的細胞毒性測定中以指定的效應子：靶標比率殺死相同的兩個小細胞肺PDX模型。不表達抗DLL3 CAR的T細胞(標記為空載體)用作陰性對照。 實施例11：使用基於利妥昔單抗的安全開關在體外檢測和消耗DLL3 CAR-T細胞

為了在不需要活性的情況下消耗或關閉CAR T細胞，如實施例9中所述，通過在CAR的胞外區的不同位置插入利妥昔單抗模擬位來開發利妥昔單抗關閉開關。使用補體依賴性細胞毒性試驗來評估DLL3 CAR-T細胞的利妥昔單抗依賴性體外消耗。在該測定中，將冷凍的CAR-T細胞解凍，並將1x10⁵ 細胞在補充有10%FBS的RPMI 1640培養基中於96孔板中溫育。在不存在或存在25%幼兔補體(Cedarlane，CL3441-S)和利妥昔單抗抗體(內部產生；100 mg/mL)的情況下，將細胞溫育3小時。用重組DLL3(脂肪原)對細胞染色，並通過流式細胞儀分析細胞毒性。圖11A描繪了實驗資料，其顯示可以通過重組DLL3和利妥昔單抗染色兩者檢測到抗DLL3 CAR-T細胞。圖11B描繪了實驗資料，其顯示了DLL3 CAR-T細胞在體外以利妥昔單抗依賴性和補體依賴性方式消耗。 實施例12：具有安全開關的抗DLL3 CAR-T細胞的體內活性

為了測試具有安全開關的DLL3 CAR-T細胞的抗腫瘤活性，使用帶有SHP-77腫瘤的NSG小鼠。從冷凍小瓶解凍SHP-77細胞，計數並稀釋。每只小鼠皮下注射在RPMI培養基/基質膠懸浮液中的50 x10⁶ 個活細胞/ mL。從植入後第5天開始，使用數位卡尺通過卡尺測量來監測腫瘤的生長。使用公式腫瘤體積=(寬度^2 x長度/2)計算腫瘤大小。植入後約14天，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為8組。每組平均腫瘤體積為178 mm³ 。在將小鼠隨機化的同一天，將未轉導T細胞和DLL3 CAR-T細胞解凍並根據標準程式計數。將細胞以5x10⁶ CAR +細胞/小鼠重懸於RPMI中，每只小鼠尾靜脈IV注射200μL的體積。持續每3-4天監測一次腫瘤，直到研究結束。到第50天，具有安全開關的DLL3 CAR-T細胞的所有組都誘導了顯著的腫瘤抑制並且完全或接近完全消除了可檢測的腫瘤(圖12A)。

為了在顯示出類似於人類疾病的轉移的模型中測試DLL3 CAR-T細胞的抗腫瘤活性，通過尾靜脈注射建立了表達外源性DLL3的DMS 273小細胞肺腫瘤(DMS 273-DLL3)。具體而言，將DMS 273-DLL3細胞解凍，並在RPMI培養基中稀釋至5x10⁵ 活細胞/mL。通過尾靜脈IV向每只小鼠注射200uL細胞懸浮液。植入後第3天，將小鼠隨機分為9組。同一天，將DLL3 CAR-T解凍，計數並以每只小鼠5x10⁶ CAR +細胞的濃度懸浮於RPMI培養基中，尾靜脈IV注射每只小鼠200μL的體積。使用IVIS成像系統繼續每3-4天監測一次腫瘤，直到研究結束。如圖12B 所示，具有不同的利妥昔單抗類安全開關的多個不同的DLL3 CAR對轉移性腫瘤有效。 實施例13：使用非荷瘤動物的小鼠安全性研究

已經在人腦和垂體中報導了DLL3 RNA(GTex)。同樣，在垂體中也報導了小鼠DLL3 RNA (Bio-GPS)。為了獲悉小鼠大腦中DLL3 RNA的表達，將來自三隻NSG小鼠的大腦固定在10%中性緩衝的福馬林(NBF)中，包埋，以4-6微米連續切片，並在RNAscope®LSRed ISH測定(ACDBio)中進行分析。在NSG小鼠的腦樣品中檢測到低水準的DLL3 RNA。圖13A顯示了在該測定法中觀察到的小鼠DLL3 RNA染色的代表性圖像。

為了獲悉DLL3 RNA在腦和垂體中表達的潛在毒性傾向，將未轉導T細胞、8 x10⁶ 10G1-K DLL3 CAR-T細胞或8 x10⁶ 2G1 DLL3 CAR-T細胞IV注射到NSG小鼠中。注射後7天，收穫脾、腦和垂體，固定在10% NBF中，包埋，以4-6微米連續切片，並用抗人CD3抗體(Abcam，ab52959，1:500稀釋液)染色以通過免疫組織化學檢測人T細胞。儘管在來自所有動物的脾中檢測到T細胞，但在腦或垂體樣品中未檢測到它們(圖13B)。因此，儘管在非荷瘤NSG小鼠中檢測到低水準的DLL3 RNA，但是在小鼠的腦或垂體樣品中未檢測到DLL3 CAR-T細胞。 實施例14：使用帶有皮下腫瘤的動物的小鼠安全性研究

為了進一步評估潛在的腦和垂體毒性責任，將DLL3 CAR-T細胞注射到帶有表達外源性小鼠DLL3 (LN229-mDLL3)的皮下LN229腫瘤的NSG小鼠中。在該模型中，腫瘤細胞對CAR-T的啟動可以導致針對潛在的表達DLL3的正常組織的敏感性和活性增加。實驗設計如圖14A所示。在腫瘤植入前三天(第-3天)，通過尾靜脈注射編碼IL-7和IL-15的腺相關病毒(AAV) (Vigene Biosciences)以支援CAR-T細胞擴增和存留。然後從冷凍小瓶中解凍LN229-mDLL3細胞，並在完全生長培養基(RPMI +10% FBS)中稀釋至4.25 x10⁷ 細胞/mL。細胞懸浮液保持在冰上直至植入。在即將植入前，將細胞與BD Matrigel Matrix (目錄號354234)以1:1混合，並對每只小鼠皮下注射200μL含有4.25x10⁶ LN229-mDLL3細胞的細胞/Matrigel懸浮液。從植入後第8天開始，使用數位卡尺通過卡尺測量監測腫瘤生長。使用公式腫瘤體積= (寬度^ 2x長度/2)計算腫瘤尺寸。在植入後第22天，基於腫瘤體積和IL-7和IL-15的血清濃度，將小鼠隨機分成5組。在同一天(第22天)，將未轉導T細胞和小鼠交叉反應性10G1-K DLL3 CAR-T細胞解凍，重懸在RPMI+10% FBS中，並且通過尾靜脈IV注射以200μL/小鼠的體積注射1 x10⁷ CAR +細胞/小鼠。每3-4天繼續監測腫瘤，直到研究結束，並且觀察到用DLL3 CAR T治療的穩健抗腫瘤活性(圖14B)。

在第49天，當接受DLL3 CAR-T細胞的動物無腫瘤時，將來自動物的腦組織固定在10% NBF中並包埋以顯示包括側腦室、第三腦室和第四腦室在內的腦室系統，使得將三個切片置於以4-6微米連續切片的單個塊中，並用蘇木精和曙紅(H&E)染色或染色以通過免疫組織化學檢測人特異性CD3 (hCD3)。將垂體腺固定在10% NBF中，處理並用H&E染色或免疫組織化學染色以顯示hCD3。用顯微鏡檢查H&E載玻片，病理學家使用標準系統對組織病理學發現進行評分。DLL3 CAR-T細胞的施用在垂體中間部中和神經部中產生大量的hCD3染色的T細胞，而在遠側部中具有相對少的T細胞(圖14C和未顯示的資料)。在腦神經纖維網和脈管系統(作為迴圈T細胞)中存在T細胞的稀少至中度低或中度至中等高的hCD3染色(圖14C和資料未顯示)。不存在其它垂體或腦發現(圖14C-D)。為了獲悉T細胞浸潤的功能性結果，使用免疫組織化學對垂體神經部中釋放的兩種激素，即加壓素和催產素染色。對於加壓素檢測，將樣品用抗加壓素抗體(ImmunoStar，20069)以1/7,000稀釋在室溫下染色1小時，然後用兔對齧齒動物HRP-聚合物(Biocare Medical)在室溫下染色30分鐘。對於催產素檢測，樣品用抗催產素抗體(ImmunoStar，20068)以1/10,000稀釋在室溫下染色15分鐘，然後用兔-on-齧齒動物HRP-聚合物(Biocare Medical)在室溫下染色30分鐘。在接受未轉導的T細胞或DLL3 CAR-T細胞的動物的垂體神經部中可以檢測到兩種激素，表明在該區域中產生激素的神經元保持功能(圖14E-F)。因此，基於病理學評估和激素染色，在樣品中沒有看到組織損傷。 實施例15：使用帶有顱內腫瘤的動物進行的小鼠安全性研究

為了促進T細胞向大腦的浸潤並進一步獲悉潛在的腦毒性，使用帶有表達外源性小鼠DLL3和人EGFRvIII (LN229-mDLL3-vIII)的顱內LN229腫瘤的NSG小鼠。實驗設計如圖15A所示。從冷凍小瓶中解凍LN229-mDLL3細胞，並在RPMI中稀釋至1 x10⁷ 個活細胞/mL。然後每只小鼠顱內注射3 µL含有3x10⁴ LN229-mDLL3細胞的細胞懸浮液。通過IVIS成像系統監測腫瘤的生長。植入後第17天，基於腫瘤體積將小鼠隨機分為10組。在同一天(第17天)，將敲除TCR的未轉導T細胞、10G1-K DLL3 CAR-T細胞和EGFRvIII CAR-T細胞解凍並重懸於RPMI中，並以200 uL/小鼠的體積通過尾靜脈IV注射1 x10⁷ CAR+細胞/小鼠。包括EGFRvIII CAR-T細胞作為對照，以評估由腦中腫瘤溶解引起的潛在炎症。為了支持CAR-T細胞擴增和存留，在第17天開始，每週兩次向每只動物給予0.5 ug IL-15 (Peprotech AF-200-15)和3ug IL-15Ra Fc 融合蛋白 (R&D Systems 7194-IR)，直到學習結束。每3-4天一次繼續監測腫瘤，直到研究結束，並且觀察到明顯的抗腫瘤活性(圖15B)。在第22和38天，對所有動物的腦組織進行修剪、處理和包埋，以露出包括側腦室、第三腦室和第四腦室的腦室系統，從而將這三個部分放入一個單獨的塊中，以4-6微米連續切片，並用H＆E染色或通過免疫組織化學染色以檢測人特異性CD45 (hCD45)。對垂體組織進行處理，使其包括垂體神經部、中間部和遠側部，並用H＆E染色或免疫組織化學染色以檢測作為人T細胞的標誌物的hCD45。

在第22天，接受未轉導T細胞或10G1-K DLL3 CAR-T細胞的動物在大腦或垂體中具有稀有/稀少的hCD45染色T細胞(資料未顯示)。另一方面，對於用EGFRvIII CAR-T細胞治療的動物，hCD45 +染色在浸潤/神經膠質瘤或神經膠質瘤區域從稀有/稀少至中等低或中等至中等高，與該組的抗腫瘤活性一致(資料未顯示)。在第38天，接受未轉導T細胞或EGFRvIII CAR-T細胞的動物在大腦和垂體中具有稀有/稀少的hCD45 +染色。接受10G1-K DLL3 CAR-T細胞的動物在垂體中，主要在垂體中間部和神經部中具有最少或輕微的單個核細胞浸潤(圖15C-D)。此外，與腦其它區域(大腦的脈管系統、脈絡叢和腦膜)的稀有/稀少染色相比，這些動物的神經膠質瘤小灶相關的hCD45 +染色略多(中等低)，與該組中的抗腫瘤活性一致，如圖15B所示。 實施例16：解離的小鼠垂體細胞的體外細胞毒性

為了直接測試DLL3 CART是否對垂體具有活性，在無菌條件下收集來自NSG小鼠的小鼠垂體以用於體外分析。通過在1 mL解離混合物[5 mL DMEM，高葡萄糖，GlutaMax(Gibco，目錄號10564)，50 uL酶H，5 uL酶R，6.25 uL酶A(Miltenyi腫瘤解離試劑盒＃130-095-929)中於37 mL的溫度下進行3輪溫育來解離組織，然後使用磨碎機進行機械解離。將單細胞轉移到完全培養基(DMEM，高葡萄糖，GlutaMax，20%，1X胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液，1X MEM非必需氨基酸，1X青黴素-鏈黴素)中，並在每輪後合併。使細胞沉澱並在室溫下用ACK裂解緩衝液處理3分鐘，然後在完全培養基中中和。通過70u篩檢程式過濾細胞懸浮液，並離心以除去緩衝液。計數細胞，並以每孔5x10⁴ 個細胞的量鋪在96孔板的完全培養基中，並使其恢復3天，然後加入CAR-T細胞。在添加CAR-T細胞時，預期的靶標密度為每孔1x10⁴ 細胞。對於對照，以相同的密度接種DLL3 +細胞(DMS-273)和DLL3-細胞(293T)。以E：T=9：1、3：1和1：1的比例添加10G1-K和2G1 DLL3 CAR-T細胞，並與靶標共培養3天。共培養3天后，將培養基與孔分離並離心以沉澱出T細胞。用50uL/孔的Cell Titer Glo(Promega，G7570)處理靶細胞10分鐘，並在SpectraMax讀板器中分析細胞毒性的讀數。

圖16A描繪了實驗資料，其顯示儘管DLL3 CAR-T細胞對DLL3+ DMS 273 細胞系具有活性，但是它們在體外對小鼠垂體細胞沒有細胞毒性。合併T細胞並針對啟動標誌物(41BB和CD25)染色，以通過流式細胞術分析。圖16B描繪了小鼠垂體細胞在體外不啟動DLL3 CAR-T細胞。將上清液在-80℃冷凍，然後使用人TH1/TH2 10-Plex組織培養試劑盒(Meso Scale Discovery, K15010B)解凍以用於細胞因數分析。圖16C描繪了儘管10G1-K和2G1 DLL3 CAR-T細胞在與DLL3+ DMS 273 細胞系共培養時都分泌干擾素-γ(IFNγ)、腫瘤壞死因數α(TNF-α)和IL-2，但是在使DLL3 CAR-T細胞與小鼠垂體細胞共培養後，沒有細胞因數分泌。因此，DLL3 CAR-T細胞在體外對垂體細胞無細胞毒性。

[圖1A-1B]是一系列曲線圖，其顯示本文所述的經純化的抗DLL3抗體與三種表達DLL3的小細胞肺癌細胞系(SHP-77、DMS 273和DMS 454)結合。實線和虛線分別表示用抗DLL3抗體或小鼠IgG2A同種型對照抗體的染色。

[圖2A-2D]顯示表位元作圖實驗的結果。圖2A是用於表位作圖的在CHO細胞上表達的全長和截短的人DLL3蛋白的示意圖，並且所有蛋白在N末端與HA標籤融合以便於檢測。圖2B和2C顯示圖2A所示的全長和截短的人DLL3蛋白的氨基酸序列。圖2D是一系列曲線圖，顯示抗DLL3抗體的表位作圖的結果，以及分別識別DSL、EGF1和EGF3結構域的抗DLL3抗體的實例；x軸表示來自PE通道的信號，y軸表示計數。

[圖3A-3C]是一系列曲線圖和表，顯示來自兩個不同供體的細胞的結構、轉導效率以及抗DLL3 CAR的細胞毒性活性。圖3A是編碼抗DLL3CAR的構建體的示意圖，其從N末端到C末端包含：抗DLL3 scFv、來自人CD8α的鉸鏈和跨膜區、來自人41BB的胞質區和來自人CD3ζ的胞質區。圖3B描述了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR在原代T細胞的表面上表達並可以識別重組DLL3；所述曲線圖在活CD3 +細胞上進行門控，曲線圖上的數位是表達每種抗DLL3 CAR的細胞的百分比。圖3C和3D顯示包含本文所述的scFv序列的抗DLL3 CAR的轉導效率。

[圖4A-4C]是一系列曲線圖，顯示一些抗DLL3 CAR的殺死資料。圖4A描繪了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶(E：T)比率在3天細胞毒性測定中特異性殺死表達人DLL3的HEK-293T細胞，而不是親本HEK-293T細胞。不表達抗DLL3 CAR的T細胞(標記為“空載體”)用作陰性對照。圖4B描繪了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶標比率在3天的細胞毒性測定中殺死表達內源性DLL3的SHP-77和WM266.4細胞。圖4C描繪了實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T細胞以指定的效應子：靶標比率在3天細胞毒性測定中特異性殺死表達內源性DLL3的DMS 454和DMS 273小細胞肺癌細胞。對於圖4A-4C中的所有曲線圖，使用One-glo測定系統來評估靶細胞的活力，n=3。

[圖5]是一系列橫條圖，顯示當CAR-T細胞和SHP-77細胞以1：1或1：9效應子：靶標比率溫育24小時時，抗DLL3 CAR-T細胞在與表達DLL3的SHP-77細胞系共溫育後釋放細胞因數。收集上清液，並使用來自MSD的促炎性9-plex試劑盒(n=3)測量IFN-γ、IL-2和TNF-α水準。

[圖6A-6B]是顯示在將抗DLL3 CAR-T細胞反復暴露於DLL3 +細胞系之後的系列殺死測定的實驗資料的曲線圖。圖6A描繪了抗DLL3 CAR-T細胞對DLL3 + WM266.4細胞的系列殺死。在測定的第12天，一些集落保持活性。圖6B描繪抗DLL3 CAR-T細胞對DMS 454和WM266.4細胞的系列殺死。圖6C描繪了抗DLL3 CAR-T對DMS 273小細胞肺癌系的系列殺死。對於圖6A-6C中的所有曲線圖，使用one-glo測定或CellTiter-glo系統來評估靶細胞活力，n=3-5。

[圖7A-7B]是證明抗DLL3 CAR-T細胞以劑量依賴性方式消除在小鼠中已建立的SHP-77小細胞肺癌皮下腫瘤的曲線圖。

[圖8]是證明10G1-K抗DLL3 CAR-T細胞以劑量依賴性方式抑制已建立的IV注射的SHP-77小細胞肺癌腫瘤的生長的曲線圖。利用重複測量，使用ANOVA進行統計分析(Dunnett多重比較)，第14天至第28天，n = 4-5。*，p＜0.05。**，p＜0.01。

[圖9A-9C]描繪了原代T細胞的結構、轉導效率和具有安全開關的抗DLL3 CAR的細胞毒性活性。圖9A是顯示具有4種不同的安全開關(QR3、SR2、RSR和R2S)的CAR設計的結構的示意。圖9B顯示流式細胞術圖，其證明了具有圖9A中所示的安全開關的抗DLL3 CAR在原代T細胞的表面上表達並且可以識別重組DLL3。該曲線圖在活CD3 +細胞上門控，曲線圖上的數字表示表達每種抗DLL3 CAR的細胞的百分比。圖9C描繪了實驗資料，其顯示具有安全開關的抗DLL3 CAR在系列殺死測定中具有活性。

[圖10A]描繪了顯示兩個小細胞肺癌患者來源的異種移植物(PDX)模型在細胞表面上表達DLL3的曲線圖。實線和虛線分別表示用抗DLL3抗體或螢光扣除對照(fluorescence minus one, FMO)染色。圖10B顯示實驗資料，其顯示抗DLL3 CAR-T示出針對所述兩個PDX模型的細胞毒性活性。

[圖11A-11B]示出了安全開關，其允許檢測和消耗具有利妥昔單抗的DLL3 CAR-T細胞。圖11A顯示了擴增後14天，用重組DLL3和PE綴合的利妥昔單抗將8E11-SR2和26C8-R2S抗DLL3 CAR-T細胞染色，並使用流式細胞術進行分析。象限中的數字表示總T細胞的百分比。圖11B顯示利妥昔單抗介導的8E11-SR2和26C8-R2S抗DLL3 CAR-T細胞的補體依賴性細胞毒性(CDC)。將CAR-T細胞與25%幼兔補體和利妥昔單抗溫育3小時，並使用流式細胞術評估細胞毒性。

[圖12A-12B]描繪了證明具有安全開關的抗DLL3 CAR-T細胞抑制了皮下或靜脈內注射的小細胞肺癌腫瘤的生長的曲線圖。圖12A顯示具有安全開關的DLL3 CAR-T細胞消除了小鼠中已建立的SHP-77小細胞肺癌皮下腫瘤。圖12B是證明抗DLL3 CAR-T細胞抑制了IV注射的DMS 273-DLL3小細胞肺癌腫瘤的生長的曲線圖。

[圖13A]顯示NSG小鼠腦中的小鼠DLL3 RNA表達的代表性圖像。圓圈表示小鼠DLL3 RNA的簇。圖13B顯示用未轉導T細胞、10G1-K DLL3 CAR-T細胞或2G1 DLL3 CAR-T細胞給藥的動物的脾、垂體和腦樣品的抗人CD3染色。箭頭指示脾中的CD3陽性細胞。

[圖14A-14F]顯示了使用皮下LN229-mDLL3腫瘤模型的小鼠安全性研究的實驗設計和結果。圖14A顯示研究組和實驗設計。圖14B顯示接受未轉導T細胞或DLL3 CAR-T細胞的動物的組織收穫時機和腫瘤體積。圖14C是顯示腦和垂體樣品的人CD3染色評分的表。圖14D是顯示所收穫的腦和垂體樣品的組織學分析的表。圖14E顯示用抗血管加壓素抗體染色的垂體樣品的圖像。圖14F顯示用抗催產素抗體染色的垂體樣品的圖像。

[圖15A-15D]顯示使用顱內LN229-mDLL3腫瘤模型的小鼠安全性研究的實驗設計和結果。圖15A顯示研究組和實驗設計。圖15B顯示了接受未轉導T細胞、DLL3 CAR-T細胞或EGFRvIII CAR-T細胞的動物的組織收穫時機和腫瘤體積。圖15C是顯示腦、垂體和脾樣品的人CD45染色評分的表。圖15D是顯示腦和垂體樣品的組織學分析的表。

[圖16A-16C]顯示解離的小鼠垂體細胞的體外細胞毒性的實驗資料。圖16A顯示在與DLL3 CAR-T細胞共培養3天后靶細胞的細胞毒性讀數，這證明DLL3 CART在體外對小鼠垂體細胞沒有細胞毒性。圖16B顯示了針對與靶標共培養的T細胞的啟動標誌物CD25和41BB進行的表面染色的流式細胞術分析，這證明小鼠垂體細胞在體外不啟動DLL3 CAR-T。圖16C顯示了通過MSD分析的在細胞培養基中分泌的細胞因數，這證明在DLL3 CAR-T細胞與小鼠垂體細胞在體外共培養3天后，沒有分泌任何細胞因數。

Claims (45)

1. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含下述中的至少一種： (a) 可變重鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460； (b) 可變重鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695； (c) 可變重鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462； (d) 可變輕鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、 463和696； (e) 可變輕鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及 (f) 可變輕鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。
2. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含： (a) 可變重鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460； (b) 可變重鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；以及 (c) 可變重鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462。
3. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含： (a) 可變輕鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696； (b) 可變輕鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及 (c) 可變輕鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。
4. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含下述中的至少一種： (a) 可變重鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466；和 (b) 可變輕鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467， 其中該可變重鏈和該可變輕鏈通過至少一個接頭連接。
5. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含： (a) 可變重鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457和466；以及 (b) 可變輕鏈，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467， 其中該可變重鏈和該可變輕鏈通過至少一個接頭連接。
6. 一種嵌合抗原受體，其包含胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞外結構域包含與DLL3特異性結合的DLL3抗原結合結構域，並且其中該抗原結合結構域包含選自由表1d中列出的那些scFv組成的組中的序列。
7. 一種與DLL3特異性結合之嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 482至533和SEQ ID NO: 632-683中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
8. 根據請求項1至7中任一項之嵌合抗原受體，其中該胞內結構域包含至少一個共刺激結構域。
9. 根據請求項8之嵌合抗原受體，其中該共刺激結構域是下述物質的信號傳導區：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程式性死亡-1 (PD-1)、誘導型T細胞共刺激因數(ICOS)、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1 (CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276 (B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞因數受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴細胞啟動分子(SLAM蛋白)、啟動NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α.、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、與CD83特異性結合的配體，或其任何組合。
10. 根據請求項9之嵌合抗原受體，其中該共刺激結構域包含4-1BB/CD137的信號傳導區。
11. 根據請求項10之嵌合抗原受體，其中該4-1BB/CD137共刺激結構域包含SEQ ID NO: 480或其片段。
12. 根據請求項1-11中任一項之嵌合抗原受體，其中該胞內結構域包含至少一個啟動結構域。
13. 根據請求項12之嵌合抗原受體，其中該啟動結構域包含CD3。
14. 根據請求項13之嵌合抗原受體，其中該CD3包含CD3ζ。
15. 根據請求項14之嵌合抗原受體，其中該CD3ζ包含SEQ ID NO: 481或其片段。
16. 根據請求項1-15中任一項之嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體由SEQ ID NO: 570-621和631中任一個的多核苷酸序列編碼。
17. 根據請求項1-16中任一項之嵌合抗原受體，其還包含安全開關。
18. 根據請求項17之嵌合抗原受體，其中該安全開關包含CD20類比表位或QBEND-10表位。
19. 根據請求項18之嵌合抗原受體，其中該安全開關包含一個或多個CD20模擬表位或一個或多個QBEND-10表位元，或其組合。
20. 根據請求項17-19中任一項之嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包含一個或多個為QR3、SR2、RSR或R2S形式的安全開關。
21. 根據請求項17-20中任一項之嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包含與SEQ ID NO: 622-628、474-476、565和684-694中任一個具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
22. 一種分離的多核苷酸，其編碼請求項1-21之嵌合抗原受體中的任一種。
23. 一種載體，其包含請求項22之多核苷酸。
24. 根據請求項23之載體，其中，該載體是逆轉錄病毒載體、DNA載體、質粒、RNA載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、慢病毒載體或其任何組合。
25. 一種工程化免疫細胞，其表達請求項1-21之嵌合抗原受體中的任一種。
26. 一種工程化免疫細胞，其表達請求項22之多核苷酸或者請求項23或24之載體。
27. 根據請求項25或26之工程化免疫細胞，其中，該免疫細胞是T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、NK細胞、表達TCR的細胞、樹突狀細胞或NK-T細胞。
28. 根據請求項27之工程化免疫細胞，其中，該細胞是自體T細胞。
29. 根據請求項27之工程化免疫細胞，其中，該細胞是同種異體T細胞。
30. 一種藥物組合物，其包含請求項25-29中任一項之工程化免疫細胞。
31. 一種治療有需要的受試者中的疾病或病症之方法，該方法包括向該受試者施用請求項25-29中任一項之工程化免疫細胞或請求項30之藥物組合物。
32. 根據請求項31之方法，其中該疾病或病症是癌症。
33. 根據請求項31或32之方法，其中該疾病或病症是小細胞肺癌。
34. 一種製品，其包含請求項26-325-29中任一項之工程化免疫細胞或請求項30之藥物組合物。
35. 一種抗DLL3結合劑，其包含： (a) 可變重鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460； (b) 可變重鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ NO: 2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695； (c) 可變重鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462； (d) 可變輕鏈CDR1，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696； (e) 可變輕鏈CDR2，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及 (f) 可變輕鏈CDR3，其包含選自由下述組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID NO: 6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。
36. 根據請求項35之DLL3結合劑，其中該結合劑是抗體，抗體綴合物，或其抗原結合片段，任選地，F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段或dAb片段。
37. 根據請求項36之抗DLL3結合劑，其中該結合劑是包含IgG恆定區的單克隆抗體。
38. 根據請求項35-37中任一項之抗DLL3結合劑，其包含與表1b中提供的可變重鏈(VH)序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的VH序列。
39. 根據請求項35-38中任一項之抗DLL3結合劑，其包含與表1c中提供的可變輕鏈(VL)序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的VL序列。
40. 根據請求項35-39中任一項之抗DLL3結合劑，其中該結合劑包含與表1d中列出的scFv序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、98%、99%或100%同一性的序列。
41. 根據請求項35-40中任一項之抗DLL3結合劑，其中該結合劑是包含與Fc恆定區融合的scFv片段的融合蛋白。
42. 一種藥物組合物，其包含請求項35-41中任一項之抗DLL3結合劑和藥學上可接受的賦形劑。
43. 一種治療有需要的受試者中的疾病或病症之方法，該方法包括向該受試者施用請求項35-41中任一項之抗DLL3結合劑或請求項42之藥物組合物。
44. 根據請求項43之方法，其中該疾病或病症是癌症。
45. 根據請求項43或44之方法，其中該疾病或病症是小細胞肺癌。

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