CN117043192B - 针对IL-13Rα2的抗体及其应用 - Google Patents
针对IL-13Rα2的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
提供抗IL‑13Rα2的抗体或其抗原结合片段、包含所述抗体或其抗原结合片段的衍生物以及药物组合物。此外，还提供所述抗体或其抗原结合片段在治疗、预防或检测与IL‑13Rα2受体相关疾病方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明涉及针对IL-13Rα2受体的抗体或其抗原结合片段、包含所述抗体或其抗原结合片段的衍生物、药物组合物及其在治疗与IL-13Rα2受体相关疾病方面的相关应用。
背景技术
IL-13主要是由活化T细胞产生的12KD的多效性细胞因子，可在B淋巴细胞，内皮细胞，单核细胞等诸多细胞中通过由IL-4Rα，IL-13Rα1和IL-13Rα2组成的复杂受体系统发挥效应。IL-13Rα1单独和IL-13结合能力很弱，但与IL-4Rα形成异源二聚体后却可组成高亲和力的IL-13受体复合物，并激活Janus蛋白激酶/信号转导子及转录激活子(JAK/STAT)信号通路发挥功能。目前已证实IL-13与多种疾病如哮喘，湿疹，纤维化及肿瘤等密切相关。IL-13Rα2比IL-13Rα1更易与IL-13结合，所以它能与IL-13Rα1竞争结合IL-13，并阻断JAK/STAT信号通路介导的功能。
IL-13Rα2是相对分子量为56KD的糖基化蛋白，包括380个氨基酸，人和小鼠的蛋白序列的同源性有59％。人的IL-13Rα1与IL-13Rα2的胞外区同源性有33％，IL-13Rα2胞内区有17个氨基酸残基，缺乏和JAK相互作用的区域。IL-13Rα2在正常组织中不表达或少量表达(如人的睾丸)。在多种癌细胞上有较高的表达，如人胶质母细胞瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌等。
人神经胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，占颅内恶性肿瘤的48.3％。年发病率在3-10/10万，平均生存率低于15个月，5年生存率低于3％。目前脑胶质瘤的治疗没有突破性进展，仍用传统的外科手术加经静脉或口服化疗加经颅放疗的综合治疗为主，治疗效果非常有限。因此开发新的靶点和新的治疗手段是广大病人的迫切需求。研究发现IL-13Rα2在正常脑组织不表达，在脑胶质瘤中表达，且病理级别越高其表达越强。IL-13Rα2高表达的病人预后较差，可以作为脑胶质瘤治疗的特异性靶标。人IL-13Rα2作为人神经胶质瘤的治疗靶点早在1988年已引起美国FDA的注意，先后制备了针对人IL-13Rα2治疗靶点的药物IL-13-PE38和针对人IL-13Rα2的单链抗体scFv-PE融合分子。尽管IL-13-PE38在神经胶质瘤，头颈部肿瘤，卵巢癌和肾癌等恶性肿瘤的治疗中取得了疗效并被FDA批准进入临床期治疗，但由于在治疗过程中，IL-13-PE38不仅与肿瘤细胞表面特异性表达的IL-13Rα2结合，也可以与表达于正常组织细胞表面的IL-13Rα1结合，损伤正常组织和细胞。由于缺乏严格的靶向性，限制了IL-13-PE38的进一步应用。目前针对IL-13Rα2的细胞疗法和疫苗疗法也在开发中。
发明概述
本公开提供了一种抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性地结合人类和食蟹猴IL-13Rα2。
在一些实施方案中，提供一种抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，其包含选自SEQ ID NO：61，64，67，70，73，76，79，82，85，88，91，94，97，100，103，106，109，112，115，118，121，124，127，130，133，136，139，142，145，148，151，154，157，160，163，166，169，172，175，178，181，184，187，190，193，196，199，202所示的HCDR1；以及，选自SEQ ID NO：62，65，68，71，74，77，80，83，86，89，92，95，98，101，104，107，110，113，116，119，122，125，128，131，134，137，140，143，146，149，152，155，158，161，164，167，170，173，176，179，182，185，188，191，194，197，200，203所示的HCDR2；以及，选自SEQ ID NO：63，66，69，72，75，78，81，84，87，90，93，96，99，102，105，108，111，114，117，120，123，126，129，132，135，138，141，144，147，150，153，156，159，162，165，168，171，174，177，180，183，186，189，192，195，198，201，204所示的HCDR3。
在一些实施方案中，提供一种抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63；或SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69；或SEQID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75；或SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78；或SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQID NO：81；或SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84；或SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87；或SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90；或SEQ ID NO：91、SEQID NO：92和SEQ ID NO：93；或SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96；或SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99；或SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102；或SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105；或SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107和SEQID NO：108；或SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：111；或SEQ ID NO：112、SEQ IDNO：113和SEQ ID NO：114；或SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117；或SEQ IDNO：118、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120；或SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123；或SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126；或SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：129；或SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132；或SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134和SEQ ID NO：135；或SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137和SEQ ID NO：138；或SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140和SEQ ID NO：141；或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144；或SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：147；或SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149和SEQ ID NO：150；或SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153；或SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156；或SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：159；或SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：162；或SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：165；或SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：168；或SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：171；或SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：174；或SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：177；或SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：180；或SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182和SEQ ID NO：183；或SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185和SEQ ID NO：186；或SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188和SEQ ID NO：189；或SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191和SEQ ID NO：192；或SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194和SEQ ID NO：195；或SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197和SEQ ID NO：198；或SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200和SEQ ID NO：201；或SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：204。
在一些实施方案中，提供一种抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3来自于SEQ ID NO：13-60，205-219所示的重链可变区。
在一些实施方案中，提供一种抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，包含重链可变区，所述重链可变区具有与SEQID NO：13-60，205-219所示序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，提供所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是重组抗体，优选的，为骆驼源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，提供根据本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是纳米抗体/VHH，优选的，为人源化的骆驼科VHH。
在一些实施方案中，提供本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，其还包括重链恒定区和/或轻链恒定区，优选的，所述重链恒定区包括Fc或变体Fc，Fc来源于鼠或人。
在一些实施方案中，提供本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，其铰链区及Fc来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
在一些实施方案中，提供本公开所述的一种偶联物，将前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成，所述的检测标记物包括放射性核素、发光物质、有色物质或酶。
在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其中的一个抗原结合结构域包含前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其中的一个抗原结合结构域包含前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供一种抗体药物缀合物，含有前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段，所述的抗体药物缀合物由抗体-接头-毒素相互连接形成。
在一些实施方案中，提供一种嵌合抗原受体，其胞外抗原结合域包含前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，提供编码前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段的核酸。
在一些实施方案中，提供本公开所述的核酸的重组载体。
在一些实施方案中，提供一种宿主细胞，其包含本公开所述的重组载体或基因组中整合本公开所述的核酸。
在一些实施方案中，提供本公开所述抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合的条件下培养本公开所述的宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。
在一些实施方案中，提供本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段在制备特异性靶向表达IL-13Rα2的细胞的药物中的用途，优选的，所述细胞包括A375细胞，U251细胞及U87细胞。
在一些实施方案中，提供本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段在制备癌症、感染性疾病或者炎性或自身免疫性疾病药物中的用途，优选的，所述肿瘤包括：胶质瘤，黑色素瘤，胰腺癌，卵巢癌，肾癌，头颈癌，乳腺癌，白血病，侵袭性淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，脑胶质瘤，宫颈癌，直肠癌，肝癌，肺癌，胃癌等。
在一些实施方案中，提供本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段在制备表达IL-13Rα2的疾病的诊断试剂中的用途。
在一些实施方案中，提供一种含有IL-13Rα2的抗体的溶液制剂，其包含抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段和缓冲液。
在一些实施方案中，提供本公开所述的一种用于鉴定个体中IL-13Rα2表达细胞的存在的方法，所述方法包括从包含细胞的个体获得生物样品，使所述细胞与本公开所述的抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段接触，以及评估所述抗体是否与所述细胞结合。在一些实施方案中，提供一种药物组合物，其包含有效量的前述任一抗IL-13Rα2的抗体或其抗原结合片段、或包含有效量的双特异性抗体、或包含有效量的多特异性抗体、或包含有效量的抗体药物缀合物、或包含有效量的嵌合抗原受体、或包含有效量的核酸、或包含有效量的重组载体、或包含有效量的宿主细胞。
在一些实施方案中，提供本公开所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，提供本公开所述的药物组合物，还包含一种或多种额外的其他治疗剂，优选的所述一种或多种额外的其他治疗剂包括：化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性治疗剂、癌症疫苗、减瘤剂、靶向性抗癌剂、抗血管生成剂、生物反应修饰剂、细胞因子、激素、抗转移剂和免疫治疗剂。
在一些实施方案中，提供一种药盒或试剂盒，其包括容器，以及位于容器中的本公开所述的药物组合物。
附图说明
附图更进一步说明了本说明书所公开的新特性。参照这些附图将能更好地理解本说明书中所公开的特性和优点，但应当理解，这些附图仅用于说明本文所公开原理的具体的实施方案，而非意欲对所附权利要求的范围加以限制。
图1显示了ELISA检测的抗IL-13Rα2抗体与IL-13Rα2蛋白的结合情况。
图2A-1显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体hI-8，hI-22，hI-101，hI-104，hI-129，hI-133，hI-146，hI-166，hI-214与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系A375细胞的结合情况。
图2A-2显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体hI-1，hI-10，hI-204与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系A375细胞的结合情况。
图2B显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体与高表达人IL-13Rα2的稳定细胞株细胞(人IL-13Rα2-CHOK1细胞)的结合情况。
图2C-1显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体hI-8，hI-22，hI-101，hI-104，hI-129，hI-133，hI-146，hI-166，hI-214与高表达食蟹猴IL-13Rα2的稳定细胞株细胞(食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1细胞)的结合情况。
图2C-2显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体hI-1，hI-10，hI-204与高表达食蟹猴IL-13Rα2的稳定细胞株细胞(食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1细胞)的结合情况。
图2D显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系U251细胞的结合情况。
图2E显示了流式细胞术检测的抗IL-13Rα2抗体与高表达IL-13Rα2的肿瘤细胞系U87细胞的结合情况。
图3显示了流式细胞术检测的A375肿瘤细胞中抗IL-13Rα2抗体的内吞情况。
具体实施方式
术语
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和个别地指示将各个别公布、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
在下文详细描述本公开前，应理解本公开不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本公开的范围。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
本文所公开的某些实施方案包含了数值范围，并且本公开涉及的某些方面可采用范围的方式描述。除非另有说明，应当理解数值范围或者以范围描述的方式仅是出于简洁、便利的目的，并不应当认为是对本公开的范围的严格限定。因此，采用范围方式的描述应当被认为具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的所有可能的具体数值点，正如这些子范围和数值点在本文中已经明确写出。例如，从1至6的范围的描述应当被认为具体公开了从1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及在这些范围内的具体的数值点，例如1、2、3、4、5、6。不论所述数值的宽窄，上述原则均同等适用。当采用范围描述时，该范围包括范围的端点。
当涉及可测量值比如量、暂时持续时间等时，术语“约”是指包括指定值的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化。
本文所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Bio1.Chem，243，p3558(1968)中所述。
常规的免疫球蛋白是四聚体，由两条重链和两条轻链组成，组合分子量约150kD。在骆驼科(Camelidae)成员中，相当比例的血清抗体是同源二聚体IgG，分子量约80kD(Hamers-Casterman等人.1993Nature，363，446-448)。这些重链免疫球蛋白(Ig)包含三个结构域，其可变区被称为VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)。为了稳定扩大的CDR，除了常规的二硫键以外，在单峰骆驼CDR1和CDR3之间，在美洲驼的CDR2和CDR3之间，VHH可具有额外的二硫键(Harmsen和De Haard 2007ApplMicrobiol Biotechnol.，77，13-22；Muyldermans 2001 J Biotechnol.，74，277-302)。扩大的CDR3环可以采取凸面构象，而常规的互补位被限制在凹的或者平面结构(Muyldermans2001J Biotechnol.，74，277-302)。这些特征允许VHH识别对于常规抗体而言免疫原性较差的独特表位(Lafaye等人.2009 Mol Immuno.，46，695-704；Wernery 2001 J Vet Med BInfect Dis Vet Public Health.，48，561-568)。尽管VHH被定义为单价抗体，默认排除任何亲合力效果，被测量表示为体外IC50的生物活性可类似于常规的二价抗体分子(Thys等人.2010 Antiviral Res.，87：257-264)。
术语“单克隆抗体”是指由单一细胞克隆产生的基本均质、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物、合成技术或上述技术的组合等。
在某些实施方式中，本公开可涉及嵌合的骆驼科动物/人抗体，特别是其中VH结构域完全是骆驼科动物序列(例如大羊驼或阿尔帕卡羊驼)，而抗体的其余部分完全是人序列的嵌合抗体。在本公开的一些优选实施方式中，还包括“人源化”或“种系化”的骆驼科抗体以及骆驼科/人嵌合抗体，其中VH结构域相对于通过主动免疫获得的骆驼科VH结构域来说在框架区包含一个或多个氨基酸替换。用人种系VH结构域中的对应残基来取代起始骆驼科VH结构域中的不匹配氨基酸残基，这样的“人源化”过程提高了与人种系VH结构域的序列一致性百分比。
根据本公开的VHH能够是单体的形式或者同源多聚体的形式，如同源二聚体或同源三聚体。
本公开的抗体包括骆驼源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
“人源化抗体(humanized antibody)”，是指将骆驼的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量骆驼蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(https：//www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/)中获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。
“VHH”涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen等人.2000EMBO J.，19，921-930；Muyldermans 2001，JBiotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot等人.2011 Antiviral Res 92，389-407)。
通常纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其中，FR1-FR4分别是指框架区(Frame)1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补决定区1-3。
术语“Fc”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的形成二聚体的两条多肽链。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端，例如，IgG Fc域包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
需说明的是，本公开的单克隆抗体可变区的CDR和FR的划分是根据Kabat定义确定的。而其他命名和编号系统，例如Chothia、IMGT或AHo等，也是本领域技术人员已知的。因此，以本公开的单抗序列为基础，包含任何命名系统衍生的一种或多种CDR的人源化抗体均明确地保持在本公开的范围内。
术语“序列同一性”或“序列相似性”或“序列同源性”，是指在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守置换视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“抗体片段”包含完整抗体的至少一部分。如在此所使用，抗体分子的“片段”包括抗体的“抗原结合片段”，并且术语“抗原结合片段”是指免疫球蛋白或抗体中与所选抗原或其抗原表位特异性结合或反应的多肽片段，或由此片段进一步衍生的融合蛋白产物，例如单链抗体，嵌合抗原受体中的胞外结合区等。示例性的抗体片段或其抗原结合片段包括但不限于：纳米抗体或其全部或部分CDR、线性抗体及由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体等。
术语“多特异性抗体”是指，将抗体通过功能连接(例如化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方法)至一个或多个其他结合分子上，从而形成与两个以上不同位点和/或靶点结合的新的抗体构建体。其中，使用较多的是“双特异性抗体”，其特指针对两种不同抗原具有特异性的抗体构建体。通常，双特异性抗体或多特异性抗体至少包括2个抗原结合结构域。
术语“抗原”是指被抗体或抗体结合片段识别并特异性结合的物质，广义上，抗原可以包括所选靶标的任何免疫原性片段或决定簇，包括单表位、多表位、单结构域、多结构域、或完整的胞外结构域(ECD)或蛋白质。肽、蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质，其部分及其组合均可构成抗原。非限制性示例性抗原包括肿瘤抗原或病原体抗原等。“抗原”也可以指引发免疫反应的分子。任何形式的抗原或含有该抗原的细胞或制剂都可以用于生成对抗原决定簇具有特异性的抗体。抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白(例如，用在其表面上表达至少一部分抗原的细胞进行免疫的)、或可溶性蛋白质(例如，仅用该蛋白质的ECD部分进行免疫的)或蛋白质构建体(例如，Fc抗原)。该抗原可以在基因修饰的细胞中产生。前述任何抗原可以单独或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强佐剂组合使用。编码该抗原的DNA可以是基因组的或非基因组的(例如，cDNA)，并且可以编码足以引起免疫原性应答的至少一部分ECD。可以使用任何载体来转化其中表达抗原的细胞，所述载体包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、质粒以及非病毒载体如阳离子脂质。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。由给定的抗体确定其结合的表位的方法是本领域熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链、环状或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，特别是保守修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还包括改性的氨基酸聚合物例如已经通过硫酸化、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、转移-RNA介导的氨基加成如精氨酸化、泛在化、或任何其他操作如与标记组分缀合等改性的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸以及D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。“衍生自”指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。该术语还包括由指定的核酸序列表达的多肽。
术语“氨基酸修饰”(或“修饰的氨基酸”)包括在多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代S32A指第32位的丝氨酸被丙氨酸替换。
人源化抗体可变区与人类抗体可变区的序列同一性或同源性可以如在此所论述的进行测定，并且当这样测量时，将优选地共享至少60％或65％的序列同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％或90％的序列同一性，甚至更优选至少93％、95％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸置换而不同。“保守取代”是一个氨基酸残基被具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基替换的氨基酸取代。一般而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他相似侧链的氨基酸残基替换本公开抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整以校正该取代的保守性质。人源化胚系基因序列的选择(Germline序列)来源于IMGT网站(http：//www.imgt.org/genedb/)。
术语“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。术语“KD”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离常数。可以使用本领域已知的各种技术来确定结合亲和力，例如表面等离子体共振、生物层干涉法、双极化干涉法、静态光散射、动态光散射、等温滴定量热法、ELISA、分析超速离心和流式细胞术等。
术语“竞争结合”或“竞争性抗体”通常是指，与本公开涉及的抗体结合相同表位的抗体，其结合导致本公开涉及的抗体与抗原表位的结合被抑制或阻断，在竞争测定中可以得到竞争性抑制的程度。
术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药用载体”或“药学上可接受的载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。
术语“有效量”指本公开涉及的抗体或片段的药物制剂的剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的患者中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如人种差异；体重、年龄和健康状况；涉及的具体疾病；疾病的严重程度；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文所用的术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
术语“稳定转染”或“稳转”是指将外源核酸、DNA或RNA引入和整合到转染细胞的基因组中。术语“稳定转染体”(stable transfectant)是指将外来DNA稳定地整合到基因组DNA中的细胞。
术语“核酸分子编码”、“编码DNA序列”和“编码DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，核酸序列编码氨基酸序列。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或其抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，(2001)ISBN：012441351上获得。
本公开工程化的抗体或其抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。
本文所用的术语“个体”或“受试者”是指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开涉及的个体包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如食蟹猴或恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
本文所用的术语“疾病”或“病症”或“紊乱”等是指任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的改变或失调。例如，所述的“疾病”包括但不限于：肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病、T细胞功能障碍性疾病、或免疫耐受能力缺陷(如移植排斥)。
本文所用的术语“治疗”是指在试图改变个人或处理细胞引起的疾病过程中的临床干预，既可以进行预防也可以在临床病理过程干预。治疗效果包括但不限于，防止疾病的发生或复发、减轻症状、减少任何疾病直接或间接的病理后果、防止转移、减慢疾病的进展速度、改善或缓解病情、缓解或改善预后等。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人IL-13Rα2及食蟹猴IL-13Rα2序列信息
表1序列信息
实施例2人IL-13Rα2及食蟹猴IL-13Rα2细胞系的制备
将编码SEQ ID NO：1所示的人IL-13Rα2氨基酸的核苷酸序列，克隆至载体中，从而获得用于人IL-13Rα2细胞系构建的载体。将所获得的载体转染至CHOK1细胞(ATCC，货号CCL-61)中，获得表达人IL-13Rα2的CHOK1细胞系(简称：人IL-13Rα2-CHOK1)。
将编码SEQ ID NO：2所示的食蟹猴IL-13Rα2氨基酸的核苷酸序列，克隆至载体中，获得用于食蟹猴IL-13Rα2细胞系构建的载体。将所获得的载体转染至CHOK1细胞中，获得表达食蟹猴IL-13Rα2的CHOK1细胞系(简称：食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1)。
实施例3骆驼VHH重链抗体免疫文库的构建
用SEQ ID NO：3所示的人IL-13Rα2抗原对骆驼进行免疫。免疫的日期分别为第0天，第14天，第28天，第42天，共免疫4次。分别在第28天，第42天，第49天抽取血样分离出血清，利用ELISA检测血清中免疫应答反应情况。检测血清效价大于1∶10000时，结束免疫。对免疫的骆驼重新抽取血样各100mL，进行如下操作：
1.使用淋巴细胞分离液(Solarbio公司)，按照操作分别分离骆驼PBMC；
2.使用细胞总RNA提取试剂盒(OMEGA公司)，按照操作分别提取骆驼总RNA；
3.使用PrimeScriptTM II反转录试剂盒(Takara公司)，按照操作分别合成骆驼cDNA；
4.以上述获得的cDNA做模板，使用下述SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：12所示的特异性引物进行巢式PCR扩增；
第一轮PCR
SEQ ID NO：4(上游引物)：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
SEQ ID NO：5(下游引物)：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
第二轮PCR
SEQ ID NO：6(上游引物)：
ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG
SEQ ID NO：7(上游引物)：
ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG；
SEQ ID NO：8(上游引物)：
ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG；
SEQ ID NO：9(下游引物)：
GGTGTTGGCCTCCCGGGCCACTAGTGCTKGAGACRGTGACCTGGGT；
SEQ ID NO：10(下游引物)：
GGTGTTGGCCTCCCGGGCCACTAGTGCTKGAGACRGTGACCAGGGT；
SEQ ID NO：11(下游引物)：
GGTGTTGGCCTCCCGGGCCACTAGTTGAKGAGACRGTGACCTGGGT；
SEQ ID NO：12(下游引物)：
GGTGTTGGCCTCCCGGGCCACTAGTTGAKGAGACRGTGACCAGGGT。
5.扩增获得骆驼VHH基因片段。
回收上述扩增获得的骆驼VHH片段，通过Sfi I酶切，连接到pADL-23c(Biovector)噬菌粒载体上，电转化TG1大肠杆菌感受态细胞建成骆驼VHH重链抗体免疫文库。IL-13Rα2骆驼免疫文库库容为2.842E8，阳性率95％。
实施例4特异性结合IL-13Rα2的阳性克隆的筛选
为了获得可与人IL-13Rα2和食蟹猴IL-13Rα2交叉结合的阳性抗体，将上述文库扩增加入M13K07 helperphage组装成噬菌体后，投入3.2×1011pfu骆驼免疫文库噬菌体与结合在磁珠上生物素化的人IL-13Rα2蛋白室温孵育1h，0.05％PBST洗去未结合的噬菌体后，用100mM三乙基胺将与IL-13Rα2特异性结合的噬菌体洗脱下来，梯度稀释后侵染对数期生长的大肠杆菌SS320，在氨苄平板上37℃过夜培养；挑取单克隆进行IPTG诱导表达，上清用于ELISA检测。ELISA板上分别包被2μg/ml人IL-13Rα2抗原4℃过夜，0.05％PBST清洗3次后用5％脱脂牛奶室温封闭1h，0.05％PBST清洗3次后每孔加入诱导的上清30μl，阴性对照孔加入培养基，室温孵育1h，最后用anti-Myc HRP检测(IPTG诱导表达出的VHH带有his和c-Myc标签)；将ELISA测试得到的结合人IL-13Rα2的OD450与结合培养基阴性对照的ELISAOD450比值均大于3的克隆进行测序，获得本公开的48个重链抗体可变区的氨基酸序列，结果如表2所示：
表2 48个重链抗体可变区的氨基酸序列
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在上述氨基酸序列的基础上，利用Kabat编号规则划分抗体可变区的CDR和FR，每个抗体的3个CDR序列组成如下表3所示。表3中括号内数字表示序列号，例如(61)即代表SEQID NO：61。
表3 48个重链抗体可变区的CDR序列
/>
/>
对上述表2中的48个ELISA阳性的抗体上清，进一步用FACS确认和IL-13Rα2阳性表达的细胞A375(ATCC，货号：CRL-1619)的结合情况。种板A375细胞，加入抗体上清，4℃孵育1小时，FACS buffer清洗2次，加入anti-c-myc-FITC，4℃孵育1小时，FACS buffer清洗2次后流式细胞仪检测抗体与细胞的结合。48个重链抗体中有26个抗体和细胞有结合，26个抗体以及对应的重链抗体可变区序列分别为：IL-13Rα2-I-1(SEQ ID NO：13)，IL-13Rα2-I-3(SEQ ID NO：43)，IL-13Rα2-I-7(SEQ ID NO：56)，IL-13Rα2-I-8(SEQ ID NO：58)，IL-13Rα2-I-10(SEQ ID NO：14)，IL-13Rα2-I-22(SEQ ID NO：40)，IL-13Rα2-I-28(SEQ ID NO：42)，IL-13Rα2-I-34(SEQ ID NO：47)，IL-13Rα2-I-41(SEQ ID NO：50)，IL-13Rα2-I-46(SEQ IDNO：52)，IL-13Rα2-I-49(SEQ ID NO：53)，IL-13Rα2-I-78(SEQ ID NO：57)，IL-13Rα2-I-95(SEQ ID NO：60)，IL-13Rα2-I-101(SEQ ID NO：15)，IL-13Rα2-I-104(SEQ ID NO：16)，IL-13Rα2-I-105(SEQ ID NO：17)，IL-13Rα2-I-112(SEQ ID NO：19)，IL-13Rα2-I-129(SEQ IDNO：21)，IL-13Rα2-I-133(SEQ ID NO：22)，IL-13Rα2-I-146(SEQ ID NO：24)，IL-13Rα2-I-148(SEQ ID NO：25)，IL-13Rα2-I-158(SEQ ID NO：27)，IL-13Rα2-I-166(SEQ ID NO：30)，IL-13Rα2-I-204(SEQ ID NO：34)，IL-13Rα2-I-208(SEQ ID NO：35)和IL-13Rα2-I-214(SEQID NO：38)。
实施例5抗IL-13Rα2抗体的人源化设计
选择实施例4中筛选获得的编号为IL-13Rα2-I-1，IL-13Rα2-I-7，IL-13Rα2-I-8，IL-13Rα2-I-10，IL-13Rα2-I-22，IL-13Rα2-I-28，IL-13Rα2-I-41，IL-13Rα2-I-101，IL-13Rα2-I-104，IL-13Rα2-I-129，IL-13Rα2-I-133，IL-13Rα2-I-146，IL-13Rα2-I-166，IL-13Rα2-I-204和IL-13Rα2-I-214的抗IL-13Rα2抗体进行人源化设计。
通过序列比对选择与抗IL-13Rα2抗体同源性较高的胚系基因序列作为VHH移植框架模板。将抗IL-13Rα2抗体CDR区嫁接至选定的人抗体可变区框架后，根据结构回复突变部分氨基酸，得到人源化抗体。抗IL-13Rα2抗体编号，对应胚系基因序列及人源化抗体编号的对应关系如表4所示。
表4 15个重链抗体的人源化序列
实施例6抗IL-13Rα2人源化抗体的构建及其在真核细胞中的瞬时转染表达
将测序完成的人源化抗体的可变区与氨基酸序列如SEQ ID NO：220所示的人IgG1铰链区及Fc拼接后生成的目的基因片段克隆到pTT5表达载体(Nova lifetech)中，制备转染级别的表达质粒。
在无血清培养基中培养Expi293FTM细胞(Thermo Fisher Scientific)，将细胞接种在摇瓶(Corning公司)中，并在37℃，8％CO2的环境中置于摇床上培养。调整细胞密度，将含有目的基因片段的pTT5重组表达载体和PEI转染试剂按照合适的比例混合，并添加进细胞培养摇瓶中，细胞培养6天后收集表达上清，高速离心去除细胞碎片，用Protein A柱进行亲和纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCL，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，换液到PBS分装备用。对最终纯化的人源化抗体进行SDS-PAGE及HPLC纯度分析和A280浓度测定。结果显示所有抗体纯度均超过90％，产量超过1mg/100ml。
实施例7抗IL-13Rα2人源化抗体与IL-13Rα2蛋白的ELISA结合实验
取实施例6中获得的抗IL-13Rα2人源化抗体，用含有1％BSA的PBS分别配置抗IL-13Rα2人源化抗体溶液，最高浓度20μg/ml，3倍稀释，获得8个浓度点样品，分别为20μg/ml、6.67μg/ml、2.23μg/ml、0.74μg/ml、0.247μg/ml、0.083μg/ml、0.027μg/ml和0.009μg/ml。ELISA板上分别包被2μg/ml人IL-13Rα2抗原4℃过夜，0.05％PBST清洗3次后用5％脱脂牛奶室温封闭1h，0.05％PBST清洗3次后每孔加入30μl不同浓度的抗体，阴性对照孔加入培养基，室温孵育1h，最后用anti-human IgG Fc-HRP检测；将ELISA测试得到的结合人IL-13Rα2的OD450数值导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC50)，结果如表5及附图1所示。结果显示上述抗体均可以和IL-13Rα2蛋白结合，同时，hI-8、hI-166和hI-41与人IL-13Rα2蛋白的结合效果非常好。
表5抗IL-13Rα2人源化抗体与人IL-13Rα2蛋白的ELISA结合
| 样品名称 | EC50(nM) |
| hI-8 | 0.951 |
| hI-22 | 2.283 |
| hI-28 | 64.93 |
| hI-41 | 1.187 |
| hI-101 | 1.788 |
| hI-104 | 1.301 |
| hI-129 | 1.811 |
| hI-133 | 1.253 |
| hI-146 | 2.55 |
| hI-166 | 1.136 |
| hI-214 | 2.453 |
实施例8抗IL-13Rα2人源化抗体与表达IL-13Rα2细胞的结合
培养实施例2中所制备得到的人IL-13Rα2-CHOK1和食蟹猴IL-13Rα2-CHOK1稳定细胞株以及高表达人IL-13Rα2的A375(ATCC，货号：CRL-1619)，U251(中科院)及U87(ATCC，货号：HTB-14)肿瘤细胞系，用0.25％胰酶(含EDTA)消化后，加入完全培养基终止反应。1500rpm离心5分钟弃上清，使用含有1％BSA的PBS重悬后计数。将细胞密度调整到1E6/ml，以100μL/孔，接种到corning-3799号96孔培养板中培养，在37℃，8％CO2的环境中培养过夜，之后将96孔培养板以1500rpm离心5分钟弃上清，4℃放置备用。
取上述实施例中获得的抗IL-13Rα2人源化抗体，用含有1％BSA的PBS分别配置抗IL-13Rα2人源化抗体溶液，最高浓度10μg/ml，3倍稀释，获得8个浓度点样品，分别为10μg/ml、3.33μg/ml、1.11μg/ml、0.37μg/ml、0.12μg/ml、0.041μg/ml、0.014μg/ml和0.005μg/ml。
用配置好的抗体重悬细胞培养板，100μL/孔。将重悬好的细胞培养板在4℃冰箱孵育1小时。1500rpm离心5分钟，弃上清，160μL含1％BSA的PBS洗涤一遍，弃上清备用。用含1％BSA的PBS配置二抗(goat anti hum an IgG Fc PE)，1∶200稀释。用配置好的二抗重悬细胞，100μL/孔，4℃冰箱孵育0.5小时。1500rpm离心5分钟，弃上清，160μL含1％BSA的PBS洗涤一遍，弃上清，100μL含1％BSA的PBS重悬细胞，300目纱布过滤细胞，然后在流式细胞仪上分析抗体与细胞结合的平均荧光强度。从流式细胞仪导出FCS文件，用Flowjo软件分析PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体与细胞的半数结合浓度(以下简称EC50)和最高平均荧光强度(Top MFI)，结果如表6及附图2A，2B，2C，2D，2E所示。结果显示hI-8，hI-1，hI-104，hI-10及hI-204与细胞表面的人及食蟹猴IL-13Rα2蛋白均有强结合。
表6抗IL-13Rα2人源化抗体与表达IL-13Rα2细胞的结合
表7抗IL-13Rα2人源化抗体与表达IL-13Rα2细胞的结合
实施例9抗体的细胞内吞实验
高表达人IL-13Rα2的A375肿瘤细胞系，用0.25％胰酶(含EDTA)消化细胞约2分钟，加入完全培养基终止反应。1500rpm离心5分钟弃上清，使用含有1％BSA的PBS重悬后计数。将细胞密度调整到1.5E6/ml，以100μL/孔，接种到96孔培养板中培养，加入不同浓度的待测抗体，样品分布放于冰上孵育0分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，150分钟及180分钟。PBS洗板一次，加入二抗，4℃孵育30分钟。PBS洗板后重悬细胞，流式细胞仪上分析抗体与细胞结合的平均荧光强度。从流式细胞仪导出FCS文件，用Flowjo软件分析PE通道平均荧光强度(以下简称MFI)，将分析得出的平均荧光强度导入Graphpad分析抗体的内化率，结果如图3所示。结果表明IhI-8的内吞比例最低，hI-133和hI-22的内吞比例较高。
实施例10特异性结合IL-13Rα2人源化抗体的Octet亲和力实验
将人源化后的抗体固定在AHC传感器(赛多利斯，货号：18-5060)表面，并且配置不同浓度的对应抗原。使用多浓度梯度法分别测定各抗原浓度下的结合解离曲线，软件拟合后得到抗体抗原间的亲和力数值。具体而言，将AHC传感器放置在仪器(Octet)内，30℃预热10min。将待测抗体样品使用kinetic buffer(PBST，0.1％BSA)稀释至5μg/mL，配置在样品板中。将对应的抗原(hum an IL-13Rα2-his，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)使用kinetic buffer分别稀释至100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.125nM，3.125nM，并配置在样品板中。
使用多浓度梯度法进行实验，步骤依次为loading抗体180s，结合300s，解离600s，使用pH1.5 Glycine-HCl作为再生试剂，进行再生，再生30s/次，共3次。
实验完成后，采用1∶1 binding模型，使用Octet仪器数据分析软件对实验结果进行拟合计算，得到Ka(结合速率常数)，Kd(解离速率常数)，KD(亲和力，KD＝Kd/Ka)数值。结果如表8所示。结果显示表8中的抗IL-13Rα2人源化抗体均与人IL-13Rα2抗原蛋白结合，其中hI-22的结合力较强，KD值为3.57×10-10M，其它抗体的结合力在10-9M。
表8抗IL-13Rα2人源化抗体与人IL-13Rα2抗原蛋白的亲和力测定结果
| Ka | Kd | KD | |
| hI-8 | 5.96E+05 | 3.75E-03 | 6.30E-09 |
| hI-22 | 9.78E+04 | 3.49E-05 | 3.57E-10 |
| hI-101 | 2.07E+05 | 5.62E-04 | 2.72E-09 |
| hI-104 | 3.56E+05 | 6.34E-04 | 1.78E-09 |
| hI-129 | 1.19E+05 | 6.72E-04 | 5.67E-09 |
| hI-133 | 1.22E+06 | 2.00E-03 | 1.65E-09 |
| hI-146 | 8.93E+04 | 6.77E-04 | 7.58E-09 |
| hI-214 | 1.25E+05 | 2.28E-04 | 1.83E-09 |
实施例11抗IL-13Rα2人源化抗体的物理稳定性测试
抗体具有三个过渡区，Tm1相对于Fab部分，Tm2相对于Fc部分的CH2结构域，Tm3相对于Fc部分的CH3结构域(较高的Tm决定了较高的稳定性)，Tagg为起始聚集温度。利用NanoDSF(差示荧光扫描技术)检测不同抗体在pH7.4 PBS缓冲液中的热稳定性。样品浓度在1mg/ml左右，利用Prometheus NT.Plex仪器进行检测。检测前，将各个样品10000g离心10分钟。样品板每个孔加入40μl样品(仪器上样量为10μl，每个样品均有一个复孔)。扫描温度从30℃开始到95℃结束，扫描速率0.5℃/min。实验结果如表9所示结果显示测试的人源化抗体的Tm1值均超过60℃，Tagg值超过75℃，具有良好的热稳定性。
表9抗IL-13Rα2人源化抗体的NanoDSF检测结果
| Tonset | Tm1 | Tm2 | Tagg | |
| hI-1 | 54.2℃ | 62.5℃ | 69.7℃ | 77.5℃ |
| hI-7 | 63.5℃ | 69.1℃ | 76.1℃ | 78.1℃ |
| hI-10 | 60.1℃ | 65.8℃ | NA | 78.9℃ |
| hI-204 | 65.1℃ | 70.0℃ | 80.8℃ | 75.1℃ |
上文所述的本公开的实施方案仅为示例性的，任何本领域技术人员都可以认识到或者可以确定无数的特定化合物、材料和操作的等价物，而不需要进行超出常规的试验。所有这些等价物都是在本公开范围之内的，并且被权利要求所包含。
Claims (22)
1.一种抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，所述重链抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，其包含重链可变区，所述重链可变区包含下组的HCDR1、HCDR2和HCDR3：SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197和SEQ ID NO：198。
2.一种抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，所述重链抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-13Rα2，其包含SEQ ID NO：58所示的重链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中所述重链抗体是重组抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中所述重链抗体是骆驼源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中所述重链抗体是纳米抗体/VHH。
6.根据权利要求5所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中所述重链抗体是人源化的骆驼科VHH。
7.根据权利要求1或2所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其还包括重链恒定区。
8.根据权利要求7所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区包括Fc或变体Fc，Fc来源于鼠或人。
9.根据权利要求8所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段，其中铰链区及Fc来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
10.一种偶联物，将前述权利要求任一项所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段与捕获标记物或检测标记物偶联形成，所述的检测标记物包括放射性核素、发光物质、有色物质或酶。
11.一种双特异性抗体或多特异性抗体，其中的一个抗原结合结构域包含权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段。
12.编码权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段的核酸。
13.包含权利要求12所述核酸的重组载体。
14.包含权利要求13所述重组载体或基因组中整合有权利要求12所述核酸的宿主细胞。
15.制备权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合的条件下培养权利要求14的宿主细胞，并从所述细胞中纯化获得表达产物。
16.权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段在制备治疗或检测特异性靶向表达IL-13Rα2的癌症细胞的药物中的用途。
17.权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段在制备治疗表达IL-13Rα2的胶质瘤的药物中的用途。
18.一种含有IL-13Rα2的抗体的溶液制剂，其包含权利要求1-9所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段和缓冲液。
19.一种药物组合物，其包含有效量的前述权利要求1-9任一项所述的抗IL-13Rα2的重链抗体或其抗原结合片段、或包含权利要求10所述的有效量的偶联物，或包含权利要求11所述的有效量的双特异性抗体或多特异性抗体、或包含权利要求12所述的有效量的核酸、或包含权利要求13所述的有效量的重组载体、或包含权利要求14所述的有效量的宿主细胞。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
21.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含一种或多种额外的其他治疗剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述一种或多种额外的其他治疗剂包括：化学治疗剂、细胞毒性剂、放射性治疗剂、癌症疫苗、减瘤剂、靶向性抗癌剂、抗血管生成剂、生物反应修饰剂、细胞因子、激素、抗转移剂和免疫治疗剂。
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