CN117529337A - 针对dll3的结合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

针对DLL3的结合分子或其抗原结合片段、包含结合分子或其抗原结合片段的衍生物以及药物组合物。此外，还涉及结合分子或其抗原结合片段在治疗癌症和检测诊断方面的相关应用。

Description

针对DLL3的结合分子及其应用 技术领域
本公开属于免疫学领域，更具体地，本公开涉及针对DLL3的结合分子及其抗原结合片段、包含所述结合分子或其抗原结合片段的衍生物、药物组合物及其在治疗癌症方面的相关应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。根据病理分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两个大类。
非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最重要的一种，有超过80％的肺癌患者属于这种类型。肺癌靶向治疗、PD-1免疫药物、基因测序如今大热，随之而来的突破性进展，主要集中在非小细胞肺癌，大大增加了这一亚群肺癌的可选有效治疗，极大的改善了非小细胞肺癌患者的五年生存率。
小细胞肺癌(SCLC)是一种具有高度侵袭性、致命性和广泛转移性肺癌，约占肺癌的15％，在病理学、分子学、生物学和临床上与其他肺癌非常不同。据估计，每年确诊超过23.4万例SCLC患者，每年在全球造成约250,000人死亡。SCLC的特征在于肿瘤快速生长，高血管分布，基因组不稳定，早期转移性传播。在过去30年中，SCLC检测、治疗或存活仅见到了适度的改善，导致SCLC被归类为顽固性癌症。局部治疗，如手术或者放疗或者两者联合，几乎不可能完全治愈。以铂类为基础的联合化疗依然是治疗的基石，一线标准方案由铂类(卡铂或顺铂)联合其他细胞毒药物(如依托泊苷)，小细胞肺癌的化疗缓解率很高，但也常伴复发，尤其是广泛期的患者。对于局限期的患者中位生存期有14-20个月，广泛期则只有9-11个月，而复发的患者，生存期更短，也几乎无治疗可选。唯一被FDA推荐的拓扑替康由于其血液学毒性受到限制，治疗反应率也不尽人意，只有5-24％，中位生存期不足25周。目前暂无具体的三线治疗方案推荐，因此急需一种新的有效的治疗药物。
Delta-like 3，也称为DLL3，是一种由DLL3基因编码的蛋白质，是Notch家族的配体之一。DLL3与DLL1只有36％的同源性，与其他deltatype dsl(delta/serate/lag-2)蛋白DLL1和DLL4不同，DLL3在胎儿大脑中的正常组织表达最高，在近轴中胚层的生长发育中起着关键作用。研究发现，在大约85％的小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌患者的肿瘤细胞表面表达，另外还高表达于多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌和直肠癌等。但在健康组织和非神经内分泌肿瘤中不表达。该蛋白参与影响Notch调节信号通路，使Notch通路发出的信号最后促发癌症不受限制地生长。在正常组织中，DLL3的mRNA表达仅限于大脑、食道和胰腺。
研究进一步显示，在肿瘤组织和正常组织标本的分析中，通过检测原发性SCLC活检标本、SCLC细胞系和正常肺活检标本的整个转录组测序数据中DLL3的表达，显示SCLC中DLL3的mRNA相对于正常肺的升高约35倍。将这些SCLC肿瘤样本与来自正常组织和癌基因组中其他肿瘤类型的转录组数据进行比较，进一步证实原发性SCLC肿瘤样本以及低级别胶质瘤(Low grade glioma，LGG)、胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)、黑色素瘤(melanoma，SKCM)中DLL3表达升高。临床肺癌基因组计划的Illumina BeadChip data也显示，与NSCLC相比，原发性SCLC肿瘤标本中的DLL3升高。
从Cancer Cell Line Encyclopedia获得的数据进一步证实DLL3mRNA的表达在SCLC细胞系中特别升高。总的来说，这些跨多个技术平台和样本的表达数据表明，DLL3mRNA在原发性SCLC肿瘤、SCLC PDX、传统SCLC细胞系和LCNEC PDX中过度表达，而正常组织中的mRNA表达主要局限于大脑。
发明内容
本公开的目的在于提供一种针对DLL3的结合分子及其抗原结合片段，所述结合分子或其抗原结合片段能够特异性地结合DLL3，而对同家族蛋白DLL1及DLL4没有非特异结合。
本公开的第一个方面提供一种DLL3结合分子或其抗原结合片段，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含：
i)重链互补决定区1(HCDR1)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：6、9、12、15或18；
ii)重链互补决定区2(HCDR2)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：7、10、13、16或19；和
iii)重链互补决定区3(HCDR3)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：8、11、14、17、20、110或111。
在一个实施方案中，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：
a)SEQ ID NO：6、7和8；或
b)SEQ ID NO：9、10和11；或
c)SEQ ID NO：12、13和14；或
d)SEQ ID NO：15、16和17；或
e)SEQ ID NO：18、19和20；或
f)SEQ ID NO：6、7和110；或
g)SEQ ID NO：6、7和111。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：1-5、21-29任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1-5、21-29任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本公开的第二个方面提供另一种DLL3结合分子或其抗原结合片段，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含：
i)重链互补决定区1(HCDR1)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：57、63、69、72、78、84、93或99；
ii)重链互补决定区2(HCDR2)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：58、64、70、73、79、85、94或100；
iii)重链互补决定区3(HCDR3)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：59、65、71、74、80、86、95或101；
iv)轻链互补决定区1(LCDR1)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：60、66、75、81、87、90、96或102；
v)轻链互补决定区2(LCDR2)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：61、67、76、82、88、91、97或103；和
vi)轻链互补决定区3(LCDR3)，其氨基酸序列选自：SEQ ID NO：62、68、77、83、89、92、98、104、112、113或114。
在一个实施方案中，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：
a)SEQ ID NO：57、58、59、60、61和62；或
b)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68；或
c)SEQ ID NO：69、70、71、66、67和68；或
d)SEQ ID NO：72、73、74、75、76和77；或
e)SEQ ID NO：78、79、80、81、82和83；或
f)SEQ ID NO：84、85、86、87、88和89；或
g)SEQ ID NO：84、85、86、90、91和92；或
h)SEQ ID NO：93、94、95、96、97和98；或
i)SEQ ID NO：99、100、101、75、76和77；或
j)SEQ ID NO：72、73、74、102、103和104；或
k)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和112；或
l)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和113；或
m)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和114。
在一个实施方案中，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区分别包含选自以下组的序列：
1)SEQ ID NO：30和31；或
2)SEQ ID NO：32和33；或
3)SEQ ID NO：34和33；或
4)SEQ ID NO：35和36；或
5)SEQ ID NO：37和38；或
6)SEQ ID NO：39和40；或
7)SEQ ID NO：39和41；或
8)SEQ ID NO：42和43；或
9)SEQ ID NO：44和36；或
10)SEQ ID NO：35和45；或
11)SEQ ID NO：46和47；或
12)SEQ ID NO：46和48；或
13)SEQ ID NO：49和50；或
14)SEQ ID NO：51和52；或
15)SEQ ID NO：51和53；或
16)SEQ ID NO：46和54；或
17)SEQ ID NO：46和55；或
18)SEQ ID NO：46和56。
本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含Fc；更优选地，Fc来源于鼠或人；更优选地，Fc的序列是天然的或经过修饰的。
本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、双特异性结合分子、多特异性结合分子、人源 化抗体、嵌合抗体、改型抗体、全人源抗体、全长抗体、重链抗体、纳米抗体、Fab、Fv、scFv、F(ab’)2、线性抗体或单结构域抗体。
本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
本公开还提供一种偶联物，是将本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成；优选地，所述检测标记物包括放射性核素、发光物质、有色物质或酶。
本公开还提供一种抗体药物偶联物(ADC)，是将本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段与其他生物活性分子偶联形成；优选地，所述其他生物活性分子为小分子药物；优选地，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段与所述其他生物活性分子通过接头连接。
本公开还提供编码本公开DLL3结合分子或其抗原结合片段的核酸，以及包含该核酸的重组载体，以及包含上述核酸或载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为原核细胞(优选大肠杆菌)，或者真核细胞(优选哺乳动物细胞或酵母；进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞)。
本公开还提供制备本公开DLL3结合分子或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合的条件下培养上述宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。
本公开还提供本公开DLL3结合分子或其抗原结合片段在制备治疗或缓解肿瘤的药物中的用途。
在一个实施方案中，所述药物靶向DLL3异常表达的肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述肿瘤选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
本公开还提供本公开DLL3结合分子或其抗原结合片段在制备检测试剂或诊断试剂中的用途。
在一个实施方案中，所述检测试剂用于检测DLL3的表达；所述诊断试剂用于诊断肿瘤；优选地，所述肿瘤选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
本公开还提供检测样品中DLL3表达的方法，所述方法包括：
(1)将样品与本公开的DLL3结合分子或其抗原结合片段接触；
(2)检测所述DLL3结合分子或其抗原结合片段与DLL3的复合物的形成；任选地，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段是被可检测地标记的。
本公开还提供一种药物组合物，其包含有效量的本公开DLL3结合分子或其抗原结合片段、或者包含有效量的本公开的抗体药物偶联物、或者包含有效量的本公开的核酸、或者包含有效量的本公开的重组载体、或者包含有效量的本公开的宿主细胞。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述药物组合物还包含一种或多种额外的其他治疗剂。
本公开还提供一种药盒或试剂盒，其包括容器，以及位于容器中的本公开的药物组合物。
本公开还提供一种诱导表达DLL3的细胞死亡的方法，所述方法包括使所述细胞与本公开的药物组合物接触，所述表达DLL3的细胞是肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述肿瘤细胞是选自以下肿瘤的细胞：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
本公开还提供一种治疗受试者中与表达DLL3相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本公开的药物组合物、或前述的药盒或试剂盒。
在一个实施方案中，所述疾病是肿瘤；小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
在一个实施方案中，所述方法还包括向所述受试者给予额外的治疗剂。
本公开的技术方案具有如下有益效果：本公开的DLL3结合分子及其抗原结合片段能够特异性地结合DLL3，而对同家族蛋白DLL1及DLL4没有非特异结合。
附图说明
附图更进一步说明了本说明书所公开的新特性。参照这些附图将能更好地理解本说明书中所公开的特性和优点，但应当理解，这些附图仅用于说明本文所公开原理的具体的实施方案，而非意欲对所附权利要求的范围加以限制。
图1A显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
图1B显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞(HEK293-cyno DLL3)的结合情况。
图2A显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3人源化抗体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
图2B显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3人源化抗体与表达DLL3细胞(HEK293-cyno DLL3)的结合情况。
图3A显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL1的结合情况。
图3B显示了本公开的骆驼来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL4的结合情况。
图4显示了本公开的骆驼来源的hDLL3-3-1人源化抗体变体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
图5A显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
图5B显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞(HEK293-cyno DLL3)的结合情况。
图6显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
图7A显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL1的结合情况。
图7B显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL4的结合情况。
图8显示了本公开的小鼠杂交瘤来源的H2-39E2D11人源化抗体变体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合情况。
具体实施方式
术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入本文。
在下文详细描述本公开前，应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本公开的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本公开的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。
本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
本文中的术语“抗体”可以包含完整抗体(例如全长单克隆抗体)及其任何抗原结合片段(即抗原结合部分)或其单链，还可以包含在完整抗体或其抗原结合片段或其单链的基础上进行改造(例如连接其他肽段、功能单位重排等)而形成的具有抗原特异性结合能力的产物。
在一个实施方案中，抗体典型是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重(H)多肽链和两条轻(L)多肽链的Y型四聚蛋白。天然IgG抗体即具有这样的结构。每条轻链由一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)组成。每条重链包含一个可变结构域(VH)和恒定区。
本领域已知五个主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，对应的重链恒定结构域分别被称为α，δ，ε，γ和μ，IgG和IgA可以进一步分为不同的亚类，例如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA可分为IgA1和IgA2。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列可以被分配到两种明显相异的类型之一，称为κ和λ。
在IgG、IgA和IgD抗体的情形中，该恒定区包含称为CH1、CH2和CH3的三个结构域(IgM和IgE具有第四结构域CH4)。在IgG、IgA和IgD类别中，CH1和CH2结构域被柔性铰链区分离，该铰链区是可变长度的富含脯氨酸和半胱氨酸的区段。每类抗体进一步包含由配对半胱氨酸残基形成的链间和链内二硫键。
术语“可变区”或“可变结构域”显示出从一种抗体到另一种抗体的氨基酸组成的显著变化，并且主要负责抗原识别和结合。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，使得完整的IgG抗体具有两个结合位点(即它是二价的)。重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)结构域各包含具有极端变异性的三个区域，被称为高变区(HVR)，或更通常地，被称为互补决定区(CDR)，VH和VL各有4个骨架区FR，分别用FR1，FR2，FR3，FR4表示。因此，CDR和FR序列通常出现在重链可变结构域(或轻链可变结构域)的以下序列中：FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
术语“Fc”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。
本文中“抗体”可在最广的意义上使用，可包括如多克隆抗体(polyclonal antibodies)、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体及灵长类化抗体、CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)、人类抗体(包括重组产生的人类抗体)、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、抗个体基因型抗体、合成抗体(包括突变蛋白及其变体)等等。
术语“单克隆抗体”(或称“单抗”)指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
需说明的是，本公开的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本公开的单抗序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本公开的范围内。
术语“人源化抗体”是指其中非人抗体(如小鼠抗体)CDR以外的所有或部分氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应氨基酸置换的抗体。氨基酸的少量添加、缺失、插入、取代或修饰是容许的，只要它们不消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保持与原抗体类似的抗原特异性。
术语“嵌合抗体”是指其中可变区源自一个物种而恒定区源自另一物种的抗体，例如其中可变区源自小鼠抗体而恒定区源自人抗体的抗体。
术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其免疫原性决定部分特异性结合或反应的多肽片 段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：可变轻链片段、可变重链片段、Fab片段、F(ab’)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、线性抗体、单链抗体(scFv)及由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体等。
术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ECD。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象存在并且包括至少3-15个氨基酸。由给定的抗体确定其结合的表位的方法是本领域熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“双特异性结合分子”、“多特异性结合分子”分别指对两种或更多种不同抗原(或表位)具有特异性的结合分子(例如抗体或包含抗体片段的分子)，优选双特异性抗体。
使用本公开中的可变区制作抗体、结合分子、双特异性结合分子或多特异性结合分子时，恒定区没有特别限定，可以使用本领域技术人员公知的恒定区或者自行获得的恒定区，还可以在恒定区部分导入氨基酸突变(例如提高或降低与Fcγ受体或FcRn的结合的突变)。
获得本公开的结合分子、抗原结合片段、抗体、双特异性结合分子或多特异性结合分子的方法没有特别限制，可通过任意方法获得，例如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明的结合分子、抗原结合片段、抗体、双特异性结合分子或多特异性结合分子可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。
术语“抗体药物偶联物”(ADC)是指已共价偶联治疗活性物质或活性药物成分(API)的抗体，从而治疗活性物质或活性药物成分(API)可以靶向至抗体的结合靶标以表现出其药理学功能。治疗活性物质或活性药物成分可以是能够杀死ADC靶向的细胞的细胞毒素，优选恶性或癌细胞。治疗活性物质、活性药物成分或细胞毒素的共价连接可以以非位点特异性方式利用偶联有效载荷至赖氨酸或半胱氨酸残基的标准化学接头进行，或者优选地，缀合以位点特异性方式进行，其允许完全控制缀合位点以及产生的ADC的药物比抗体比例。
术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术等。
术语“生物学活性”指抗体结合抗原并导致可测量的生物学反应的能力，所述生物学反应可以在体外或体内进行测量。
本公开的药物组合物，可以根据需要与对其为惰性的适当的药学上可接受的载体、介质等进行混和而制剂化。例如：生理盐水、灭菌水、赋形剂、稳定剂、抗氧化剂(如抗坏血酸等)、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(如EDTA等)或粘合剂等。另外，还可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白等蛋白质、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化物、甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇。在制为注射用水溶液时，可举出例如生理盐水、含葡萄糖和其它辅药的等渗液，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，还可以与适当的助溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子型表面活性剂(聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188、HCO-50)等并用。另外，通过在制剂中混合透明质酸酶(hyaluronidase)，还可以进行更大液量的皮下给药。
本公开的结合分子或抗原结合片段可与其他药物联合使用，活性成分可以混合在一起形成单一的给药单元，也可分别独立成为给药单元，分别使用。
术语“有效量”指本公开的抗体或片段的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“药盒”或“试剂盒”包括有效量的一种或多种单位剂型的本公开的药物组合物。在一些实施方案中，药盒可 含有无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合于保持药物的材料制成。此外，药盒还包括将本公开的药物组合物给予个体的说明书。说明书中通常包含使用本公开的药物组合物来治疗疾病的方法。
本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。
本文所用的术语“肿瘤”指的是一种以细胞或组织的病理性增生为特征的疾病，及其随后的迁移或侵袭其他组织或器官。肿瘤生长通常是不受控制的和进行性的，不诱导或抑制正常细胞增殖。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如“J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002”中所述的条件)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.人DLL3及食蟹猴DLL3抗原信息
实施例中使用的人DLL3的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：105)(Uniprot ID：Q9NYJ7)如下所示，其购买自恺佧生物(货号DLL-HM103)。
注释：双横线部分为信号肽(1-26)；划横线部分为DLL3胞外区(27-492)；点横线部分为跨膜区(493-513)；斜体部分为胞内区(514-618)。
实施例中使用的食蟹猴DLL3(cyno-DLL3)的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：106)(Uniprot ID：A0A2K5WSR4)如下所示，其购买自恺佧生物(货号CM103)。
注释：双横线部分为信号肽(1-26)；划横线部分为DLL3胞外区(27-490)；点横线部分为跨膜区(491-513)；斜体部分为胞内区(514-618)。
实施例2.同家族成员DLL1及DLL4抗原信息
实施例中使用的人DLL1的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：107)(Uniprot ID：O00548)如下所示，其购买自义翘神州(货号11635-H08H)。
注释：双横线部分为信号肽(1-17)；划横线部分为DLL3胞外区(18-545)；点横线部分为跨膜区(546-568)；斜体部分为胞内区(569-723)。
实施例中使用的人DLL4的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：108)(Uniprot ID：Q9NR61)如下所示，其购买自义翘神州(货号10171-H08H)。
注释：双横线部分为信号肽(1-26)；划横线部分为DLL3胞外区(27-529)；点横线部分为跨膜区(530-550)；斜体部分为胞内区(551-685)。
实施例3.骆驼免疫，仅重链的抗体免疫文库的构建
用人DLL3抗原(实施例1中所述)对骆驼进行免疫。免疫的日期分别为第0天、第21天、第35天、第49天，共免疫4次。分别在第28天、第42天、第73天抽取血样分离出血清，利用蛋白水平ELISA检测血清中免疫应答反应情况。检测血清效价大于1：128000，结束免疫，对免疫的骆驼重新抽取血样100mL，按制造商说明书使用Solarbio公司淋巴细胞分离液分别分离骆驼PBMC，提取总RNA(OMEGA细胞总RNA提取试剂盒)后用Takara PrimeScript TM II反转录试剂盒合成cDNA做模板，用设计的特异性引物进行巢式PCR扩增出VHH基因片段，回收VHH片段后通过Sfi I酶切连接到pADL-23c噬菌粒载体上，TG1电转化感受态细胞建成DLL3骆驼免疫文库(库容为1.12E8)。
实施例4.骆驼来源的抗DLL3的阳性克隆的筛选
为了获得可与人DLL3和食蟹猴DLL3交叉结合的阳性抗体，将上述文库扩增加入M13K07helper phage组装成噬菌体后，投入1×10 12pfu骆驼免疫文库噬菌体与结合在磁珠上生物素化的人DLL3蛋白(8μg/mL)室温孵育1h，0.05％PBST洗去未结合噬菌体后，用100mM三乙基胺将与DLL3特异性结合的噬菌体洗脱下来，梯度稀释后侵染对数期生长的大肠杆菌SS320后涂在氨苄平板上37℃过夜培养；挑取单克隆进行IPTG诱导表达，上清用于ELISA检测。ELISA板上分别包被2μg/ml人DLL3或食蟹猴DLL3抗原4℃过夜，0.05％PBST清洗3次后用5％脱脂牛奶室温封闭1h，0.05％PBST清洗3次后每孔加入诱导的上清30μL，阴性对照孔加入培养基，室温孵育1h，最后用anti-Myc HRP检测(IPTG诱导表达出的VHH带有his和c-Myc标签)；将ELISA测试得到的结合人和食蟹猴DLL3的OD450值大于1.0，且与结合培养基阴性对照的ELISA OD450比值均大于3的克隆进行测序，获得本公开的5个重链抗体可变区的氨基酸序列，结果如表1所示：
表1骆驼来源的抗DLL3的5个重链抗体可变区的氨基酸序列
在上述氨基酸序列的基础上，利用Kabat编号规则划分抗体可变区的CDR和FR，每个抗体的3个CDR序列组成如下表2所示。
表2骆驼来源的抗DLL3的5个重链抗体的CDR序列
实施例5.骆驼来源的抗DLL3嵌合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬时转染表达
将测序完成的本公开的重链抗体可变区与人IgG1恒定区拼接后生成的目的基因片段克隆到pTT5表达载体中，制备转染级别的表达质粒。重链抗体可变区可以通过连接短肽与人IgG1恒定区连接，即形成：重链抗体可变区-连接短肽-人IgG1恒定区。本实施中采用的连接短肽序列为GGGGS。
引入的人IgG1恒定区序列(SEQ ID NO：109)如下：
在无血清培养基中培养Expi293F TM细胞(Thermo Fisher Scientific)，将细胞接种在摇瓶(Corning Inc.)中，并在37℃，8％CO 2的环境中置于摇床上培养。调整细胞密度，将含有目的基因片段的重组表达载体和PEI转染试剂按照合适的比例混合，并添加进细胞培养摇瓶中，细胞培养6天后收集表达上清，高速离心去除细胞碎片，用Protein A柱进行亲和纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，换液到PBS分装备用。对最终纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及HPLC纯度分析和A280浓度测定。
实施例6.骆驼来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞的结合
HEK293细胞(来自中科院)转染cyno-DLL3抗原全长基因(序列见实施例1)，进行细胞培养传代，单克隆挑选，流式鉴定单克隆细胞DLL3蛋白的表达水平，扩大培养，冻存入库备用。
培养SHP-77和HEK293-cyno DLL3细胞，SHP-77细胞的培养基为RPMI1640+10％FBS，HEK293-cyno DLL3细胞的培养基为DMEM+10％FBS+200μg/ml Hygromycin(潮霉素)，使用T75细胞培养瓶置于37℃5％CO 2培养箱培养。待细胞使用时使用无菌DPBS洗细胞，0.25％胰酶EDTA消化约5分钟后用完全培养基终止。
将消化好的细胞以1000rpm转速常温离心5分钟，弃上清，用100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞。细胞计数，并将细胞密度调整到1E6/mL，铺到96孔圆底培养板(corning 3799)中，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清，4℃放置备用。用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体样品，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。使用稀释好的抗体重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育1小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。用1％BSA(在PBS中)按照说明书1:200稀释二抗(goat anti human IgG Fc PE)，用稀释好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，300目纱布过滤细胞，流式细胞仪检测PE通道平均荧光强度。
从流式细胞仪导出FCS文件，用flowjo软件分析每个样本的PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC 50)和最高平均荧光强度(Top MFI)，结果如表3及附图1所示。
表3抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞的结合
实施例7.骆驼来源的抗DLL3重链抗体的人源化设计
通过序列比对选择与候选重链抗体同源性较高的胚系基因序列作为VHH移植框架模板。将候选抗体CDR区嫁接至选定的人抗体可变区框架后，进行个别氨基酸的回复突变，得到人源化抗体，人源化可变区氨基酸序列如表4。
表4骆驼来源的抗DLL3的7个人源化抗体可变区的氨基酸序列
实施例8.骆驼来源的抗DLL3的人源化抗体的制备
参照实施例5所述，将人源化抗体的可变区与人IgG1恒定区拼接后生成的目的基因片段克隆到pTT5表达载体中，制备转染级别的表达质粒。
在无血清培养基中培养Expi293F TM细胞(Thermo Fisher Scientific)，将细胞接种在摇瓶(Corning Inc.)中，并在37℃，8％CO 2的环境中置于摇床上培养。调整细胞密度，将含有目的基因片段的重组表达载体和PEI转染试剂按照合适的比例混合，并添加进细胞培养摇瓶中，细胞培养6天后收集表达上清，高速离心去除细胞碎片，用Protein A柱进行亲和纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，换液到PBS分装备用。对最终纯化的人源化抗体进行SDS-PAGE及HPLC纯度分析和A280浓度测定。
实施例9.骆驼来源的抗DLL3人源化抗体的体外细胞结合验证
培养SHP-77和HEK293-cyno DLL3细胞，SHP-77细胞的培养基为RPMI1640+10％FBS，HEK293-cyno DLL3细胞的培养基为DMEM+10％FBS+200μg/ml Hygromycin(潮霉素)，使用T75细胞培养瓶置于37℃5％CO 2培养箱培养。待细胞使用时使用无菌DPBS洗细胞，0.25％胰酶EDTA消化约5分钟后用完全培养基终止。
将消化好的细胞以1000rpm转速常温离心5分钟，弃上清，用100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞。细胞计数，并将细胞密度调整到1E6/mL，铺到96孔圆底培养板(corning 3799)中，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清，4℃放置备用。用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体样品，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。使用稀释好的抗体重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育1小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。用1％BSA(在PBS中)按照说明书1:200稀释二抗(goat anti human IgG Fc PE)，用稀释好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，300目纱布过滤细胞，流式细胞仪检测PE通道平均荧光强度。
从流式细胞仪导出FCS文件，用flowjo软件分析每个样本的PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC 50)和最高平均荧光强度(Top MFI)，结果如表5及附图2所示。
表5抗DLL3人源化抗体与表达DLL3细胞的结合
实施例10.骆驼来源的抗DLL3人源化抗体的Biacore亲和力实验
使用Biacore 8K仪器分析抗DLL3人源化抗体与人DLL3的亲和力和动力学性质。CM5芯片先用EDC和NHS活化，然后固定抗人Fc的鼠单抗，再用乙醇胺封闭。
为测定与人DLL3的亲和力与动力学性质，DLL3人源化抗体用HBS-EP+(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％P20)缓冲液稀释至0.2μg/mL，以10μL/min的流速捕获45s。人DLL3两倍逐级稀释至系列浓度(100nM-0.39nM)，以50μL/min的流速结合90s，解离600s。
每一轮实验结束后，使用3M MgCl 2溶液冲洗以30μL/min的流速冲洗30s，将捕获的抗体连同抗原一起去除，完成芯片的再生。原始数据使用Biacore Insight Evaluation Software(3.0.12.15655)软件进行分析，以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，结果如表6所示。
表6抗DLL3人源化抗体与人DLL3抗原蛋白的亲和力测定结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
DLL3-3 2.15E+06 2.74E-04 1.27E-10
hDLL3-3-1 1.91E+06 5.80E-04 3.04E-10
hDLL3-3-2 1.95E+06 7.76E-04 3.99E-10
DLL3-26 3.82E+05 1.23E-05 3.22E-11
hDLL3-26 2.10E+05 3.55E-04 1.69E-09
DLL3-122 9.32E+04 3.92E-04 4.21E-09
hDLL3-122 9.85E+04 4.66E-04 4.73E-09
实施例11.骆驼来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL1及DLL4的结合实验
将抗原蛋白human DLL1(SinoBiological，货号11635-H08H)或human DLL4(SinoBiological，货号10171-H08H)溶解在1×PBS中，浓度为1μg/mL。然后将抗原加到高亲和力ELISA板中(Biolegend，货号423501)，100μL/孔，4℃放置过夜。用PBST洗涤抗原，300μL/孔，洗三遍。用1％BSA(在PBST中)封闭抗原，200μL/孔，37℃孵育1.5小时。
用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。PBST洗涤板子，300μL/孔，洗三遍。将稀释好的抗体加入到ELISA板中，100μL/孔，常温孵育2小时。用PBST洗涤抗体，300μL/孔，洗三遍。用1％BSA(在PBST中)稀释二抗(用于DLL4的山羊抗人IgG Fc(HRP),1:20000稀释；用于DLL1的HRP山羊抗鼠IgG(H+L)，1:10000稀释)。将稀释好的二抗加入到ELISA板中，100μL/孔，常温孵育1小时。PBST洗涤板子，300μL/孔，洗6遍。配置显色液(TMA与TMB 1:1混合)，将显色液加入到板中，100μL/孔，避光孵育5分钟。加入50μL ELISA终止液到板中，摇匀。
在envision上读取OD450，用OD450在GraphPad上作图求EC 50值。结果如图3所示，显示所测抗体与同家族蛋白DLL1及DLL4均无非特异结合。
实施例12.制备骆驼来源的抗DLL3人源化抗体的变体
经过对本公开的重链抗体进行翻译后修饰(PTM)分析，发现hDLL3-3-1的可变区中存在1个脱酰胺位点，对第103位氨基酸进行单个位点的定点突变，制备两个hDLL3-3-1的突变体：分别是hDLL3-3-1-NA和hDLL3-3-1-QS。上述两个变体的可变区氨基酸序列如表7所示。
表7 hDLL3-3-1人源化抗体变体的氨基酸序列
参照实施例5所述，制备上述2个变体，经哺乳动物细胞系瞬转表达后，使用SHP-77细胞进行亲和力检测，结果参见表8及图4，显示2个变体能够在细胞水平的结合不发生明显变化的情况下去除翻译后修饰风险。使用人 DLL3抗原蛋白进行亲和力检测结果参见表9。
表8 hDLL3-3-1人源化抗体变体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合
表9 hDLL3-3-1人源化抗体变体与人DLL3抗原蛋白的亲和力测定结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
hDLL3-3-1 1.36E+06 6.14E-04 4.50E-10
hDLL3-3-1-NA 1.29E+06 1.35E-04 1.05E-10
hDLL3-3-1-QS 1.22E+06 6.11E-03 5.02E-09
实施例13.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3抗体的获得
抗DLL3单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用Swiss Webster白小鼠，雌性，6周龄(Charles River公司)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。免疫抗原为带His标签的人DLL3重组蛋白(huDLL3-His)。用Titermax(sigma Lot Num：T2684)为佐剂。抗原与佐剂(titermax)比例为1:1，抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、35、56天，在进行脾细胞融合前3天加强免疫。期间用ELISA及FACS方法检测小鼠血清，确定小鼠血清中的抗体滴度。在第5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，采用优化的电融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞( CRL-8287 TM)进行融合得到杂交瘤细胞。
融合后的杂交瘤细胞培养7-14天后，取培养基上清，使用DLL3重组蛋白，ELISA实验对杂交瘤上清进行抗体筛选，得到的阳性抗体株进一步使用稳转表达DLL3的CHO-K1细胞，对比空白CHO-K1细胞以排除非特异性结合抗体杂交瘤株，用流式分选方法进行筛选，从而选定结合重组蛋白且也结合细胞表达抗原的杂交瘤。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA并反转录(PrimeScript TM Reverse Transcriptase，Takara#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326Rev.B 0503)进行PCR扩增后测序，获得本公开的10个单克隆抗体可变区的氨基酸序列，如表10A所示。
表10A小鼠杂交瘤来源的抗DLL3的10个单克隆抗体可变区的氨基酸序列
在上述氨基酸序列的基础上，利用Kabat编号规则划分抗体可变区的CDR和FR，每个抗体的6个CDR序列组成如下表10B所示。
表10B小鼠杂交瘤来源的抗DLL3的10个单克隆抗体的CDR序列
实施例14.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3嵌合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬时转染表达
将测序完成的本公开的单抗重链可变区及轻链可变区分别与IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区拼接后生成的目的基因片段克隆到pTT5表达载体中，制备转染级别的表达质粒。
在无血清培养基中培养Expi293F TM细胞(Thermo Fisher Scientific)，将细胞接种在摇瓶(Corning Inc.)中，并在37℃，8％CO 2的环境中置于摇床上培养。调整细胞密度，将含有目的基因片段的重组表达载体和PEI转染试剂按照合适的比例混合，并添加进细胞培养摇瓶中，细胞培养6天后收集表达上清，高速离心去除细胞碎片，用Protein A柱进行亲和纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，换液到PBS分装备用。对最终纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及HPLC纯度分析和A280浓度测定。
实施例15.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3嵌合抗体的体外细胞结合验证
培养SHP-77和HEK293-cyno DLL3细胞，SHP-77细胞的培养基为RPMI1640+10％FBS，HEK293-cyno DLL3细胞的培养基为DMEM+10％FBS+200μg/ml Hygromycin(潮霉素)，使用T75细胞培养瓶置于37℃5％CO 2培养箱培养。待细胞使用时使用无菌DPBS洗细胞，0.25％胰酶EDTA消化约5分钟后用完全培养基终止。
将消化好的细胞以1000rpm转速常温离心5分钟，弃上清，用100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞。细胞计数，并将细胞密度调整到1E6/mL，铺到96孔圆底培养板(corning 3799)中，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清，4℃放置备用。用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体样品，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。使用稀释好的抗体重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育1小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。用1％BSA(在PBS中)按照说明书1:200稀释二抗(goat anti human IgG Fc PE)，用稀释好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，300目纱布过滤细胞，流式细胞仪检测PE通道平均荧光强度。
从流式细胞仪导出FCS文件，用flowjo软件分析每个样本的PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC 50)和最高平均荧光强度(Top MFI)，结果如表11及附图5所示。
表11小鼠杂交瘤来源的抗DLL3嵌合抗体与表达DLL3细胞的结合
实施例16.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3抗体的人源化
10个嵌合抗体经过表达纯化测试及细胞水平结合测试等，进一步挑选3个克隆进行人源化设计。
鼠源抗人DLL3单克隆抗体人源化如本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种抗体序列。在所获得的鼠源抗体VH/VL CDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与人源抗体种系数据库比较，获得同源性高的人种系模板。
将鼠源抗体的CDR区移植到选择好的相应人源化模板上，替换人源化可变区，再与IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，设计了由如下人源化轻重链可变区序列组合而成的抗体，如表12所示。
表12小鼠杂交瘤来源的3个人源化抗体可变区的氨基酸序列
实施例17.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体的体外细胞结合验证
培养SHP-77细胞，SHP-77细胞的培养基为RPMI1640+10％FBS，使用T75细胞培养瓶置于37℃5％CO 2培养箱培养。待细胞使用时使用无菌DPBS洗细胞，0.25％胰酶EDTA消化约5分钟后用完全培养基终止。
将消化好的细胞以1000rpm转速常温离心5分钟，弃上清，用100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞。细胞计数，并将细胞密度调整到1E6/mL，铺到96孔圆底培养板(corning 3799)中，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清，4℃放置备用。用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体样品，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。使用稀释好的抗体重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育1小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。用1％BSA(在PBS中)按照说明书1:200稀释二抗(goat anti human IgG Fc PE)，用稀释好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃孵育0.5小时。1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。160μL 1％BSA(在PBS中)重悬洗涤，1500rpm转速4℃离心5分钟，弃上清。100μL 1％BSA(在PBS中)重悬细胞，300目纱布过滤细胞，流式细胞仪检测PE通道平均荧光强度。
从流式细胞仪导出FCS文件，用flowjo软件分析每个样本的PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC 50)和最高平均荧光强度(Top MFI)，结果如表13及附图6所示。
表13小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与表达DLL3细胞(SHP-77)的结合
实施例18.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体的Biacore亲和力实验
使用Biacore 8K仪器分析抗DLL3人源化抗体与人DLL3的亲和力和动力学性质。CM5芯片先用EDC和NHS活化，然后固定抗人Fc的鼠单抗，再用乙醇胺封闭。
为测定与人DLL3的亲和力与动力学性质，DLL3人源化抗体用HBS-EP+(10mM HEPES,pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％P20)缓冲液稀释至0.2μg/mL，以10μL/min的流速捕获45s。人DLL3两倍逐级稀释至系列浓度(100nM-0.39nM)，以50μL/min的流速结合90s，解离600s。
每一轮实验结束后，使用3M MgCl 2溶液冲洗以30μL/min的流速冲洗30s，将捕获的抗体连同抗原一起去除，完成芯片的再生。原始数据使用Biacore Insight Evaluation Software(3.0.12.15655)软件进行分析，以(1∶1)Langmuir模型进行拟合，结果如表14所示。
表14小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与人DLL3抗原蛋白的亲和力测定结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 3.13E+05 1.80E-04 5.76E-10
H-46A5A4 2.19E+05 1.78E-04 8.11E-10
H2-45E4D7 2.35E+05 5.78E-05 2.46E-10
实施例19.小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体与同家族蛋白DLL1及DLL4的结合实验
将抗原蛋白human DLL1(SinoBiological，货号11635-H08H)或human DLL4(SinoBiological，货号10171-H08H)溶解在1×PBS中，浓度为1μg/mL。然后将抗原加到高亲和力ELISA板中(Biolegend，货号423501)，100μL/孔，4℃放置过夜。用PBST洗涤抗原，300μL/孔，洗三遍。用1％BSA(在PBST中)封闭抗原，200μL/孔，37℃孵育1.5小时。
用1％BSA(在PBS中)稀释待测抗体，起始浓度为100nM，10倍往下稀释7个浓度。PBST洗涤板子，300μL/孔，洗三遍。将稀释好的抗体加入到ELISA板中，100μL/孔，常温孵育2小时。用PBST洗涤抗体，300μL/孔，洗三遍。用1％BSA(在PBST中)稀释二抗(用于DLL4的山羊抗人IgG Fc(HRP),1:20000稀释；用于DLL1的HRP山羊抗鼠IgG(H+L)，1:10000稀释)。将稀释好的二抗加入到ELISA板中，100μL/孔，常温孵育1小时。PBST洗涤板子，300μL/孔，洗6遍。配置显色液(TMA与TMB 1:1混合)，将显色液加入到板中，100μL/孔，避光孵育5分钟。加入50μL ELISA终止液到板中，摇匀。
在envision上读取OD450，用OD450在GraphPad上作图求EC 50值。结果如图7所示，显示所测抗体与同家族蛋白DLL1及DLL4均无非特异结合。
实施例20.制备小鼠杂交瘤来源的抗DLL3人源化抗体的变体
经过对本公开的抗体进行翻译后修饰(PTM)分析，发现H2-39E2D11的轻链可变区中存在1个脱酰胺位点，对第99位氨基酸进行单个位点的定点突变，制备三个H2-39E2D11的突变体：分别是H2-39E2D11-NA，H2-39E2D11-QS和H2-39E2D11-AS。上述三个变体的可变区氨基酸序列如表15所示。
表15 H2-39E2D11人源化抗体变体的氨基酸序列
参照实施例5所述，制备上述3个变体，经哺乳动物细胞系瞬转表达后，使用SHP-77细胞进行亲和力检测，结果参见图8，显示变体能够在细胞水平的结合不发生明显变化的情况下去除翻译后修饰风险。使用人DLL3抗原蛋白进行亲和力检测结果参见表16。
表16A H2-39E2D11人源化抗体变体与人DLL3抗原蛋白的亲和力测定结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 1.81E+05 1.34E-04 7.39E-10
H2-39E2D11-NA 2.47E+05 1.20E-04 4.84E-10
H2-39E2D11-QS 1.71E+05 3.91E-05 2.29E-10
H2-39E2D11-AS 2.06E+05 3.62E-04 1.76E-09
表16B H2-39E2D11人源化抗体变体与食蟹猴DLL3抗原蛋白的亲和力测定结果
克隆号 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
H2-39E2D11 2.21E+05 3.16E-05 1.43E-10
H2-39E2D11-NA 2.33E+05 8.09E-05 3.46E-10
H2-39E2D11-QS 1.98E+05 8.59E-05 4.34E-10
H2-39E2D11-AS 2.62E+05 4.27E-04 1.63E-09
上文所述的本公开的实施方案仅为示例性的，任何本领域技术人员都可以认识到或者可以确定无数的特定化合物、材料和操作的等价物，而不需要进行超出常规的试验。所有这些等价物都是在本公开范围之内的，并且被权利要求所包含。

Claims (14)

  1. 一种DLL3结合分子或其抗原结合片段，其特征在于：所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：
    a)SEQ ID NO：6、7和8；或
    b)SEQ ID NO：9、10和11；或
    c)SEQ ID NO：12、13和14；或
    d)SEQ ID NO：15、16和17；或
    e)SEQ ID NO：18、19和20；或
    f)SEQ ID NO：6、7和110；或
    g)SEQ ID NO：6、7和111；
    优选地，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：1-5、21-29任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：1-5、21-29任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
  2. 一种DLL3结合分子或其抗原结合片段，其特征在于：所述DLL3结合分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：
    a)SEQ ID NO：57、58、59、60、61和62；或
    b)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和68；或
    c)SEQ ID NO：69、70、71、66、67和68；或
    d)SEQ ID NO：72、73、74、75、76和77；或
    e)SEQ ID NO：78、79、80、81、82和83；或
    f)SEQ ID NO：84、85、86、87、88和89；或
    g)SEQ ID NO：84、85、86、90、91和92；或
    h)SEQ ID NO：93、94、95、96、97和98；或
    i)SEQ ID NO：99、100、101、75、76和77；或
    j)SEQ ID NO：72、73、74、102、103和104；或
    k)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和112；或
    l)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和113；或
    m)SEQ ID NO：63、64、65、66、67和114；
    优选地，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：30、32、34、35、37、39、42、44、46、49或51任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或
    所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一的氨基酸序列，或者包含与SEQ ID NO：31、33、36、38、40、41、43、45、47、48、50、52、53、54、55或56任一具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
    更优选地，所述重链可变区和轻链可变区分别包含选自以下组的序列：
    1)SEQ ID NO：30和31；或
    2)SEQ ID NO：32和33；或
    3)SEQ ID NO：34和33；或
    4)SEQ ID NO：35和36；或
    5)SEQ ID NO：37和38；或
    6)SEQ ID NO：39和40；或
    7)SEQ ID NO：39和41；或
    8)SEQ ID NO：42和43；或
    9)SEQ ID NO：44和36；或
    10)SEQ ID NO：35和45；或
    11)SEQ ID NO：46和47；或
    12)SEQ ID NO：46和48；或
    13)SEQ ID NO：49和50；或
    14)SEQ ID NO：51和52；或
    15)SEQ ID NO：51和53；或
    16)SEQ ID NO：46和54；或
    17)SEQ ID NO：46和55；或
    18)SEQ ID NO：46和56。
  3. 如前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段，其还具有以下特征的一种或多种：
    i)其还包含重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含Fc；更优选地，Fc来源于鼠或人；更优选地，Fc的序列是天然的或经过修饰的；
    ii)所述DLL3结合分子或其抗原结合片段为单克隆抗体、双特异性结合分子、多特异性结合分子、人源化抗体、嵌合抗体、改型抗体、全人源抗体、全长抗体、重链抗体、纳米抗体、Fab、Fv、scFv、F(ab’) 2、线性抗体或单结构域抗体；和/或
    iii)其为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
  4. 一种偶联物，其特征在于：将前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成；优选地，所述检测标记物包括放射性核素、发光物质、有色物质或酶。
  5. 一种抗体药物偶联物，其特征在于：将前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段与其他生物活性分子偶联形成；优选地，所述其他生物活性分子为小分子药物；优选地，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段与所述其他生物活性分子通过接头连接。
  6. 编码前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段的核酸，或者包含所述核酸的重组载体，或者包含所述核酸或所述重组载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为原核细胞(优选大肠杆菌)，或者真核细胞(优选哺乳动物细胞或酵母；进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞或HEK293细胞)。
  7. 制备前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。
  8. 前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段在制备治疗或缓解肿瘤的药物中的用途；
    优选地，所述药物靶向DLL3异常表达的肿瘤细胞；优选地所述肿瘤选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
  9. 前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段在制备检测试剂或诊断试剂中的用途；
    优选地，所述检测试剂用于检测DLL3的表达；所述诊断试剂用于诊断肿瘤；优选地，所述肿瘤选自：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
  10. 一种检测样品中DLL3表达的方法，所述方法包括：
    (1)将样品与前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段接触；
    (2)检测所述DLL3结合分子或其抗原结合片段与DLL3的复合物的形成；任选地，所述DLL3结合分子或其抗原结合片段是被可检测地标记的。
  11. 一种药物组合物，其包含有效量的前述任一权利要求所述的DLL3结合分子或其抗原结合片段、或者包含有效量的权利要求5所述的抗体药物偶联物、或者包含有效量的权利要求6所述的核酸或者重组载体或者宿主细胞；
    优选地，其还包含药学上可接受的载体；优选地，其还包含一种或多种额外的其他治疗剂。
  12. 一种药盒或试剂盒，其包括容器，以及位于容器中的如权利要求11所述的药物组合物。
  13. 一种诱导表达DLL3的细胞死亡的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求11所述的药物组合物接触，所述表达DLL3的细胞是肿瘤细胞；
    优选地，所述肿瘤细胞是选自以下肿瘤的细胞：小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌。
  14. 一种治疗受试者中与表达DLL3相关的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用如权利要求11任一所述的药物组合物和/或如权利要求12所述的药盒或试剂盒；
    优选地，所述疾病是肿瘤；小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、神经内分泌癌、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌以及上述肿瘤的转移癌；
    更优选地，还包括向所述受试者给予额外的治疗剂。
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