CN107835820A - 识别癌症特异性IL13Rα2的CAR T细胞 - Google Patents

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Abstract

提供结合到IL13Rα2的抗原决定基的特异性结合分子或其片段，所述抗原决定基是优先发现于癌细胞而非健康细胞的表面上的受体多肽。示范性的特异性结合分子是包含IL13Rα2结合分子的片段和提供第二功能的肽的双特异性结合分子，所述第二功能提供T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能、T细胞活化的肽调节物或标记系统的酶组分。还提供编码这类特异性结合分子(例如双特异性结合分子)的聚核苷酸、载体、宿主细胞、医药组合物，和预防、治0或改善与癌症疾病如实体肿瘤疾病(例如多形性成胶质细胞瘤)相关的症状的方法。

Description

识别癌症特异性IL13Rα2的CAR T细胞
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求2015年1月26日提交的美国临时专利申请第62/107,980号和2015年10月23日提交的美国临时专利申请第62/245,771号的优先权权益，所述申请的公开内容均以全文引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入以电子版提交的材料
本申请含有呈计算机可读形式的序列表作为本公开的单独部分，所述序列表以全文引用的方式并入并且标识如下：文件名：49923A_Seqlisting.txt；176,301个字节，2016年1月22日生成。
技术领域
本公开大体上涉及癌症生物学领域并且涉及分子抗体-受体技术。
背景技术
癌症对人类和非人类动物的健康具有重大威胁，其降低生活品质并且在太多情况下导致死亡。就所需的来源和人力来说，置于国家、区域和地方保健组织上的治疗和预防各种形式癌症的负担相当重。脊椎动物(包括人类)必须对抗疾病的一种主要武器是功能免疫系统。简单考虑治疗或预防癌症的免疫疗法可以让人得出如下结论：由于免疫系统提防外来或非自身物质并且癌细胞起因于内部，即其是自身物质，因此努力后成功的希望极小。然而，在我们的理解中，癌症和免疫学的持续进展正在可见地改善。
例如在小鼠中突变体抗原是肿瘤破坏的有力标靶，并且在患者中靶向这些突变的肿瘤-浸润淋巴细胞引起持久的肿瘤消退。然而，对于疫苗方法，非突变体抗原已经被许多科学家推测为是癌症特异性或“相对癌症特异性”并且安全的抗原。然而，过继转移的T 细胞可以在数量级上比接种更有效并且更具破坏性。因此，在现在停止的临床试验中用 T细胞靶向MAGE-A3、HER-2或CEA已引起死亡或产生严重毒性(8-11)。如在2002 年显示，具有极高或极低表达水平的靶抗原的癌细胞仅在免疫应答诱导中不同，而在效应阶段不如此(15)。
高亲和力白介素-13受体α2(IL13Rα2)由多形性成胶质细胞瘤(GBM)以及若干其它肿瘤类型以高频率选择性地表达。靶向这种肿瘤特异性受体的一种方法利用缀合到细胞毒性分子的同源配位体IL-13。然而，这种方法缺乏特异性，因为针对IL-13、IL13Rα1 的较低亲和力受体由正常组织广泛地表达。
大多数的人类癌症缺乏可预测地存在并且充当有效标靶以由T细胞根除的特异性抗原。每一癌细胞类型具有产生不同肿瘤特异性抗原的独特的突变集合。尽管技术取得了巨大进展，但仍难以鉴别有效独特的抗原并且分离适当TCR用于自体T细胞的转导而用于过继免疫疗法。使用抗体或T细胞的过继免疫疗法在临床上以及实验上是最有效的免疫疗法，至少当考虑临床相关癌症时如此(22)。然而，使用嵌合抗体受体(CAR) 和双特异性T细胞啮合蛋白(BiTE)的过继免疫疗法的显著成功在很大程度上受限于特异于患者中的CD19/CD20根除B细胞恶性病和正常B细胞的那些者，即，造血癌症。因此，需要对大范围实体肿瘤鉴别共享但具肿瘤特异性的抗原，并且同时需要开发可以诊断、预防、治疗或改善这些癌症的症状的预防剂和治疗剂，以及用于诊断、预防和治疗各种癌症的方法。
发明内容
本文公开表达特异性地识别并且结合于α2白介素13受体(即，IL13Rα2)的嵌合抗原受体(即，CAR)的T细胞。IL13Rα2特异性CAR一般在本文中被称作47-CAR，当在T细胞中表达时其有效地靶向并且杀死IL13Rα2阳性靶细胞。也公开确立如下的证据：具有短间隔区或SSR的47-CAR(即，47-CAR.SSR)展现以抗原依赖性方式诱导IL2 产生的更大能力。本文进一步公开47-CAR.SSR T细胞在体内具有有效的抗肿瘤活性的实验证据。
本公开提供(i)特异性靶向人类肿瘤相关抗原IL13Rα2的单克隆抗体(即，克隆 47抗体)的重链(SEQ ID NO：7)和轻链(SEQ ID NO：8)可变区的序列，和(ii)展现由重链和轻链cDNA编码的呈scFv抗体型式的蛋白质或与其它功能部分的融合体的功能性的数据。也确定重链和轻链恒定区的序列并且发现其与基因银行(Genbank)Acc. 第DQ381544.1号中的相对应序列一致。确切地说，以SEQ ID NO：104形式阐述克隆47 抗体的CH1序列，以SEQ IDNO：105形式阐述CH2并且以SEQ ID NO：106形式阐述 CH3；以SEQ ID NO：107形式阐述克隆47抗体的轻链恒定区序列；并且以SEQ ID NO：108 形式阐述克隆47抗体的铰链区。重链和轻链可以按不同型式布置，如单链抗体、双功能抗体、双特异性抗体和三特异性抗体、具有治疗蛋白和其它部分的融合体、人类或人源化全抗体以及人类或人源化Fab片段和其它功能衍生物。单链抗体或由重链和轻链编码的蛋白质的其它布置，例如双特异性结合分子，可以经过表达并且缀合到治疗载体(例如病毒、细胞、纳米材料)用于将治疗剂特异性递送到IL13Rα2过表达肿瘤中或用于使肿瘤负荷成像。
由肿瘤细胞而非正常细胞表达的蛋白质是用于选择性递送细胞毒性分子的有吸引力的分子。因此，针对白介素-13(IL-13)的高亲和力受体白介素-13受体α2(IL13Rα2) 是一种有前景的候选物。IL13Rα2以高频率在称为多形性成胶质细胞瘤(GBM)的侵蚀性并不可治愈形式的原发性脑肿瘤(1-3)中表达，以及被其它实体肿瘤(4)表达。相反，除睪丸之外，正常组织表达极少到不表达IL13Rα2(6)。值得注意地，许多组织广泛表达对IL-13具有低亲和力的一不同受体IL13Rα1(7-9)，使其成为肿瘤特异性免疫治疗应用的选择性靶向的较差候选物。
若干研究已在临床前动物模型和临床试验中所测试的患者中研究出与衍生自假单胞菌外毒素A的重组细胞毒素缀合的IL-13融合蛋白(IL-13PE)的治疗特性，所述假单胞菌外毒素A在体外诱导IL13Rα2表达神经胶质瘤细胞中的细胞凋亡(17-22)。然而，这类药剂缺乏与IL13Rα2的相互作用的高特异性，因为其替代性地结合于广泛表达的 IL13Rα1。因此，预期开发针对IL13Rα2表达细胞的特异性可以与效应子(例如T细胞、毒素)组合的高度选择性抗体片段会产生治疗有益的结果。
本公开通过提供特异于IL13Rα2的蛋白质结合伴侣而非模拟IL13自身来获得IL13Rα2的肿瘤特异性，其将产生展现结合于IL13Rα1和IL13Rα2两者的能力的分子。此外，本公开提供一种编码这些癌症特异性IL13Rα2结合伴侣中的一种的聚核苷酸，包括针对特异于这些IL13Rα2结合伴侣中的一种的抗原决定基的结合伴侣包含密码子优化编码区的聚核苷酸。明确涵盖融合蛋白或嵌合体，其包含呈连接到肽的可操作连接形式的如上文所定义的IL13Rα2结合伴侣，所述肽提供第二功能，如T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能，T细胞活化的肽调节物或标记系统的酶组分。示范性的T 细胞信号传导蛋白包括4-1BB(CD137)、CD3ζ和融合蛋白，例如CD28-CD3ζ和 4-1BBCD3ζ。4-1BB(CD137)和CD28是T细胞的共刺激分子；CD3ζ是T细胞抗原受体的信号转导组分。在某些实施例中，IL13Rα2特异性CAR可以按在不添加外源性物质情况下非活性的两个片段表达。借助于非限制性实例，CAR将由两个分子组成：1) 第一分子将含有IL13Rα2特异性scFc、铰链、跨膜域、共刺激域和杂二聚体 (heterodimerizer)域(Exto-TM-HD)，和2)第一分子将含有跨膜域、共刺激域、杂二聚体域、CD3ζ活化域(Cyto-HD)(Wu等人；《科学(Science)》.2015年10月16日； 350(6258)：aab407)。除非添加连接Exto-TM-HD和Cyto-HD的小分子例如但不限于 rapalog A/C杂二聚体，而允许药理学控制IL13Rα2-CAR活性，否则Exto-TM-HD和 Cyto-HD在细胞中的表达将产生非活性的IL13Rα2-CAR。提供第二功能的肽或蛋白质可以提供T细胞活化的调节物，如IL15、IL15Rα、IL15/IL15Rα融合体的调节物，或其可以编码适用于体内或体外监测结合的程度和/或位置的标记系统的标记物或酶组分。在本公开的一些实施例中，编码置于T细胞如自体T细胞情形下的这些预防和治疗活性生物分子的药剂提供有力的平台用于招募过继转移的T细胞，以预防或治疗各种癌症。对特异于癌细胞上发现的抗原决定基的结合伴侣的编码区的密码子优化提供一种递送本文所公开的诊断、预防和/或治疗蛋白的有效方法。
在一个方面中，本公开提供一种白介素13受体α2(IL13Rα2)结合伴侣，其包含 SEQID NO：1的抗体重链可变片段(VH)互补决定区1(CDR1)、SEQ ID NO：2的VH CDR2、SEQ ID NO：3的VH CDR3、SEQ ID NO：4的轻链(VL)互补决定区1(CDR1)、 SEQ ID NO：5的VL CDR2和SEQID NO：6的VL CDR3，其中IL13Rα2结合伴侣特异性结合到IL13Rα2的抗原决定基。在一些实施例中，VH序列阐述为SEQ ID NO：7并且在相同和一些不同实施例中的一些中，VL序列阐述为SEQ ID NO：8。
本公开的一相关方面提供一种双特异性结合分子，其包含结合于IL13Rα2抗原决定基的本文所描述的IL13Rα2结合伴侣的片段，所述片段共价连接到提供第二功能的肽以形成双特异性结合分子。在一些实施例中，肽的第二功能选自由以下组成的组：T细胞信号传导蛋白的信号传导域的信号传导功能、T细胞活化的肽调节物和标记系统的酶组分。在一些实施例中，片段是单链可变片段(scFv)，其可以含于双特异性T细胞啮合体(BiTE)或嵌合抗原受体(CAR)内。提供一些实施例，其中如本文所描述的双特异性结合分子缀合到治疗载体。
本公开的另一方面涉及一种医药组合物，其包含如本文所描述的IL13Rα2结合伴侣和药学上可接受的载剂、佐剂或稀释剂。
一相关方面提供一种试剂盒，其包含本文所描述的医药组合物和用于给予组合物的方案。也相关的是如下一方面：提供编码如本文所描述的IL13Rα2结合伴侣的聚核苷酸和包含如本文所描述的聚核苷酸的载体。又一方面是针对一种宿主细胞，其包含本文所描述的聚核苷酸或本文所描述的载体。
本公开的又一方面提供一种预防、治疗或改善癌症疾病的症状的方法，所述方法包含给予治疗有效量的如本文所描述的医药组合物。在一些实施例中，癌症是实体肿瘤，如多形性成胶质细胞瘤(GBM)。在一些实施例中，癌症通过抑制实体肿瘤的生长速率治疗。在一些实施例中，所改善的症状是疼痛。
更确切地说，本公开的一个方面涉及一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ ID NO：1)； RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；AASRQGSG(SEQ IDNO：5)和QQSKEVPWT (SEQ ID NO：6)，(B)铰链区，(C)跨膜域，以及(D)胞内域(endodomain)，所述胞内域包含信号传导域CD3ζ链和CD28的信号传导域。在一些实施例中，胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域：CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和 Myd88，任选地，其中胞内域包含SEQ ID NO：68、70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个。在一些实施例中，铰链区包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含CD28的跨膜域。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在一些实施例中，CD3ζ链信号传导域包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR 包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO 49或51的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：7 和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的一个或两个。在一些实施例中，根据权利要求9 所述的IL13Rα2特异性CAR，其中SEQ ID NO：7的氨基酸序列通过连接子融合到SEQID NO：8的氨基酸序列。在一些实施例中，连接子包含EEGEFSEAR(SEQ ID NO 10) 的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
在一相关方面中，本公开提供一种编码本文所公开或描述的任何IL13Rα2特异性CAR的核酸。在一些实施例中，核酸包含SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、 48、50、52、54、56或65的序列。
在又一方面中，本公开提供一种包含本文所公开或描述的核酸的载体。在一些实施例中，载体是反转录病毒载体。
在另一方面中，本公开提供一种包含本文所公开或描述的载体的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是人类宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，宿主细胞是自然杀伤细胞。
在一相关方面中，本公开提供一种包含本文所公开或描述的宿主细胞的细胞群体。在一些实施例中，细胞群体包含至少107个宿主细胞。
另一方面涉及一种医药组合物，其包含如本文所公开或描述的IL13Rα2特异性CAR、如本文所公开或描述的核酸、如本文所公开或描述的载体、如本文所公开或描述的宿主细胞或如本文所公开或描述的细胞群体，和药学上可接受的载剂。
本公开的另一方面提供一种治疗个体的癌症的方法，其包含以有效治疗个体的癌症的量向个体给予如本文所公开或描述的细胞群体。在一些实施例中，癌症是结肠癌。在一些实施例中，细胞群体的宿主细胞是获自个体的细胞。在一些实施例中，获自个体的细胞是T淋巴细胞。在一些实施例中，获自个体的细胞是自然杀伤细胞。
本公开的另一方面提供一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含：(A) 包含以下的氨基酸序列中的每一个的胞外域：(i)NYLMN(SEQ ID NO：1)；(ii)RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；(III)GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；(iv)RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；(v)AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和(vi) QQSKEVPWT(SEQ IDNO：6)；(B)间隔区；(C)跨膜域；和(D)选自由以下组成的组的胞内域：CD3.ζ、CD28.ζ、CD28.OX40.ζ、CD28.41BB.ζ和41BB.ζ。在一些实施例中，间隔区包含不多于100个氨基酸或不多于50个氨基酸或不多于25个氨基酸，或间隔区包含来自IgG1铰链区的SEQ ID NO：103(PKSCDKTHTCPPCPAPEL)。在一些实施例中，跨膜域包含CD28(如包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的跨膜域)或CD8α的跨膜域。在一些实施例中，胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域： CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和Myd88。在一些实施例中，胞内域包含SEQID NO：68、70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个。在包含CD3ζ链信号传导域的一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在一些实施例中， IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO 49或51的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2 特异性CAR包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的一个或两个。
本公开也涵盖其中SEQ ID NO：7的氨基酸序列通过连接子融合到SEQ ID NO：8的氨基酸序列的实施例。在一些实施例中，连接子包含EEGEFSEAR(SEQ ID NO10)的氨基酸序列。在这些实施例中的一些中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在一些实施例中，IL13Rα2特异性CAR包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55 的氨基酸序列。
本公开的另一方面涉及一种编码本文所公开的IL13Rα2特异性CAR的核酸。在一些实施例中，核酸包含SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、 56和65的序列。
本公开的再一方面涉及一种包含本文所公开的核酸的载体。在一些实施例中，载体是反转录病毒载体。
本公开的又一方面是一种包含本文所公开的载体的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是人类宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是T淋巴细胞或自然杀伤细胞。在一些实施例中，获自个体的细胞是T细胞和/或其它淋巴细胞，包括但不限于NKT细胞、γδT细胞、粘膜相关恒定T细胞或MAIT细胞和固有淋巴细胞。此外，干细胞和/或祖细胞可以获自个体，随后分化成前述免疫细胞。
本公开的另一方面是一种包含本文所公开的宿主细胞的细胞群体。在一些实施例中，细胞群体包含至少107个宿主细胞。
在另一方面中，本公开提供一种医药组合物，其包含如本文所公开的IL13Rα2特异性CAR、如本文所公开的核酸、如本文所公开的载体、如本文所公开的宿主细胞或如本文所公开的细胞群体，和药学上可接受的载剂。
本公开的又一方面是一种治疗个体的癌症的方法，其包含以有效治疗个体的癌症的量向个体给予如本文所公开的细胞群体。在一些实施例中，癌症是结肠癌。在一些实施例中，细胞群体的宿主细胞是获自个体的细胞。在一些实施例中，获自个体的细胞是T 细胞和/或其它淋巴细胞，包括但不限于NKT细胞、γδT细胞、粘膜相关恒定T细胞或 MAIT细胞和固有淋巴细胞。此外，干细胞和/或祖细胞可以获自个体，随后分化成前述免疫细胞。
在一些实施例中，通过表达CAR或BITE分子遗传修饰为具IL13Rα2特异性的免疫细胞或干细胞和/或祖细胞可以进一步经过遗传修饰以增强其抗肿瘤活性。额外遗传修饰的非限制性实例包括但不限于：i)特异于肿瘤细胞上或肿瘤环境内表达的其它抗原的 CAR或BITE，ii)细胞因子(例如各种白介素，如IL7、IL12、IL15、IL21)，iii)嵌合细胞因子受体(例如IL7R、IL15R)，iv)趋化细胞素受体(例如CCR2b、CXCR2)，iv) 嵌合活化受体(例如IL4/IL7R、IL4/IL2R、TGFβ/TLR4R)，v)沉默阴性调节因子(例如PD1、SHP1)，vi)沉默内源性TCR表达，和vii)诱导型自杀基因(例如CD20、截短EGFR、诱导型卡斯蛋白酶(caspase)9)。
本公开的其他特征和优势将从包括图式的以下详细描述变得显而易见。然而，应理解，虽然详细描述和具体实例指示优选实施例，但仅提供其用于说明，因为对于所属领域的技术人员，本发明的精神和范围内的各种改变和修改将从详细描述变得显而易见。
附图说明
专利或申请文件含有至少一个彩制图式。具有彩色图式的这一专利或专利申请公开的复本将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。
图1.杂交瘤克隆的抗原识别和筛选的表征。A：B-D13 mAb与涂布有0.1和1μg/ml的rhIL13Rα2hFc的ELISA板的结合。B：板结合的ELISA中，IL13Rα2 mAb与原生和变性(在β-巯基乙醇存在下在95℃下)rhIL13Rα2hFc的结合。配对t检验用以评估对照组(n＝4)之间的差异。*：p＜0.1；***：p＜0.001。误差棒表示S.D。这些数据是两个独立实验的代表。C：板结合的ELISA中，针对rhIL13Rα2hFc的所选择杂交瘤群体的筛选。D：使用蛋白质印迹针对rhIL13Rα2hFC的所选择杂交瘤群体的筛选。
图2.IL13Rα2(克隆47)mAb特异性结合到CHO细胞的细胞表面上表达的 rhIL13Rα2和IL13Rα2。A：板结合的ELISA中，IL13Rα2(克隆47、83807和B-D13) mAb与rhIL13Rα2的结合。B：IL13Rα2(克隆47)mAb与CHO细胞表面上表达的人类IL13Rα2的结合。C：IL13Rα2(克隆47)mAb与hrIL13Rα1的交叉反应性。D：IL13Rα2 (克隆47、83807和B-D13)mAb与小鼠rIL13Rα2的交叉反应性。误差条表示S.D。
图3.IL13Rα2 mAb与神经胶质瘤细胞的结合A：结合于神经胶质瘤细胞、正常人类原代星形胶质细胞和转染有IL13Rα2的HEK细胞的表面的IL13Rα2(克隆47、83807 和B-D13)mAb的流程图。B：通过流式细胞测量术分析的IL13Rα2(克隆47、83807 和B-D13)mAb之间与各种细胞系的结合的中位荧光强度的数据。对于每一细胞系，高于条棒的数目表示当与克隆B-D13相比较时克隆47的结合的差值。A和B的颜色键相同。C：神经胶质瘤细胞以及正常人类原代星形胶质细胞中的IL13Rα2的mRNA表达。 D：图a-c，展现IL13Rα2(克隆47)mAb与来自颅内异种移植物(xeno)的带GFP标记的U251神经胶质瘤细胞的特异性结合的流式细胞测量术。具有子图B中的曲线下的有效面积的曲线描绘mAb IL13Rα2(克隆47)与GFP阴性细胞的结合；具有子图C中的曲线下的有效面积的曲线描绘mAb IL13Rα2(克隆47)与GFP阳性细胞的结合。具有曲线下的灰色面积的子图b和c中的曲线显示当将对照IgG暴露到GFP阴性细胞(子图B)或GFP阳性(子图C)细胞时的结果。neg：阴性。A：面积；SSC-A：侧向散射面积；APC-A：别藻蓝蛋白面积。
图4.IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL13Rα2之间的亲和力。显示了IL13Rα2(克隆 47)mAb(A)和可商购mAb克隆83807(B)和B-D13(C)与rhIL13Rα2的相互作用的动力学，如通过SPR在Biacore 3000中目测。在20μl/min的恒定流速下在固定化抗体上和对照聚葡萄糖表面上以1到100nM范围内的浓度(下部到上部曲线，所显示的1 nM、2.5nM、5nM、7.5nM、10nM、15nM、20nM、25nM浓度)注射rhIL13Rα2(从信号中减去这些值)。监测缔合和解离阶段300秒，随后监测以RU给出的SPR信号的变化(彩色曲线)。黑色曲线表示数据与一个位点结合模型的拟合。对于衍生的动力学参数，参见表1。下部图显示一个位点结合模型的残数，指示极佳的拟合。
图5.IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL-13竞争IL13Rα2的结合位点。A：使用竞争结合板分析，IL13Rα2(克隆47)mAb而非对照mIgG或抗体克隆83807、B-D13和YY-23Z 显著消除rhIL-13与吸收到塑料的rhIL13Rα2Fc嵌合体的结合。进行单因素方差分析，随后进行邓尼特事后检验(Dunnett′s post hoc test)。显示单一代表性实验的数据。B：重组人类IL-13与IL13Rα2(克隆47)mAb竞争HEK细胞表面上表达的WT IL13Rα2而非4胺基酸(4aa)突变体IL13Rα2的结合位点。C：IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL-13 竞争WT和4胺基酸突变体形式的IL13Rα2的结合位点。进行配对t检验。数据表示B 和C中所示的三个独立实验的汇总。*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001。误差棒表示S.D。
图6.IL13Rα2的Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基对结合IL13Rα2(克隆47)mAb的贡献。A：产生编码IL13Rα2的突变成Ala的个别突变或组合性4胺基酸突变体 (4aamut)的cDNA的变异体。HEK细胞转染有对照载体或编码IL13Rα2变异体的载体。 48小时后，通过流式细胞测量术分析IL13Rα2(克隆47)mAb与经转染细胞的表面的结合。在这一分析中抗IL13Rα2抗体克隆83807和B-D13用作参考抗体。将抗体的结合确定为阳性细胞的百分比。确定每一IL13Rα2突变体的结合克隆的比率并且与野生型受体相比较。进行单因素方差分析，随后进行邓尼特事后检验。数据表示四个独立实验的汇总。误差棒表示S.D。B：流式细胞测量术数据的代表图，其展现克隆47或rhIL-13 与HEK细胞表面上表达的IL13Rα2受体的WT和4胺基酸突变变异体的结合。填充曲线：阴性对照，用同型对照IgG+二级抗体染色；开口曲线：用抗IL13Rα2(克隆47) 单克隆抗体+二级抗体染色。A：面积；APC-A：别藻蓝蛋白面积；FITC-A：异硫氰酸荧光素面积。
图7.N-连接糖基化对IL13Rα2与重组IL13Rα2的结合的影响。A：IL13Rα2与对照和Pngase F处理的rhIL13Rα2的结合。用1μg/ml的hrIL13Rα2涂布板并且在37℃下用天然缓冲液或用天然缓冲液中的1毫单位(milliunit)/孔Pngase F处理3小时。进行相较于抗体克隆B-D13、83807和YY-23Z以及rhIL-13，针对IL13Rα2(克隆47)mAb 的结合的ELISA，并且显示来自三个独立实验的一个代表性实验的数据。配对t检验用以评估对照组与Pngase F处理组(n＝4)之间的差异。*：p＜0.5；**：p＜0.01；***： p＜0.001。B：蛋白质印迹显示由于从分子中去除N-连接糖基化加合物，因此Pngase F 处理的rhIL13Rα2的分子量较低。C：流式细胞测量术显示在37℃下IL13Rα2 mAb与用 1毫单位Pngase F处理1小时的IL13Rα2表达U251和HEK293细胞的结合。数据是三个独立实验的代表。配对t检验用以评估对照组与Pngase F处理组之间的差异。*：p＜0.5。 MFI：平均荧光强度。误差棒表示S.D。
图8.IL13Rα2(克隆47)mAb识别GBM组织和人类神经胶质瘤异种移植物中的IL13Rα2。用3μg/ml浓度的IL13Rα2(克隆47)mAb或mIgG对来自三个人类GBM样品和U251异种移植物的冷冻组织切片上进行免疫组织化学分析。GBM组织的染色展现样品1中大多数细胞的阳性染色、样品2中仅一部分细胞的阳性反应性和样品3中的阴性染色。在同一实验中对所有三个样品进行染色。也在U251异种移植物组织中检测到阳性染色。箭头指向个别阳性细胞。比例尺＝100μm。
图9.在原位人类神经胶质瘤异种移植物模型中，IL13Rα2(克隆47)mAb提高小鼠的存活率。A：用U251神经胶质瘤细胞(2.5×104个)单独注射或与对照IgG或IL13Rα2 (克隆47)mAb组合注射的动物的存活率。B：来自用U251细胞单独注射(图a和b) 或与mIgG(图c和d)或mAbIL13Rα2(克隆47)(图e和f)组合注射的小鼠的染色有H&E的10μm厚组织切片的代表性显微照片。箭头指向肿瘤和侵入细胞。比例尺(图 a、c和e)＝100μm。比例尺(图b、d和f)＝100μm。
图10.IL13Rα2(克隆47)mAb与N10神经胶质瘤细胞表面的竞争结合分析。A.在冰上将IL13Rα2(克隆47)mAb与10×过量rhIL13Rα2一起预培育30分钟。随后将N10 细胞与同型对照mIgG或IL13Rα2(克隆47)mAb单独或在rhIL13Rα2存在下一起培育并且通过流式细胞测量术分析结合抗体。B.在冰上将N10神经胶质瘤细胞与10×过量 rhIL13(左图)或10×过量IL13Rα2(克隆47)mAb(右图)一起预培育30分钟。随后将N10细胞与同型对照mIgG、IL13Rα2(克隆47)mAb或rhIL13一起培育。用二级抗体检测结合抗体或rhIL13并且通过流式细胞测量术分析。数据呈现为阳性细胞的百分比。
图11.在已确立的人类U251神经胶质瘤下，IL13Rα2(克隆47)mAb对小鼠的存活率的影响。用2.5×104个U251神经胶质瘤细胞颅内注射小鼠并且处理三天，稍后单次注射PBS(n＝7)或10μg IL13Rα2(克隆47或B-D13)mAb(n＝7)。使用对数秩检验分析动物的存活率。相对于分别用B-D13和47IL13Rα2 mAb处理的组的23和35天的中位存活期，PBS组中的中位存活期确定为27天(p＞0.05)。
图12.板ELISA中IL13Rα2克隆47噬菌体与IL13Rα2hFc的结合。这些数据证实在3轮生物淘选后，针对IL13Rα2Fc嵌合蛋白，阳性选择存在scFv IL13Rα2(克隆47) 的噬菌体。
图13.结合scFv IL13Rα2克隆47与IL13Rα2hFc竞争性分析的特异性。这些数据显示存在于噬菌体表面上的scFvIL13Rα2(克隆47)与重组IL13Rα2的结合通过亲本单克隆抗体(克隆47)而非针对IL13Rα2的其它抗体被完全消除。其指示scFvIL13Rα2 (克隆47)和亲本单克隆抗体(克隆47)共享IL13Rα2分子上的抗原决定基(即，识别位点)。在所有图中每一个数据点是3个独立重复的平均值。数据以平均值±SEM呈现。 ***p＜0.001。
图14.可溶scFv IL13Rα2(克隆47)与IL13Rα2hFc嵌合体的结合。这些数据显示在原核表达系统(大肠杆菌(E.coli))中产生的可溶scFvIL13Rα2(克隆47)特异性结合于IL13Rα2Fc重组蛋白。亲本抗体、mAb IL13Rα2(克隆47)和对照小鼠IgG分别充当阳性和阴性对照
图15.分泌scFvIL13Rα2 sTRAIL融合蛋白的间叶干细胞对U87-IL13Rα2神经胶质瘤细胞系的影响。这些数据显示在IL13Rα2表达U87神经胶质瘤细胞系中，经修饰分泌scFvIL13Rα2(克隆47)与TRAIL蛋白的基因融合体的间叶干细胞展现治疗作用。所述结果确立将scFV结合到TRAIL细胞因子的功效。癌细胞杀死的量等效于在无scFV下单独使用TRAIL，但在靶向IL13Rα2的scFv赋予特异性的情况下，预期scFV-TRAIL 对非癌组织的危害将更小。
图16.编码IL13Rα2特异性scFv CAR的反转录病毒载体的示意性图。CAR由以下组成：免疫球蛋白重链前导肽、IL13Rα2特异性scFv克隆47(M47)、短铰链(SH)或长铰链(LH)、衍生自CD28的跨膜域(TM)和CD28.ζ胞内域。LTR：长末端重复序列(反转录病毒主链)。域被鉴别为嵌段结构。图不按比例绘制。
图17.IL13Rα2-scFv CAR T细胞剂：T细胞中相对于CAR剂的αGAPDH，αCD3.ζ的表达。SH：短铰链。LH：长铰链。
图18.IL13Rα2-scFv CAR在T细胞表面上表达。IL13Rα2-CAR T细胞由反转录病毒转导产生并且CAR表达通过FACS分析确定。短铰链CAR用特异于鼠类scFV的抗体检测。长铰链CAR用特异于长铰链的抗体检测。同型抗体对照：开口曲线；特异性抗体：填充曲线。
图19.IL13Rα2-CAR T细胞-细胞毒性的功能表征。用Raji(IL13Rα1-/IL13Rα2-)、293T(IL13Rα1+/IL13Rα2-)、经过遗传修饰以表达IL13Rα2的293T细胞(293T-IL13Rα2；IL13Rα1+/IL13Rα2+)或U373(IL13Rα1+/IL13Rα2+)细胞作为标靶进行标准51铬细胞毒性分析。使用IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞、 IL13Rα2-CAR.SH.ΔT细胞或IL13Rα2-CAR.LH.ΔT细胞作为效应子非转导(NT)T细胞。仅IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞和IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ T细胞杀死IL13Rα2+靶细胞(U373和293T-IL13Rα2；n＝4)。表达非功能性CAR(IL13Rα2-CAR.SH.Δ和 IL13Rα2-CAR.LH.Δ)的T细胞不具有溶细胞活性，证实杀死活性取决于功能性 IL13Rα2-CAR的表达。NT T细胞不杀死标靶，进一步确认特异性。
图20.IL13Rα2-CAR T细胞-IFNγ和IL2细胞因子分泌的功能表征。A.NT T细胞、IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.SH.ΔT细胞或IL13Rα2-CAR.LH.Δ T细胞与U373细胞共培养24到48小时(n＝4)。仅 IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞和IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ T细胞分泌IFNγ，证实与 IL13Rα2-CAR.SH.Δ T细胞、IL13Rα2-CAR.LH.Δ T细胞或NT T细胞相比，靶细胞的识别。B.NT T细胞、IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ T细胞、 IL13Rα2-CAR.SH.ΔT细胞或IL13Rα2-CAR.LH.Δ T细胞与U373细胞共培养24到48小时(n＝4)。仅IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞分泌IL2，证实相较于 IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ，IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ诱导优异的T细胞活化。 IL13Rα2-CAR.SH.Δ T细胞、IL13Rα2-CAR.LH.Δ T细胞或NT T细胞也不诱导IL2产生。
图21.IL13Rα2-SH CAR在体内具有抗神经胶质瘤活性。用1×105个表达萤火虫荧光素酶的U373细胞颅内注射严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。在第7天，用1×106个 IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.LH.CD28.ζ T细胞、IL13Rα2-CAR.SH.ΔT细胞或IL13Rα2-CAR.LH.Δ T细胞处理小鼠(每组5只小鼠)。通过生物发光成像监测肿瘤生长。仅IL13Rα2-CAR.SH.CD28.ζ T细胞具有显著的抗神经胶质瘤作用，其中4/5 只小鼠具有完全应答。
图22.m47 CAR T细胞剂的特性。m47-CAR T细胞识别IL13Rα2+而非IL13Rα1+标靶。数据显示就效应功能来说，短铰链CD28z-CAR(SH2)T细胞比CD28z-CAR(SH3)、 CD28z-CAR(LH2)、CD28z-CAR(LH3)、CD28z-CAR(SH2Δ)或CD28z-CAR(SH3Δ) 表现得更好。
图23.m47 CAR T细胞剂的功能比较。开口曲线：二级抗体；填充曲线：IL13Rα2Fc +二级抗体。
图24.m47 CAR T细胞剂在转导后高度表达。开口曲线：二级抗体；填充曲线：IL13Rα2Fc+二级抗体。
图25.m47 CAR T细胞产生干扰素γ和白介素2，但仅在IL13Rα2刺激后产生。
图26.IL13Rα2-和IL13Rα1-阳性细胞系是通过HEK 293T细胞的遗传修饰制备。填充曲线：同型抗体对照；开口曲线：特异性抗体。
图27.m47 CAR T细胞仅杀死IL13Rα2+细胞系。体外实验提供确立如下的数据：m47 CAR T细胞在细胞表面上存在重组CAR蛋白，其除特异性识别IL13Rα2外不识别 IL4R、IL13Rα1或任何受体。识别的特异性延伸到仅针对那些表达IL13Rα2的细胞系的特异性。
图28.比较裸小鼠中m47 CAR T细胞剂、未处理和NT处理的多形性成胶质细胞瘤异种移植物的作用的体内数据。使用U373多形性成胶质细胞瘤异种移植物小鼠模型。在第0天，每只小鼠给予1×105个GFP-ffluc U373细胞。在第7天，给予2×106个m47 CAR T细胞或NT细胞。在第7天未处理样品不接受处理。不给予外源性白介素2并且通过连续生物发光成像记录存活分析的结果。n＝3。
图29.m47 CAR T细胞剂延长具有多形性成胶质细胞瘤的裸小鼠的存活。
图30.IL13Rα2-CAR T细胞的表征。(A、B)使用重组蛋白的共培养分析证实以IL14Rα2依赖性方式产生干扰素γ和白介素2；(C)标准铬释放分析中的溶细胞活性。
图31.47 CAR T细胞的产生。(A)M47 CAR的方案。所有CAR含有N端前导序列、编码呈scFv型式的M47的密码子优化合成基因、间隔区、CD28跨膜域和衍生自 CD28和CD3-ζ的信号传导域。间隔区是IgG1铰链(16个氨基酸；短间隔区； M47-CAR.SSR.CD28.ζ)或IgG1-CH2CH3域。构筑无信号传导域的LSR.Δ和 SSR.ΔM47-CAR并且将其充当对照。(C：B)使用FACS分析确认CAR表达。显示代表图(B)和汇总数据(C)(平均值74.1％-93.3％，n＝5-6/CAR构筑体)。开口曲线：二级抗体；填充曲线：IL13Rα2Fc +二级抗体。(D)通过蛋白质印迹分析、使用CD3-ζ抗体的全长47-CAR.SSR.CD28.ζ和47-CAR.LSR.CD28.ζ的表达。
图32.47-CAR T细胞系的表型分析。使用CD4-PacBlue和CD8-PerCP抗体(BD生物科学(BD Biosciences))分析CAR T细胞的CD4和CD8表面表达。对CD4和CD8 的表面表达进行分析的四种CAR T细胞系是SSR.Δ、SSR.CD28.ζ、LSR.Δ和LSR.CD28.ζ。直方图提供分析结果，其中浅灰色条棒指示CD4表达并且黑色条棒指示CD8表达。
图33.47-CAR T细胞在用重组IL13Rα2蛋白或IL13Rα2阳性细胞刺激后释放细胞因子。47-CAR或非转导(NT)T细胞是用重组IL13Rα1、IL13Rα2或IL4Rα蛋白刺激。 24小时后，通过ELISA测量IFNγ(A)(n＝4)。相较于IL13Rα1和IL4Rα刺激的T细胞，当用重组IL13Rα2蛋白刺激时，表达47-CAR构筑体的T细胞而非对照表达显著含量的IFNγ(p＜0.001)。47-CAR T细胞与Raji、U373细胞、293T-GFP和293T-GFP/IL13Rα2 以1∶2 E∶T比率共培养。NT和CAR.ΔT细胞充当对照。(B：C)24小时后，通过ELISA 测量细胞因子(IFNγ，IL2)(n＝3)。(B)U373和293T-GFP-IL13Rα2(IFNγ)；SSR.Δ相对于SSR.CD28.ζ：p＜0.001；LSR.Δ相对于LSR.CD28.ζ：p＜0.05。(C)：U373和 293T-GFP-IL13Rα2(IL2)；SSR.Δ相对于SSR.CD28.ζ：p＜0.01；LSR.Δ相对于LSR.CD28.ζ： NS。(D)在10∶1的E∶T比率下的4小时细胞毒性分析(n＝4)。
图34.LSR.CD28.ζ T细胞在离体扩增期间显示自活化表型。使用CD247(pY142) -AF647抗体(BD生物科学)分析T细胞的磷光体-CD3-ζ表达。
图35.IL13Rα1和IL13Rα2的细胞表面表达。使用一级山羊抗IL13Rα1和抗IL13Rα2抗体(分别是AF152和AF146；R&D)、随后使用二级兔抗山羊IgG Alexa647抗体(生命技术(Life Technologies))来分析细胞系的IL13Rα1和IL13Rα表达。填充曲线：同型抗体对照；开口曲线：特异性抗体。
图36.具有CD28.OX40.ζ、CD28.41BB.ζ或41BB.ζ胞内域的SSR 47-CAR的产生。 (A)SSR 47-CAR的方案。(B：C)使用FACS分析确认CAR表达。显示代表图(B) 和汇总数据(C)。47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ和47-CAR.SSR.CD28.41BB.ζ：平均值： 74.6％-77.5％(n＝4)；47-CAR.SSR.CD28.41BB.ζ：平均值：4.9％(n＝3)。开口曲线：二级抗体；填充曲线：IL13Rα2Fc +二级抗体。(D)通过蛋白质印迹分析的 47-CAR.SSR.41BB.ζ、M47-CAR.SSR.OX40.CD28.ζ和M47-CAR.SSR.41BB.CD28.ζ的表达。
图37.对47-CAR.SSR.CD28.ζ、47-CAR.SSR.41BB.ζ和47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞的比较。(A)47-CAR T细胞与U373细胞以1：2 E∶T比率共培养。NT和CAR.Δ T 细胞充当对照。24小时后，通过ELISA测量IFNγ和IL2(n＝3)；SSR.Δ相对于SSR.CD28.ζ (U373；IFNγ)：p＜0.001；SSR.Δ相对于SSR.41BB.ζ(U373；IFNγ)：p＜0.05；SSR.Δ相对于SSR.CD28.OX40.ζ(U373；IFNγ)：p＜0.001；SSR.Δ相对于SSR.CD28.ζ(U373； IL2)：p＜0.001；SSR.Δ相对于SSR.41BB.ζ(U373；IL2)：p＜0.001；SSR.Δ相对于 SSR.CD28.OX40.ζ(U373；IL2)：p＜0.01。(B)在10∶1的E∶T比率下的4小时细胞毒性分析(n＝4)。
图38.用表达47-CAR的T细胞处理神经胶质瘤异种移植物引起肿瘤消退并且提高了总存活率。在第7天用SSR.CD28.ζ(n＝9)、SSR.41BB.ζ(n＝9)或SSR.OX40.CD28.ζ (n＝9)T细胞处理带有U373神经胶质瘤的小鼠。SSR.ΔCAR T细胞(n＝7)充当对照。显示(A)每组的代表图像和(B)所有小鼠的定量生物发光(光亮度＝光子/秒/平方厘米/立体弧度)成像数据(点线：个别小鼠；实线：中位数)。(C)卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier) 存活率分析(SSR.Δ相较于SSR.CD28.ζ：p＝0.0002；SSR.Δ相较于SSR.41BB.ζ：p＝0.0039； SSR.Δ相较于SSR.OX40.CD28.ζ：p＝0.0092；SSR.CD28.ζ相较于SSR.41BB.ζ：p＝0.4723； SSR.CD28.ζ相较于SSR.OX40.CD28.ζ：p＝0.3582；SSR.41BB.ζ相较于SSR.OX40.CD28.ζ： p＝0.8374)。
图39.对从复发性肿瘤中分离的U373细胞的分析。从用47-CAR T细胞处理的小鼠的复发性肿瘤中分离U373细胞。在短期培养(2到7天)后，进行FACS分析和细胞毒性分析。(A)IL13Rα2的FACS分析。(B)在针对来自经标记细胞的Cr释放的标准四小时细胞毒性分析中，与Raii细胞相比，47-CAR T细胞杀死从复发性肿瘤中分离的 U373肿瘤细胞。开口曲线：同型抗体对照；填充曲线：特异性抗体。
图40.体内47-CAR T细胞的受限制存留。47.SSR.CD28.ζ-CAR T细胞经过转导以表达eGFP.ffLuc。(A)FACS分析确认CAR和eGFP.ffLuc转基因的表达。(B：C)将1 ×105个未经修饰的U373细胞颅内注射于小鼠中。在第7天，使用相同肿瘤座标，小鼠颅内接受2×106个47.SSR.CD28.ζ.eGFP.ffLuc CAR T细胞。生物发光成像用以监测T 细胞存留。
图41.LSR-CD28.41BB.ζCAR T细胞的产生和表征。(A)LSR.CD28.41BB.ζCAR 构筑体的方案。(B)使用FACS分析确认CAR表达。代表图。开口曲线：二级抗体；填充曲线：IL13Rα2Fc +二级抗体。(C)LSR.CD28.41BB.ζCAR T细胞与U373细胞以 1∶2 E∶T比率共培养。NT T细胞充当对照。24小时后，通过ELISA测量IFNγ或IL2(n＝3)。
图42.SSR.α.CD28.41BB.ζCAR T细胞的产生。(A)SSR.α.CD28.41BB.ζCAR构筑体的方案。(B)使用FACS分析测试CAR表达(显示代表图)。
图43.在存在和不存在IFNγ刺激下U373细胞表面上的PD-L1表达的FACS分析。在存在或不存在IFNγ(100单位/毫升)下培养U373细胞。24小时后，使用CD271 PE 抗体(BD生物科学)分析U373细胞的PD-L1表达。
图44.SSR.CD28.ζ T细胞中IL15的转基因表达增强抗原依赖性IL15的分泌。用(A)重组蛋白或(B)细胞系刺激T细胞。
图45.IL15的转基因表达产生(A)增强的SSR.CD28.ζ T细胞的体内存留，提高(B)无进展存活(PFS)。
具体实施方式
本公开提供特异性地识别白介素13受体α2(IL13Rα2)的结合剂或伴侣，以用于诊断、预防、治疗或改善通过存在IL13Rα2的细胞表征的大范围癌症中的任一种的症状。更确切地说，本公开提供(i)特异性靶向人类肿瘤相关抗原、即白介素13受体α2 (IL13Rα2)的单克隆抗体(m47)的六个互补决定区的序列，和(ii)展现由重链和轻链cDNA编码的呈scFv抗体型式的蛋白质或与其它功能部分的缀合物(例如融合体) 的功能性的数据。与免疫技术中的理解一致，m47单克隆抗体的六个互补决定区赋予针对IL13Rα2的结合特异性。在一些实施例中，scFv包含抗体m47的完整重链和轻链可变区或抗体m47的完整重链和轻链。在一些实施例中，重链和轻链片段包含例如m47 CDR或m47可变区，并且这些域可以按不同型式布置，如抗体的单链可变片段(即，scFv)、双功能抗体、双特异性抗体片段、三特异性抗体片段、具有广泛多种治疗蛋白中的任一种和/或其它部分的融合蛋白、人源化抗体片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab)2′片段和提供靶向功能和效应功能的双功能肽的任何其它功能型式。此外，单链抗体或由重链和轻链编码的蛋白质的其它布置可以经过表达并且缀合到治疗载体(例如病毒、细胞、纳米材料)用于将治疗剂特异性递送到IL13Rα2表达肿瘤中。根据本公开的材料也适用于使肿瘤负荷成像。
所述技术解决阻碍免疫疗法进展的最严重障碍，即假想不存在所定义的肿瘤特异性抗原，所述抗原可以预测地发现于人类癌症的至少一更大子组上并且可以充当有效标靶以用于癌症根除。寻找这类抗原将会使所述领域超出用于治疗CD19/CD20表达B细胞恶性病的方法。
当在本公开的情形下视为整体时，除非本文清楚地指出不同含义，否则，在所属领域中给出贯穿本公开所使用的术语的普通和习惯含义。
本公开描述对IL13Rα2具有特异性的单克隆抗体(mAb)片段的开发和表征，以用于靶向IL13Rα2表达肿瘤的治疗目的。高亲和力IL13Rα2由多形性成胶质细胞瘤(GBM) 以及若干其它肿瘤类型以高频率选择性地表达。靶向这种肿瘤特异性受体的一种方法利用缀合到细胞毒性分子的同源配位体IL-13。然而，这种方法缺乏特异性，因为针对IL-13、 IL13Rα1的较低亲和力受体由正常组织广泛地表达。预期对IL13Rα2具有特异性的单克隆抗体(mAb)解决困扰识别两种IL13受体即IL13Rα1以及IL13Rα2的方法的特异性缺乏。这类mAb将治疗性地适用于靶向并且治疗IL13Rα2表达癌症，包括肿瘤。
如本文所公开，产生杂交瘤细胞系并且比较其与重组人类IL13Rα2(rhIL13Rα2)的结合亲和力。克隆47展现与IL13Rα2的原生构形的结合并且因此被选择用于进一步研究。克隆47特异性结合到rhIL13Rα2而非rhIL13Rα1或鼠类IL13Rα2并且与rhIL13Rα2 具有高亲和力(KD＝1.39×10-9M)。此外，克隆47特异性识别在CHO和HEK细胞以及若干神经胶质瘤细胞系的表面上表达的野生型IL13Rα2。竞争结合分析揭露克隆47 也显著抑制人类可溶IL-13与IL13Rα2受体之间的相互作用。此外，IL13Rα2的N-连接糖基化部分地促进抗体与IL13Rα2的相互作用。在体内，IL13Rα2 mAb提高颅内植入有人类U251神经胶质瘤异种移植物的裸小鼠的存活率。
如本文所公开构筑的基于scFv的IL13Rα2特异性CAR，47-CAR提供用于探究长和短间隔区以及胞内域对其功能的影响的材料。虽然47-CAR.SSR.CD28.ζ(即，47-CAR 结合区，按接合到如本文中所定义的短间隔区、反过来接合到未经修饰或嵌合胞内域或 T细胞细胞质域的scFv的形式提供)和47-CAR.LSR.CD28.ζ(取代长间隔区(LSR)的类似构筑体)识别靶细胞，如通过IFNγ产生所判定，但仅47-CAR.SSR.CD28.ζ诱导IL2 产生，指示更好的T细胞活化。显示含有CD28.41BB.ζ胞内域的额外LSR 47-CAR(图 41)缺乏诱导IL2表达的能力。这些观测与如下知识一致：与结合到细胞膜远端的抗原决定基的scFv相比，针对理想的CAR功能，结合到非常接近于癌细胞膜的抗原决定基的scFv需要长间隔区。本文所公开的数据指示通过47-CAR识别的IL13Rα2抗原决定基位于细胞膜的远端。
更具体来说，构筑四个SSR 47-CAR，每一个具有不同的胞内域，即，CD28.ζ、 41BB.ζCD28.OX40.ζ和CD28.41BB.ζ。虽然如通过蛋白质印迹分析所判定，所有四个CAR 被表达，但未观测到47-CAR.SSR.CD28.41BB.ζ的显著细胞表面表达。我们探究如果改变47-CAR.SSR.CD28.41BB.ζ中CD28到CD8α的跨膜域，那么将产生更好的细胞表面表达，但未观测到表达增加。因为47-CAR.LSR.CD28.41BB.ζ是在细胞表面上表达(图 42)，结果指示间隔区与胞内域之间的相互作用影响CAR细胞表面表达。
47-CAR.SSR.CD28.ζ、47-CAR.SSR.41BB.ζ和47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞在体内具有有力的抗肿瘤作用，产生显著的存活优势。虽然相较于47-CAR.SSR.41BB.ζ或 47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞处理的小鼠，用47-CAR.SSR.CD28.ζ T细胞处理的小鼠具有最长的中位存活期(median survival)，但这一差异并未达到显著性。实验结果也显示添加第二共刺激胞内域并不改良体内的抗肿瘤活性。体内受限制的T细胞存留被鉴别为疗法的主要限制。这种限制可以通过细胞因子36的转基因表达或通过阻断在神经胶质瘤细胞表面上分泌或存在的抑制分子来解决。举例来说，如U373的神经胶质瘤表达 PD-L1，其在IFNγ存在下上调(图43)，并且可以靶向于未来研究中。
本文所公开的实验结果确立：使用47-CAR重新定向到IL13Rα2的T细胞在体外具有针对神经胶质瘤细胞的有力的抗肿瘤活性，并且在体内诱导所确立的GBM异种移植物的消退。预期47-CAR不仅在IL13Rα2阳性GBM的治疗中而且在表达IL13Rα2的其它恶性病的治疗中具有价值。
本文所公开的实验结果确立：在体内在GBM异种移植物中，使用47-CAR的重新定向到IL13Rα2并且也表达IL15的T细胞具有增强的抗肿瘤活性。
本公开至少部分地基于如下发现：IL13Rα2优先发现于如肿瘤细胞的癌细胞上。这种受体充当已被使用以诱发高亲和力单克隆抗体m47以及所述抗体的抗原结合片段的癌症或肿瘤特异性抗原。m47抗体的VL和VH可变区已被工程改造成单链(sc)可变片段(scFv)以产生缀合物，如嵌合抗原受体(即，CAR)，以引入到T细胞中用于过继转移。因此，预期CAR转导的T细胞靶向肿瘤特异性IL13Rα2抗原决定基，根除存在所述受体的癌细胞。相信识别IL13Rα2的CAR转导的T细胞将破坏大实体肿瘤。然而，CAR转导的T细胞仅直接靶向癌细胞并且抗原阴性癌细胞可能会逃脱。所预期的是 CAR转导的T细胞也将在经由旁观者效应消除抗原阴性癌细胞中有效。
本文公开如下实验：确立具有基于scFv47的抗原结合域的IL13Rα2特异性CAR(47-CAR)的开发。数据显示在提供理想功能性的短间隔区下47-CAR表现得更好，并且47-CAR T细胞能够在体外仅识别和杀死IL13Rα2阳性靶细胞并且不识别和杀死 IL13Rα1阳性靶细胞。此外，在GBM的原位异种移植物小鼠模型中，47-CAR T细胞诱导肿瘤消退，其与显著的存活优势相关。
根据本公开的蛋白质缀合物特异于与癌症例如肿瘤相关的IL13Rα2。此外，本公开提供一种编码这些癌症特异性结合伴侣中的一种的聚核苷酸，包括针对特异于IL13Rα2 的抗原决定基的结合伴侣包含密码子优化编码区的聚核苷酸。本公开的聚核苷酸编码缀合物或双功能多肽，所述缀合物或双功能多肽适用于诊断、预防、治疗或改善癌症的症状，所述癌症如各种人类癌症、包括形成实体肿瘤的那些癌症中的任一种。也涵盖包含如本文所公开的聚核苷酸的载体、包含这类聚核苷酸和/或如上文所描述的载体的宿主细胞，以及治疗、预防或改善癌症疾病例如实体肿瘤、原发性癌症部位或转移癌症的症状的方法。
本公开涵盖所属领域中已知的各种形式的缀合物。这些缀合物提供对癌症以及蛋白质极具特异性的抗体受体，所述受体可以并入提供效应功能的各种骨架中，如下文所提到的双特异性T细胞啮合体(BITE)或嵌合抗原受体(CAR)。本公开的示范性的缀合物包括CAR；融合蛋白，包括包含单链可变(抗体)片段(scFv)多聚体的融合体，或与编码适用于治疗癌症的产物例如IL15、IL15Rα或IL15/IL15Rα剂的编码区融合的scFv 融合体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体和双特异性二价scFv，包括双特异性串联二价scFv，也称为双特异性T细胞啮合体或BITE。此外，这些缀合物形式中的任一种可以展现各种相对结构中的任一种，如在所属领域中已知，不同域顺序(例如H2N-VH- 连接子-VL-CO2H和H2N-VL-连接子-VH-CO2H)与特异性结合相容。也涵盖本文所描述的缀合物的更高级形式，如包含本文所公开的缀合物的至少一种形式的肽体。本公开的缀合物特异性结合到癌症特异性抗原决定基(例如IL13Rα2)并且可以对编码其的聚核苷酸进行密码子优化，以例如用于最大化翻译，用于在所靶向细胞(例如人类或小鼠细胞)中表达。在表达本公开的缀合物如CAR的情形下，为确保蛋白质的产生有效并且足够稳固以适用作治疗剂源，密码子优化至关重要。
本公开也涵盖其中靶向部分(抗IL13Rα2抗体或其片段)连接到提供第二功能的肽的缀合物，所述第二功能例如效应功能，如涉及T细胞活化的T细胞信号传导域；影响或调节针对癌细胞的免疫应答的肽；或在缀合物的编码区经过密码子优化用于在靶细胞中表达的情况下，产生由根据本公开的聚核苷酸编码的CAR的标记系统的酶组分。示范性的缀合物包括抗IL13Rα2 scFv，其连接到铰链、跨膜域和效应化合物或域，例如 CD28、CD3ζ、CD134(OX40)、CD137(41BB)、ICOS、CD40、CD27或Myd88，由此产生CAR。
本公开的聚核苷酸方面包含如下实施例：其中提供较慢生长的更高级真核生物如脊椎动物(例如人类)中关于密码子优化的未预期变化，其聚焦于翻译优化(最大化高保真性翻译率)而非用于这类生物体中的典型的密码子优化，其经设计以适应突变偏移并且由此将突变降到最小。也公开诊断、预防、治疗或改善癌症的症状的方法。示意性地描述，聚核苷酸包含用于抗原受体的密码子优化编码区，所述抗原受体特异性识别连接到以下中的任一个的IL13Rα2抗原决定基：涉及T细胞活化的T细胞信号传导域的编码区；影响或调节针对癌细胞的免疫应答的基因产物，如IL15/IL15Rα融合体；或标记组分，如标记系统的酶组分。连接的编码区产生根据本公开的编码缀合物如BITE或嵌合抗原受体(CAR)的聚核苷酸。
在诊断、预防、治疗或改善癌症的症状的方法中，本公开的组合物典型地以缀合物转导的细胞形式给予，所述缀合物转导的细胞如T细胞、NK细胞或淋巴细胞，包括但不限于NKT细胞、γδT细胞、粘膜相关恒定T细胞或MAIT细胞，或固有淋巴细胞，但也涵盖对包含本公开的聚核苷酸的载体的给予或对本公开的聚核苷酸的给予，这取决于缀合物的功能性。将本公开的聚核苷酸、载体或宿主细胞与生理学上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂组合得到根据本公开的医药组合物，并且这些医药组合物适用于给药以诊断、预防、治疗或改善癌症的症状。
在本文所描述的实验工作的过程中，产生杂交瘤细胞系并且比较其与重组人类IL13Rα2(rhIL13Rα2)的结合亲和力。克隆47展现与IL13Rα2的原生构形的结合并且因此进一步被表征。克隆47特异性结合到rhIL13Rα2而非rhIL13Rα1或鼠类IL13Rα2 并且与rhIL13Rα2具有高亲和力(KD 1.39×10-9M)。此外，克隆47特异性识别在CHO 和HEK细胞以及若干神经胶质瘤细胞系的表面上表达的野生型IL13Rα2。竞争结合分析揭露克隆47也显著抑制人类可溶IL-13与IL13Rα2受体之间的相互作用。此外，发现IL13Rα2的N-连接糖基化部分地促进抗体与IL13Rα2的相互作用。在体内，IL13Rα2 单克隆抗体提高颅内植入有人类U251神经胶质瘤异种移植物的裸小鼠的存活率。总起来说，这些数据确立本文所公开的癌症的免疫调节治疗的功效。
IL13Rα2在多形性成胶质细胞瘤(GBM)中而非在正常脑组织中的过表达独特地将这种受体定位为用于靶向肿瘤细胞的候选物。GBM是高度浸润性肿瘤，经常使完全的手术去除变得不可能。此外，GBM高度耐辐射和化学疗法(16)，使进一步开发用于治疗患者的新颖并靶向的疗法有必要。
已使用噬菌体展示文库方法来选择对人类IL13Rα2具有特异性的小抗体片段，随后在体外和体内对其进行评估(23)。尽管与IL13Rα2的相互作用具高特异性，但当与 IL-13PE38的作用相比较时，与毒素的结合不能增加IL13Rα2表达神经胶质瘤和肾细胞癌细胞系中的细胞毒性。所产生的抗体片段的低亲和力是对缺乏成功最合理的解释。已知衍生自噬菌体呈现文库的抗体片段在亲和力和亲合力方面比由常规杂交瘤技术产生的抗体更低(24)。经常需要修饰那些小抗体片段以增强其与所靶向蛋白质的亲和力和亲合力。近年来，单克隆抗体作为靶向抗癌和诊断药剂日益取得成功(25、26)，并且需要进一步探索对肿瘤相关抗原具有受限制特异性的高亲和力试剂。设计本文所公开的实验以发现、开发并且表征特异性地识别在癌细胞表面上表达的IL13Rα2的高亲和力抗体。与所述设计一致，本文公开如下实验：确立拥有体内对IL13Rα2表达肿瘤的免疫治疗靶向关键的特性并且潜在地适用于各种其它应用的抗体的产生。
单克隆抗体看起来是有价值的研究和诊断工具以及治疗剂。由于具有特异性靶向癌细胞同时避免与未转化组织相互作用的能力，因此特异于肿瘤相关抗原的单克隆抗体具有优于系统性化学疗法的显著优势。因此，对新颖“灵丹妙药(magic bullet)”的探索持续增长，经全球市场确认，截至2010年，治疗抗体值480亿美元。治疗抗体是传统杂交瘤技术或抗体片段的文库筛选和其成为人源化片段或实际大小分子的后续工程改造的产物。在本研究之前，在科学界不可获得分泌对肿瘤特异性抗原IL13Rα2具高亲和力的抗体的杂交瘤细胞系。此处，我们描述对肿瘤特异性抗原IL13Rα2具高亲和力的抗体的产生和表征，并且论述其在不同应用中的可能用途。
新发现的抗体与人类IL13Rα2的相互作用的特异性通过ELISA使用rhIL13Rα2hFc融合蛋白、在CHO和HEK细胞的表面上表达的重组人类IL13Rα2和表达各种含量的 IL13Rα2的若干神经胶质瘤细胞系通过流式细胞测量术来分析。本文中所鉴别的抗体和使用其结合域的药剂展现与人类IL13Rα2的相互作用的特异性并且不与人类IL13Rα1或小鼠IL13Rα2交叉反应。此外，对于在HEK细胞表面上表达的IL13Rα2的检测，在竞争结合分析中使用rhIL13Rα2hFc融合蛋白通过ELISA或通过流式细胞测量术确认与 IL13Rα2的结合的特异性。在这些分析中，IL13Rα2(克隆47)mAb与重组人类IL-13 竞争其抗原决定基并且能够阻断IL-13与IL13Rα2之间约80％的结合。相反，人类重组IL-13能够阻断约50％的与IL13Rα2的抗体结合。类似地，当rhIL13R2hFc嵌合体和 rhIL-13用作竞争者时，观测到IL13Rα2(克隆47)mAb与N10神经胶质瘤细胞的结合显著降低。rhIL-13与N10细胞的结合也通过IL13Rα2(克隆47)mAb消除。这些数据指示两个分子在其针对IL13Rα2的识别位点中具有显著的重叠。
IL-13是小10kDa分子(31)，然而抗体的分子质量比其大约15倍。rhIL-13与抗体竞争结合位点的能力表明抗体的抑制特性有可能是由于与促进IL-13与同源受体的结合的氨基酸残基的特异性相互作用而非位阻所致，所述位阻也可以防止IL-13与其受体的相互作用。先前，Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318被鉴别成为与IL-13的相互作用所需的IL13Rα2的关键残基(28)。在本文所公开的分析中，当与野生型受体相比较时， IL-13与携带突变成丙氨酸的所有4个氨基酸突变的组合的突变体IL13Rα2的结合被显著消除。然而，IL13Rα2mAb与IL13Rα2的个别形式或4胺基酸突变体形式的结合不受显著影响。这些发现指示Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基对于经IL13Rα2 mAb 识别IL13Rα2来说不关键。人类IL13Rα2和鼠类IL13Rα2在结构上保守并且共享59％的氨基酸一致性(32)。此外，Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基在人类和鼠类 IL13Rα2中是保守的。IL13Rα2mAb与鼠类IL13Rα2hFc融合体的结合的缺乏进一步支持如下预期：这些氨基酸残基有助于IL-13与IL13Rα2的结合并且对于这种抗体与受体的相互作用不关键。
为进一步表征IL13Rα2与本文所公开的抗体和抗体药剂的相互作用，测量IL13Rα2mAb的亲和力并且使用表面等离子体共振法(surface plasmon resonance method)将其与两种可商购抗体的结合特性相比较。经过测定IL13Rα2 mAb的亲和力等于1.39×10-9M，大大超过可比较的可商购抗体的亲和力，超出达75倍。与亲和力研究一致，在与各种神经胶质瘤细胞表面上表达的IL13Rα2的结合和ELISA方面，IL13Rα2 mAb(克隆47) 展现超越两种商业抗体的优越性。尽管应在具体使用之前考虑抗体的许多特性，包括亲和力和亲合力、体内稳定性、清除速率和内化速率、肿瘤渗透和保持力，但已经报导对于免疫治疗肿瘤靶向应用，更高亲和力的抗体更佳(33)。针对表皮生长因子受体变异体III的单链抗体片段(scFv)MR1-1展现比亲本scFvMR1高约15倍的亲和力，并且还显示比scFvMR1的肿瘤吸收高平均244％的肿瘤吸收(34)。有可能本文所公开的 IL13Rα2 mAb和其药剂的高亲和力特性将有利于利用靶向表达IL13Rα2的肿瘤细胞的抗体或相关衍生物的应用。
IL13Rα2的N-连接糖基化已被鉴别为是与IL-13的有效结合的必需要求(30)。考虑到本文所公开的IL13Rα2 mAb抑制约80％的IL-13与同源受体IL13Rα2的结合，合理地期望在IL13Rα2的去糖基化形式下这种抗体或含有其结合域的药剂的结合也会受影响。IL13Rα2分子具有四个可能的N-连接糖基化位点。当与非处理对照相比较时，抗体与rhIL13Rα2或与在用Pngase F处理的HEK或U251细胞的表面上表达的IL13Rα2的结合分别降低35和30％。当与克隆83807和B-D13相比较时，克隆47的结合活性的部分变化表明使用Pngase F从IL13Rα2中去除碳水化合物加合物使得受体的构形发生变化，间接影响IL-13(30)和IL13Rα2 mAb与IL13Rα2的结合。这也支持如下预期：抗体直接结合到IL13Rα2胺基酸主链而非与翻译后添加的碳水化合物部分相互作用。支持这种预期，若干研究先前已证实蛋白质的构形概况和结构刚度取决于N-连接糖基化(22、 35-38)。
为调查IL13Rα2 mAb和其药剂的治疗特性，进行体内研究，其中将神经胶质瘤细胞和IL13Rα2(克隆47)mAb颅内共注射于脑中，或将抗体注射于经确立带有肿瘤的小鼠中。有趣地，IL13Rα2 mAb能够延迟肿瘤发展，并且提高具有颅内U251神经胶质瘤异种移植物的动物的存活率，在共注射模型中最显著，进而展现提高具有已确立的神经胶质瘤的动物的中位存活期的趋势。尽管对于这种抗肿瘤作用的基础机制仍然不清楚，但所述结果确立这种抗体或其药剂(含有IL13Rα2结合域，所述结合域呈六个CDR区形式，或呈克隆47抗IL13Rα2的两个可变域形式)单独或与药物载剂组合的治疗适用性，由此提供用于治疗IL13Rα2表达神经胶质和其它谱系肿瘤的疗法。已显示若干抗体通过 Fc介导的补体活化介导肿瘤中的细胞毒性作用(39)。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性诱导的效应细胞活化也可以对针对所靶向细胞的抗体的细胞毒性作用做出贡献(40、 41)。衍生自用表达人类IL13Rα2的D5黑素瘤细胞攻击的动物的血清的抗IL13Rα2活性证实体外抑制细胞生长的能力(4)。
适合于所描述治疗的癌症包括已发现表达IL13Rα2的癌症，包括成胶质细胞瘤；神经管胚细胞瘤；卡波西(Kaposi)肉瘤；和头颈癌、卵巢癌、胰脏癌、肾癌和结肠直肠癌(2、43-47)。尽管IL13Rα2在一些癌症中的作用尚不界定，但最新报导已证实IL13Rα2 对卵巢癌、胰脏癌和结肠直肠癌的侵袭性表型有贡献(5、13)。此外，Minn等人(42) 已表明IL13Rα2表达与到肺的乳癌转移之间的关系。此外，Fichtner-Feigl等人(11)证实IL-13与IL13Rα2的相互作用上调TGF-β1，介导博莱霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化模型中的纤维化。根据这种发现，预期抗IL13Rα2抗体(克隆47)和其结合剂将能够减弱TGF-β1诱导的肺纤维化。
如本文所公开，所描述实验产生抗IL13Rα2抗体和其结合剂，其均对人类IL13Rα2具有特异性。抗体和其药剂拥有针对IL13Rα2的高亲和力并且与IL-13竞争IL13Rα2上的结合位点。抗体识别在神经胶质瘤细胞以及其它IL13Rα2表达细胞的细胞表面上表达的抗原，确立体内用于靶向IL13Rα2表达肿瘤细胞的适合性。也预期抗IL13Rα2抗体和其结合剂在诊断成像、抗体放射性核素缀合物的递送、检测IL13Rα2的生物分析中有效并且经济，并且作为治疗剂在不同类型的IL13Rα2过表达肿瘤中的载体。
在诊断、预防、治疗或改善癌症的症状的方法中，本公开的组合物典型地以缀合物转导的T细胞形式给予，但也涵盖对包含本公开的聚核苷酸的载体的给予或对本公开的聚核苷酸的给予，这取决于缀合物的功能。将本公开的聚核苷酸、载体或宿主细胞与生理学上合适的缓冲液、佐剂或稀释剂组合得到根据本公开的医药组合物，并且这些医药组合物适用于给药以诊断、预防、治疗或改善癌症的症状。
也涵盖根据本公开的缀合物，如由融合到IL15/IL15Rα的针对IL13Rα2抗原决定基的scFv受体构成的融合蛋白。预期融合蛋白将消除临床大小肿瘤或仅初期和微散播的癌细胞。本公开进一步涵盖对人类癌症上的两种独立的IL13Rα2抗原决定基的同时靶向，其可能为防止逃脱治疗(如CAR治疗)所必需。
通过CAR的对不同IL13Rα2抗原决定基的同时靶向应降低癌症亚群逃脱的可能性，其提供了鉴别额外IL13Rα2抗体产物和/或抗原决定基的强有力的理由。
本公开提供可调适并且可以充当具有可观增长可能性的平台技术的基础的材料和方法。预期IL13Rα2的癌症特异性性质向癌症诊断剂、预防剂和治疗剂提供主要优势优于先前和当前使用的标靶的标靶。
与前述的精神一致，以下提供对本文所提供的材料和方法的描述。
本文公开IL13Rα2结合剂，其包含以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ IDNO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)； RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和QQSKEVPWT (SEQ ID NO：6)。在示范性方面中，除提供构架以支撑结合到IL13Rα2的三维构形的其它序列以外，结合剂包含前述六个氨基酸序列中的每一个。在示范性方面中，IL13Rα2 结合剂包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的一个或两个。在示范性方面中，IL13Rα2结合剂包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。在示范性方面中，IL13Rα2 结合剂包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，IL13Rα2结合剂包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列两者。在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列存在于结合剂中的示范性方面中，SEQ ID NO：7的氨基酸序列经由连接子融合到 SEQ ID NO：8的氨基酸序列。合适的连接子在所属领域中已知。在示范性方面中，连接子包含约5到约25个氨基酸、例如约10到约20个氨基酸的短氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含EEGEFSEAR(SEQ ID NO10)的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含AKTTPPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列。在示范性方面中，IL13Rα2结合剂包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
在示范性实施例中，本文所提供的结合剂进一步包含额外氨基酸序列。在示范性方面中，结合剂进一步包含重链的恒定区和/或轻链的恒定区。重链和轻链恒定区的序列是公众可获得的。举例来说，美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库提供IgG1 κ轻链的恒定区的序列。参见以引用的方式并入本文中的基因银行(GenBank)登录号DQ381549.1。在示范性方面中，结合剂包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在示范性方面中，结合剂包含SEQ ID NO：28的经过修饰的氨基酸序列。。在示范性方面中，结合剂包含与SEQID NO：28至少90％、至少93％、至少95％或至少98％一致的氨基酸序列。同样，举例来说，NCBI核苷酸数据库提供小家鼠(Mus musculus)IgG1的恒定区的序列。参见基因银行登录号DQ381544.1。在示范性方面中，结合剂包含SEQ ID NO：29 的氨基酸序列。在示范性方面中，结合剂包含SEQ ID NO：29的经过修饰的氨基酸序列。。在示范性方面中，结合剂包含与SEQID NO：29至少90％、至少93％、至少95％或至少 98％一致的氨基酸序列。
在示范性方面中，IL13Rα2结合剂是抗体或其抗原结合片段。在示范性方面中，抗体包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个。在示范性方面中，抗体包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，抗体包含SEQ ID NO：7和 SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，抗体包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO： 8的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：7的氨基酸序列经由连接子融合到SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含约5到约25个氨基酸、例如约10到约20 个氨基酸的短氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含EEGEFSEAR(SEQ ID NO10) 的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含AKTTPPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：80) 的氨基酸序列。在示范性方面中，抗体包含SEQ IDNO：13的氨基酸序列。
在示范性方面中，抗体可以是所属领域中已知的任何类型的免疫球蛋白。举例来说，抗体可以具有任何同型，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是天然存在的抗体，即，从哺乳动物例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人类等等中分离和/或纯化的抗体。在这点上，抗体可被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人类抗体等等。如本文所用，术语“分离”意指已从其天然环境去除。如本文所用，术语“纯化”涉及分子或化合物以大体上不含污染物(其通常与分子或化合物在原生或天然环境中缔合)的形式分离，并且意指已因与初始组合物的其它组分分离而导致纯度增加。应认识到，“纯度”是相对术语，并且不必解释为绝对纯度或绝对富集或绝对选择。在一些方面中，纯度是至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、或至少或约90％(例如，至少或约91％、至少或约92％、至少或约93％、至少或约94％、至少或约95％、至少或约 96％、至少或约97％、至少或约98％、至少或约99％或约100％)。
在示范性方面中，抗体包含IgG的恒定区。在示范性方面中，抗体包含IgG1的恒定区。在示范性方面中，抗体包含IgG κ轻链的恒定区。举例来说，抗体可以包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。在示范性方面中，抗体包含高度类似于SEQ ID NO：28的氨基酸序列。举例来说，抗体可以包含与SEQ ID NO：28具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：28具有至少90％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28 具有至少93％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：28具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：28具有至少98％序列一致性的氨基酸序列。
在示范性方面中，抗体包含小家鼠IgG1的恒定区。举例来说，抗体可以包含SEQ IDNO：30的氨基酸序列。在示范性方面中，抗体包含高度类似于SEQ ID NO：30的氨基酸序列。举例来说，抗体可以包含与SEQ ID NO：30具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQID NO：30具有至少90％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30 具有至少93％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30具有至少95％序列一致性的氨基酸序列，或与SEQID NO：30具有至少98％序列一致性的氨基酸序列。
本公开的抗IL13Rα2抗体和其片段可以具有针对IL13Rα2的任何水平的亲和力或亲合力。解离常数(KD)可以是本文关于结合单元所描述的那些示范性解离常数中的任一项。结合常数，包括解离常数，通过所属领域中已知的方法确定，所述方法包括例如利用表面等离子体共振原理的方法，例如利用BiacoreTM系统的方法。根据前述，在一些实施例中，抗体呈单体形式，而在其它实施例中，抗体呈聚合物形式。在抗体包含两个或多于两个不同抗原结合区或片段的某些实施例中，抗体视为双特异性、三特异性或多特异性的或二价、三价或多价的，这取决于经结合剂识别并结合的不同抗原决定基的数目。
因为本公开的结合剂可以针对与IL13Rα2的结合而与IL13竞争，所以示范性方面中的抗体被视为阻断抗体或中和抗体。在一些方面中，针对IL13Rα2，结合剂的KD大约与原生配位体IL13的KD相同。在一些方面中，针对IL13Rα2，结合剂的KD比IL13 的KD更低(例如低至少0.5倍、低至少1倍、低至少2倍、低至少5倍、低至少10倍、低至少25倍、低至少50倍、低至少75倍、低至少100倍)。在示范性方面中，KD在约0.0001nM与约100nM之间。在一些实施例中，KD是至少或约0.0001nM、至少或约 0.001nM、至少或约0.01nM、至少或约0.1nM、至少或约1nM、或至少或约10nM。在一些实施例中，KD不大于或约100nM、不大于或约75nM、不大于或约50nM、或不大于或约25nM。在示范性方面中，针对人类IL13Rα2，抗体具有不大于约1.39×10-9 M的KD。
在示范性方面中，结合剂，例如抗体或其抗原结合片段，不结合到人类IL13Rα1。
在示范性实施例中，抗体是基因工程改造过的抗体，例如单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、包括特异于IL13Rα2的CDR序列的部分的抗体(例如包括 SEQ IDNO：1-6的CDR序列的抗体)、人改造或人源化抗体、双特异性抗体、三特异性抗体等等，如本文中更详细地定义。基因工程技术还提供制备非人类中的全人类抗体的能力。
在一些方面中，抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用以指如下抗体：含有来自一种物种的恒定域和来自第二物种的可变域，或更通常含有来自至少两种物种的氨基酸序列片段。
在一些方面中，抗体是人源化抗体。当相关于抗体使用时，术语“人源化”用以指抗体具有来自非人类源的至少CDR区，经过工程改造而具有相对于初始源抗体更类似于真实人类抗体的结构和免疫功能。举例来说，人源化可以涉及将来自非人类抗体如小鼠抗体的CDR接枝于人类抗体中。如将在所属领域中已知，人源化也可以涉及选择氨基酸取代以制备更类似于人类序列的非人类序列。
本文中对术语“嵌合或人源化”的使用不意指为相互排斥的；相反，意指涵盖嵌合抗体、人源化抗体和已进一步经过人源化的嵌合抗体。除非上下文另外指示，否则关于嵌合抗体(嵌合抗体的特性、用途、测试等)的陈述适用于人源化抗体，并且关于人源化抗体的陈述也涉及嵌合抗体。同样，除非上下文规定，否则这类陈述也应理解为适用于抗体和这类抗体的抗原结合片段。
在本公开的一些方面中，结合剂是特异性结合到根据本发明的IL13Rα2的抗体的抗原结合片段。抗原结合片段(在本文中也被称作“抗原结合部分”)可以是任一种本文所描述抗体的抗原结合片段。抗原结合片段可以是具有至少一个抗原结合位点的抗体的任何一部分，包括但不限于Fab、F(ab′)2、dsFv、sFv、scFv、双功能抗体、三功能抗体、双scFv、通过Fab表达文库表达的片段、域抗体、VhH域、V-NAR域、VH域、VL域等等。然而，本发明的抗体片段不限于这些示范性类型的抗体片段。
在示范性方面中，IL13Rα2结合剂是抗原结合片段。在示范性方面中，抗原结合片段包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个。在示范性方面中，抗原结合片段包含 SEQID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，抗原结合片段包含 SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，抗原结合片段包含SEQ ID NO：7和SEQID NO：8的氨基酸序列，并且SEQ ID NO：7的氨基酸序列经由连接子融合到SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含约5到约25个氨基酸、例如约10到约20个氨基酸的短氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含 EEGEFSEAR(SEQ ID NO 10)的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含 AKTTPPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：80)的氨基酸序列。在示范性方面中，本文所提供的抗原结合片段包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
在示范性方面中，抗原结合片段包含前导序列。任选地，在一些方面中，前导序列位于重链可变区的N端。在示范性方面中，抗原结合片段包含Ig κ前导序列。合适的前导序列在所属领域中已知，并且包括例如METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO： 9)的Ig κ前导序列。
在示范性方面中，抗原结合片段包含一个更多个标签序列。标签序列可以有助于产生并且表征所制造的抗原结合片段。在示范性方面中，抗原结合片段包含一个或多个在轻链可变区的C端的标签序列。合适的标签序列在所属领域中已知并且包括但不限于 Myc标签、His标签等等。在示范性方面中，抗原结合片段包含GGPEQKLISEEDLN(SEQ ID NO：11)的Myc标签。在示范性方面中，抗原结合片段包含HHHHHH(SEQ ID NO：12) 的His标签序列。
在示范性方面中，本公开的抗原结合片段从N端到C端包含前导序列、重链可变区、连接子序列、轻链可变区、Myc标签(例如SEQ ID NO：11)和His标签(例如SEQ ID NO：12)。在示范性方面中，本公开的抗原结合片段包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
在示范性方面中，抗原结合片段是域抗体。域抗体包含抗体的功能结合单元，并且可以对应于抗体的重(VH)或轻(VL)链的可变区。域抗体可以具有约13kDa，或全抗体的约十分之一重量的分子量。域抗体可以衍生自全抗体，如本文所描述的那些抗体。在一些实施例中，抗原结合片段是单体或聚合的、双特异性或三特异性的并且是二价或三价的。
含有抗体分子的抗原结合或独特位(idiotope)的抗体片段共享常见独特型并且由本公开涵盖。这类抗体片段可以由所属领域中已知的技术产生，并且包括但不限于可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段；可以通过减少F(ab′)2片段的二硫桥键产生的Fab′片段；和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的两个Fab′片段。
在示范性方面中，本文所提供的结合剂是单链可变区片段(scFv)抗体片段。scFv可以由包含抗体重链的可变(V)域的截短Fab片段组成，所述可变(V)域经由合成肽连接到抗体轻链的V域，并且scFv可以使用常规重组DNA技术技术产生(参见例如 Janeway等人，《免疫生物学(Immunobiology)》，第2版，加兰出版社(Garland出版)，纽约(New York)，(1996))。类似地，二硫键稳定化可变区片段(dsFv)可以通过重组 DNA技术制备(参见例如Reiter等人，《蛋白质工程(Protein Engineering)》，7， 697-704(1994))。
在示范性方面中，本文所提供的IL13Rα2结合剂是scFv。在示范性方面中，scFv 包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个。在示范性方面中，scFv包含SEQ ID NO： 7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，scFv包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，scFv包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列，并且SEQ IDNO：7的氨基酸序列经由连接子融合到SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含约5到约25个氨基酸、例如约10到约20个氨基酸的短氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含EEGEFSEAR(SEQ ID NO10)的氨基酸序列。在示范性方面中，连接子包含AKTTPPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO：80) 的氨基酸序列。在示范性方面中，本文所提供的scFv包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
重组抗体片段，例如本公开的scFv，也可以经过工程改造以组装于对不同靶抗原具有高结合亲合力和特异性的稳定多聚体寡聚物中。这类双功能抗体(二聚体)、三功能抗体(三聚体)或四功能抗体(四聚体)在所属领域中是众所周知的。参见例如Kortt 等人，《生物分子工程(Biomol Eng)》.2001 18：95-108，(2001)和Todorovska等人，《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》.248：47-66，(2001)。
在示范性方面中，结合剂是双特异性抗体(bscAb)。双特异性抗体是包含两个单链Fv片段的分子，所述两个单链Fv片段使用重组方法经由甘氨酸-丝氨酸连接子接合。在示范性实施例中，所关注的两个抗体的V轻链(VL)和V重链(VH)域使用标准PCR 方法分离。随后在两步融合PCR中，获自每一杂交瘤的VL和VH cDNA接合以形成单链片段。双特异性融合蛋白以类似方式制备。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白是包括在本发明范围内的抗体物质。示范性的双特异性抗体教示于美国专利申请公开第 2005-0282233A1号和国际专利申请公开第WO 2005/087812号中，以上公开的应用均以全文引用的方式并入本文中。
在示范性方面中，结合剂是含有两个产生为单一多肽链的scFv的双特异性T细胞啮合抗体(BiTE)。在示范性方面中，结合剂是包含两个scFv的BiTE，其中至少一个scFv包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个或包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8。制备并且使用BiTE抗体的方法描述于所属领域中。参见例如Cioffi等人，《临床癌症研究(ClinCancer Res)》18：465，Brischwein等人，《分子免疫学(Mol Immunol)》 43：1129-43(2006)；Amann M等人，《癌症研究(Cancer Res)》68：143-51(2008)；Schlereth 等人，《癌症研究》65：2882-2889(2005)；和Schlereth等人，《癌症免疫与免疫疗法 (Cancer ImmunolImmunother)》55：785-796(2006)。
在示范性方面中，结合剂是双重亲和力再靶向抗体(dual affinity re-targeting antibody，DART)。DART产生为通过使链间二硫键稳定而接合的单独多肽。在示范性方面中，结合剂是包含scFv的DART，所述scFv包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个或包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8。制备并且使用DART抗体的方法描述于所属领域中。参见例如Rossi等人，《mAb》6：381-91(2014)；Fournier和 Schirrmacher，生物制药《BioDrugs》27：35-53(2013)；Johnson等人，《分子生物学杂志(J Mol Biol)》399：436-449(2010)；Brien等人，《病毒学杂志(J Virol)》87：7747-7753 (2013)；和Moore等人，《血液(Blood)》117：4542(2011)。
在示范性方面中，结合剂是四价串联双功能抗体(TandAb)，其中抗体片段产生为呈头到尾布置形式的非共价均二聚体折叠子(folder)。在示范性方面中，结合剂是包含scFv的TandAb，所述scFv包含SEQ ID NO：1-6的氨基酸序列中的每一个或包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8。TandAb在所属领域中已知。参见例如McAleese等人，《未来肿瘤学(Future Oncol)》8：687-695(2012)；Portner等人，《癌症免疫与免疫疗法(Cancer ImmunolImmunother)》61：1869-1875(2012)；和Reusch等人，《mAb》6：728(2014)。
在示范性方面中，BiTE、DART或TandAb包含SEQ ID NO：1-6的CDR。在示范性方面中，BiTE、DART或TandAb包含SEQ ID NO：7和8的氨基酸序列。在示范性方面中，BiTE、DART或TandAb包含SEQ ID NO：13。
合适的制备抗体的方法在所属领域中已知。举例来说，标准杂交瘤方法描述于例如 Harlow和Lane(编)，《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，CSH出版社(CSH Press)(1988)，和CA.Janeway等人(编)，免疫生物学，第5版，加兰出版社，纽约，纽约州(NY)(2001))。
用于本发明中的单克隆抗体可以使用任何技术制备，所述任何技术通过培养物中的传代细胞系提供抗体分子的产生。这些技术包括但不限于最初由Koehler和Milstein(《自然(Nature)》256：495-497，1975)描述的杂交瘤技术；人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，《今日免疫学(Immunol Today)》4：72，1983；Cote等人，《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci)》80：2026-2030，1983)；和EBV杂交瘤技术(Cole等人，《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》，Alan R Liss Inc，纽约州纽约，第77-96页，(1985)。
简单来说，多克隆抗体是通过用包含本发明多肽的免疫原免疫动物并且从经过免疫的动物中收集抗血清来制备。大范围动物物种可以用于产生抗血清。在一些方面中，用于产生抗抗血清的动物是非人类动物，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、猪或马。因为兔的血量相对大，所以在一些示范性方面中兔是用于产生多克隆抗体的优选选择。在用于产生对所选择IL13Rα2抗原决定基具免疫反应性的多克隆抗血清的一示范性方法中，在弗氏完全佐剂(Freund′s Complete Adjuvant)中乳化50μg IL13Rα2抗原用于兔的免疫接种。在例如21天的间隔下，在弗氏不完全佐剂中乳化50μg抗原决定基用于增强。多克隆抗血清可以在抗体产生的允许时间后仅通过使动物出血并且由全血制备血清样品来获得。
简单来说，在示范性实施例中，为产生单克隆抗体，用重组IL13Rα2(针对其抗体待升高)(例如10-20μg乳化于弗氏完全佐剂中的IL13Rα2)周期性地注射小鼠。小鼠获得含有允许特异性识别PBS中的淋巴内皮细胞的抗原决定基的IL13Rα2多肽的最终预融合加强，并且四天后处死小鼠并且移出其脾。将脾置于10ml无血清RPMI 1640中，并且通过在两个玻璃显微镜载片的毛端之间研磨脾而形成单细胞悬浮液，所述载片浸没于补充有2mM L谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的无血清RPMI 1640中(RPMI)(吉毕科(Gibco)，加拿大(Canada))。经由无菌70 目Nitex细胞过滤器(贝克顿-迪金森(BectonDickinson)，新泽西州派西派尼市 (Parsippany，N.J.)过滤细胞悬浮液，并且通过在200g下离心5分钟而洗涤两次，并且将离心块再悬浮于20ml无血清RPMI中。以类似方式制备获自三只未处理Balb/c小鼠的脾细胞并且将其用作对照。将NS-1骨髓瘤细胞，其在融合之前在具有11％胎牛血清 (FBS)(海克隆实验室公司(Hyclone Laboratories，Inc.)，犹他州洛根(Logan，Utah))的 RPMI中维持对数期三天，在200g下离心5分钟，并且洗涤离心块两次。
将脾细胞(1×108)与2.0×107NS-1细胞组合并且离心，并且抽吸上清液。通过轻敲试管移出细胞离心块，并且历经1分钟时程在搅拌下添加1ml的37℃ PEG 1500 (50％于75mM Hepes中，pH 8.0)(宝灵曼(Boehringer Mannheim))，随后历经7分钟添加7ml无血清RPMI。添加额外8ml RPMI并且在200g下离心细胞10分钟。舍弃上清液后，将离心块再悬浮于200ml含有15％FBS、100μM次黄嘌呤钠、0.4μM氨基喋呤、16μM胸苷(HAT)(吉毕科)、25单位/毫升IL-6(宝灵曼)和1.5×106个脾细胞/ 毫升的RPMI中，并且接种于10个康宁(Corning)底部平坦的96孔组织培养板(康宁，纽约州康宁)中。
在第2、4和6天，在融合后，从融合板的孔中去除100μl培养基并且用新鲜培养基替换。在第8天，通过ELISA筛选融合体，如下测试结合到IL13Rα2的小鼠IgG的存在。在37℃下用100纳克/孔的稀释于25mM pH 7.5 Tris中的IL13Rα2涂布Immulon 4 个板(Dynatech(戴雷泰克)，马萨诸塞州剑桥市(Cambridge，Mass.)，持续2小时。抽吸涂布溶液并且添加200微升/孔的阻断溶液(稀释于CMF-PBS中的0.5％鱼皮明胶(西格玛(Sigma))，并且在37℃下培育30分钟。用含有0.05％Tween 20(PBST)的PBS 洗涤板三次，并且添加50μ培养物上清液。在37℃下培育30分钟并且如上洗涤后，添加50μl按1∶3500稀释于PBST中的辣根过氧化酶缀合的山羊抗小鼠IgG(Fc)(杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)，宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove，Pa.))。如上培育板，用PBST洗涤四次并且添加100μl底物，所述底物由于100mM pH 4.5柠檬酸盐中的1mg/ml邻亚苯基二胺(西格玛)和0.1μl/ml 30％H2O2组成。5分钟后停止显色反应，添加50μl 15％H2SO4。使用板读取器(戴雷泰克)测定A490吸光度。
通过稀释于96孔板中将所选择融合孔克隆两次，并且5天后对每孔的菌落数进行视觉评分。使用Isostrip系统(宝灵曼，印第安纳州的印第安纳波利斯(Indianapolis，Ind.)) 对杂交瘤产生的单克隆抗体进行同型化。
当采用杂交瘤技术时，可以使用骨髓瘤细胞系。适合用于产生杂交瘤的融合程序中的这类细胞系优选是非抗体产生的，具有高融合效率和酶不足，所述酶不足使其不能在仅支持所期望融合细胞(杂交瘤)生长的某种选择性培养基中生长。举例来说，在经过免疫的动物是小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、 Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/15XX0 Bul；对于大鼠，可以使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、 LICR-LON-HMy2和UC729-6均适用于与细胞融合体连接。应注意，通过用于产生单克隆抗体的这类技术产生的杂交瘤和细胞系预期是本公开的组合物。
取决于宿主物种，可以使用各种佐剂来增加免疫应答。这类佐剂包括但不限于弗氏；矿物凝胶，如氢氧化铝；和表面活性物质，如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔螺血氰蛋白和二硝基苯酚。卡介苗((bacilliCalmette-Guerin，BCG)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)是潜在适用的人类佐剂。
或者，可以使用其它方法，如所属领域中已知的EBV杂交瘤方法(Haskard和Archer，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》，74(2)，361-67(1984)和Roder等人5《酶学方法(Methods Enzymol.)》，121，140-67(1986))；和噬菌体载体表达系统(参见例如Huse等人，《科学(Science)》，246，1275-81(1989))。此外，在非人类动物中产生抗体的方法描述于例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公开第 2002/0197266 A1)号中。
抗体还可以通过诱导淋巴细胞群体的体内产生或通过筛选高度特异性结合试剂的重组免疫球蛋白文库或图来产生，如Orlandi等人(《美国国家科学院院刊》86： 3833-3837；1989)以及Winter和Milstein(《自然》349：293-299，1991)中所公开。
此外，噬菌体呈现可用以产生本公开的抗体。在这点上，编码抗体的抗原结合可变(V)域的噬菌体文库可以使用标准分子生物学和重组DNA技术产生(参见例如Sambrook 等人(编)，《分子克隆实验指南(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)》，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约(2001))。编码具有所期望特异性的可变区的噬菌体选用于特异性结合到所期望抗原，并且完全或部分抗体经过复原包含所选择的可变域。编码复原抗体的核酸序列被引入到适合的细胞系如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞中，使得细胞分泌具有单克隆抗体特征的抗体(参见例如Janeway 等人，前述；Huse等人，前述和美国专利6,265,150)。相关方法也描述于美国专利第 5,403,484号；第5,571,698号；第5,837,500号；和第5,702,892号中。美国专利第5,780,279 号、第5,821,047号、第5,824,520号、第5,855,885号、第5,858,657号、第5,871,907 号、第5,969,108号、第6,057,098号和第6,225,447号中所描述的技术也预期为适用于制备根据本公开的抗体。
抗体可以由特异性重链和轻链免疫球蛋白基因为转基因的转基因小鼠产生。这类方法在所属领域中已知并且描述于例如美国专利第5,545,806号和第5,569,825号以及Janeway等人，前述中。
用于产生人源化抗体的方法在所属领域中众所周知并且详细地描述于例如Janeway 等人，前述；美国专利第5,225,539号、第5,585,089号和第5,693,761号；欧洲专利第0239400 B1号；和联合王国专利第2188638号中。人源化抗体也可以使用美国专利第 5,639,641号和Pedersen等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，235：959-973(1994) 中所描述的抗体表面重修技术来产生。
可以使用经过开发用于“嵌合抗体”产生的技术，即将小鼠抗体基因与人类抗体基因拼接以获得具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人，《美国国家科学院院刊》81：6851-6855，1984；Neuberger等人，《自然》312：604-608，1984；和Takeda 等人，《自然》314：452-454；1985)。或者，经过描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可以适于产生IL13Rα2特异性单链抗体。
优选的嵌合或人源化抗体具有人类恒定区，而抗体的可变区或至少一CDR衍生自非人类物种。用于使非人类抗体人源化的方法在所属领域中众所周知。(参见美国专利第5,585,089号和第5,693,762号)。一般来说，人源化抗体具有一个或多个引入到来自非人类来源的CDR区和/或其构架区中的氨基酸残基。人源化可以例如使用Jones等人 (《自然》321：522-525，1986)、Riechmann等人(《自然》332：323-327，1988)和Verhoeyen 等人(《科学》239：1534-1536，1988)中所描述的方法，通过用啮齿动物互补决定区(CDR) 的至少一部分取代人类抗体的对应区来进行。用于制备工程改造抗体的诸多技术描述于例如Owens和Young，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)》，168：149-165(1994)中。随后可以将其它变化引入到抗体构架中以调节亲和力或免疫原性。
与前述描述一致，包含CDR的组合物可以至少部分地使用所属领域中已知的技术来产生以分离CDR。互补决定区的特征在于六个多肽环，三个环针对重链或轻链可变区中的每一个。CDR中的氨基酸位置由Kabat等人，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列 (Sequences ofProteins of Immunological Interest)》，美国卫生和公众服务部(U.S. Department ofHealth and Human Services)，(1983)界定，所述文献以引用的方式并入本文中。举例来说，人类抗体的高变区经过粗略地界定发现在重链和轻链可变区的残基28 到35、49-59和残基92-103处[Janeway等人，前述]。发现鼠类CDR也恰在这些氨基酸残基处。应理解，在所属领域中，CDR区可以发现于具有上文所阐述的适当氨基酸位置的若干氨基酸内。免疫球蛋白可变区也由围绕CDR的四个“构架”区(FR1-4)组成。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内高度保守，并且也在人类与鼠类序列之间保守。
产生包含单克隆抗体的重链可变区或轻链可变区的一个、两个和/或三个CDR的组合物。举例来说，使用包含具有SEQ ID NO：1-6序列的CDR的杂交瘤克隆47的抗体，产生包含这些CDR的多肽组合物。也涵盖包含抗体的一个、二个、三个、四个、五个和/或六个互补决定区的多肽组合物。使用围绕CDR的保守构架序列，产生与这些共同构架序列互补的PCR引物，以扩增定位于引物区之间的CDR序列。用于克隆并且表达核苷酸和多肽序列的技术在所属领域中是公认的[参见例如Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第2版，冷泉港，纽约(1989)]。所扩增的CDR序列接合于适当质粒中。包含一个、二个、三个、四个、五个和/或六个克隆CDR的质粒任选地含有编码连接到CDR 的区域的额外多肽。
预期产生经过修饰的多肽组合物，其包含具有SEQ ID NO：1-6的重链或轻链的一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR，其中CDR经过改变以提供针对标靶IL13Rα2 的增加的特异性或亲和力或亲合力。在CDR中的位置处的位点典型地经过连续修饰，例如通过首先用保守选择取代(例如疏水性氨基酸取代不相同的疏水性氨基酸)并且随后用更不相似的选择取代(例如疏水性氨基酸取代带电荷氨基酸)，并且随后可以在标靶位点处进行缺失或插入。
鼠类抗体的构架区(FR)通过取代相容的人类构架区人源化，所述相容的人类构架区选自人类抗体可变序列的大数据库，包括超过一千二百个人类VH序列和超过一千个 VL序列。用于比较的抗体序列的数据库从Andrew C.R.Martin′s KabatMan web page (http：//www.rubic.rdg.ac.uk/abs/)下载。用于鉴别CDR的卡巴特(Kabat)法提供用于描绘任何人类抗体的近似CDR和构架区并且针对相似性比较鼠类抗体的序列以确定CDR 和FR的手段。最匹配的人类VH和VL序列基于高的整体构架匹配、类似CDR长度以及典型和VH/VL接触残基的最小错配而选择。最类似于鼠类序列的人类构架区被插入在鼠类CDR之间。或者，鼠类构架区可以通过对更接近地类似人类抗体构架区的原生构架区的全部或部分进行氨基酸取代来修饰。
“保守”氨基酸取代基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性来进行。举例来说，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸(Ala，A)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、缬氨酸(Val，V)、脯氨酸(Pro，P)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和甲硫氨酸(Met，M)；极性中性氨基酸包括甘氨酸 (Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、酪氨酸(Tyr， Y)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)；带正电(基础)氨基酸包括精氨酸(Arg， R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；并且带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸 (Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。“插入”或“缺失”优选在约1到20个氨基酸、更优选1 到10个氨基酸范围内。可以通过使用重组DNA技术在多肽分子中系统地进行氨基酸取代并且分析所得重组变异体的活性来引入变化。可以在不同物种在核酸方面不同的位点 (可变位置)处或在高度保守区(恒定区)中进行核酸改变。下文更详细地描述用于表达适用于本发明的多肽组合物的方法。
此外，用于产生用于本公开方法的抗体的另一适用技术可以是使用合理设计型方法的技术。合理设计的目标是制造相互作用的生物活性多肽或化合物的结构类似物(促效剂、拮抗剂、抑制剂、肽模拟物、结合伴侣等等)。在这种情况下，活性多肽包含本文所公开的SEQ ID NO：1-6的序列。通过生成这类类似物，有可能形成比原生或天然分子更具免疫反应性的额外抗体。在一种方法中，将产生抗体或其抗原决定基结合片段的三维结构。这可以通过x射线结晶学、计算机建模或通过两种方法的组合实现。一种替代方法-“丙氨酸扫描”-涉及残基贯穿具有丙氨酸的分子的随机替代，并且确定对功能的所得影响。
解析特异性抗体的晶体结构也是可能的。原则上，这种方法得到后续药物设计可以以其为基础的制药核心(pharmacore)。有可能通过将抗独特型抗体产生为功能性药理学活性抗体而完全绕过蛋白质结晶学。作为镜像的镜像，预期抗独特型抗体的结合位点是初始抗原的类似物。随后抗独特型抗体用以从以化学或生物学方式产生的肽的库中鉴别并且分离额外抗体。
化学合成的双特异性抗体可以通过借助化学物质如异双官能试剂丁二酰亚胺基-3-(2-呲啶基二硫醇)-丙酸酯(SPDP，Pierce Chemicals，伊利诺斯州罗克福德(Rockford，I11))使异源Fab或F(ab′)2片段化学交联来制备。Fab和F(ab′)2片段可以通过分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体而获自完整抗体(Karpovsky等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》160：1686-701，1984；Titus等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》， 138：4018-22，1987)。
无论抗体怎样产生，测试抗体结合到IL13Rα2的抗原决定基的能力的方法在所属领域中已知并且包括任何抗体-抗原结合分析，例如放射免疫分析(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争抑制分析(参见例如Janeway等人，下文，和美国专利申请公开第2002/0197266 A1号)。
出于本文的目的，从抗体群体中选择抗体也包括使用血管内皮细胞“减去”与在这类细胞上的不为IL13Rα2抗原决定基的抗原决定基交叉反应的那些抗体。剩余的抗体群体在优先用于IL13Rα2抗原决定基的抗体中富集。
适体
组合科学领域中的最新进展已鉴别出对给定标靶具有高的亲和力和特异性的短聚合物序列(例如寡核苷酸或肽分子)。举例来说，已使用SELEX技术来鉴别竞争哺乳动物抗体的具有结合特性的DNA和RNA适体，免疫学领域已产生并且分离结合到大量化合物的抗体或抗体片段，并且已经利用噬菌体呈现来发现具有极有利结合特性的新肽序列。基于这些分子演变技术的成功，确定可以生成结合到任何靶分子的分子。环结构经常涉及如在适体的情况下提供所期望的结合属性，所述适体经常利用产自无互补碱基配对的短区域的发夹环，利用环形高可变区的组合布置的天然衍生的抗体，和利用环肽的新噬菌体呈现文库，所述新噬菌体呈现文库当与线性肽噬菌体呈现结果相比较时已显示提高的结果。因此，已产生足够的证据以指示到高亲和力配位体可以通过组合分子演变技术来生成和鉴别。对于本发明，分子演变技术可以用以分离特异于本文所公开的 IL13Rα2的结合剂。关于适体的更多内容，一般参见Gold，L.，Singer，B.，He，Y.Y.，Brody. E.，“作为治疗剂和诊断剂的适体(Aptamers As Therapeutic And Diagnostic Agents)，”《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74：5-13(2000)。用于产生适体的相关技术见于美国专利第6,699,843号，所述专利以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，适体通过制备核酸文库、使核酸文库与生长因子接触来产生，其中选择并且扩增对生长因子具有更大结合亲和力(相对于其它文库核酸)的核酸以得到富含针对结合到生长因子具有相对较高的亲和力和特异性的核酸的核酸混合物。可以重复所述过程，并且使所选择的核酸突变并且重新筛选，其中生长因子适体被鉴别。可以筛选核酸以选择结合到多于标靶的分子。结合多于一种标靶可以指同时或竞争性地结合多于一种标靶。在一些实施例中，结合剂包含至少一种适体，其中第一结合单元结合 IL13Rα2的第一抗原决定基并且第二结合单元结合IL13Rα2的第二抗原决定基。
关于本公开组合物的结合剂，在将结合剂结合到IL13Rα2时IL13Rα2的配位体诱导的活化降低。如本文所使用，术语“降低”以及类似术语例如“抑制”未必暗示100％或完全的降低或抑制。相反，存在降低或抑制的变化程度，其中所属领域的一般技术人员认为具有潜在益处或治疗作用。相应地，在一些实施例中，IL13Rα2的配位体诱导的活化被完全消除。在一些实施例中，当不存在结合剂或其不结合到IL13Rα2时，相较于IL13Rα2 的配位体诱导的活化，配位体诱导的活化基本上降低，例如降低约10％(例如约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％)或更多。测量IL13Rα2 的配位体诱导的活化的方法在所属领域中已知，并且包括例如下文实例中所描述的分析。
缀合物
本文公开包含靶向域和效应域的缀合物。在示范性实施例中，缀合物包含本文所公开的结合剂中的任一种作为靶向域以将缀合物定位到表达IL13Rα2的细胞，例如表达IL13Rα2的肿瘤细胞；和效应域。在示范性方面中，缀合物是融合蛋白。在示范性方面中，缀合物是嵌合蛋白。如本文所使用，术语“嵌合”是指由不同来源的部分构成的分子。总体上嵌合分子是非天然存在的，例如合成或重组的，但包含嵌合分子的部分可以是天然存在的。
示范性效应域
如本文所使用，术语“效应域”是指影响所期望的生物功能的缀合物的一部分。在示范性方面中，效应域鉴别或定位IL13Rα2表达细胞。举例来说，效应域可以是诊断剂，例如放射性标记物、荧光标记物、酶(例如催化量热或荧光反应)、底物、固体基质或载体(例如生物素或抗生物素蛋白)。在一些方面中诊断剂是成像剂。许多适当的成像剂在所属领域中已知，将标记剂附接到本发明肽的方法也一样(参见例如美国专利第 4,965,392号；第4,472,509号；第5,021,236号；和第5,037,630号；每一专利以引用的方式并入本文中)。向个体给予在药学上可接受的载剂中的成像剂，并且使其积累于具有淋巴内皮细胞的标靶位点处。随后这种成像剂充当用于标靶位点的X射线、磁共振、正电子发射断层扫描(positronemission tomography)、单光子发射计算机断层扫描(single photon emission computedtomography，SPECT)，或超声或闪烁成像的对比试剂。当然，应理解，成像可以在体外进行，其中来自个体的组织经由活检获得，并且淋巴内皮细胞的存在借助于本文所描述的成像剂以及用于制备和固定组织的组织化学技术来确定。适用于本发明的成像剂的顺磁离子包括例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。适用于X射线成像的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II) 并且尤其铋(III)。用于诊断应用的放射性同位素包括例如211砹、14碳、51铬、36氯、57钴、67铜、152铕、67镓、3氢、123碘、125碘、111铟、59铁、32磷、186铼、75硒、35硫、99m锝、90钇和99锆。
效应域可以是改变缀合物的物理-化学特征的一者，例如赋予增加的溶解性和/或稳定性和/或半衰期、抗蛋白水解分裂性、清除率的调节的效应子。在示范性方面中，效应域是聚合物、碳水化合物或脂质。
聚合物可以是分枝或未分枝的。聚合物可以具有任何分子量。在一些实施例中，聚合物具有在约2kDa到约100kDa之间的平均分子量(术语“约”指示在制备水溶性聚合物中，一些分子将比所规定的分子量更重，一些分子比所规定的分子量更轻)。在一些方面中，聚合物的平均分子量在约5kDa与约50kDa之间，在约12kDa到约40kDa之间或在约20kDa到约35kDa之间。在一些实施例中，聚合物经过修饰具有单个反应性基团，如针对酰化的活性酯或针对烷基化的醛，使得聚合度可以受到控制。在一些实施例中，聚合物是水溶性的，使得其附接的蛋白质不在水性环境如生理环境中沉淀。在一些实施例中，当例如组合物用于治疗用途时，聚合物是药学上可接受的。此外，在一些方面中，聚合物是聚合物的混合物，例如共聚物、嵌段共聚物。在一些实施例中，聚合物选自由以下组成的组：聚酰胺；聚碳酸酯；聚亚烷基和其衍生物，包括聚亚烷二醇、聚烷醚、聚对苯二甲酸亚烷酯；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)；聚乙烯基聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯基卤化物、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯呲咯烷酮；聚乙交酯；聚硅氧烷；聚氨基甲酸酯和其共聚物；纤维素，包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟基丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和硫酸纤维素钠盐；聚丙烯；聚乙烯，包括聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)及聚(对苯二甲酸乙二酯)；和聚苯乙烯。在一些方面中，聚合物是生物可降解聚合物，包括合成生物可降解聚合物(例如乳酸与乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原)酸酯、聚氨基甲酸酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚 (丙交酯-共-己内酯))，和天然生物可降解聚合物(例如，海藻酸盐和其它多糖(包括聚葡萄糖和纤维素)、胶原蛋白、其化学衍生物(取代、添加例如烷基、亚烷基的化学基团、羟基化、氧化和所属领域的技术人员通常进行的其它修饰)、白蛋白和其它亲水性蛋白质(例如，玉米蛋白(zein)和其它醇溶谷蛋白(prolamine)和疏水性蛋白质))，以及其任何共聚物或混合物。一般来说，这些材料在体内通过酶水解或暴露于水、通过表面或整体侵蚀而降解。在一些方面中，聚合物是生物粘附聚合物，如生物可侵蚀性水凝胶(由H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubbell于《大分子(Macromolecules)》，1993， 26，581-587中描述，该文献的教示内容并入本文中)、聚玻尿酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白(glutin)、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸盐、聚葡萄胺糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚 (甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)及聚(丙烯酸十八烷酯)。在一些实施例中，聚合物是水溶性聚合物或亲水性聚合物。合适的水溶性聚合物在所属领域中已知并且包括例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC；Klucel)、羟丙基甲基纤维素(HPMC；Methocel)、硝基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基丁基纤维素、羟丙基戊基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素(Ethocel)、羟乙基纤维素、各种烷基纤维素和羟烷基纤维素、各种纤维素醚、乙酸纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、乙酸乙烯酯/丁烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸羟基烷酯、甲基丙烯酸羟基甲酯、甲基丙烯酸共聚物、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、马来酸酐/甲基乙烯醚共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和聚丙烯酸钙、聚丙烯酸、酸性羧基聚合物、羧基聚亚甲基、羧基乙烯基聚合物、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、聚甲基乙烯醚-共-马来酸酐、羧甲基酰胺、甲基丙烯酸钾二乙烯基苯共聚物、聚氧基乙二醇、聚氧化乙烯，以及其衍生物、其盐和其组合。在一些方面中，水溶性聚合物或其混合物包括但不限于N连接或O连接的碳水化合物、糖、磷酸盐、碳水化合物；糖；磷酸盐；聚乙二醇(PEG)(包括已经用以衍生蛋白质的PEG形式，包括单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇)；单甲氧基-聚乙二醇；聚葡萄糖(如，例如约6kD的低分子量聚葡萄糖)；纤维素；其它碳水化合物基聚合物；聚-(N-乙烯基呲咯烷酮)；聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物；聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。本公开也涵盖可以用以制备共价连接的多聚体的双官能交联分子。本文中使用的特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。如本文所使用，聚乙二醇意指涵盖可以用于衍生其它蛋白质的PEG形式中的任一种，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。PEG是线性或分枝的中性聚醚，以广泛范围的分子量获得，并且可溶于水和大多数有机溶剂中。当存在于水中时，PEG主要经由其高动态链运动性和疏水性在排除其它聚合物或肽方面有效，由此当附接到其它蛋白质或聚合物表面时生成水壳或水合球面。PEG是无毒性、非免疫原性的，并且由食品和药物管理局(Food andDrug Administration)认可用于内部消耗。蛋白质或酶当缀合到PEG时具有经过证实的生物活性、非抗原特性和当在动物中给予时降低的清除率。F.M.Veronese等人，用于治疗应用的单甲氧基聚(乙二醇)修饰的酶的制备和特性(Preparation and Properties ofMonomethoxypoly(ethylene glycol)-modified Enzymes for TherapeuticApplications)，于J. M.Harris编，《聚(乙二醇)化学--生物技术和生物医学应用(Poly(Ethylene Glycol) Chemistry--Biotechnical and Biomedical Applications)》，127-36，1992中，所述文献以引用的方式并入本文中。不希望受理论所束缚，这些现象可能归因于PEG在预防通过免疫系统的识别中的排除特性。此外，PEG已广泛地用于表面修饰程序以降低蛋白质吸附并且提高血液相容性。S.W.Kim等人，《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》516： 116-30 1987；Jacobs等人，《人工器官(Artif.Organs)》12：500-501，1988；Park等人，《聚合物科学杂志，A辑(J.Poly.Sci，Part A)》29：1725-31，1991，每一文献以全文引用的方式并入本文中。疏水性聚合物表面，如聚氨基甲酸酯和聚苯乙烯，可以通过PEG(MW 3,400)的接枝来修饰并且用作非血栓形成性表面(nonthrombogenicsurface)。归因于PEG 的水合作用，表面特性(接触角)可以与亲水性表面更加一致。更重要地，由PEG的高链运动性、水合球面和蛋白质排除特性所造成，蛋白质(白蛋白和其它血浆蛋白)吸附会大大地降低。在表面固定研究中，PEG(MW 3,400)被确定为理想大小，Park等人，《生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mat.Res.)》26：739-45，1992，而PEG(Mw 5,000) 在降低蛋白质抗原性方面是最有益的。F.M.Veronese等人，于J.M.Harris，等人，《聚(乙二醇)化学--生物技术和生物医学应用》，127-36中。用于制备PEG化结合剂多肽的方法可以包含以下步骤(a)使多肽与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)在结合剂多肽附接到一个或多个PEG基团的条件下反应，和(b)获得反应产物。一般来说，酰化反应的理想反应条件将基于已知参数和所期望的结果来确定。举例来说，PEG：蛋白质的比率越大，聚-PEG化产物的百分比越大。在一些实施例中，结合剂将在N端具有单个PEG部分。参见美国专利第8,234,784号，所述专利以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，效应域是碳水化合物。在一些实施例中，碳水化合物是单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、双糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉籽糖、水苏糖)、多糖(例如淀粉、淀粉酶、胶淀粉、纤维素、几丁质、愈创聚葡糖(callose)、昆布糖(1aminarin)、木聚糖、甘露聚糖、褐藻糖胶或半乳甘露聚糖)。
在一些实施例中，效应域是脂质。在一些实施例中，脂质是脂肪酸、类廿烷酸(eicosanoid)、前列腺素、白三烯、血栓素、N-酰基乙醇胺、甘油脂质(例如，单取代甘油、双取代甘油、三取代甘油)、甘油磷脂(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如，神经鞘胺醇、神经酰胺)、固醇脂质(例如，类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质(prenol lipid)、糖脂质、或聚酮化合物(polyketide)、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯或磷脂。
致死域
在示范性方面中，效应域是赋予致死性的致死域，使得当缀合物定位到表达IL13Rα2 的细胞例如表达IL13Rα2的肿瘤细胞时。效应域向缀合物赋予一旦结合剂已发现并且结合到其IL13Rα2标靶就杀死IL13Rα2表达细胞的能力。
在示范性方面中，效应域是细胞毒素(在本文中也被称作“细胞毒性剂”)。细胞毒性剂是对细胞具有毒性的任何(化学或生物化学)分子。在一些实施例中，细胞毒性剂是化学治疗剂。化学治疗剂在所属领域中已知并且包括但不限于铂配位化合物、拓扑异构酶抑制剂、抗生素、抗有丝分裂生物碱和二氟核苷，如美国专利第6,630,124号中所描述。在一些实施例中，化学治疗剂是铂配位化合物。术语“铂配位化合物”是指提供呈离子形式的铂的任何肿瘤细胞生长抑制铂配位化合物。在一些实施例中，铂配位化合物是顺-二氨二水合铂(II)-离子(cis-diamminediaquoplatinum(II)-ion)；氯(二亚乙基三胺)- 氯化铂(II)(chloro(diethylenetriamine)-platinum(II)chloride)；(乙二胺)-二氯合铂(II)(dichloro(ethylenediamine)-platinum(II))、(1，1-环丁烷二甲酸)二氨合铂(II)(卡铂(carboplatin))；螺铂；异丙铂；(2-乙基丙二酸)-二氨合铂(II) (diammine(2-ethylmalonato)-platinum(II))；乙二胺丙二酸铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)- 水合硫酸铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)丙二酸铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)(4-羧基邻苯二甲酸)铂(II)((4-caroxyphthalato)(1，2-diaminocyclohexane)platinum(II))；(1，2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸)铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)顺(丙酮酸)铂(II)；(1，2-二氨基环己烷)草酸铂(II)；奥马铂(ormaplatin)；或四铂。在一些实施例中，顺铂是本发明的组合物和方法中所采用的铂配位化合物。顺铂可按名称PLATINOLTM商购自Bristol Myers-SquibbCorporation，并且可以用于与水、无菌盐水或其它合适的媒剂配制的粉末形式获得。适合用于本发明中的其它铂配位化合物是已知的并且可商购和/或可以通过常规技术制备。在各种人类实体恶性肿瘤的治疗中，顺铂或顺-二氯二氨铂II已作为化学治疗剂成功地使用了很多年。近年来，在各种人类实体恶性肿瘤的治疗中，其它二氨基-铂络合物也已显示作为化学治疗剂的功效。这类二氨基-铂络合物包括但不限于螺铂和卡铂。尽管顺铂和其它二氨基-铂络合物已广泛地用作人类的化学治疗剂，但其不得不以会引起毒性问题如肾损害的高剂量水平递送。
在一些实施例中，化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶是能够改变真核细胞中的DNA拓扑结构的酶。其对细胞功能和细胞增殖很关键。一般来说，在真核细胞中存在两种类别的拓扑异构酶，I型和II型。拓扑异构酶I是具有约100,000分子量的单体酶。所述酶结合到DNA并且引入短暂的单链断裂，使双螺旋解旋(或允许其展开)，并且随后将裂口再封合，之后从DNA链解离。各种拓扑异构酶抑制剂最近已在罹患卵巢癌、食道癌或非小细胞肺癌的人类的治疗中显示临床功效。在一些方面中，拓扑异构酶抑制剂是喜树碱(camptothecin)或喜树碱类似物。喜树碱是水不溶性的细胞毒性生物碱，由中国本土的喜树(Camptotheca accuminata tree)和印度本土的青脆枝树 (Nothapodytes foetidatree)产生。喜树碱展现针对许多肿瘤细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。喜树碱类似物类别的化合物是DNA拓扑异构酶I的典型的特异性抑制剂。术语“拓扑异构酶的抑制剂”意指结构上与喜树碱相关的任何肿瘤细胞生长抑制化合物。喜树碱类似物类别的化合物包括但不限于拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)和9- 氨基-喜树碱。在额外实施例中，细胞毒性剂是以下中所要求或描述的任何肿瘤细胞生长抑制喜树碱类似物：美国专利第5,004,758号；欧洲专利申请号883 11366.4(公开号EP 0 321 122)；美国专利第4,604,463号；欧洲专利申请公开号EP 0 137 145；美国专利第 4,473,692号；欧洲专利申请公开号EP 0074 256；美国专利第4,545,880号；欧洲专利申请公开号EP 0 074 256；欧洲专利申请公开号EP 0 088 642；Wani等人，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》，29，2358-2363(1986)；和Nitta等人，《会刊(Proc.)》第14 届国际化疗会议(14th InternationalCongr.Chemotherapy)，京都(Kyoto)，1985，东京出版社(Tokyo Press)，抗癌章节1，第28-30页。确切地说，本公开涵盖称作CPT-11 的化合物。CPT-11是具有4-(哌啶基)-哌啶侧链的喜树碱类似物，所述侧链经由氨甲酸酯连接在10-羟基-7-乙基喜树碱的C-10处接合。CPT-11目前正经历人类临床试验并且还被称作伊立替康；Wani等人，《药物化学杂志》，23，554(1980)；Wani等人，《药物化学杂志》，30，1774(1987)；美国专利第4,342,776号；欧洲专利申请公开号EP 418 099；美国专利第4,513,138号；欧洲专利申请公开号EP 0 074 770；美国专利第4,399,276号；欧洲专利申请公开号0 056 692；以上文献中的每一个的全部揭示内容由此以引用的方式并入。喜树碱类似物类别的所有上文所列举化合物可商购和/或可以通过常规技术(包括上文所列举文献中所描述的那些技术)来制备。拓扑异构酶抑制剂可以选自由以下组成的组：拓朴替康、伊立替康和9-氨基喜树碱。
喜树碱类似物类别的诸多化合物(包括其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物)的制备，以及包含喜树碱类似物类别的这类化合物和惰性的药学上可接受的载剂或稀释剂的口服和肠胃外医药组合物的制备广泛地描述于美国专利第5,004,758号和欧洲专利申请号88311366.4(公开号EP 0 321 122)中，所述专利中的每一个的教示内容以全文引用的方式并入本文中。
在本发明的再一实施例中，化学治疗剂是抗生素化合物。合适的抗生素包括但不限于小红莓(doxorubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、博莱霉素(bleomycin)、道诺霉素(daunorubicin)和链脲霉素(streptozocin)。在一些实施例中，化学治疗剂是抗有丝分裂生物碱。一般来说，抗有丝分裂生物碱可以从从长春花(Cantharanthus roseus)中提取，并且作为抗癌化学治疗剂已显示为有效的。已在化学上和药理学上研究了大量的半合成衍生物(参见O.Van Tellingen等人，《抗癌研究(Anticancer Research)》，12，1699-1716(1992))。本发明的抗有丝分裂生物碱包括但不限于长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉醇(Taxol)和长春瑞宾(vinorelbine)。后两种抗有丝分裂生物碱可分别商购自礼来公司(Eli Lilly and Company)和皮耶法柏实验室(Pierre Fabre Laboratories)(参见美国专利第5,620,985号)。在本发明的一个方面中，抗有丝分裂生物碱是长春瑞宾。
在本发明的另一实施例中，化学治疗剂是二氟核苷。2′-脱氧-2′，2′-二氟核苷在所属领域中已知为具有抗病毒活性。这类化合物公开并且教示于美国专利第4,526,988号和第 4,8086 14号中。欧洲专利申请公开184,365公开到这些相同的二氟核苷具有溶瘤活性。在某些特定方面中，本公开的组合物和方法中所使用的2′-脱氧-2′，2′-二氟核苷是2′-脱氧 -2′，2′-二氟胞苷盐酸盐，也称为吉西他滨(gemcitabine)盐酸盐。吉西他滨可商购或可以按如美国专利第4,526,988号、第4,808,614号和第5,223,608号中所公开的多步方法合成，所述专利中的每一个的教示内容以全文引用的方式并入本文中。
在示范性方面中，效应域是造成IL13Rα2表达细胞编程性细胞死亡(apoptose)的细胞凋亡标签。在示范性方面中，细胞凋亡标签是TRAIL蛋白或其一部分。在示范性方面中，细胞凋亡标签包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在示范性方面中，缀合物包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。
在示范性实施例中，效应域是IgG或其它免疫球蛋白的Fc域。对于取代基，如人类IgG的Fc区，融合体可以直接融合到结合剂或经由插入序列融合。举例来说，人类 IgG铰链、CH2和CH3区可以在结合剂的N端或C端处融合以附接Fc区。所得Fc-融合体药剂使得能够经由蛋白A亲和柱(Pierce，伊利诺斯州罗克福德)纯化。融合到Fc 区的肽和蛋白质可以展现体内比未融合对应体基本上更大的半衰期。融合到Fc区的融合体允许融合多肽进行二聚化/多聚化。Fc区可以是天然存在的Fc区，或可以针对优异特征例如治疗质量、循环时间、减少的聚集而经过修饰。如上所指出，在一些实施例中，结合剂缀合(例如融合)到免疫球蛋白或其部分(例如可变区、CDR或Fc区)。已知类型的免疫球蛋白(Ig)包括IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。Fc区是Ig重链的C端区，其负责与进行如再循环(其导致半衰期延长)的活动的Fc受体的结合、抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
举例来说，根据一些定义，人类IgG重链Fc区从重链的Cys226延展到C端。“铰链区”一般从人类IgG1的Glu216延伸到Pro230(通过比对半胱氨酸键结中所涉及的半胱氨酸，可以将其它IgG同型物的铰链区与IgG1序列进行比对)。IgG的Fc区包括两个恒定域CH2和CH3。人类IgG Fc区的CH2域通常从氨基酸231延伸到氨基酸341。人类IgG Fc区的CH3域通常从氨基酸342延伸到447。对免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号的参考均基于Kabat等人1991，《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》，美国公共卫生部(U.S.Department ofPublic Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Md.)，其以引用的方式并入本文中。在相关实施例中，Fc区可以包含一个或多个不为CH1的来自免疫球蛋白重链的原生或经过修饰的恒定区，例如IgG和IgA的CH2区和CH3区，或IgE的CH3区和CH4区。
合适的缀合物部分包括包含FcRn结合位点的免疫球蛋白序列的部分。救助受体FcRn负责再循环免疫球蛋白并且使其返回到血液中的循环。已基于X射线结晶学描述了结合到FcRn受体的IgG Fc部分的区域(Burmeister等人1994，《自然》372：379)。 Fc与FcRn的主要接触区域接近CH2域与CH3域的接面。Fc-FcRn接触点均在单一Ig 重链内。主要接触位点包括CH2域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、 308-311和314，和CH3域的氨基酸残基385-387、428和433-436。
一些缀合物部分可能包括或可能不包括FcγR结合位点。FcγR负责抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。与FcγR直接接触的Fc区内位置的实例是氨基酸234-239(下端铰链区)、氨基酸265-269(B/C环)、氨基酸297-299 (C′/E环)和氨基酸327-332(F/G)环(Sondermann等人，《自然》406：267-273，2000)。IgE的下端铰链区也已与FcRI结合有关(Henry等人，《生物化学(Biochemistry)》36， 15568-15578，1997)。涉及IgA受体结合的残基描述于Lewis等人，(《免疫学杂志》 175：6694-701，2005)中。涉及IgE受体结合的氨基酸残基描述于Sayers等人(《生物化学杂志(J Biol Chem.)》279(34)：35320-5，2004)中。
可以对免疫球蛋白的Fc区进行氨基酸修饰。这类变异Fc区在Fc区的CH3域(残基342-447)中包含至少一个氨基酸修饰和/或在Fc区的CH2域(残基231-341)中包含至少一个氨基酸修饰。相信赋予FcRn以增加的亲和力的突变包括T256A、T307A、E380A 和N434A(Shields等人2001，《生物化学杂志》276：6591)。其它突变可以降低Fc区与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合而不显著降低对FcRn的亲和力。举例来说，用Ala或另一氨基酸取代Fc区的位置297处的Asn去除高度保守的N-糖基化位点并且可以降低Fc区的免疫原性，同时延长Fc区的半衰期，以及降低与FcγR的结合(劳特利奇等人1995，《移植(Transplantation)》60：847；Friend等人1999，《移植》68：1632；Shields等人1995，《生物化学杂志》276：6591)。已对IgG1的位置233-236 处进行氨基酸修饰以降低与FcγR的结合(Ward和Ghetie 1995，《治疗免疫学(Therapeutic Immunology)》2：77；和Armour等人1999，《欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)》 29：2613)。一些示范性的氨基酸取代描述于美国专利第7,355,008号和第7,381,408号中，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，结合剂融合到碱性磷酸酶(AP)。用于制备Fc或AP融合剂的方法提供于WO 02/060950中。
嵌合抗原受体(CAR)
在示范性方面中，效应域是T细胞信号传导域。在示范性方面中，缀合物是嵌合抗原受体(CAR)。嵌合抗原受体(CAR)是经过工程改造的跨膜蛋白，其将抗原-特异性抗体的特异性与T细胞受体功能组合起来。一般来说，CAR包含胞外域、间隔区、跨膜域和胞内域。在示范性方面中，CAR的胞外域包含抗原识别区域，其可以是抗原-特异性抗体的scFV。在一些实施例中，胞外域也包含将新生蛋白质引入内质网中的信号肽。在示范性方面中，胞外域包含将抗原识别区连接到跨膜域的间隔区。跨膜(TM)域是穿越细胞膜的CAR的部分。在示范性方面中，TM域包含疏水性α螺旋。在示范性方面中，TM域包含CD28的TM域的全部或一部分。在示范性方面中，TM域包含CD8α的 TM域的全部或一部分。CAR的胞内域包含一个或多个信号传导域。在示范性方面中，胞内域包含CD3的ζ链，其包含免疫受体酪胺酸基活化基元(ITAM)的三个拷贝。ITAM 一般包含由来自Leu或Ile的两个氨基酸分隔开的Tyr残基。在免疫细胞受体例如T细胞受体和B细胞受体的情况下，ITAM多次出现(至少两个)并且每一个ITAM通过6-8 个氨基酸与另一ITAM分隔开。CAR的胞内域还可以包含对下游信号转导至关重要的额外信号传导域，例如蛋白质部分。在示范性方面中，胞内域包含来自CD28、41BB或 4-1BB(CD137)、ICOS、CD27、CD40、OX40(CD134)或Myd88中的一个或多个的信号传导域。编码这类蛋白质的信号传导域的序列在本文中以SEQ ID NO：39-42、68-79、 81和83形式提供。制备CAR、在例如T细胞的细胞中表达CAR和在疗法中利用CAR 表达T细胞的方法在所属领域中已知。参见例如国际专利申请公开第WO2014/208760 号、第WO2014/190273号、第WO2014/186469号、第WO2014/184143号、第 WO2014180306号、第WO2014/179759号、第WO2014/153270号；美国申请公开第 US20140369977号、第US20140322212号、第US20140322275号、第US20140322183 号、第US20140301993号、第US20140286973号、第US20140271582号、第US20140271635号、第US20140274909号；欧洲申请公开第2814846号，其中的每一个以全文引用的方式并入。
在示范性方面中，本公开的缀合物是IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含本文所描述的结合剂、铰链区和胞内域，所述胞内域包含CD3ζ链的信号传导域和 CD28、CD134和/或CD137的信号传导域的。在示范性方面中，CAR包含(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ ID NO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)； AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和QQSKEVPWT(SEQ ID NO：6)；(B)铰链区；和(C) 胞内域，所述胞内域包含CD3ζ链的信号传导域和CD28、CD134和/或CD137的信号传导域。在示范性方面中，CD3ζ链信号传导域包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR基于CD28的跨膜(TM)域进一步包含TM域。在示范性方面中， CAR包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR基于CD8α的跨膜(TM) 域进一步包含TM域。在示范性方面中，CAR包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列。在示范性方面中，铰链区包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51的氨基酸序列。在示范性方面中，本公开的CAR的胞内域包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55的氨基酸序列。在示范性方面中，本公开的CAR的胞内域包含SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89的氨基酸序列。在示范性方面中，本公开的CAR的胞内域包含SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：95的氨基酸序列。在示范性方面中，本公开的CAR的胞内域包含SEQ ID NO：97、 SEQ ID NO：99或SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
在示范性方面中，胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域：CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和Myd88。在示范性方面中，胞内域包含SEQ ID NO：68、 70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个，上述氨基酸序列分别提供包含CD27 信号传导域的序列、包含CD40信号传导域的序列、包含CD134信号传导域的序列、包含CD137信号传导域的序列、包含ICOS信号传导域的序列和包含Myd88信号传导域的序列。
在示范性方面中，CAR包含(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ ID NO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)； RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和QQSKEVPWT (SEQ ID NO：6)；(B)铰链区；(C)胞内域，所述胞内域包含CD3ζ链的信号传导域和 CD28的信号传导域和至少一个其它信号传导域。在示范性方面中，CAR包含包含41BB 的信号传导域(CD137)的胞内域。在示范性方面中，CAR包含包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的胞内域。在示范性方面中，CD137信号传导是CD3ζ链信号传导链的N 端。在示范性方面中，胞内域包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR 包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。
在示范性方面中，CAR包含包含OX40的信号传导域(CD134)的胞内域。在示范性方面中，CAR包含包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的胞内域。在示范性方面中， CD137信号传导是CD3ζ链信号传导链的N端。在示范性方面中，胞内域包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR包含SEQ IDNO：99的氨基酸序列。
在示范性方面中，CAR包含(A)以下的氨基酸序列中的每一个：NYLMN(SEQ ID NO：1)；RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)； RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和QQSKEVPWT (SEQ ID NO：6)；(B)铰链区；(C)CD8α链的跨膜域；和(D)胞内域，所述胞内域包含CD3ζ链的信号传导域和任选地至少一个其它信号传导域。在示范性方面中，跨膜域包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR进一步包含CD137信号传导域和CD3ζ链信号传导域。在示范性方面中，CAR包含SEQID NO：93的氨基酸序列。在示范性方面中，CAR包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列。
作为一实例，提供三种额外IL13Rα2特异性CAR的序列。一种CAR含有CD8α TM 域和41BB.ζ信号传导域(由SEQ ID NO：94编码的SEQ ID NO：93)。其它两种CAR含有CD28 TM域和CD28.CD134.ζ(由SEQ ID NO：100编码的SEQ ID NO：99)或 CD28.CD137.ζ(由SEQ ID NO：102编码的SEQ ID NO：101)信号传导域。
核酸、载体、宿主细胞
本公开进一步提供一种核酸，其包含编码本文所描述的结合剂和缀合物(例如嵌合蛋白、融合蛋白、CAR)中的任一种的核苷酸序列。核酸可以包含编码本文所描述的结合剂和缀合物中的任一种的任何核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6的CDR中的每一个的核苷酸序列。在示范性方面中，本公开的核酸包含编码 SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的核酸序列。在示范性方面中，本公开的核酸包含编码SEQ ID NO：13或SEQID NO：14的核酸序列。在示范性方面中，本文所提供的核酸包含SEQ ID NO：15和/或SEQ IDNO：16的序列。在示范性方面中，核酸包含SEQ ID NO： 66或67的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：25的序列的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含SEQ IDNO：26的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码SEQ ID NO：28或30的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码与SEQ ID NO：28 或30至少90％一致的氨基酸序列的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：29或31的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：33的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含SEQ ID NO：34 的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码 SEQ ID NO：35或37的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6 中的每一个并且包含SEQ ID NO：36或38的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码SEQ ID NO：39或41的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：40或42的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码SEQ ID NO：47的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：48的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6 中的每一个并且编码SEQ ID NO：49或51的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：50或52的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：53或55的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：54或56的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且编码SEQ ID NO：68、70、 72、74、76和78中的一个或多个的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQ ID NO：69、71、73、75、77和79中的一个或多个的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含编码SEQ ID NO：1-6中的每一个并且包含SEQID NO：82、84、86、88、90、92、94、96中的一个或多个的核苷酸序列。在示范性方面中，核酸包含包含SEQ ID NO：98、100和102中的一个的核苷酸序列。
如本文所用，“核酸”包括“聚核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且一般意指DNA 或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成的或从天然来源中获得(例如分离和/或纯化)，其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸间连接，如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，而不是发现于未经修饰的寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。一般优选的是核酸不包含任何插入、缺失、倒置和 /或取代。然而，如本文所论述，在一些情况下核酸包含一个或多个插入、缺失、倒置和 /或取代可能合适。
在示范性方面中，本公开的核酸是重组的。如本文所使用，术语“重组(的)”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段接合到可以在活细胞中复制的核酸分子而构筑在活细胞外部的分子，或(ii)由上文(i)中所描述的那些分子的复制产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
在示范性方面中，核酸基于化学合成和/或酶连接反应使用所属领域中已知的程序构筑。参见例如Sambrook等人，前述，和Ausubel等人，前述。举例来说，核酸可以使用天然存在的核苷酸或各种各样经过修饰的核苷酸以化学方式合成，所述经过修饰的核苷酸经过设计以增加分子的生物稳定性或增加杂交时形成的双螺旋体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可以用于产生核酸的经过修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、 5-甲基胞嘧啶、N-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、丁氧核苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，本公开的核酸中的一个或多个可以购自如Macromolecular Resources(科罗拉多州柯林斯堡 (Fort Collins，CO))和Synthegen(德克萨斯州休斯顿(Houston，TX))的公司。
在示范性方面中，本公开的核酸并入重组表达载体中。在这点上，本公开提供包含本公开的核酸中的任一个的重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或聚核苷酸构筑体，当构筑体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且载体在足以使mRNA、蛋白质、多肽、或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述构筑体准许由宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本公开的载体总体上不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于如下DNA和RNA：其可以是单链或双链的，合成的或部分地从天然来源中获得，并且其可以含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在或非天然存在的核苷酸间连接，或这两种类型的连接。在示范性方面中，改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸间连接不阻碍载体的转录或复制。
本公开的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括经过设计用于扩展和扩增或用于表达或以上两项的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉荷亚(LaJolIa，CA))、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉(Uppsala，Sweden))和pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto))。也可以使用噬菌体载体，如λGTIO、λGT1 1、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1 149。植物表达载体的实例包括pBIO1、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19 (Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如反转录病毒载体。
本公开的重组表达载体可以使用描述于例如Sambrook等人，前述和Ausubel等人，前述中的标准重组DNA技术制备。可以制备环形或线性的表达载体构筑体以在原核或真核宿主细胞中含有复制系统功能。复制系统可以衍生自例如CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等等。
在示范性方面中，重组表达载体包含调节序列，如转录与翻译起始和终止密码子，其按需要并且考虑载体是否是基于DNA或RNA的而对待引入载体的宿主类型(例如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性。
重组表达载体可以包括一个或多个允许选择转化或转染的宿主的标记基因。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中提供原营养的互补性等等。用于本发明表达载体的合适的标记基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇(histidinol)抗性基因、四环素抗性基因和安比西林 (ampicillin)抗性基因。
重组表达载体可以包含原生或正常启动子，所述启动子可操作地连接到编码结合剂或缀合物的核苷酸序列，或与编码结合剂或缀合物的核苷酸序列互补或与其杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性，在从业者的普通技能内。
类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在从业者的技能内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和鼠类干细胞病毒的长末端重复序列中所发现的启动子。
本发明的重组表达载体可以经过设计用于短暂表达、用于稳定表达或用于两者。同样，重组表达载体可以经过制备用于组成型表达或用于诱导型表达。此外，重组表达载体可以经过制备以包括自杀基因。
如本文所使用，术语“自杀基因”是指造成表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是如下基因：给表达所述基因的细胞时赋予对药剂例如药物的敏感性，并且当细胞与药剂接触或暴露于药剂时造成细胞死亡。自杀基因在所属领域中已知(参见例如《自杀基因疗法：方法和评论.(Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews.)》Springer，Caroline J.(Maycer研究所的Maycer治疗剂的Maycer研究英国中心(Maycer Research UKCentre for Maycer Therapeutics at the Institute of Maycer Research)，英国萨里萨顿 (Sutton，Surrey))，胡马纳出版社(Humana Press)，2004)，并且包括例如单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
本公开进一步提供包含本文所描述的核酸或载体中的任一种的宿主细胞。如本文所使用，术语“宿主细胞”是指可以含有本文所描述的核酸或载体的任何类型的细胞。在示范性方面中，宿主细胞是真核细胞，例如植物、动物、真菌或海藻；或可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。在示范性方面中，如本文所描述，宿主细胞是起源于或获自个体的细胞。在示范性方面中，宿主细胞来源于或获自哺乳动物。如本文所使用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(order Rodentia)哺乳动物，如小鼠和仓鼠；和兔形目(order Lagomorpha)哺乳动物，如兔。优选地，哺乳动物来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)。更优选地，哺乳动物来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或属于奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科动物(马)。最优选地，哺乳动物属于灵长目(order Primate)、新世界猴类(Ceboids)或狐猴类(Simoids)(猴)或属于类人猿亚目(order Anthropoids) (人类和猿)。特别优选的哺乳动物是人类。
在示范性方面中，宿主细胞是培养细胞或原代细胞，即，直接从生物体例如人类中分离。在示范性方面中，宿主细胞是粘附细胞或悬浮细胞，即，在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞在所属领域中已知并且包括例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞、猴VERO细胞、T293细胞、COS细胞、HEK293细胞等等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选是原核细胞，例如DH5α细胞。出于产生结合剂或缀合物的目的，在一些方面中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在示范性方面中，宿主细胞是人类细胞。虽然宿主细胞可以具有任何细胞类型，但宿主细胞可以来源于任何类型的组织，并且可以具有任何发育阶段。在示范性方面中，宿主细胞是造血干细胞或祖细胞。参见例如Nakamura De Oliveira等人，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》 24：824-839(2013)。在示范性方面中，宿主细胞是外周血液淋巴细胞(PBL)。在示范性方面中，宿主细胞是自然杀伤细胞。在示范性方面中，宿主细胞是T细胞。
出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，如培养T细胞，例如原代T细胞，或来自培养T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物，那么T细胞可以获自诸多来源，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞还可以被富集或被化。T细胞可以通过在体外或体内将造血干细胞成熟化成T细胞而获得。在示范性方面中，T细胞是人类T细胞。在示范性方面中，T细胞是从人类中分离的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，包括NKT 细胞，并且可以具有任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞；CDA+辅助T细胞；例如Th1和Th2细胞，CD8+ T细胞(例如细胞毒性T细胞)；外周血液单核细胞(PBMC)；外周血液白细胞(PBL)；肿瘤浸润细胞(TIL)；记忆T细胞；未处理T细胞等等。优选地，T细胞是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。
本公开还提供包含至少一种本文所描述的宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以是异质群体，除至少一种其它细胞以外，所述异质群体包含包含任一种所描述重组表达载体的宿主细胞，所述至少一种其它细胞例如不包含任一种重组表达载体的宿主细胞(例如T细胞)，或不为T细胞的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。或者，细胞群体可以是基本上均质的群体，其中群体主要包含包含重组表达载体(例如基本上由重组表达载体组成)的宿主细胞。群体也可以是细胞克隆群体，其中群体的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得群体的所有细胞包含重组表达载体。在本公开的示范性实施例中，细胞群体是包含表达本文所描述的核酸或载体的宿主细胞的克隆群体。
医药组合物和给药途径
在本公开的一些实施例中，结合剂、缀合物、核酸、载体、宿主细胞或细胞群体与药学上可接受的载剂掺合。相应地，涵盖医药组合物，其包含本文所描述的结合剂、缀合物、核酸、载体、宿主细胞或细胞群体中的任一种，并且包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
药学上可接受的载剂是常规使用的那些载剂中的任一种，并且仅受到物理-化学考虑因素(如溶解性和与活性结合剂的反应性的缺乏)限制，并且受给药途径限制。本文所描述的药学上可接受的载剂，例如媒剂、佐剂、赋形剂和稀释剂为所属领域的技术人员所熟知并且公众可容易获得。在一个方面中，药学上可接受的载剂是对医药组合物的活性成分例如第一结合剂和第二结合剂具有化学惰性的载剂，并且是在使用条件下不具有不利的副作用或毒性的载剂。在一些实施例中，当向动物或人类给予时，载体不产生不良、过敏或其它不适当的反应。在一些方面中，医药组合物不含热原质以及会对人类或动物有害的其它杂质。药学上可接受的载剂包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等；其用途在所属领域中是众所周知。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂对接受者无毒性并且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲夜，如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；盐形成抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如Tween、Pluronics 或聚乙二醇(PEG)。
适用于实施本文所公开的方法的组合物的治疗配制物，如多肽、聚核苷酸或抗体，可以通过以冻干饼或水溶液的形式将具有所期望纯度的所选择组合物与任选的生理学上药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合(《雷明顿的药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)》，第18版，A.R.Gennaro编，马克出版公司(Mack PublishingCompany)(1990))来制备用于储存。医药组合物可以通过与一种或多种合适的载剂或佐剂掺合来制造，所述载剂或佐剂如水、矿物油、聚乙二醇、淀粉、滑石、乳糖、增稠剂、稳定剂、悬浮剂等等。这类组合物可以呈溶液、悬浮液、片剂、胶囊、乳膏、油膏、软膏的形式或呈其它常规形式。
体内给药所用的组合物应为无菌的。这通过在冻干和复原之前或之后经由无菌过滤膜过滤容易地实现。治疗性组合物一般置于具有无菌接入端口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。适用于可注射用途的医药形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在一些情况下，所述形式应为无菌的，并且应是流体，以达到能够易于注射的程度。其应在制造和储存的条件下稳定并且应被保存以免遭微生物如细菌和真菌的污染作用。用于肠胃外给药的组合物通常将以冻干形式或以溶液形式储存。
载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散液情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以通过各种抗细菌剂和/或抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来实现。在许多情况下，优选的将是包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
载剂的选择将部分地通过医药组合物的结合剂的特定类型以及通过用以给予医药组合物的特定途径来确定。相应地，存在各种合适的医药组合物的配制物。
本发明的医药组合物可以包含任何药学上可接受的成份，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气雾剂推进剂(aerosol propellant)、空气置换剂、碱化剂、防结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、抗菌剂(antiseptic)、基质、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂布剂、着色剂、干燥剂、清洁剂、稀释剂、消毒剂(disinfectant)、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填充剂、成膜剂、香味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、保湿剂、润滑剂、粘膜粘着剂、软膏基质、软膏、油性媒剂、有机碱、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂(surface active agent)、表面活性剂(surfactant)、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水可混溶性共溶剂、水软化剂或湿润剂。
医药组合物可以经过配制以获得生理学上相容的pH。在一些实施例中，取决于配制物和给药途径，医药组合物的pH可以是至少5、至少5.5、至少6、至少6.5、至少7、至少7.5、至少8、至少8.5、至少9、至少9.5、至少10或至少10.5到并且包括pH 11。在某些实施例中，医药组合物可以包含缓冲剂以获得生理学上相容的pH。缓冲剂可以包括能够在所期望的pH下缓冲的任何化合物，例如磷酸盐缓冲液(例如PBS)、三乙醇胺、Tris、二甘氨酸、TAPS、麦黄酮、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、 MES和所属领域中已知的其它化合物。
在一些实施例中，包含本文所描述的结合剂的医药组合物经过配制用于肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、动脉内给药、鞘内给药或腹膜内给药。在其它实施例中，医药组合物通过经鼻、喷雾、口服、气雾剂、直肠或阴道给药来给予。组合物可以通过输注、快速注射或通过植入装置来给予。
仅提供关于给药途径的以下论述来说明示范性实施例并且不应解释为以任何方式限制所公开主题的范围。
适用于口服给药的配制物可以由以下组成：(a)液体溶液，如有效量的本发明组合物溶解于稀释剂如水、盐水或橙汁中；(b)胶囊、药囊、片剂、糖锭和糖衣锭，每一种含有预定量的活性成分，呈固体或颗粒形式；(c)粉末；(d)适当液体中的悬浮液；和 (e)合适的乳剂。液体配制物可以包括稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，其中添加有或未添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以具有含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉的普通硬壳或软壳明胶类型。片剂形式可以包括以下中的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、湿润剂、防腐剂、调味剂和其它药理学上相容的赋形剂。糖锭形式可以包含于通常蔗糖和阿拉伯胶或黄着的调味剂中的本公开组合物，以及锭剂包含于如明胶和丙三醇或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中的本公开组合物，乳液、凝胶等等任选地也含有如所属领域中已知的这类赋形剂。
单独或与其它适合组分组合的本发明组合物可以经由肺部给药递送，并且可以制成待经由吸入给药的气雾剂配制物。这些气雾剂配制物可以置于可接受的加压推进剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等等中。其也可以被配制为如在喷雾器或雾化器中的非加压制剂的医药。这类喷雾配制物也可以用于喷雾粘膜。在一些实施例中，组合物被配制成粉末掺合物或微米粒子或纳米粒子。合适的肺部配制物在所属领域中已知。参见例如Qian 等人，《国际医药学杂志(Int J Pharm)》366：218-220(2009)；Adjei和Garren，《医药研究(Pharmaceutical Research)》，7(6)：565-569(1990)；Kawashima等人，《控制释放杂志(JControlled Release)》62(1-2)：279-287(1999)；Liu等人，《医药研究》10(2)：228-232(1993)；国际专利申请公开第WO 2007/133747号和第WO 2007/141411号。
局部配制物为所属领域的技术人员所熟知。这类配制物在本发明的背景下尤其适于施用到皮肤。
在一些实施例中，本文所描述的医药组合物经过配制用于肠胃外给药。出于本文的目的，肠胃外给药包括但不限于静脉内、动脉内、肌内、脑内、脑室内、心内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、眼球后、肺内、膀胱内和阴茎海绵体内注射或输注。也涵盖通过在特定部位处手术植入的给药。
适用于肠胃外给药的配制物包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使配制物与预期接受者的血液等张的溶解物；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“肠胃外”意指不经由消化道而是通过如皮下、肌内、脊柱内或静脉内的某一其它途径。本发明的组合物可以在医药载剂中与生理学上可接受的稀释剂一起给予，所述医药载剂如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液、醇(如乙醇或十六醇)、二醇(如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮(如2，2-二甲基-1，5，3-二氧杂环戊烷-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加有或未添加药学上可接受的表面活性剂(如皂或清洁剂)、悬浮剂(如果胶)、卡波姆(carbomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素、或乳化剂和其它医药佐剂。
可以用于肠胃外配制物中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石蜡油和矿物油。用于肠胃外配制物中的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和十四烷酸异丙酯是合适脂肪酸酯的实例。
在一些实施例中，肠胃外配制物含有防腐剂或缓冲液。为了将注射部位处的刺激降到最小或消除，这类组合物任选地含有一种或多种具有约12到约17的亲水-亲油平衡(HLB)的非离子表面活性剂。这类配制物中的表面活性剂的量典型地在约5重量％到约 15重量％范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，如脱水山梨糖醇单油酸酯；和氧化乙烯与通过氧化丙烯与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。肠胃外配制物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器如安瓿和小瓶中，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在即将使用之前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述并且在所属领域中已知的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
可注射配制物是根据本发明。所属领域的普通技术人员熟知用于可注射组合物的有效医药载剂的要求(参见例如《制药学和药学实践(Pharmaceutics and PharmacyPractice)》，J.B.利平科特公司(J.B.Lippincott Company)，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia)，Banker和Chalmers编，第238-250页(1982)；和《可注射药物的ASHP 手册(ASHP Handbook on Injectable Drugs)》，Toissel，第4版，第622-630页(1986))。
所属领域的技术人员应了解，除上述医药组合物以外，本公开的组合物可以被配制成包合物，如环糊精包合物，或脂质体。
剂量
出于本文的目的，在合理的时间范围内，所给予的医药组合物的量或剂量在个体或动物中足以发挥作用，例如治疗或预防应答。举例来说，医药组合物的剂量足以自给药时间起在约12小时、约18小时、约1到4天或更长，例如5天、6天、1周、10天、2 周、16到20天或更长时间的周期内治疗或预防疾病或医学病状。在某些实施例中，时间段甚至更长。剂量通过特定医药组合物的功效和动物(例如人类)的条件以及待治疗的动物(例如人类)的体重来确定。
用于确定给予剂量的许多分析在所属领域中已知。在一些实施例中，一种分析用以确定待给予到哺乳动物的起始剂量，所述分析包含在一组每一只被给予不同剂量的结合剂的哺乳动物中，向一哺乳动物给予给定剂量时，比较结合剂阻断IL13Rα2介导的细胞生长的程度。在给予某一剂量时结合剂阻断IL13Rα2介导的细胞生长的程度可以通过所属领域中已知的方法分析。
也将通过给予特定医药组合物可能伴随产生的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定医药组合物的剂量。典型地，主治医生将考虑到各种因素如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、待给予的医药组合物的结合剂、给药途径和被治疗的病状的严重程度，来决定用于治疗每一个别患者的医药组合物的剂量。
通过实例并且不意图限制本发明，本发明结合剂的剂量可以是约0.0001到约1克/被治疗个体的千克体重/天、约0.0001到约0.001克/千克体重/天或约0.01毫克到约1克 /千克体重/天。在一些方面中，医药组合物包含浓度是至少A的本发明结合剂，其中A 是约0.001mg/ml、约0.01mg/ml、0约1mg/ml、约0.5mg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约11mg/ml、约12mg/ml、约13mg/ml、约14mg/ml、约15mg/ml、约 16mg/ml、约17mg/ml、约18mg/ml、约19mg/ml、约20mg/ml、约21mg/ml、约22mg/ml、约23mg/ml、约24mg/ml、约25mg/ml或更高。在一些实施例中，医药组合物包含浓度是至多B的结合剂，其中B是约30mg/ml、约25mg/ml、约24mg/ml、约23mg/ml、约22mg/ml、约21mg/ml、约20mg/ml、约19mg/ml、约18mg/ml、约17mg/ml、约 16mg/ml、约15mg/ml、约14mg/ml、约13mg/ml、约12mg/ml、约11mg/ml、约10mg/ml、约9mg/ml、约8mg/ml、约7mg/ml、约6mg/ml、约5mg/ml、约4mg/ml、约3mg/ml、约2mg/ml、约1mg/ml或约0.1mg/ml。在一些实施例中，组合物可以含有浓度范围是 A到B mg/ml，例如约0.001到约30.0mg/ml的类似物。
额外给药指导可以根据其它抗体治疗剂估量，所述其它抗体治疗剂如贝伐单抗(bevacizumab)(AvastinTM Genentech)、西妥昔单抗(西妥昔单抗)(ExbituxTM Imclone)、帕尼单抗(Panitumumab)(VectibixTM Amgen)和曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HerceptinTMGenentech)。
给药时序
可以根据任何方案给予所公开的医药配制物，所述方案包括例如每天(每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次、每天6次)、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每三周、每月或每两月。类似于给药，时序可以基于剂量反应研究、功效和毒性数据细调，并且最初基于用于其它抗体治疗剂的时序来估量。
控制释放配制物
在某些方面中，医药组合物被修改成长效制剂形式(depot form)，使得医药组合物的活性成分(例如结合剂)释放于给予其的身体中的方式在时间和身体内的位置方面受到控制(参见例如美国专利第4,450,150号)。在各种方面中，长效制剂形式包括例如包含多孔或无孔材料如聚合物的可植入组合物，其中结合剂通过材料和/或无孔材料的降解来囊封或贯穿材料而扩散。随后长效制剂植入身体内的所期望位置中并且结合剂以预定速率从植入物中释放。
相应地，在某些方面中，医药组合物经过修改以具有任何类型的体内释放曲线。在一些方面中，医药组合物是立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或两相释放配制物。配制用于控制释放的肽(例如肽结合剂)的方法在所属领域中已知。参见例如Qian等人，《医药学杂志(J Pharm)》374：46-52(2009)和国际专利申请公开第 WO 2008/130158号、第WO2004/033036号、第WO2000/032218号和第WO 1999/040942 号。持续释放制剂的合适实例包括呈成型制品例如膜或微胶囊形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(美国专利第3,773,919号、EP 58,481)、 L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，《生物聚合物(Biopolymers)》，22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，《生物医学材料研究杂志 (J.Biomed.Mater.Res.)》，15：167-277(1981)和Langer，《化学技术(Chem.Tech.)》， 12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，前述)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过所属领域中已知的若干方法中的任一种制备(例如DE 3,218,121；Epstein等人，《美国国家科学院院刊》，82：3688-3692 (1985)；Hwang等人，《美国国家科学院院刊》，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676； EP 88,046；EP 143,949)。
组合
本公开的组合物可以单独采用或与其它药剂组合采用。在一些实施例中，给予多于一种类型的结合剂。举例来说，所给予的组合物例如医药组合物可以包含抗体以及scFv。在一些实施例中，本公开的组合物连同另一治疗剂或诊断剂(包括本文所描述的那些药剂中的任一种)一起给予。与单独使用任何一种疗法相比，某些疾病例如癌症或患者可能适于组合药剂的治疗以获得相加效应或甚至协同效应。
用途
部分地基于本文所提供的数据，结合剂、缀合物、宿主细胞、细胞群体和医药组合物适用于治疗赘瘤、肿瘤或癌症。
出于本发明的目的，如本文所使用，术语“治疗”和“预防”以及由其词干提取的词未必暗示100％或完全的治疗(例如治愈)或预防。相反，存在治疗或预防的变化程度，其中所属领域的一般技术人员认为具有潜在益处或治疗作用。在这方面中，本发明的方法可以在患者例如人类中提供癌症的任何量或任何水平的治疗或预防。此外，本文所公开的方法提供的治疗或预防可以包括对疾病例如被治疗或预防的癌症的一种或多种病状或症状的治疗或预防。同样，出于本文的目的，“预防”可以涵盖延迟疾病或其症状或病状的发作。
本文所描述的材料和方法特别适用于抑制赘生性细胞生长或扩散；确切地说抑制结合剂所靶向的IL13Rα2起作用的赘生性细胞生长。
可通过本公开的结合剂、缀合物、宿主细胞、细胞群体和医药组合物治疗的赘瘤包括实体肿瘤，例如癌瘤和肉瘤。癌瘤包括衍生自上皮细胞的浸润(例如侵袭)周围组织并且引起转移的恶性赘瘤。腺癌是衍生自腺组织或衍生自形成可识别腺结构的组织的癌瘤。另一广泛类别的癌症包括肉瘤和纤维肉瘤，其是细胞嵌入于纤维状或均质物质如胚胎结缔组织中的肿瘤。本发明也提供治疗骨髓或淋巴系统的癌症的方法，所述癌症包括白血病、淋巴瘤和典型地不作为肿瘤块存在但分布在血管或淋巴网状系统中的其它癌症。进一步涵盖用于治疗以下的方法：成人和小儿肿瘤、实体肿瘤/恶性病的生长、粘液样和圆形细胞癌瘤、局部晚期肿瘤、癌转移，包括淋巴性转移。本文所列举的癌症并不打算为限制性的。年龄(儿童和成人)、性别(男性和女性)、原发性和继发性、转移前和转移后、急性和慢性、良性和恶性、解剖位置癌症实施例和变化形式均是所涵盖的目标。癌症根据胚胎来源(例如癌瘤、淋巴瘤和肉瘤)、根据器官或生理系统并且通过杂项分组来分组。特定癌症可以在其分类中重叠，并且其在一组中的列举不将其从另一组中排除。
可以被靶向的癌瘤包括肾上腺皮质癌、腺泡状癌、腺泡细胞癌、腺泡癌、腺囊癌、腺样囊性癌、腺样鳞状细胞癌、癌症腺瘤(cancer adenomatosum)癌、腺鳞癌、附属器癌、肾上腺皮质的癌症、肾上腺皮质癌、醛固酮产生癌、醛固酮分泌癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、成釉细胞癌、壶腹癌、甲状腺退行性癌症、大汗腺癌、基底细胞癌、基底细胞癌、肺泡癌、粉刺状基底细胞癌、囊性基底细胞癌、硬斑病样基底细胞癌、多中心基底细胞癌、结节溃疡性基底细胞(nodulo-ulcerative basal cell)癌、有色基底细胞癌、硬化性基底细胞癌、表层基底细胞癌、基底细胞样癌、鳞状基底细胞癌、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、支气管肺泡癌、细支气管癌、细支气管细胞癌、支气管肺癌癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、脉络丛癌、透明细胞癌、泄殖腔源性癌、胶质癌、粉刺状癌、体癌、子宫体癌、皮质醇产生癌、筛形癌、圆柱形癌、圆柱形细胞癌、导管癌、腺管癌、前列腺导管癌、导管原位癌(ductal cancer in situ，DCIS)、分泌腺癌、胚胎癌、铠甲状癌(cancer en cuirasse)、子宫内膜癌、子宫内膜的癌症、子宫内膜样癌、表皮样瘤、混肿瘤状癌(cancer ex mixed tumor)、多形性腺瘤外癌(cancerex pleomorphic adenoma)、外生性癌、纤维板型癌、纤维软疣癌(cancer fibrosum)、滤泡性甲状腺癌、胃癌、凝胶样癌、胶状癌、巨大细胞癌、巨大细胞甲状腺癌、巨细胞癌、腺癌、颗粒细胞癌、肝细胞癌、许特尔(Hurthle)细胞癌、肾上腺样癌、婴儿型胚胎癌、胰岛细胞癌、乳房发炎性癌、原位癌、导管内癌、表皮内癌、上皮内癌、幼年型胚胎癌、库利奇茨基(Kulchitsky)细胞癌、大细胞癌、软脑膜癌、小叶癌、浸润性小叶癌、侵袭性小叶癌、小叶原位癌(lobular cancer in situ，LCIS)、淋巴上皮癌、髓样癌、髓质癌、甲状腺髓质癌、髓质甲状腺癌、黑色素癌、脑膜癌、默克(Merkel)细胞癌、变型细胞癌、微乳头状癌、软性癌(cancer molle)、粘液性癌、粘液癌(cancer muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(cancer mucosum)、黏液癌(mucous carcinoma)、鼻咽癌、神经内分泌皮肤癌(neuroendocrine cancer of the skin)、非浸润性癌、非小细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、燕麦细胞癌、骨化性癌(cancer ossificans)、骨化性癌(osteoid carcinoma)、佩吉特氏(Paget′s)骨病或乳房病、乳头状癌、乳头状甲状腺癌、壶腹周围癌、蔓延前癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌、原发性中央型癌(primaryintrasseouscarcinoma)、肾细胞癌、疤痕癌、血吸虫性膀胱癌(schistosomal bladdercarcinoma)、施奈德癌(Schneiderian carcinoma)、硬癌、皮脂癌、印指环状细胞癌、单工癌(cancer simplex)、小细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、梭形细胞癌、海绵体癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、多形性低度恶性癌(terminal duct carcinoma)、退行性甲状腺癌、滤泡甲状腺癌、髓质甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、小梁皮肤癌、移行细胞癌、管状癌、甲状腺未分化癌、子宫体癌、疣状癌、绒毛状癌(villous carcinoma)、绒毛状癌(cancer villosum)、卵黄囊癌、鳞状细胞癌(确切地说头颈部鳞状细胞癌)、食道鳞状细胞癌和口癌。
可以被靶向的肉瘤包括脂肪肉瘤、肺泡软部分肉瘤、成釉细胞肉瘤、禽肉瘤、葡萄样肉瘤、葡萄状肉瘤、鸡肉瘤、绿色肉瘤、软骨型肉瘤、肾脏透明细胞肉瘤、胚胎肉瘤、子宫内膜间质肉瘤、上皮状肉瘤、尤文氏(Ewing′s)肉瘤、筋膜肉瘤(fascial sarcomas)、成纤维细胞肉瘤、飞禽肉瘤、巨大细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、血管内皮细胞肉瘤、霍奇金氏(Hodgkin′s)肉瘤、特发性多色出血性肉瘤、成免疫细胞B细胞肉瘤(immunoblastic sarcoma of Bcell)、成免疫细胞T细胞肉瘤、詹森氏(Jensen′s)肉瘤、卡波西氏(Kaposi′s) 肉瘤、库普弗(Kupffer)细胞肉瘤、白细胞肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、混合细胞肉瘤、多肉瘤、淋巴管肉瘤、特发性出血性肉瘤、多潜能原发性骨肉瘤、成骨细胞肉瘤、成骨性肉瘤、骨膜外肉瘤、多晶型肉瘤、伪卡波西(Kaposi)肉瘤、网状细胞肉瘤、网状细胞脑肉瘤、横纹肌肉瘤、劳斯(Rous)肉瘤、软组织肉瘤、梭形细胞肉瘤、滑膜肉瘤、毛细血管扩张性肉瘤、骨的肉瘤(骨肉瘤(osteosarcoma))/恶性纤维组织细胞瘤和软组织肉瘤。
可以被靶向的淋巴瘤包括AIDS相关淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、非洲淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞单核球淋巴瘤、牛恶性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt′s)淋巴瘤、中央细胞淋巴瘤、皮肤淋巴瘤(lymphoma cutis)、弥漫性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、混合小细胞和大细胞淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、小裂解细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性中央细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、混合小裂解细胞和大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、主要大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、主要小裂解细胞淋巴瘤、巨大滤泡性淋巴瘤、巨大滤泡性淋巴瘤、肉芽肿性淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、成免疫细胞淋巴瘤、大裂解细胞淋巴瘤、大非裂解细胞淋巴瘤、伦纳特氏(Lennert′s)淋巴瘤、成淋巴细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中间性淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中度分化性淋巴瘤、浆细胞性淋巴瘤、分化不良的淋巴细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、分化良好的淋巴细胞性淋巴瘤、牛淋巴瘤、MALT、外膜细胞淋巴瘤、外膜区淋巴瘤、边际区淋巴瘤、地中海 (Mediterranean)淋巴瘤混合的淋巴细胞-组织细胞淋巴瘤、节状淋巴瘤、浆细胞性淋巴瘤、多形性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、小B细胞淋巴瘤、小裂解细胞淋巴瘤、小非裂解细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、卷积T细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性T细胞淋巴瘤、不确定的淋巴瘤、u细胞淋巴瘤、未分化型淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、渗出性(基于体腔的)淋巴瘤、胸腺淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。
可以被靶向的白血病和其它血细胞恶性病包括急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓白血病、淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、毛状细胞白血病、成淋巴细胞白血病、骨髓白血病、淋巴细胞性白血病、骨髓性白血病、白血病、毛状细胞白血病、T细胞白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、粒细胞白血病、格罗斯(gross)白血病、手镜细胞白血病(hand mirror-cell leukemia)、嗜碱性白血病、成血细胞白血病(hemoblasticleukemia)、组织细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴白血病、希林氏(Schilling′s) 白血病、干细胞白血病、骨髓单核细胞性白血病、前淋巴细胞性白血病、小成髓细胞白血病、成巨核细胞白血病、巨核细胞白血病、瑞登(Rieder)细胞白血病、牛白血病、白细胞不增多性白血病、肥大细胞白血病、骨髓细胞性白血病、浆细胞白血病、亚白血性白血病、多发性骨髓瘤、非淋巴细胞白血病和慢性骨髓细胞白血病。
可以被靶向的脑和中枢神经系统(CNS)癌症和肿瘤包括星形细胞瘤(包括小脑和大脑)、神经胶质瘤(包括恶性神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、脑干神经胶质瘤、视觉路径和下丘脑神经胶质瘤)、脑肿瘤、室管膜瘤、神经管胚细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、颅外生殖细胞肿瘤、骨髓发育不良综合症、少突神经胶质瘤、骨髓发育不良/骨髓增生疾病、骨髓性白血病、骨髓白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生病症、神经母细胞瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、中枢神经系统淋巴瘤、固有脑肿瘤、星形胶质细胞脑肿瘤和中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞侵犯。
可以被靶向的胃肠道癌症包括肝外胆管癌、结肠癌、结肠和直肠癌、结直肠癌、胆囊癌、胃(胃部)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、膀胱癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、胰脏癌、胰岛细胞胰脏癌、前列腺癌、直肠癌、唾液腺癌、小肠癌、结肠癌和与结直肠瘤形成相关的息肉。对结直肠癌的论述描述在Barderas等人，《癌症研究》72：2780-2790(2012)中。
可以被靶向的骨癌症包括骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、骨髓癌、骨转移、骨的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，和骨瘤和骨肉瘤。可以被靶向的乳癌包括小细胞癌和腺管癌。
可以被靶向的肺和呼吸性癌症包括支气管腺瘤/类癌瘤、食道癌食道癌、食道癌、下咽癌、喉癌、下咽癌、肺类癌肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(small cell lungcancer)、小细胞肺癌(small cell carcinoma of the lung)、间皮瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、鼻咽癌、口癌、口腔和唇癌、口咽癌、副鼻窦和鼻腔癌，和胸膜肺母细胞瘤。
可以被靶向的泌尿道和生殖性癌症包括宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢上皮癌、性腺外生殖细胞肿瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠期滋养细胞肿瘤、脾癌、肾癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜在肿瘤、阴茎癌、肾细胞癌(包括癌瘤)、肾细胞癌、肾盂和输尿管(移行细胞癌)、肾盂和输尿管的移行细胞癌、妊娠期滋养细胞肿瘤、睾丸癌、输尿管和肾盂癌、移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮赘瘤、宫颈癌、子宫癌和卵巢滤泡中的实体肿瘤、浅表性膀胱肿瘤、侵袭性膀胱移行细胞癌和肌肉侵袭性膀胱癌。
可以被靶向的皮肤癌和黑素瘤(以及非黑素瘤)包括皮肤T细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、人类皮肤角化细胞的肿瘤进展、基底细胞癌和鳞状细胞癌。可以被靶向的肝癌包括肝外胆管癌和肝细胞癌。可以被靶向的眼癌包括眼内黑素瘤、成视网膜细胞瘤，并且可以被靶向的眼内黑素瘤激素癌包括：甲状旁腺癌、松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、胸腺瘤和胸腺癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾上腺皮质癌和ACTH产生肿瘤。
可以被靶向的各种其它癌症包括晚期癌症、AIDS相关癌、肛门癌、肾上腺癌、皮质癌、再生障碍性贫血、苯胺癌、槟榔或萎叶性颊癌(betel or buyo cheek cancer)、髓样癌、烟囱扫除癌(chimney-sweep cancer)、粘土管癌(clay pipe cancer)、胶质癌、接触癌、囊性癌、树突状癌、配偶癌(cancer a deux)、乳腺管癌、染料工人(dye workers) 癌症、脑样癌、铠甲状癌、子宫内膜癌、内皮癌、上皮癌、腺癌、原位癌、康(kang) 癌、康格里(kangri)癌、潜在癌症、髓质癌、黑色素癌、骡-旋转式癌(mule-spinners′cancer)、非小细胞肺癌、隐性癌症、石蜡癌、沥青工癌(pitch workers′cancer)、疤痕癌、血吸虫性膀胱癌、硬癌、淋巴结癌、小细胞肺癌、软癌、烟尘癌、梭形细胞癌、沼泽癌(swamp cancer)、焦油癌和管状癌。
可以被靶向的各种其它癌症也包括类癌(胃肠道和支气管)、卡斯特莱曼氏(Castleman′s)病、慢性骨髓增生病症、腱鞘透明细胞肉瘤、尤文氏肿瘤家族、头颈癌、唇和口腔癌、瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血症、隐性原发性转移性鳞状颈癌(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、多发性内分泌腺瘤综合症、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、维尔姆斯(Wilms′)瘤、蕈样真菌病、嗜铬细胞瘤、塞扎里(sezary)综合征、幕上原始神经外胚层肿瘤、未知原发部位、腹膜渗出、恶性肋膜积液、滋养细胞赘瘤和血管外皮瘤。
在示范性方面中，癌症是前述的中的任一种，其中IL13Rα2在癌细胞上表达。在示范性方面中，癌症是结肠癌。在示范性方面中，癌症是多形性成胶质细胞瘤。在示范性方面中，治疗有需要个体的癌症的方法包含以有效治疗癌症的量向所述个体给予本文所描述的结合剂、缀合物、核酸、载体、宿主细胞、细胞群体或医药组合物中的任一种。在示范性方面中，所述方法包含给予本文所描述的缀合物。在示范性方面中，所述方法包含给予本公开的宿主细胞，并且相关于被治疗的个体，宿主细胞是自体细胞。在示范性方面中，所述方法包含给予本公开的宿主细胞，并且宿主细胞是获自被治疗的个体的细胞。在示范性方面中，细胞是T淋巴细胞。在替代方面中，细胞是自然杀伤细胞。
将参照以下实例更完全地理解本公开，所述实例详述本公开的示范性实施例。然而，实例不应解释为限制本公开的范围。
实例1
材料
脂染胺(Lipofectamine)2000和pEF6/Myc-His载体获自英杰公司(Invitrogen)。IL13Rα2的单克隆抗体(克隆YY-23Z和B-D13)和IsoStrip小鼠单克隆抗体同型试剂盒购自圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology)(加利福尼亚州圣克鲁斯(Santa Cruz))。IL13Rα2的mAb(克隆83807)和重组型人类和小鼠IL13Rα2hFc和IL13Rα1hFc 嵌合体购自R&DSystems(明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis，MN))。生物素化马抗小鼠抗体和Elite试剂盒获自载体实验室(Vector Laboratories)(加利福尼亚州伯林盖姆(Burlingame))。3，3′-二氨基联苯胺底物购自达科公司(Dako)(加利福尼亚州卡平特里亚(Carpinteria)。与过氧化酶缀合的山羊抗小鼠抗体购自Chemicon International(加利福尼亚州坦密库拉(Temicula)，并且Pngase F购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(马萨诸塞州伊普威治(Ipswich，MA)。QuikChange LightningTM定点突变诱发试剂盒购自安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies，Inc.)(加利福尼亚州圣克拉拉 (Santa Clara))，并且RNeasy PlusTM试剂盒接受自凯杰(Qiagen)(加利福尼亚州巴伦西亚(Valencia))。cDNAiScriptTM试剂盒、7.5％Tris-HCl凝胶和ImmunStarTM WesternCTM开发试剂和蛋白质标记物购自伯乐(Bio-Rad)。人类IL-13 ELISA试剂盒购自电子生物科学(eBioscience)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego))。GBM12和GBM43由David C.James博士(加州大学旧金山分校(University of California-San Francisco))友情提供，并且编码人类野生型IL13Rα2的cDNA获自Waldemar Debinski博士(维克弗斯特大学 (Wake Forest University))。获得编码人类野生型IL13Rα2或大多数其它蛋白质的cDNA 涉及使用熟知技术和可容易获得的试剂。
细胞系
U373(GBM)、293T(人类胚胎肾)和Raji(伯基特氏淋巴瘤)细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas))。先前报导了表达增强绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的U373细胞(U373.eGFP.ffLuc)、表达绿色荧光蛋白的293T细胞(293T.GFP)或表达IL13Rα2和 GFP的293T细胞(293T.IL13Rα2.GFP)的产生。参见Chow等人，《分子治疗(Mol. Ther.)》21：629-637(2013)；Krebs等人，《细胞疗法(Cytotherapy)》16：1121-1131(2014)。细胞系生长在具有10％胎牛血清(FCS；海克隆(HyClone)，犹他州洛根)和2mM GlutaMAX-ITM(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad))的RPMI或DMEM (赛默科技海克隆(Thermo ScientificHyClone)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham)；隆萨 (Lonza)，瑞士巴塞尔(Basel，Switzerland))中。细胞系由德克萨斯州休斯顿(Houston， Texas)的MD安德森癌症中心(MDAnderson Cancer Center)的表征细胞系核心设施(The Characterized Cell Line CoreFacility)验证。
免疫接种
为获得对原生IL13Rα2具有特异性的单克隆抗体，针对动物的免疫接种并且在所有筛选分析中使用人类重组IL13Rα2hFc融合体。持续2个月在2周间隔下，用完全弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)中的10μg rhIL13Rα2hFc蛋白质的腹膜内注射使两只6周龄雌性BALB/c小鼠免疫，随后用在不完全弗氏佐剂中的10μg rhIL13Rα2hFc蛋白质的腹膜内注射免疫。在最后一次腹膜内注射后的两周和融合前的3天，通过组合无弗氏佐剂的 10μg抗原的静脉内和腹膜内注射进行加强。通过使用和Milstein(27)描述的程序进行小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系X63.Ag8.653亚克隆P3O1的融合。针对 IL13Rα2抗体的存在，使用酶联免疫吸附分析(ELISA)分析杂交瘤上清液。对所选择群体进行克隆，并且分析上清液以鉴别具有最强结合的克隆。
表达人类IL13Rα2的CHO细胞系的产生
用以下引物对扩增编码人类野生型IL13Rα2的cDNA：正向 5′-GCTTGGTACCGAATGGCTTTCGTTTGCTTGGC-3′(SEQ ID NO：17)，和反向 5′-GTTTTTGTTCGAATGTATCACAGAAAAATTCTGG-3′(SEQ ID NO：18)。将纯化的PCR产物用KpnI和BstBI酶限制，琼脂糖凝胶纯化，并且随后在具有Myc和His6标签的阅读框中克隆于pEF6/Myc-His载体中。在80％汇合下接种CHO细胞并且使用脂染胺 2000用编码IL13Rα2的质粒转染。第二天，添加4μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)以选择已稳定并入并且表达IL13Rα2转录物的细胞。将稳定的细胞群体进一步以一个细胞/ 孔的密度亚克隆于96孔板中。十天后，针对IL13Rα2的细胞表面表达，通过流式细胞测量术使用IL13Rα2的抗体(克隆B-D13)来筛选单克隆。选择并且扩增具有最高水平的IL13Rα2表达的克隆以用于分泌IL13Rα2抗体的杂交瘤的后续筛选。
ELISA
在4℃下用50μl人类或小鼠重组IL13Rα2hFc或IL13Rα1hFc或浓度是1μg/ml的人类对照IgG涂布96孔板，过夜。用TBS-Tween 20缓冲液洗涤并且用1％脱脂奶粉阻断后，将50μl纯化的抗体、血清或杂交瘤上清液(在各种稀释度下)施用到板并且在室温下培育1小时。用缀合到碱性磷酸酶的山羊抗小鼠抗体检测结合抗体，之后用碱性磷酸酶底物显色。在A405下使用UniRead 800板读取器(伯腾(BioTek))读取板。
流式细胞测量术
用1μg/ml的IL13Rα2(克隆47)单克隆抗体染色表达IL13Rα2的CHO或HEK细胞；神经胶质瘤细胞系A172、N10、U251、U87和U118；源自患者的GBM12和GBM43 以及原代人类星形胶质细胞，随后用山羊抗小鼠Alexa Fluor 647(1∶500)染色。所有染色程序在冰上进行。使用BD FACSCanto流式细胞仪和FACSDiVaTM软件分析样品。
对于实例13-16中所公开的实验，使用FACSCalibur仪器(BD生物科学，加利福尼亚州山景城(Mountain View))来获取免疫荧光数据，所述免疫荧光数据用CellQuest (BD)或FCS Express软件(De Novo Software，加利福尼亚州洛杉矶(Los Angeles)) 分析。同型对照是免疫球蛋白G1-异硫氰酸荧光素(IgG1-FITC；BD生物科学)和IgG1- 藻红蛋白(IgG1-PE；BD生物科学)。通过用IL13Rα2嵌合体随后用Fc-FITC(密理博 (Milipore))或Fc-PE(南方生物科技(SouthernBiotech))将T细胞染色来检测SSR 47-CAR 表达。使用Fc-FITC或Fc-PE检测LSR 47-CAR。使用CD271 PE抗体(BD生物科学) 分析U373细胞的PD-L1表达。使用前向散射和侧向散射门控来区分活细胞与死细胞。收集细胞并且用含有1％FBS的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(西格玛；FACS缓冲液)洗涤一次，之后添加抗体。在黑暗中在冰上培育细胞30分钟，洗涤一次，并且固定在0.5％多聚甲醛/FACS缓冲液中，之后分析。
PCR
为测定IL13Rα2在各种神经胶质瘤细胞和星形胶质细胞中的表达，使用RNeasyPlus 试剂盒由细胞离心块产生总RNA。随后使用cDNA iScript试剂盒将200ng的总RNA转化成cDNA。针对IL13Rα2和GAPDH，使用IL13Rα2和GAPDH引物通过PCR进一步扩增cDNA 30个循环，并且在1％琼脂糖凝胶上显现。
表面等离子体共振
用Biacore 3000生物传感器通过表面等离子体共振(SPR)测量IL13Rα2(克隆47)单克隆抗体、可商购的IL13Rα2单克隆抗体(克隆83807和B-D13)与标靶(rhIL13Rα2) 之间的相互作用的亲和力和速率。使用氨基偶合试剂盒将单克隆抗体固定(以共价方式) 到传感器芯片(CM5)的聚葡萄糖基质。用含有0.2M N-乙基-N’-(3-二乙氨基-丙基)-碳化二亚胺和0.05 M N-羟基丁二酰亚胺的溶液的注射来活化传感器表面上的羧基。通过注射1甲醇胺盐酸盐以阻断剩余酯基完成固定程序。以10μl/min的流速进行固定方法的所有步骤。除了注射操作缓冲液而非单克隆抗体，以类似方式制备对照表面。在25℃下在HBSP缓冲液(20mMHEPES，pH 7.4，150mM NaCl，和0.005％(v/v)表面活性剂P20)中使用20μl/min的流速进行结合反应。在结合阶段期间在流动中添加各种浓度的标靶(rhIL13Rα2)。通过折射率(由应答单位(RU)表示)的变化监测结合到传感器芯片的蛋白质的量。对仪器进行编程以在同一表面上在标靶的增加的浓度下进行一系列结合测量。对标靶的每一浓度重复注射三次。使用BIAevaluation v4.1分析传感图(表面上RU随时间变化的图)。使用1∶1结合模型通过曲线拟合估算亲和常数。
数据准备和动力学分析
通过在固定化mAb上重复注射一系列标靶浓度来估算动力学参数。通过“双参考”方法准备数据。这种方法利用对照聚葡萄糖表面上每一标靶样品的平行注射，以及固定化mAb和对照聚葡萄糖表面两者上的操作缓冲液注射。这些传感图的扣除产生对照；这由实验传感图扣除。使用各种动力学模型分析每一数据组(由增加的标靶浓度在相同水平的固定化mAb上的传感图组成)。随后BIAevaluation v 4.1软件用于数据分析。使用1∶1结合模型通过曲线拟合估算亲和常数。局部或总体地拟合传感图缔合和解离曲线。通过以下类型的方程式描述样品注射期间复合物形成的速率：dR/dt＝kaC(Rmax-R)-kdR (针对1∶1相互作用)，其中R是以RU为单位的SPR信号，C是分析物的浓度，Rmax是以RU为单位的最大的分析物结合能力，并且dR/dt是SPR信号的改变速率。早期结合阶段(300s)用以确定mAb与标靶之间的缔合常数(ka)。在标靶注射结束时使用引入游离缓冲液时RU的降低速率测量解离阶段(dissociation phase，kd)。通过软件程序(全局拟合算法)同时拟合数据，并且复合物的解离常数(KD)以比率ka/kd形式测定。针对定量分析，对每一个样品进行三次独立的重复。数据表述为平均值±S.E。
竞争结合分析
针对竞争结合板分析，用pH 9.6的碳酸盐缓冲液中的50μl 1μg/ml的亲和纯化的hrIL13Rα2hFc涂布96孔板，并且在4℃下储存过夜。在用含有0.05％Tween 20的PBS 洗涤后，在室温下添加IL13Rα2的mAb(10μg/ml)或对照mIgG，持续30分钟。洗涤后，在室温下添加PBS中的50μl纯化rhIL-13和0.1％10ng/ml的BSA用于1小时培育，并且使用来自人类IL-13ELISA试剂盒的检测试剂分析结合的rhIL-13。单独地，在冰上用2μg/ml的rhIL-13或mAbIL13Rα2(克隆47)预处理表达野生型IL13Rα2或在 IL13Rα2序列中的4氨基酸突变体(参见实例10)的HEK细胞30分钟，随后分别与 100ng/ml的IL13Rα2(克隆47)mAb或rhIL-13一起培育1小时。单独或在竞争对手存在下，用人类IL-13 mAb-FITC检测rhIL-13与IL13Rα2的结合。单独或在竞争对手存在下，用缀合到Alexa Fluor 649的抗小鼠抗体检测IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL13Rα2 的结合，并且通过流式细胞测量术分析。
IL13Rα的突变诱发
先前，人类IL13Rα2的Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318被鉴别为对与人类IL-13的相互作用关键的残基(28)。为判定那些残基是否对IL13Rα2(克隆47)mAb与IL13Rα2 的结合至关重要，根据制造商的建议，使用QuikChange Lightning定点突变诱发试剂盒，将Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基单独地或同时突变成Ala(4氨基酸突变体)。使用常规技术测序所选择的克隆，其确认所选择的突变的存在。使用Lipofectamine Plus 转染试剂，在pEF6Myc-His载体中用IL13Rα2 cDNA的野生型或突变变异体转染HEK 细胞。在转染后48小时，收集细胞并且经由流式细胞测量术分析与IL13Rα2(克隆47) mAb的结合。
蛋白质印迹
将rhIL13Rα2以200纳克/泳道施用到7.5％Tris-HCl凝胶(伯乐)并且在还原条件下解析。在将蛋白质转移到PVDF膜(伯乐)并且用2％脱脂奶粉阻断后，所述膜用2μg/ml 的抗IL13Rα2 mAb(克隆YY-23Z和B-D13)或用从杂交瘤克隆收集的上清液(稀释10 倍)染色，随后用与过氧化酶缀合的山羊抗小鼠抗体染色。使用ImmunStarTM WesternCTM使反应显色。使用伯乐ChemiDoc成像系统捕获图像。
对于实例13-16中所公开的实验，细胞用PBS+3mM EDTA解离并且在含有50mMTris、150mM NaCl、5mM EDTA、1％Triton X-100(均来自西格玛，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))和蛋白酶抑制剂(赛默科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham)) 的缓冲液中裂解。使用伯乐蛋白质分析(伯乐，加利福尼亚州埃库莱斯(Hercules))并以牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定蛋白质浓度。在95℃下在勒姆利(Laemmli)缓冲液(伯乐)中使样品变性5分钟。每孔装载5μg蛋白质并且在10％聚丙烯酰胺凝胶上操作。将蛋白质转移到硝化纤维膜(伯乐(BioRad))。用Tris缓冲盐水(TBS)+0.1％ Tween-20(西格玛)中的5％奶粉(MP)阻断膜，并且随后用抗CD3.ζ(sc-1239，圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)，加利福尼亚州圣克鲁兹)或GAPDH (sc-47724，圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚州圣克鲁兹)小鼠单克隆抗体探测，随后用辣根过氧化酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(sc-2005，圣克鲁斯生物技术公司)探测。使用SuperSignal West Dura ExtendedDuration底物(赛默科技)使印迹显色并且使其暴露于GeneMate Blue Basic放射自显影膜(BioExpress，犹他州凯斯维尔 (Kaysville)))。
免疫组织化学
根据芝加哥大学(University of Chicago)机构审查委员会(InstitutionalReview Board) 认可的方案收集GBM组织。将快速冷冻的脑肿瘤组织切成10μm厚。用-20℃甲醇固定组织切片，并且针对人类IL13Rα2，使用浓度是3μg/ml的小鼠IL13Rα2(克隆47)mAb或同型对照mIgG1染色。用生物素化马抗小鼠抗体检测结合抗体(1∶100)。用3，3′-二氨基联苯胺底物利用Elite试剂盒检测抗原-抗体结合。使用CRI全景扫描全幻灯片扫描器 (CRIPanoramic Scan Whole Slide Scanner)和全景查看器(Panoramic Viewer)软件分析载片。
动物研究
根据机构动物照护与使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)方案并且根据美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)指南维护并照护所有动物。实验中所使用的动物是6到7周龄雄性无胸腺nu/nu小鼠。用氯胺酮盐酸盐/甲苯噻嗪(25mg/ml/2.5mg/ml)混合物的腹膜内注射来麻醉小鼠。为确立颅内肿瘤，制备中线颅骨切口，并且在矢状缝侧2mm和λ上约2mm放置右侧钻孔。将动物安置在立体定位框中，并且将汉密尔顿(Hamilton)针插入通过钻孔并前移3mm。紧接着颅内渗透的是(i)注射2.5×104个U251神经胶质瘤细胞，所述细胞在与200ng mIgG或IL13Rα2 (克隆47)mAb组合的2.5μl无菌PBS中，或(ii)用如先前所描述的PBS或10μg IL13Rα2 (克隆47或B-D13)mAb对神经胶质瘤细胞进行3天后的颅内注射(29，以引用的方式并入本文中)。监测所有小鼠的存活。在第17天处死每组的三只动物，并且收集脑并冷冻用于切片、苏木精和伊红(H&E)染色和显微镜分析。
实例13-16中所公开的动物实验遵循贝勒医学院机构动物照护与使用委员会(Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee)认可的方案。如Ahmed 等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》16：474-485(2010)(以引用的方式并入本文中)中所描述进行实验，其中有少许改动。ICR-SCID小鼠购自泰克里克(Taconic) (IcrTac：ICR-Prkdcscid；Fox Chase C.B-17 SCIDTM ICR；泰克里克，纽约州赫德森 (Hudson))。将雄性7到9周龄小鼠麻醉，头部刮毛并且将小鼠固定在安装于E15600实验室标准立体定位仪器(Lab Standard Stereotaxic Instrument)(Stoelting)中的CunninghamTM小鼠/新生大鼠转接器(Stoelting，伊利诺斯州伍德戴尔(Wood Dale)) 立体定位装置中，并且随后用1％聚维酮-碘擦洗。沿着中线制备10mm皮肤切口。安装于的汉密尔顿注射器(汉密尔顿，内华达州里诺(Reno))上的30G1/2英寸针的顶端充当参照点。在前囟前面1mm和右侧2mm的颅骨上钻1mm的钻孔。在5分钟内，对应于右尾状核的中心，距前囟3mm深注射2.0μL的1×105个U373.eGFP.ffLuc细胞。把针留在原位3分钟以避免肿瘤细胞挤出，并且随后历经5分钟抽出。肿瘤细胞注射后七天，根据相同肿瘤座标，用2μL 2×106个效应细胞处理动物。用2-3间断的7.0爱惜康 (Ethicon)缝合线(爱惜康公司(Ethicon，Inc.)，新泽西州萨默维尔(Somerville))封闭切口。针对疼痛控制，皮下注射0.03-0.1mg/kg丁基原啡因(RBH，英国赫尔(Hull，England))。
编码IL13Rα2-scFv特异性CAR的反转录病毒载体的产生
由含有免疫球蛋白重链前导肽37和由5′NcoI和3′BamHI位点侧接的scFv47的GeneArt(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)合成密码子优化基因。将这种微基因亚克隆于SFG反转录病毒载体中，所述载体含有具有短或长间隔区(SSR，LSR)和 CD28.ζ，CD28.OX40.ζ，CD28.41BB.ζ或41BB.ζ胞内域的IL13Rα2特异性CAR(47-CAR)。 5,38,39除了具有CD8α跨膜域的47.SSR.CAR.41BB.ζ以外，所有CAR含有CD28跨膜域。通过PCR克隆产生无胞内域的47.SSR.CAR和47.LSR.CAR(47.SSR.CAR.Δ和 47.LSR.CAR.Δ)。通过测序(Seqwright，德克萨斯州休斯顿)检验CAR的所有克隆。如先前描述于以引用的方式并入本文中的Johnson等人，《科学转化医学 (Sci.Transl.Med.)》7：275ra22(2015)中，通过293T细胞的瞬时转染来产生RD114假型化的反转录病毒粒子。
CAR T细胞的产生
在根据赫尔辛基声明(Declaration of Helsinki)获得知情同意书后，在贝勒医学院 IRB认可的方案下，获得来自健康供体的人类外周血液单核细胞(PBMC)。为产生 47-CAR T细胞，由Lymphoprep(Greiner Bio-One，北卡罗来纳州门罗(Monroe))分离PBMC，梯度离心，并且随后在非组织培养物处理的24孔板上刺激，所述板预涂有OKT3 (CRL-8001，ATCC)和CD28(BD生物科学，加利福尼亚州山景城)抗体。在第2天向培养物中添加重组型人类白介素-7(IL7)和IL15(IL7，10ng/mL；IL15，5ng/mL；普罗金(Proleukin)；凯龙(Chiron)，加利福尼亚州爱莫利维尔(Emeryville))(Xu等人，《血液(Blood)》123：3750-3759(2014)，以引用的方式并入本文中)。在第3天，在IL7和IL15存在下，在(Clontech，加利福尼亚州山景城)涂布的板上转导OKT3/CD28-刺激T细胞(2.5×105个细胞/孔)。在第5或6天，将T细胞转移于新孔中并且随后用IL-7和IL15扩增。用OKT3/CD28活化非转导(NT)T细胞并且用 IL-7和IL15同时扩增。转导3到4天后，确定47-CAR表达。
共培养分析
重组蛋白共培养分析.用重组人类IL13Rα1、IL13Rα2或IL4R蛋白质(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)以500纳克/孔的最终浓度预涂布非组织培养物24孔板。使用RPMI洗涤板一次，并且接种CAR或NT T细胞。24小时后，收集上清液并且根据制造商的说明书(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)通过ELISA测量干扰素γ (IFNγ)和白介素2(IL2)的释放。
细胞培养物共培养分析.在24孔板中以1∶2效应子比标靶(E∶T)的比率将CAR T 细胞与靶细胞共培养。NT T细胞充当对照。24小时后，收集培养物上清液，并且根据制造商的说明书(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)通过ELISA确定IFNγ和 IL2的存在。
细胞毒性分析
如以引用的方式并入本文中的Gottschalk等人，《血液》101：1905-1912(2003)中所描述，进行标准铬(51Cr)释放分析。简单来说，将1×106个靶细胞用0.1mCi(3.7MBq) 51Cr标记，并且与减少数目的效应细胞混合，得到40∶1、20∶1、10∶1和5∶1的效应子比标靶比率。使用在单独完全培养基中或在1％Triton X-100中培育的靶细胞来分别确定自发和最大51Cr释放。4小时后，收集上清液并且在γ计数器(Cobra Quantum；珀金埃尔默(PerkinElmer)；威尔斯利(Wellesley)；马萨诸塞州)中测量放射性。根据下式计算一式三份孔的特异性溶解的平均百分比：[测试释放-自发释放]/[最大释放-自发释放]× 100。
生物发光成像
在将每只小鼠腹膜内注射150mg/kg D-荧光素(精诺真(Xenogen))后，使用系统(IVIS，精诺真公司(Xenogen Corp.)，加利福尼亚州阿拉米达(Alameda))使异氟醚麻醉的动物成像10-15分钟。使用Living Image软件(卡立泊生命科学(Caliper LifeSciences)，马萨诸塞州霍普金顿(Hopkinton))定量从荧光素酶表达肿瘤细胞发出的光子。产生表示光强度的伪彩色图像(蓝色强度最小并且红色强度最大)，并且其在灰度参考图像上叠加。当在两个时刻肿瘤光亮度大于1×109时，或当小鼠符合根据贝勒医学院比较医学中心(the Center for Comparative Medicine at Baylor College of Medicine)的安乐死准则(神经缺陷，重量损失，痛苦迹象)时，将小鼠安乐死。
统计
通过史都登氏(Student′s)t检验或使用事后比较杜凯氏(Tukey′s)检验或邓尼特检验的单因素方差分析评估各组之间的差异。对于体内存活率数据，使用卡普兰-迈耶存活率分析，并且使用对数秩检验进行统计分析。P＜0.05视为在统计学上显著。
对于实例13-16中所公开的实验，至少重复三次体外实验，并且使用格拉夫帕德(GraphPad)Prism 5软件(格拉夫帕德软件公司(GraphPad software，Inc.)，加利福尼亚州拉荷亚(La Jolla))用于统计分析。将测量数据呈现为平均值±标准差(SD)。通过适当测试来测试平均值之间的差异。所使用的显著性水平是P＜0.05。对于小鼠实验，计算每时间点下肿瘤光亮度偏离基线的变化，并且使用t检验在各组之间比较。通过卡普兰-迈耶方法并且通过对数秩检验分析从肿瘤细胞注射时间开始确定的存活率。
实例2
抗原的表征和分泌抗IL13Rα2抗体的杂交瘤克隆的筛选
本研究的主要目标是产生适用于靶向在肿瘤细胞表面上表达的IL13Rα2的高亲和力单克隆抗体。因此我们将小鼠免疫并且对于针对抗原rhIL13Rα2(呈其原生构形)的反应性筛选所得杂交瘤克隆。针对rhIL13Rα2的检测，确立利用针对rhIL13Rα2的杂交瘤克隆YY-23Z的板结合的ELISA。发现1μg/ml的吸收到塑料的rhIL13Rα2的浓度适用于检测抗体结合(图1A)。然后，通过利用一对仅识别原生(发现于细胞表面上)和变性(在还原条件下使用蛋白质印迹法)形式的IL13Rα2的可商购抗体来表征 rhIL13Rα2hFc的“原生性”，并且分别使用抗体克隆B-D13和YY-23Z在ELISA中表征其与rhIL13Rα2的结合特性。在板结合的ELISA中，克隆B-D13和YY-23Z均能够识别 rhIL13Rα2hFc(图1B)。在β-巯基乙醇存在下在95℃下持续5分钟的抗原变性完全消除抗体克隆B-D13通过ELISA识别抗原的能力，然而YY-23Z克隆保持结合变性抗原的能力。因此，吸收到塑料的rhIL13Rα2hFc，含有蛋白质的原生和变性形式的ELISA板。分析来自用rhIL13Rα2和hFc的融合体免疫的动物的血清揭露了针对rhIL13Rα2和人类 Fc片段的抗体的存在。为选择特异于融合体的IL13Rα2部分的抗体，将人类IgG作为额外阴性对照包括，以用于筛选杂交瘤群体。在39个筛选的原代群体中，仅15个群体对IL13Rα2具有特异性，并且四个与人类IgG具反应性。最后，进一步扩增并且再克隆与原生IL13Rα2强烈反应的五个克隆。仅识别变性抗原的两个克隆选自具有 rhIL13Rα2hFc嵌合体的单独免疫接种组。在板结合的ELISA(图1C)中并且通过蛋白质印迹法(图1D)比较所选择克隆的上清液结合hrIL13Rα2的能力。图1C显示在板结合的ELISA中而非通过蛋白质印迹法，克隆47强烈地结合到抗原，指示克隆47识别抗原的原生构形的能力。因此，选择克隆47用于进一步表征并且用于其它实验。发现克隆47具有IgG1同型，拥有κ链。
实例3
IL13Rα2(克隆47)mAb与在细胞表面上表达的重组人类IL13Rα2和IL13Rα2的结合特异性
我们研究在板结合的ELISA中，相对于可商购的克隆83807和B-D13，IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL13Rα2的结合特性。图2A显示当与克隆83807和B-D13相比较时，克隆47与rhIL13Rα2的结合较强并且具特异性。克隆47在0.05μg/ml的低浓度下达到结合平台。在这些实验中，无抗体显示与用作额外阴性对照的人类IgG的结合。为进一步验证克隆47与人类IL13Rα2的相互作用的特异性，产生表达实际大小野生型人类 IL13Rα2的CHO细胞的克隆系(克隆6)。将抗体与转染有空白载体的对照CHO细胞的结合与抗体与表达IL13Rα2的CHO细胞的组合相比较。再次，IL13Rα2(克隆47)mAb 展现与在细胞表面上表达的IL13Rα2而非与对照CHO细胞的结合较强并且具特异性，指示这种抗体特异性地识别IL13Rα2的原生构形(图2B)。克隆47在0.25μg/ml的最低测试浓度下展现针对IL13Rα2的最强亲和力。值得注意地，其它所选择的杂交瘤克隆展现类似的与在CHO细胞的细胞表面上表达的IL13Rα2而非与对照CHO细胞的相互作用的特异性。在板结合的ELISA中获得的数据也揭露到克隆47不与IL-13的低亲和力受体IL13Rα1(图2C)或小鼠重组IL13Rα2相互作用，进一步验证克隆47与IL13Rα2 之间的相互作用的特异性(图2D)。克隆83807和B-D13并不显示与小鼠rIL13Rα2的结合，这与目前对这些抗体与小鼠IL13Rα2的交叉反应性的理解一致。
然后，我们表征克隆47与各种神经胶质瘤细胞系、源自患者的神经胶质瘤系GBM12和GBM43以及正常人类星形胶质细胞的结合能力。在44-47％人类GBM切除的样本(3) 中和在多达82％(14/17)的衍生自GBM和正常脑外植体的原代细胞培养物中(2)报导相对于正常脑组织IL13Rα2基因的增加的表达。图3的A和B显示神经胶质瘤细胞、人类星形胶质细胞和在细胞表面上表达重组人类IL13Rα2的HEK细胞与IL13Rα2(克隆47、83807和B-D13)mAb的比较染色的流程图。图3的A和B揭露(i)细胞表面上IL13Rα2表达的各种水平，和(ii)相对于克隆B-D13(细胞系之间1.2-4.6倍的差异) 和83807，克隆47与所分析细胞系的表面的优异结合。有趣地，我们观测到与表达 IL13Rα2的HEK细胞相比，克隆83807与神经胶质瘤细胞系的结合几乎完全不存在。未检测到克隆47与正常人类星形胶质细胞的结合，确认克隆47与表达IL13Rα2的人类神经胶质瘤细胞的相互作用的特异性。IL13Rα2 mRNA在这些细胞中的表达一般与细胞表面上的IL13Rα2表达水平相关。此外，表达低IL13Rα2 mRNA到不表达IL13Rα2 mRNA 的细胞，包括U118和原代人类星形胶质细胞，展现IL13Rα2在细胞表面上低表达到不表达(图3B)。在额外实验中，将N10神经胶质瘤细胞与1μg/ml的IL13Rα2(克隆47) mAb或用10倍过量的rhIL13Rα2预培育的IL13Rα2(克隆47)mAb一起培育(图10)，并且通过流式细胞测量术分析。当与单独的克隆47相比较时，发现在10倍过量的 rhIL13Rα2存在下的IL13Rα2(克隆47)mAb之间的相互作用显著去除。类似地，N10 细胞与10倍过量的rhIL-13或IL13Rα2(克隆47)mAb的预培育几乎完全阻断抗体或 rhIL-13与N10细胞之间的相互作用(补充图1B)，指示在神经胶质瘤细胞表面上表达的IL13Rα2与克隆47之间的识别的特异性(图10)。
为验证IL13Rα2(克隆47)mAb拥有原位结合神经胶质瘤细胞表面上的IL13Rα2 的能力，在裸小鼠中确立表达绿色荧光蛋白(GFP)的U251细胞的颅内神经胶质瘤异种移植物。三周后，处死动物，并且获得细胞并将其放置于体外培养条件下。48小时后，收集细胞并且用对照mIgG或IL13Rα2(克隆47)mAb染色。所培养的表达GFP的U251 细胞充当阳性对照。GFP阳性U251细胞代表全部细胞的约56％(图3C，图a)，并且 96％的细胞与IL13Rα2(克隆47)mAb具反应性(图3C，图c)，然而GFP阴性细胞不与抗体相互作用(图3C，图b)。这些数据进一步确认IL13Rα2(克隆47)mAb特异性地识别表达小鼠异种移植物中的IL13Rα2的神经胶质瘤细胞，并且不与来自小鼠脑的其它细胞具反应性。
实例4
亲和力研究
使用表面等离子体共振来确定IL13Rα2(克隆47)mAb与rhIL13Rα2之间的相互作用的亲和力和速率。相较于针对IL13Rα2的两种商业抗体克隆83807和B-D13，进行所有测量。图4显示每一抗体的传感图。测量结果概述在表1中。
表1
结合到人类重组IL13Rα2的单克隆抗体的动力学
如实例1中所描述估算动力学参数。将复合物的解离常数(KD)确定为比率ka/kd。针对定量分析，每一个样品有三个独立的重复。数据表述为平均值±S.E。这些数据证实IL13Rα2(克隆47)mAb与重组IL13Rα2的亲和力分别超过可商购的mAb克隆83807 和B-D13的亲和力75倍和33倍。
图4A显示到，克隆47展现与rhIL13Rα2在30分钟时间范围内测量的长期并稳定的缔合，然而克隆83807(图4B)和B-D13(图4C)相对快速地解离。IL13Rα2(克隆 47)mAb与rhIL13Rα2的结合亲和力计算为1.39×10-9M。这个值分别超过可商购的抗体克隆83807和B-D13与rhIL13Rα2的亲和力75倍和33倍。当分别与克隆83807和 B-D13的250和8-16RU相比较时，克隆47在390RU下展现与rhIL13Rα2的最高结合亲和力(Rmax)。这些数据指示IL13Rα2(克隆47)mAb拥有比克隆83807和B-D13优异的特性以及展现针对rhIL13Rα2的更高的亲和力。
实例5
单克隆抗体与rhIL-13竞争与IL13Rα2的结合
为判定IL13Rα2(克隆47)mAb是否拥有抑制特性，进行利用rhIL13Rα2hFc嵌合体和短暂表达人类IL13Rα2的HEK细胞的竞争结合分析。以板结合的ELISA型式设定竞争结合分析。吸收到板的rhIL13Rα2hFc充当靶抗原。为判定IL13Rα2 mAb是否特异性抑制IL-13与rhIL13Rα2的结合，将板与100倍过量的mIgG、IL13Rα2(克隆47) mAb或包括83807、YY-23Z和B-D13的其它IL13Rα2 mAb克隆预培育，随后与rhIL13 一起培育。图5A显示IL13Rα2(克隆47)mAb显著消除rhIL-13与rhIL13Rα2的结合，然而针对人类IL-13的结合，IL13Rα2 mAb克隆B-D13和83807展现显著较小的竞争。
为进一步验证IL13Rα2(克隆47)mAb的抑制特性，将HEK 293T细胞用编码IL13Rα2cDNA的野生型或4氨基酸突变体形式的药剂转染，在所述突变形式中Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基被Ala取代。先前，人类IL13Rα2的这些残基被鉴别为与同源配位体IL-13的相互作用所需要的氨基酸。所有四种突变在一个分子中的存在已显示使 IL-13几乎完全丧失与IL13Rα2的突变形式的结合(28)。48小时后，将细胞用20倍过量的rhIL-13或IL13Rα2(克隆47)mAb预处理，随后分别与IL13Rα2(克隆47)mAb 或rhIL-13一起培育。图5B显示通过20倍过量的rhIL-13，IL13Rα2(克隆47)mAb 与野生型(WT)IL13Rα2而非IL13Rα2的4氨基酸突变体形式有约50％的结合抑制。当在细胞表面上表达80％时，20倍过量的抗体消除rhIL-13与IL13Rα2的结合，这类似于板ELISA中所观测到的结果。IL-13与IL13Rα2的4氨基酸突变体形式的残余结合进一步通过过量的IL13Rα2(克隆47)mAb降低(图5C)。总起来说，这些数据指示IL13Rα2 (克隆47)mAb与rhIL-13特异性竞争IL13Rα2上的结合位点。同样，这些数据指示 IL13Rα2(克隆47)mAb与IL-13在其IL13Rα2分子的识别位点中具有显著重叠。
实例6
Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基对IL13Rα2(克隆47)mAb结合的作用
考虑到IL-13和IL13Rα2(克隆47)单克隆抗体可以彼此显著竞争IL13Rα2的结合，我们判定促进IL-13与IL13Rα2的相互作用(28)的残基Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318是否也对IL13Rα2(克隆47)mAb与IL13Rα2的结合至关重要。产生如下质粒：其编码针对携带Tyr207、Asp271、Tyr315或Asp318残基到Ala的个别突变或所有四个突变在一个分子中的组合的IL13Rα2的cDNA，并且其在HEK细胞中短暂表达。通过流式细胞测量术分析IL13Rα2(克隆47)mAb与IL13Rα2的野生型和突变体形式的结合。IL13Rα2mAb 83807和B-D13用作参考抗体，以排除HEK细胞表面上IL13Rα2的野生型或突变变异体的表达水平变化的可能影响(图6A)。当与抗体克隆83807和B-D13 相比较时，将数据计算为IL13Rα2(克隆47)与IL13Rα2的结合的比率。图6A展现当与野生型受体相比较时，IL13Rα2(克隆47)mAb的结合不受IL13Rα2的个别突变或4 氨基酸突变体形式的显著影响。相反，IL-13与IL13Rα2的4氨基酸突变体形式的结合几乎被消除(图6B)。这些数据指示Tyr207、Asp271、Tyr315和Asp318残基对IL13Rα2 (克隆47)mAb与IL13Rα2的相互作用不关键，但为与IL-13的结合所必需。
实例7
N-连接糖基化影响IL13Rα2mAb对IL13Rα2的亲和力
先前已证实N-连接糖基化对IL-13与同源受体IL13Rα2的有效结合至关重要(30)。考虑到IL13Rα2(克隆47)mAb与IL-13之间的抗原决定基识别的显著重叠，我们预期 IL13Rα2的N-连接糖基化有助于IL13Rα2(克隆47)mAb的结合。为确认这种预期，用Pngase F处理rhIL13Rα2hFc以从蛋白质中去除N-连接糖基化。研究IL13Rα2(克隆 47)mAb与对照和去糖基化靶蛋白的结合。在原生条件下(在不存在SDS下)用Pngase F处理rhIL13Rα2，以避免影响抗体结合的rhIL13Rα2的变性。在分析中包括IL13Rα2 的额外mAb(克隆83807、B-D13和YY23Z)和rhIL-13以证实结合的特异性。在板结合的ELISA中，当与未处理蛋白质相比较时，IL13Rα2(克隆47)mAb与Pngase F处理的IL13Rα2的结合降低35％(n＝4；P＜0.001)。当与未处理蛋白质相比较时，IL13Rα2 (克隆83807)的结合降低80％，并且IL13Rα2 mAb B-D13和YY-23Z分别完全不存在结合(n＝4；P＜0.001)(图7A)。rhIL-13与Pngase F处理的rhIL13Rα2的结合也显著减弱。为验证Pngase F处理导致蛋白质去糖基化，通过蛋白质印迹解析对照和Pngase F 处理的rhIL13Rα2hFc蛋白质。图7B显示Pngase F处理的蛋白质具有更低分子量，确认 N-连接聚糖从IL13Rα2分子中去除。当与对照未处理细胞相比较时，IL13Rα2(克隆47) mAb与Pngase F处理的U251神经胶质瘤和表达野生型IL13Rα2的HEK 293细胞的结合也降低约30％(n＝3；P＜0.05)(图7C)。
实例8
免疫组织化学
在新鲜的冷冻组织中评估IL13Rα2(克隆47)mAb检测IL13Rα2的能力。用同型对照mIgG1或IL13Rα2(克隆47)mAb染色快速冷冻的人类GBM样品或U251神经胶质瘤侧腹异种移植物。图8显示两个人类GBM样品中的阳性(褐色)染色，只是在样品以及基于U251神经胶质瘤细胞的神经胶质瘤异种移植物中的阳性细胞有不同频率。在所分析的三个GBM样品中的两个中检测到阳性染色，这与少于50％的原发性GBM 表达IL13Rα2的预期一致(3)。这些数据也与这种抗体识别在细胞表面上和在ELISA 应用中表达的IL13Rα2的原生形式的能力一致，以及与这种mAb通过蛋白质印迹法检测变性抗原的折衷能力一致。
实例9
IL13Rα2单克隆抗体延长具有颅内神经胶质瘤异种移植物的动物的存活
也在人类神经胶质瘤的原位小鼠模型中确定IL13Rα2(克隆47)mAb的潜在治疗特性。在对照mIgG存在下或在IL13Rα2(克隆47)mAb下，将U251神经胶质瘤细胞单独地颅内注射于裸小鼠的脑中。图9A显示对照PBS(n＝15)和mIgG(n＝16)组中的动物分别展现27和25天的类似中位存活期。相反，用IL13Rα2(克隆47)mAb共注射的动物的存活期(n＝13)显著增加到34天的中位数(p＝0.0001；mIgG相对于IL13Rα2 mAb 组)。对来自在第17天收集的脑的神经胶质瘤异种移植物的H&E染色的分析揭露了神经胶质瘤细胞分布在对照组的脑中的类似模式。相反，用IL13Rα2 mAb共注射的动物组中的肿瘤块的大小显著降低(图9B)。独立地，在小鼠的脑中接种U251细胞并且3天后经由同一钻孔用如先前所描述的PBS或IL13Rα2(克隆47或B-D13)mAb注射(29)。有趣地，类似于在共注射实验中所发现的(图9A)，当与PBS和克隆B-D13组相比较时，用克隆47注射的小鼠展现中位存活期的提高(35天分别相对于27和23天；n＝7； P＞0.05)(图11)。然而，所有动物最终因疾病而死亡。这些数据指示在小鼠脑中，IL13Rα2 (克隆47)mAb在促进IL13Rα2表达U251神经胶质瘤细胞的肿瘤排斥中展示前景。这种发现预期并入IL13Rα2(克隆47)mAb的IL13Rα2结合域的抗体药剂将在治疗通过 IL13Rα2的呈递表征的各种人类和非人类癌症(如IL13Rα2表达神经胶质瘤细胞和其它恶性细胞类型)中有效。
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实例10
用于选择性靶向IL13Rα2表达脑肿瘤的单链抗体
IL13Rα2在大多数高级星形细胞瘤和其它恶性病中过度表达，并且在各种临床前模型中其已被验证为用于治疗应用的标靶。然而，由于与由正常或健康细胞广泛表达的IL13Rα1受体的相互作用，目前基于IL13的治疗剂缺乏特异性。严格地结合到IL13Rα2 的靶向剂的产生将显著扩大用于治疗IL13Rα2表达癌症的治疗潜在性。最近，已开发出单克隆抗体47(mAb47)并且其被广泛地表征。mAb47排他性地结合到人类IL13Rα2 的原生形式。使用mAb47，单链抗体(scFv)片段从由亲本杂交瘤细胞系表达的mAb47 中工程改造。测试单链抗体(scFv)片段作为可溶药剂的靶向特性，并且将具有并有 scFv47作为靶向基元的经修饰纤维的腺病毒(Ad)药剂化。
利用噬菌体呈现方法来选择来自产生mAb47的所确立杂交瘤细胞的可变重(VH)和轻(VL)链的功能组合。测试呈现scFv47的纯化噬菌体与IL13Rα2hFc重组蛋白-即 IL13Rα2和抗体的Fc区的融合体-的相互作用。利用竞争性ELISA来验证亲本mAb47 和结合到相同抗原决定基的scFv47片段。通过SDS-PAGE分析在大肠杆菌和CHO细胞中表达的scFv47的可溶形式，并且测试其稳定性和靶向特性。为产生IL13Rα2特异性 Ad，用由在其C端处连接到scFV47的T4纤维蛋白三聚域构成的嵌合纤维基因置换编码绿色荧光蛋白的复制缺陷型Ad5的纤维(AdFFscFv47-CMV-GFP)。为产生病毒粒子，在HEK293F28细胞中拯救编码腺病毒基因组的药剂，扩展并且纯化。IL13Rα2+和 IL13Rα2 U251细胞系分别经由用对照或IL13Rα2特异性shRNA(U251-IL13Rα2.KO) 稳定转染来确立。在这些U251细胞系中并且在IL13Rα2表达U87细胞中测试AdFFscFv47-CMV-GFP病毒的靶向特性。
在板ELISA中，噬菌体的生物淘选选择库以及若干个别克隆展现与IL13Rα2hFc蛋白质而非hIgG的特异性结合。scFv47呈现的噬菌体与IL13Rα2的结合由mAb47而非对照IgG或其它所测试的IL13Rα2 mAb完全消除，由此确认如由亲本mAb47所识别，同一IL13Rα2抗原决定基由scFv47识别。类似于噬菌体呈现的scFv47，可溶scFv47显示与IL123Rα2而非IL13Rα1的特异性结合。相对于U251-IL13Rα2.KO细胞，针对 U251-IL13Rα2+细胞中的GFP表达，如通过流式细胞测量术所判断， Ad5FFscFv47-CMV-GFP的相互作用也对IL13Rα2表达U251细胞具有特异性。此外，感染有Ad5FFscFv47-CMV-GFP的细胞中的GFP表达强烈地与IL13Rα2的表面表达水平相关。进一步在U251神经胶质瘤模型中验证病毒感染的特异性。
所述数据将scFv47验证为高度选择性的IL13Rα2靶向剂，其提供适用于诊断并且治疗IL13Rα2表达癌症如神经胶质瘤、结肠癌(参见实例12)等的可溶性单链生物制剂。
实例11
IL13Rα2-CAR的产生
为产生IL13Rα2特异性T细胞，最初构筑IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)。合成密码子优化微基因，其含有免疫球蛋白重链前导肽和由连接子分隔开的IL13Rα2特异性单链可变片段(scFv)的重链和轻链(scFv衍生自杂交瘤47，Balyasnikova等人《生物化学杂志》2012；287(36)：30215-30277)。将微基因亚克隆于SFG反转录病毒载体中，所述SFG反转录病毒载体含有人类IgG1-CH2CH3域、CD28跨膜域和衍生自CD28和 CD3ζ-链的共刺激域。用RD114假型化的反转录病毒粒子转导CD3/CD28活化的人类T 细胞并且随后使用IL2扩增。功能分析揭露到如通过细胞因子产生(IFNγ和IL2；图19 和20)所判断，表达IL13Rα2特异性CAR的T细胞(IL13Rα2-CAR T细胞)识别重组 IL13Rα2蛋白，并且在细胞毒性分析中杀死IL13Rα2阳性细胞(图18)。非转导(NT) T细胞不产生细胞因子并且不具有溶细胞活性。
实例12
将T细胞再引导到IL13Rα2阳性小儿神经胶质瘤
IL13Rα2在多形性成胶质细胞瘤中异常表达，并且因此是一种用于CAR T细胞免疫疗法的有前景的标靶。CAR的抗原识别域通常由单链可变片段(scFv)组成，但目前的 IL13Rα2特异性CAR使用IL13突变蛋白作为抗原识别域。然而，已显示基于IL13突变蛋白的CAR也识别IL13Rα1，产生重大的安全问题。为解决这种障碍，已将高亲和力 IL13Rα2特异性scFv药剂化。这种scFv用于开发基于scFv的IL13Rα2特异性CAR (IL13Rα2-CAR)，其在T细胞中表达时将提供具有细胞毒性效应功能的IL13Rα2-CAR T 细胞。
将抗原特异性T细胞并入用于扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(diffuse intrinsicpontine glioma，DIPG)和成胶质细胞瘤(GBM)的有效免疫疗法中，所述瘤在儿童中是最具侵蚀性的均一致死性的原发性人类脑肿瘤。IL13Rα2在DIPG和GBM两者中而非在正常脑中以高频率表达，使得其成为用于T细胞免疫疗法和融合有提供效应功能的其它构架的scFv融合体的有前景的标靶，所述T细胞免疫疗法包括基于scFv的疗法、基于scFv-CAR T细胞的疗法，所述scFv融合体如BITE和scFv-CAR-NK。已使用IL13 的突变形式作为CAR结合域产生IL13结合CAR，但这些CAR也识别IL13Rα1，产生重大的毒性问题。
为克服这种限制，产生不识别IL13Rα1的高亲和力IL13Rα2特异性scFv。将一组IL13Rα2-CAR药剂化，其含有作为胞外域的IL13Rα2特异性scFv、短铰链(SH)或长铰链(LH)、CD28跨膜域和胞内域，所述胞内域含有衍生自CD3ζ的信号传导域和共刺激分子(例如CD28.ζ、CD137.ζ、CD28.CD137.ζ、CD28.CD134.ζ)。IL13Rα2-CAR T细胞通过反转录病毒转导来产生，并且效应功能在体外使用共培养和细胞毒性分析确定，并且在体内使用U373脑异种移植物模型确定(图21)。
如通过蛋白质印迹分析所判断，所有CAR在T细胞中的表达是类似的。然而，取决于药剂的铰链和胞内域，CAR细胞表面表达是不同的。在细胞毒性分析中，各种 IL13Rα2-CART细胞仅杀死表达IL13Rα2并且不表达IL13Rα1的靶细胞，确认了特异性 (图18)。虽然所有IL13Rα2-CAR T细胞在与IL13Rα2+神经胶质瘤细胞系U373的共培养分析中分泌显著含量的IFNγ(图19)，但仅短铰链CAR T细胞分泌显著量的IL2(图 20)。表达具有缺失胞内域的IL13Rα2-CAR(IL13Rα2Δ-CAR)的T细胞不分泌细胞因子，确认细胞因子产生取决于功能IL13Rα2-CAR的存在。如通过生物发光成像所判断，体内IL13Rα2.SH.CD28.ζ-CAR T细胞于带有U373的小鼠中的注射使神经胶质瘤异种移植物消退(图21)。IL13Rα2.LH.CD28.ζ-或IL13Rα2.Δ-CAR T细胞不具有抗肿瘤作用。数据确立到CAR仅识别IL13Rα2并且无IL13Rα1产生，并且CAR优先靶向表达IL13Rα2 的肿瘤细胞。对若干IL13Rα2-CAR的比较揭露：如通过IL2产生和体内抗神经胶质瘤活性所判断，具有SH和CD28.ζ胞内域的CAR产生显著的T细胞活化。结果显示儿童中原发性人类脑肿瘤例如高级神经胶质瘤的过继性免疫疗法是可行并有前景的。
实例13
47-CAR T细胞的产生
最初产生编码基于scFv47的CAR(47-CAR；图31A)24、25的两种反转录病毒载体。两种CAR含有N端前导序列、编码scFv47的密码子优化合成基因、间隔区、CD28跨膜域，和衍生自CD28和CD3.ζ的信号传导域(图31A)。间隔区是IgG1铰链(16个氨基酸；短间隔区(SSR)；47-CAR.SSR.CD28.ζ)或IgG1-CH2CH3域(293个氨基酸；长间隔区(LSR)；47-CAR.LSR.CD28.ζ)。作为对照，构筑无信号传导域的LSR和SSR 47-CAR(47-CAR.SSR.Δ，47-CAR.LSR.Δ；图31A)。用RD114假型化的反转录病毒粒子转导来自健康供体的CD3/CD28活化的T细胞，并且转导后4到5天，通过FACS分析确定T细胞表型和CAR表达。CAR在细胞表面上表达，并且转导效率在69.2％-98.5％范围内，其中构筑体之间不具有显著差异(图31B、C)。通过蛋白质印迹使用用于检测的CD3.ζ抗体确认全长47-CAR.SSR.CD28.ζ和47-CAR.LSR.CD28.ζ的表达(图31D)。表型分析揭露CD4和CD8阳性T细胞的混合物。虽然对于47-CAR.SSR.CD28.ζ、 47-CAR.SSR.Δ和47-CAR.LSR.ΔT细胞系，CD8阳性T细胞比CD4阳性T细胞的比率是约3∶1，但对于47-CAR.LSR.CD28.ζ，比率是约1.5∶1(图2)。
实例14
47-CAR T细胞仅识别IL13Rα2
为最初确定47-CAR的特异性，在未涂布或涂布有编码IL13Rα1、IL13Rα2或IL4R 的重组蛋白的组织培养板上，培养表达47-CAR.SSR.CD28.ζ、47-CAR.LSR.CD28.ζ、 M47-CAR.SSR.Δ或M47-CAR.LSR.Δ的T细胞。非转导(NT)T细胞和表达识别IL13Rα1 和IL13Rα2的IL13突变蛋白-CAR.LSR.CD28.ζ10的T细胞充当对照。相较于IL13Rα1 或IL4R刺激的T细胞，当用重组IL13Rα2蛋白刺激时，表达47-CAR.SSR.CD28.ζ或 47-CAR.LSR.CD28.ζ的T细胞产生显著含量的IFNγ(p＜0.001)(图33A)。相反，回应于所有三种蛋白质，表达47-CAR.SSR.Δ或47-CAR.LSR.Δ的T细胞不产生IFNγ，指示 IFNγ产生取决于完整的47-CAR信号传导域。47-CAR.LSR.CD28.ζ T细胞也产生低含量的无活化的IFNγ，指示基线T细胞活化，其通过针对磷酸化CD3.ζ的胞内染色来确认 (图34)。相较于NT T细胞，在IL13Rα1(p＜0.001)和IL13Rα2(p＜0.05)存在下，IL13 突变蛋白-CAR.LSR.CD28.ζ T细胞产生显著含量的IFNγ。
随后使用对IL13Rα1和IL13Rα2为阴性(Raji)、对IL13Rα1为阳性(293T-GFP细胞)或对IL13Rα1和IL13Rα2为阳性(U373，293T-GFP/IL13Rα2；图35)的细胞系确认47-CAR T细胞的特异性。将表达47-CAR.SSR.CD28.ζ、47-CAR.LSR.CD28.ζ、 47-CAR.SSR.Δ或47-CAR.LSR.Δ的T细胞与Raji、293T-GFP或293T-GFP/IL13Rα2细胞共培养。NT T细胞充当对照。在24小时后，收集培养基并且通过ELISA确定IFNγ和IL2的浓度。47-CAR.SSR.CD28.ζ和47-CAR.LSR.CD28.ζ T细胞仅在U373或 293T-GFP/IL13Rα2细胞存在下产生显著量的IFNγ(图33B)，其中SSR.CAR T细胞与 LSR.CAR T细胞相比产生显著更多的IFNγ(p＜0.001)。在293T-GFP/IL13Rα2和U373 细胞存在下，47-CAR.SSR.CD28.ζ T细胞也产生显著量的IL2，而47-CAR.LSR.CD28.ζ T 细胞并不如此(图33C)。回应于任何靶细胞，NT-T细胞和表达47-CAR.SSR.Δ或 47-CAR.LSR.Δ的T细胞不产生IFNγ或IL2。最后，我们确认在标准细胞毒性分析中使用Raii、293T-GFP、293T-GFP/IL13Rα2和U373作为标靶的47-CAR T细胞的特异性(图 33D)。
实例15
具有CD28.OX40/41BB的短间隔区(SSR)47-CAR的产生
虽然上文所描述的结果证实47-CAR T细胞仅识别IL13Rα2，如通过细胞因子产生和溶细胞活性所判断，但所述结果也突显了LSR与SSR 47-CAR之间的差异。由于在 IL13Rα2阳性靶细胞存在下仅47-CAR.SSR产生IL2，因此下一组实验的焦点转移到具有SSR的47-CAR，并且产生具有CD28.OX40.ζ、CD28.41BB.ζ或41BB.ζ胞内域的额外 CAR(图36A)。通过反转录病毒转导产生CAR T细胞并且通过FACS分析(图36B、C) 和蛋白质印迹(图36D)确定CAR表达。虽然如通过蛋白质印迹分析所判断，所有CAR 是表达的，但47-CAR.SSR.CD28.41BB.ζ在细胞表面上不表达，并且从进一步分析中排除。
实例16
比较短间隔区47-CAR
为比较47-CAR.SSR T细胞回应于抗原暴露产生IFNγ和IL2的能力，用U373细胞进行共培养分析。表达47-CAR.SSR.Δ的T细胞充当对照。在U373细胞存在下，所有具有功能胞内域的47-CAR.SSR均诱导IFNγ和IL2产生；然而，相较于 47-CAR.SSR.CD28.ζ和47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞，47-CAR.SSR.41BB.ζ T细胞产生显著较少(p＜0.05)的IFNγ(图37A)。47-CAR.SSR.CD28.ζ T细胞产生最高量的 IL2，之后是47-CAR.SSR.41BB.ζ和47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞。在细胞毒性分析中，使用Raji、293T-GFP、293T-GFP/IL13Rα2和U373细胞作为标靶，在所有三种构筑体之间未观测到显著差异(图37B)。
由于所有具有功能胞内域的三种47-CAR.SSR T细胞均产生IL2，因此在T细胞直接注射于肿瘤中的原位U373神经胶质瘤异种移植物小鼠模型中测试所有三种构筑体6。所述模型允许连续的生物发光成像，因为U373细胞经过遗传修饰以表达eGFP.ffLuc融合蛋白(U373.eGFP.ffLuc)。在第0天，将U373.eGFP.ffLuc细胞以立体定位方式注射于 SCID小鼠的脑中，并且在第7天瘤内注射表达47-CAR.SSR.CD28.ζ、 47-CAR.SSR.41BB.ζ、47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ或47-CAR.SSR.Δ的T细胞。虽然用 47-CAR.SSR.Δ T细胞处理的小鼠在T细胞注射的4天内显示连续的肿瘤生长，但用具有功能胞内域的47-CAR.SSR T细胞处理的小鼠并不如此(图38A、B)。对生物发光成像结果的比较揭露在T细胞注射的当天，47-CAR.SSR.Δ T细胞组与47-CAR.SSR T细胞组之间无显著差异。然而，相较于用47-CAR.SSR.Δ T细胞处理的小鼠，早在处理后一天，用47-CAR.SSR.CD28.ζ或47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζT细胞处理的小鼠具有显著更低的肿瘤信号(p＝0.012；表2)。对于47-CAR.SSR.CD28.ζ或47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞处理的小鼠，这产生显著的存活优势(p＝0.0002和p＝0.0092；图40C)。虽然 47-CAR.SSR.41BB.ζ T细胞处理的小鼠应答地较慢，在第14天所处理的47-CAR.SSR.Δ T 细胞之间产生显著差异(p＝0.005；表2)，但用这种CAR T细胞处理也产生显著的存活优势(p＝0.0039；图5C，图40C)。47-CAR.SSR.CD28.ζ T细胞处理的小鼠具有最长的中位存活期(84天)。然而，相较于47-CAR.SSR.41BB.ζ(63天)或 47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ(56天)T细胞处理的小鼠的中位存活期，不存在统计差异。
虽然47-CAR T细胞具有有力的抗神经胶质瘤活性，但小鼠出现复发性神经胶质瘤。为研究肿瘤复发的病因，从已用47-CAR.SSR.CD28.ζ或47-CAR.SSR.CD28.OX40.ζ T细胞处理的两只带有肿瘤的小鼠中分离U373细胞。短期培养后的FACS分析揭露IL13Rα2 的细胞表面表达，并且在细胞毒性分析中这些细胞容易被47-CAR T细胞杀死(图39)。紧接着，由具有47-CAR.SSR.CD28.ζ和eGFP.ffLuc的经过遗传修饰的T细胞 (Luc/47-CAR T细胞)确定T细胞的存留，并且将其注射于带有U373肿瘤的小鼠中。T 细胞存留小于7天。不希望受理论所束缚，受限制的存留似乎最有可能解释肿瘤复发(图 40)。
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实例17
IL15的转基因表达增加引起增强的抗肿瘤活性的47-CAR T细胞存留
通过用逆转录病毒双转导T细胞来产生表达IL15的IL13Rα2-CAR.CD28.ζ T细胞(IL13Rα2-CAR.IL15 T细胞)，所述逆转录病毒含有编码i)IL13Rα2-CAR.CD28.ζ或ii)IL15、Δ神经生长因子受体(ΔNGFR)和由2A序列分隔开的诱导型卡斯蛋白酶9(iC9) 的表达盒。合适的2A序列包括所属领域中已知的任何2A序列，如由以下所示范：来自猪捷申病毒(teschovirus)-1的2A氨基酸序列(SEQ ID NO：109)，由以SEQ ID NO： 110形式阐述的聚核苷酸序列编码；来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thoseaasigna virus) 的2A氨基酸序列(SEQID NO：111)，由以SEQ ID NO：112形式阐述的聚核苷酸序列编码；来自马鼻炎A病毒(ERAV)的2A氨基酸序列(SEQ ID NO：113)，由以SEQ ID NO：114形式阐述的聚核苷酸序列编码；或来自口蹄疫病毒(FMDV)的2A氨基酸序列 (SEQ ID NO：115)，由以SEQ ID NO：116形式阐述的聚核苷酸序列编码。Kim等人，《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》6(4)：1-8(2011)。体外使用标准分析并且在U373 GBM 异种移植物模型中确定IL13Rα2-CAR.IL15 T细胞的效应功能。
CD3/CD28活化的T细胞的双转导产生在45-50％的T细胞中表达两种转基因的T 细胞系。在基线下，IL13Rα2-CAR.IL15 T细胞产生平均69.5pg/ml的IL15。在CD3或抗原特异性T细胞刺激后，产生是显著增加的(176.7pg/ml；n＝6；p＜0.001)。在体外在杀死IL13Rα2阳性GBM细胞时，IL13Rα2-CAR.IL15 T细胞像IL13Rα2-CAR T细胞那样有效在瘤内注射于带有U373神经胶质瘤的小鼠中后，与IL13Rα2-CAR T细胞相比， IL13Rα2-CAR.IL15 T细胞显著存留得更长(p＜0.05)。这在经处理小鼠的无进展(98相对于49天；p＝0.004)和总体存活(p＝0.006)中引起显著增加。
本实例中所公开的数据证实IL15的转基因表达增强IL13Rα2-CAR T细胞的体内存留，提高了抗神经胶质瘤活性。
如将从引用的情形中显而易见，本文所引用的每一个参考文献以全文或相关部分引用的方式并入本文中。
从本文的公开内容应了解，尽管本文中已出于说明的目的描述了本公开的特定实施例，但可以在不背离本公开的精神和范围的情况下进行各种修改。
序列表
<110> Balyasnikova等人
<120> 识别癌症特异性IL13Rα2的CAR T细胞
<130> 27373/49923A
<150> US 62/245,771
<151> 2015-10-23
<150> US 62/107,980
<151> 2015-01-26
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
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Asn Tyr Leu Met Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
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Asp
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<220>
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Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu Asp Trp Ile
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Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
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100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Lys Leu Glu
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Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp
165 170 175
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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180 185 190
Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
195 200 205
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<212> DNA
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<223> 合成聚核苷酸
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cctgagcaag accttgactg gattggaagg attgatcctt acgatggtga cattgactac 180
aatcaaaact tcaaggacaa ggccatattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggttat 300
ggcacggcct atggtgtgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 16
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 16
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cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 17
gcttggtacc gaatggcttt cgtttgcttg gc 32
<210> 18
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 18
Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys Thr
20 25 30
Gly Gly
<210> 19
<211> 146
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(34)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (35)..(132)
<400> 19
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-30 -25 -20
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
-15 -10 -5
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
-1 1 5 10
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Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
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80 85 90
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
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Phe Asn
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<400> 20
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cgcttttgtt gaccacggtc attgctctca cttgccttgg cggctttgcc tccccaggcc 120
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accagaaggc tccgctctgc aatggcagca tggtatggag catcaacctg acagctggca 240
tgtactgtgc agccctggaa tccctgatca acgtgtcagg ctgcagtgcc atcgagaaga 300
cccagaggat gctgagcgga ttctgcccgc acaaggtctc agctgggcag ttttccagct 360
tgcatgtccg agacaccaaa atcgaggtgg cccagtttgt aaaggacctg ctcttacatt 420
taaagaaact ttttcgcgag ggacagttca actgaaactt cgaaagcatc attatttgca 480
gagacaggac ctgactattg aagttgcaga ttcatttttc tttctgatgt caaaaatgtc 540
ttgggtaggc gggaaggagg gttagggagg ggtaaaattc cttagcttag acctcagcct 600
gtgctgcccg tcttcagcct agccgacctc agccttcccc ttgcccaggg ctcagcctgg 660
tgggcctcct ctgtccaggg ccctgagctc ggtggaccca gggatgacat gtccctacac 720
ccctcccctg ccctagagca cactgtagca ttacagtggg tgcccccctt gccagacatg 780
tggtgggaca gggacccact tcacacacag gcaactgagg cagacagcag ctcaggcaca 840
cttcttcttg gtcttattta ttattgtgtg ttatttaaat gagtgtgttt gtcaccgttg 900
gggattgggg aagactgtgg ctgctagcac ttggagccaa gggttcagag actcagggcc 960
ccagcactaa agcagtggac accaggagtc cctggtaata agtactgtgt acagaattct 1020
gctacctcac tggggtcctg gggcctcgga gcctcatccg aggcagggtc aggagagggg 1080
cagaacagcc gctcctgtct gccagccagc agccagctct cagccaacga gtaatttatt 1140
gtttttcctt gtatttaaat attaaatatg ttagcaaaga gttaatatat agaagggtac 1200
cttgaacact gggggagggg acattgaaca agttgtttca ttgactatca aactgaagcc 1260
agaaataaag ttggtgacag at 1282
<210> 21
<211> 427
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(21)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (22)..(427)
<400> 21
Met Glu Trp Pro Ala Arg Leu Cys Gly Leu Trp Ala Leu Leu Leu Cys
-20 -15 -10
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Pro Thr Glu Thr Gln
-5 -1 1 5 10
Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val
15 20 25
Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu
30 35 40
Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro
45 50 55
Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu
60 65 70 75
Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile
80 85 90
Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala
95 100 105
Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys
110 115 120
Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu
125 130 135
Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile
140 145 150 155
Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val
160 165 170
Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp
175 180 185
Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser
190 195 200
Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn
205 210 215
Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg
220 225 230 235
Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His
240 245 250
Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu
255 260 265
Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro
270 275 280
Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys
285 290 295
Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile
300 305 310 315
Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile Thr Met Leu Leu Ile Val
320 325 330
Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val Leu Leu Leu Tyr Leu Lys
335 340 345
Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro Gly Lys Ile
350 355 360
Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu His Trp Lys
365 370 375
Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys Glu Glu Thr Asp Ser Val
380 385 390 395
Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser Gln
400 405
<210> 22
<211> 4006
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
tgccaaggct ccagcccggc cgggctccga ggcgagaggc tgcatggagt ggccggcgcg 60
gctctgcggg ctgtgggcgc tgctgctctg cgccggcggc gggggcgggg gcgggggcgc 120
cgcgcctacg gaaactcagc cacctgtgac aaatttgagt gtctctgttg aaaacctctg 180
cacagtaata tggacatgga atccacccga gggagccagc tcaaattgta gtctatggta 240
ttttagtcat tttggcgaca aacaagataa gaaaatagct ccggaaactc gtcgttcaat 300
agaagtaccc ctgaatgaga ggatttgtct gcaagtgggg tcccagtgta gcaccaatga 360
gagtgagaag cctagcattt tggttgaaaa atgcatctca cccccagaag gtgatcctga 420
gtctgctgtg actgagcttc aatgcatttg gcacaacctg agctacatga agtgttcttg 480
gctccctgga aggaatacca gtcccgacac taactatact ctctactatt ggcacagaag 540
cctggaaaaa attcatcaat gtgaaaacat ctttagagaa ggccaatact ttggttgttc 600
ctttgatctg accaaagtga aggattccag ttttgaacaa cacagtgtcc aaataatggt 660
caaggataat gcaggaaaaa ttaaaccatc cttcaatata gtgcctttaa cttcccgtgt 720
gaaacctgat cctccacata ttaaaaacct ctccttccac aatgatgacc tatatgtgca 780
atgggagaat ccacagaatt ttattagcag atgcctattt tatgaagtag aagtcaataa 840
cagccaaact gagacacata atgttttcta cgtccaagag gctaaatgtg agaatccaga 900
atttgagaga aatgtggaga atacatcttg tttcatggtc cctggtgttc ttcctgatac 960
tttgaacaca gtcagaataa gagtcaaaac aaataagtta tgctatgagg atgacaaact 1020
ctggagtaat tggagccaag aaatgagtat aggtaagaag cgcaattcca cactctacat 1080
aaccatgtta ctcattgttc cagtcatcgt cgcaggtgca atcatagtac tcctgcttta 1140
cctaaaaagg ctcaagatta ttatattccc tccaattcct gatcctggca agatttttaa 1200
agaaatgttt ggagaccaga atgatgatac tctgcactgg aagaagtacg acatctatga 1260
gaagcaaacc aaggaggaaa ccgactctgt agtgctgata gaaaacctga agaaagcctc 1320
tcagtgatgg agataattta tttttacctt cactgtgacc ttgagaagat tcttcccatt 1380
ctccatttgt tatctgggaa cttattaaat ggaaactgaa actactgcac catttaaaaa 1440
caggcagctc ataagagcca caggtcttta tgttgagtcg cgcaccgaaa aactaaaaat 1500
aatgggcgct ttggagaaga gtgtggagtc attctcattg aattataaaa gccagcaggc 1560
ttcaaactag gggacaaagc aaaaagtgat gatagtggtg gagttaatct tatcaagagt 1620
tgtgacaact tcctgaggga tctatacttg ctttgtgttc tttgtgtcaa catgaacaaa 1680
ttttatttgt aggggaactc atttggggtg caaatgctaa tgtcaaactt gagtcacaaa 1740
gaacatgtag aaaacaaaat ggataaaatc tgatatgtat tgtttgggat cctattgaac 1800
catgtttgtg gctattaaaa ctcttttaac agtctgggct gggtccggtg gctcacgcct 1860
gtaatcccag caatttggga gtccgaggcg ggcggatcac tcgaggtcag gagttccaga 1920
ccagcctgac caaaatggtg aaacctcctc tctactaaaa ctacaaaaat taactgggtg 1980
tggtggcgcg tgcctgtaat cccagctact cgggaagctg aggcaggtga attgtttgaa 2040
cctgggaggt ggaggttgca gtgagcagag atcacaccac tgcactctag cctgggtgac 2100
agagcaagac tctgtctaaa aaacaaaaca aaacaaaaca aaacaaaaaa acctcttaat 2160
attctggagt catcattccc ttcgacagca ttttcctctg ctttgaaagc cccagaaatc 2220
agtgttggcc atgatgacaa ctacagaaaa accagaggca gcttctttgc caagaccttt 2280
caaagccatt ttaggctgtt aggggcagtg gaggtagaat gactccttgg gtattagagt 2340
ttcaaccatg aagtctctaa caatgtattt tcttcacctc tgctactcaa gtagcattta 2400
ctgtgtcttt ggtttgtgct aggcccccgg gtgtgaagca cagacccctt ccaggggttt 2460
acagtctatt tgagactcct cagttcttgc cacttttttt tttaatctcc accagtcatt 2520
tttcagacct tttaactcct caattccaac actgatttcc ccttttgcat tctccctcct 2580
tcccttcctt gtagcctttt gactttcatt ggaaattagg atgtaaatct gctcaggaga 2640
cctggaggag cagaggataa ttagcatctc aggttaagtg tgagtaatct gagaaacaat 2700
gactaattct tgcatatttt gtaacttcca tgtgagggtt ttcagcattg atatttgtgc 2760
attttctaaa cagagatgag gtggtatctt cacgtagaac attggtattc gcttgagaaa 2820
aaaagaatag ttgaacctat ttctctttct ttacaagatg ggtccaggat tcctcttttc 2880
tctgccataa atgattaatt aaatagcttt tgtgtcttac attggtagcc agccagccaa 2940
ggctctgttt atgcttttgg ggggcatata ttgggttcca ttctcaccta tccacacaac 3000
atatccgtat atatcccctc tactcttact tcccccaaat ttaaagaagt atgggaaatg 3060
agaggcattt cccccacccc atttctctcc tcacacacag actcatatta ctggtaggaa 3120
cttgagaact ttatttccaa gttgttcaaa catttaccaa tcatattaat acaatgatgc 3180
tatttgcaat tcctgctcct aggggagggg agataagaaa ccctcactct ctacaggttt 3240
gggtacaagt ggcaacctgc ttccatggcc gtgtagaagc atggtgccct ggcttctctg 3300
aggaagctgg ggttcatgac aatggcagat gtaaagttat tcttgaagtc agattgaggc 3360
tgggagacag ccgtagtaga tgttctactt tgttctgctg ttctctagaa agaatatttg 3420
gttttcctgt ataggaatga gattaattcc tttccaggta ttttataatt ctgggaagca 3480
aaacccatgc ctccccctag ccatttttac tgttatccta tttagatggc catgaagagg 3540
atgctgtgaa attcccaaca aacattgatg ctgacagtca tgcagtctgg gagtggggaa 3600
gtgatctttt gttcccatcc tcttctttta gcagtaaaat agctgaggga aaagggaggg 3660
aaaaggaagt tatgggaata cctgtggtgg ttgtgatccc taggtcttgg gagctcttgg 3720
aggtgtctgt atcagtggat ttcccatccc ctgtgggaaa ttagtaggct catttactgt 3780
tttaggtcta gcctatgtgg attttttcct aacataccta agcaaaccca gtgtcaggat 3840
ggtaattctt attctttcgt tcagttaagt ttttcccttc atctgggcac tgaagggata 3900
tgtgaaacaa tgttaacatt tttggtagtc ttcaaccagg gattgtttct gtttaacttc 3960
ttataggaaa gcttgagtaa aataaatatt gtctttttgt atgtca 4006
<210> 23
<211> 380
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(26)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (27)..(380)
<400> 23
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
-25 -20 -15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
-10 -5 -1 1 5
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
10 15 20
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
25 30 35
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
40 45 50
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
55 60 65 70
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
75 80 85
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
90 95 100
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
105 110 115
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
120 125 130
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
135 140 145 150
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
155 160 165
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
170 175 180
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
185 190 195
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
200 205 210
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
215 220 225 230
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
235 240 245
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
250 255 260
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
265 270 275
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
280 285 290
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
295 300 305 310
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
315 320 325
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
330 335 340
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr
345 350
<210> 24
<211> 1376
<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
gtaagaacac tctcgtgagt ctaacggtct tccggatgaa ggctatttga agtcgccata 60
acctggtcag aagtgtgcct gtcggcgggg agagaggcaa tatcaaggtt ttaaatctcg 120
gagaaatggc tttcgtttgc ttggctatcg gatgcttata tacctttctg ataagcacaa 180
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agatagtgga tcccggatac ttaggttatc tctatttgca atggcaaccc ccactgtctc 300
tggatcattt taaggaatgc acagtggaat atgaactaaa ataccgaaac attggtagtg 360
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agggcattga agcgaagata cacacgcttt taccatggca atgcacaaat ggatcagaag 480
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atcatgcatt acagtgtgtt gattacatca aggctgatgg acaaaatata ggatgcagat 720
ttccctattt ggaggcatca gactataaag atttctatat ttgtgttaat ggatcatcag 780
agaacaagcc tatcagatcc agttatttca cttttcagct tcaaaatata gttaaacctt 840
tgccgccagt ctatcttact tttactcggg agagttcatg tgaaattaag ctgaaatgga 900
gcataccttt gggacctatt ccagcaaggt gttttgatta tgaaattgag atcagagaag 960
atgatactac cttggtgact gctacagttg aaaatgaaac atacaccttg aaaacaacaa 1020
atgaaacccg acaattatgc tttgtagtaa gaagcaaagt gaatatttat tgctcagatg 1080
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aaactttgct acgtttctgg ctaccatttg gtttcatctt aatattagtt atatttgtaa 1200
ccggtctgct tttgcgtaag ccaaacacct acccaaaaat gattccagaa tttttctgtg 1260
atacatgaag actttccata tcaagagaca tggtattgac tcaacagttt ccagtcatgg 1320
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<210> 25
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln
20 25 30
Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys
35 40 45
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys
50 55 60
Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr
65 70 75 80
Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu
85 90 95
Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
100 105 110
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr
115 120 125
Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu
145 150 155 160
Ala Arg Val Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val
165 170 175
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
180 185 190
Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly
210 215 220
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu
225 230 235 240
Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln
245 250 255
Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
260 265 270
Ile Lys Ala Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys
290 295 300
Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val
305 310 315 320
Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser
325 330 335
Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp
340 345 350
Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg
355 360 365
Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser
370 375 380
Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn
385 390 395 400
Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp
405 410 415
Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp
420 425 430
Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu
435 440 445
Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile
450 455 460
Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
465 470 475
<210> 26
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 26
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
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aactgggtta agcagaggcc tgagcaagac cttgactgga ttggaaggat tgatccttac 240
gatggtgaca ttgactacaa tcaaaacttc aaggacaagg ccatattgac tgtagacaaa 300
tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctgacat ctgaggactc tgcggtctat 360
tactgtgcaa gaggttatgg cacggcctat ggtgtggact actggggtca aggaacctca 420
gtcaccgtct cctcagccaa aacgacaccc ccaaagcttg aagaaggtga attttcagaa 480
gcacgcgtag atattgtgct aactcagtct ccagcttctt tggctgtgtc tctaggacag 540
agggccacca tctcctgcag agccagcgaa agtgttgata attatggcat tagttttatg 600
aactggttcc aacagaaacc aggacagcca cccaaactcc tcatctatgc tgcatccagg 660
caaggatccg gggtccctgc caggtttagt ggcagtgggt ctgggacaga cttcagcctc 720
aacatccatc ctatggagga ggatgatact gcaatgtatt tctgtcagca aagtaaggag 780
gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag ctggaaatca aagcggccgc tggcggaggc 840
ggttcgggcg gaggtggctc tggcggtggc ggatcaacct ctgaggaaac catttctaca 900
gttcaagaaa agcaacaaaa tatttctccc ctagtgagag aaagaggtcc tcagagagta 960
gcagctcaca taactgggac cagaggaaga agcaacacat tgtcttctcc aaactccaag 1020
aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac tcctgggaat catcaaggag tgggcattca 1080
ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt gaactggtca tccatgaaaa agggttttac 1140
tacatctatt cccaaacata ctttcgattt caggaggaaa taaaagaaaa cacaaagaac 1200
gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa tacacaagtt atcctgaccc tatattgttg 1260
atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct aaagatgcag aatatggact ctattccatc 1320
tatcaagggg gaatatttga gcttaaggaa aatgacagaa tttttgtttc tgtaacaaat 1380
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<210> 27
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile
1 5 10 15
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile
20 25 30
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
35 40 45
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
50 55 60
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
65 70 75 80
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe
85 90 95
Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met
100 105 110
Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
115 120 125
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 155 160
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 28
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 29
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 29
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324
<210> 30
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 31
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 31
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300
gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360
cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420
gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480
gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540
agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600
aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660
aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720
agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780
aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840
tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900
acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960
tctcctggta aatga 975
<210> 32
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 33
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
260 265
<210> 34
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 34
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
gagcaggacc tggattggat cggcagaatc gacccctacg acggcgacat cgactacaac 240
cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
gccagcgaga gcgtggacaa ctacggcatc agcttcatga attggttcca gcagaagccc 600
ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa g 801
<210> 35
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys
225 230 235
<210> 36
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 36
gatcccgccg agcccaaatc tcctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc aaccggagaa caactacaag 540
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 600
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaaaaa 708
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Asp Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro
<210> 38
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 38
gatctcgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc g 51
<210> 39
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser
65
<210> 40
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 40
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 41
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 42
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 42
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu
<210> 44
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 44
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctg 105
<210> 45
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 45
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
20
<210> 46
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 46
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctg 105
<210> 47
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 47
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
65 70 75 80
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
85 90 95
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
100 105 110
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
115 120 125
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
130 135 140
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
165 170 175
Leu Pro Pro Arg
180
<210> 48
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 48
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 240
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 300
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 360
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 420
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 480
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 540
<210> 49
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 49
Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe
225 230 235 240
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
245 250 255
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
260 265 270
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
275 280 285
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
290 295 300
Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
305 310 315 320
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
325 330 335
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
340 345 350
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
355 360 365
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
370 375 380
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
385 390 395 400
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
405 410 415
Pro Pro Arg
<210> 50
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 50
gatcccgccg agcccaaatc tcctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc aaccggagaa caactacaag 540
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 600
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaaaaaga tcccaaattt 720
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 780
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 840
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 900
gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 960
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1020
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1080
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1140
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1200
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1257
<210> 51
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 51
Asp Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
20 25 30
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
35 40 45
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
50 55 60
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
65 70 75 80
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
85 90 95
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
115 120 125
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
130 135 140
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
145 150 155 160
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
165 170 175
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
180 185 190
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成多肽
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2060
<210> 55
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 55
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275 280 285
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385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
420 425 430
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
435 440 445
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
450 455 460
Pro Pro Arg
465
<210> 56
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 56
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
gagcaggacc tggattggat cggcagaatc gacccctacg acggcgacat cgactacaac 240
cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
gccagcgaga gcgtggacaa ctacggcatc agcttcatga attggttcca gcagaagccc 600
ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa ggatctcgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
ccaccgtgcc cggatcccaa attttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 900
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 960
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1020
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc 1080
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1140
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1200
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1260
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1320
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1380
atgcaggccc tgccccctcg c 1401
<210> 57
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 57
Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe
225 230 235 240
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
245 250 255
His
<210> 58
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 58
gatcccgccg agcccaaatc tcctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420
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tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc aaccggagaa caactacaag 540
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cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaaaaaga tcccaaattt 720
tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 780
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tg 822
<210> 59
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 59
Asp Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
20 25 30
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
35 40
<210> 60
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 60
gatctcgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc ggatcccaaa 60
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 120
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctg 165
<210> 61
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 61
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Glu Asp Pro Ala
260 265 270
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu
500 505 510
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu His
515 520 525
<210> 62
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 62
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
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cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
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aggctcctga ct 1632
<210> 63
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 63
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Leu Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile His
305 310
<210> 64
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 64
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
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cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
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ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa ggatctcgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
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ctcctgact 969
<210> 65
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 65
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<210> 66
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 66
caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacgttctcc aactacttga tgaactgggt taagcagagg 120
cctgagcaag accttgactg gattggaagg attgatcctt acgatggtga cattgactac 180
aatcaaaact tcaaggacaa ggccatattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggttat 300
ggcacggcct atggtgtgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcagat 360
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<210> 67
<211> 1488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 67
Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr
20 25 30
Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr
35 40 45
Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr
50 55 60
Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala
65 70 75 80
Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys
85 90 95
Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala
100 105 110
Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala
115 120 125
Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys
130 135 140
Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr
145 150 155 160
Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala
165 170 175
Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys
180 185 190
Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys
195 200 205
Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly
210 215 220
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys
225 230 235 240
Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys
245 250 255
Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly
260 265 270
Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys
275 280 285
Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala
290 295 300
Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala
305 310 315 320
Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys
325 330 335
Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr
340 345 350
Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys
355 360 365
Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala
370 375 380
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly
385 390 395 400
Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr
405 410 415
Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Thr Cys Thr
420 425 430
Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly
435 440 445
Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly
450 455 460
Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr
465 470 475 480
Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly
485 490 495
Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr
500 505 510
Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly
515 520 525
Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly
530 535 540
Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr
545 550 555 560
Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys
565 570 575
Ala Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly
580 585 590
Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Thr
595 600 605
Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys
610 615 620
Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys
625 630 635 640
Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Ala Thr
645 650 655
Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys
660 665 670
Gly Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys Cys
675 680 685
Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Thr
690 695 700
Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys
705 710 715 720
Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly
725 730 735
Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala
740 745 750
Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Cys
755 760 765
Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys
770 775 780
Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Ala
785 790 795 800
Gly Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Gly Cys Cys
805 810 815
Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala
820 825 830
Gly Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Ala
835 840 845
Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly
850 855 860
Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Gly
865 870 875 880
Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr
885 890 895
Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys
900 905 910
Gly Ala Cys Ala Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys
915 920 925
Ala Gly Ala Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala
930 935 940
Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly
945 950 955 960
Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala
965 970 975
Cys Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr
980 985 990
Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Gly Cys
995 1000 1005
Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly
1010 1015 1020
Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala
1025 1030 1035
Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys
1040 1045 1050
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Thr
1055 1060 1065
Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Cys Ala
1070 1075 1080
Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys
1085 1090 1095
Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys
1100 1105 1110
Cys Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala
1115 1120 1125
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Thr Thr Cys Thr Cys Cys
1130 1135 1140
Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys
1145 1150 1155
Ala Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly
1160 1165 1170
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly
1175 1180 1185
Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys
1205 1210 1215
Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys
1220 1225 1230
Gly Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys
1235 1240 1245
Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys
1250 1255 1260
Ala Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Thr Cys Cys Ala Gly
1265 1270 1275
Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly
1280 1285 1290
Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly
1295 1300 1305
Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys
1310 1315 1320
Ala Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala
1325 1330 1335
Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr
1340 1345 1350
Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys
1355 1360 1365
Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys
1370 1375 1380
Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr
1385 1390 1395
Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys
1400 1405 1410
Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr
1415 1420 1425
Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala
1430 1435 1440
Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys
1445 1450 1455
Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys
1460 1465 1470
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly
1475 1480 1485
<210> 68
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 68
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 69
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 69
caacgaagga aatatagatc aaacaaagga gaaagtcctg tggagcctgc agagccttgt 60
cgttacagct gccccaggga ggaggagggc agcaccatcc ccatccagga ggattaccga 120
aaaccggagc ctgcctgctc cccc 144
<210> 70
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 70
Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn Lys Ala Pro His Pro Lys Gln
1 5 10 15
Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr
20 25 30
Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser Val Gln Glu Arg Gln
50 55 60
<210> 71
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 71
aagaaggtgg ccaagaagcc caccaacaag gccccccacc ctaagcagga accccaggaa 60
atcaacttcc ccgacgacct gcccggcagc aatactgctg ctcccgtgca ggaaaccctg 120
cacggctgtc agcctgtgac ccaggaagat ggcaaagaaa gccggatcag cgtgcaggaa 180
cggcag 186
<210> 72
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 73
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 73
agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc 60
cccatccaag aggagcaggc cgacgcccac tccaccctgg ccaagatc 108
<210> 74
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 74
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 75
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 75
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 76
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 76
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 77
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 77
tgctggctga ccaaaaaaaa atatagcagc agcgtgcatg atccgaacgg cgaatatatg 60
tttatgcgcg cggtgaacac cgcgaaaaaa agccgcctga ccgatgtgac cctg 114
<210> 78
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 78
Met Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Ala Ala Pro Val Ser Ser
1 5 10 15
Thr Ser Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Asn Met Arg Val Arg Arg Arg
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Leu Asn Val Arg Thr Gln Val Ala Ala Asp Trp Thr
35 40 45
Ala Leu Ala Glu Glu Met Asp Phe Glu Tyr Leu Glu Ile Arg Gln Leu
50 55 60
Glu Thr Gln Ala Asp Pro Thr Gly Arg Leu Leu Asp Ala Trp Gln Gly
65 70 75 80
Arg Pro Gly Ala Ser Val Gly Arg Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Leu
85 90 95
Gly Arg Asp Asp Val Leu Leu Glu Leu Gly Pro Ser Ile Glu Glu Asp
100 105 110
Cys Gln Lys Tyr Ile Leu Lys Gln Gln Gln Glu Glu Ala Glu Lys Pro
115 120 125
Leu Gln Val Ala Ala Val Asp Ser Ser Val Pro Arg Thr Ala Glu Leu
130 135 140
Ala Gly Ile Thr Thr Leu Asp Asp Pro Leu Gly His Met Pro Glu Arg
145 150 155 160
Phe Asp Ala Phe Ile Cys Tyr Cys Pro Ser Asp Ile
165 170
<210> 79
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 79
atggctgctg gcggacctgg cgccggatct gctgctcctg tgtctagcac aagcagcctg 60
cctctggccg ccctgaacat gagagtgcgg agaaggctga gcctgttcct gaacgtgcgg 120
acacaggtgg ccgccgattg gacagccctg gccgaggaaa tggacttcga gtacctggaa 180
atccggcagc tggaaaccca ggccgaccct acaggcagac tgctggatgc ttggcagggc 240
agaccaggcg cttctgtggg aaggctgctg gaactgctga ccaagctggg cagggacgac 300
gtgctgctgg aactgggccc tagcatcgaa gaggactgcc agaagtacat cctgaagcag 360
cagcaggaag aggccgagaa gcctctgcag gtggcagccg tggatagcag cgtgccaaga 420
acagccgagc tggccggcat caccaccctg gatgatcctc tgggccacat gcccgagaga 480
ttcgacgcct tcatctgcta ctgccccagc gacatc 516
<210> 80
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 80
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala
1 5 10 15
Arg Val
<210> 81
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 81
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 82
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 82
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 83
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 83
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 84
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 84
agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc 60
cccatccaag aggagcaggc cgacgcccac tccaccctgg ccaagatc 108
<210> 85
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 85
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25 30
<210> 86
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 86
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 60
gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac 90
<210> 87
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 87
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
35 40 45
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
50 55 60
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
65 70 75 80
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
85 90 95
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
100 105 110
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
115 120 125
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 88
<211> 462
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 88
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 180
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 240
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 300
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 360
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 420
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 462
<210> 89
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 89
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
35 40 45
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
50 55 60
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
65 70 75 80
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
85 90 95
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
100 105 110
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
115 120 125
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
130 135 140
Leu Pro Pro Arg
145
<210> 90
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 90
agggaccaga ggctgccccc cgatgcccac aagccccctg ggggaggcag tttccggacc 60
cccatccaag aggagcaggc cgacgcccac tccaccctgg ccaagatcag agtgaagttc 120
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 180
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 240
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 300
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 360
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 420
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 444
<210> 91
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 91
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
65 70 75 80
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
85 90 95
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
100 105 110
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
115 120 125
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
130 135 140
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
145 150 155 160
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
165 170 175
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
180 185 190
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
195 200 205
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215 220
<210> 92
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 92
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctccaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 240
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 300
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 360
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 420
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 480
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 540
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 600
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 660
cctcgc 666
<210> 93
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 93
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg
20 25 30
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
35 40 45
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
50 55 60
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
65 70 75 80
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
85 90 95
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
100 105 110
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
130 135 140
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
165 170 175
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180
<210> 94
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 94
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 60
gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 120
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 180
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 240
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 300
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 360
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 420
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 480
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 540
ctgccccctc gc 552
<210> 95
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 95
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
20 25 30
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
35 40 45
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
50 55 60
Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro
65 70 75 80
Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp
85 90 95
Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
100 105 110
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
115 120 125
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
130 135 140
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
145 150 155 160
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
165 170 175
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
180 185 190
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
195 200 205
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
210 215
<210> 96
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 96
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctccagggac cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc 240
cctgggggag gcagtttccg gacccccatc caagaggagc aggccgacgc ccactccacc 300
ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 360
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 420
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 480
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 540
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 600
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 648
<210> 97
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 97
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Leu Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
355 360 365
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
370 375 380
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
385 390 395 400
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
420 425 430
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
450 455 460
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
465 470 475 480
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
485 490 495
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 98
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 98
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
gagcaggacc tggattggat cggcagaatc gacccctacg acggcgacat cgactacaac 240
cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
gccagcgaga gcgtggacaa ctacggcatc agcttcatga attggttcca gcagaagccc 600
ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa ggatctcgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
ccaccgtgcc cggatcccaa attttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 900
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 960
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1020
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccaaacg gggcagaaag 1080
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1140
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1200
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1260
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1320
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1380
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1440
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1500
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1527
<210> 99
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Leu Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Phe
275 280 285
Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu
290 295 300
Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro
325 330 335
Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala
340 345 350
Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala
370 375 380
His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
385 390 395 400
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
405 410 415
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
420 425 430
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
450 455 460
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
485 490 495
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 100
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 100
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
gagcaggacc tggattggat cggcagaatc gacccctacg acggcgacat cgactacaac 240
cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
gccagcgaga gcgtggacaa ctacggcatc agcttcatga attggttcca gcagaagccc 600
ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa ggatctcgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
ccaccgtgcc cggatcccaa attttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 900
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 960
ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1020
taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctccaggga ccagaggctg 1080
ccccccgatg cccacaagcc ccctggggga ggcagtttcc ggacccccat ccaagaggag 1140
caggccgacg cccactccac cctggccaag atcagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500
ccccctcgc 1509
<210> 101
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 101
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu
50 55 60
Asp Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe
180 185 190
Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu
225 230 235 240
Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Leu Glu Pro Lys
260 265 270
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Asp Pro Lys Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 102
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 102
atggactgga tctggcgcat cctgtttctc gtgggagccg ccacaggcgc ccattctcag 60
gtgcagctgc agcagcctgg cgctgaactc gtgcggccag gcgcttctgt gaagctgagc 120
tgtaaagcca gcggctacac cttcagcaac tacctgatga actgggtcaa gcagcggccc 180
gagcaggacc tggattggat cggcagaatc gacccctacg acggcgacat cgactacaac 240
cagaacttca aggacaaggc catcctgacc gtggacaaga gcagcagcac cgcctacatg 300
cagctgtcca gcctgaccag cgaggacagc gccgtgtact actgcgccag aggctacggc 360
acagcctacg gcgtggacta ttggggccag ggcacaagcg tgaccgtgtc cagcgccaag 420
accacccccc ctaagctgga agagggcgag ttctccgagg cccgggtgga cattgtgctg 480
acacagtctc cagccagcct ggccgtgtcc ctgggacaga gagccaccat cagctgtagg 540
gccagcgaga gcgtggacaa ctacggcatc agcttcatga attggttcca gcagaagccc 600
ggccagcccc ccaagctgct gatctatgcc gccagcagac agggcagcgg agtgcctgcc 660
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcagcctga acatccaccc tatggaagag 720
gacgacaccg ccatgtactt ttgccagcag agcaaagagg tgccctggac ctttggcgga 780
ggcaccaagc tggaaatcaa ggatctcgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 840
ccaccgtgcc cggatcccaa atgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 900
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca accacaggaa caaacggggc 960
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1020
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> hIgG1的铰链区
<400> 103
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu
<210> 104
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 克隆47重链恒定区1
<400> 104
gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60
tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120
tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180
ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag cgagaccgtc 240
acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat t 291
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 克隆47重链恒定区2
<400> 105
gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt 60
actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc 120
cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag 180
gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg 240
ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag 300
aaaaccatct ccaaaaccaa a 321
<210> 106
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 克隆47重链恒定区3
<400> 106
ggcagaccga aggctccaca ggtgtacacc attccacctc ccaaggagca gatggccaag 60
gataaagtca gtctgacctg catgataaca gacttcttcc ctgaagacat tactgtggag 120
tggcagtgga atgggcagcc agcggagaac tacaagaaca ctcagcccat catggacaca 180
gatggctctt acttcgtcta cagcaagctc aatgtgcaga agagcaactg ggaggcagga 240
aatactttca cctgctctgt gttacatgag ggcctgcaca accacca 287
<210> 107
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 克隆47轻链恒定区
<400> 107
cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60
ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120
tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180
agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240
cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300
agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324
<210> 108
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 克隆47铰链区
<400> 108
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtaca 39
<210> 109
<211> 66
<212> DNA
<213> 猪捷申病毒（Porcine teschovirus）
<400> 109
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 110
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒（Porcine teschovirus）
<400> 110
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 111
<211> 63
<212> DNA
<213> 明脉扁刺蛾β四体病毒（Thoseaasigna virus）
<400> 111
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 112
<211> 21
<212> PRT
<213> 明脉扁刺蛾β四体病毒（Thoseaasigna virus）
<400> 112
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 113
<211> 69
<212> DNA
<213> 马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus）
<400> 113
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 114
<211> 23
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒（Equine rhinitis A virus）
<400> 114
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 115
<211> 84
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease virus，FMDV）
<400> 115
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agggaagcgg agtgaaacag 60
actttgaatt ttgaccttct caag 84
<210> 116
<211> 25
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease virus，FMDV）
<400> 116
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25

Claims (65)

1.一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，包含：
(A)以下的氨基酸序列中的每一个：
NYLMN(SEQ ID NO：1)；
RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；
GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；
RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；
AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和
QQSKEVPWT(SEQ ID NO：6)；
(B)铰链区；
(C)跨膜域；和
(D)胞内域，所述胞内域包含信号传导域CD3ζ链和CD28的信号传导域。
2.根据权利要求1所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域：CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和Myd88，任选地，其中所述胞内域包含SEQ ID NO：68、70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个。
3.根据权利要求1或2所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述铰链区包含SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含CD28的跨膜域。
5.根据权利要求4所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述CD3ζ链信号传导域包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。
8.根据权利要求1到6中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO 49或51的氨基酸序列。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：7和/或SEQID NO：8的氨基酸序列中的一个或两个。
10.根据权利要求9所述的IL13Rα2特异性CAR，其中SEQ ID NO：7的所述氨基酸序列经由连接子融合到SEQ ID NO：8的所述氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述连接子包含EEGEFSEAR(SEQID NO 10)的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：53或SEQID NO：55的氨基酸序列。
14.一种核酸，编码根据权利要求1到13中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR。
15.根据权利要求14所述的核酸，包含SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和65的序列。
16.一种载体，包含根据权利要求14或15所述的核酸。
17.根据权利要求16所述的载体，其是反转录病毒载体。
18.一种宿主细胞，包含根据权利要求16或17所述的载体。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其是人类宿主细胞。
20.根据权利要求18或19所述的宿主细胞，其是T淋巴细胞。
21.根据权利要求19所述的宿主细胞，其是自然杀伤细胞。
22.根据权利要求18所述的宿主细胞，进一步包含IL15的可表达编码区。
23.一种细胞群体，包含根据权利要求18到22中任一项所述的宿主细胞。
24.根据权利要求23所述的细胞群体，包含至少107个宿主细胞。
25.一种医药组合物，包含根据权利要求1到13中任一项所述的IL13Rα2特异性CAR、根据权利要求14或15所述的核酸、根据权利要求16或17所述的载体、根据权利要求18到21中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求22或23所述的细胞群体，和药学上可接受的载剂。
26.一种治疗个体的癌症的方法，包含以有效治疗所述个体的所述癌症的量向所述个体给予根据权利要求23或24所述的细胞群体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述细胞群体的所述宿主细胞是获自所述个体的细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是T淋巴细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是自然杀伤细胞。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞群体的所述宿主细胞表达IL15。
32.一种IL13Rα2特异性嵌合抗原受体(CAR)，包含：
(A)胞外域，所述胞外域包含以下的氨基酸序列中的每一个：
(i)NYLMN(SEQ ID NO：1)；
(ii)RIDPYDGDIDYNQNFKD(SEQ ID NO：2)；
(III)GYGTAYGVDY(SEQ ID NO：3)；
(iv)RASESVDNYGISFMN(SEQ ID NO：4)；
(v)AASRQGSG(SEQ ID NO：5)；和
(vi)QQSKEVPWT(SEQ ID NO：6)；
(B)间隔区；
(C)跨膜域；和
(D)胞内域，所述胞内域选自由以下组成的组：CD3.ζ、CD28.ζ、CD28.OX40.ζ、CD28.41BB.ζ和41BB.ζ。
33.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述间隔区包含不大于100个氨基酸。
34.根据权利要求33所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述间隔区包含不大于50个氨基酸。
35.根据权利要求34所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述间隔区包含不大于25个氨基酸。
36.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述间隔区包含来自IgG1铰链区的SEQ ID NO：103(PKSCDKTHTCPPCPAPEL)。
37.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述跨膜域是CD28或CD8α的跨膜域。
38.根据权利要求37所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述CD28的跨膜域包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列。
39.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述胞内域进一步包含以下中的一种或多种的信号传导域：CD137、CD134、CD27、CD40、ICOS和Myd88。
40.根据权利要求39所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述胞内域包含SEQ ID NO：68、70、72、74、76和78的氨基酸序列中的一个或多个。
41.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述CD3ζ链信号传导域包含SEQID NO：41的氨基酸序列。
42.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。
43.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO 49或51的氨基酸序列。
44.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：8的氨基酸序列中的一个或两个。
45.根据权利要求44所述的IL13Rα2特异性CAR，其中SEQ ID NO：7的所述氨基酸序列经由连接子融合到SEQ ID NO：8的所述氨基酸序列。
46.根据权利要求45所述的IL13Rα2特异性CAR，其中所述连接子包含EEGEFSEAR(SEQID NO 10)的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
48.根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR，包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：55的氨基酸序列。
49.一种核酸，编码根据权利要求32所述的IL13Rα2特异性CAR。
50.根据权利要求49所述的核酸，包含SEQ ID NO：34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和65的序列。
51.一种载体，包含根据权利要求49或50所述的核酸。
52.根据权利要求51所述的载体，其是反转录病毒载体。
53.一种宿主细胞，包含根据权利要求51或52所述的载体。
54.根据权利要求53所述的宿主细胞，其是人类宿主细胞。
55.根据权利要求53或54所述的宿主细胞，其是T淋巴细胞。
56.根据权利要求54所述的宿主细胞，其是自然杀伤细胞。
57.根据权利要求53所述的宿主细胞，进一步包含IL15的可表达编码区。
58.一种细胞群体，包含根据权利要求53到57中任一项所述的宿主细胞。
59.根据权利要求58所述的细胞群体，包含至少107个宿主细胞。
60.一种医药组合物，包含根据权利要求34所述的IL13Rα2特异性CAR、根据权利要求49或50所述的核酸、根据权利要求51或52所述的载体、根据权利要求53到57中任一项所述的宿主细胞或根据权利要求58或59所述的细胞群体，和药学上可接受的载剂。
61.一种治疗个体的癌症的方法，包含以有效治疗所述个体的所述癌症的量向所述个体给予根据权利要求58或59所述的细胞群体。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述细胞群体的所述宿主细胞是获自所述个体的细胞。
64.根据权利要求63所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是T淋巴细胞。
65.根据权利要求63所述的方法，其中获自所述个体的所述细胞是自然杀伤细胞。
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